Bài giảng: Kĩ thuật di truyền

KI THU T DI TRUY N KI THU T DI TRUY N

Ậ Ậ

Ề Ề

I/ Khái niệm kĩ thuật di truyền I/ Khái niệm kĩ thuật di truyền

1.Định nghĩa Kĩ thuật di truyền là kĩ thuật thao tác trên vật liệu di truyền dựa vào những hiểu biết về cấu trúc hoá học của các axit nuclêic và di truyền vi sinh vật.

2. Phương pháp 2. Phương pháp

Phương pháp được sử dụng phổ biến hiện

nay là kĩ thuật cấy gen, tức là chuyển một đoạn AND từ tế bào cho sang tế bào nhận bằng cách dùng plasmit làm thể truyền.

II/ K THU T C Y GEN Ậ

Ấ

Ỹ

Dùng PLASMIT hay

GEN (T BÀO Ế CHO)

GEN (T BÀO Ế NH N)Ậ

̣ thể thưc khuẩn

Plasmit laø gì ?

- Plasmit : Plasmit laø nhöõng caáu truùc naèm trong teá baøo chaát cuûa vi khuaån. Tuyø loaøi vi khuaån, moãi teá baøo chöùa töø vaøi plasmit ñeán vaøi chuïc plasmit. - Plasmit chöùa ADN daïng voøng, goàm khoaûng töø 8.000 – 200.000 caëp nucleâoâtit. ADN cuûa plasmit töï nhaân ñoâi ñoäc laäp vôùi ADN nhieãm saéc theå.

3. Caùc khaâu chuû yeáu cuûa kyõ thuaät caáy gen:

Kĩ thu t c y gen có 3 khâu ch y u:

ậ ấ

ủ ế

bào cho

+ Tách ADN nhi m s c th c a t ễ

ắ

và tách plasmit ra kh i t

ể ủ ế bào.

ỏ ế

ắ

bào cho vào ADN ạ

ủ ế ể

ị

+ C t và n i plasmit ở ADN tái t

ố ADN c a t nh ng đi m xác đ nh, t o nên ữ h p. ổ ợ

ạ

ệ

ượ

ờ

ắ ắ

ở

i ta có th tách

ườ

ấ ị

ủ

ệ ự

ệ

c th c hi n - Thao tác c t tách đo n ADN đ ự nh enzim c t (restrictaza). Các phân t ử nh ng enzim này nh n ra và c t đ t ADN ữ ắ ứ ậ nuclêôtit xác đ nh nh đó ng ể ờ ị các gen mã hoá nh ng prôtêin nh t đ nh. ữ Vi c c t đ t ADN vòng c a plasmit cũng đ ượ th c hi n do enzim c t còn vi c ghép đo n ạ ắ bào cho vào ADN plasmit thì do ADN c a t enzim n i (ligaza) đ m nhi m. ệ

ắ ứ ệ ủ ế ố

ả

ể

ổ ợ

ể

ề

ậ , t o ạ ệ

+ Chuy n ADN tái t ệ

ổ ợ

h p vào t bào nh n ế c bi u hi n. ượ c chuy n vào t ế ể ượ ng pháp khác nhau.

đi u ki n cho gen đã ghép đ h p đ ươ

ậ

Vào t

c truy n qua ề

ự

ế

nhân đôi, đ ượ ế

ạ

Plasmit mang ADN tái t bào nh n b ng nhi u ph ề ằ bào nh n, nó t ậ các th h t bào sau qua c ch phân bào và ế ệ ế t ng h p lo i prôtêin đã mã hoá trong đo n ADN ạ ợ ổ c ghép. đ ượ

- T bào nh n đ

ng ru t E.Coli. T bào E.Coli

ậ ườ

, 1 ờ bào, c ượ

ấ

ả ng ng v i các gen ớ

ứ

ớ

c dùng ph bi n là vi ế ổ ế ượ khu n đ ẩ ế ộ nhân đôi. Sau 12 gi sau 30 phút l i t ạ ự bào ban đ u s sinh ra 16 tri u t t ệ ế ẽ ầ ế qua đó các plasmit trong chúng cũng đ nhân lên r t nhanh và s n xu t ra m t ấ ộ l ng l n các ch t t ấ ươ ượ đã ghép vào plasmit.

c dùng ph bi n là vi khu n đ ượ ổ ế ậ

 T bào nh n đ ế , 1 t

ế ộ

ờ ế bào ban đ u s sinh ra 16 tri u t ẽ ầ

ượ

ng l n các ch t t ộ ượ ả ớ ng ẩ ườ i t nhân đôi. ạ ự bào, ệ ế c nhân lên r t ấ ng ng ứ ấ ươ

 Trong kĩ thu t c y gen ng

ru t E.Coli. T bào E.Coli sau 30 phút l Sau 12 gi qua đó các plasmit trong chúng cũng đ nhanh và s n xu t ra m t l ấ v i các gen đã ghép vào plasmit. ớ

ẩ i ta còn dùng th th c ườ ắ ậ ấ ể ề ạ

bào cho bào nh n ủ ậ ậ

ể ự khu n làm th truy n. Nó g n đo n ADN c a t ủ ế vào ADN c a nó và trong khi xâm nh p vào t ế nó s đem theo c đo n ADN này vào đó. ạ ẽ ả

K THU T C Y GEN K THU T C Y GEN

Ậ Ậ

Ấ Ấ

Ỹ Ỹ

Enzim c tắ

G n đo n b c t vào plasmit nh enzim n i ố ạ ị ắ ờ ắ

Chuy n đ n t bào nh n ể ế ế ậ

ADN Plasmit tái t h p ổ ợ d ng vòng ạ

ADN c a t ủ ế bào nh n E.coli ậ 14

– Tách ADN

Tách ADN nhieãm saéc theå cuûa teá nhieãm saéc theå cuûa teá baøo cho,taùch plasmit ra khoûi teá baøo cho,taùch plasmit ra khoûi teá baøo baøo – Cắt vaø nối ADN cuûa teá baøo cho vaø Cắt vaø nối ADN cuûa teá baøo cho vaø ADN plasmit ôû nhöõng ñieåm xaùc ADN plasmit ôû nhöõng ñieåm xaùc ñònh,taïo ADN taùi toå hôïp. ñònh,taïo ADN taùi toå hôïp. * Caét: Enzim caét (restrictaza) * Caét: Enzim caét (restrictaza) * Noái: Enzim noái (ligaza) * Noái: Enzim noái (ligaza) – Chuyển ADN taùi tổ hợp vaøo tế baøo Chuyển ADN taùi tổ hợp vaøo tế baøo nhận, taïo ñieàu kieän cho gen ñaõ nhận, taïo ñieàu kieän cho gen ñaõ gheùp ñöôïc bieåu hieän . gheùp ñöôïc bieåu hieän .

Enzim c tắ

ADN th th c khu n đ t ẩ ứ

ể ự

ADN t

bào cho

ế

Enzim n iố

bào nh n

Chuy n đ n t ể

ế ế

ậ

S Đ Ơ Ồ S Đ Ơ Ồ ẤC Y GEN Ấ C Y GEN NH ỜNH Ờ THEÅ THEÅ THÖÏC THÖÏC KHU N Ẩ KHU N Ẩ

ADN c a t ủ ế bào nh n E.coli ậ

III/ PH

NG PHÁP PCR

ƯƠ

(POLYMERASE CHAIN REACTION)

1. Nguyên t c c a ph ng pháp PCR: ắ ủ ươ

ADN polymerase th c hi n t ng h p m ch m i t ệ ổ ớ ừ ự ạ ợ AND m ch khuôn ạ

t. c n s hi n di n c a m i chuyên bi ệ ủ ầ ự ệ ồ ệ

M i:ồ đo n AND ng n, có kh năng b t c p b sung v i m t đ u c a ộ ầ ủ ắ ặ ạ ắ ả ớ ổ

m ch khuôn. ạ

Nhi t đ nóng ch y c a m i: t đ này, 50 % ADN m ch ệ ộ ả ủ ồ Tm ( nhi ở ệ ộ ạ

đôi b tách m ch thành m ch đ n). ạ ạ ơ ị Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C

N u cung c p 2 m i chuyên bi t (m i xuôi và m i ng ế ấ ồ ệ ồ ồ ượ c) b t c p b ổ ắ ặ

ADN, ADN polymerase s xúc tác sung v i 2 đ u c a m t trình t ầ ủ ộ ớ ự ẽ

t ng h p đo n ADN n m gi a 2 m i. ổ ữ ạ ằ ợ ồ

2. Ph n ng PCR: ả ứ

 Thành ph n ph n ng: ầ ả ứ

- ADN b n m u ẫ ả

- M i xuôi và m i ng c ồ ồ ượ

- dNTP (g m 4 lo i: dATP, dGTP, dTTP, dCTP) ạ ồ

- MgCl2

- Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu…)

- Dung d ch đ m. ị ệ

- N c c t 2 l n (đã kh trùng) ầ ướ ấ ử

Các b c c a ph n ng: ướ ủ ả ứ

Là m t chu i nhi u chu kỳ, m i chu kỳ g m 3 b c: ề ộ ỗ ồ ỗ ướ

B c 1: Bi n tính (denaturation) ướ ế

0C,

ADN đ c bi n tính nhi t đ cao, th ng là 94 – 95 ượ ế ở ệ ộ ườ

trong th i gian 30s – 1 phút. ờ

B c 2: B t c p m i ướ ắ ặ ồ (hybridization)

0C).

Nhi t đ c n cho s b t c p m i v i ADN m ch khuôn là ệ ộ ầ ự ắ ặ ồ ớ ạ Ta

ấ ả ơ (Ta th p h n Tm kho ng 5

B c 3: Kéo dài (elongation) ướ

0C, đ ADN polymerase ho t

Nhi c tăng lên đ n 72 t đ đ ệ ộ ượ ế ể ạ

đ ng kéo dài m ch. ộ ạ

ng đ n ph n ng PCR nh h ế ưở ả ứ ế ố ả

ng ADN s d ng cho PCR có khuynh h ướ ng gi m ả ượ ử ụ

ẩ ạ

c b o qu n t t. ẫ  h n ch s n ph m “kí sinh”. ế ả ượ ả ẫ ệ ả ố

t đ c tách chi ầ ị ệ ượ t t ế ừ

3. Các y u t  ADN m u:ẫ - ADN s ch, l ạ (kho ng 100 ng) ả - Gi m l ng m u ượ ả - PCR có th th c hi n trên các m u không đ ể ự  Enzyme : - Enzyme polymerase đ u tiên ch u nhi Thermus aquaticus là Taq polymerase.

- Enzyme Pfu ADN polymerase thu nh n t ơ

ừ ậ

ẩ Pyroccus vi khu n t cao h n, có ho t tính 3’-5’ ạ ệ ị

- Tth polymerase, tách chi

furiosus có kh năng ch u nhi ả exonuclease.

t t ả

ế ừ Thermus thermophilus, có kh năng c khi có RNA và Mn2+, khi có ADN và Mg2+ thì

phiên mã ng enzyme này th c hi n khu ch đ i ADN. ệ ượ ự ạ ế

 M i và nhi ồ

ệ ộ

- M i là ch tiêu quan tr ng nh t, quy t đ nh tính đ c hi u c a ph n t đ lai T a ọ ệ ủ ế ị ặ ả ấ ỉ

ồ ng.ứ - Khi thi ắ ặ ả

ế ế ồ ầ ồ ữ t k m i c n chú ý: thành ph n GC, kh năng b t c p b ầ ổ c”, kh năng t o c u trúc “k p ẹ ạ ấ ượ ả ồ

sung gi a “m i xuôi” và “m i ng tóc”.

ệ

- Tm c a 2 m i không cách bi ồ - M i đ c tr ng cho trình t ư khác trên gen. ự

ADN c n khu ch đ i và không b t c p ạ ắ ặ ế ự t quá xa. ầ

ủ ồ ặ v i trình t ớ

ả ứ

n ng đ là 20 -200 µM đ i v i m i lo i. ố ớ ạ ỗ ườ ộ

 Các thành ph n khác c a ph n ng: ầ ủ ng s d ng - dNTP: th ử ụ ở ồ - Mg2+: quá ít  hi u qu nhân b n gi m ả ệ quá nhi u ề  t o s n ph m không đ c hi u ệ ặ ạ ả

 S l

ả ả

ng chu kỳ: không v t quá 40 ố ượ ẩ ượ

ng pháp PCR Ứ

 dòng hóa gene, gi i trình t , ự ả

ấ ẫ

ả ADN ươ ớ ả ề - Bi n đ i m t trình t ổ ế ộ ị

: thêm v trí c a enzyme c t h n ch , ế g n 4. ng d ng c a ph ủ ụ ng l n b n sao ADN - T o s l ạ ố ượ l p b n đ di truy n, s n xu t m u dò… ồ ả ậ ắ ạ ủ ự promoter, trình t ự ự ắ ạ ộ

ng pháp PCR ươ

ế ủ ễ

t l p ph n ng PCR và phân tích s n ph m đ c ẩ ả ượ

ti n hành ử Vi c thi ệ ở ế

- Nhân b n không đ c hi u: - Các sai sót do Taq polymerase

gây t o đ t bi n trên ADN, thêm trình t ế c a ribosome… ủ 5. H n ch c a ph ạ - Ngo i nhi m: ạ X lí:ử Kh trùng khu v c thao tác . ự ả ứ ế ậ các khu v c khác nhau. ự ệ ặ ả

ạ ủ

ng ng): xác đ nh hàm l ị ị

ẩ

5. Các d ng khác c a PCR : - RT –PCR (reverse transcriptase –PCR): RNA  cADN  ADN. - RT – PCR (Realtime PCR – PCR đ nh l ượ ạ ể ị ượ t ng th i đi m. ờ ẩ ng s n ph m d a trên tín hi u ự ượ ệ ả

s n ph m PCR t o ra ở ừ ả Nguyên t c:ắ xác đ nh hàm l huỳnh quang.

- PCR nested: s d ng nhi u h n m t c p m i

ề ơ ộ ặ ồ  thu nh n s n ậ ả

ph m đ c hi u h n. ẩ ặ ử ụ ơ ệ

Ụ

Ậ

Ỹ

IV/ NG D NG C A K THU T DI Ủ Ứ TRUY NỀ

ọ

ệ

ử ụ ữ

ụ

u vang; vi

ể ạ i:ườ ượ

ượ

ả

c dùng s n xu t bia, r ấ

ượ

ả c dùng s n xu t các ch t kháng

ấ c dùng s n xu t cheese, yogurt, v.v... ẩ

ấ

u và m t s s n ph m khác

Công ngh sinh h c (Biotechnology) s d ng các bào s ng đ t o ra các nguyên li u h u d ng t ố ế cho con ng –N m nen đ ấ khu n đ ẩ –Các vi khu n đ sinh, r ượ

ượ ộ ố ả

ả ẩ

c ph m đã đ

ẩ

ượ ạ

c t o ra nh k ờ ỹ

vi khu n E. coli nh k thu t tái t

ấ ừ

c ượ ổ

ờ ỹ

ẩ

ậ

ả ợ

ự ế

ộ

ụ

ả

• Nhi u lo i d ạ ượ ề thu t tái t h p ADN ổ ợ ậ • Thí d : ụ –TPA (tissue plasminogen activator) đang đ s n xu t t h p ADN –TPA là m t enzyme xúc tác s bi n đ i ổ plasminogen trong máu thành plasmin. Plasmin là m t protein có kh năng hòa tan c c máu ộ (clot)