CHƯƠNG 5. DI TRUYỀN VI SINH VẬT

NG 5 NG 5

ƯƠCH ƯƠ CH

DI TRUY N Ề VI SINH V TẬ

ụM c tiêu M c tiêu ượ

ể

1. Trình bày đ ế ủ 2. Phân bi

ề

ố

ụ c các ki u đ t bi n và c ế ơ ộ ch c a các tác nhân gây đ t bi n ế ộ c 2 lo i tái t h p di t đ ệ ượ ổ ợ ạ di truyên IS, Tn truy n và 3 lo i nhân t ạ và Bacteriophage Mu

c ph

3. Trình bày đ

ươ

ậ

ng pháp v n ượ ậ chuy n v t li u di truy n vi khu n. ể ậ ệ ẩ ề ở 4. Trình bày các b i ích c c b n và l ợ ướ ơ ả c a k thu t di truy n trong công ề ủ ỹ nghi p.ệ

ạ ươ

tiên c a

ổ

ố

ủ

mình

ể

ở ầ ế

ờ

ạ

ả ạ

ề

ể

ề

ằ

ầ

ế di truy n

ng 1. Đ i c Các VSV h u h t đ u gi ng t ầ ế ề h u h t các đ c đi m. ặ Di truy n là vi c duy trì các đ c đi m c a ủ ể ặ ề ệ i h u sinh . t tiên cho đ i sau c a th gi ế ớ ữ ủ ổ Đ n v di truy n là gen. Gen là m t đo n ộ ề ơ ị ADN đ m nhi m vi c mã hoá m t đ n v ộ ơ ị ệ ệ tính tr ng di truy n, các đ c đi m c a gen ủ ặ c di truy n cho th h sau qua sao chép. đ ế ệ ượ bào. Ph n ề

Ph n l n gen n m trong nhân t ầ ớ nh thu c plasmid, các y u t ế ố ộ ỏ đ ng.ộ

§¹i c ­¬ng 1. 1. §¹i c ­¬ng

* Theo quan niÖm hiÖn hµnh dßng th«ng tin di truyÒn tõ nhiÔm s¾c thÓ ®Õn tÕ bµo chÊt ë mäi vi sinh vËt diÔn ra nh­ sau:

1 3a ARN protein

3b? 2b

1 2a ADN ¨ * LiÖu qu¸ tr×nh 3b cã tån t¹i trong tù nhiªn

hay kh«ng?

:

OH

NH2

N

N

N

N

N

N

H2N

N H

N H

Adenin

Guanin

NH2

OH

OH

CH3

N

N

N

HO

N

HO

N

HO

N

Uracil

T hymin

Cit osin

NH2

NH2

N

N

N

N

N

N

N

N

C

O

C

HOH2

O

HOH2

H

H

H

H

H

H

H

H

H

OH

OH

OH

Nucleozid cña ADN

Nucleozid cña ARN

NH2

NH2

N

N

N

N

N

N

N

N

O-

O-

O-

OP

O

O-

OP

O

1'

1'

O

O

H

5' CH2 4' H

H

5' CH2 4' H

H 2' H

H 3' OH

H 2' OH

H 3' OH

Nucleotid cña ARN

Nucleotid cña ADN

ị ị

2. Sao chép AND, phiên mã, d ch 2. Sao chép AND, phiên mã, d ch mãmã ( Sinh viên t ( Sinh viên t

nghiên c u ) nghiên c u )

ứ ứ

ự ự

Ể Ể

Ộ Ộ

Ộ Ộ

ộ ộ

ế ế

ế ế ộ ế

ườ ủ

3. PHÁT SINH Đ T BI N VÀ CÁC KI U Đ T Ế 3. PHÁT SINH Đ T BI N VÀ CÁC KI U Đ T Ế BI NẾBI NẾ 3.1. Đ t bi n ng u nhiên và đ t bi n gây t o ộ ạ ẫ 3.1. Đ t bi n ng u nhiên và đ t bi n gây t o ộ ạ ẫ 3.1.1. Đ t bi n ng u nhiên ẫ + Nguyên nhân: * Tác đ ng c a môi tr * Chuy n hóa tautomer (h bi n c a các

ng ỗ ế ủ

ộ ể base khi sao chép)

+ Ví d : T ụ ở ạ ể

ạ ậ ớ

ế ệ ặ

d ng keto khi sao chép chuy n sang d ng enol s b t c p v i G . H u qu ẽ ắ ặ ả là trong s i ADN m i sau 1 th h 1 c p GC ớ ợ s thay vào v trí AT ẽ ị

Ế Ế

Ộ Ộ

Ể Ể

Ế Ế

Ộ Ộ

ế ế

ẫ ẫ

ộ ộ

3. PHÁT SINH Đ T BI N VÀ CÁC KI U 3. PHÁT SINH Đ T BI N VÀ CÁC KI U Đ T BI N Đ T BI N 3.1. Đ t bi n ng u nhiên và đ t bi n gây t o ạ ế ộ 3.1. Đ t bi n ng u nhiên và đ t bi n gây t o ạ ế ộ 3.1.1. Đ t bi n gây t o ạ ộ ế + Nguyên nhân: S lý TB VSV v i các tác nhân gây đ t bi n v t lý,

ế

ậ

ộ

ử

ọ

ớ hóa h c, sinh h c ọ + 2 d ng đ t bi n: ế

ạ

ộ

ủ

ổ ố đ n b i thành đa b i => có giá tr trong c i t o

- Đ t bi n t ng gen thay đ i s genom c a VSV ộ VD: t ừ ơ

ế ổ ộ

ả ạ

ộ

ị

gi ngố ộ

ổ ấ

ồ

t khung

- Đ t bi n gen thay đ i c u trúc gen g m ế + Đ t bi n đi m ộ + Đ t bi n tr ộ

ể ượ

ế ế

Ế Ế

Ể Ể

Ộ Ộ

Ế Ế

Ộ Ộ

ẫ ẫ

ộ ộ

ế ế ị

3. PHÁT SINH Đ T BI N VÀ CÁC KI U 3. PHÁT SINH Đ T BI N VÀ CÁC KI U Đ T BI N Đ T BI N 3.1. Đ t bi n ng u nhiên và đ t bi n gây t o ạ ế ộ 3.1. Đ t bi n ng u nhiên và đ t bi n gây t o ạ ế ộ + Đ t bi n đi m m t c p base b thay th ế ộ ặ ể ế ộ b ng m t c p base khác ộ ặ ằ - Chuy n d ch (base purin đ ị ể

c thay b ng ượ ằ

purin)

VD: AT thay b ng GC ằ - Đ o d ch là khi base purin đ ả ị ượ c thay th ế

ị ạ ế ộ

ự ỗ ị

) b ng base pirimidin ằ VD: AT thay b ng CG ằ + Đ t bi n tr t khung ( 1 đo n ADN b lo i ượ ạ đi, b chuy n ch , b cách ra do s chèn vào ể ị c a ADN l ạ ủ

ế ế

ổ ặ ổ ặ

ể ể

Đ t bi n đi m đ i c p base ộ Đ t bi n đi m đ i c p base ộ A ­ T

i tác d ng c a tác

ặ

ướ

ụ

Tác nhân đ t bi n ế

ộ

ủ ặ

ế ộ

C p base AT d nhân đ t bi n đã bi n thành c p GC ế ộ trong allen đ t bi n ế .

(H)A*­ T

(H)A* ­ C

A ­ T

(H)A*­ C

G ­ C

Đ t bi n tr Đ t bi n tr

t khung t khung

ế ế

ộ ộ

ượ ượ

C C G CT TT T C G AT G G C G A A A A G C T A

®øt ®o¹ n

C C G C T T T TC G A T G G C G A A A G C T A

C C G C T T T T C G A T G G C G A A G C T A

A

Sãng ®«i sai

Ph©n huû

T¸ i tæng hî p ADN- ligase

T¸ i tæng hî p ADN- ligase

T T

C C G C T T C G A T G G C G A A G C T A

C C G C T T T T C G A T G G C G A A A A G C T A

A

MÊt A A

Thªm A

Tr- î t khung thay ®æi m·

(c¸ c acid amin thay ®æi trong protein)

ng t

ự

ế ế ộ ộ

base ấ

ổ bào nh m l n l p

base là ch t kháng trao đ i ầ

ẫ ắ

ế

Th

ng gây đ t bi n là BU (5 brom-

ng t (anti – metabolite), t vào ADN. ườ

ế

ộ uracil) và AP (2-amino-purin)

3.2. C ch td c a các tác nhân đ t bi n ủ ơ ế 3.2. C ch td c a các tác nhân đ t bi n ủ ơ ế 3.2.1. L p ch t t ấ ươ ắ Ch t t ự ấ ươ

3.2.1.L P CH T T

Ấ ƯƠ

Ắ

NG T BASE Ự

A

A

Nhân đôi

G

Nhân đôi

5BU

G

Nhân đôi

T

5BU

C

c ch phát sinh đ t bi n

ơ ồ

ả ơ ế

ộ

ế

gen do tác đ ng c a 5BU (5Brôm – Uraxin).

Quan sát s đ và mô t ủ

ộ

ổ

ọ ủ

ơ ử ư

ứ ợ ế ằ

3.2.2. Thay đ i hóa h c c a base + Acid nitr kh amin c a A, G, nh ng không ủ làm đ t s i, do đó thay th nhóm –NH2 b ng -OH:

c Cượ

=> A thành hypoxantin ghép đôi đ AT => GC => G thành xantin, v n sóng đôi v i C nên ẫ ớ

ộ

không gây đ t bi n ế + Hydroxylamin p ch y u v i C, khi n base ứ ủ ế ế ớ

này sóng đôi sai v i A, CG => TA ớ

+Ethyl- và methyl-sulfonat, ethylenimin, N-

nitroso-guanidin là các tác nhân alkyl hóa gây đ t bi n m nh ế ạ ộ

Đ t bi n gây t o do hydroxylamino Đ t bi n gây t o do hydroxylamino

ế ế

ạ ạ

ộ ộ

H

H

H

H

N

OH N -

H

N

N

H

H

NH2OH

N

H

N+ H

N

H

N

dr

N

N

N

dr

dr

O

O

H

Adenin

Hydroxylamino-cytosin

Cytosin

ộ

ạ

ặ

3.2.3.Chèn thêm vào ho c lo i đi m t c p base. ặ Phân t ử

ặ

ữ ỗ

ấ

ể ị

acridin xen vào gi a các c p base trên ữ chu i ADN làm tăng kho ng cách gi a chúng ả => m t đi m t s c p ho c thêm vào m t s ộ ố ặ c p base và nh v y làm chuy n d ch khung ặ đ c mã trong t ng h p protein gây đ t bi n. ọ ộ ố ặ ư ậ ổ ế ợ ộ

Tác d ng gây đ t bi n c a Acridin Tác d ng gây đ t bi n c a Acridin

ế ủ ế ủ

ụ ụ

ộ ộ

Sî i mí i

Sî i khu«n

6 5 4

Acridin

0,68 nm x'-ngÉu nhiª n xen vµo

6' 5' 4' x' 3' 2' 1'

3 2 1

Sao chÐp A DN

CÆp x - x' ®- î c xen vµo

6' 5' 4' x' 3' 2' 1'

6 5 4 x 3 2 1

ngo i UV và b c

ử

ứ

ạ

ngo i UV, tia R nghen và

ạ

ơ

ụ

3.2.4. Ánh sáng t x ion hóa ạ Ánh sáng t ử ứ ạ ạ

ế

ế

ụ

ả

ậ

ị

ụ ổ ị

ượ

ạ

ộ

các b c x ion khác nhau có tác d ng gây ch t m nh và gây đ t bi n. Ánh sáng UV ộ tác d ng lên acid nucleic h u qu là khi sao chép b sai l ch. Ví d : ánh sáng t ử ệ t khung ngo i gây đ t bi n đ i d ch, tr ế th m trí m t đo n. ạ

ậ

ấ

Tia R nghen, alpha, beta, cũng là 1 tác

ơ

ế nhân gây đ t bi n.

ộ

ngo i UV : ạ ấ

Ánh sáng t * Năng l ượ

ử ng th p không đ đ ion hóa, ượ

ủ ể

ằ ế c ậ

không xuyên xâu nên không tác đ ng đ vào các t Có hi u qu đ t bi n ệ ộ ơ ể VSV, h t ph n… ạ ấ

ế

ế

ụ ạ

bào n m sau trong c th sinh v t. ế ở ả ộ * C ch ch y u c a đ t bi n UV là do acid ơ ế ủ ế ủ ộ bào h p th , nucleic và các h p ch t trong t ụ ấ ấ ợ s h p th càng m nh thì kh năng đ t bi n ế ộ ả ự ấ càng cao.

* Acid nucleic h p th b c sóng 260 nm là

ụ ướ c sóng 260 nm có hi u qu ả ệ

ấ cao nh t , nên b ướ ấ t nh t. đ t bi n t ấ ế ố ộ

ụ

ủ

Tác d ng c a UV (ĐB gen or ĐB NST): + Các base thymin g n nhau trên phân t ử ầ

ạ

ADN có

ử ả ủ

ế

ADN liên k t v i nhau t o ế ớ dimerthymin,gây méo mó phân t th d n đ n m t kh năng tái b n c a ả ấ ể ẫ ADN.

ế ế

+ Tia UV th ườ ộ

ộ

ạ

bào mà t o ng ít gây ch t t ạ nên các đ t bi n. Tác đ ng gây đ t bi n ế ế ộ bào, ph thu c vào tr ng thái sinh lý c a t ủ ế tu i gi ng, loài sinh v t…

ộ ố

ụ ổ

ậ

Tia b c x ion hóa ứ ạ - Tia có b n ch t sóng đi n t ả ồ

v i b c sóng ấ ệ ừ ớ ướ

- Tia có b n ch t h t g m các tía alpha, beta,

c c ng n g m tia X, tia gamma. ự ắ

ấ ạ ồ ả

các proton,…

- Các tia b c x có năng l ứ ạ n ử ướ

ượ

ế

ữ ặ

ả ứ ấ

ng l n làm cho ớ c và các phân t trong t các phân t bào ử tích đi n ( b b phá v thành nh ng phân t ử ị ệ ỡ ị ion hóa). Khi có m t O2 b c x oxi hóa sinh ứ ạ ra các peroxid hydro và nhi u ch t ph n ng ề . ng ADN m nh gây t n th ươ ạ ổ

Ề

Ạ

bào

ợ ử

h p

ệ

ế

ậ

ấ

ủ ế

1 ủ

ạ

ậ

ạ

ệ

ấ

h p ph ổ

ổ ợ

ề

ồ

4. TÁI T H P DI TRUY N VÀ Ổ Ợ CHUY N TÍNH TR NG Ể h p di truy n 4.1. Tái t ề ổ ợ h p c a t bào nhân th t: + Tái t ậ ổ ợ ủ ế là s n ph m k t h p c a 2 t H p t ế ế ợ ủ ẩ ả bào nhân nguyên th y t + Tái t ủ ổ ợ ở ế * M t ph n c a ADN c a t bào cho chuy n ể ủ ế ầ ủ ộ sang t bào nh n do đó ch xu t hi n h p t ỉ ợ ử bào nh n và ADN c a ph n. Đo n ADN c a t ầ bào cho ,sóng đôi và trao đ i đo n và khi phân t ổ ế bào ch ch a NST bào ti p theo s xu t hi n 1 t ỉ ứ ế ẽ ế h p. đã tái t ổ ợ h p di truy n g m có: - Tái t * Tái t ổ ợ bi nế

- Tái t

h p đ c

ổ ợ

ặ

hi uệ

4.1.1.TÁI T H P PH BI N Ổ Ợ

Ổ Ế

ổ ế

ượ

bào đ ế ệ

TH ph bi n là quá trình mà trong đó ADN l ạ c liên k t m i xâm nh p vào trong t ế ậ ớ v i ADN ch thông qua vi c ghép đôi đo n ạ ủ ớ t ng đ ng ,b v và trao đ i chéo 2 đo n ạ ươ ADN có trình t

ổ ồ

ẻ ỡ ự ố

ADN t

ế

bào nh n ậ

,

ADN c a t

ủ ế

bào nh n tái t ậ

h p ổ ợ

gi ng nhau Có 6 enzym tham gia vào quá trình này: trong đó đáng chú ý là -SSB protein, RecA protein

4.1.1.TÁI T H P Đ C HI U 4.1.1.TÁI T H P Đ C HI U

Ổ Ợ Ặ Ổ Ợ Ặ

Ệ Ệ

phage

Lambda

ATTP

gal

Lambda bio

gal

bio

ATTB

gal

bio

ADN E. coli t¸i tæ hî p

ADN E. coli

ADN E. coli

AND c a ủ E.coli tái t

h p ổ ợ

4.1.1.TÁI T H P Đ C HI U 4.1.1.TÁI T H P Đ C HI U

Ổ Ợ Ặ Ổ Ợ Ặ

Ệ Ệ

Tái t ặ ệ ỉ ầ

ạ t – g i h p đ c hi u v trí ch c n m t đo n ổ ợ ọ ươ ỏ ể ế ậ

ộ ị ADN t ng đ ng r t nh đ nh n bi ấ ồ là trình t t, quá trình này c n các nh n bi ầ ế ự ậ enzym đ c hi u cho các phân t ADN tái t ổ ử ệ ặ h p.ợ

ổ ợ

phân t ị t ế

ặ

ADN đ u mang trình t 2 phân t Phân lo i: + Tái t h p đ c hi u 1 v trí: 1 ạ ệ ặ nh n bi ADN mang trình t ự ậ ử h p đ c hi u 2 v trí n u c + Tái t ế ả ị ệ ổ ợ t. nh n bi ế ự ậ ề ử

di truy n đ ng ề di truy n đ ng ề ộ ộ

IS là nhân t

ố ố chèn vào IS chèn vào IS 4.1.3. Các nhân t 4.1.3. Các nhân t 4.1.3.1. Nhân t ố 4.1.3.1. Nhân t ố

ố ể ắ di truy n có th l p vào các v ị

ẩ ủ

ấ ụ ủ

ề trí khác nhau trên genom c a vi khu n làm m t tính liên t c c a gen. Đ c tính này t o ạ cho IS có kh năng di đ ng r ng rãi.

Nhân t

c xác đ nh đ u tiên là ặ ộ ầ

ộ ị ặ

ứ

ả IS đ ượ ố ở E.coli g m 800 -1400 c p base và không ồ mang m t phenotyp nào khác ngoài ch c ộ năng chuy n ch . ỗ ể

di truy n đ ng ề di truy n đ ng ề ộ ộ

IS đ

ố ố chèn vào IS chèn vào IS 4.1.3. Các nhân t 4.1.3. Các nhân t 4.1.3.1. Nhân t ố 4.1.3.1. Nhân t ố

E.coli do tác ở

ế

ố

ng ng VK m t kh ả ấ này r i ờ c ượ ả

IS không mã hóa protein nên ch ỉ ự

ệ ộ

c phát hi n đ u tiên ầ ệ ượ đ ng c ch ho t đ ng c a gen. Khi IS xen ủ ạ ộ ộ ứ vào bên trong gen t ươ ứ năng lên men galactose, khi nhân t kh i gen kh năng lên men galactose đ ỏ tái l p.ậ Các trình t có th phát hi n chúng thông qua tác đ ng ể c a chúng. ủ

ố ố di truy n đ ng ề di truy n đ ng ề ộ ộ

4.1.3. Các nhân t 4.1.3. Các nhân t 4.1.3.2. Transposon (Tn) 4.1.3.2. Transposon (Tn)

di truy n đ ng gây đ t bi n và ộ ố ế ề

đ

ạ ễ ậ ấ

ộ ố ư

ư

S chuy n ch c a Tn là k t qu c a s sao v trí chèn

ự ể

Là nhân t ộ c g i là ‘gen nh y’. ả ượ ọ Tn đ c mã m t s tính tr ng d nh n th y ọ v ki u hình nh tính kháng kháng sinh ề ể (penicilin, tetracyclin, kanamycin…), tính kháng kim lo i n ng nh Ag. ạ ặ ế ỗ ủ chép do đó không làm m t đi Tn vào ban đ u trong ADN.

ả ủ ự ở ị ấ

ầ

4.1.3.3. Bacteriophage Mu

*Có chung đ c tính c a c IS và Tn. Bacteriophage Mu

, khi h p nh t vào t

ủ ả ồ

ấ

ổ

ợ

bào ch s ủ ẽ

ế

ủ

ặ

ặ coi nh 1 Tn kh ng l ư gây đ t bi n. ế ộ * Đ o ng c gen là đ c tính đáng chú ý c a ượ ả bacteriophage Mu.

* VD: Sù ®¶o ng­îc ®Çu ®o¹n G cña Bacteriophage Mu. §o¹n G m· ho¸ tæng hîp c¸c protein sîi ®u«i. NÕu ®o¹n n»y n»m theo h­íng G+, c¸c protein ®u«i S vµ U ®­îc t¹o thµnh vµ phage nhiÔm vµo E. coli K 12. NÕu ®o¹n ®¶o ng­îc theo h­íng G-, mét promotor kh¸c sÏ ho¹t ®éng vµ sîi ADN ®èi diÖn sÏ ®­îc sö dông, sîi nµy phiªn m· c¸c gen kh¸c mµ s¶n phÈm cña chóng lµ mét protein ®u«i S’ vµ U’ kh¸c lµm thay ®æi phæ vËt chñ cña phage. Nhê vËy phage cã thÓ hÊp thô vµo c¸c tÕ bµo E. coli C vµ c¸c vi khuÈn ®­êng ruét kh¸c. Sù ®¶o ng­îc còng liªn quan ®Õn S almone lla, vµ ë ®©y liªn quan ®Õn sù thay ®æi tæng hîp tiªn mao cña vi khuÈn.

Ạ Ạ

4.2.BI N N P (transformation) 4.2.BI N N P (transformation) m t vi

i t

ự

c chi

ẩ

Ế Ế Đ/n: S chuy n gen ADN đ ượ ể t t khu n cho ho c đ ế ừ ặ ượ sang vi khu n nh n khác g i là bi n n p. ọ ậ tr ng thái có th bi n n p đ

bào

ẩ ở ạ

ế

ế ể ế ng là các t

c gi ả ừ ộ vi khu n cho này ẩ ạ c ạ ượ bào kh ả ế

ườ

Các t b i 1 ADN trong môi tr ở n p.ạ

Phân lo i: - Bi n n p t

ạ

ạ ự

ộ ố ề

ượ ườ

ệ ủ ạ

ạ

nhiên : Tr ng thái kh ả ạ c kích thích ng. ạ ạ

- Bi n n p nhân t o: Tr ng thái kh ả ụ ủ ử

ế n p do các gen NST mã hóa và đ ạ b i m t s đi u ki n c a môi tr ở ế n p có đ ả ạ v i n ng đ cao các ion hóa tr 2. ớ ồ

c ph i qua x lý nhân t o. Ví d ượ ộ

ị

nhiên th

ế ạ ự và tính nguyên d

Tính tr ng bi n n p t ạ ộ ố

ưỡ

ng là tính ườ ng v i acid ớ

kháng đ c t amin.

Trong tr ng thái sinh lý thích h p t

ợ ế

ế

kh n p đã đ

t vào

ả ạ

bào thay đ i, thành t ổ ạ c t o ra và ti ượ ạ

ỉ ầ

ị

bào kh ả ạ bào n p có b m t t ề ặ ế ạ x p có ho t tính enzym ngo i bào cao, đ ng ồ ạ ố th i y u t ờ ế ố ế ng. môi tr ườ ộ ồ th p: 0,1 ấ bi n n p 5 % qu n th t ế

N ng đ ADN thích h p cho bi n n p ch c n ạ ế ợ bào là đ đ µgADN/ml huy n d ch t ủ ể ế ậ

ạ

ầ

ề bào nh n. ể ế Thí nghi m Grififth v i D.pneumoniae (nòi S,R) ớ

ệ

nhiên ) nhiên ) 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự ế ế

VD: Diplococcus pneumoniae Đi u ki n: - 12 phân t

nhiên ) nhiên ) 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự ế ế

c t ng ỏ ượ ổ

Protein nh đ ng ệ ế ề h p ti ợ

ế ố

ử ườ - N ng đ c a TB và các y u t ộ ủ kh n p đ t đ n n ng đ nh t đ nh. ồ t vào môi tr ồ ạ ế ả ạ ấ ị

ủ ộ ứ ấ

ạ ế ặ

AND g m 11 c p base. => Màng c a thành TB ch a c u trúc d ng túi bên trong m i túi có protein liên k t đ c hi u ệ v i 1 trình t ớ ỗ ự ặ ồ

nhiên ) nhiên ) 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự ế ế

Streptococcus pneumoniae H p th và ch bi n ADN t ạ

b t kỳ ngu n ừ ấ ồ ế ế ấ

ụ ẳ ừ

S.pneumoniae khác đ u đ ư tinh trùng cá h i hay ề ượ ấ ỉ ồ c h p th ụ ươ

ng đ ng ồ c h p ớ ượ ợ ủ ẩ ậ

nào ch ng h n ADN t t ừ nh nhau. Tuy nhiên ch có ADN t v i ADN c a vi khu n nh n m i đ ớ nh t,ấ

Haemophilus influenza H p th plasmid nguyên v n n u plasmid

nhiên ) nhiên ) 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế 4.2.BI N N P (transformation) Ạ Ế nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự nhiên (Kh n p t Bi n n p t ả ạ ự ạ ự ế ế

ế

ụ ch a 11 th t ấ ứ ứ ự

ờ

ẹ base phù h p ợ cũng c t plasmid ắ bào và chuy n thành s i ể ợ Còn S.pneumoniae bao gi ậ ế

khi xâm nh p vào t đ n.ơ

Ạ Ạ

Đ i v i các VK

ố ớ

ở ề

đi u ki n bình th ệ ế ạ ả c c m bi n ng nh x lý t nhi

ể ượ ả ị ớ

ờ ử ặ ủ ở

2 ho c

ng ườ không có kh năng bi n n p, tính kh n p ả ạ có th đ ế ế ứ t đ bào v i dung d ch CaCl ệ ộ l nh.ạ

VD: Vi c s d ng các VK Gr (+) chi

ệ ử ụ ạ

ẩ

ế

ấ

ể ế ạ

ự

bacillus và các x khu n chi Streptomyces vi c s d ng nguyên sinh ch t thi u vách ệ ử ụ (t bào tr n) đ bi n n p có ý nghĩa th c ế ầ ti n cao….(SGT) ễ

4.2.BI N N P (transformation) 4.2.BI N N P (transformation) Bi n n p nhân t o (Kh n p nhân t o ) ạ Bi n n p nhân t o (Kh n p nhân t o ) ạ Ế Ế ạ ạ ả ạ ả ạ ế ế ạ ạ

Ạ Ạ

đi n

4.2.BI N N P (transformation) 4.2.BI N N P (transformation) Bi n n p nhân t o (Kh n p nhân t o ) ạ Bi n n p nhân t o (Kh n p nhân t o ) ạ ả ạ ả ạ ế ế ạ ạ

ứ ấ

ụ ệ

Khi công t c th nh t đóng, t ệ

ộ

ạ

ệ

ắ

ứ

ộ

ậ

ổ

ầ

c c a t ướ ủ ế ế ệ

bào) trong vài ph n ầ

ệ

ạ

ố

bào và

ế

t m th i. Kh năng

ủ ờ

ử

ượ ạ

ệ

Ế Ế ạ ạ ắ

ơ ả

ủ

ạ

n p đi n vào và tích m t đi n áp cao. Khi công t c th hai đóng, đi n ệ áp này phóng qua d ch huy n phù t ề ị ế bào. M t xung đi n c n thi t cho k ỹ ế ệ ầ ng là kho ng 10.000- thu t này th ả ườ 100.000 v/cm (thay đ i tùy theo kích th tri u giây đ n m t ph n ngàn giây. ộ Xung đi n này làm r i lo n phospholipid kép c a màng t t o ra các l ả ỗ ạ ạ bào cùng lúc tăng đi n qua màng t ế ệ đã lên 0,5-1,0 v vì v y các phân t ậ đ ế bào thông qua các l

màng.

c n p đi n này đi qua màng t ỗ

S đ b trí m ch c b n c a máy ơ ồ ố xung đi nệ

Ạ Ạ

ạ

Hình 2.18: S đ plasmid ch a DNA ngo i lai đi qua các l ế

ơ ồ ờ trên màng t t m th i

ứ bào ch t ấ

ỗ ạ

4.2.BI N N P (transformation) 4.2.BI N N P (transformation) Bi n n p nhân t o (Kh n p nhân t o ) ạ Bi n n p nhân t o (Kh n p nhân t o ) ạ Ế Ế ạ ạ ả ạ ả ạ ế ế ạ ạ

4.3.T I N P (transduction)

Ả Ạ

bào cho

ể

t ừ ế

c chuy n

ắ

ể

ượ

ậ ỉ ộ

sang t ườ

ườ

ợ

ườ bào ch

ư ấ ng g p

các loài

ng b i n p th ị ả ạ i t ủ ả ế Bacillus, Escherichia,

ặ ở

ả ấ ả

ấ ả i n p và các vi khu n đ u t

Đ/n: T i n p là s chuy n gen ADN t ự ả ạ bào nh n nh phage ờ ế Th ng ch m t đo n ng n ADN đ ạ Có - T i n p ph bi n ổ ế ả ạ - T i n p đ c hi u ệ ặ ả ạ Và trong c hai tr ng h p phage t ả t nh m t kh năng dung gi khuy t t ả ế ậ T i n p th ườ ả ạ Pseudomonas, Salmonella, Shigella..Tuy nhiên không ph i t t ả ạ

t c các t ẩ

t c các phage đ u có th ề ể c. i n p đ ề ả ạ ượ

Ả Ạ Ả Ạ

Đ/n: Là ki u t

ặ ặ i n p mà trong đó m t đo n c l p thêm c thay th b ng genom c a phage.

4.3.T I N P (transduction) 4.3.T I N P (transduction) 4.3.1. T i n p không đ c hi u ệ 4.3.1. T i n p không đ c hi u ệ ộ ủ ượ ắ ủ

ả ạ ả ạ ể ả ạ bào ch đ ế ế ằ

ạ

c nhi m phage ôn b t kỳ c a ADN t ủ ấ ho c đ ặ ượ Thí nghi mệ - Ch ng ủ S.typhimurium B+ đ ượ ễ

hòa P22

bào ch các phage đ c ủ

i t ả ế v i ch ng ủ ớ ượ ủ S.typhimurium B-

ấ ộ

ề

ạ ế ệ ủ ạ

- Sau khi dung gi tách riêng và ( khác v i ớ S.typhimurium B+ ít nh t m t tính tr ng di truy n) ấ S.typhimurium B- xu t ấ - K t qu : Khi nuôi c y ả hi n m t s bi n ch ng có tính tr ng c a ủ ộ ố ế S.typhimurium B+

Ả Ạ Ả Ạ

ả ạ ả ạ

Đ i v i phage 22 c a

4.3.T I N P (transduction) 4.3.T I N P (transduction) 4.3.1. T i n p không đ c hi u ệ 4.3.1. T i n p không đ c hi u ệ ố ớ

ỉ ộ ạ

ặ ặ ủ Salmonella, phage P1 c a ủ E.coli ch m t tính tr ng ho c là các gen ặ c t r t g n nhau là có th đ i n p. ể ượ ả ạ ấ ầ i n p ch b ng 1-2% ADN ượ ả ạ ạ

Đo n ADN đ c a vi khu n ẩ ủ

Phage PBS1 c a B.subtilis t

c t ỉ ằ

c 8% ủ i n p đ ả ạ ượ

genom c a TB ch ủ ủ

Quá trình t Quá trình t

ả ạ ả ạ

i n p nh phage ờ i n p nh phage ờ

Chu trình nhân lên c a phage

ủ

Ả Ạ

4.3.T I N P (transduction) 4.3.2. T i n p đ c bi ả ạ

t ệ

ặ

ỏ ỉ ộ

• Ch m t đo n ADN nh xác đ nh đ ạ

ị lamda th ạ ẳ c t ượ ả ạ ườ i n p ng ch ỉ

ế

mà thôi.Ch ng h n là phage i n p gen gal và gen bio. t ả ạ i n p nhi m vào 1 t ả ạ ễ t ch ng h n gen gal (-), tái t ẳ bào nh n b ị ậ h p qua ổ ợ

ạ ằ

• VD: Phage t khuy t t ế ậ trao đ i gen gal (-) b ng t ổ th tái t ổ ợ ể s là gal (+). ẽ

h p ho c các th t i n p gal (+). Các i n p t o thành ặ ả ạ ể ả ạ ạ

Ả Ạ

4.3.T I N P (transduction) 4.3.2. T i n p đ c bi ả ạ

t ệ

ặ

• Phage phi 80 : l p vào c nh gen đ c mã t ng ể

ắ ọ ổ

ệ ợ ợ

ạ h p triptopan do dó thích h p cho vi c chuy n các gen trp.

ng h p ADN đ i n p không ợ

ằ

• M t s tr ộ ố ườ h p mà n m ngoài NST c a th nh n: tái t ậ ổ ợ bào d h p v tính tr ng đ c truy n t =>”t ề ả ạ ề ị ợ ế c phiên mã nh ng không sao chép. ADN đ

i”- c t ượ ả ạ ể ủ ượ

ư

ượ => “T i n p khuy t” ả ạ ế

4.3.3. Ti p h p ( conjugation) 4.3.3. Ti p h p ( conjugation)

ế ế

ợ ợ

ế ợ

ể

T bào cho ch a m t y u t

ng t bào cho (đ c) sang t ế ậ ầ ẩ t ừ ế ự

Đ/n: Ti p h p là s v n chuy n ADN qua ự ậ ể thi t l p c u ti p h p tr c ti p gi a hai t ữ ế ế ợ ự ế bào vi khu n, s d ch chuy n này đ c đ nh ượ ị ự ị h bào nh n ậ ế ướ (cái). ế

ộ ế ố

c g i là plasmid gi ứ ể ượ ọ ớ

Khi ti p h p 100% plasmid đ

ADN có th di chuy n đ ữ TB thi u plasmid F (F-) ch có th là th nh n ậ ỉ

ợ ế ế

ể i tính F. Nh ng ể ể c chuy n ể ượ ễ ủ ắ

c h p chuy n. nh ng không có tính tr ng nào c a nhi m s c ư ạ th đ ể ượ ợ ể

4.3.3. Ti p h p ( conjugation) 4.3.3. Ti p h p ( conjugation)

ế ế

ợ ợ

Plasmid có th h p nh t vào nhi m s c th và ấ c

ắ ễ ể ể ợ

ắ

ẩ ơ ầ ớ

=> T bào Hfr (t n s cao c a các th tái t ầ ố

khi ti p h p ADN c a nhi m s c th s đ ể ẽ ượ ễ ợ ế ủ vi khu n cho sang vi khu n nh n chuy n t ậ ẩ ể ừ v i t n s cao h n hàng trăm l n so v i dùng ớ ầ ố ch ng F+ ủ ế ổ ủ ể

Plasmid F g n vào NST theo ki u thu n

h p)ợ

ể ắ ậ

ị

bào ch t o ủ ế ủ ạ

ngh ch và khi tách ra n u không chính xác nó s ẽ ế kéo theo 1 đo n ADN c a t ạ plasmid F’

Ti p h p ợ Ti p h p ợ ế ế

Ủ Ủ

4.4.VAI TRÒ C A CÁC PLASMID 4.4.VAI TRÒ C A CÁC PLASMID TRONG SINH H CỌ TRONG SINH H CỌ

5 base có kh năng t

ADN s i kép, vòng kín, ử

Plasmid là phân t ướ

sao chép ự

c 10 kích th đ c l p v i nhi m s c th ớ ộ ậ ễ ợ ả ể.

ắ C¸c tÝnh tr¹ng ®­îc m· ho¸ bëi plasmid th­ êng cung cÊp cho c¸c tÕ bµo chñ c¸c ­u thÕ sinh tr­ëng, vµ nhê ®ã mµ c¸c tb nµy thu ®­îc ­u thÕ chän läc.

Vai trò c a các plasmid trong sinh h c Vai trò c a các plasmid trong sinh h c

ủ ủ

ọ ọ

ọ ủ

Vai trò c a các plasmid trong sinh h c + Plasmid kháng thu cố + Plasmid mã hóa bacteriocin + Plasmid mã hóa y u t + Plasmid mã hóa trao đ i ch t ph c t p ứ ạ

ệ

gây b nh ế ố ấ ổ

4.4.1. Plas mid kh¸ng Plasmid R (plasmid kh¸ng thuèc) … Kh¸ng víi kim lo¹i nÆng, nh­ b¹c, nicken, C¸c plasmid R cã thÓ ®­îc chuyÓn t¶i

nhê tiÕp hîp hoÆc biÕn n¹p. Mét sè gen nhiÔm s¾c thÓ còng ®­îc huy ®éng bëi plasmid R.

4.4.2. Plas mid m· ho ¸ bac te rio c in Mét sè protein cã kh¶ n¨ng giÕt chÕt

hoÆc k×m h·m sinh tr­ëng cña c¸c loµi th©n thuéc, lµ c¸c bacteriocin vµ do plasmid m· ho¸: Colixin, pyoxin, megaxin.

4.4.3. Plas mid m· hãa yÕu tè g ©y bÖnh C¸c yÕu tè x©m thùc – invasin (S . fle xne ri ), Enterotoxin ( ®éc tè ruét) ®éc víi ®­êng ruét vµ g©y Øa ch¶y, Hemolyzin cã t¸c dông dung gi¶i hång cÇu. C¸c siderophor liªn kÕt s¾t nh­ aerobactin

4.4.4. Plas mid m· ho ¸ trao ®æ i c hÊt

C¸c plasmid khæng lå, kÝch th­íc kho¶ng

phø c t¹p

C¸c plasmid cã vai trß trong tiÕn ho¸.

300-1200 kb, ®­îc gäi lµ c¸c mega plasmid m· hãa c¸c gen cè ®Þnh nit¬ t¹o nèt sÇn, qóa tr×nh nitrat ho¸.

4.4.5. C¸c thÕ hÖ plas mid + C¸c p las m id thÕ hÖ thø nhÊt: lµ c¸c plasmid t×m thÊy trong tù nhiªn (ColE1, pSC101,…),

+ C¸c p las m id thÕ hÖ hai: c¸c plasmid ®­

îc t¹o ra b»ng c¸ch tËp trung c¸c ®Æc tÝnh quý cña nhiÒu plasmid tù nhiªn vµo mét plasmid.

+ C¸c p las m id thÕ hÖ b a: ®©y lµ c¸c

plasmid m¹nh nhÊt hiÖn nay víi 2 ®Æc tÝnh c¬ b¶n lµ : (1) kÝch th­íc nhá nªn sao chÐp rÊt nhanh, t¹o ®­îc nhiÒu b¶n sao trong vi khuÈn; (2) cã mang mét polylinker (polycloning site).

Ả Ả

I H N VÀ C I Bi N 5. GI Ế Ớ Ạ I H N VÀ C I Bi N 5. GI Ế Ớ Ạ S K THU T GEN CC S K THU T GEN Ậ Ơ Ở Ỹ Ậ Ơ Ở Ỹ HiÖn t­îng giíi h¹n vµ enzym giíi h¹n do Hamilton Smith vµ céng sù ph¸t hiÖn ®Çu tiªn (1970) ë vi khuÈn Hemophilus influenzae.

B×nh th­êng tÕ bµo VK bÞ nhiÔm

phage th­êng bÞ phage ph¸ hñy. Mét sè chñng khi bÞ nhiÔm phage kh«ng bÞ phage ph¸ hñy mµ cã kh¶ n¨ng ph©n hñy ADN phage, nhê mét sè lo¹i enzym ®Æc hiÖu trong tÕ bµo VK.

Ả Ả

I H N VÀ C I Bi N 5. GI Ế Ớ Ạ I H N VÀ C I Bi N 5. GI Ế Ớ Ạ S K THU T GEN CC S K THU T GEN Ậ Ơ Ở Ỹ Ậ Ơ Ở Ỹ HÖ thèng enzym ph¸ huû ADN l¹ x©m nhËp

vµ b¶o vÖ ADN b¶n th©n lµ hÖ thèng enzym giíi h¹n.

HÖ thèng enzym giíi h¹n (restrictase) cã hai

lo¹i ho¹t tÝnh enzym: endonuclease vµ methyltransferase. C¶ hai thÓ hiÖn ho¹t tÝnh ë mét ®o¹n x¸c ®Þnh tr×nh tù ph©n biÖt. Methyltransferase c¶i biÕn tr×nh tù ADN tÕ bµo (methyl ho¸ adenyl ë vÞ trÝ N-6 khi sao chÐp), vµ råi endonuclease ®­îc ho¹t ho¸, ADN l¹ kh«ng ®­îc c¶i biÕn lµ c¬ chÊt cho enzym nµy.

5. 1. C¸c endonuclease giíi h¹n C¸c endonuclease giíi h¹n 5. 1. C¨n cø vµo kh¶ n¨ng nhËn biÕt vµ vÞ trÝ

Enzym giíi h¹n Lo ¹i I ®­îc cïng 1 protein

c¾t ®Æ c hiÖu ng-ê i ta chia e nz ym giíi h¹n lµm 3 lo¹i:

Enzym giíi h¹n Lo ¹i II cã endonuclease vµ methyltransferase ®­îc mang bëi 2 protein kh¸c nhau, cã tr×nh tù nhËn biÕt ®Æc hiÖu, vÞ trÝ c¾t ®Æc hiÖu vµ n»m trong vïng nhËn biÕt, thÓ hiÖn sù ®èi xøng quay kÐp, ®­îc sö dông trong t¹o dßng

mang c¶ hai ho¹t tÝnh, tr×nh tù nhËn biÕt ®Æc biÖt, c¾t ADN ngÉu nhiªn.

nh©n b¶n gen.

5. 1. C¸c endonuclease giíi h¹n C¸c endonuclease giíi h¹n 5. 1. Enzym giíi h¹n lo¹i III ®­îc cïng mét protein

Cã hµng tr¨m enzym giíi h¹n th­¬ng m¹i. C¸c RE c¾t ®o¹n ADN lÖch ®i t¹o ra ®Çu dÝnh (cè kÕt), cßn sè enzym kh¸c nÕu c¾t trªn cïng mét vÞ trÝ sÏ t¹o ra c¸c ®Çu b»ng (tï).

C¸c ®o¹n ADN víi c¸c ®Çu dÝnh bï t¹o lk hydro, sau ®ã ligase hµn l¹i, t¹o lk míi

mang c¶ hai ho¹t tÝnh, cã vÞ trÝ nhËn biÕt ®Æc hiÖu vµ vÞ trÝ c¾t còng ®Æc hiÖu.

Mét sè enzym giíi h¹n

g è c tù nhËn

3'

Ng uån e nzym Tªn g äi Trình biÕt

5' G A A* T T C 3' GA

TTC

A*

5'

EcoRI

3'

Es che richia coli R Y 13

GC

C*

5'

5' G C* G C 3' G

HhaI

Hae m ophilus hae m olyticus

5' 3'

T CA

3' 5'

G G C* C A T GGC*

BalI

Bre vibacte rium albidum

C

3' 5'

5' G G C* C 3' GGC*

HaeIII

Hae m ophilus ae gyticus

5.2. ThiÕt kÕ c ¸c plas mid 5.2. ThiÕt kÕ c ¸c plas mid (ve c tor) t¸i tæ hîp (ve c tor) t¸i tæ hîp NÕu 2 lo¹i ADN ®­îc xö lý víi

cïng 1 RE (restrictase) th× mçi ADN sÏ cã ®Çu dÝnh t­¬ng hîp nhau vµ 2 ®o¹n ADN Êy sÏ g¾n l¹i ®­îc víi nhau t¹o thµnh ADN duy nhÊt. Plas mid mµ cã chø a 2 lo¹i ADN cã nguån kh¸c nhau ®-îc gäi lµ plas mid t¸i tæ hîp .

Enzim cắt

Enzim  cắt

Tách ADN NST của “tế bào cho”

Đoạn ADN bị cắt ra

Gắn đoạn bị cắt vào plasmid nhờ enzim nối

ADN tái tổ  hợp

Chuyển ADN tái tổ hợp vào  tế bào nhận E.coli

Enzim cắt

Tách ADNnst  tb cho

ADN tái tổ hợp

Chuyển  ADNtth vào  TB nhận

Tách plasmit

Enzim cắt

5.2. ThiÕt kÕ c ¸c plas mid 5.2. ThiÕt kÕ c ¸c plas mid (ve c tor) t¸i tæ hîp (ve c tor) t¸i tæ hîp Cã thÓ g¾n ge n (b¶n s ao cADN) cña s inh vËt nh©n thËt bËc cao (vd v-în, ng-ê i) vµo 1 plas m id, the o c¸c b-íc s au: tõ m « vËt chñ ta chiÕt lÊy pre -m -AR N tõ ge n m ôc tiªu råi lo¹i bá intron vµ ghÐp nè i c¸c e xon ta ®-îc m -AR N tt. Tõ m -AR N tr-ë ng thµnh nhê e nz ym phiªn m · ng-îc tæ ng hîp cADN (kü thuËt R T-PCR ), vµ cADN ®-îc ghÐp víi plas m id t¹o thµnh plas m id lai.

C¸c b­íc chÝnh chÕ t¹o plasmid t¸i tæ hîp

BiÕn n¹p: xö lý tÕ bµo nhËn víi dung dÞch CaCl2 ë nhiÖt ®é thÊp (0-4ºC víi E. coli), bæ sung plasmid tt hîp råi ®un nãng tÕ bµo nhËn (tíi 42ºC víi E. coli) ®Ó g©y shock nhiÖt chung. Nhê vËy tÝnh thÊm cña tÕ bµo VSV thay ®æi, cho phÐp plasmid x©m nhËp tÕ bµo.

TÕ bµo sau khi bÞ xö lý víi shock ®iÖn

5.3. §­a plas mid tt hîp vµo tÕ bµo vk 5.3. §­a plas mid tt hîp vµo tÕ bµo vk nhËn nhËn

Ng­êi ta sö dông c¸c gen kh¸ng kh¸ng sinh

(xung ®iÖn), shock ®iÖn t¹o thµnh c¸c mao dÉn qua ®ã plasmid cã thÓ dÔ dµng x©m nhËp tÕ bµo.

nh­ kh¸ng tetracyclin, ampicilin ®Ó lµm dÊu hiÖu nhËn biÕt tÕ bµo ®· dung n¹p plasmid.

Khi tÕ bµo VK nhËn plasmid t¸i tæ hîp, tÕ

5.3. §­a plas mid tt hîp vµo tÕ bµo vk 5.3. §­a plas mid tt hîp vµo tÕ bµo vk nhËn nhËn

V× plasmid lµ t¸c nh©n biÕn truyÒn nhê ®ã mµ gen míi ®­îc ®­a vµo tb vk, nªn plasmid cßn ®­îc gäi lµ vect¬ t¹o dßng.

Víi mét sè plasmid, viÖc cho vµo m«i tr­êng nång ®é thÊp cña chloramphenicol d® viÖc sao chÐp plasmid mÊt ®iÒu khiÓn khiÕn hµng tr¨m b¶n sao plasmid (vµ tÊt nhiªn gen ngo¹i lai trong ®ã) ®­îc tæng hîp bëi mçi mét tÕ bµoVK. Sù sao chÐp bÊt th­êng nh­ vËy cña plasmid gäi lµ sù khuyÕch ®¹i.

bµo sinh s¶n t¹o thµnh 1 quÇn thÓ lín c¸c tb gièng nhau gäi lµ mét dßng.

6. Kt PCR vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù ADN

6.1. Ph¶n ø ng c huç i trïng hîp (PCR) Ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR lµ ph­¬ng ph¸p t¹o dßng (khuÕch ®¹i) ADN in vitro, (c«ng bè th¸ng 10 n¨m 1985 nhê ph¸t minh cña Karl Mullis)

Ph­¬ng ph¸p PCR cho phÐp khuÕch ®¹i, t¹o mét sè l­îng rÊt lín b¶n sao cña gen ( hay mét ®o¹n ADN) trong mét thêi gian ng¾n.

Ph­¬ng phaps PCR ®· t¹o ra mét b­íc nh¶y vät cña sinh häc ph©n tö vµ kü thuËt gen.

b¾t cÆp ®­îc víi 2 ®Çu mét ®o¹n ADN, enzym taq ADN polymerase, ion Mg2+ vµ c¸c nucleotid t­¬ng øng, trong 3 chu kú nhiÖt thÝch hîp ®o¹n ADN ®· nªu sÏ ®­îc tæng hîp khuÕch ®¹i lªn mét c¸ch m¹nh mÏ

Måi (®o¹n ADN måi - probe) lµ ®o¹n ADN ng¾n cã kh¶ n¨ng sãng ®«i bæ sung víi 1 ®Çu cña m¹ch khu«n vµ ADN polymerase sÏ nèi dµi måi ®Ó t¹o thµnh m¹ch ADN míi

 CÇn cã th«ng tin tèi thiÓu vÒ tr×nh tù cần

khuếch ®¹i, ®ñ ®Ó t¹o c¸c måi bæ sung chuyªn biÖt. Cã mét måi xu«i vµ mét måi ng­îc (so víi chiÒu phiªn m·).

6.1.1. Ng uyªn t¾c 6.1.1. Ng uyªn t¾c  Trong ®k in vitro víi c¸c ®o¹n måi chuyªn biÖt

B-íc 2: NhiÖt ®é 38-70oC, 30 gi©y - 1

phót. §©y lµ giai ®o¹n lai.

B-íc 3: NhiÖt ®é 72oC, vµ ®­îc gi÷ ë

®©y tõ 30 gi©y - vµi phót ADN polymerase chÞu nhiÖt (Taq ADN pol) tæng hîp ADN sîi ®óp míi tõ c¸c ADN sîi ®¬n

6.1.2. Thùc ng hiÖm Gåm chuçi pø 3 chu kú nhiÖt B-íc 1: Ph©n tö (®o¹n) ADN ®­îc biÕn tÝnh ë 94 - 95oC, 30 gi©y - 1 phót, giai ®o¹n biÕn tÝnh

5' 3'

94-95 Co

C¸c b­íc chu kú cña kü thuËt PCR C¸c b­íc chu kú cña kü thuËt PCR 3' 5'

A

LÆp

3'

5'

5'

3'

l¹ i

o

38-70 C

B

3'

5'

n lÇn

5'

3'

C

o 72 C

3'

5'

5'

3'

6.1.2. Thùc ng hiÖm 6.1.2. Thùc ng hiÖm

Nh­ vËy, mét chu kú 3 b­íc sÏ ®­îc

lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ mçi lÇn sÏ lµm t¨ng gÊp ®«i l­îng mÉu ADN cña lÇn tr­íc.

Sau 30 chu kú sù khuÕch ®¹i sÏ t¨ng

lªn 106 lÇn so víi l­îng khu«n ban ®Çu.

Tïy thuéc vµo sè l­îng khu«n ban

®Çu ®Ó chän sè khu«n chu kú phï hîp ,

Các y u t Các y u t

c n thi c n thi

t cho PCR t cho PCR

ế ố ầ ế ố ầ

ế ế

do (dNTP)

ự

ệ

ị ế ị ự

t b th c hi n ph n ng ệ

ả ứ

ADN khuôn Các nucleotid t M i ồ Enzym ADN polymerase Dung d ch đ m cho PCR Thi

ế ế

ế ố ầ ế ố ầ

ữ

t cho PCR t cho PCR ộ

Các y u t c n thi Các y u t c n thi ADN khuôn: tinh s ch là m t trong nh ng ạ đ m b o cho PCR chính xác. Kích

ớ

y u t ế ố ả th ướ ủ th ườ

ộ

c đo n gen và s chu kỳ PCR ố c ch n. N u n ng đ các lo i dNTP ít ộ ế

ả c c a đo n khuôn không quá l n ạ t nh t. ng 3 kb là t ấ ố Các nucleotid t do (dNTP) tùy thu c vào ự kích th ướ ạ đ ượ ạ ọ ế ồ không đ th c hi n. N u quá nhi u p ề ứ ệ ủ ự cũng khó th c hi n ệ ự

c n thi c n thi

t cho PCR t cho PCR

ế ế

ế ố ầ ế ố ầ

ồ

Các y u t Các y u t * M i: ồ + M t c p m i trong PCR g m m t m i xuôi t đ Tm

ộ c R.Yêu c u nhi ồ ồ ầ ồ ệ ộ

ộ ặ F và m t m i ng ượ ộ c a các không chênh l ch quá l n ủ

ồ ế

ớ ả ả ả

ệ ặ ồ

c a m i có tính đ c hi u cao, ch ỉ ự ủ ồ ớ ầ ượ ắ ặ

ệ + M i không quá ng n (k t qu PCR không ắ chính xác ) ho c quá dài (khó đ m b o thành ặ công c a PCR) ủ + Trình t b t c p v i đ u 3’ cu m ch khuôn. Các m i ả ạ ắ ặ không đ ớ + Trong PCR ph i xác đ nh n ng đ m i phù c b t c p v i nhau. ồ ộ ồ ả ị

h pợ

c n thi c n thi

ế ế

ế ố ầ ế ố ầ

Các y u t Các y u t *Enzym ADN polymerase: là y u t

t. ử ụ

t cho PCR t cho PCR r t quan ế ố ấ ng s d ng các enzym ch u nhi tr ng.Th ệ ị N ng đ c a enzym s d ng ph i v a đ . ả ừ ủ c nóng

ườ ộ ủ ử ụ ọ ồ

+ Taq ADN polymerase (VK su i n ố ướ

Thermus aquticus)

+Tth ADN polymerase (Thermus theromophylus)

ư

c khi có ho t đ ng nh enzym phiên mã ng m t ARN làm khuôn và ion Mn2+ k t qu thu ả đ ượ ế ARN khuôn ban đ u. c cADN t ạ ộ ặ ượ ừ ầ

ộ ố

+ M t s enzym khác nh T4 ADN polymerase , ư Vent ADN polymerase , Pfu ADN polymerase …

ẩ ượ

C¸c øng dông cña PCR K thu t PCR chu n (standard) ậ K thu t PCR ng c (RT – PCR) ậ K thu t PCR l ng ( Nested PCR) ồ ậ K thu t PCR đ o (inverse PCR) ả ậ K thu t PCR ph c (Multiplex ứ ậ

i ch (PCR in situ)

ỹ ỹ ỹ ỹ ỹ PCR) ỹ

ạ

ỗ

K thu t PCR t ậ

C¸c øng dông cña PCR

S d ng PCR tách dòng gen, xây d ng ngân

ử ụ

ự i trình t ự ậ ả ồ ả

Nghiên c u chu n đoán s m các b nh

hàng gen, l p các b n đ gen, gi gen.

ứ ẩ ớ

ễ ẩ ộ ệ ế

nhi m virus, vi khu n và các đ t bi n gây r i lo n di truy n . ố ề ạ

ọ

PCR có vai trò quan tr ng trong nghiên c u ứ ngu n g c các loài sinh v t và trong phân ồ lo i.ạ …….

ậ ố

* Gi¶i tr×nh tù gen ( ADN sequenceing) lµ ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh vÞ trÝ s¾p xÕp c¸c nucleotid trong ph©n tö ADN * Mét sè ph­¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù: + Ph­¬ng ph¸p hãa häc cña Maxam vµ

Gilbert (1977) vµ

+ Ph­¬ng ph¸p enzym häc cña Sanger

vµ céng sù (1977).

+ Ph­¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù b»ng m¸y tù

®éng

6.2. K THU T XÁC Đ NH TRÌNH T GEN 6.2. K THU T XÁC Đ NH TRÌNH T GEN Ự Ự Ậ Ậ Ỹ Ỹ Ị Ị

)

Ph

ng pháp enzyme (1977

ươ

Frederick (Fred) Sanger

Ph­¬ng ph¸p e nzym

Nguyªn lý: Ph­¬ng ph¸p Sanger dùa vµo sù tæng hîp m¹ch bæ sung (bï) cña tr×nh tù ADN m¹ch ®¬n cÇn x¸c ®Þnh nhê enzym ADN polymerase. Ngoµi 4 Nu cÇn thiÕt cßn cÇn 4 dideoxynucleotid lµm ngõng p.ø.

[A]

[G]

[C]

[U]

H

H

H

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

O

O

O

OH

O

OH

OH

3'

OH

3'

3'

3'

H

5'

H

5'

5'

H

H

5'

HO

O

P

PO

O

O P

O

H2C

O P

O

H2C

OH

H2C

H2C

O

O

O

O

M¹ch ®¬n polynucleotid cña ARN

[A]

[G]

[C]

[T]

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

3'

3'

3'

3'

H

H

H

H

PO

O

HO

O

P

PO

O

5' H2C

O P

O

5' H2C

OH

5' H2C

5' H2C

O

O

O

O

M¹ch ®¬n polynucleotid cña ADN

Ỹ Ỹ Ậ Ậ Ị Ị

6.2. K THU T XÁC Đ NH TRÌNH T Ự 6.2. K THU T XÁC Đ NH TRÌNH T Ự GENGEN

ng pháp Sanger ng pháp Sanger

ươPh ươ Ph

SANGER DIDEOXY SEQUENCING SANGER DIDEOXY SEQUENCING SANGER DIDEOXY SEQUENCING SANGER DIDEOXY SEQUENCING

End labeled End labeled

primer primer

ddNTP Reaction Mix ddNTP Reaction Mix

5’- 5’-

4 tubes 4 tubes

DNA DNA Polymerase Polymerase

C T A G C T A G

+dNTPs +dNTPs

ddATP ddATP

+ one of: + one of:

ddTTP ddTTP

ddCTP ddCTP

ddGTP ddGTP

5’- 5’-

C C

5’- 5’-

C C

5’- 5’-

5’ 5’ C C G G T T A A A A G G G G T T A A T T C C C C 3’ 3’

C C

autoradiograph of dried autoradiograph of dried sequencing gel sequencing gel

In the ddGTP reaction there is a In the ddGTP reaction there is a random chance a ddGTP will be random chance a ddGTP will be incorporated across from a C incorporated across from a C

Sequence is complementary Sequence is complementary to the strand being sequenced! to the strand being sequenced!

ng pháp Sanger ng pháp Sanger

ươPh ươ Ph

trình t trình t

gen ADN b ng máy t gen ADN b ng máy t

ằ ằ

ự ự

ự ự

ằ

Gi ả Gi ả đ ngộđ ngộ Ph ng pháp gi i trình t ả ươ đ ng hoàn toàn đ c thi ượ ộ t c c a s d ng ddNTP c a Sanger và c ng ắ ủ ử ụ s .ự

gen b ng máy t ự ự t k trên nguyên ế ế ộ ủ

ổ ợ ấ ạ

ằ ỗ ắ

ế

Trong quá trình t ng h p đánh d u m i lo i ddNTP b ng m t flourchrom có màu s c khác nhau => nh ng olygonucleotid cùng k t i ddNTP s có cùng m t màu. thúc t Sau khi đi n di trên gen polyacrylamid k t ế

ộ ữ ẽ ạ ộ

ệ

ệ ố ắ ớ

c đ c qua h th ng g n v i máy qu s đ ả ẽ ượ ọ tính đi u khi n ể ề

ụ ụ

Ứ Ứ

ủ ỹ ủ ỹ

ậ ậ

7. ng d ng c a k thu t gen 7. ng d ng c a k thu t gen C«ng nghÖ d-îc phÈm s ö dông kü thuËt biÕn ®æ i ge n ®· s ¶n xuÊt ®-îc c¸c ho¹t chÊt, d-îc chÊt nh-:

S n xu t vacin phòng b nh l

ả ệ ở ồ

m m long h p và vaccin phòng ổ ợ

ố

ấ móng , vaccin tái t ch ng viêm gan B. Vaccin ch ng AIDS. ố S n xu t insulin ấ K thu t di truy n VSV v i nông nghi p ệ ề ậ ả ỹ ớ

ể

ệ

ệ ố

ẩ

ọ

ỹ

ạ ủ ỹ

ự

ậ

Các h th ng bi u hi n genBi u hi n gen t o s n ph m protein ạ ả ệ ể h p là k thu t quan tr ng, tái t ậ ổ ợ quy t đ nh s thành b i c a k thu t ế ị gen.

c

ế

bào ch th ủ ườ ệ

bào n m men, ấ

ậ

ng đ ượ s d ng trong bi u hi n gen g m: ồ ể ử ụ T bào Vi khu n, t ế ẩ ế t bào tr ng c a đ ng v t có vú, ủ ộ ứ ế bacilovirus…

H th ng t ệ ố

Bi u hi n gen trong t

bào VK

ể

ệ

ế

VK E.coli đ

ượ ư

c a chu ng trong ộ

ể

ng nhanh,

ưở

bi u hi n gen: ệ ố ộ ể

ả

ệ

ổ

ạ

- E.coli có t c đ sinh tr

ề

c bi

đ

kh năng bi u hi n protein tái t h p m nh ợ ấ ượ - Môi tr

ể ặ ng đ i rõ. t t ố ế ươ ng nuôi c y kinh t ấ

ườ

. ế

- C u trúc và đ c đi m di truy n đã

ề

ẩ

ố

ả

ờ

i.

Vaccin Vaccin Vaccin truy n th ng ố : là vi khu n ho c ặ c virus s ng đã làm gi m đ c l c. Nh ượ ộ ự ả đi m: th i gian b o qu n ng n, khó b o ả ắ ả ể đ m an toàn → tính đ c h i l ộ ồ ạ ả

ậ ộ

ệ

ẩ

ả

ệ ể

ư

ệ

Vaccin TTH: protein kháng nguyên nh ờ k thu t DNA. u đi m: giá thành r , s ẻ ử Ư ể ỹ d ng r ng rãi ch ng các b nh do vi ố ụ khu n, ký sinh trùng, viêm gan do virus. Vaccin TTH có hi u qu cao trong phòng ch ng b nh hi m nghèo (ung th , AIDS, ố …)

7.1. Vac c in bÖnh lë måm long mãng , vac in t¸i tæ hîp vµ vac in c hè ng viªm gan B . Gen protein vá ®Æc hiÖu cña virus g©y lmlm ë ®éng vËt ®­îc ®­a vµo plasmid vµ plasmid t¸i tæ hîp ®­îc biÕn n¹p vµo E.coli. ChiÕt xuÊt dÞch nu«i cÊy ®Ó thu ®­îc vaccin.

Tr­êng hîp vk Vibrio chole ra ta lo¹i bá 1

M¸u cña nh÷ng ng­êi m¾c bÖnh virus viªm

phÇn gen m· ho¸ enterotoxin cña vi khuÈn tr­íc khi dïng chóng ®Ó s¶n xuÊt vaccin, kq vÉn tèt.

gan B (HBV) kinh niªn cã chøa c¸c h¹t protein nhá v« h¹i cña virus. §©y lµ protein HBsAg. S . ce re vis ie ae biÕn ®æi gen cã thÓ s¶n xuÊt HBsAg lµm vaccin.

7.3. S¶n xuÊt ins ulin Nguy ªn lý Gen chuyªn tr¸ch vÒ cÊu tróc insulin tõ c¸c nguån kh¸c nhau (tæng hîp hãa häc hay ph©n lËp tõ c¸c nguån kh¸c nhau råi ®­îc khuyÕch ®¹i) ®­îc ®­a vµo tbµo VSV. Khi c¸c VSV ph¸t triÓn sÏ biÓu hiÖn gen míi nµy vµ t¹o ra ho¹t chÊt insulin mµ ta mong muèn.

7.3. S¶n xuÊt insulin

Insulin bao gåm 2 m¹ch polypeptid: m¹ch dµi 30 (B) vµ m¹ch ng¾n 21 (A) ®¬n vÞ acid amin. Gen m· ho¸ polypeptid nµy chøa hai chuçi ADN: chuçi dµi chøa 18 ph©n ®o¹n nucleotid, vµ chuçi ng¾n chøa 11 ph©n ®o¹n.

Hai chuçi nµy ®­îc tæng hîp thµnh 2 ®o¹n

Plasmid ®­îc biÕn n¹p vµo E.coli. TiÕn

gen riªng biÖt vµ ®­îc ghÐp vµo 1 plasmid.

hµnh lªn men chñng E.coli biÕn ®æi gen. S¶n phÈm thu ®­îc hai m¹ch A, B ®­îc g¾n l¹i víi nhau t¹o ra in sulin ho¹t ®éng

(KT 2 block).

H×nh 5.15. S¶n xuÊt insulin víi kü thuËt 2 S¶n xuÊt insulin víi kü thuËt 2 H×nh 5.15. blockblock

7.3. S¶n xuÊt ins ulin 7.3. S¶n xuÊt ins ulin

Gly

Ile

Chuçi A

Val

S

S

Glu

Gln

Cys

Cys

Thr Ser

Ile Cys

Ser Leu

Tyr

Gln

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

S

S S

S

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gln

Gly

Chuçi B

Asn

Glu

Val

Arg

Phe

Thr Lys

Pro Thr Tyr

Phe

Phe

Gly

7.3. S¶n xuÊt insulin

Ph­¬ng ph¸p s¶n xuÊt insulin mét b­íc: + G¾n gen m· hãa tæng hîp proinsulin vµo tÕ bµo E. coli råi tiÕn hµnh lªn men E.coli biÕn ®æi gen vµ chiÕt lÊy proinsulin.

+ Thñy ph©n tiÒn insulin b»ng protease

cho ta insulin ho¹t ®éng.

+ Ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông víi tÕ

bµo biÓu hiÖn gen lµ nÊm men S.cerevisiae.

S¶n xuÊt insulin theo kü thuËt mét block S¶n xuÊt insulin theo kü thuËt mét block

Ứ ng d ng c a k thu t gen ủ ỹ ụ ậ

c các nhà ủ i đ ườ ượ

ể ệ ả

ườ

h p đ u ầ

ả ủ ẩ

1978 Insulin c a ng khoa h c c a Genetech nhân tách ọ ủ dòng vào E. coli. Genetech sau đó đã chuy n giao công ngh s n xu t ấ insulin cho Eli Lilly. Năm 1982, i, hay Humulin, tr insulin ng ở thành lo i thu c DNA tái t ổ ợ ố ạ tiên đ c C quan Qu n lý Th c ơ ự ượ ph m và D c ph m c a Hoa Kỳ ượ ẩ (FDA) c p phép ấ

S n xu t insulin tái t h p ấ ả ổ ợ

Human Insulin Production by Bacteria

and cut with a restriction enzyme

6) join the plasmid and human fragment

Human Insulin Production by Bacteria

.

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

One cell with the recombinant plasmid

This is the step when gene cloning takes place.

The single recombinant plasmid replicates within a cell.

A fermentor used to grow recombinant bacteria.

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

The final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the insulin protein expressed from the recombinant human insulin gene.

Preproinsulin Preproinsulin is difficult for is difficult for E.coli to E.coli to produce produce

Insulin Insulin

Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total A chain = 21 amino acids B chain = 30 amino acids

7.4. Kü thuËt di truyÒn vs v víi n«ng nghiÖp 7.4. Kü thuËt di truyÒn vs v víi n«ng nghiÖp C¸c chñng Ps e udom onas s yringae vµ

ViÖc t¹o ra vµ kÕt hîp thµnh c«ng c¸c vi

Ps e udom onas fluore s ce ns biÕn ®æi gen ®Ó b¶o vÖ c©y qu¶ chèng l¹i s­¬ng gi¸. Nhê kü thuËt di truyÒn, tÝnh kh¸ng nhiÖt vµ chÞu h¹n cña c©y trång ®­îc c¶i thiÖn, còng nh­ cã thÓ t¹o ra c¸c c©y trång cã tÝnh kh¸ng c«n trïng vµ c¸c VSV g©y bÖnh.

khuÈn cè ®Þnh nit¬ cã kh¶ n¨ng céng sinh víi c¸c c©y ngò cèc

Tuy nhiªn kü nghÖ di truyÒn còng cã thÓ

Kü thuËt di truyÒn VS V Kü thuËt di truyÒn VS V  Kü thuËt di truyÒn còng cã thÓ cung cÊp c¸c biÖn ph¸p míi cho b¶o vÖ m«i tr­êng. lai ghÐp gen ph©n gi¶i dÇu ho¶.

C¸c thÝ nghiÖm liªn kÕt toµn bé hay mét

g©y nhiÒu t¸c h¹i: gen t¹o thµnh ®éc tè, c¸c vÊn ®Ò ®¹o ®øc….

phÇn ADN tõ c¸c virus sinh khèi u, hay c¸c virus kh¸c vµo trong c¸c nh©n tè ADN sao chÐp ®éc lËp (c¸c plasmid cña vi khuÈn hay c¸c ADN virus kh¸c) còng ®Æt ra nh÷ng rñi ro t­¬ng tù.

8. D­îc häc thê i hËu ge nom ng­ 8. D­îc häc thê i hËu ge nom ng­ ê iê i

N¨m 2005 c¸c nhµ khoa häc c«ng bè ®· gi¶i m· ®­îc bé genom ng­ êi….

VÒ ph­¬ng diÖn d­îc häc ngµy nay ®ang dÇn h×nh thµnh m«n khoa häc míi lµ Di truy Òn d­îc häc (Pharmac oge ne tic s ),