intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

CÔNG NGHỆ GENE

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:45

Thêm vào BST
Báo xấu
48
lượt xem 9
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ. Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom) Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CÔNG NGHỆ GENE

  1. Chương II CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING) Nguyễn Vũ Phong
  2. QUY TRÌNH TIẾN HÀNH • Bước 1: Nuôi tế bào chủ và tế bào cho • Bước 2: Tách DNA plasmind và DNA tế bào cho • Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục tiêu • Bước 4: Nối 2 loại DNA bằng enyme nối tạo DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh • Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường là vi khuẩn E.coli) • Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm
  3. 1. Enzyme 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) - 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn - Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ. - Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom) - Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end) .
  4. 1. Enzyme 1.1. Restriction endonuclease enzyme (RE) - Khoảng 3000 RE với 230 trình tự nhận biết khác nhau. - Quy tắc đặt tên: EcoRI Eco: Escherichia coli R: dòng vi khuẩn I: thứ tự RE được tìm ra (I: đầu tiên)
  5. 1. Enzyme 1.2. Enzyme nối (Ligase) - Nối : hình thành cầu phosphodiester EcoRI EcoRI GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG G AATTC CTTAA G Ligase G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G
  6. Ligation. (ligere = latin ‘to join’) 1. DNA Ligase reacts with an AMP donor in an ATP (or NAD+ dependent manner depending on the source of ligase)  activated enzyme. 2. Activated enzyme donates AMP to free 5’-PO4= at the nick in the lower strand of the DNA duplex, creating a high-energy diphosphate group on one side of the nick. 3. Cleavage of the di-phosphate bond liberates energy to create a new phosphodiester bond. Seals the nick in the DNA. N.B. Reaction can occur on Both Strands, allowing joining of two independent DNA molecules.
  7. 1. Enzyme 1.3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) • Tổng hợp DNA một mạch c-DNA (complementary DNA) từ một sợi mRNA hoặc từ polyribonucleotide tổng hợp • c-DNA có thể tổng hợp thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA polymerase. c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA
  8. 1. Enzyme 1.4. Các enzyme khác Enzyme Chức năng DNaseI Endonuclease Nuclase BAL31 Exon nuclease S1 nuclease Cắt DNA mạch đơn Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease 3’-5’ Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt
  9. 2. Các vector chuyển gene Plasmid: - DNA vòng tròn - Sao chép độc lập trong tế bào - Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein Vector: - Có khả năng tự tái bản - Tồn tại độc lập trong tế bào - Mang được gene mong muốn
  10. 2. Các vector chuyển gene Yêu cầu đối với vector chuyển gene. - Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) - Trình tự nhận biết cho RE - Trình tự điều hòa (promoter) - Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp - Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết. Ứng dụng của vector chuyển gene - Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA - Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn trình tự DNA - Chuyển gene - Sản xuất RNA - Sản xuất protein từ gene được tạo dòng.
  11. 2. Các vector chuyển gene 2.1. Vector chuyển gene plasmid - Plasmid của vi khuẩn và bacteriophage. - pBR322
  12. 2. Các vector chuyển gene 2.2. Phage λ - Có hệ thống xâm nhập tự động và sinh sản - Có dạng tròn hoặc dạng thẳng, 2 đoạn cos (12 nu) ở 2 đầu mút, dùng tạo cosmid và phagemid - Mang được đoạn DNA (15-23Kb) - Dùng trong thành lập ngân hàng gene
  13. 2. Các vector chuyển gene 2.3. Cosmid : - Plasmid gắn thêm đoạn cos của phage, - Có thể chứa đoạn gene dài đến 45kb - Dùng lập thư viện gen 2.4. Phagemid
  14. 2. Các vector chuyển gene 2.5. Phage M13: - DNA mạch đơn - Dùng xác định trình tự nucleotide của gene - Sản xuất mẫu dò (probe) - Gây đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis)
  15. 2. Các vector chuyển gene 2.5. Plasmid Ti - Agrobacterium tumefaciens - Chuyển gen ở thực vật - 200Kb - Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào
  16. 2. Các vector chuyển gene 2.6. Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC-yeast artificial chromosome) - Plasmid vòng tròn 2µm - Chứa đoạn DNA lạ dài đến 2000Kb 2.7. Các nhiễm sắc thể nhân tạo khác - BAC (Bacterial artificial chromosome) - MAC (Mammalian artificial chromosome) - P1AC (P1 bacteriophage derived artificial chromosome)
  17. 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) Mục đích: - Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng. - Biểu hiện gene - Sản xuất protein tái tổ hợp.
  18. 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.1. Escherichia coli (E.coli) - Dễ nuôi cấy và nhân dòng - Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau. - Vi khuẩn Gram-, hình que, - Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base 3.2. Saccharomyces cerevisiae - Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote - Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh - Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có đủ hoạt tính sinh học. - Sản xuất protein tái tổ hợp - Sinh vật an toàn
  19. 3. Hệ thống tế bào chủ (Host) 3.3. Hệ thống tế bào thực vật 3.4. Hệ thống tế bào động vật - Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney) - Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney) - Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney - Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary) - Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người - Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans
  20. Kỹ thuật và phương pháp căn bản 1. Lai nucleic acid - Tách chiết và tinh sạch DNA và RNA - Điện di trên gel - Wells Large Small +
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2