Ch
ng II
ươ
CÔNG NGH GENE
Ệ
(GENETICS ENGENEERING)
Nguy n Vũ Phong
ễ
QUY TRÌNH TI N HÀNH
Ế
• B c 1: Nuôi t bào ch và t ế ủ ế
ướ bào cho
• B c 2: Tách DNA plasmind và
ướ DNA t bào cho ế
• B c 3: C t DNA plasmid và ướ ắ
DNA m c tiêu ụ
ướ ạ
• B c 4: N i 2 lo i DNA b ng ằ h p ổ ợ ố ố ạ
enyme n i t o DNA tái t hoàn ch nhỉ
• B c 5: Chuy n DNA tái t
ể bào nh n (th h p ổ ợ ng là vi ườ ậ
ướ vào t ế khu n E.coli) ẩ
• B c 6: Ch n l c và nhân dòng ọ ọ ướ
vi khu n mang gene tái t h p ẩ ổ ợ
ướ • B c 7: Nghiên c u đi u ki n đ ể ứ ề
ệ gene bi u hi n ra s n ph m ệ ể ả ẩ
1. Enzyme
-
1962: h n ch s sinh s n c a phage trong t
bào vi khu n
ế ự
ủ
ả
ạ
ế
ẩ
-
ế
ả
H th ng h n ch - bi n đ i (restriction – modification system) giúp b o v ệ ố ệ . bào kh i s xâm nh p c a DNA l t ạ ế
ạ ỏ ự
ổ ủ
ế ậ
-
Trình t
t: trình t
4-6 c p nu đ i x ng đ o ng
c (palindrom)
ự
nh n bi ậ
ế
ự
ố ứ
ặ
ả
ượ
-
C t t o thành đ u so le (sticky end) hay đ u b ng (cohesive end) .
ắ ạ
ầ
ằ
ầ
1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE)
1. Enzyme
1.1. Restriction
endonuclease enzyme (RE)
-
nh n bi ậ
Kho ng 3000 RE v i ớ ả 230 trình t t ế ự khác nhau.
- Quy t c đ t tên : EcoRI ắ ặ
Eco: Escherichia coli
R: dòng vi khu n ẩ
RE đ c tìm ượ
I: th t ứ ự ra (I: đ u tiên) ầ
1. Enzyme ố
1.2. Enzyme n i (Ligase) - N i : hình thành c u phosphodiester ầ ố
EcoRI GAATTC CTTAAG
EcoRI GAATTC CTTAAG
AATTC G
G CTTAA
Ligase AATTC G
G CTTAA
G CTTAA
AATTC G
1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in an ATP (or NAD+ dependent manner depending on the source of ligase) activated enzyme.
2. Activated enzyme donates AMP to free = at the nick in the lower strand of 5’-PO4 the DNA duplex, creating a high-energy diphosphate group on one side of the nick.
3. Cleavage of
the di-phosphate bond create a new to liberates energy phosphodiester bond. Seals the nick in the DNA.
N.B. Reaction can occur on Both Strands, independent
joining of
two
allowing DNA molecules.
Ligation. (ligere = latin ‘to join’)
1. Enzyme
1.3. Enzyme phiên mã ng c ượ
(reverse transcriptase)
• ộ ợ
ặ ợ ộ
T ng h p DNA m t ổ c-DNA m ch ạ ừ (complementary DNA) t m t s i mRNA ho c t ừ t ng ổ polyribonucleotide h pợ
• ợ ể ổ
nh ờ
ệ ạ ượ
c-DNA có th t ng h p thành c-DNA kép (c-DNA duplex) DNA polymerase. c-DNA kép c dùng trong vi c t o đ dòng c-DNA
1. Enzyme
1.4. Các enzyme khác
Enzyme Ch c năng ứ
DNaseI Endonuclease
Nuclase BAL31 Exon nuclease
S1 nuclease C t DNA m ch đ n ắ ạ ơ
Đo n Klenow ạ ạ ỉ
DNA polymerase ch còn ho t tính exonuclease 3’-5’
Taq polymerase DNA polymerase ch u nhi ị t ệ
2. Các vector chuy n gene
ể
bào ộ ậ ế
Plasmid: - DNA vòng tròn - Sao chép đ c l p trong t - Có kh năng mang m t s gene có kh năng bi u hi n thành protein ộ ố ể ệ ả ả
tái b n ự ả
i đ c l p trong t bào ồ ạ ộ ậ ế
Vector: - Có kh năng t ả - T n t - Mang đ c gene mong mu n ượ ố
2. Các vector chuy n gene Yêu c u đ i v i vector chuy n gene
.
ể ể
- Có trình t
kh i đ u sao chép (ori)
ự
ở ầ
- Trình t
t cho RE
ự
nh n bi ậ
ế
- Trình t
đi u hòa (promoter)
ự ề
- Đ m b o s di truy n b n v ng c a
ủ
ữ
ề
ề
ả
ả DNA tái t
ự h p ổ ợ
- Có gene đánh d u (marker) đ d ể ễ ấ
dàng nh n bi
t.
ậ
ế
ố ớ ầ
- T o dòng và khuy ch đ i trình t
DNA
ế
ạ
ạ
ự
- Nghiên c u s bi u hi n c a đo n trình
ự ể
ứ
ủ
ệ
ạ
DNA
t ự
- Chuy n gene ể
- S n xu t RNA
ả
ấ
gene đ
c t o dòng.
- S n xu t protein t ấ
ả
ừ
ượ ạ
ng d ng c a vector chuy n gene Ứ ụ ủ ể
2. Các vector chuy n gene
ể
2.1. Vector chuy n gene plasmid ể
- Plasmid c a vi khu n và bacteriophage. ẩ ủ
- pBR322
2. Các vector chuy n gene
ể
2.2. Phage λ
- Có h th ng xâm nh p t ậ ự
ệ ố đ ng và sinh s n ả ộ
ạ ặ ạ
ạ ầ
- Có d ng tròn ho c d ng th ng, 2 đo n cos (12 nu) ạ ẳ 2 đ u mút, dùng t o ở cosmid và phagemid
c đo n DNA ượ ạ
- Mang đ (15-23Kb)
- Dùng trong thành l p ậ
ngân hàng gene
2. Các vector chuy n gene
ể
2.3. Cosmid :
- Plasmid g n thêm đo n cos c a ủ ắ ạ
phage,
- Có th ch a đo n gene dài đ n ứ ế ể ạ
45kb
2.4. Phagemid
- Dùng l p th vi n gen ư ệ ậ
2. Các vector chuy n gene
ể
2.5. Phage M13:
- DNA m ch đ n ạ ơ
ự
- Dùng xác đ nh trình t nucleotide c a gene ị ủ
- S n xu t m u dò ấ ẫ ả
(probe)
- Gây đ t bi n đi m đ nh ế ể ộ
ị ng (site-directed ướ
h mutagenesis)
2. Các vector chuy n gene
ể
2.5. Plasmid Ti - Agrobacterium tumefaciens
ở ự th c v t ậ
- Chuy n gen ể - 200Kb - Chuy n và g n ng u nhiên vào b gene ẫ ắ ộ
bào ể c a t ủ ế
2. Các vector chuy n gene
ể
ắ ạ ể
ễ ấ
2.6. Nhi m s c th nhân t o c a n m men (YAC-yeast ủ artificial chromosome) - Plasmid vòng tròn 2m m - Ch a đo n DNA l dài ứ ạ ạ
đ n 2000Kb ế
2.7. Các nhi m s c th nhân ễ ể ắ
t o khác ạ
- BAC (Bacterial artificial
chromosome)
- MAC (Mammalian artificial
chromosome)
- P1AC (P1 bacteriophage
derived artificial chromosome)
3. H th ng t ệ ố
bào ch ủ
ế (Host)
ụ
ng l n dùng cho thí nghi m t o dòng. ố ượ ạ ệ ạ ớ
h p. : M c đích - Nhân nuôi t o s l - Bi u hi n gene ệ - S n xu t protein tái t ấ ể ả ổ ợ
3. H th ng t ệ ố
bào ch ủ
ế (Host)
3.1. Escherichia coli (E.coli)
- D nuôi c y và nhân dòng ễ ấ
- D ch p nh n các lo i vector khác nhau. ễ ạ ậ ấ
- Vi khu n Gram-, hình que, ẩ
- B gene kho ng 4,6x10(6) c p base ặ ả ộ
3.2. Saccharomyces cerevisiae
- Đ i t ng nghiên c u c a vi sinh v t Eukaryote ố ượ ứ ủ ậ
- Phân l p đ c nhi u promotor ho t đ ng m nh ậ ượ ạ ộ ề ạ
- Th c hi n bi n đ i sau d ch mã t o protein có ự ế ệ ạ ị
đ ho t tính sinh h c. ủ ạ ổ ọ
h p - S n xu t protein tái t ấ ả ổ ợ
- Sinh v t an toàn ậ
3. H th ng t ệ ố
bào ch ủ
ế (Host)
3.3. H th ng t ệ ố ế bào th c v t ậ ự
3.4. H th ng t ệ ố ế bào đ ng v t ậ ộ
- T bào th n kh xanh châu Phi (COS- African green monkey ế ậ ỉ
kidney)
- T bào th n chu t đ ng con (BHK- Baby hamster kidney) ộ ồ ế ậ
- T bào th n phôi ng i (HEK-239- Human embryonic kidney ế ậ ườ
cung chu t b ch (CHO-Chinese hamster ovary) - T bào t ế ử ộ ạ
- T bào côn trùng nuôi baculovirus bi u hi n protein ng ề ệ ế i ườ
- T bào tuy n trùng Caenorhabditis elegans ế ế
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
1. Lai nucleic acid
- Tách chi t và tinh s ch DNA và RNA ế ạ
- Đi n di trên gel ệ
-
Wells
Large
Small
+
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
-
Lai trên pha r nắ
Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot và slot blot
1. Lai nucleic acid
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
1. Lai nucleic acid
Dot và slot blot dùng cho RNA và DNA
- Lai trên pha r nắ
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
1. Lai nucleic acid
- Lai trên pha r nắ
- Lai t ạ i ch ổ
situ ứ
ả
t ra ngoài hybridisation): (in nghiên c u nucleic acid t i ạ ch không c n ph i tách ầ ổ chi ế
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
2. Thu nh n gene ậ
- b gene Thu nh n DNA t ậ ừ ộ
* Shotgun
* Ngân hàng/th vi n DNA b gene (Bank/Library of genomic DNA) ư ệ ộ
- T ng h p gene b ng ph ằ ổ ợ ươ ng pháp hóa h c ọ
- L p ngân hàng c-DNA ậ
* Ch a trình t mã hóa liên t c c a m t gene (no intron) ứ ự ụ ủ ộ
* Xác đ nh đúng dòng gene mu n nghiên c u : EX: hemoglobine ố ứ ị
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
2. Thu nh n gene ậ
- b gene Thu nh n DNA t ậ ừ ộ
- T ng h p gene b ng ph ằ ợ ổ ươ ng pháp hóa h c ọ
- L p ngân hàng c-DNA ậ
* Ch a trình t mã hóa liên t c c a m t gene (no intron) ứ ự ủ ụ ộ
* Xác đ nh đúng dòng gene mu n nghiên c u : EX: hemoglobine ố ứ ị
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
h p ạ ổ ợ
3. T o plasmid tái t a) Dùng đ u so le ầ
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
h p ạ ổ ợ
3. T o plasmid tái t a) b) Dùng đ u so le ầ Dùng các đo n n i (linkers) ạ ố
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
h p ạ ổ ợ
3. T o plasmid tái t a) b) c) Dùng đ u so le ầ Dùng các đo n n i (linkers) ố ạ Dùng enzyme terminal transferase
ậ
bào ổ ợ
ạ
ế ạ ả
- h n h p, x lý CaCl2 l nh + s c nhi t (42oC, 2 phút)
K thu t và ỹ ng pháp căn b n ph ả ươ h p vào t 4. Bi n n p DNA tái t ế ạ ế Hóa bi n n p a) ế - T bào vi khu n không có plasmid có kh năng dung n p ẩ (competent cell) ợ Ủ ỗ
ử ệ ạ ố
ậ
bào ổ ợ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n ph ả ươ h p vào t 4. Bi n n p DNA tái t ế ạ ế a) Hóa bi n n p ạ ế b) Đi n bi n n p (electroporation) ạ ế
ệ
ậ
bào ổ ợ
ệ
ắ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n ph ả ươ h p vào t 4. Bi n n p DNA tái t ế ạ ế a) Hóa bi n n p ạ ế b) Đi n bi n n p (electroporation) ạ ế c) Vi tiêm (micro-injection) d) B n gene ....
Cell’s DNA
DNA coated golden particles
Plant cell Gene gun
A plant cell with the new gene
Cell division Transgenic plant
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
ệ ạ
5. Ch n l c, t o dòng và s bi u hi n gene a) Xác đ nh dòng vi khu n ch a plasmid tái t h p ự ể ứ ọ ọ ị ẩ ổ ợ
ậ
K thu t và ỹ ng pháp căn b n
ph
ả
ươ
ạ ệ
h p ẩ ổ ợ ọ ọ ị ự ể ứ
c t o dòng ủ ượ ạ
ng h p lý b n sao cho m i t
bào
ỗ ế
ợ ể
ệ
t ố
ự
ụ
ị
i protein (proteolysis) do các enzyme trong t
bào
ể ệ
ế
5. Ch n l c, t o dòng và s bi u hi n gene a) Xác đ nh dòng vi khu n ch a plasmid tái t b) T o dòng ạ c) S bi u hi n c a gene đ ệ ự ể - Vector bi u hi n Yêu c uầ : S l ả ố ượ Promotor bi u hi n bám vào ribosome (rbs) và DNA ph cho d ch mã t Trình t S n đ nh lâu dài ị ự ổ Tránh s th y gi ả ự ủ
PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR d a trên 3 b
nhi
ự
c ướ ở
ệ
t đ ộ
khác nhau. 1.
ạ
: t o dây đ n DNA v i ớ ơ
t đ 94
ệ ộ
2. B t c p
oC ữ
ơ
oC
ổ
ạ ộ
1. Bi n tính ế nhi ắ ặ : lai gi a primers và dây đ n DNA. Nhi t đ thay đ i ổ ệ ộ tùy theo, kho ng 50 ả 3. Kéo dài : t o dây DNA b sung v i tác đ ng c a polymerase ủ ớ và dNTPs: 72oC.
L p l ậ
ầ ầ
i chu kỳ kho ng 30-40 l n ạ ả ng DNA c n s t o ra s l ố ượ ẽ ạ khu ch đ i đ quan sát trên ạ ủ ế gel qua quá trình đi n di
ệ
1985, Kary Mullis 1. Nguyên t cắ
t ệ
ị
ủ ả ứ
Primer Polymerase ch u nhi dNTP Dung d ch đ m ị
ệ
2. Các thành ph n c a ph n ng ầ - - - -
PCR (Polymerase Chain Reaction)
ế
3. Ý nghĩa - ờ - ệ - ự 4. Cách d ng PCR khác - - - - Th i gian Hi u qu kinh t ả Th c hi n ệ ạ RT-PCR Competitive RP-PCR Real Time PCR PCR- ELISA
Sequencing
1. Ph ươ ng pháp hóa h c c a Maxam và Gilbert ủ ọ
Sequencing
ọ
1. 2. Ph Ph ươ ươ ng pháp hóa h c c a Maxam và Gilbert ủ ng pháp didesoxy c a F. Sanger ủ
ng d ng công ngh gene
Ứ
ụ
ệ
Khai thác DNA các b gene ộ
1. 1.1. Genomics: - nucleotide c a b gene và ch c năng c a ự ủ ứ ủ ộ
- Xác đ nh trình t ị chúng Phát hi n, b o t n s đa d ng sinh h c, s d ng chúng. ạ ả ồ ử ụ ự ệ ọ
ấ ế ị 1.2. Proteomics - ứ
ng tác (interactions), ch c năng ổ ự ươ ứ
- Nghiên c u c u hình (conformation), v trí (localization), các bi n đ i (modification), s t (function) T o hormone, vaccin tái t h p dùng ch a tr b nh. ổ ợ ị ệ ữ ạ
ọ
1.3. Human Genome Projet 1.4. Các ngành h c khác - - - Cellomics Metabolomics Ionomics
ng d ng công ngh gene
Ứ
ụ
ệ
ộ
1. 2. Khai thác DNA các b gene Công ngh RNA ệ
rRNA, mRNA, tRNA
ribozyme
RNAi, microRNA
i RNA
M ng l ạ
ướ
Slipcing
Công ngh RNA
Th đ ng ụ ộ
ệ
Postranscriptional regulation
- - - Antisense RNA Interfering RNA và microRNA Các ribozyme
ng d ng công ngh gene
Ứ
ụ
ệ
ộ
h p
Khai thác DNA các b gene Công ngh RNA ệ Công ngh protein tái t ệ
ổ ợ
1. 2. 3. - S n xu t r-protein ấ
ả
Các b nh đi u tr
STT S n ph m ả
ẩ
ệ
ề
ị
Năm h t patent ế
1
Insulin
ng
2001
Ti u đ ể
ườ
2
Interferon alpha
2002
Viêm gan siêu vi B, ung th , ..ư
3
Interferon beta
2003
X c ng ơ ứ
4
Hormon tăng t
ng ng
Thi u năng tăng tr
ng
2003
ưở
i ườ
ể
ưở
5
Erythropoetin
Thi u máu
2004
ế
6
Nh i máu c tim
2005
ồ
ơ
T-PA (tissu plasminogen activator)
7
2006
G-CSF (granulocyte – COLONY Stimulating Factor
Chemotherapy-induced neutropenia
ng d ng công ngh gene
Ứ
ụ
ệ
ộ
h p ổ ợ
ả
1. 2. 3. - -
ế ạ ố ạ ạ ợ
ạ ạ
Khai thác DNA các b gene Công ngh RNA ệ Công ngh protein tái t ệ S n xu t r-protein ấ Ch t o protein * N i các đo n gene t o protein dung h p (fusion protein) * Làm m t đo n ho c tăng đo n gene ấ ặ * Thay th nucleotide ế
ng d ng công ngh gene
Ứ
ụ
ệ
ộ
h p ổ ợ
ẩ ử
ng pháp lai DNA ươ ự
1. 2. 3. 4. - - - - - Khai thác DNA các b gene Công ngh RNA ệ Công ngh protein tái t ệ Ch n đoán phân t D a trên ph DNA marker Biomarker DNA fingerprinting Micro array và Biochips
ể
5. Vi sinh v t chuy n gene ậ 6. Th c v t chuy n gene 7. Đ ng v t chuy n gene ự ộ ậ ậ ể ể
ng d ng công ngh gene
Ứ
ụ
ệ
ộ
h p ổ ợ
ẩ ử
ể
ự ộ ể ể ậ ậ
1. Khai thác DNA các b gene 2. Công ngh RNA ệ 3. Công ngh protein tái t ệ 4. Ch n đoán phân t 5. Vi sinh v t chuy n gene ậ 6. Th c v t chuy n gen 7. Đ ng v t chuy n gene 8. Công ngh gene đ i v i s c kh e con ng ệ ố ớ ứ ỏ i ườ
ệ
ng th c đi u tr Xét nghi m SNP (Single Nucleotide Polymorphism) t k thu c cho t ng b nh nhân * Thi ừ * Nh n d ng t ng nhóm b nh, xác đ nh ph ị ệ ế ế ạ ậ ố ừ ươ ệ ứ ề ị
Pharmacogenomics: Cung c p cách ch a b nh an toàn và hi u qu cho t ng cá nhân ữ ừ ệ ệ ấ ả
ổ
Gene therapy: * Dùng rprotein ho c b sung enzyme ặ * Thay th gene ế
