NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI
Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPD-
PCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE
Nguyễn Hoài Giang
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình Lương
Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ lâu, nấm linh chi (Ganoderma) được biết tới như một
loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ và
chữa trị nhiều loại bệnh (bệnh thận, gan, bệnh tiểu đường,
bệnh tim mạch, dị ứng...). Ganoderma có khả năng tăng
cường sự thải độc ở gan và kích thích hệ thống miễn dịch
hoạt động hiệu quả hơn. Ganoderma còn kìm hãm sự sinh
tổng hợp ADN mới của tế bào ung thư, kìm hãm sự phát
triển của các khối u và hạn chế sự di căn. Các nghiên cứu y
và dược học cũng cho thấy các loài Ganoderma khác nhau
cũng có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạt
tính khác nhau (1). Việc phân loại Ganoderma dựa vào
hình thái và các isozym gặp nhiều khó khăn, nhiều khi
thiếu chính xác. Gần đây, việc sử dụng đoạn trình tự ITS
(Internal Transcribed Spacer) của ADN ribosom và kỹ
thuật nhân bản ngẫu nhiên ADN bằng mồi tuỳ ý (Random
Amplified Polymorphic DNA: RAPD) đã góp phần quan
trong trọng việc phân loại Ganoderma ở mức độ ADN (2).
Ngoài tác dụng làm thuốc, Ganoderma cũng là những loài
nấm gây bệnh và phá huỷ nhiều cây thân gỗ. Laccase,
lignin peroxidases (LIPs) và peroxidases phụ thuộc mangan
(MNPs) là ba nhóm enzym được cho là có vai trò quan
trọng trong việc phân huỷ gỗ của các loại nấm. Enzym
laccase, LIPs và MNPs có khả năng oxy hoá các phức
phenolic để tạo thành gốc phenoxy. Mỗi phân tử enzym
laccase liên kết với bốn nguyên tử đồng. Những nghiên cứu
về cấu trúc và chức năng của laccase cho thấy tại vị trí giữa
một axit amin cystein và mười axit amin histidin là điểm
bám cho bốn nguyên tử đồng và trình tự ở quanh vị trí này
thường rất ít thay đổi ở những loài nấm khác nhau (3, 4).
Nghiên cứu này giới thiệu một cách tiếp cận nhằm góp
phần phân loại và xếp nhóm ở Ganoderma: Sử dụng
RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên OPU1 và PCR với cặp
mồi đặc hiệu cho hai đoạn trong gen laccase.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:
Vật liệu:
Các mẫu nấm Ganoderma lucidum với các nhóm dưới loài
khác nhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganoderma
australe sensulato với các nhóm dưới loài khác nhau được
ký hiệu là Ga 1 và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulato
với các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 và
Gb 2; Ganoderma tortnatum sensulato với các nhóm dưới
loài khác nhau được ký hiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganoderma
australe được ký hiệu là Gau, do phòng thí nghiệm nấm -
Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội
cung cấp.
Phương pháp nghiên cứu:
- Tách chiết ADN từ các mẫu Ganoderma theo phương
pháp của Porebski và được thích ứng với điều kiện phòng
thí nghiệm của Việt Nam theo cải tiến của các tác giả
Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương (6).
- Kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1, trình tự là 5'-
ACGGACGTCA -3' (6). - PCR với mồi đặc hiệu cho 2
đoạn gen laccase của G. lucidum 103561 (4).
- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% và
nhuộm bạc (7).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân loại Ganoderma
Đoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử dụng rất
phổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma. Tuy
nhiên, thông tin về trình tự vùng ITS nhiều khi không thay
đổi ở một số taxon gần nhau. Do vậy nếu chỉ sử dụng kết
quả đoạn ITS sẽ không đảm bảo có sự chính xác cao trong
phân loại Ganoderma (2). Trong thời gian gần đây, kỹ
thuật RAPD-PCR được sử dụng rất phổ biến và là một
trong những phương pháp nhạy, có hiệu quả cao để phân
biệt những taxon không thể phân biệt được bằng ITS (2).
Để phân loại các loài Ganoderma mà chúng tôi hiện đang
có, kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1 được sử dụng (6).
Điều kiện PCR sau khi được tối ưu hoá là 94oC 2 phút/ 35
chu kỳ với 94oC 1 phút, 46oC 30 giây, 72oC 2 phút/ 72oC
10 phút.
Kết quả điện di trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạc
cho thấy: các mẫu Ganoderma lucidum có 5 băng ADN
giống nhau với kích thước khoảng 1636, 800, 690, 630 và
450 bp; các mẫu Ganoderma australe sensulato có 4 băng
ADN giống nhau với kích thước khoảng 1824, 407, 370 và
300 bp; các mẫu Ganoderma applanatum sensulato có 3
băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 310, 240 và
140 bp; các mẫu Ganoderma tortnatum sensulato có 4 băng