Chương 5: Các vecto và sự tạo dòng

Chia sẻ: Ngo Van Quang | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:89

Thêm vào BST

Báo xấu

256
lượt xem 74
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức năng, và sự điều hòa của các gene và sản phẩm của gene. Các mục đích của kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp gồm: Nhận dạng các gene, Tách các gene, Điều chỉnh các gene, Tái biểu hiện các gene ở sinh vật hoặc cơ thể chủ khác.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Chương 5: Các vecto và sự tạo dòng

CHÖÔNG 5 Caùc vector & söï taïo doøng
rDNA không phải là nhân bản động vật Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức năng, và sự điều hòa của các gene và sản phẩm của gene.
• Các mục đích của kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp gồm: – Nhận dạng các gene – Tách các gene – Điều chỉnh các gene – Tái biểu hiện các gene ở sinh vật hoặc cơ thể chủ khác • Cho phép các nhà khoa học: – Xác định các gene mã hóa và sản phẩm của chúng (breast cancer, retino-blastoma, và neurofibromatosis) – Điều trị các bệnh do gene (cystic fibrosis, rheumatoid arthritis, vascular disease, và certain cancers) – Sản xuất lượng lớn hormones, vaccines, và các hợp chất sinh học khác mà Y học quan tâm (Insulin, growth hormone, follicle-stimulating hormone)
Vector Plasmid Vector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bào chủ, sao chép trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men để tạo ra nhiều bản sao hoặc tao ra sản phẩm protein của DNA ngoại lai. Đặc trưng chính của các vector tạo dòng: • Có trình tự cho phép sự tự sao chép trong vi khuẩn hay nấm men • Có vị trí để chèn DNA ngoại lai. Hầu hết các vector có trình tự cắt duy nhất của nhiều enzyme cắt giới hạn (MCS) • Một phương pháp để nhận biết tế bào có chứa vector, thường là các marker chọn lọc tính kháng kháng sinh.
Các loại vector • Plasmid – DNA dạng vòng tự sao chép nhân đôi trong tế bào vi khuẩn. Khả năng dòng hóa: 0.1-10 kilobases (kb) • Phage – dẫn xuất của bacteriophage lambda; phân tử DNA thẳng có thể được thay thế bằng DNA ngoại lai mà không làm gián đoạn vòng đời của nó. Khả năng dòng hóa: 8-20 Kb • Cosmids – DNA dạng vòng kết hợp các tính năng của plasmid và phage. Khả năng dòng hóa: 35-50 Kb • Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC) – dựa trên mini-plasmid F của vi khuẩn. Khả năng dòng hóa: 75-300 Kb • Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC) – một nhiễm sắc thể nhân tạo có chứa telomeres, nguồn gốc của sao chép (ori), centromere của nấm men, và marker để lựa chọn xác định các tế bào nấm men. Khả năng dòng hóa: 100-1000 Kb
Plasmid Vectors Điện di trên gel agarose plasmid tự nhiên Plasmid nhân tạo đầu tiên pBR322 (High-Copy-Number)
Plasmid tự nhiên ColE1 Plasmid tự nhiên (low copy number) pSC101
The pUC 18 or 19 Cloning Vector (Very high copy number) Lac Z α RE Sites in blue occur only once in the
Promotor Site Origin of Replication Antibiotic Resistance Multiple Gene Cloning Site
MCS – Multi Cloning Site  Các vị trí cắt duy nhất  Chèn/cắt đoạn DNA ngoại lai dễ dàng  Subcloning dễ dàng hơn
Chức năng sao chép không được mã hóa trên plasmid. Nó sử dụng chức năng từ các DNA polymerase I và III, DNA-RNA polymerase của tế bào chủ. Có thể ức chế sự tổng hợp protein với thuốc kháng sinh (chloramphenicol, spectinomycin). Vậy sự sao chép của plasmid có xảy ra không khi chloramphenicol hiện diện trong tế bào?
Replicons kiểm soát khả năng tương thích của plasmid • Khả năng tương thích của plasmid: khả năng của hai plasmid khác nhau cùng tồn tại trong cùng một TB chủ • Plasmid sử dụng các hệ thống sao chép giong nhau không thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào vi khuẩn • Các plasmid mang cùng replicon thuộc nhóm không tương thích
Sự không tương thích của plasmids Khi 2 plasmid cùng chia sẽ các yếu tố cùa cùng 1 bộ máy sao chép Sẽ có sự cạnh tranh Không thể cùng tồn tại khi không có sự chọn lọc trong môi trường nuôi vi khuẩn ☞ Cùng replicon  nhóm không tương thích  không thể duy trì trong cùng 1 vi khuẩn
Hơn 30 nhóm không tương thích được biết Plasmid Replicon Copy Number pBR 322 and its derivatives pMB1 15-20 pUC vectors pMB1 500-700 pACYC and its derivatives p15A 10-12 pSC101 and its derivatives pSC101 ~5 ColE1 ColE1 15-20
Sự an toàn của plasmid Một số plasmid tự nhiên có thể được chuyển giao cho TB khác bằng conjugation Conjugation đòi hỏi ba yếu tố: – Một gen linh động trans-acting (mob) – Một yếu tố cis-acting (bom) – Một vị trí cụ thể bị đứt mạch (nicked) bởi mob (nic) Một số plasmid cũ như pBR322 bị thiếu mob Một số vector mới hơn như pUC thiếu nic / bom và không thể linh động
Asilomar Conference Người ta tin rằng "an toàn" của các chủng vi khuẩn, vi rút và vectơ có thể được thực hiện trong một vài tuần NIH thành lập Ban tư vấn về DNA tái tổ hợp (RAC) Phải mất năm 1 (1976) trước khi dòng "an toàn" E.coli đầ u tiên (loại EK2) đã được tạo ra. Năm đó, RAC phát hành một bộ nguyên tắc đòi hỏi việc sử dụng các vi khuẩn an toàn
NIH Guidelines  Self Regulation in Science Milestone  Contents  Specified handling and construction processes  Microorganisms containing recombinant DNA were prohibited outside of the laboratory  Vectors that sexually move to “unsafe” bacteria was prohibited  Subsequent modifications  1986 expanded to include animals and plants, and 4 biosafety levels  1994 officially relinquished control of GMO plants in the environment to EPA and APHIS
Xu hướng tiếp theo là phát triển plasmid nhỏ Ưu điểm • Tăng hiệu quả của biến nạp • Dễ dàng hơn tạo bản đồ enzyme cắt giới hạn • Số lượng plasmid cao hơn
Giới hạn chính của tạo dòng sử dụng plasmid • Giới hạn tối đa của kích thước DNA tạo dòng là 10 kb • Cần chuẩn bị các tế bào chủ khả nạp • Không hiệu quả khi tạo genomic libraries vì các vùng trùng lặp cần thiết để tạo ra trình tự thích hợp • Thích số lượng clone nhỏ để biến nạp • Tạo ra các vùng gene lớn nhưng rời rạc • Nếu bộ gene của E. coli chứa 4,639,221 bp, cần bao nhiêu clone để tạo dòng cả bộ genome? • Nếu là vector biểu hiện thì các giới hạn liên quan đến biểu hiện protein của eukaryote
Bacteriophage lambda (λ) In 1971 Alan Campbell showed that the central third of the genome was not required for lytic growth. People started to replace it with E. coli DNA http://phage.bocklabs.wisc.edu/Virus.htm