Bài giảng kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật: Tổng hợp kiến thức

Các kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật

Nội dung bài học

 Mở đầu  Các phương pháp chuyển gen không sử

dụng virus

 Các phương pháp chuyển gen sử dụng

virus

 Ứng dụng  Kết luận

Mở đầu

 Dự án giải mã bộ gen Người (Human

Genome Project, 1990 – 2003)  Hiểu biết rõ ràng hơn về bộ gen Người  Cải tiến về các phương pháp chuẩn đoán,

điều trị trên từng cá thể  Liệu pháp gen

Mở đầu  Liệu pháp gen là việc áp dụng các nguyên lí di truyền trong điều trị bệnh lí trên người

 Liệu pháp gen = chuyển vật liệu di

truyền vào tế bào với các mục tiêu  Thay thế cho các gen mất chức năng  Ức chế sự biểu hiện của gen bệnh  Tiêu diệt tế bào bệnh bằng gen tự sát  …

Mở đầu

Mô hình liệu pháp gen

Mở đầu  Chiến lược chuyển gen

 In vivo  Ex vivo

Mở đầu

 Các phương pháp chuyển gen

 Phương pháp chuyển gen sử dụng virus  Phương pháp chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp hóa học  Phương pháp vật lí

Phương pháp

 Chuyển gen bằng virus

 Khả năng xâm nhiễm đa dạng và chuyên biệt  Gắn chèn gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào

chủ  biểu hiện ổn định protein mục tiêu

 Retrovirus, Herpesvirus, Adenovirus, Lentivirus,

…

Phương pháp

 Quá trình sao chép của virus

Chuyển gen sử dụng virus

 Chiến lược sử dụng vector virus

 Giai đoạn 1: tạo vector virus

Tín hiệu đóng gói Gen mục tiêu

Vector DNA

Helper DNA

Virus hoang dại

Gen cần thiết của virus

Protein virus Protein virus

Tế bào đóng gói

Protein virus

Vector retrovirus

Chuyển gen sử dụng virus

 Giai đoạn 2: quá trình xâm nhiễm

Vector trần

vector

Vector tồn tại trong nhân

Vector gắn chèn vào NST

Tế bào mục tiêu

mRNA và Protein trị liệu

Chuyển gen sử dụng virus  Retrovirus  Cấu tạo

 Vỏ

 Thụ thể Glycoprotein

 Lõi

 Protein lõi  Vật liệu di truyền  Các enzym

Chuyển gen sử dụng virus

 Retrovirus

Chuyển gen sử dụng virus  Retrovirus  Ưu điểm

 Gắn chèn gen mục tiêu vào NST của tế bào quan tâm

 biểu hiện gen mục tiêu ổn định

 Ít nhạy cảm với hệ miễn dịch  Sử dụng đối với các dòng tế bào phân chia mạnh

 Khuyết điểm

 Gắn chèn gen mục tiêu một cách ngẫu nhiên  Không có khả năng chuyển nhiễm lên các dòng tế bào

không phân chia

 Sự biểu hiện bắt đầu giảm đi sau một thời gian biểu

hiện ổn định

Chuyển gen sử dụng virus

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp hóa học  Calcium Phosphate  DEAE dextran  Liposome

 Phương pháp vật lí

 Điện biến nạp  Súng bắn gen

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp hóa học

 Sử dụng lần đầu tiên vào năm 1965 (DEAE-

dextran)

 Giúp cho DNA dễ dàng bám và di chuyển

qua màng tế bào, màng nhân.

 Hiệu quả thấp hơn so với các phương pháp

chuyển gen sử dụng virus

 Yêu cầu nghiêm ngặt về hóa chất sử dụng  Không liên quan đến các vấn đề về an toàn

sinh học

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp Calcium Phosphate

 Tạo tủa từ phức hợp DNA/CaCl2 và đệm HBS

2X (Hepes buffer saline)

 Tủa có chứa DNA sẽ được gắn lên bề mặt tế

bào quan tâm

 DNA sẽ di chuyển vào bên trong tế bào thông qua cơ chế thực bào (endocytosis)  Tủa CaPO4: ngăn chặn sự ảnh hưởng của

nuclease

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp Calcium Phosphate

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp DEAE-dextran

 Phức hợp DNA/DEAE-dextran được tạo ra

dưới tác dụng của lực tĩnh điện

 DEAE-dextran có điện tích +, gắn kết DNA

(-) và màng tế bào (-)

 Hiệu quả cao hơn Calcium phosphate, nhưng DEAE-dextran độc với tế bào, dễ làm chết tế bào sau biến nạp

 Thực hiện biến nạp không sử dụng huyết

thanh

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp DEAE-dextran

Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Cationic lipid (Liposome)  Một trong những phương pháp không sử

dụng virus khá hiệu quả

 Khi cho Cationic lipid vào DNA

 Tập hợp DNA (điện tích)  Hình thành phức hợp 2 lớp nhiều tầng DNA/cationic

lipid

 Dễ dàng thấm qua màng tế bào hoặc di chuyển thông qua quá trình thực bào  Một số loại cationic lipid độc với tế bào  Một số sản phẩm thương mại: Lipofectamine

(Invitrogen), Fugene (Roche, Promega)

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp Cationic lipid (Liposome)

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp vật lý

 Thường sử dụng khi các phương pháp chuyển

gen bằng hóa học kém hiệu quả  Không phụ thuộc vào loại tế bào  Không có giới hạn về kích cỡ DNA chuyển  Yêu cầu có các dụng cụ chuyên biệt (Súng bắn gen, Máy điện biến nạp, Hệ thống vi thao tác, …)

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp điện biến nạp

 Sử dụng dòng điện  tạo một điện trường tác động lên màng tế bào trong thời gian cực ngắn (us – ms)

 Xuất hiện các lổ (pore) trên màng tế bào 

vector dễ dàng di chuyển xuyên qua màng tế bào

 Thông số điện biến nạp giữa các dòng tế bào

rất khác nhau

 Thường gây chết tế bào !!!

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp điện biến nạp

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp điện biến nạp

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp bắn gen

 Hệ thống bao gồm một xylanh và một “hộp đạn” có chứa các hạt vàng được phủ DNA  Khi kích hoạt hệ thống, khí nén Helium được giải phóng, tác động một sóng siêu âm lên các hạt vàng có phủ DNA  các hạt này di chuyển vào tế bào chất của tế bào

 Thường áp dụng cho tế bào thực vật (Bắp,

Lúa mạch, Đậu nành, …)

Chuyển gen không sử dụng virus

 Phương pháp bắn gen

Ứng dụng

 Bệnh SCID – Suy giảm miễn dịch trầm trọng (Severe Combined Immunodeficiency Disease)  Do

Adenosin Deaminase

thiếu

hụt

(Adenosine Deaminase Deficiency (ADA)), dẫn đến tạo ra một số lượng lớn S-adenosylhomocysteine, gây độc cho sự trưởng thành của Lympho T và B

 Gen mã hóa nằm ở NST số 22 (32Kbp, 12 exons)  Hậu quả: Lympho T và B không có chức năng  Các tác nhân lạ dễ dàng xâm nhập  chết, nếu không

điều trị

Ứng dụng  Điều trị

 Trước khi có liệu pháp gen  ghép tủy  David, bị SCID khi vừa mới sinh ra đời, nhận tủy

của chị gái  chết, do bị ung thư máu

Ứng dụng  Điều trị

 Tháng 9, 1990, NIH đã điều trị cho 2 bệnh nhân

SCID đầu tiên bằng liệu pháp gen

 Ashanti – 4 tuổi, được tiến hành ghép các tế bào lympho đã được biến nạp gen mã hóa ADA bằng phương pháp sử dụng retrovirus (~109 vector retrovirus được sử dụng)

 Cynthia – 9 tuổi, điều trị giống như Ashanti  Thành công trong việc tái tạo hệ miễn dịch, tuy nhiên, các tế bào bạch cầu có đời sống ngắn, phải lặp lại các ca ghép tế bào đã được chuyển gen.