10/ 21/ 2018
THỰC HÀNH
Vi sinh vật đại cương
(Chương trình POHE)
NỘI DUNG
BÀI 1. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ
NHUỘM MÀU GRAM
BÀI 2. QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT
BÀI 3. PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG
BÀI 4. NUÔI CẤY VI SINH VẬT
BÀI 5. ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CỦA VSV TRÊN CÁC
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
BÀI 6. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG TB VSV
Bài 1: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN SOI TƯƠI
NỘI DUNG:
1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi
2. Quan sát tiêu bản nấm mốc
MỤC ĐÍCH:
Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang học. Nắm được cách
sử dụng
Học cách làm tiêu bản soi tươi (không nhuộm)
Quan sát tiêu bản nấm mốc
II. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi
-Tiêu bản soi tươi: Lấy trực tiếp mẫu đặt lên phiến kính để quan sát, không cần nhuộm
màu.
-Tiêu bản này không thể bảo quản lâu dài
-Thực hành:
+ Phương pháp làm tiêu bản giọt ép (quan sát nấm men)
+ Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc
2.1. Các bước chuẩn bị:
-Mẫu vi sinh vật cần quan sát:
+ Mẫu lỏng: Dung dịch nuôi cấy nấm men Saccharomyces sp.
+ Mẫu rắn: Đĩa nuôi cấy nấm mốc: Aspergillus sp., Rhizopus/Niger, Penicillium
-Các dụng cụ khác: Lam kính, que cấy, ống hút Pasteur, đèn cồn, bút viết kính, panh
kẹp, lamen, dao cắt mẫu …
-Dung dịch soi tươi: Dung dịch phenol
10/ 21/ 2018
2.2. Phương pháp làm tiêu bản giọt ép
Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần.
Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu bản
Bước 2: Sử dụng ống hút Pasteur lấy một giọt mẫu, đặt lên lam kính nhỏ 1 giọt
phenol trộn đều.
Bước 3: Đặt lamen nghiêng 1 góc 45o, từ từ đậy lamen xuống sao cho lamen phủ kín
giọt dung dịch mẫu và không có bọt khí.
Bước 4: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40x
2.3. Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc (soi tươi)
Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần.
Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu bản
Bước 2: Sử dụng que cấy đầu nhọn hoặc dao cắt mẫu cắt một phần thạch có chứa
mẫu đặt lên lam kính
Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 4x và 10x
10/ 21/ 2018
1. Quan sát tiêu bản làm sẵn
+ Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x)
2. Quan sát tiêu bản tự làm
+ Tiêu bản nấm men với vật kính 40x
+ Tiêu bản nấm mốc với vật kính 4 và 10x
3. Mô tả hình thái (yêu cầu vẽ hình)
Hình thái: Cho biết hình thái của nấm men và nấm mốc
Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?, hình thành bào tử gì?
Yêu cầu báo cáo thực hành
Bài 2: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ
NHUỘM MÀU GRAM
NỘI DUNG:
1. Phương pháp làm tiêu bản cố định
2. Phương pháp nhuộm màu Gram
MỤC ĐÍCH:
Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương
pháp nhuộm Gram
-Tiêu bản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái
học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống…
-Tiêu bản này có thể bảo quản lâu dài
-VSV quan sát được giết chết trong quá trình xử lý an toàn cho người quan sát
1.1. Các bước chuẩn bị:
-Chuẩn bị mẫu vật gồm:
+ Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic
+ Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men
- Chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vô trùng, bút viết kính, lam
kính sạch
-Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn lửa đèn cồn để
làm sạch.
+ Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm
I. Phương pháp làm tiêu bản cố định
1.2. Các bước làm tiêu bản cố định
Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết kính vẽ lên một
vòng tròn định vị vùng làm vết bôi.
Bước 2: Làm vết bôi
+ Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt lên vòng tròn
trên lam kính và dàn mỏng ra.
+ Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất đặt lên vòng tròn;
Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống; hòa tan cùng với giọt nước cất
dàn mỏng ra
Bước 3:Làm khô: để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn vài
lần. Mục đích của bước cố định tiêu bản:
-Giết chết vsvan toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu tốt hơn
- Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính khi rửa không bị trôi đi
-Giữ nguyên hình dạng và kích thước khi nhuộm
Lưu ý: + tránh đun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn
+ Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng
10/ 21/ 2018
Tiêu bản sau khi cố định
Cố định tiêu bản
II. Phương pháp nhuộm Gram
2.1. Lịch sử:
-Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram âm và
Gram dương
-Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch phát minh
2.2. Chuẩn bị thuốc nhuộm
-Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet
-Dung dịch cố định màu: Dung dịch lugol
-Dung dịch tẩy màu: Cồn axeton
-Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/ Safranin
-Nước rửa:Nước sạch
2.3. Các bước nhuộm Gram
Gồm 4 bước
Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bôi để 1-2 phút. Sau đó rửa thuốc nhuộm thừa với
nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi nước chảy ra
không còn màu tím
Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi, để 1 phút Rửa với nước
sạch vẩy khô
Bước 3: Tẩy màu với cồn axeton: Nghiêng phiến kính 45o, để cồn chảy từ đầu đến cuối phiến kính
cho đến khi không còn màu tím. Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô.
Bước 4: Nhuộm màu với đỏ Fuchsin: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút Rửa thuốc
nhuộm thừa với nước sạchlàm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn
Lactobacillus sp. (gram +)
E. coli (gram -) Salmonella (gram -)
Pseudomonas (gram -)
Staphylococcus aureus (gram +) Bacillus cereus (gram +)
10/ 21/ 2018
Nấm men Saccharomyces
Nấm men nảy chồi (mũi tên)
Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên)
nảy chồi (mũi tên)
1. Mô tả và thực hành được phương pháp làm tiêu bản cố định
+ Tiêu bản vi khuẩn lactic
+ Tiêu bản nấm men
2. Thực hành phương pháp nhuộm Gram với 2 tiêu bản tự làm
+ Trình bày trình tự các bước nhuộm Gram
+ Cho biết tại sao khi nhuộm màu vi khuẩn lại có tính chất bắt màu Gram khác
nhau?
+ Trong trường hợp nào, khi nhuộm Gram chỉ cần sử dụng 1 loại thuốc nhuộm?
Yêu cầu báo cáo thực hành
Bài 3: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT
NỘI DUNG:
1. Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi quang học
2. Quan sát tiêu bản nhuộm
MỤC ĐÍCH:
Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương
pháp nhuộm Gram
Quan sát một số hình thái cơ bản của nấm mốc, vi khuẩn và
nấm men
I. Sử dụng kính hiển vi quang học (light microscope)
1.1. Cấu tạo kính hiển vi quang học