Bài giảng Thực hành vi sinh vật thực phẩm

Ố Ụ

ƯƠ

B C C CH

NG TRÌNH

ố ượ ị ự ộ ậ ẫ ẩ Bài 1: Xác đ nh s l ng vi sinh v t trong m t m u th c ph m

ủ ả ị ể Bài 2: Xác đ nh kh năng chuy n hóa hydratcacbon c a VSV

ủ ợ ả ị ậ ổ Bài 3: Xác đ nh kh năng sinh t ng h p enzym c a vi sinh v t

Ự Ậ

Ự

Ẩ

TH C HÀNH VI SINH V T TH C PH M

ụ ộ Ễ ƯỜ Cán b ph trách: ThS. NGUY N TR NG THÀNH

Tel: 0989658724 .

Email: thanhcntp@gmail.com

Ệ Ự Ẩ KHOA CÔNG NGH TH C PH M

Ộ Ự Ẩ ƯỠ B MÔN TH C PH M DINH D NG

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẫ

ẩ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ố ượ ề ị I. Khái quát chung v công tác xác đ nh s l ng VSV

ụ M c tiêu:

ườ ứ ậ ộ ậ giúp cho ng i nghiên c u bi ế ượ t đ c m t đ vi sinh v t có

ụ ụ ự ẩ ẫ trong m u th c ph m là bao nhiêu, ph c v cho công tác

ỷ ệ ế ứ ố ặ nghiên c u (t l ố ti p gi ng…), ho c cho công tác công b

ấ ượ ự ẩ ch t l ng th c ph m .

ươ ị Các ph ng pháp xác đ nh:

ươ ự ế + Ph ị ng pháp xác đ nh tr c ti p

ươ ế + Ph ị ng pháp xác đ nh gián ti p

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẫ

ẩ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ươ ố ượ ự ế ị II. Ph ng pháp xác đ nh tr c ti p s l ậ ng vi sinh v t

1. Nguyên t cắ

ử ụ ồ ế ế ế ầ S d ng khung đ m (bu ng đ m) Goriaep. Đây là phi n kính dày, ph n

ữ ế ắ ướ ớ ệ gi a phi n kính có kh c 1 l i các ô vuông v i di n tích là 1mm

2.

ướ ớ ệ ắ L i kh c chia thành 25 ô vuông l n ớ  di n tích 1 ô vuông l n là 1/25

mm2

ớ ạ ỗ ố M i ô vuông l n l i chia thành 16 ô vuông nh ỏ  S ô vuông nh ỏ

2

ướ ắ ỏ ệ trên l i kh c là 400 ô  di n tích hình vuông nh là 1/400 mm

ủ ỗ ề ỗ ỏ ể  m i ô vuông nh có th tích là 1/4000

Chi u sâu c a m i ô là 0,1mm

ươ ươ mm3 hay t ng đ ng là 1/4000000ml (vì 1ml = 1000 mm

3 )

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẫ

ẩ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ươ ố ượ ự ế ị II. Ph ng pháp xác đ nh tr c ti p s l ậ ng vi sinh v t

ế 2. Cách ti n hành

ồ ộ ẫ ế Pha loãng m u đ n n ng đ 1/10000

ọ ị ữ ề ế ậ ỏ ộ Nh m t gi t d ch huy n phù có vi sinh v t vào gi a khung đ m và

ể ế ế ầ ậ ằ ị ẹ đ y kín b ng lá kính, di chuy n nh khung đ m làm d ch chi m đ y

các khoang.

ọ ậ ủ ế ẹ ể ả ặ Đ t khung đ m vào bàn k p tiêu b n c a kính hi n vi, ch n v t kính

ồ ừ ừ ặ ố ẹ ả ỉ 10x ho c 40x r i t t ư dùng c ch nh thô đ a bàn k p tiêu b n lên

ồ ể ế ạ ậ ầ trên đ bu ng đ m g n ch m vào v t kính.

ố ỉ ừ ừ ư ố ướ ể ả ấ ả đ a tiêu b n xu ng d t i đ tìm nh và l y nét.

Dùng c vi ch nh t

ố ế ế ế ớ ỏ ặ Ti n hành đ m s t bào trong 10 ô vuông l n ho c 20 ô vuông nh .

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẩ

ẫ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ươ ố ượ ự ế ị II. Ph ng pháp xác đ nh tr c ti p s l ậ ng vi sinh v t

ế ả 3. Tính k t qu :

N = 1000. a. n/h.s

ố ế ố ế ề ị Trong đó N: s t bào trong 1 ml d ch huy n phù; a là s t bào trung

ủ ướ ề ế bình trong 1 hình vuông c a l ủ i, h là chi u sâu c a khung đ m; n là

ủ ướ ộ ộ ề ệ ị đ pha loãng d ch huy n phù; s là di n tích m t hình vuông c a l i

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẩ

ẫ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ố ượ ự ủ ộ ẫ ậ ấ ị III. Xác đ nh s l ng vi sinh v t (n m men) c a m t m u th c

ẩ ươ ươ ằ ph m b ng ph ế ng pháp gián ti p thông qua ph ng pháp

ẩ ạ ế đ m khu n l c

1. Nguyên t c:ắ

ượ ồ ấ ượ ợ ồ ộ ế ẫ M u đ c đ ng nh t và đ ồ c pha loãng đ n n ng đ thích h p r i

ấ ườ ọ ọ ừ ạ c y trên môi tr ng th ch ch n l c cho t ng nhóm, loài VSV.

ố ượ ẩ ạ ờ ạ ị Xác đ nh s l ề ặ ng khu n l c trên b m t th ch sau th i gian

ủ ấ nuôi trong t m.

ế ẻ ấ ườ ở ộ Cách đ m: l y bút chì k 2 đ ng vuông góc đáy h p petri. Đ m

ẩ ạ ứ ự ừ ừ ố ả ừ s khu n l c trong t ng góc theo th t t trái qua ph i, t ế 7 trên

ố ướ xu ng d i.

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẫ

ẩ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ố ượ ủ ự ộ ậ ấ ẫ ị III. Xác đ nh s l ng vi sinh v t (n m men) c a m t m u th c

ẩ ươ ươ ằ ph m b ng ph ế ng pháp gián ti p thông qua ph ng pháp

ẩ ạ ế đ m khu n l c

ế 2. Cách ti n hành:

ồ ộ ế ẫ Pha loãng m u đ n n ng đ 1/1000000 1/100000000

ồ ấ ẫ ị ộ C y 1ml d ch m u vào đĩa petri (3 đĩa/1 n ng đ )

ẩ ị ườ ợ ườ ệ Chu n b môi tr ng nuôi hansen, đ i môi tr ả ng gi m nhi t

ộ ổ ố ớ ộ ề ấ ẫ đ xu ng 50 đ , đ vào các đĩa petri đã c y m u (chi u dày l p

ườ ừ môi tr ng t 2 – 3mm

ồ ồ ề ượ Xoay đĩa 4 vòng theo chi u kim đ ng h và 4 vòng ng

ề c chi u 8

ồ ườ ớ ợ ề ồ ể ẫ kim đ ng h đ m u và môi tr ng hòa đ u v i nhau. Đ i môi

ườ ạ ủ ủ ấ ẩ ạ ố ị tr ng đông l i, trong t m. Xác đ nh s khu n l c sau 48h

nuôi.

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẫ

ẩ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ố ượ ự ủ ộ ấ ậ ẩ ẫ ị III. Xác đ nh s l ng vi sinh v t (n m men) c a m t m u th c ph m

ằ ươ ươ ẩ b ng ph ế ng pháp gián ti p thông qua ph ế ng pháp đ m khu n

l cạ

ế ả 3. Tính k t qu :

ặ ặ A (CFU/g ho c CFU/ml) = M.a.f.N ho c A = M/ n1.v1f1 + .......+ nivifi

ậ ộ ế ị ể ơ ẫ Trong đó A là m t đ t bào trên 1 đ n v th tích m u

ẩ ạ ố M là s khu n l c trung bình trong 1 đĩa petri

ồ ố ể ộ N1: s đĩa, V1: th tích = 1ml, f1: n ng đ

ể ẫ a là th tích m u đem c y ấ ( = 1ml)

ệ ố ố ượ ệ ố ủ ứ ẫ N h s tính theo kh i l ng khô tuy t đ i c a m u nghiên c u

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẩ

ẫ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ệ ặ ượ IV. Đ t thí nghi m cho quá trình lên men r u, lactic, axetic

ượ ệ 1. Thí nghi m lên men r u:

ẩ ị ị ườ Chu n b 100ml dung d ch đ ng saccharose10% cho vào

ấ bình tam giác 250ml, thêm 0.1 – 0.2g n m men

ượ ị Saccharomyces cerevisiae đã đ c hòa trong 10ml d ch

ườ ướ đ ng 10% tr c đó 1h.

ệ 2. Thí nghi m lên men lactic:

ữ ươ ẩ ị Chu n b 100ml s a t i vào bình tam giác 250ml. Thêm vào

ữ ặ ủ ấ ộ 10g s a chua. Đ t trong t m 40đ C.

ệ ặ 3. Đ t thí nghi m lên men axetic:

ượ ộ 100ml bia + 1ml r u + 10ml axetic 1N. Nuôi 30đ C.

ị

ậ

Bài 1: Xác đ nh s l

ng vi sinh v t

ẩ

ẫ

ố ượ ự

trong m u th c ph m

ệ ặ ượ IV. Đ t thí nghi m cho quá trình lên men r u, lactic, axetic

ủ ử ợ ổ ệ ả 4. Thí nghi m th kh năng sinh t ng h p enzyme c a VSV

ẩ ị ườ ớ ầ Chu n b môi tr ng v i thành ph n:

NaNO3: 3g/l; K2HPO4: 1g/l; KCl: 0,5g/l; MgSO4.7H20: 0,5g/l;

ướ ộ FeSO4: 0,1g/l; Tinh b t tan: 15g/l; Agar: 20g/l; N c:

1000ml

ộ ướ ấ ạ Chú ý: Tinh b t tan hòa trong n ồ c m cho tan thành d ng h

ớ ổ ườ ồ r i m i đ vào môi tr ng

ố ố ấ ấ C y n m m c Aspergillus và Penecillium (8 đĩa, 1 m c 4

đĩa)

ườ Môi tr ng Hansen: Glucoo: 50g, Pepton: 10g,

ướ K2HPO4 : 3g, MgSO4.7H2O: 2 g/l N c : 1000ml, Agar:

20g

ị

ả

Bài 2: Xác đ nh kh năng chuy n hóa hydratcacbon

ủ

ể ậ c a vi sinh v t

ệ ượ ị ượ 1. ng, xác đ nh l ng

Quá trình lên men lactic : Quan sát hi n t ị ạ ả axit lactic t o thành, đ nh làm tiêu b n quan sát hình thái các

ủ ẩ ch ng vi khu n lactic.... 1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic

ệ ượ ị ượ 2. ng, xác đ nh l ng Quá trình lên men axetic : Quan sát hi n t

ủ ả ạ axit axetic t o thành, làm tiêu b n quan sát hình thái các ch ng vi

ẩ khu n axetic.... 1ml NaOH 0.1N = 0,006g

ử ả ổ ợ ệ ặ 3. Đ t thí nghi m th kh năng t ng h p emzym amilaza và

proteaza

ủ

ợ

ổ

ả

ị

Bài 3: Xác đ nh kh năng sinh t ng h p enzym c a VSV

ử ụ ậ ủ 1. Quan sát hình thái các ch ng vi sinh v t đã s d ng:

ệ ợ ấ ấ ộ ơ ử N m m c ố (Aspergillus): nhu m đ n, quan sát h s i n m, bào t

ủ ổ ợ ả ị 2. Xác đ nh kh năng t ng h p enzyme amilaza và proteaza c a

vi sinh v t ậ

ườ ầ Thành ph n môi tr ng Hansen:

Saccharose: 20g/l; Pepton: 10g/l; KH2PO4: 3g/l; MgSO4.7H2O:

ướ ấ 2g/l; N c c t: 1000ml; pH 5,6.

ƯƠ

Ộ

PH

NG PHÁP NHU M GRAM

ế ướ

ẩ ấ c ti n hành: ị ế ẩ

ờ ấ gi a phi n ấ ọ ướ t n ộ ấ ở ữ c c t th ch (sau khi c y 24 gi ) hoà vào 1 gi

ồ ơ ế ố ị ọ ử bào: h nhanh v t bôi trên ng n l a đèn c n 23

ị ử ế

ấ ướ

ạ ằ ử ị i b ng dung d ch Iod (lugon) trong 1 phút, r a

ướ

ữ ừ ế ả ấ kho ng 30 giây (cho đ n khi v a th y

ấ

ấ c, th m khô. ằ ử ộ ị

ướ ể c, đ khô trong không khí.

ậ ầ

ế

ắ ắ ỏ Các b ∙ Chu n b v t bôi: dùng que c y vô trùng l y m t ít vi khu n ế ừ ạ t kính, làm khô trong không khí. ế ∙ C đ nh t l n.ầ ằ ộ ∙ Nhu m b ng dung d ch Tím k t tinh trong 1 2 phút, r a c, th m khô. n ộ ∙ Nhu m l ấ c, th m khô. n ẩ ỏ ị ∙ Nh d ch t y màu, gi ướ ử m t màu), r a n ổ ∙ Nhu m b sung b ng dung d ch Safranin trong 12phút, r a n ∙ Soi kính: dùng v t kính d u 100´. ả K t qu : ẩ Vi khu n Gram (+) b t màu tím, Gram () b t màu đ