Bài giảng Thực hành công nghệ sinh học động vật [Mới nhất]

Bài giảng TH CNSHĐV

Baøi 1 NHAÄN DIEÄN KHAÙNG NGUYEÂN BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP OUTERLONY

I. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT

1. Caùc khaùi nieäm caàn nhôù

Mieãn dòch laø khaû naêng cuûa cô theå nhaän ra vaø loaïi boû caùc vaät laï (khaùng nguyeân - Ag: Antigen). Töø coå xöa, ngöôøi ta ñaõ bieát öùng duïng mieãn dòch trong vieäc phoøng tröø moät soá beänh nhieãm khuaån, vì theá khaùi nieäm veà mieãn dòch hoïc ñaõ xuaát hieän töø raát sôùm. Tuy nhieân, cho tôùi cuoái theá kyû thöù XIX, mieãn dòch hoïc môùi trôû thaønh moät moân khoa hoïc rieâng bieät. Trong lòch söû phaùt trieån cuûa moân mieãn dòch hoïc, quan nieäm veà ñaùp öùng mieãn dòch thay ñoåi theo tieán boä cuûa khoa hoïc kyõ thuaät vaø ñoàng thôøi noù cuõng coù moái lieân heä maät thieát vôùi moät soá ngaønh khoa hoïc khaùc nhö Sinh hoïc phaân töû, Y sinh hoïc, Döôïc hoïc, Thuù y, Vi sinh hoïc…

Trong cô theå ñoäng vaät baäc cao (trong ñoù coù ngöôøi), ñaùp öùng mieãn dòch coù theå taïm chia ra thaønh hai loaïi: ñaùp öùng mieãn dòch töï nhieân vaø ñaùp öùng mieãn dòch thu ñöôïc. Tuy nhieân hai khaùi nieäm naøy coù moái quan heä maät thieát vôùi nhau. Noùi chung, khi coù moät yeáu toá laï coù haïi- coù theå gaây caùc hieäu öùng sinh hoùa (khaùng nguyeân) xaâm nhaäp vaøo cô theå, heä thoáng mieãn dòch coù nhieäm vuï nhaän bieát vaø sau ñoù coù nhöõng hoaït ñoäng coù hieäu quaû tieáp theo ñeå loaïi boû. Ñaùp öùng mieãn dòch dòch theå vaø ñaùp öùng mieãn dòch teá baøo laø hai phöông thöùc maø heä thoáng mieãn dòch söû duïng ñeå choáng laïi khaùng nguyeân. Ñoái vôùi mieãn dòch dòch theå thì khaùng theå hoøa tan, chính xaùc hôn laø globulin mieãn dòch ñaûm ñöông chöùc naêng naøy. Caùc globulin mieãn dòch naøy ñöôïc saûn xuaát töø caùc teá baøo plasma (töông baøo), bieät hoùa töø lympho baøo B.

Theo nghóa roäng thì taát caû caùc chaát noäi dòch ñeàu coù theå giuùp sinh vaät choáng ñôõ laïi yeáu toá khaùng nguyeân xaâm nhaäp vaøo cô theå. Tuy nhieân, khaùng theå dòch theå ñöôïc hieåu ôû ñaây laø thaønh phaàn globulin mieãn dòch coù trong huyeát thanh mieãn dòch (thaønh phaàn naøy coù khoaûng 20% trong huyeát thanh).

Bài giảng TH CNSHĐV

Hình 45 :Sô ñoà caáu truùc phaân töû Ig.

Veà phaân loaïi, ngöôøi ta chia Ig thaønh caùc lôùp phaân töû sau:

+ Globulin mieãn dòch G (IgG): chieám khoaûng 70-75% toång soá Ig cuûa huyeát thanh ngöôøi. Ñaây laø lôùp khaùng theå chuû yeáu trong ñaùp öùng mieãn dòch vaø cuõng laø phaân töû ñoäc quyeàn khaùng ñoäc toá. Lôùp IgG coù vai troø quan troïng nhaát trong cô cheá ñaùp öùng mieãn dòch.

+ Globulin mieãn dòch A (IgA): chieám khoaûng 15-20% toång soá Ig trong huyeát thanh. Chuùng coù hai loaïi laø IgA noäi dòch huyeát thanh vaø IgA tieát ra ngoaøi nieâm maïc. IgA laø phöông tieän baûo veä taïi choã raát höõu hieäu cuûa cô theå, ngaên caûn söï xaâm nhaäp cuûa khaùng nguyeân (virus, vi khuaån, teá baøo laï, caùc phaân töû sinh hoùa…) + Globulin mieãn dòch M (IgM): chieám khoaûng 10% toång löôïng IgG huyeát thanh, chuùng coù vai troø ñaëc bieät quan troïng trong nhöõng tröôøng hôïp nhieãm khuaån sôùm. + Globulin mieãn dòch D (IgD): chieám 1% toång löôïng Ig huyeát thanh. Cho tôùi hieän nay thì chöùc naêng chính cuûa IgD vaãn chöa ñöôïc xaùc ñònh roõ raøng, nhöng ngöôøi ta thöôøng thaáy noàng ñoä cuûa chuùng taêng chaäm trong nhöõng tröôøng hôïp nhieãm khuaån maõn tính nhöng khoâng ñaëc hieäu cho loaïi nhieãm khuaån naøo. + Globulin mieãn dòch E (IgE): raát ít, chuùng chæ chieám khoaûng 0,004% toång löôïng Ig huyeát thanh. Vai troø cuûa IgE laø khôûi ñoäng vieäc giaûi phoùng caùc saûn phaåm töø teá baøo baïch caàu öa kieàm.

Bài giảng TH CNSHĐV

2. Phaûn öùng khaùng nguyeân- khaùng theå

IgG trong heä thoáng mieãn dòch coù nhieäm vuï keát hôïp ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân. Ñaây laø moät trong nhöõng chöùc naêng quan troïng nhaát beân caïnh caùc chöùc naêng khaùc nhö hoaït hoùa baïch caàu, boå theå, hoaït hoùa cô cheá vaän chuyeån qua maøng teá baøo… Khaû naêng keát hôïp ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân coù ñöôïc laø do caáu truùc ñaëc bieät cuûa phaân töû globulin mieãn dòch .

Hình 46:Hình caáu truùc khoâng gian

cuûa protein khaùng theå vaø caùch baét Ag.

Phaûn öùng in-vitro dieãn ra giöõa khaùng nguyeân khaùng theå hay coøn ñöôïc goïi laø caùc phöông phaùp huyeát hoïc (serological assays) ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi trong chaån ñoaùn beänh.

Söï keát hôïp giöõa khaùng nguyeân - khaùng theå chính laø keát quaû cuûa haøng loaït caùc phaûn öùng tuûa, phaûn öùng ngöng keát, phaûn öùng coá ñònh boå theå vaø phaûn öùng mieãn dòch ñaùnh daáu. Saûn phaåm hoùa lyù cuûa söï keát hôïp khaùng nguyeân vôùi khaùng theå maø cuï theå laø keát quaû cuûa phaûn öùng trung hoøa khaùng nguyeân coù yù nghóa raát lôùn vaø ñöôïc

Bài giảng TH CNSHĐV

II. NGUYEÂN LIEÄU, HOÙA CHAÁT, DUÏNG CUÏ

- Lame 9 x 8,5cm. - Boä duïng cuï ñuïc loã thaïch. - Bình tam giaùc. - OÁng tieâm 1ml. - Buoàng aåm. - Agarose tinh khieát. - Nöôùc muoái sinh lyù. - Dung dòch ñeäm PBS. - Dung dòch nhuoäm maøu Commassive brilliant blue. - Dung dòch taåy maøu. - Vaccine DPT. - Huyeát thanh khaùng ñoäc toá baïch haàu. - Huyeát thanh chuaån (ñaõ bieát tröôùc noàng ñoä). - Giaûi ñoäc toá baïch haàu.

III. TIEÁN HAØNH THÍ NGHIEÄM

(Phöông phaùp khuyeách taùn hai chieàu do Outerlony ñeà xuaát)

- Giaûi haáp phuï vaccine DPT: duøng vaccine DPT ñeå giaûi haáp phuï ñoäc toá baïch haàu ra khoûi gel aluminum baèng dung dòch Na Citrat noàng ñoä 2% trong 24 giôø.

- Tieán haønh phaûn öùng nhaän dieän: duøng phaûn öùng khuyeách taùn keùp (double diffusion) do Outerlony ñeà xuaát (ñöôïc goïi taét laø phaûn öùng Outerlony).

- Caùc böôùc tieán haønh nhö sau:

+ Chöng thaïch: Agarose tinh khieát 1% pha trong dung dòch

ñeäm PBS coù pH= 7,2.

+ Ñoå thaïch leân lame: duøng lame nhoû hoaëc film 2,5x8cm,

khoaûng 3ml thaïch/ lame.

+ Ñuïc loã thaïch.

Bài giảng TH CNSHĐV

Vaccine DPT ñaõ giaûi haáp phuï ñöôïc pha loaõng ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau

Huyeát thanh khaùng ñoäc toá baïch haàu 50 Iu/ml

Lame

Hình 47 : Caùch boá trí caùc loã thaïch treân lame.

Tieán haønh phaûn öùng Outerlony trong buoàng aåm, thöïc hieän nhuoäm

vaø eùp tieâu baûn.

GOÀM CAÙC BÖÔÙC SAU:

 Ngaâm tieâu baûn vaøo dung dòch sinh lyù trong 12- 18 ñeå loaïi boû caùc

yeáu toá keát hôïp khoâng ñaëc hieäu.

 Nhuoäm tieâu baûn baèng thuoác nhuoäm commassive brilliant blue

trong 10 phuùt.

 Röûa saïch thuoác nhuoäm baèng caùch ngaâm tieâu baûn vaøo dung dòch taåy maøu (chuù yù trong quaù trình ngaâm phieán phaûi thay dung dòch taåy maøu thöôøng xuyeân). Caån thaän traùnh laøm bieán daïng phieán thaïch hoaëc bong agarose.

 EÙp khoâ tieâu baûn.

IV. NHÖÕNG ÑIEÅM CAÀN LÖU YÙ

Khoâng ñeå hoùa chaát daây vaøo tay, quaàn aùo

Laøm thí nghieäm, sinh vieân phaûi mang gaêng tay

V. YEÂU CAÀU

- Noäp laïi cho cán bộ hướng dẫn maãu keát quaû

Bài giảng TH CNSHĐV

Baøi 2

PHÖÔNG PHAÙP THU NHAÄN HUYEÁT THANH TÖØ MAÙU NGÖÔØI VAØ ÑOÄNG VAÄT

I. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT

a. Ñònh nghóa

Huyeát thanh laø huyeát töông khoâng coù fibrinogen vaø moät soá yeáu toá

ñoâng maùu khaùc.

b. Vai troø cuûa huyeát thanh trong Coâng ngheä Sinh hoïc ñoäng vaät

Laø thaønh phaàn quan troïng, khoâng theå thieáu ñoái vôùi moâi tröôøng

nuoâi caáy moâ vaø teá baøo ñoäng vaät. Huyeát thanh coù caùc ñaëc ñieåm:

(1) Cung caáp caùc chaát dinh döôõng quan troïng cho teá baøo nhö caùc amino acid thieát yeáu, tieàn chaát cuûa nucleic acid, caùc nguyeân toá vi löôïng… (2) Cung caáp caùc nhaân toá taêng tröôûng, kích thích cho teá baøo phaân chia. (3) Chöùa caùc protein coù khaû naêng laøm baát hoaït trypsin (moät enzyme ñöôïc söû duïng ñeå taùch teá baøo ñoäng vaät) traùnh hieän töôïng enzyme gaây toån thöông teá baøo. (4) Caûi thieän tính tan cuûa caùc chaát dinh döôõng. (5) Caûi thieän tính dính cuûa teá baøo leân beà maët bình nuoâi nhôø caùc yeáu toá laøm taêng ñoä dính cuûa teá baøo leân giaù ñôõ. (6) Choáng oxy hoùa: huyeát thanh coù tính khaùng oxy maïnh vaø öùc cheá ñoäc tính cuûa oxy.

Huyeát thanh coøn laø nguyeân lieäu haøng ñaàu trong ñieàu cheá vaccin vaø coâng nghieäp döôïc phaåm noùi chung.

c. Nguyeân taéc thu nhaän huyeát thanh

Maùu töôi vöøa ñöôïc laáy ra tröïc tieáp töø cô theå ñoäng vaät thöôøng ñöôïc ñeå yeân trong vaøi giôø, trong suoát thôøi gian naøy fibrinogen chuyeån thaønh fibrin gel (cuïc maùu ñoâng). Cuïc maùu ñoâng naøy co daàn laïi vaø laøm chöøa ra phaàn dòch loûng hay huyeát thanh cuûa maùu. Ngöôøi ta thu nhaän laáy phaàn dòch loûng naøy trong ñieàu kieän voâ truøng.

Bài giảng TH CNSHĐV

Caùc böôùc thieát yeáu trong vieäc thu nhaän huyeát thanh bao goàm:

- Thu nhaän maùu töø cô theå. - Taïo cuïc maùu ñoâng trong bình chöùa. - Taùch huyeát thanh khoûi cuïc maùu ñoâng baèng loïc vaø ly taâm. - Tinh saïch, baûo quaûn.

II. NGUYEÂN LIEÄU, HOÙA CHAÁT, DUÏNG CUÏ

1. Hoùa chaát

- Hoùa chaát baûo quaûn: merthiolate caàn ñöôïc söû duïng vôùi noàng ñoä sao cho vieäc boå sung chuùng vaøo huyeát thanh seõ khoâng laøm loaõng huyeát thanh.

- Maãu maùu (thu nhaän töø thoû).

2. Duïng cuï - thieát bò

a. Duøng cho vieäc thu maùu  Thoû 2,5kg hoaëc naëng hôn (khoâng cho aên trong 12 giôø tröôùc ñoù ñeå

huyeát thanh thu ñöôïc ít lipid nhaát).

 Baøn coät thoû, 4 ñoaïn daây coät.  Dao caïo môùi.  Keùo, pince y teá.  Boâng goøn + coàn 70o.  Boä duïng cuï laáy maùu:

+ Kim tieâm voâ truøng, 18G, 2in. + OÁng daãn nhöïa hoaëc cao su. + OÁng nghieäm voâ truøng coù saün naép ñaäy.

 Ñeøn boùng troøn 15W (ñaët beân döôùi tai thoû, laøm noùng ñeå maùu

khoâng ñoâng nhanh trong quaù trình laáy maùu).

 Baêng keo y teá.  Chai ñöïng maùu coù naép ñaäy (ñaõ haáp khöû truøng).  10.Giaù ñeå oáng nghieäm.  11.Gaêng tay, khaåu trang vaø quaàn aùo baûo hoä.  12.Ñoà caáp cöùu caù nhaân.

b. Duøng cho vieäc thu nhaän huyeát thanh  Tuû laïnh.  Que goã voâ truøng.

Bài giảng TH CNSHĐV

 Micropipette 100-1000l + tip.  Maùy li taâm oáng nghieäm.  Chai thuûy tinh coù naép vaën ñeå chöùa huyeát thanh (voâ truøng).  Pheãu loïc + giaáy loïc (voâ truøng).  Milipore filter (maøng loïc) 0,22-0,45m.  Thieát bò laøm laïnh saâu (-800C  -200C).  Giaáy hoaëc khaên lau saïch.

III. TIEÁN HAØNH THÍ NGHIEÄM

1. Phöông phaùp thu maùu

a. Coá ñònh thoû naèm uùp treân baøn thao taùc b. Caïo loâng treân tai thoû ñeå coù theå nhìn thaáy roõ tónh maïch tai. c. Ñeå laáy maùu deã daøng, caàn laøm giaõn nôû maïch baèng caùch duøng ñeøn boùng troøn 15W laøm aám maët trong cuûa tai thoû. d. Saùt truøng nôi ñònh laáy maùu treân tai thoû. e. Ghim kim tieâm vaøo tónh vaïch theo chieàu höôùng vaøo goác tai thoû (ngöôïc vôùi chieàu chaûy cuûa maùu). f. Giöõ thoû naèm yeân vaø thu maùu vaøo oáng nghieäm voâ truøng gaén vôùi kim tieâm qua oáng daãn. g. Phöông phaùp naøy coù theå thu ñöôïc ñeán 20ml maùu thoû (moät con, moät laàn). Neáu maùu ngöng chaûy, buùng nheï vaøo tónh maïch tai ñeå coù theå tieáp tuïc thu maùu. h. Sau khi thu ñuû theå tích maùu caàn duøng, ñaët goøn hoaëc gaïc leân veát caét, duøng ngoùn caùi vaø ngoùn troû ñeå eùp chaët veát thöông laïi. i. Duøng baêng keo ñeå giöõ mieáng gaïc ñuùng vò trí. j. Thu huyeát thanh theo quy trình beân treân. k. Xöû lyù vaø baûo quaûn.

2. Thu nhaän huyeát thanh

a. Ñeå yeân maãu maùu trong 1-2 giôø ôû nhieät ñoä phoøng nhaèm taïo cuïc maùu ñoâng. Caån thaän taùch cuïc maùu ñoâng khoûi thaønh oáng nghieäm baèng thìa theùp hoaëc que goã. Giöõ oáng nghieäm ñöïng maùu trong tuû laïnh trong voøng 12-24 giôø ñeå cuïc maùu ñoâng co laïi.

b. Gaïn laáy phaàn huyeát thanh vaøo caùc oáng nghieäm saïch vaø li taâm vôùi toác ñoä 1000xg trong 30 phuùt ôû 4oC (khoaûng 2500 voøng ñoái vôùi

Bài giảng TH CNSHĐV

rotor coù baùn kính 14cm). Caån thaän laáy huyeát thanh ra baèng caùch gaïn laáy phaàn dòch trong beân treân hoaëc duøng pipette huùt ra

c. Thöôøng thì huyeát thanh thu ñöôïc ôû laàn li taâm ñaàu tieân chöùa moät ít baïch caàu, ñeå loaïi nhöõng teá baøo naøy, caàn li taâm laëp laïi caùc saûn phaåm ñaõ thu ôû laàn ly taâm thöù nhaát nhö moâ taû treân.

e. Khöû truøng huyeát thanh thu ñöôïc baèng phöông phaùp loïc f. Theâm chaát baûo quaûn, sau ñoù baûo quaûn laïnh ñeå giöõ ñöôïc huyeát

thanh trong nhieàu ngaøy.

g. Ñeå thuaän lôïi cho vieäc löu giöõ huyeát thanh vaø do moãi khi söû duïng chæ caàn moät löôïng nhoû, huyeát thanh caàn ñöôïc chia vaøo nhieàu chai ñöïng coù kích thöôùc nhoû. Ñaây laø ñieàu baét buoäc khi thöïc hieän löu tröõ huyeát thanh ôû traïng thaùi ñoâng laïnh. IV. NHÖÕNG ÑIEÅM CAÀN LÖU YÙ

 Trong quaù trình laøm caàn thaät nheï nhaøng, traùnh gaây laéc maïnh oáng

ñöïng maùu khieán vôõ teá baøo hoàng caàu.

 Sau khi laáy maùu (khoâng quaù 10ml) thì phaûi khöû truøng veát thöông

treân tai thoû ngay vaø baêng laïi.

 Khöû truøng toaøn boä duïng cuï.

 Tröôùc khi li taâm phaûi caân ñoái troïng cho ñeàu caùc oáng nghieäm

V. YEÂU CAÀU

- Huyeát thanh coù maøu vaøng nhaït ñeàu, trong suoát, ít coù hoàng caàu vôõ. - Khoâng coù lôùp môõ vaùng beân treân. - Khoâng coù lôùp caën döôùi ñaùy chai ñöïng. - Khoâng coù boït khí hoaëc vaät laï hoaëc caùc sôïi huyeát lô löûng. - Huyeát thanh thu ñöôïc ñaûm baûo voâ truøng.

+ Dòch nuoâi caáy ñuïc so vôùi ban ñaàu: coù söï hieän dieän cuûa vi sinh vaät

trong maãu huyeát thanh.

+ Dòch nuoâi caáy khoâng ñoåi so vôùi ban ñaàu: khoâng coù söï hieän dieän

cuûa vi sinh vaät trong maãu huyeát thanh.

- Cuõng coù theå kieåm tra vi sinh vaät baèng caùch caáy maãu ñeå theo doõi

söï phaùt trieån cuûa caùc khuaån laïc

Bài giảng TH CNSHĐV

Thu maùu

Ñeå yeân 1-2h, to phoøng

Taùch cuïc maùu ñoâng khoûi thaønh chai ñöïng

Ñeå laïnh 4oC, 12-24h

Gaïn laáy phaàn huyeát thanh cho vaøo chai ñöïng

Ly taâm 1000g, 30 phuùt, to=40oC

Huùt dòch trong ra

Laëp laïi 2-3 laàn

Ly taâm 4oC, 50.000g, 20 phuùt

Loïc qua giaáy loïc nhaùm

Loïc voâ truøng

Chia thaønh caùc maãu nhoû

BAÛO QUAÛN ÔÛ –20OC

QUY TRÌNH THU NHAÄN HUYEÁT THANH.

Bài giảng TH CNSHĐV

Baøi 3 TAÙCH TEÁ BAØO TÖØ MOÂ ÑOÄNG VAÄT BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP TRYPSIN

I. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT

1. Nuoâi caáy sô caáp (primary culture)

Nuoâi caáy sô caáp laø giai ñoaïn nuoâi caáy ñaàu tieân nhöõng teá baøo vöøa ñöôïc taùch ra töø moâ hay cô quan. Caùc teá baøo thu ñöôïc trong laàn nuoâi sô caáp naøy ñöôïc goïi laø teá baøo sô caáp (primary cell). Caùc teá baøo sô caáp thöôøng khoâng thuaàn nhaát vì laø haäu dueä cuûa nhieàu teá baøo ban ñaàu khaùc nhau. Ñeå thöïc hieän quaù trình nuoâi caáy sô caáp teá baøo ñoäng vaät, böôùc ñaàu tieân laø taùch chuùng thaønh caùc teá baøo rieâng reõ töø nhöõng maûnh moâ vaø cho chuùng baùm vaøo giaù theå phuø hôïp. Vieäc taùch teá baøo coù theå thöïc hieän baèng bieän phaùp cô hoïc hay baèng enzym ñeå taïo thaønh moät dòch huyeàn phuø teá baøo. Haàu heát caùc loaïi teá baøo ñoäng vaät bình thöôøng (tröø teá baøo maùu) ñeàu caàn baùm vaøo moät giaù theå ñeå soáng vaø phaùt trieån vôùi hieäu quaû cao nhaát. Tuy nhieân, nhöõng teá baøo ung thö coù theå phaùt trieån ôû traïng thaùi lô löûng trong moâi tröôøng. Coù nhieàu loaïi enzym ñöôïc söû duïng ñeå taùch teá baøo nhö collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase…nhöng trypsin ñöôïc duøng phoå bieán nhaát vì hieäu quaû taùch teá baøo cao vaø giaù reû. Trypsin coù theå taùch hoaøn toaøn teá baøo töø moâ baèng caùch thuûy phaân caùc protein lieân keát caùc teá baøo vôùi nhau. Tuy nhieân trypsin cuõng coù theå laøm toån thöông maøng teá baøo trong quaù trình taùch, do ñoù caàn phaûi xaùc ñònh noàng ñoä enzym vaø thôøi gian taùch toái öu.

Caùc nhaø khoa hoïc thöôøng mong muoán coù theå tieán haønh nghieân cöùu moät chöùc naêng nhaát ñònh cuûa moät moâ hay moät teá baøo trong moät heä thoáng ñôn giaûn. Ñeå thöïc hieän ñieàu naøy, ngöôøi ta tìm caùch taùch teá baøo ra khoûi moâ noäi quan cuûa cô theå vaø tieán haønh nuoâi caáy chuùng trong ñieàu kieän nhaân taïo. Ñaây laø kyõ thuaät cô baûn trong nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät. Baèng kyõ thuaät taùch teá baøo ñoäng vaät, chuùng ta coù theå laøm chuû ñöôïc nhöõng doøng teá baøo taïm thôøi hay lieân tuïc, töø ñoù coù nhöõng öùng duïng quan troïng veà sau.

Bài giảng TH CNSHĐV

Teá baøo sô caáp laø caùc teá baøo ñöôïc taùch ra laàn ñaàu tieân vaø chöa heà qua nuoâi caáy. Caùc teá baøo naøy coù theå taïo lôùp ñôn. Ngöôøi ta coù theå duøng caùc teá baøo lôùp ñôn ñeå thöïc hieän caùc test vi sinh vaät vaø mieãn dòch. Moãi lôùp ñôn cuûa caùc teá baøo sô caáp thöôøng raát nhieàu chuûng loaïi, coù theå tìm kieám ñöôïc caùc teá baøo maàm trong lôùp ñôn khi phaân laäp vaø ñem caáy chuyeàn nhieàu laàn.

Vieäc taùch teá baøo theo phöông phaùp söû duïng enzyme cho pheùp coù theå thu ñöôïc moät löôïng lôùn teá baøo rôøi trong thôøi gian ngaén. Nhôø ñoù, vieäc nuoâi caáy sô caáp coù nhieàu thuaän lôïi vaø tieát kieäm ñöôïc thôøi gian, do coù söï taêng cöôøng khaû naêng tieáp xuùc giöõa caùc teá baøo vôùi moâi tröôøng.

Tuy nhieân, ñieàu quan troïng caàn chuù yù laø phaûi laøm giaûm ñeán möùc thaáp nhaát söï tieáp xuùc giöõa teá baøo vôùi trypsin hoaït ñoäng, nhaèm giöõ cho tyû leä soáng cuûa teá baøo caøng cao caøng toát.

+ Do ñoù trong quaù trình taùch teá baøo baèng trypsin ôû 36,5oC thì caùc teá baøo rôøi caàn ñöôïc thu moãi 30 phuùt. Trypsin ñöôïc loaïi ra baèng caùch ly taâm vaø hoaït tính bò öùc cheá do huyeát thanh hieän dieän trong moâi tröôøng.

+ Quy trình taùch teá baøo baèng caùch ngaâm moâ trong trypsin ôû 4oC, 6- 18 giôø seõ cho pheùp trypsin thaám vaøo khoái moâ vôùi hoaït tính trypsin thaáp nhaát vaø quaù trình phaân giaûi coù theå tieán haønh tieáp theo ñoù vôùi thôøi gian ngaén hôn nhieàu (20-30 phuùt), ôû 37oC.

Maëc duø phöông phaùp söû duïng trypsin laïnh cho pheùp thu ñöôïc nhieàu teá baøo soáng vaø teá baøo cuõng ít bò aûnh höôûng cuûa trypsin hôn, nhöng phöông phaùp söû duïng trypsin aám vaãn ñöôïc söû duïng moät caùch roäng raõi do ít toán thôøi gian vaø ít phöùc taïp hôn.

Bài giảng TH CNSHĐV

II. NGUYEÂN LIEÄU, HOÙA CHAÁT, DUÏNG CUÏ

1.Vaät lieäu: Gan boø

Bài giảng TH CNSHĐV

2. Hoùa chaát

-Dung dòch PBS. -Dung dòch trypsin 1%. -Moâi tröôøng nuoâi caáy (E'MEM-10% huyeát thanh).

3. Duïng cuï- thieát bò

-Erlen 50ml voâ truøng. -Pipetman 200 -1000l. -Pipetman 10 -100l. -Ñaàu tip voâ truøng. -Maùy laéc. -Keùo nhïn voâ truøng. -Ñóa petri voâ truøng. -Becher 250ml. -Pipette 1ml, 2ml, 5ml voâ truøng. -Boùp cao su (loaïi nhoû). -Boùp cao su (caùc loaïi). -Kính hieån vi. -Buoàng ñeám teá baøo. -Maùy Vortex. -Maùy saáy. -Lamelle.

III. TIEÁN HAØNH THÍ NGHIEÄM

1. Taùch teá baøo

a) Caân 3 maãu moâ gan, moãi maãu 5g. Röûa maãu trong ñóa Petri voâ

truøng baèng dung dòch PBS 3 laàn, huùt boû dòch röûa.

b) Cho 3 maãu gan vaøo 3 erlen voâ truøng, caét nhuyeãn moâ gan baèng

keùo voâ truøng.

c) Cho vaøo moãi erlen (ñaùnh soá 1, 2, 3). -Erlen 1: 18ml PBS + 2ml trypsin 1%. -Erlen 2: 15ml PBS + 5ml trypsin 1%. -Erlen 3: 12ml PBS + 8ml trypsin 1%. Nhö vaäy, ta ñöôïc 3 dung dòch trypsin coù noàng ñoä 0,1; 0,25;

0,4% töông öùng vôùi erlen 1, 2, 3.

d) Laéc caùc erlen maãu treân maùy laéc.

Bài giảng TH CNSHĐV

Hình : Teá baøo ñoäng vaät trong phoøng ñeám.

e) Sau 60, 90, 120 phuùt, laáy maãu ôû moãi erlen vaø xaùc ñònh maät ñoä teá baøo gan trong dung dòch baèng buoàng ñeám. Löu yù phaân bieät teá baøo gan vaø teá baøo hoàng caàu.

IV. NHÖÕNG ÑIEÅM CAÀN LÖU YÙ

- Thôøi gian phaûi chính xaùc trong suoát quaù trình laéc vaø ñeám maät ñoä

teá baøo.

- Röûa saïch maùu ñeå traùnh ñeám nhaàm teá baøo maùu trong buoàng ñeám.

V. YEÂU CAÀU

Xaùc ñònh noàng ñoä trypsin vaø thôøi gian toái öu ñeå taùch teá baøo.

Bài giảng TH CNSHĐV

Baøi 4

TAÙCH VAØ NUOÂI CAÁY SÔ CAÁP TEÁ BAØO SÔ PHOÂI GAØ

I. MUÏC ÑÍCH:

 Laøm quen vôùi kyõ thuaät nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät.  Taùch teá baøo töø phoâi gaø vaø nuoâi caáy sô caáp.  Phaân laäp doøng teá baøo cô baûn töø phoâi gaø.  So saùnh keát quaû nuoâi caáy töø hai doøng teá baøo cô.

II. PHÖÔNG PHAÙP TAÏO TEÁ BAØO SÔ CAÁP :

 Teá baøo sô caáp laø teá baøo ñöôïc taùch ra laàn ñaàu tieân vaø chöa heà qua nuoâi caáy. Caùc teá baøo naøy coù theå taïo lôùp ñôn. Ngöôøi ta coù theå duøng caùc teá baøo lôùp ñôn ñeå thöïc hieän caùc test vi sinh vaät vaø mieãn dòch. Moãi lôùp ñôn cuûa caùc teá baøo sô caáp thöôøng raát nhieàu chuûng loaïi, coù theå tìm kieám ñöôïc caùc teá baøo maàm trong lôùp ñôn khi phaân laäp vaø ñem caáy chuyeàn nhieàu laàn.

 Vieäc taùch teá baøo theo phöông phaùp söû duïng enzyme cho pheùp coù theå thu ñöôïc moät löôïng lôùn teá baøo rôøi trong thôøi gian ngaén. Nhôø ñoù, vieäc nuoâi caáy sô caáp coù nhieàu thuaän lôïi vaø tieát kieäm ñöôïc thôøi gian, do coù söï taêng cöôøng khaû naêng tieáp xuùc giöõa caùc teá baøo vôùi moâi tröôøng maø vieäc taùch teá baøo cuõng trôû neân deã daøng hôn.

 Tuy nhieân, ñoái vôùi phöông phaùp naøy, ñieàu quan troïng caàn chuù yù laø phaûi laøm giaûm ñeán möùc thaáp nhaát söï tieáp xuùc giöõa teá baøo vôùi enzyme Trypsin hoaït ñoäng, nhaèm giöõ cho tyû leä soáng cuûa teá baøo caøng cao caøng toát. Ñeå thöïc hieän ñieàu naøy chuùng ta coù 2 phöông phaùp: + Qui trình Trypsin aám: Trong quaù trình taùch teá baøo baèng Trypsin ôû 36,50C, caùc teá baøo seõ ñöôïc taùch rôøi vaø ñöôïc thu nhaän sau 30 phuùt. Trypsin ñöôïc loaïi ra baèng caùch li taâm, loïc baèng giaáy loïc. Sau ñoù, cho vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Hoaït tính bò öùc cheá do huyeát thanh hieän dieän trong moâi tröôøng.

Bài giảng TH CNSHĐV

 Maëc duø phöông phaùp söû duïng Trypsin laïnh cho pheùp thu ñöôïc nhieàu teá baøo soáng vaø teá baøo cuõng ít bò aûnh höôûng cuûa Trypsin hôn , nhöng phöông phaùp söû duïng Trypsin aám vaãn ñöôïc söû duïng moät caùch roäng raõi do ít toán thôøi gian vaø ít phöùc taïp hôn .

+ Qui trình Trypsin laïnh: Quaù trình taùch teá baøo baèng caùch ngaâm moâ trong trypsin baèng 40 C trong 6- 18 giôø seõ cho pheùp Trypsin ngaám vaøo khoái moâ vôùi hoaït tính Trypsin ôû möùc thaáp nhaát. Sau khi loaïi boû Trypsin, quaù trình phaân giaûi coù theå tieán haønh baèng caùch uû aám oáng chöùa moâ ôû 36.50 C vôùi thôøi gian ngaén hôn nhieàu (20-30 phuùt).

 Coù moät soá phöông phaùp taùch baèng cô hoïc thuaàn tuùy, tuy nhieân caùc

phöông phaùp naøy khoâng ñem laïi hieäu quaû cao. ÔÛ baøi naøy, chuùng ta söû duïng qui trình Trypsin aám ñeå taùch teá baøo phoâi gaø vaø tieán haønh nuoâi caáy sô caáp nhöõng teá baøo naøy.

II.1. Duïng cuï

 Khay inox  Mieáng loùt cao su  2 boä duïng cuï moå (keùo thaúng, keùo cong, pinch thaúng, pinch cong)  Oáng nghieäm  Ñóa petri (ñöôøng kính 10cm)  Becher 50ml vaø 100ml  Erlen 50 ml  Eppendorf 1500l  Kim tieâm 1ml  Tip 10 - 100l vaø 100 - 1000l  Lame  Pipette (1ml, 2ml, 5ml, 10ml)  Micropipette (10 - 100l vaø 100 - 1000l)  Pipettus - Junior  Phoøng ñeám teá baøo NEUBAUER  Ñóa nuoâi caáy 4 gieáng, ñóa petri nuoâi caáy teá baøo  Ñeøn coàn  Goøn khoâng thaám, goøn thaám, vaûi muøng, giaáy loïc  Oáng ñong 100ml, 500ml, 1000ml  Bình ñònh möùc 100ml  Chai thuûy tinh nuùt nhaùm 100ml

Bài giảng TH CNSHĐV

II.2. Thieát bò

 Phoøng voâ truøng  Caân ñieän töû  pH keá  Autoclave  Phin loïc (filter)  Tuû laïnh  Tuû caáy voâ truøng

II.3. Hoùa chaát

II.3.1. Dung dòch PBS (Phosphate Buffered Saline)

 NaCl :10g  KCl : 0,25g  Na2HPO4.12H2O: 3,6g  KH2PO4 : 0,255g  Nöôùc caát : ñuû 1.000ml

II.3.2. Dung dòch L - Glutamine 200mM

 L-glutamine: 7,25g  NaCl : 5g  Nöôùc caát : ñuû 500ml

II.3.3. Penicillin - Streptomycin 200X

 Penicillin G : 1.000.000 ñôn vò  Streptomycin sulfate: 1g  PBS : ñuû 50ml

II.3.4. Amphotericin B 0,1%

 Amphotericin B voâ truøng: 100mg  Nöôùc caát voâ truøng : 100ml

II.3.5. Bicarbonate 7,5%

 NaHCO3: 7,5g  Nöôùc caát: ñuû 100ml Boå sung: _100l Pen-strep 200X _ 20l Ampotericin B

Bài giảng TH CNSHĐV

II.3.6. HEPES 1M

 HEPES : 11,915g  Nöôùc caát: ñuû 50ml

II.3.7. Phenol Red 0,4%

 Phenol red: 0,2g  Nöôùc caát : 50ml

II.3.8. Dung dòch NH4Cl 10X

 NH4Cl : 8,4g  Nöôùc caát: 100ml

II.3.9. Moâi tröôøng E'MEM 5%

 E’MEM : 4,72g E'MEM coù thaønh phaàn nhö sau:

Thaønh phaàn Noàng ñoä (mg/l) 200. 0 Muoái voâ cô CaCl2

KCl 400. 0

200. 0 MgSO4. 7 H2O

NaCl 6800. 0

2200. 0 NaHCO3

140. 0 NaH2PO4.H2O

Glucose D-Glucose 1000. 0

126. 0 Amino acid L-Arginine .HCl

L-Cystine 24. 0

L-Glutamin 292. 0

42. 0

L-Histidine. HCl. H2O L-Isoleucine 52. 0

L-Leucine 52. 0

73. 1 L-Lysine. HCl

L-Methyonine 15. 0

L-Phenylalanine 33. 0

Bài giảng TH CNSHĐV

L-Threonine 48. 0

L-Tryptophane 10. 0

L-Tyrosine 36. 0

L-Valine 47. 0

Vitamin D-Ca pantothenate 1. 0

Choline chloride 1. 0

Acid Folic 1. 0

I-Inositol 2. 0

Nicotinamide 1. 0

Pyridoxal HCl 1. 0

Riboflavine 0. 1

Thyamine HCl 1. 0

 Phenol Red 0,4% : 1ml  NaHCO3 7,5% voâ truøng : 7,5ml  HEPES 1M voâ truøng : 10ml  Amphotericin B voâ truøng: 125l  Pen-strep 200X : 2,5ml  Glutamine 200mM : 5ml  Huyeát thanh : 50ml (FBS: Fetal Bovine Serum)

 Nöôùc caát : ñuû 500 ml

Bài giảng TH CNSHĐV

Caùc teá baøo ñaõ baùm vaø moïc taïi beà maët nuoâi caáy.

III. KEÁT QUAÛ VAØ BIEÄN LUAÄN:

 Treân ñaây laø nhöõng hình aûnh ghi nhaän ñöôïc trong quaù trình taùch teá

baøo cô cuûa phoâi gaø ñeå nuoâi caáy sô caáp.

 Ñeå xaùc ñònh noàng ñoä teá baøo ñem ñi nuoâi caáy, ta söû duïng phöông

phaùp ñeám baèng phoøng ñeám hoàng caàu. Keát quaû ghi nhaän ñöôïc: + Trung bình moät oâ nhoû ôû phoøng ñeám treân ta coù: 0.7125 teá baøo + Dieän tích moät oâ nhoû laø : 0.0025 mm2 + Chieàu cao moät oâ nhoû : 0.1 mm

Theå tích moät oâ nhoû : 0.0025 x 0.1 = 0.00025 mm3 Vaäy maät ñoä ñem ñi nuoâi caáy laø : 0.7125 : 0.00025 = 2850 teá

baøo/mm3 Maät ñoä teá baøo ñem ñi nuoâi caáy: 2850 x 1000 = 285 x 104 teá baøo/ml

(vì 1 ml = 1 cm3)

Bài giảng TH CNSHĐV

Vaäy maät ñoä teá baøo ñem ñi nuoâi caáy khoaûng: 285 x 104 teá baøo/ml

IV. NHAÄN XEÙT VAØ PHAÂN TÍCH KEÁT QUAÛ:

 Ta thaáy maät ñoä teá baøo ñem ñi nuoâi caáy thaáp: 285 x 104 teá baøo/ ml.  Vì trong quaù trình söû duïng Trypsin ñeå phaân caét teá baøo, coù theå ta cho noàng ñoä Trypsin hôi cao hoaëc trong thôøi gian khuaáy töø ta ñeå thôøi gian hôi laâu.

 Maãu coù söï hieän dieän naám do coù söï nhieåm khuaån, do sai soùt trong

thao taùc chöa ñaûm baûo voâ truøng.

giảng TH CNSHĐV

Baøi 5 TEÁ BAØO SINH DUÏC CUÛA ÑOÄNG VAÄT HÖÕU NHUÕ

I. ÑAÏI CÖÔNG

1. Heä sinh duïc ñöïc

a. Caáu taïo

- Tinh hoaøn (testis): coù caáu truùc daïng caëp ñöôïc boïc trong moät tuùi (bìu). Beân trong tinh hoaøn coù nhieàu ngaên, trong moãi ngaên ñeàu laø toå chöùc moâ bieät hoùa vaø sinh saûn tinh truøng.

- Maøo tinh (epididymis): ñöôïc noái vôùi tinh hoaøn, ñaây laø caùc ñöôøng daãn cuûa

tinh truøng.

- OÁng daãn tinh (ductus deferens): noái vôùi caùc oáng maøo tinh. - Tuùi tinh: nôi chöùa tinh truøng vaø tieát dòch troän vôùi tinh truøng taïo tinh dòch.

Tuùi tinh coøn laø nôi taäp keát taïm thôøi cuûa tinh truøng tröôùc khi ra ngoaøi.

- Tuyeán tieàn lieät: saûn xuaát dòch (coù trong thaønh phaàn cuûa tinh dòch) ñöôïc

tieát vaøo tuùi tinh.

- Nieäu ñaïo: naèm trong döông vaät, tinh truøng phoùng ra ngoaøi qua nieäu ñaïo. - Döông vaät: xuaát tinh vaø baøi xuaát nöôùc tieåu.

b. Sinh lyù tinh truøng

Caáu taïo tinh truøng goàm 3 phaàn: ñaàu, thaân vaø ñuoâi. + Phaàn ñaàu: chöùa theå ñænh acrosome, ñaây laø nôi giaûi phoùng caùc enzyme

giuùp cho tinh truøng xaâm nhaäp tröùng.

+ Phaàn thaân: chöùa ty theå, coù lieân quan ñeán caùc hoaït ñoäng chuyeån hoùa chaát

vaø naêng löôïng.

+ Phaàn ñuoâi: coù vai troø vaän ñoäng, khoâng tham gia vaøo quaù trình thuï tinh.

Hình 7.1: Caáu taïo teá baøo tinh truøng.

giảng TH CNSHĐV

Soá löôïng tinh truøng: chieám trung bình 5% theå tích tinh dòch (95% dòch tieát). ÔÛ ngöôøi, trung bình coù 3ml tinh dòch cho moät laàn xuaát tinh soá löôïng trung bình töø 60-120 trieäu teá baøo/ml. Soá löôïng treân ôû boø laø 4-5ml vaø lôïn laø 150-200ml.

Tinh truøng vaän ñoäng baèng caùch töï quaãy ñuoâi. Söï sinh tinh xaûy ra gaàn nhö suoát ñôøi soáng cuûa caù theå ñöïc, tuy nhieân soá

löôïng vaø chaát löôïng teá baøo coù theå thay ñoåi. Cô cheá cuûa söï sinh tinh

GP

NP

Tinh nguyeân baøo Tinh baøo 4 tinh truøng (n)

Ñieàu kieän ñeå quaù trình thuï tinh xaûy ra bình thöôøng: + Tinh truøng gaëp tröùng sau 12 giôø phoùng vaøo oáng daãn tröùng. + Soá löôïng tinh truøng phaûi ñaûm baûo trong 1ml tinh dòch. + Tyû leä % tinh truøng dò daïng khoâng vöôït quaù 2-5%. + Phaàn ñaàu tinh truøng coù chöùa ñuû löôïng enzyme hyaluronidase.

Maøo tinh hoaøn

Daây tinh hoaøn

Maøng cô sôû

Tinh nang

Voû bao tinh hoaøn

OÁng daãn tinh

OÁng OÁng sinh sinh tinh tinh

Teá baøo tinh truøng

Teá baøo Sertoli

Vaùch Vaùch ngaên ngaên

Hình 7.2: Caáu taïo tinh hoaøn (a) vaø söï sinh tinh (b). 2. Heä sinh duïc caùi a. Caáu taïo

Buoàng tröùng: nôi chöùa caùc nang tröùng.

giảng TH CNSHĐV

Voøi töû cung (oáng daãn tröùng): nôi tröùng gaëp tinh truøng vaø thuï tinh (ôû 1/3 oáng

daãn tröùng).

Töû cung: cô quan ñeå thai laøm toå vaø phaùt trieån. AÂm ñaïo: cô quan giao hôïp. Moät soá cô quan phuï (thöù caáp) khaùc.

b. Sinh lyù buoàng tröùng

Buoàng tröùng caáu taïo daïng caëp, goàm 2 phaàn voû vaø tuûy. Phaàn voû chöùa caùc teá baøo tröùng ñaõ phaùt trieån, phaàn tuûy coù nhieàu maïch maùu vaø baïch huyeát, moät soá teá baøo phuï trôï khaùc. Caùc tröùng non naèm döôùi maøng lieân keát (nang nguyeân thuûy).

Hình 7.3: Buoàng tröùng vaø söï phaùt trieån caùc giai ñoaïn cuûa tröùng.

ÔÛ ngöôøi, khi sô sinh coù khoaûng 3.104-3.105 nang tröùng nguyeân thuûy. Khi tröôûng thaønh coøn 400-500 nang.

Hình 7.4: Thôøi ñieåm kích hoaït hormon cho tôùi khi ruïng tröùng.

giảng TH CNSHĐV

GP2

Caùc teá baøo sinh duïc tröôûng thaønh khoâng theå hieän ñaày ñuû caùc cô quan noäi

Kích thöôùc caùc teá baøo sinh duïc tröôûng thaønh thöôøng lôùn hôn caùc teá baøo

Trong moät giai ñoaïn phaùt trieån nhaát ñònh, chuùng coù theå khoâng caàn giaù

Trong quaù trình phaùt trieån luoân xuaát hieän caùc caáu truùc ñaëc thuø daønh cho

Noaõn nguyeân baøo NP Noaõn baøo caáp 1 GP1 Noaõn baøo caáp 2 + Theå cöïc I (khi tinh truøng xaâm nhaäp tröùng) Tröùng + Theå cöïc II 3. Ñaëc ñieåm cô baûn cuûa caùc teá baøo sinh duïc. Moät trong caùc ñaëc ñieåm cuûa teá baøo sinh duïc tröôûng thaønh ôû sinh vaät noùi chung laø boä nhieãm saéc theå ñôn boäi (n). Ñaây laø keát quaû cuûa hai laàn phaân chia giaûm nhieãm tröôùc khi thuï tinh. baøo nhö caùc teá baøo soma. khaùc. theå baùm dính. Ñieàu naøy trong nuoâi caáy in-vitro thuaän lôïi hôn teá baøo soma. chöùc naêng thuï tinh (theå cöïc, maøng thuï tinh…). 4. Söï thuï tinhôû ñoäng vaät höõu nhuõ

Tinh truøng ñöôïc phoùng vaøo aâm ñaïo ñi theo oáng daãn tröùng. Luùc naøy tröùng ñaõ di chuyeån ñöôïc khoaûng 1/3 chieàu daøi oáng daãn tröùng. Tinh truøng gaëp tröùng, söï thuï tinh dieãn ra vaø taïo hôïp töû (2n).

Moãi laàn phoùng tinh, soá tinh truøng ñi vaøo voøi tröùng tôùi haøng traêm trieäu, tuy nhieân chæ coøn chöøng vaøi ngaøn teá baøo vaøo ñöôïc tôùi vò trí thuï tinh. Theá nhöng khi gaëp tröùng thì chæ coøn vaøi traêm tinh truøng. Tieán haønh thuï tinh thì chæ coù 1 tinh truøng.

Tinh truøng tieát enzyme hyaluronidase phaù maøng trong suoát cuûa tröùng, nhôø vaäy phaàn ñaàu tinh truøng chui ñöôïc vaøo tröùng. Luùc naøy, tinh truøng loaïi boû phaàn ñuoâi.

Trong lónh vöïc thuï tinh nhaân taïo treân ngöôøi vaø ñoäng vaät, vieäc thu nhaän ñöôïc soá löôïng lôùn caùc teá baøo sinh duïc goàm teá baøo tröùng vaø tinh truøng laø moät yeâu caàu thieát yeáu. Caùc teá baøo sinh duïc thu nhaän ñöôïc phaûi ñaûm baûo caùc yeâu caàu veà chaát löôïng nhaèm ñaït keát quaû toát cho thuï tinh in-vitro.

giảng TH CNSHĐV

Tröùng coù theå thu nhaän töø ñoäng vaät ñöôïc kích hoaït baèng kích duïc toá gaây söï ruïng tröùng goàm coù PMSG (Pregnant-Mare’s-Serum-Gonadotrophin) vaø hCG (Human Chorionic Gonadotrophin) hoaëc töø buoàng tröùng ñoäng vaät gieát moå.

Tröùng thu nhaän töø caùc ñoäng vaät ñöôïc kích hoaït baèng kích duïc toá laø nhöõng tröùng ñaõ thaønh thuïc (tröùng chín), töùc saün saøng cho söï thuï tinh neáu gaëp tinh truøng. Ngöôøi ta thu tröùng baèng phöông phaùp noäi soi ñoái vôùi nhöõng ñoäng vaät lôùn. Trong tröôøng hôïp thí nghieäm ôû chuoät, khoâng theå tieán haønh noäi soi, ngöôøi ta coù theå gieát chuoät ñeå thu nhaän tröùng chín vaø ruïng töø caùc oáng daãn tröùng.

Tröùng thu nhaän töø buoàng tröùng ñoäng vaät gieát moå (heo, boø…) laø caùc tröùng chöa chín, do ñoù caàn ñöa tröùng vaøo moâi tröôøng nuoâi chín. Trong moâi tröôøng naøy ngöôøi ta caàn boå sung caùc yeáu toá dinh döôõng vaø caùc loaïi hormon…ñeå kích thích söï chín cuûa tröùng.

Söï chín cuûa tröùng coù nghóa laø coù söï thay ñoåi hình thaùi hoïc, sinh hoùa hoïc ôû teá baøo chaát, nhaân teá baøo vaø caùc boä phaän khaùc, sao cho caùc tröùng naøy coù khaû naêng thuï tinh vaø phaùt trieån thaønh phoâi. Thôøi gian thaønh thuïc vaø chín cuûa tröùng non trong moâi tröôøng nhaân taïo thöôøng töø 24-44 giôø, tuøy loaøi.

Nhö vaäy, thuï tinh nhaân taïo coù theå thöïc hieän ñöôïc caàn hai yeáu toá quan troïng laø thu nhaän ñöôïc nhöõng teá baøo tröùng toát coù khaû naêng thuï tinh vaø nhöõng tinh truøng toát, khoûe.

5. Caùc kyõ thuaät caàn thieát Trong baøi thöïc taäp naøy, sinh vieân thöïc hieän hai kyõ thuaät: thu nhaän teá baøo tröùng töø buoàng tröùng heo vaø ñaùnh giaù moät soá chæ tieâu sinh lyù cuûa tinh dòch heo. Thu nhaän teá baøo tröùng

Thu nhaän teá baøo tröùng töø buoàng tröùng cuûa con vaät: coù theå töø con vaät coøn soáng (qua noäi soi hoaëc giaûi phaãu) hoaëc töø loø moå (caét buoàng tröùng töø ñoäng vaät ñaõ bò gieát).

Kyõ thuaät ñeå laáy tröùng

Thu nhaän buoàng tröùng töø loø moå. Moå buoàng tröùng. Choïc nang tröùng. Huùt nang tröùng. Caét buoàng tröùng thaønh laùt moûng.

a.      Caùc tröùng chöa ñöôïc thuï tinh naøy thöôøng khoâng ñoàng nhaát vaø khoù phaùt trieån thaønh tröùng chín, tyû leä thuï tinh cuûa chuùng raát thaáp. Ñeå coù theå thu nhaän ñöôïc nhöõng teá baøo tröùng coù khaû naêng thuï tinh, ngöôøi ta phaûi nuoâi tröùng vaøo moâi tröôøng thuùc tröùng chín coù boå sung moät soá hormon.

b. Ñaùnh giaù phaân loaïi tröùng

giảng TH CNSHĐV

Theo söï hieän dieän hoaëc ñoä daøy, moûng cuûa teá baøo haït cumulus bao chung quanh tröùng (Teá baøo cumulus- laø caùc teá baøo coù nhieàu haït ñöôïc hình thaønh sau khi tröùng ruïng vaøo oáng daãn. Trong moâi tröôøng nuoâi caáy, lôùp teá baøo naøy cuõng ñöôïc hình thaønh. Caùc teá baøo cumulus coù nhieäm vuï chính laø cung caáp chaát dinh döôõng cho tröùng trong khi chöa ñöôïc thuï tinh. Khi gaëp tinh truøng, lôùp teá baøo naøy bò bong ra. Trong thuï tinh in-vitro, ngöôøi ta phaûi tìm caùch gôõ boû lôùp teá baøo naøy nhöng khoâng ñöôïc gaây toån thöông tröùng).

+ Loaïi A: tröùng coù lôùp teá baøo cumulus bao kín xung quanh. + Loaïi B: tröùng coù lôùp teá baøo cumulus bao vaây moät phaàn. + Loaïi C: tröùng khoâng coù lôùp teá baøo cumulus bao quanh.

Hình 7.6: Tröùng loaïi B.

Hình 7.7: Tröùng loaïi C

Thöôøng chæ duøng tröùng loaïi A ñeå nuoâi caáy vaø thuï tinh nhaân taïo. Hình 7.5: Tröùng loaïi A

Vieäc ñaùnh giaù, phaân loaïi caùc traïng thaùi cuûa tröùng chæ coù tính öôùc leä töông ñoái, tuy nhieân trong thuï tinh in-vitro, ñaây laø tieâu chuaån quan troïng nhaát, ñoàng thôøi cuõng deã nhaän bieát nhaát.

Thu nhaän vaø ñaùnh giaù chaát löôïng tinh dòch Noäi dung chuû yeáu ñeå ñaùnh giaù tinh dòch laø: a. Laáy tinh: ngaøy, thaùng, naêm, giôø laáy tinh; phöông phaùp laáy tinh; nhieät ñoä

khoâng khí, quaù trình vaän chuyeån, baûo quaûn.

b. Ñaùnh giaù ñaïi theå: löôïng xuaát tinh, maøu saéc, muøi, ñoä keo dính, pH, tyû leä dò daïng… Thoâng thöôøng, ngöôøi ta coù cheá ñoä dinh döôõng ñaëc bieät cho con vaät ñöôïc choïn laáy tinh tröôùc ñoù vaøi ngaøy.

c. Ñaùnh giaù vi theå: noàng ñoä tinh truøng, tinh truøng kyø hình, söùc ñeà khaùng cuûa tinh truøng, tyû leä tinh truøng soáng, söùc hoaït ñoäng cuûa tinh truøng (thöôøng tinh dòch ñöôïc kieåm tra ngay baèng kính luùp).

giảng TH CNSHĐV

d. Nhöõng ñaùnh giaù khaùc duøng trong nghieân cöùu: tình traïng acrosome, aùp suaát thaåm thaáu, naêng löïc ñeäm, ñoä nhôùt tyû troïng, heä soá hoâ haáp, söùc soáng beàn, söï chuyeån ñoäng v.v…

e. Gioáng di truyeàn, theå traïng con vaät (thöôøng coù caùc caùn boä chuyeân moân

hoùa vieäc ñaùnh giaù tinh truøng cho coâng ngheä taïo gioáng vaät nuoâi).

Vieäc ñaùnh giaù tinh truøng caàn tieán haønh thaät nhanh, chính xaùc vaø caån thaän.

A. DUÏNG CUÏ – THIEÁT BÒ - Kính hieån vi - Kính luùp - Dao moå - Becher - Lame vaø Lamelle - Ñóa Petri - OÁng huùt - Phoøng ñeám hoàng caàu - OÁng troän baïch caàu - Kim 23G - OÁng mao quaûn

B. HOÙA CHAÁT - MAÃU VAÄT

- Maãu buoàng tröùng heo. - Maãu tinh dòch heo.

- Dung dòch pha loaõng tinh truøng - Dung dòch Tyrode - Thuoác nhuoäm Eosine 1% vaø Nigrosine 10% - Nöôùc caát, alcool

II.CHUAÅN BÒ

III. TIEÁN HAØNH

1. Thu nhaän tröùng töø buoàng tröùng

Buoàng tröùng ñöôïc thu nhaän töø loø moå, ñaët trong nöôùc muoái 9o/oo aám (25- 30oC), coù boå sung khaùng sinh. Chuyeån nhanh veà phoøng thí nghieäm.Tröùng chæ söû duïng ñöôïc trong voøng töø 3 - 4 giôø sau ñoù.

Röûa buoàng tröùng nhieàu laàn baèng nöôùc muoái aám ñeán khi saïch maùu, sau ñoù ñeå buoàng tröùng vaøo nöôùc muoái saïch vaø giöõ ôû 38oC trong ñieàu kieän voâ truøng ñeán khi söû duïng.

Söû duïng moät buoàng tröùng, giöõ buoàng tröùng phía treân becher coù chöùa dung dòch tyrode (khoaûng 50ml) vaø duøng dao moå taïo nhöõng veát caét doïc theo

giảng TH CNSHĐV

nhöõng nang tröùng cho ñeán khi thaáy ñöôïc dung dòch trong buoàng tröùng chaûy vaøo becher.

Nhuùng buoàng tröùng vaøo becher vaø khuaáy maïnh nhieàu laàn cho tröùng coù

theå rôi vaøo dung dòch. Laáy buoàng tröùng ra khoûi becher.

Ñeå tröùng laéng trong 5 phuùt. Duøng pipet huùt boû dung dòch phía treân, chöøa laïi khoaûng 20ml. Caån thaän ôû böôùc naøy, neáu khoâng seõ maát nhieàu tröùng. Neáu khi huùt dung dòch bò xaùo troän, phaûi ngöng laïi vaø ñôïi vaøi phuùt cho tröùng laéng trôû laïi.

Röûa nhö treân hai laàn, chöøa laïi khoaûng 20ml dung dòch ôû ñaùy. Chuyeån dung dòch tyrode coù tröùng vaøo ñóa petri. Soi tröùng döôùi kính luùp, ñaùnh giaù phaân loaïi tröùng. Caên cöù vaøo vuøng teá

baøo cumulus ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng tröùng.

Thu nhaän tröùng baèng duïng cuï huùt tröùng. Tröùng thu nhaän ñöôïc chuyeån vaøo caùc epperdorf coù 1ml Tyrode.

(Chuù yù: laøm nhanh, chuaån vaø traùnh ñeå tröùng quaù laâu ngoaøi khoâng khí).

HÌNH 7.8: CAÙC BÖÔÙC THU NHAÄN TRÖÙNG TÖØ BUOÀNG TRÖÙNG

giảng TH CNSHĐV

HÌNH 7.9: RÖÛA BUOÀNG TRÖÙNG TRONG DUNG DÒCH TYRODE.

Thao taùc moå doïc buoàng tröùng theo thöù töï A,B,C,D. THAO TAÙC VÔÙI TRÖÙNG ÑAÕ ÑÖÔÏC TAÙCH RÔØI

giảng TH CNSHĐV

Loaïi dung dòch Tyrode theo thöù töï A,B,C,D.

Chuyeån dung dòch vaøo ñóa petri-thu tröùng.

2. Ñaùnh giaù tinh dòch

Trong phaàn thöïc taäp naøy, sinh vieân khaûo saùt hai chæ tieâu ñeå ñaùnh giaù vi theå tinh dòch ñoäng vaät: xaùc ñònh noàng ñoä tinh truøng baèng phoøng ñeám hoàng caàu vaø xaùc ñònh tyû leä tinh truøng soáng baèng nhuoäm maøu tinh truøng.

a. Noàng ñoä tinh truøng (C) laø soá tinh truøng hieän dieän xaùc suaát trong 1ml tinh

dòch.

Thöïc hieän vieäc ñeám tinh truøng heo baèng phöông phaùp ñeám hoàng caàu.

+ Pha loaõng tinh truøng trong oáng troän baïch caàu baèng dung dòch pha loaõng

(ñöôïc chuaån bò tröôùc).

+ Ñeám soá löôïng tinh truøng trong 400 oâ nhoû (cuûa 25 oâ lôùn) cuûa phoøng ñeám. (Sinh vieân xem laïi caùch tính trong giaùo trình Thöïc taäp Sinh hoïc ñaïi cöông). Trong phaàn naøy, tinh dòch ñöôïc pha loaõng 20 laàn baèng oáng troän baïch caàu. Coâng thöùc tính nhö sau:

C = 10000xDxN

C: Noàng ñoä tinh truøng trong tinh dòch.

giảng TH CNSHĐV

D: Ñoä pha loaõng tinh dòch N: Soá tinh truøng ñeám ñöôïc.

b. Xaùc ñònh tyû leä tinh truøng soáng

Coù theå ñaùnh giaù tyû leä soáng cuûa tinh truøng baèng caùch nhuoäm tinh truøng (ñang coøn soáng) trong thuoác nhuoäm. Khi nhuoäm, neáu tinh truøng coøn soáng thì ñaàu tinh truøng khoâng baét maøu, ngöôïc laïi,neáu tinh truøng heát thì ñaàu tinh truøng baét maøu hoàng.

+Phöông phaùp nhuoäm baèng thuoác nhuoäm Eosin 0,5%

Troän moät gioït tinh truøng töôi vôùi moät gioït dung dòch Eosin 1% leân moät phieán kính, phuû lamell leân, tieán haønh kieåm tra sau 30 giaây ôû kính hieån vi (vaät kính 40). Quan saùt keát quaû: Tinh truøng soáng khoâng nhuoäm maøu. Tinh truøng cheát nhuoäm maøu ñoû hoàng.

+Phöông phaùp nhuoäm baèng hoãn hôïp Eosin-nigrosin

1. Troän moät gioït tinh truøng vôùi hai gioït Eosin 1%. 2. Sau 30 giaây, theâm ba gioït Nigrosin 10% vaø troän (30 giaây). 3. Ñaët moät gioït maãu leân moät phieán kính vaø traûi ra lôùp moûng. Ñeå maãu khoâ, kieåm tra döôùi kính 10-40. Quan saùt keát quaû: Tinh truøng soáng coù maøu traéng. Tinh truøng cheát nhuoäm maøu ñoû.

(1)

Gioït maãu

(2)

(1)

(2)

Ñaët maãu leân kính hieån vi (x 10), kieåm tra toång soá 100 tinh truøng trong ñoù tính soá löôïng tinh truøng soáng (khoâng baét maøu) vaø suy ra tyû leä phaàn traêm. Neáu tinh truøng soáng ñaït 80% trôû leân, chöùng toû tinh dòch toát, söû duïng ñaït hieäu quaû cao.

(1)

Höôùng keùo lame

) 45o

giảng TH CNSHĐV

Hình 7.10: Caùch keùo tieâu baûn

Hình 7.11: Tinh truøng cheát baét maøu.

1. Thu nhaän soá tröùng töø buoàng tröùng vaøo 3 epperdorf khaùc nhau, theo 3 loaïi

A,B,C. Ghi nhaän ngaøy, thaùng thu nhaän.

2. Xaùc ñònh noàng ñoä tinh truøng, ñeám hai laàn trong phoøng ñeám. 3. Xaùc ñònh phaàn traêm tinh truøng soáng töø tieâu baûn nhuoäm.

IV. YEÂU CAÀU