Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (Terminalia catappa)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

Đồ án tốt nghiệp

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Tuyết Dung

MSSV: 1311100019 Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

Đồ án tốt nghiệp

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: Trần Thị Tuyết Dung

MSSV: 1311100019 Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2017

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý

thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh

Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố

trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam

đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm……..

Sinh viên

Trần Thị Tuyết Dung

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Con xin khắc ghi công ơn cha mẹ và những người thân đã nuôi dưỡng và giáo dục

con nên người.

Tôi xin gửi lòng biết ơn đến:

- Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

- Khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường, Trường Đại Học Công

Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

- Cô chủ nhiệm, Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học

Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn

thành đề tài.

Tôi xin chân thành biết ơn: Ths. Phạm Minh Nhựt đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ,

giành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý

giá, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này.

Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian làm đề tài.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm……..

Sinh viên

Trần Thị Tuyết Dung

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN .....................................................................................................................iv

MỤC LỤC ........................................................................................................................... v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................... v

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................................vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1

1. Đặt vấn đề ........................................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 2

4. Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................................... 2

Chương 1: TỔNG QUAN ................................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về cây bàng ................................................................................................. 3

1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên thực vật ở nước ta ....................................................... 3

1.1.2. Sơ lược về cây bàng ................................................................................................... 3

1.1.3. Công dụng của cây bàng ............................................................................................ 5

1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên từ thực vật ......................................... 6

1.2.1. Carbohydrate ............................................................................................................. 6

1.2.2. Alkaloid ..................................................................................................................... 7

1.2.3. Glycoside ................................................................................................................... 8

1.3. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật ........ 18

1.3.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn ....................................................................... 18

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn ................................................................................................ 18

1.3.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật ........................................... 21

1.3.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và Việt Nam........... 26

1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) .............................................................................. 29

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp 1.4. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật ........................... 30

1.5. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ................................................................................ 31

1.5.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli ............................................................................. 31

1.5.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. .............................................................................. 32

1.5.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. ................................................................................... 34

1.5.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. ................................................................................... 35

1.5.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ..................................................................................... 36

1.5.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. ...................................................... 37

1.5.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp. ....................................................... 38

1.5.8. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus aureus. .............................................. 39

1.6. Sơ lược về vi khuẩn V.alginolyticus ........................................................................... 40

1.6.1. Phân loại khoa học ................................................................................................... 40

1.6.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................................... 40

1.6.3. Đặc điểm phân bố .................................................................................................... 41

1.6.4. Khả năng gây bệnh .................................................................................................. 42

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 44

2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện ................................................................................. 44

2.1.1. Địa điểm .................................................................................................................. 44

2.1.2. Thời gian. ................................................................................................................. 44

2.2. Vật liệu ....................................................................................................................... 44

2.2.1. Vật liệu: …………………………………………………………………………...44

2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị ....................................................................................................... 44

2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ...................................................................................... 44

2.3.3. Hóa chất, dung môi .................................................................................................. 45

2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 46

2.4.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu ..................................................................... 46

2.4.2. Phương pháp thu nhận cao thực vật và xác định hiệu suất thu hồi. ........................ 46

2.4.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh ........................................................... 47

2.4.4. Phương pháp tăng sinh, xác đinh mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị ......................... 48

2.4.5. Phương pháp pha loãng mẫu ................................................................................... 48 ii

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ........................................................ 49

2.4.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC ............................................. 50

2.4.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học của cao chiết ....................................... 51

2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 54

2.5. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................................... 54

2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết từ lá bàng đối với dung môi ethanol 70%. 56

2.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. ........................................................................................................... 57

2.5.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với chủng vi khuẩn gây bệnh. ................................................................................................................. 58

2.5.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của TcEE. ................. 60

2.5.5. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết đến vi khuẩn V. alginolyticus theo .................................................................................................................... 62 thời gian

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 65

3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi TcEE ................................................................... 65

3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE đối với chủng vi khuẩn chỉ thị. .. 65

3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE đối nhóm vi khuẩn Escherichia coli ..................................................................................................................................... 66

3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. ........................................................................................................................................... 67

3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Samonella spp ...................................................................................................................................... 68

3.2.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Shigella spp ........................................................................................................................................... 69

3.2.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Virio spp . 71

3.2.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da .......................................................................................................................... 72

3.2.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn và kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với 20 vi khuẩn chỉ thị. ........................................................... 73

3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của TcEE ........................................... 77

iii

3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của TcEE đến vi khuẩn V. alginolyticus ....................... 79

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 83

4.1. Kết luận ....................................................................................................................... 83

4.2. Đề nghị ....................................................................................................................... 83

iv

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 84

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DMSO: Dimethyl sulfoxide

DNA: Deoxyribonucleic acid

MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu

TSA: Trypton Soya Agar

TSB: Trypton Soya Broth

v

TcEE: Cao chiết Ethanol 70% từ lá bàng

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất........... 17

Bảng 1.2. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) ........................................................................................................................................... 20

Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% đối với 20 vi khuẩn chỉ thị ............................................................................ 74

vi

Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học của TcEE .............................................. 77

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Lá và quả bàng. .................................................................................................... 4

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloids. .......................................... 8

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid .............................. 12

Hình 1.4. Caffeic acid ........................................................................................................ 13

Hình 1.5. Phân loại nhóm phenolics theo cấu trúc hóa học .............................................. 13

Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) . 19

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin ................ 21

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của catechine ......................................................................... 22

Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của coumarine. ...................................................................... 23

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine ..................................................... 24

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của berberine ....................................................................... 25

Hình 1.12. E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2µm (Bact, 2005). .............. 31

Hình 1.13. Hình thái vi khuẩn Samonella spp. (Taragui, 2005). ....................................... 33

Hình 1.14. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) .................................. 34

Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Listeria spp. ...................................................................... 35

Hình 1.16. Hình thái vi khuẩn Vibrio (Microscopy, 2004) ............................................... 36

Hình 1.17. Hình thái vi khuẩn Pseudomonas spp. ............................................................ 37

Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Enterococcus .................................................................... 38

Hình 1.19. Hình thái vi khuẩn Staphylococcus aureus ..................................................... 39

Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu………………………………………….............45

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ...................................................................... 55

Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ lá bàng. .................................................. 56

Hình 2.4. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết .................................. 57

Hình 2.5. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết. ................... 59

Hình 2.6. Quy trình định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70% từ lá bàng. .................................................................................................................................. 61

Hình 2.7. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của cao chiết đến vi khuẩn V. alginolyticus theo thời gian. ............................................................................................................................ 63 vii

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli .......... 66

Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Listeria spp. ................ 67

Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Samonella spp. ............ 68

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Shigella spp. ................ 70

Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Virio spp. ..................... 71

Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da ........................................................................................................................................... 72

Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào .......................................................................... 80

viii

Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện giá trị OD600nm ........................................................................ 80

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Sức khỏe là vốn quý nhất của con người nhưng hiện nay vấn đề về thực phẩm

bẩn đã khiến cho nguy cơ mắc nhiều loại bệnh tật đang gia tăng, do đó việc tìm ra

phương thuốc chữa trị vừa mang lại hiệu quả nhưng không gây tác dụng phụ luôn

được người dân quan tâm lựa chọn.

Đã từ rất lâu, dựa vào kinh nghiệm dân gian con người đã biết sử dụng các loại

cây có trong tự nhiên để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh. Việt Nam là một quốc

gia nằm ở vùng nhiệt đới gió mùa có nhiều điều kiện cho hệ thực vật phát triển tạo

ra sự phong phú và đa dạng, đó là nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài

nguyên tái tạo được, nhiều cây thuốc quý với đầy đủ chủng loại và số lượng, trong

đó có cây bàng.

Cây bàng tên khoa học là Terminalia catappa L, thuộc họ Bàng Combretaceae.

Đây là một loại cây được trồng như một loại cây cảnh để lấy bóng râm nhờ tán lá

lớn và rậm. Qủa ăn được và có vị hơi chua. Hạt bàng thì dùng làm nguyên liệu để

chế biến thành mứt. Ở Việt Nam cây bàng dễ trồng, phát triển tốt và có mặt ở hầu

hết các địa bàn trong cả nước. Người dân từ xưa đã dùng lá bàng để chữa cảm sốt,

ra mồ hôi, chữa tê thấp và lỵ. Dùng búp lá non phơi khô, tán bột rắc trị ghẻ, sắc đặc

ngậm trị sâu răng. Ngoài ra, người ta còn dùng vỏ thân bàng dạng thuốc sắc uống trị

lỵ và tiêu chảy, rửa vết loét, vết thương. Đặt biệt, nhựa lá non trộn với dầu hạt bông

và nấu chín là một thứ để chữa bệnh hủi. Hạt nấu chín dùng để chữa đi cầu ra máu.

Ngoài ra, cũng được dùng đối với việc nuôi cá cảnh để xử lý kim loại nặng trong

nước có hại cho cá, ngăn ngừa hữu hiệu các loại vi khuẩn, các loại nấm trên cá.

Mặc dù có nhiều công dụng như vậy nhưng ở nước ta hiện nay chưa có công

trình khoa học mang tính hệ thống nghiên cứu về quá trình chiết tách hay xác định

thành phần hóa học, xác định cấu trúc của một số hợp chất trong cây bàng. Chính vì

vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao

1

chiết ethanol từ lá bàng (Terminalia catappa L)” nhằm cung cấp thêm thông tin về

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

loại cây này, góp phần vào việc khai thác, chế biến và ứng dụng các sản phẩm của

cây bàng một cách hiệu quả, khoa học hơn.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Tách chiết cao ethanol từ lá bàng và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.

- Bước đầu xác định một số thành phần hóa học.

3. Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng.

- Đánh giá hiệu lực kháng khuẩn của cao chiết lá bàng theo thời gian.

4. Phạm vi nghiên cứu

- Chỉ tách chiết cao lá bàng bằng dung môi ethanol 70%.

2

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với 20 chủng vi khuẩn chỉ thị.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây bàng

1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên thực vật ở nước ta

Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có tới ¾ diện tích cả

nước là núi rừng. Với đặc điểm khí hậu và địa hình như vậy nên nước ta được đánh

giá là nước có nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, được xếp thứ 16

trong số 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật

phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị .

Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học được ứng dụng rất lớn trong nhiều

lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các

nhà phân loại thực vật, nước ta có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó

khoảng 3.948 loài được dùng làm dược liệu (Viện vật liệu, 2007). Nếu so với

khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây

thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy có nguồn thực vật đa dạng và phong phú

nhưng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác không có kế

hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lượng các loài cây ngày càng ít đi. Thế

nên, hiện nay chúng ta cần khai thác có hiệu quả về hoạt tính sinh học của các loài

cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc chữa bệnh

mới đem lại lợi ít cho con người nhưng không làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nước

nhà.

1.1.2. Sơ lược về cây bàng

1.1.2.1. Phân loại khoa học

Giới Plantae

Angiospermae

Eudicots

Rosids

Bộ Myrtales

Họ Combretceae

Chi Terminalia

3

Loài T. catappa

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Lá và quả bàng.

1.1.2.2. Đặc điểm hình thái

Cây Bàng ta là cây thân gỗ lớn sống tại vùng nhiệt đới, loại cây này có thể cao

35 m, có đường kính thân từ 40 – 80 cm. Với tán lá mọc thẳng, đối xứng và các

cành nằm ngang tạo thành hình dáng giống như cái bát trải rộng.

Lá to, dài khoảng 15 – 25 cm và rộng 10 – 14 cm, hình trứng, xanh sẫm và

bóng. Về mùa khô thì lá chuyển thành màu đỏ ánh hồng hay nâu vàng sau đó rụng

hết để hạn chế thoát hơi nước và giúp cây kích thích ra cành lá non.

Bàng ta là loài cây có hoa đơn tính cùng gốc, nghĩa là hoa đực và hoa cái ra

chung trên một cây. Hoa có kích thước 1 cm có màu trắng hơi xanh không có cánh

hoa, chúng mọc trên các nách lá hoặc ở đầu cành. Quả dài 5 – 7 cm, rộng 3 – 5,5

cm, khi non quả có màu xanh sau đó ngã sang màu vàng và khi chín quả có màu đỏ.

Mùa quả tháng 8 - 10.

Cây Bàng ta được trồng tại khu vực nhiệt đới, là loài cây ưa sáng, có tốc độ sinh

trưởng nhanh. Cây chủ yếu được tái sinh bằng hạt.

Cây bàng ta là loại cây công trình trồng lấy bóng mát, phát triển nhanh, ít sâu

bệnh, dễ chăm sóc. Cây có thể trồng trong vườn nhà, ven đường, lối đi trong khuân

viên nhà máy...

1.1.2.3. Phân bố

Cây bàng được trồng khắp nơi làm cây bóng mát. Người ta cho rằng cây bàng

4

vốn không có ở nước ta, mà di thực từ đảo Moluques vào.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2.4. Thành phần hóa học

Lá và vỏ cây chứa tanin: vỏ thân chứa từ 25 - 35% tanin pyrogalic và tanin

catechic. Vỏ cành chứa 11% tanin.

Nhân hạt chứa 50% dầu béo màu vàng nhạt hay lục nhạt, vị dễ chịu, giống như

dầu hạng nhân, ăn được. Tuy nhiên nhân chỉ chiếm 10% toàn quả cho nên cuối cùng

toàn quả chỉ chứa chừng 5% dầu béo, việc tách nhân lại đòi hỏi nhiều công sức,

chưa cơ giới hóa được cho nên đến nay việc khai thác dầu hạt bàng chưa được đặt

ra. Một số tính chất của dầu nhân hạt bàng đã được nghiên cứu kết quả như sau: Tỷ

trọng 0,917, chỉ số khúc xạ ở 35°C là 1,4660, độ đông đặc + 1°C, chỉ số axit 2,94,

chỉ số xà phòng hóa 0,38, axit toàn phần tách được ở dạng đặc, màu vàng nhạt hay

trắng, phần axit đặc chiếm tới 36%. Do chỉ số iốt thấp và do không cho phản ứng

hexabromua cho nên người ta có thể kết luận dầu bàng không có glyxerit linoleic và

thuộc loại dầu không khô.

1.1.3. Công dụng của cây bàng

1.1.3.1. Theo kinh nghiệm dân gian

Cao vỏ thân cây bàng (bỏ lớp vỏ đen bên ngoài) có tác dụng lợi tiểu, cường tim

làm săn. Cao methanol có tác dụng giảm co thắt ruột thỏ cô lập. Lá được dùng làm

thuốc chữa cảm sốt, làm ra mồ hôi, chữa tê thấp và lỵ. Búp non phơi khô tán bột rắc

trị ghẻ, trị sâu quảng, sắc đặc ngậm trị sâu răng. Dùng tươi, xào nóng để đắp và

chườm nơi đau nhức. Vỏ thân sắc uống trị lỵ và tiêu chảy, rửa vết loét, vết thương.

Nhựa lá non trộn với dầu hạt bông và nấu chín là một thứ thuốc để chữa hủi. Hạt

nấu uống để trị tiêu chảy ra máu.

1.1.3.2. Trong đời sống – kinh tế

Cây trồng địa phương. Nếu tổ chức trồng cây bàng trên quy mô lớn để tạo ra

nguồn hàng hóa bàng không chỉ có giá trị trực tiếp dùng để chữa bệnh và chăm sóc

sức khỏe, nếu biết bảo tồn và khai thác hợp lý thì đó còn là một nguồn thu nhập

5

trong phạm vi hộ gia đình và các cộng trên thị trường thì nó còn góp phần vào sự

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

tăng trưởng kinh tế của đất nước. Trên thế giới, nhiều nước đã xuất khẩu các chế

phẩm từ cây bàng và thu được nguồn ngoại tệ đáng kể.

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho sự phát triển của

cây trồng nói chung. Nhất là ở những vùng đồng bằng có khí hậu mát mẻ thích hợp

cho việc trồng và phát triển cây bàng.

1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên từ thực vật

1.2.1. Carbohydrate

1.2.1.1. Khái niệm

Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rải trong cơ thể sinh

vật. Được cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n,

thường m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). Nhìn chung hàm lượng

carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo

loài, giai đoạn sinh trưởng và phát triển.

- Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận như củ, quả, lá, thân, cành.

- Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu,.. (Phùng Trung Hùng và ctv,

2013).

1.2.1.2. Phân loại

Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm 3 nhóm lớn:

monosaccharide, oligosaccharide (Disaccharide) và polysaccharide ( Phùng Trung

Hùng và ctv, 2013).

- Monosaccharide gồm: glucose, fructose.

- Disaccharide gồm: saccharose, lactose, maltose.

- Polysaccharide gồm: tinh bột, cellulose.

1.2.1.3. Vai trò

Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng:

- Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống.

- Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidolican…).

- Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide).

- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) ( Nguyễn Phương Hà

6

Linh, 2011).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Alkaloid

1.2.2.1. Khái niệm

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản

ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật. Thông thường các

alkaloid không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại thì các

muối alkaloid thì dễ tan trong nước và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ ít

phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung

môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid.

Alkaloid là amin có nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do

động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid. Nhiều alkaloid có các tác

động dược lý học đối với con người và các động vật khác. Các alkaloid thông

thường là các dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng.

Chúng được tìm thấy như là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây

hay cà chua), động vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm. Nhiều alkaloid có

thể được tinh chế từ các dịch chiết thô bằng phương pháp chiết acid - base (Tôn Nữ

Minh Nguyệt và ctv, 2010).

Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2

nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước,

tủa này sinh ra hầu hết do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm amin

lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ 2 cho kết tủa ở dạng tinh

thể. Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những

màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn

phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid ( Phạm Thanh Kỳ, 1998).

1.2.2.2. Phân loại

Các nhóm alkaloid hiện bao gồm:

- Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpine,

nicotin, spartein, pelletierin.

- Nhóm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như morphin, codein, thebain,

papaverin, narcotin, sanguinarin, hydrastin, hydrastin, berberin.

7

- Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

- Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine.

- Nhóm quinolin: quinine, quinidine, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine,

brucin, veratrin, cevadin.

- Nhóm phenothylamin : mescalin, ephedrine, dopamine, amphetamine.

- Nhóm indole :

+ Các tryptamin : DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin.

+ Các ergolin : Các alkaloid từ nhựa ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamine, acid

lysergic v.v

+ Các beta-cabolin : harmin, harmalin, yohimbin, reserpine, emetin

- Nhóm purin: các xanthin như caffeine, theobromine, theophylline (Tôn Nữ Minh

Nguyệt và ctv, 2010).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloids.

1.2.2.3. Vai trò

Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, một số loại có tác động lên hệ

thần kinh như morphin, codein, cocain,... Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và

giúp chống ung thư ( Vũ Xuân Tạo, 2013).

1.2.3. Glycoside

1.2.3.1. Khái niệm

Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường. Cấu tạo gồm 1 phần đường

(glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đường (aglycon) theo Vũ Kim Dung và

8

ctv (2011). Hai phần kết hợp với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

dễ bị phân hủy khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong

cây.

Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol).

Đây là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycoside phụ thuộc vào phần

aglycon còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị

hòa tan trong nước, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trưng (Trần Trường Hận, 2010).

1.2.3.2. Phân loại

Glycoside có 3 cách phân loại dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên

kết giữa chúng (Vũ Kim Dung và ctv, 2011).

- Phần đường: có nhiều loại đường nhưng thường là glucose và đồng phân đường.

- Liên kết giữa phần đường và phần không đường: C – glycosidic, O – glycosidic, N

– glycosidic, S – glycosidic.

- Nhóm hợp chất không đường: saponins glycosidic, cardiac glycosidic,

anthraquinone glycosidic, phenolic glycosidic, cyanogenic glycosidic, alcoholic

glycosidic, coumarin glycosidic, chromonr glycosidic, steviol glycosidic.

1.2.3.3. Vai trò

Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dưỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có

vai trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, qua quá trình thủy phân tạo ra 1 số chất

kháng khuẩn thường tập chung ở vỏ và hạt như độc tố Solanine ở khoai tây (Trần

Trường Hận, 2010).

Một số glycoside quan trọng

 Saponin

a. Khái niệm

Saponin là một glycoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật. Dưới

tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thủy phân

thành genin (sapogenin) và phần carbohydrate (Ngô Văn Thu, 2011).

Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan được trong nước, alcohol

và rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hòa tan saponin vào nước sẽ làm giảm

9

sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

b. Phân loại

Saponin được chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid (

Nguyễn Tấn Thịnh, 2013).

- Saponin triterpenoid:

+ Saponin triterpenoid pentacyclic: nhóm olean, nhóm ursan, nhóm hopan, nhóm

lupan.

+ Saponin triterpenoid tetracyclic: nhóm dammaran, nhóm lanostan, nhóm

cucurbitan

- Saponin steroid: nhóm spirostan, nhóm furosatn, nhóm aminofurostan, nhóm

spirosolan, nhóm solanidan.

c. Vai trò

Vai trò của saponin:

- Tác dụng long đờm chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng).

- Một số saponin có tác dụng chống viêm.

- Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus.

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt.

 Anthraquione glycoside

a. Khái niệm

Anthraquione glycoside thường tồn tại dưới dạng glycoside. Đa số các

anthraquione glycoside là các polyoxy anthraquione và nhân thường gắn các nhóm

chức –OH, -OCH3, -CH3, -COOH,… Tùy theo vị trí các nhóm chức dính vào nhân

mà có các dẫn chất khác nhau (Ngô Văn Thu, 2011).

Những dẫn xuất anthraquione glycoside đều có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ.

Ở glycoside thì dễ tan trong nước, còn thể tự do (aglycon) thì tan trong ether,

chloroform và một số dung môi hữu cơ khác (Ngô Văn Thu, 2011).

b. Phân loại

Dẫn xuất Anthraquione glycoside có thể chia làm 3 nhóm:

- Nhóm phẩm nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquione).

- Nhóm nhuộm tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquione).

10

- Nhóm dimer (Ngô Văn Thu, 2011).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

c. Vai trò

Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn xuất anthraquione glycoside có tác dụng

kích thích miễn dịch chống ung thư (Ngô Văn Thu, 2011).

 Cardiae glycoside

a. Khái niệm

Cardiae glycoside là các glycoside thực vật, bao gồm hai phần là phần aglycon

(không đường) và các glycine hay phần đường (Karkare, 2007). Cardiac glycoside

là những chất kết tinh không màu, có vị đắng. Chúng tan trong các dung môi phân

cực và dễ bị thủy phân trong môi trường acid theo Karkare (2007).

b. Vai trò

Vai trò của Cardiac glycoside

- Ở nồng độ thấp: có tác dụng điều hòa nhịp tim

- Ở nồng độ cao: gây nôn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy, giảm sức co bóp của tim

(Karkare, 2007).

 Flavonoid

a. Khái niệm

Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật, đây còn là sắc tố

sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng benzene A và

B được nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid có màu

vàng, tuy nhiên 1 số màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong thực vật

cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng như carotenoid,

anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011).

Chúng thường được cải biến bằng cách gắn thêm gốc (-OH), hoặc (-OCH3) và

thường ở dạng phức với glucose và hữu cơ. Trong số này có những chất phổ biến

như flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone. Chỉ riêng 2 nhóm

flavon, flavonone với các nhóm thế OH và OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38

627 chất (Ngô Văn Thu, 1998).

Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các

protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo thì càng có khả

11

năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

b. Phân loại

Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3 C nên

các flavonoid được chia thành 3 nhóm chính:

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid.

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid

- Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011).

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid

(B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid

c. Vai trò

Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa bởi các gốc tự do như OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào,

ung thư, tăng nhanh sự lão hóa,…) làm cho tế bào hoạt động khác thường.

Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu

cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl,.. giúp bảo vệ vi sinh chống lại quá trình

oxy hóa có hại như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các

chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa sơ vữa động mạch, tai biến

mạch lão hóa, tổn thương do bức xạ. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm

giảm thương tổn ở gan và bảo vệ chức năng gan.

Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự

phóng thích hay tổng hợp các chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng như

12

histamine, serine protease, prostaglandin, leukotriene,… ( Quỳnh Ngọc, 2011).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

 Phenolic

a. Khái niệm

Hợp chất phenolic là các hợp chất có 1 hoặc nhiều vòng thơm với 1 hoặc nhiều

nhóm hydroxyl, chúng được phân bố rộng rãi trong thực vật và các sản phẩm trao

đổi chất của thực vật. Hơn 8000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy từ các phân tử

đơn giản như các acid phenolic đến các hợp chất polymer như tannin. Sự tích lũy

các hợp chất phenolic phụ thuộc vào loài, trạng thái sinh lý và vị trí địa lý của các

loài cây (Shetty và ctv, 2006).

Đa số các hợp chất phenolic được tổng hợp từ phenylalanine. Ở thực vật nhóm

phenolic chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid, đây là 1 trong những hợp chất đơn

giản có độc tính sinh học và được cấu tạo từ dẫn xuất thế vòng phenolic. Một số

phenolic như furanocoumarins thì không gây độc, nhưng khi tiếp xúc với nhiệt độ

cao, dưới ánh sáng có bước sóng gần với tia tử ngoại (UV-A) thì nó trở nên rất độc

(Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012).

Hình 1.4. Caffeic acid

b. Phân loại

Phenolic chia làm hai nhóm: phenolic acids và flavonoid polyphenols.

Phenolics

Phenolic acids Flavonoid polyphenols

Hình 1.5. Phân loại nhóm phenolics theo cấu trúc hóa học

c. Vai trò

Vai trò của nhóm phenolic:

13

- Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh, côn trùng và các động vật ăn cỏ.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

- Khả năng ức chế vi sinh vật và nấm sợi.

- Chất chống oxy hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo và trà xanh.

- Chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa,

2012).

1.2.4. Tannin

a. Khái niệm

“Tannin” được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những nhất có mặt trong

dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật cho da

biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tannin được định nghĩa là những hợp

chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát được phát hiện dương tính với “thí

nghiệm thuộc da”. Tannin có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các

hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Chúng thường gặp chủ

yếu trong thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm.

Tannin tan trong nước, kiềm loãng, glycerin và aceton, đa số không tan trong

các dung môi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thủy

ngân, kẽm, sắt).

b. Phân loại

- Tannin có thể chia thành hai loại chính:

- Tannin thủy phân được hay còn gọi là tannin pyrogallic (Gallic acid).

- Tannin ngưng tụ hay còn gọi là tannin pyrocatechic (Flavone).

c. Vai trò

Vai trò của tannin:

- Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu.

- Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng.

14

- Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy…(Ngô Thị Thùy Dương, 2012).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

1.2.5. Steroid

a. Khái niệm

Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có bộ khung cacbon stenan chứa bốn

vòng cycloalkane được nối với nhau theo những cách đặc trưng riêng (Đặng Văn

Hoài, 2009).

Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng

hợp dễ tan trong chloroform, ether, rượu nóng và không tan trong nước (Tôn Nữ

Minh Nguyệt, 2011).

b. Phân loại

Steroid được chia làm 4 nhóm chính (Đặng Văn Hoài, 2009):

- Nhóm steroid động vật: Cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan-β-ol, desosterol,

coprosterol, cerebrosterol và lathosterol.

- Nhóm steroid của động vật biển không xương sống: Spongesterol, clionasterol,

24-methylencholesterol và fucosterol.

- Nhóm Steroid thực vật: Sistosterol (có các đồng phân α,β,), stigmasterol, α-

spinasterol và brassicasterol.

- Nhóm sterol nấm men: Ergosterol, zymosterol, acosterol và fecosterol.

c. Vai trò

- Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống.

- Thường dùng làm các thuốc kích thích (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv,2011).

1.2.6. Amino acid

a. Khái niệm

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino acid là một phân tử

chứa cả nhóm amin và carboxylate, chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là

peptide hay polypeptide. Tất cả amino acid tự nhiên đều thuộc α-amino acid, nhóm

amino (-NH2) gắn vào cacbon thứ 2 (hay cacbon α) của acid hữu cơ. Ngoài nhóm –

NH2, -COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhóm chức khác như: -OH,

15

HS-, -CO-…

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

b. Phân loại

Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 amino acid cơ bản thành các nhóm. Một

trong các cách phân loại là 20 amino acid được phân thành 5 nhóm như sau (Hồ Chí

Tuấn, 2009):

- Nhóm 1: các amino acid có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này

có 6 amino acid: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I),

Proline (P).

Nhóm 2: các amino acid có gốc R là nhân thơm thuộc nhóm này có 3 amino

acid: Phenylamine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W).

Nhóm 3: các amino acid có gốc R bazo, tích đện dương, thuộc nhóm này có

3 amino acid: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H).

Nhóm 4: các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm

này có 6 amino acid: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M),

Asparagine (N), Glutamine (Q).

Nhóm 5: các amino acid có gốc R acid, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2

amino acid: Aspartate (D), Glutamate (E).

c. Vai trò

Vai trò của amino acid trong cơ thể thực vật:

- Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất.

- Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật.

16

- Tăng khả năng ra hoa và quả.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất

Amino acid Hoạt động sinh hóa

Glycine Là tiền chất của chlorophyll

Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước. Proline Hydroxyproline

Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action). Thiết yếu để tạo phấn hoa (tốt cho đậu trái).

Glutamic Glutamine Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và protein thông qua phản ứng trao đổi.

Serine trọng cho quá trinh Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất tổng hợp quan cholorophyll.

Arginine Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để phân chia tế bào.

Phenylalanine Tiền chất cấu tạo nên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe hơn.

Alanine Vai trò rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi chất và kháng virus.

Tryptophan Tiền tố của indol-acetic acid, các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên.

1.2.7. Isoprenoid (terpene)

a. Khái niệm

Isoprenoid (terpene) là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon

được tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene – C4H8. Terpene có nhiều ở thực vật đặc

biệt là loài họ thông.

b. Phân loại

Phân loại dựa vào số đơn vị isoprene cấu thành phân tử

- Sesterterpenoid (5 đơn vị)

- Triterpenoid (6 đơn vị)

17

- Tetraterpenoid (8 đơn vị)

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

- Polyterpenoid (n đơn vị)

- Monoterpenoid (2 đơn vị)

- Sesquiterpenoid (3 đơn vị)

- Diterpenoid (4 đơn vị)

c. Vai trò

- Ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn ngăn ngừa ung thư.

- Bảo vệ thực vật.

- Có khả năng xua đuổi côn trùng.

1.3. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ

thực vật

1.3.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn

Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực

vật, có tác dụng tiêu diệt hay kiềm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng

khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ

thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010).

1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn

Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật đã

được nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá

trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đường truyền tín

hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003).

Không phải tất cả cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và

18

một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi các cơ chế khác.(Hình 1.6)

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt,

2004)

Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi

khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của

màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá

hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các

thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền.

Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến

sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động

của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần

19

của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan,

Nhóm

Phân nhóm

Ví dụ

Cơ chế

Phenolic

Phenol đơn

Catechol

Phá vỡ màng sinh chất

Epicatechin

Phá vỡ vách tế bào

Phenolic acid Cinnamic acid

Quinone

Hypericin

Liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, làm bất hoạt enzyme

Flavonoid

Chrysin

Liên kết bám dính

Flavone

Tạo phức hợp với thành tế bào

Abyssinone

Khử hoạt tính enzyme

Ức chế phiên mã ngược HIV

Flavonol

Tannin

Ellagitannin

Bám dính Protein

Bám dính Adhesin

Ức chế enzyme

Phá vỡ màng sinh chất

Tạo phức hợp với thành tế bào

Phá vỡ vách tế bào

Tạo phức kim loại - ion

Coumarin

Warfarin

Tương tác DNA nhân thực (hoạt tính kháng virus)

Capsaicin

Phá vỡ vách tế bào

Terpenoid Tinh dầu

Berberine

Xen vào thành tế bào hoặc DNA

Alkaloid

Piperine

Mannose – specific agglutinin

Khóa sự kết hợp của virus hoặc hấp phụ

Lectin Polypeptide

Falxatin

Hình thành cầu Disulfide

Polyacetylen

8s – heptadeca – 2(Z), 9(Z) – diene – 4,6 – diyne – 1,8 diol

20

1999)

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật

1.3.3.1. Hợp chất Phenolic

Nguyên nhân chính tạo ra độc tính của các hợp chất phenolic đối với vi sinh vật

là sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm

sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein.

a. Quinone

Quinone là những vòng thơm với 2 nhóm thế ketone. Chúng là những hợp chất

màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trưng cao.

Quinone có thể tạo phức không thay đổi với các amino acid ái nhân trong

protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Do đó khả năng

kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt

tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra

chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật.

Người ta nhận thấy rằng anthraquinone được lấy từ một loài cây có nguồn gốc

từ Pakistan có khả năng kiểm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium

pseudodiphthericum, và Pseudomonas aeruginosa, có khả năng diệt khuẩn đối với

Pseudomonas pseudomalliae. Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả

năng chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp (Tôn Nữ Minh

Nguyệt và ctv, 2010).

Quinone Anthraquinone Hypericin

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin

b. Flavonoid

Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn

21

và có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành

tế bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo

cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được. Các flavonoid càng ưa

béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv,

2010).

Catechin là những hợp chất flavonoid được nghiên cứu rộng rãi do chúng có

mặt trong trà xanh ôlong. Qua những nghiên cứu, người ta nhận thấy trà xanh có

hoạt tính kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptpcoccus mutans,

Shigella spp., và các vi khuẩn, vi sinh vật khác. Catechin vô hoạt độc tố gây bệnh tả

của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của vi khuẩn S. mutans, cơ chế tác

dụng cũng là do khả năng tạo phức như được mô tả ở phần quinone. Hoạt động

nghiên cứu gần đây được tiến hành trên cơ thể chuột, khi chuột được cho ăn khẩu

phần ăn có chứa 0,1% catechin có nguồn gốc từ trà thì khe nứt do sâu răng của

chuột do S. mutans gây ra giảm 40% (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của catechine

Nhiều nghiên cứu khác cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones có khả năng ức

chế virus (RSV). Người ta đã tìm ra hoạt tính và phương thức hoạt động của

quercetin, naringin, hesperretin và catechin. Trong khi naringin không ức chế virus

typr 1 (HSV – 1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó

thở ở trẻ hoặc RSV, thì ba flavonoid khác lại có tác dụng theo những phương thức

khác nhau. Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các loài virus trên,

catechin ứa chế sự lây nhiễm nhưng không làm giảm sự sao chép nội bào của RSV

và HSV – 1, quercetin là chất có hiệu quả tốt trong việc giảm tình trạng lây nhiễm

các loại bệnh do vi sinh vật gây ra. Người ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo

trong các hợp chất cũng ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của

22

chúng.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

c. Counarine

Coumarine là hợp chất phenolic được tạo thành bởi benzene nóng chảy và vòng

α-pyrone. Chúng có hoạt tính chống đông máu, chống viêm và giãn mạch máu.

Warfarin là một Coumarine đặc biệt nổi tiếng khi sử dụng như chất chống đông

máu sử dụng kèm theo đường miệng và đồng thời cũng được sử dụng để giết động

vật gặm nhắm.

Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của coumarine.

Nhiều dẫn chất Coumarine có tác dụng kháng khuẩn đặc biệt là chất

novobiocine là một chất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trong nấm

Streptomyces niveus. Nó cũng có hoạt tính chống lại virus. Coumarine được biết là

có độc tính cao vì thế cần được xử lý rất cẩn thận bởi y tế cộng đồng. Một vài

Coumarine khác cũng có hoạt tính chống lại vi sinh vật và có khả năng ức chế nấm

Candida albicans (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

d. Tannin

Một trong những tính chất đặc trưng của tannin là tạo phức với các protein

thông qua các liên kết không đặc hiệu như lên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị.

Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng.

Các protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào

polypeptide…

Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991. Ông

đưa ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin. Theo các nghiên cứu

này, tannin có thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn. Tính

kháng khuẩn của tannin được tăng cường bởi tia cực tím (UV) có mức ánh sáng

23

kích hoạt bước sóng 320 đến 400 nm. Ngoài ra, có ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ ra

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

rằng tannin có thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngược quá trình phiên mã DNA của

virus.

1.3.3.2. Nhóm alkaloid

a. Solamargine

Solamargine là một glycoalkaloid kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia

và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn

gây bệnh tiêu chảy. Thường có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum)

và các alkaloid khác trong loài cây này có khả năng chống lại sự lây nhiễm khi đã

mắc phải HIV.

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine

b. Berberine

Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid có trong các cây: hoàng đằng,

hoàng lá, hoàng liên… có tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp.,

Staphylococcus spp. (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp. Những năm gần

đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tính kháng khuẩn với nhiều

vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra nó còn chống lại

một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh.

Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh sốt rét do

berberine có khả năng đột biến RNA của vi khuẩn gây sốt rét, chính điều này mà tác

24

dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với các loại vi khuẩn gây bệnh này.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của berberine

1.3.3.3. Nhóm terpenoid và tinh dầu

Terpenene và terpenoid cóa hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus

và động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của

tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn.

Đồng thời, các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid có khả năng

ức chế được HIV. Cơ chế tác động của tecpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng

được suy đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic.

Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh

dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogene. Theo Mendoza,

việc tăng nhóm ưa nước (hydrophilicity) của kaurene diterpenoids thì làm giảm

mạnh tính kháng khuẩn của chúng. Các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy

các terpenoids hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát

Listeria monocytogene. Dầu húng quế, một thảo dược được thương mại hóa, được

xác định là hiệu quả kháng khuẩn tương đương với 125 ppm clo khử trùng trong lá

rau diếp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010).

1.3.3.4. Nhóm lictin và polypeptide

Cơ chế kháng khuẩn của lectin và polypeptide là do có sự hình thành các ion

trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ

quan thụ cảm vật chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản

trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất.

Thionin là peptide thường được tìm thấy trong lúa mạch và lúa mì, bao gồm 47

amino acid. Chúng có khả năng ức chế nấm men, vi khuẩn Gram âm và Gram

25

dương.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Fabatin là một loại peptide có trong đậu fava, có cấu trúc liên quan tới γ-

thionins từ ngũ cốc và nó ức chế được E.coli, P.aeruginosa, và Enterococcus hirae

nhưng lại không ức chế Candida hoặc Saccharomyces.

1.3.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và Việt

Nam

1.3.4.1. Trên thế giới

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng

diệt khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J.Cavallito đã phân tích được

hợp chất Alicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Năm 1949, Dold và

Knapp đã kiểm tra hoạt động kháng khuẩn của 27 chiết xuất từ thực vật chống lại 8

chủng sinh vật thử nghiệm: E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhosa, Shigella

paradysenteria… và cho thấy tỏi có hoạt động chống lại tất cả các sinh vật được

kiểm tra. Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh, nước tinh chất

từ tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn,

nhất là loại Salmonella spp. (Fulder,2005).

Năm 1959, Horak đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ chiết xuất cây

Cannabit sativa có nguồn gốc từ Ấn Độ, ông đã tìm thấy cannabiriolic là một chất

có tác dụng ức chế với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn Gram dương như

Staphylococcus pyogenes aureus, Streptococcus alpha haemolyticus, Streptococcus

beta haemolyticus, Enterococcus, Diplococcus pneumoniae, B.subtilis, B.anthracis,

Corynebacterium diphtheriae và Corynebacterium cutis, đặc biệt có thể ức chế vi

khuẩn kháng lại penicilin (Kabelik và ctv 1960).

Năm 1982, Ueda cũng đã thử nghiệm chất chiết xuất từ cây thuốc và gia vị

bằng dung môi ethanol để ức chế vi khuẩn và nấm trong môi trường nuôi cấy tại pH

khác nhau. Đinh hương được nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn có thể chống lại tất

cả các sinh vật thử nghiệm bao gồm cả vi khuẩn B.subtilis PCI, S.aureus 209P,

E.coli, S.typhimurium, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Proteus

vulgaris, Proteus morganii.

Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và ctv đã thử nghiệm thành

26

công khả năng kháng khuẩn của các loài cây thảo dược như: O.sanctum, C.alata,

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava,

Clinacanhusnutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus

reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus và P.urinaria đối với Vibrio

spp. Tuy nhiên, chỉ có 2 cây Momordica chratina và Psidium và Psidium guajava

có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp.

Năm 2000 nghiên cứu của Avancini CAM, Wiest JM, Mundstock EA, cho kết

quả hoạt tính kháng khuẩn của “carqueja” (Baccharis trimera Less) ức chế được

nhóm vi khuẩn Gram dương (S.aureus, Streptococcus uberi) và Gram âm

(Salmonella gallinarumand, Escherichia coli).

Vào năm 2003 nhóm Candan và ctv đã nghiên cứu tinh dầu trong lá cỏ thi

(Achillea millefolium) có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn mẫu cao được chiết tử

methanol. Tinh dầu có thể ngăn chặn sự phát triển của các nhóm vi khuẩn

Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringes, nấm Candida albicans và ức

chế yếu hơn đối với Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffiiand, Candida

krussei.

Vào năm 2006, nghiên cứu của nhóm Asolini và ctv cho kết quả nhóm hợp chất

phenolic tồn tại trong mẫu cao chiết ethanol có khả năng kháng khuẩn rất tốt. Mẫu

dịch chiết từ a–ti–sô (Cynara scolymus) và mẫu cao ethanol (80%) của cả a–ti-sô và

“macela” (Achyroline satureioides) ức chế sự phát triển của Bacillus cereus,

B.subtilis, Pseudomonas aeruginosa và S.aureus.

Năm 2011, Naveed Ahmad và ctv đã nghiên cứu về sự chống oxy hóa và kháng

khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại dung

môi khác nhau. Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn

của chiết xuất từ lá của cây Syxygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis (Mehndi),

Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) và Ficus religiosa (Peepal)

chống lại Staphylococcus aureus.

Chaghaby và ctv (2014) đã chứng minh các dịch chiết khác nhau từ lá cây

Annona Squamosa L. đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương

mạnh hơn Gram âm. Kết quả của ông được nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học của

27

Chopra và Greenwood, cho rằng vi khuẩn Gram âm ít bị ảnh hưởng nhiều bởi

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

những chất có chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn Gram dương là do chúng

có một lớp màng ngoài bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide. Đó là lớp

màng chọn lọc cho phép chúng có khả năng điều hòa lưu thông các chất ra vào bên

trong cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27

chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn ở những dịch chiết lên các

chủng vi sinh vật là khác nhau. Sự khác nhau đó là do sự khác biệt giữa các hợp

chất hoá học có trong mỗi loại dịch chiết.

1.3.4.2. Việt Nam

Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc và

khẳng định nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn

Hưởng và ctv đã nghiên cứu trên 1000 cây thuốc và chỉ ra việc sử dụng những cây

thuốc rất an toàn và có hoạt tính kháng khuẩn cao, từ đó nhóm đã đưa ra chế phẩm

cây Tô Mộc trị tiêu chảy (Trần Nam Hà, 2008).

Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phước và ctv đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu

không để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tượng nuôi động vật thủy sản,

bước đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm.

Tác giả Đặng Xuân Cường (Đại học Nha Trang, 2009) đã nghiên cứu các

phương pháp thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ loài rong nâu Dictyota

dichotama Việt Nam. Tác giả cũng cho thấy dịch chiết thu nhận từ loài rong nâu

này co hoạt tính kháng khuẩn khá tốt và đã phân tích được các thành phần có trong

dịch chiết từ rong nâu. Cùng năm 2009, Võ Thị Mai Hương đã nghiên cứu về khả

năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Muồng Trâu trên 5 nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và cho

kết quả kháng khuẩn cao hơn so với nghiên cứu tương tự vào năm 2002 của Elysha

và ctv.

Năm 2010, Phạm Văn Ngọt và ctv đã thông báo kết quả nghiên cứu khả năng

kháng khuẩn của loài Mộc Kí Ngũ Hùng (Dendrophthoepentadra (L.) Miq.) thuộc

họ Tầm gửi.

Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hương nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của

28

cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Năm 2012, tại Nha Trang, Lê Thị Hương Hà nghiên cứu tách chiết và khảo sát

hoạt tính kháng khuẩn – chống oxy hóa của cao dịch chiết từ củ hành tăm (Allium

schoenoprasum) trên các chủng vi khuẩn gây bệnh: Salmonella, E.coli, S.aureus,

Pseudomonas, B.subtilis, B. cereus, Aspergillus, Penicillum.

Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn từ các loại dịch chiết ethanol, methanol và các phân đoạn n-Hexan, EtOAC,

n-Butanol của methanol từ quả Nhàu và kết quả cho thấy các loại dung môi trên đều

cho hoạt tính kháng khuẩn cao với các vi khuẩn khảo sát Staphylococcus aureus,

Salmonella typhii, Escherichia coli, Bacillus pumilus.

Năm 2014, Huỳnh Kim Diệu và Võ Thị Tuyết đã đánh giá sự thuần chủng và

hoạt tính kháng khuẩn của cây hẹ (Allium tuberosum Roxb. Et Spreng) trên 8 chủng

vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherrichia coli,

Aeromonas hydrophila, Edwardsiella icaluri, Edwardsiella tarda, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella spp. Kết quả nghiên cứu cao hẹ có khả năng ức chế trên tất

cả các chủng vi khuẩn thí nghiệm (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml).

1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

1.3.5.1. Khái niệm

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibition Concentration (MIC)) là nồng

độ thấp nhất của chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) có khả năng ức chế sự tăng

trưởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuôi cấy.

Khi cho vi khuẩn tiếp xúc với chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) ở các liều

lượng nồng độ khác nhau, vi khuẩn bị ức chế hoặc bị tiêu diệt. Một số vi khuẩn có

thể nhạy cảm với một ít hoặc với chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh). Chỉ số MIC

có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn các chất kháng khuẩn (hoặc kháng

sinh) phù hợp với từng loại vi khuẩn gây bệnh. Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự

đoán dựa vào dữ liệu MIC, đồng thời xác định được nồng độ tối ưu để làm chậm sự

29

chọn lọc vi khuẩn kháng thuốc.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

1.3.5.2. Phương pháp xác định

Tùy theo phương pháp áp dụng mà có nhiều cách xác định chỉ số MIC khác

nhau. Các phương pháp phổ biến như: phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch,

phương pháp pha loãng, phương pháp đặt khoanh giấy…

Sau đó ta có thể xác định nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hoàn toàn sự

tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách quan sát với mắt thường.

1.4. Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật

Tách chiết bằng dung môi là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn –

lỏng. Quá trình này sẽ sử dụng một số dung môi thích hợp để hòa tan các hợp chất

tan có trong thực vật, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan. Phần dung môi hòa

tan các chất được gọi là dịch chiết, phần không tan được gọi là bã thực vật.

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự

đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn ly trích, từ đó lựa chọn dung môi

tách chiết thích hợp:

- Trong dịch chiết ete và ete dầu hỏa sẽ có các thành phần của tinh dầu như

monoterpene, các chất không phân cực như chất béo, carotene, các sterol, các chất

màu thực vật, chlorophyll…

- Trong dịch chiết nước sẽ có các glycoside, tannin…

- Trong dịch chiết chloroform sẽ có mặt quinone, các aglycol do glycodise thủy

phân, sesquiterpen, diterpen…

- Methanol và ethanol là những dung môi phân cực hơn các hydrocacbon thế cho.

Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào, hòa

tan được các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với

các nhóm phân cực khác, nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được

lượng lớn thành phần các hợp chất tự nhiên.

2. Yêu cầu đối với dung môi:

- Dễ thấm vào dược liệu: dung môi có độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ.

- Hòa tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất.

- Có tính trơ về mặt hóa học: không làm biến đổi hoạt chất, không gây khó khăn

30

trong quá trình bảo quản, không bị phân hủy bởi nhiệt độ cao.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

- Dễ dàng được loại bỏ, phải bay hơi được khi cần cô đặc dịch chiết.

- Không làm cao có mùi đặc biệt, khó chịu.

- Cần có độ tinh khiết nhất định để không làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất

lượng của quá trình chiết cao.

- Rẻ tiền, dễ kiếm.

2.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh

2.1.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli

2.1.1.1. Đặc điểm hình thái

E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thước dài, ngắn khác nhau

trung bình từ 2 - 3µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích

hợp (ví dụ trong môi trường có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm).

Rất ít chủng E.coli có v, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di

động (Bùi Thị Hài Hoà, 2012).

Trực khuẩn E.coli hiếu khí và kỵ khí tuỳ nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ

15oC – 40oC, phát triển ở nhiệt độ thích hợp 37oC với pH = 7,2 – 7,4; phát triển

được ở pH = 5,5 – 8,0 (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).

Trong môi trường lỏng, sau 4 - 5 giờ, E.coli đã làm đục nhẹ môi trường, càng

để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể đóng váng mỏng trên mặt môi trường,

để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống.

Trên môi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng,

không màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2 – 3 mm.

31

Hình 1.12. E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2µm (Bact, 2005).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.1.1.2. Khả năng gây bệnh

E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở người như tiêu chảy, gây viêm đường

tiêu hoá, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hô hấp. Là một trong những nguyên

nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong bệnh

viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. Nhưng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là

viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm

trùng trong bỏng.

Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất được biết đến

trên người, làm huỷ hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm

nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế

bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu. Những

trường hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột (Bùi Thị Hài Hoà, 2012).

E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh chi súc vật tương đối thấp,

phải cần một số lượng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đường tĩnh mạch

cho thỏ mới gây chết được súc vật.

2.1.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp.

2.1.2.1. Đặc điểm hình thái

Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thước trung bình 3,0 x

0,5 µm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ A.gallinarum và S.pullorum), có khả

năng di động, không có vỏ, không sinh bào tử (Trần Kim Hùng Nguyên, 2005).

Là vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển được trên môi trường nuôi cấy thông

thường. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 – 42oC và pH từ 6 – 9, nhưng điều

kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2.

Nuôi cấy trên môi trường lỏng: sau khi nuôi cấy vài giờ Salmonella spp làm

môi trường đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuôi cấy lâu sẽ có cặn ở đáy ống

nghiệm và có màng mỏng trên bề mặt môi trường (Nguyễn Như Thanh, 1997).

Nuôi cấy trên môi trường thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, nhỏ,

32

trong hoặc xám, nhẵn, bóng hay lồi lên ở giữa.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.13. Hình thái vi khuẩn Samonella spp. (Taragui, 2005).

2.1.2.2. Khả năng gây bệnh

Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc

hay còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thường gặp như tiêu chảy, co

thắt dạ dày, đau đầu, sốt, nôn mửa và mất nước (mất dịch cơ thể). Triệu chứng có

thể tiến triển từ 12 – 72 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Các triệu chứng thường kéo dài

trong vòng 4 – 7 ngày và sau đó tự hồi phục. Tuy nhiên một số ít trường hợp có thể

diễn biến nặng và gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013).

Salmonella spp. còn gây bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhii gây thương tổn

mảng Peyer, xuất huyết tiêu hoá, có thể gây thủng ruột; ngoài ra, còn gây trạng thái

sốt kéo dài, li bì, chứng truỵ tim mạch… Các bệnh khác (không phải thương hàn)

thường là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hoá chủ yếu là do 2 tác nhân

S.typhimurium, S.enteritidis gây ra, bệnh có biểu hiện gây sốt, nôn, tiêu chảy. Ngoài

ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thương ở ngoài đường tiêu hoá như viêm

màng não, có thễ nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi…

Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm trên gia cầm: vi khuẩn Salmonella gây 3

thể bệnh: bệnh thương hàn, phó thương hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc

S.choleraesuis chủng Kunzendorf và S.typhisuis chủng Caoldagsen gây bệnh phó

thương hàn cho heo, S.enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phó thương hàn

cho bò, bê, S.abortusovis gây bệnh sảy thai ở cừu, S.gallinarum – pullorum gây

33

bệnh thương hàn cho gà (Nguyễn Như Thanh, 1997).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.1.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp.

2.1.3.1. Đặc điểm hình thái

Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đường ruột) là trực khuẩn

Gram âm, nhỏ, dài với kích thước 0.5 – 0.6 x 1 – 3 µm, không sinh bào tử, không di

động, thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi nhưng phát triển tốt trong

điều kiện hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC. Chúng có thể sống nhiều

ngày với điều kiện lý hoá khắc nghiệt như trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trường

chứa 5% NaCl hay trong môi trường có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị

tiêu diệt khi khử trùng bằng phương pháp khử trùng Pasteur.

Trong môi trường lỏng: sau 18 – 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục

đều môi trường.

Trên môi trường đặc: sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính khoảng 1

mm, tròn, lồi, mặt nhẵn, rìa đều.

Hình 1.14. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011)

2.1.3.2. Khả năng gây bệnh

Nhiễm khuẩn Shigella spp. thường chỉ giới hạn ở đường tiêu hoá. Chỉ cần số

lượng nhỏ 10 – 100 vi khuẩn đủ gây bệnh. Sau khi xâm nhập, vi khuẩn tấn công lớp

biểu mô niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti rồi hoại tử, làm ung loét và

xuất huyết. Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy phân nhầy máu, số lần đi tiêu 10 – 20

lần/ ngày và kèm theo đau bụng và sốt cao. Đa số sự hiện diện bạch cầu trong phân.

34

Bệnh thường kéo dài dưới 7 ngày (Nguyễn Minh Hoàng, 2013).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đường tiêu hoá như viêm kết

mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn

huyết,…theo Nguyễn Đức Hiền (2013).

2.1.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp.

2.1.4.1. Đặc điểm hình thái

Các loài Listeria spp. là trực khuẩn Gram dương, có kích thước ngắn (0,4 – 0,5

x 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trường nuôi cấy không acid, không sinh

nha bào. Ở 20oC chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous

flagella), nhưng sự di động không quan sát được ở 37oC. Chúng là vi khuẩn kỵ khí

không bắt buộc và có thể sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3

– 45oC (tối ưu là 30 – 36oC), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm. Chúng

có thể mọc ở pH 9,6, nhưng đạt điều kiện tối ưu ở pH hơi kiềm hoặc môi trường

trung tính (Nguyễn Hữu Liêm, 2013).

Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Listeria spp.

2.1.4.2. Khả năng gây bệnh

Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở người với các triệu chứng rất

nguy hiểm và có tỷ lệ tử vong cao. Người nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm

sàng nhẹ như sốt, viêm dạ dày – ruột. Đồng thời L.monocytogenes là tác nhân gây

chết đặc biệt ở trẻ em dưới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô

cấy ghép và có hệ miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi người mẹ bị nhiễm

Listeria spp. thì có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống như bị cảm

cúm nhưng bào thai và thai nhi sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai,

35

chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp. tác động chuyên biệt

trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng như viêm não, viêm màng não,

nhiễm trùng máu, sảy thai, đẻ non.

2.1.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp.

2.1.5.1. Đặc điểm hình thái

Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, thuộc họ Vibrionaceae là nhóm vi khuẩn

Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thước 0,3

– 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều

tiên mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp.

đều là vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển trong môi trường bổ sung muối (NaCl) và

không sinh H2S.

Hình 1.16. Hình thái vi khuẩn Vibrio (Microscopy, 2004)

2.1.5.2. Khả năng gây bệnh

Bệnh tả là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholera gây ra. Biểu hiện

lâm sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nước và thức ăn, về sau

giống như dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài

phân lỏng có mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nước, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn

đến tử vong nếu không điều trị kịp thời.

Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng như tiêu chảy nhiều lần trong

ngày, đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân,2013).

Một số loại vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đã được công bố là tác nhân gây

bệnh nghiêm trọng ở một số đối tượng thủy sản (Austin & Austin 1993). Một số

36

bệnh ở thủy sản do Vibrio spp. gây ra như sau: bệnh phát sàng ở ấu trùng tôm, bệnh

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

xuất huyết lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác và một số bệnh

khác nhau: gây chết ở ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đường ruột, bệnh hoại

tử gan ở giáp xác…(Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).

2.1.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp.

2.1.6.1. Đặc điểm hình thái

Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí

bắt buộc; có hình thẳng, hai đầu tròn, dài 1 – 5 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một

tiêm mao đơn cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo

thành chuỗi ngắn.

Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ

phát triển tối ưu ở 37oC phát triển được ở nhiệt độ 5oC – 42oC. Trên môi trường đặc,

thường có 2 loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ,

xù xì, lồi.

Hình 1.17. Hình thái vi khuẩn Pseudomonas spp.

2.1.6.2. Khả năng gây bệnh

Pseudomonas spp. gây bệnh cho người: trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh

có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính,

khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng,

các vết thương hở,…

Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi,

37

chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

nhiễm trùng đường tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não,

viêm tủy xương…

Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang,

tiêm vào màng bụng chuột 0,1,- 0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài

giờ, những con chuột sống dần dần được hình thành những ổ mủ.

2.1.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp.

2.1.7.1. Đặc điểm hình thái

Enterococcus faecalis có đầy đủ đặc tính của streptococcus, là vi khuẩn Gram

dương thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có đường kính < 2 µm. Nhiệt độ thích hợp cho

sinh trưởng và phát triển là 30 – 35oC.

Enterococcus faecalis có thể sống sót trên các bề mặt môi trường, không chịu

được sự thanh trùng, pH < 6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng, không sinh độc tố

(Dương Văn Sĩ, 2010).

Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Enterococcus

2.1.7.2. Khả năng gây bệnh

Vi khuẩn Enterococcus faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thường của

người, chúng là một trong những nguyên nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội trên cơ

thể người khi cơ thể đang bị bệnh, hệ miễn dịch suy yếu hay do dùng kháng sinh lâu

dài. Vi khuẩn Enterococcus faecalis thường gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu, gây

nhiễm trùng vết thương (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng), và nhiễm

38

khuẩn huyết.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.1.8. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus aureus.

2.1.8.1. Đặc điểm hình thái

Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đường kính 0,8 – 1 µm, đứng

tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi

hay thành từng chuỗi ngắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dương,

hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có

khả năng sinh độc tố. Chúng phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh

lệch nhiều (nhiệt độ từ 10oC – 45oC).

Hình 1.19. Hình thái vi khuẩn Staphylococcus aureus.

2.1.8.2. Khả năng gây bệnh

Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thường gặp nhất là tụ cầu vàng

(Staphylococcus aureus) và có loại bình thường sống trên da và niêm mạc, không

gây bệnh. Staphylococcus aureus cư trú trên người và động vật, có trong sữa bò bị

bệnh, thịt heo tươi, trong đất là vi sinh vật gây bệnh cơ hội mạnh nhất.

Vi khuẩn Staphylococcus spp. gây bệnh bằng cách bám dính vào da, niêm mạc

(khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) hay các tổ chức sâu hơn như tổ chức

lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặc phế nang, tổ chức nội mô. Ngoài ra

Staphylococcus aureus còn là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: Nhiễm

trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu, tác động lên hệ thần kinh trung

ương.

Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ

39

cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.2. Sơ lược về vi khuẩn V.alginolyticus

2.2.1. Phân loại khoa học

Giới Bacteria

Ngành Proteobacteria

Lớp Gamma proteobacteria

Bộ Vibrinonales

Họ Vibrinoceae

Giống Vibrio

Loài Vibrio alginolyticus

2.2.2. Đặc điểm hình thái

Vibrio alginolyticus là vi khuẩn Gram (-), hình que hơi uốn cong, kích thước

0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 µm, chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay

nhiều tiêm mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Là loài vi khuẩn kỵ khí, có đặc điểm

phản ứng dương tính với lysine, nitrate, lipid, gelatin, oxidase nhưng âm tính với

ure, arginine và không phát sáng. Vibrio alginolyticus phát triển tốt trong môi

trường peptone 1% có chứa 3, 6, 8, 10% NaCl, nhưng lại không phát triển ở 0%

NaCl.

Ngoài ra, vi khuẩn không sinh H2S và mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129

Theo mô tả của Austin (2007) và của Viên Đại Phúc (2011) Vibrio

alginolyticus có đặc điểm đặc trưng là phát triển thành từng cụm trên bề mặt thạch

rắn, trên môi trường TCBS, khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng, bờ không đều, trên

môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Vibrio alginolyticus có

khả năng làm tan huyết, phân giải chitin, lipid, gelatin và tinh bột nhưng không

phân giải aesculin. Vibrio alginolyticus lên men đường với glycerol, maltose,

mannitol, mannose, salicin và sucrose nhưng không lên men đường với arabinose,

inositol và lactose.

Ultizur (1975) đã xác định Vibrio alginolyticus phát triển tốt nhất ở 370C.

Yếu tố nhiệt độ, độ muối và nồng độ dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến tốc độ phát

40

triển của vi khuẩn, trong đó nhiệt độ có tác động lớn nhất. Ở 390C thời gian phát

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

triển giữa các thế hệ là 10-11 phút, còn ở 210C thời gian là 60 phút. Cũng theo

Ulitzur, sự phát triển của các lông rung của roi và hoạt động bơi của vi khuẩn Vibrio

alginolyticus phụ thuộc vào một mối quan hệ phức tạp giữa nhiệt độ, nồng độ muối

và độ pH.

2.2.3. Đặc điểm phân bố

Vibrio alginolyticus là một loài vi khuẩn ưa mặn và phân bố rộng, chúng có mặt

ở hầu hết các mẫu thu từ nhiều đối tượng thủy sản khác nhau như cá, giáp xác,

nhuyễn thể, rong biển… Vibrio alginolyticus có mặt trong môi trường nước mặn ở

vùng biển nhiệt đới ôn hòa và liên quan tới tỷ lệ chết cao trong hệ thống nuôi trồng

thủy sản ở vùng biển Tunisian. Vi khuẩn này thường có mặt ở những người thường

ăn hải sản tươi sống hoặc chưa nấu chín dẫn đến viêm dạ dày ruột và bệnh đại tràng.

Những bệnh này thường xuất hiện vào mùa hè, khi nhiệt độ nước tăng.

Stephen đã phân lập Vibrio alginolyticus từ 9/12 loại hải sản ở vùng biển Ả

Rập, với hầu hết các chủng có nguồn gốc từ việc đánh bắt cá mòi tươi, cá thu, và

cua. Vi khuẩn V.alginolyticus đã được biết là cùng môi trường giống với vi khuẩn

V.parahaemolyticus và thường được phân lập từ cùng một loại mẫu. Cả hai đều có

thể tồn tại ở mẫu hải sản bán phổ biến ở chợ tại Jakarta.

Vi khuẩn V.alginolyticus xuất hiện với tần số cao hơn so với

V.parahaemolyticus đã được báo cáo trong các mẫu nước biển và hải sản thu thập

tại Na Uy, Hà Lan, và Nhật Bản. Sự phong phú tương đối của V.alginolyticus và

V.parahaemolyticus trong nước biển nhiệt đới và các nguồn hải sản ít được nghiên

cứu, nhưng một báo cáo gần đây cho thấy một tỷ lệ lớn các mẫu cá biển tươi sống

thu được khuẩn lạc màu vàng hơn là khuẩn lạc xanh trên môi trường thạch TCBS.

Sakazaki đã đề xuất V.alginolyticus là một chỉ số so sánh cho bề mặt bị ô nhiễm thứ

cấp của hải sản và đồ dùng so với V.parahaemolyticus. Tuy nhiên, đề xuất này nên

áp dụng đối với các vùng ở khu vực nhiệt đới, nơi 2 loài vi khuẩn V.alginolyticus và

V.parahaemolyticus phát triển phong phú.

Theo Zhi, V.alginolyticus được phát hiện từ mẫu tôm ướp muối từ vụ ngộ độc

thực phẩm, là tác nhân gây bệnh thông qua điều tra dịch tễ và kiểm tra nguyên nhân

41

gây bệnh. V.alginolyticus gây nhiễm trùng máu cho người và nhiễm vào vết thương

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

và nó được tìm thấy từ mẫu phân của người bị tiêu chảy chưa tìm được nguyên

nhân gây bệnh. Từ các mẫu thức ăn dẫn đến ngộ độc thực phẩm. Vi khuẩn

V.alginolyticus cũng liên quan đến dịch bệnh ở cá biển nuôi và tự nhiên cũng như

dịch bệnh ở ấu trùng và con giống của nhuyễn thể và giáp xác trên thế giới. Dựa vào

nghiên cứu của Hormansdorfer, V.alginolyticus được tìm thấy sự có mặt của chúng

trong nước biển, chất lắng cặn ở bề mặt đá san hô.

2.2.4. Khả năng gây bệnh

V.alginolyticus lần đầu tiên được xác định là một mầm bệnh của người vào năm

1973. Đôi khi nó gây ra nhiễm trùng mắt, tai và vết thương. V. alginolyticus là một

loài có khả năng chịu mặn cao và có thể phát triển trong nồng độ muối 10%. Hầu

hết các chủng lâm sàng đều đến từ những vết thương bị nhiễm trùng bị nhiễm bẩn ở

bãi biển. Tetracycline thường kết quả trong điều trị. V. alginolyticus là nguyên nhân

hiếm gặp của nhiễm khuẩn huyết ở những người bị suy giảm miễn dịch.

Theo nghiên cứu của Josenhans (2002) , nhiều vi khuẩn gây bệnh trên

người, động vật và thực vật sử dụng roi để di chuyển. Đối với nhiều tác nhân gây

bệnh, vận động là điều cần thiết trong một số giai đoạn của chu kỳ sống và độc tính

cùng với sự vận động được điều khiển chặt chẽ bởi hệ thống gen. Theo

Hörmansdorfer (2000), Vibrio alginolyticus trong 13/45 mẫu thu từ nước biển và

chất lắng cặn ở bề mặt đá san hô. Tất cả các chủng này đều có tính độc tạo ra sản

phẩm men phân giải casein và lipid, 11/13 chủng phân giải tinh bột và gelatin, 7/13

chủng thể hiện tác dụng với lecithin và 2/13 chủng có men phân giải hồng

cầu. Cũng như các loài vi khuẩn khác, khả năng tương tác giữa tác nhân gây

bệnh và vật chủ là sự bám dính và các hoạt động thủy phân. Hoạt động thủy phân đã

được xem là yếu tố độc tính bởi vì chúng cho phép vi khuẩn sống sót, sinh sản và

xâm lấn các mô vật chủ. Hoạt động phân giải protein của các sản phẩm ngoại bào

có tương quan với khả năng gây bệnh của nhiều loài vi khuẩn Vibrio và Aeromonas.

Hầu hết các chủng Vibrio alginolyticus phân lập đều có sản phẩm của enzyme phân

giải gelatin, lipid, ADN và casein, tất cả các yếu tố độc này có thể giúp các sinh vật

42

khác nhiễm vào và sinh sôi nảy nở.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Theo nghiên cứu của Narjol (2006), Vibrio alginolyticus phân lập từ hầu

ở Alaskan có chứa gen trh (thermostable direct haemolysin-related haemolysin), tiết

ra chất có tác dụng làm tan hồng cầu, trước đây đã được báo cáo chỉ có ở

Vibrio parahaemolyticus (là yếu tố gây độc của vi khuẩn này), gen giống trh này đã

được tách dòng và giải trình tự giống đến 98% so với gen trh2 Vibrio

parahaemolyticus. Wang (2007) đã chứng minh rằng khả năng phân giải protein

43

ngoại bào và các chất làm tan huyết cũng như sự lấy sắt của Vibrio alginolyticus.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện

2.1.1. Địa điểm

Phòng thí nghiệm vi sinh, Phòng thí nghiệm Hóa học, Khoa Công Nghệ Sinh

Học- Thực Phẩm- Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

2.1.2. Thời gian: từ ngày 06/03/2017 đến 16/07/2017.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Vật liệu:

Lá bàng (Terminalia catappa) thu hái tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long.

2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn được

cung cấp bởi Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện

Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II, bao gồm:

- Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7.

- Nhóm vi khuẩn Shigella : S. sonnei, S. boydii, S. flexneri.

- Nhóm vi khuẩn Samonella spp : S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin.

- Nhóm vi khuẩn Vibrio : V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.

cholerae.

- Nhóm vi khuẩn Listeria : L. monocytogenes, L. innocua.

- Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da : E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa.

2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.3.1. Dụng cụ

- Erlen 1000ml. - Micropipette loại 10-100µl, 100-

- Phễu . 1000µl.

- Cốc thủy tinh 1000ml, 250ml, - Đầu tipe loại 100 µl, 1000µl.

100ml, 50ml. - Pipette thủy tinh 1 ml, 10 ml.

- Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml. - Pipette Pasteur.

- Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml. - Ống nghiệm lớn, nhỏ.

- Ependoff 2 ml. - Đèn cồn.

44

- Bình môi trường 250 ml, 500ml. - Que cấy trang.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

- Dụng cụ đục lỗ (d = 6 mm). - Bông thấm và bông không thấm

nước. - Thước đo.

- Các loại dụng cụ khác như: bao - Giá ống nghiệm.

chịu nhiệt, kéo, giấy gói, kẹp gấp, - Eppendorf.

muỗng, dao, thun, parafirm, giấy - Đũa thủy tinh.

lọc… - Bình tia.

- Đĩa petri.

2.3.2. Thiết bị

- Autoclave (Huxky Đài Loan) - Cân phân tích (Orbital Germany)

- Tủ ấm 300C, 370c (Memmert - Bếp từ (Billy – England)

merman) - Máy nước cất (Branstead USA)

- Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy lắc

- Máy cô cách thủy. - Máy lọc chân không

- Máy đo UV – VIS (Hach) - Máy xay mẫu

2.3.3. Hóa chất, dung môi

- Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ).

- Môi trường TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ).

- Ciprofloxacin 500mg (Việt Nam)

- H2SO4 đậm đặc, H2SO4 loãng, HCl đậm đặc, chloroform.

- Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol.

- Acid acetic glacial, acetic anhydrine, benzene, bột Magnesium.

- NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2)) 10%.

- Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager,

Wagner.

- Ethanol 70% (Việt Nam).

- Nước cất.

- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc).

- NaCl

45

- Agar

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu

Mẫu thực vật được thu một lượng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá và cành

mang đi rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 400C đạt khối lượng không đổi.

Mẫu lá khô được tiến cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lượng bột mẫu

thu được sẽ được đóng gói trong túi nhựa và bảo quản ở - 4oC để tách chiết cao sử

dụng trong các thí nghiệm.

2.4.2. Phương pháp thu nhận cao thực vật và xác định hiệu suất thu hồi.

2.4.2.1. Phương pháp thu nhận cao thực vật

Mẫu thực vật được tách chiết bởi nhiều loại dung môi khác nhau bằng

phương pháp ngấm kiệt ở nhiệt độ thường và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay

hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp.

Nguyên tắc: sử dụng phương pháp chiết ngâm, mẫu thực vật được ngâm

trong lượng lớn dung môi (w/v) ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong

mẫu hòa tan vào dung môi.

Cách tiến hành: ngâm một lượng mẫu vào một lượng dung môi (tỷ lệ 1:20

(w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được ngâm trong khoảng 24h;

thỉnh thoảng có khấy trộn hoặc lắc sau đó đem đi lọc hoặc ly tâm, ép bã thu dịch

chiết. tiếp tục cho thêm lượng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm

một số lần nữa cho đến khi dịch lọc có màu trong suốt. Phần dịch chiết được cô đặc,

thu hồi cao bằng phương pháp cô quay chân không ở 400C (đối với dung môi

methanol) và cô cách thủy ở 700C (đối với dung môi ethanol, nước). Các cao chiết

được bảo quản ở nhiệt độ - 40C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

2.4.2.2. Xác định hiệu suất thu hồi

Hiệu suất thu hồi cao được tính theo công thức sau:

46

𝐻 = × 100(%) 𝑚1 − 𝑚2 𝑚

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó

H: hiệu suất cao thu được (%)

m1: khối lượng cốc thủy tinh có chứa bột cao (g)

m2: khối lượng cốc thủy tinh ban đầu (g)

m: khối lượng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g)

Sau khi xác định hiệu suất thu hồi các loại cao thu hồi được bảo quản ở nhiệt độ 40C

trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí

nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.

2.4.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh

2.4.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật

được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh

vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 - 50C) để bảo quản.

Qúa trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật

luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh

vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy truyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa

là 3 tháng cấy chuyền một lần.

Cách tiến hành: Giống vi sinh thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch

nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh

vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh

vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống

thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ

ủ giao động từ 48 - 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong được

bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.4.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng,

có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ

trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là

47

việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

trong tế bào. Để khác phục nhược điểm này người ta bổ sung các chất làm hạn chế

tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol.

Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích

hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu

cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở

nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007).

2.4.4. Phương pháp tăng sinh, xác đinh mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị

Nhằm hoạt hóa các vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì chúng

có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản.

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh

dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh

vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi

chất giữa vi sinh vật và môi trường.

Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi

khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol 40%, tiến hành tăng

sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml môi trường TSB

trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ

ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê

Ngọc Thùy Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp

đó mật độ quang OD ở bước sóng 600nm.

Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland)

Mật độ = OD600 nm x 1,02 x 109 (cfu/ml)

2.4.5. Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai

trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng

độ thích hợp sẽ giúp rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh

48

vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu loãng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong

mẫu.

Cách tiến hành: Dùng micropipeptte hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9

ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ

ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha

loãng ta được nồng độ pha loãng là 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi

được nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013).

Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu

2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết được đánh giá bằng phương pháp

khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) dựa trên phương pháp của

Anonymous (1996) và Hadacek và ctv (2000) có sự điều chỉnh phù hợp với điều

kiện của phòng thí nghiệm.

Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trường thạch và

tác động lên các chủng vi khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các

chủng vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức

chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo

49

đường kính vòng ức chế (mm).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Cách tiến hành

Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ giống gốc trong môi trường lỏng TSB, lắc

qua đêm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ 106 cfu/ml lên đĩa

TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng đường kính d = 6

mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2 – 3 cm.

Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lượng cao chiết trong Dimethyl

Sulfoxide (DMSO) 1% theo nồng độ yêu cầu 100 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao

chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ

để dịch cao được khuếch tán đều vào môi trường thạch. Sau đó ủ các đĩa vào tủ ấm

370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả bằng cách đo giá trị đường kính vòng ức

chế (mm) trên đĩa thạch. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Đối chứng là kháng sinh Ciprofloxacin (500 µg/ml).

2.4.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC

Nguyên tắc: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết có số lượng

vi sinh vật bị kháng cao nhất. Nhằm mục đích xác định nồng độ ức chế nhỏ nhất của

cao chiết đối với các vi sinh vật bị kháng. Sử dụng phương pháp khuếch tán trên

giếng thạch (agar well diffusion method) ở các nồng độ khác nhau.

Cách tiến hành:

Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ 106 cfu/ml trên đĩa TSA và

tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng có đường kính 6 mm trên

đĩa TSA.

Cao chiết được pha loãng trong DMSO 1% với nồng độ gốc là 200 mg/ml. Từ

nồng độ gốc pha loãng theo cấp số 2 thành nhiều dãy nồng độ thấp hơn cụ thể như

sau: 150 mg/ml, 100mg/ml, 50 mg/ml.

Sau khi có dịch cao chiết ở nhiều nồng độ, tiến hành bổ sung 100 µl dịch cao

chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ

để dịch cao được khuếch tán đều vào môi trường thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm

ở 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả bằng cách đo giá trị đường kính vòng

50

ức chế (mm) trên đĩa thạch. Mỗi nồng độ cao thí nghiệm được lặp lại ba lần.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.4.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học của cao chiết

Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng

các phản ứng hóa học theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã

được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất (Lương Văn Tiến và ctv, 2015).

Cách tiến hành: cao chiết được ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc

và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần

hóa học với các lọai hóa chất, thuốc thử đặc trưng.

2.4.8.1. Định tính carbohydrate

Thử nghiệm Molisch: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2

giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ tư từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc và

đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ -

tím.

Thử nghiệm Fehling: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1

ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút, làm lạnh và

đọc kết quả. Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O.

Thử nghiệm Barfoed: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml

thuốc thử Brafoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả.

Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch (Yadav và ctv, 2013).

2.4.8.2. Định tính saponin

Thử nghiệm tạo bọt: hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2

ml nước cất vào lắc mạnh. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện bọt và ổn

định (Abba và ctv, 2009).

2.4.8.3. Định tính alkaloid

Thử nghiệm Mayer: hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt

thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa

màu trắng được tạo thành.

Thử nghiệm Dragendorff: hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ

vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành

51

kết tủa màu vàng cam.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Thử nghiệm Hager: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml

thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu

vàng.

Thử nghiệm Wagner: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2

ml thuốc thử Wargner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết

tủa màu nâu đỏ (Yadav và ctv, 2013).

2.4.8.4. Định tính cardiac glycoside

Thử nghiệm Legal: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml

pyridine hoặc 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 giọt NaOH 10% vào và đọc

kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.

Thử nghiệm Keller Kiliani: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2

ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc và

đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic

(Yadav và ctv, 2013).

2.4.8.5. Định tính anthraquinone glycoside

Thử nghiệm Bontrager: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml

dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi, sau đó tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc,

bổ sung thêm 3 ml benzene lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene cho vào ống

nghiệm khác, tiếp tục thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết

quả dương tính khi xuất hiện màu hồng hoặc đỏ (Abba và ctv, 2009).

2.4.8.6. Định tính flavonoid

Thử nghiệm alkaline: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào 5

giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống

nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng

làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện

màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có

thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất.

Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho một ít

52

bột Magnesium vào, cho từ từ 1 ml HCl đậm đặc vào sát thành ống nghiệm. Sau đó

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

thêm 5 ml ethanol 95% và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi mẫu có xuất hiện

cam, hồng, đỏ đến tím,…

Thử nghiệm Ferric chloride: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó

cho thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính

khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím (Mamta và ctv, 2012).

2.4.8.7. Định tính các hợp chất phenol

Thử nghiệm lead acetate: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho

vào 3 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết

tủa trong ống nghiệm.

Thử nghiệm Gelatin: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt

gelatin 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng.

(Mamta và ctv, 2012).

2.4.8.8. Định tính tannin

Thử nghiệm Ferric chloride: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và

thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết

quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen (Abba và ctv,

2009).

Thử nghiệm Lead acetate: hút 2 ml dung dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và

thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử lead acetate 10% vào và đọc kết quả. Kết

quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng (Mamta và ctv, 2012).

2.4.8.9. Định tính steroid

Thử nghiệm Salkowski: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2

ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách

thành 2 lớp đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2

trường hợp: ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là

triterpenoid.

Thử nghiệm Libermann Burchard: hút 2 ml dung dịch cao chiết cho vào ống

nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống

53

nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: xuất hiện

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

vòng màu nâu ở mặt phân cách và lớp trên có màu xanh lá là sterol. Hình thành màu

đỏ đậm là triterpenoid (mamta và ctv, 2012).

2.4.8.10. Định tính amino acid

Thử nghiệm Ninhydrin: hút 1 ml dung dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau

đó cho một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả

dương tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013)..

2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và phần mềm SAS

version 9.4 với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phương sai One-way

ANOVA (P<0,05) có ý nghĩa thống kê.

2.5. Bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt

54

tính kháng khuẩn của lá bàng được trình bày ở Hình 2.2.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu lá bàng

Xử lý mẫu

Ngâm dung môi ethanol 70%

Lọc

Cô mẫu

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao

Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao

Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết lá bàng đến vi khuẩn V.alginolyticus

Xác định chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70%

Cao chiết lá bàng

Đánh giá kết quả

55

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết từ lá bàng đối với

dung môi ethanol 70%.

2.5.1.1. Quy trình thực nghiệm

Mẫu lá bàng

Xứ lý mẫu: phơi khô, xay nhuyễn

Lọc tinh Ngâm với dung môi (1:20 (w/v)) ethanol 70% Bã

Dịch lọc

Cô cách thủy 700C

Cao chiết

Bảo quản ở - 40C

Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ lá bàng.

2.5.1.2. Thuyết minh quy trình

Lá bàng sau khi được thu nhận lá được rửa sạch và sấy ở 400C. Sau khi khô, tiến

hành đem xay nhỏ thành dạng bột.

Tiến hành ngâm mẫu với các dung môi ethanol 70% theo tỷ lệ 1:20 (w/v) trong

56

24 giờ. Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

được ngâm, lọc với lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết có màu nhạt

dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô

cách thủy ở 70oC để thu nhận cao chiết (TcEE). Bảo quản cao chiết ở nhiệt độ -

40C.

Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết theo 3.4.2.2.

2.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt

tính kháng khuẩn của cao chiết.

2.5.2.1. Quy trình thí nghiệm

Vi sinh vật chỉ thị

Môi trường TSA

Tăng sinh trong môi trường TSB

Hấp tiệt trùng 121oC – 1atm trong 15 phút

Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ)

Đổ đĩa Đo OD600nm

Hút 100 µl dịch vi khuẩn

Cao chiết Cấy trang

Pha loãng về 106 cfu/ml

DMSO 1% Đục lỗ (d=6mm)

Nhỏ dịch

Nồng độ 100 mg/ml

Ủ 37oC/24 giờ

Đo đường kính vòng kháng khuẩn

57

Hình 2.4. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của TcEE

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.5.2.2. Thuyết minh quy trình

Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các

loại cao chiết lá bàng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.

Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi

trường TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. Có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc

với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn

sau khi lắc được đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha

loãng bằng các ống nước muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106

cfu/ml.

Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha loãng cho lên trung tâm đĩa thạch

TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. Môi trường TSA có bổ sung

1,5% NaCl). Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong

điều kiện vô trùng. Dùng ống trụ kim loại khử trùng có đường kính d = 6 mm, đục

các giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang. TcEE được hòa tan bằng DMSO 1% ở

nồng độ 100mg/ml. Hút vào mỗi giếng 100 µl dịch cao hoặc chất kháng sinh (đối

với mẫu đối chứng). Sau đó, các đĩa petri được để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để

dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở

37oC trong thời gian 18 – 24 giờ và đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng ức

chế,

Mẫu đối chứng là ciprofloxacin 8 µg/ml với chủng Vibrio spp. Và 500

µg/ml với các chủng còn lại.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.5.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với

chủng vi khuẩn gây bệnh.

Kết thúc thí nghiệm 2 TcEE có hoạt tính kháng khuẩn cao. Vì vậy, mẫu cao

chiết này sẽ được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng vi khuẩn đối

58

kháng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

2.5.3.1. Quy trình thí nghiệm

Vi sinh vật chỉ thị

Môi trường TSA

Tăng sinh trong môi trường TSB

Hấp tiệt trùng 121oC – 1atm trong 15 phút Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ)

Đổ đĩa Đo OD600nm

Hút 100µl dịch vi khuẩn Cao chiết

Pha loãng về 106 cfu/ml Cấy trang DMSO 1%

Đục lỗ (d=6mm)

Cao ở các nồng độ 50-100-150 mg/ml

Ủ 37oC/24 giờ

Đo đường kính vòng kháng khuẩn

Hình 2.5. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết.

2.5.3.2. Thuyết minh quy trình

Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi

trường TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. Có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc

với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn

59

sau khi lắc được đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

loãng bằng các ống nước muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106

cfu/ml.

Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha loãng cho lên trung tâm đĩa thạch

TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. Môi trường TSA có bổ sung

1,5% NaCl). Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong

điều kiện vô trùng, dán nhãn các chủng vi khuẩn tương ứng. Dùng que đục đã khử

trùng có đường kính d = 6 mm, đục 3 hoặc 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi

trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1 cm. Dùng dao vô trùng lấy phần

thạch đã đục ra khỏi đĩa.

Cao chiết ethanol 70% được hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 200

mg/ml. Sau đó pha loãng cao theo dãy nồng độ 150 – 100 – 50 mg/ml vào mỗi bình

thủy tinh đã được khử trùng. Hút vào mỗi giếng 100 µl dịch cao. Mỗi nồng độ lặp

lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị. Dán nhãn lên đĩa với các nồng độ tương

ứng. Các công đoạn trên đều thực hiện trong điều kiện vô trùng với ngọn lửa đèn

cồn. Các đĩa petri được để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng

khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở tủ ấm 37oC trong thời gian

18 – 24 giờ và đọc kết quả.

Chỉ số MIC được xác định ở nồng độ dịch chiết thấp nhất mà tại đó đường

kình vòng kháng khuẩn bắt đầu xuất hiện.

2.5.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của TcEE.

60

2.5.4.1. Quy trình thí nghiệm

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Cao chiết

Hòa tan trong dung dịch DMSO 1% Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10%

Lọc Lọc

Dịch trong Dịch trong

Phân tích thành phần hóa học

Phân tích thành phần hóa học

Flavonoid

Saponin

Cardiac glycoside

Phenolic Steroid

Carbohydrate

Alkaloid

Tannin Amino acid Athraquinone glycoside

Hình 2.6. Quy trình định tính một số thành phần hóa học của cao chiết ethanol 70%

từ lá bàng.

2.5.4.2. Thuyết minh quy trình

Chuẩn bị mẫu:

Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao chiết được hòa tan trong dung dịch H2SO4 10%

trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần

61

dịch trong để tiến hành các thử nghiệm.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được hòa tan trong dung dịch DMSO 1% cho

đến khi hòa tan hoàn toàn. Sau đó, thu phần dịch cao qua giấy lọc và thu dịch trong

để tiến hành các thử nghiệm.

Tiến hành thí nghiệm định tính thành phần hóa học các chất sau:

carbohydrate, saponin, alkaloid, cardiac glycoside, anthraquinone glycoside,

flavonoid, phenolic, tannin, steroid, amino acid,…

2.5.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết đến vi khuẩn V.

alginolyticus theo thời gian.

62

2.5.5.1. Quy trình thí nghiệm

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Cao chiết

Vi sinh vật chỉ thị DMSO 1%

Dịch cao chiết 10 mg/ml

Tăng sinh trong môi trường TSB

Cao ở các nồng độ (mg/ml)

Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ)

0,6 0,4 ĐC 0,1 0,2 0,8

Đo OD600nm

Hút 100 µl dịch vi khuẩn

Erlen chứa 100 ml TSB Pha loãng về 106 cfu/ml

Thu mẫu tại mỗi thời điểm 0 – 3 – 6 – 12 – 24 – 36 giờ

Đánh giá tế bào sống

Đánh giá kết quả

Hình 2.7. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của cao chiết đến vi khuẩn V. alginolyticus theo

thời gian.

2.5.5.2. Thuyết minh quy trình

Chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường

TSB có bổ sung thêm 1,5% NaCl, để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 – 24 giờ ở

nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc được đo OD ở bước sóng 600

nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nước muối sinh lí vô trùng

để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml.

Cao chiết ethanol 70% được hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 10

63

mg/ml. Sau đó hút bỏ 100 µl môi trường TSB và hút 100 µl vi khuẩn đã pha loãng

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

mật độ 106 cfu/ml. Sau đó hút cao theo dãy nồng độ 0,1 – 0,2 – 0,4 – 0,6 – 0,8

mg/ml tương ứng vào mỗi erlen đã được khử trùng với thể tích 100 – 200 – 400 –

600 – 800 µl, riêng erlen đối chứng bổ sung cao. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Tiến

hành thu mẫu tại từng thời điểm khảo sát lần lược là 0h, 3h, 6h, 12h, 24h, 36 giờ.

Tại mỗi thời điểm lấy mẫu đem đi đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định

mật độ tế bào và pha loang thành dãy nồng độ mong muốn. Hút 100 µl từng nồng

độ vào đĩa petri mỗi nồng độ lặp lại 2 lần đổ môi trường TSA và ủ ở 37oC trong thời

64

gian 24 giờ và đếm số lượng khuẩn lạc.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi TcEE

Hiệu quả tách chiết cao của dung môi phụ thuộc vào độ phân cực và khả

năng khuếch tán của dung môi vào sâu bên trong lớp nguyên liệu (Trần Thị Ngọc

Thanh, 2012). Do đó, việc lựa chọn dung môi thích hợp nhằm thu được lượng cao

lớn đồng thời có hoạt thính sinh học của cao là điều hết sức cần thiết trong thí

nghiệm này. Mẫu lá bàng sau khi được xử lý, tiến hành tách chiết cao với dung môi

EtOH 70%. Hàm lượng cao chiết thu hồi trung bình các lần chiết cao là 23,87%

Từ kết quả, thấy rằng dung môi EtOH 70% là dung môi tách chiết cho hàm

lượng thu hồi cao tốt đối với lá bàng. Kết quả này cho thấy có thể sử dụng ethanol

để tách chiết cao từ lá bàng tuy nhiên cần tiến hành thêm các thí nghiệm khác để

khẳng định.

Việc sử dụng dung môi tách chiết là dung môi phân cực là do dung môi phân

cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất có trong thực vật như các glycoside, các muối

của alkaloid, saponin hay các hợp chất polyphenol (flavonoid, tannin,…). Ngoài ra,

khả năng bốc hơi trong quá trình cô mẫu cũng nhanh hơn so với các dung môi

không phân cực. Sử dụng dung môi phân cực trong quá trình tách chiết an toàn hơn

so với các dung môi không phân cực (Ngô Văn Thu, 2011).

3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE đối với chủng vi khuẩn

chỉ thị.

Với mục tiêu nghiên cứu là đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

ethanol từ lá bàng đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị, kết quả khảo sát hoạt tính

65

kháng khuẩn được thể hiện như sau:

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE đối nhóm vi khuẩn

Escherichia coli

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm E.

35

)

a

30

m m

25

NĐ 50 mg/ml

20

a

NĐ 100 mg/ml

a

a

b

a

( ế h c c ứ g n ò v

b

b

ab

15

b

b

NĐ 150 mg/ml

b

b

b

b

b

b

NĐ 200 mg/ml

h n í k

10

Ciprofloxacin (500µg/ml)

5

g n ờ ư Đ

0

Vi khuẩn chỉ thị

E.coli

ETEC

E.coli 0208

E. 0157:H7

coli được trình bày ở hình 3.1.

Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli

Kết quả hình 3.1 cho thấy TcEE có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với 4 chủng

E. coli khảo sát (đường kính vòng ức chế từ 11 – 16 mm) và ức chế 4/4 chủng ở ¾

các nồng độ khảo sát. Ở nồng độ 50 mg/ml, TcEE chỉ ức chế được chủng E. coli và

không thể hiện hoạt tính ức chế đối với 3 chủng còn lại, điều này có nghĩa là nồng

độ 50 mg/ml khá thấp không đủ hoạt lực để ức chế các chủng E. coli khảo sát.

Trong khi đó, TcEE ở nồng độ 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml ức chế 4/4 chủng

khảo sát với hoạt tính ức chế tăng dần. Điều này có ý nghĩa là nồng độ TcEE càng

cao thì hoạt tính ức chế càng mạnh.

So với hoạt tính kháng khuẩn của ciprofloxacin (500 µg/ml), hoạt tính ức chế E.

coli của TcEE ở nồng độ 200 mg/ml cao hơn ciprofloxacin một cách có ý nghĩa

thống kê (p < 0,05). Còn đối với các chủng còn lại thì hoạt tính của TcEE ở các

66

nồng độ khảo sát tương đương hoặc thấp hơn (đối với ETEC).

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

So với kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng tách chiết bằng ethanol

ở các nồng độ 100 – 150 – 200 mg/ml của Greger H (2000) đối với vi khuẩn E. coli

cho thấy rằng cao chiết ethanol từ lá bàng có khả năng ức chế mạnh đối với 2 chủng

vi khuẩn E. coli, E. coli0208 (đường kính vòng ức chế từ 10 – 21 mm). Và cũng

theo nghiên cứu của Chitmanat (2005) thì TcEE ức chế mạnh 2 chủng ETEC,

E.0157:H7 (đường kính vòng ức chế 13 -17 mm).

3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn

Listeria spp.

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm

20

)

a

a

18

m m

16

b

14

ab

b

12

b

b

NĐ 50 mg/ml

b

10

NĐ 100 mg/ml

( ế h c c ứ g n ò v

NĐ 150 mg/ml

8

NĐ 200 mg/ml

6

h n í k

Ciprofloxacin (500µg/ml)

4

2

g n ờ ư Đ

0

Vi khuẩn chỉ thị

L. innocua.

L. monocytogenes

Listeria spp. được trình bày ở hình 3.2.

Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Listeria spp.

Kết quả hình 3.2 cho thấy TcEE có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với 2 chủng

Listeria spp. khảo sát (đường kính vòng ức chế từ 10 – 16 mm) và ức chế cả 2

chủng ở ¾ các nồng độ khảo sát. Ở nồng độ 50 mg/ml, TcEE không thể hiện hoạt

tính ức chế được đối với 2 chủng Listeria spp. điều này có ý nghĩa là nồng độ 50

mg/ml khá thấp không đủ hoạt lực để ức chế các chủng Listeria spp. khảo sát.

67

Trong khi đó, các nồng độ 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml ức chế cả 2 chủng

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

khảo sát với đường kính vòng ức chế từ 10 đến 16 mm. Điều này có ý nghĩa là nồng

độ TcEE càng cao thì hoạt tính ức chế càng mạnh.

So với hoạt tính kháng khuẩn của ciprofloxacin (500 µg/ml), hoạt tính ức chế

Listeria spp. của TcEE ở nồng độ 200 mg/ml thấp hơn ciprofloxacin một cách có ý

nghĩa thống kê (p < 0,05).

So với kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng tách chiết bằng

ethanol ở các nồng độ 100 – 200 mg/ml của Tongdonmuan (2010) đối với vi khuẩn

Listeria sp. cho thấy rằng cao chiết ethanol từ lá bàng có khả năng ức chế mạnh đối

với 2 chủng vi khuẩn L. innocua, L. monocytogenes (đường kính vòng ức chế từ 11

– 15 mm).

3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn

Samonella spp

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm

20

)

a

18

a

a

m m

ab

16

a

ab

a

a

ab

b

b

ab

14

ab

a

ab

b

12

NĐ 50 mg/ml

b

c

10

NĐ 100 mg/ml

( ế h c c ứ g n ò v

NĐ 150 mg/ml

8

NĐ 200 mg/ml

h n í k

6

Ciprofloxacin (500µg/ml)

4

2

g n ờ ư Đ

0

Vi khuẩn chỉ thị

S. dublin.

S. enteritidis

S. typhii

S. typhimurium

Samonella spp. được trình bày ở hình 3.3.

Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Samonella spp.

Kết quả hình 3.3 cho thấy ở nồng độ 50 mg/ml, TcEE chỉ ức chế được 2 chủng

68

S. enteritidis và S. dublin và không thể hiện hoạt tính ức chế đối với 2 chủng còn

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

lại, điều này có ý nghĩa là nồng độ 50 mg/ml khá thấp không đủ hoạt lực để ức chế

các chủng Samonella spp. khảo sát. Trong khi đó, các nồng độ 100 mg/ml, 150

mg/ml, 200 mg/ml ức chế 4/4 chủng khảo sát với hoạt tính ức chế tăng dần. Điều

này có ý nghĩa là nồng độ TcEE càng cao thì hoạt tính ức chế càng mạnh. TcEE có

hoạt tính kháng khuẩn cao đối với 4 chủng Samonella spp. khảo sát (đường kính

vòng ức chế từ 10 – 16 mm) và ức chế 4/4 chủng ở ¾ các nồng độ khảo sát.

So với hoạt tính kháng khuẩn của ciprofloxacin (500 µg/ml), hoạt tính ức chế

Samonella spp. của TcEE ở nồng độ 150 - 200 mg/ml cao hơn ciprofloxacin một

cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

So với kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng tách chiết bằng ethanol

ở các nồng độ 50 - 100 – 150 – 200 mg/ml của Khanom (2010) đối với vi khuẩn

Samonella spp. cho thấy rằng cao chiết ethanol từ lá bàng có khả năng ức chế mạnh

đối với 2 chủng vi khuẩn S.interitids và S. dublin ( đường kính vòng ức chế từ 15 –

19 mm). Và cũng theo nghiên cứu của W. Nunsong (2010) thì TcEE ức chế mạnh 2

chủng S. typhii, S. typhimurium (đường kính vòng ức chế 15 -17 mm) ở nồng độ

100 mg/ml – 150 mg/ml – 200 mg/ml.

3.2.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn

Shigella spp

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm

69

Shigella spp. được trình bày ở hình 3.4.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

40

)

a

35

m m

30

25

NĐ 50 mg/ml

20

NĐ 100 mg/ml

( ế h c c ứ g n ò v

b

a

a

a

NĐ 150 mg/ml

a

a

b

15

a

b

b

NĐ 200 mg/ml

b

h n í k

10

Ciprofloxacin (500µg/ml)

5

g n ờ ư Đ

0

Vi khuẩn chỉ thị

S. boydii

S. flexneri

S. sonnei

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Shigella spp.

Kết quả hình 3.4 cho thấy TcEE có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với 3 chủng

Shigella spp. khảo sát (đường kính vòng ức chế từ 10 – 15 mm) và ức chế 3/3 chủng

ở ¾ các nồng độ khảo sát. Ở nồng độ 50 mg/ml, TcEE chỉ ức chế được chủng S.

sonnei và không thể hiện hoạt tính ức chế đối với 2 chủng còn lại, điều này có ý

nghĩa là nồng độ 50 mg/ml khá thấp không đủ hoạt lực để ức chế các chủng

Shigella spp. khảo sát. Trong khi đó, các nồng độ 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200

mg/ml ức chế 3/3 chủng khảo sát với hoạt tính ức chế tăng dần. Điều này có ý nghĩa

là nồng độ TcEE càng cao thì hoạt tính ức chế càng mạnh.

So với hoạt tính kháng khuẩn của ciprofloxacin (500 µg/ml), hoạt tính ức chế S.

flexneri của TcEE ở nồng độ 200 mg/ml cao hơn ciprofloxacin một cách có ý nghĩa

thống kê (p < 0,05). Còn đối với chủng S. sonnei thì hoạt tính của TcEE ở các nồng

độ khảo sát thấp hơn. Riêng chủng S. boydii thì ciprofloxacin không ức chế nhưng

TcEE thì ức chế mạnh được thể hiện qua đường kính vòng ức chế từ 11 – 15 mm.

So với kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng tách chiết bằng ethanol

ở các nồng độ 50 - 100 – 150 – 200 mg/ml của P. Pachontis (2000) đối với vi khuẩn

Shigella spp. cho thấy rằng cao chiết ethanol từ lá bàng có khả năng ức chế mạnh

70

đối với 2 chủng vi khuẩn S. sonnei (đường kính vòng ức chế từ 15 – 19 mm). Và

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

cũng theo nghiên cứu của W. Nunsong (2010) thì TcEE ức chế mạnh 2 chủng S.

boydii, S. flexneri (đường kính vòng ức chế 10 -15 mm) ở nồng độ 100 mg/ml – 150

mg/ml – 200 mg/ml.

3.2.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn

Virio spp.

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ các dung môi khác

20

bc

a

a

)

18

ab

a

a

a

ab

b

b

m m

bc

16

abc

c

14

a

bc

b

12

a

NĐ 50 mg/ml

d

c

10

NĐ 100 mg/ml

( ế h c c ứ g n ò v

NĐ 150 mg/ml

8

NĐ 200 mg/ml

h n í k

6

Ciprofloxacin (8µg/ml)

4

2

g n ờ ư Đ

0

Vi khuẩn chỉ thị

V. alginolyticus

V. cholerae

V. harveyi

V. parahaemolyticus

nhau đối với nhóm Vibrio spp. được trình bày ở hình 3.5

Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn Virio spp.

Kết quả hình 3.5 cho thấy TcEE có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với 2 chủng

Virio spp. khảo sát (đường kính vòng ức chế từ 9,5 – 17 mm) và ức chế 4/4 chủng ở

¾ các nồng độ khảo sát. Ở nồng độ 50 mg/ml, TcEE không thể hiện hoạt tính ức

chế được đối với chủng V.parahaemolyticus và thể hiện hoạt tính ức chế đối với 3

chủng còn lại, điều này có ý nghĩa là nồng độ 50 mg/ml đủ hoạt lực để ức chế các

chủng Virio spp. khảo sát. Trong khi đó, các nồng độ 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200

mg/ml ức chế 4/4 chủng khảo sát với hoạt tính ức chế tăng dần. Điều này có ý nghĩa

71

là nồng độ TcEE càng cao thì hoạt tính ức chế càng mạnh.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

So với hoạt tính kháng khuẩn của ciprofloxacin (8 µg/ml), hoạt tính ức chế Virio

spp. của TcEE ở nồng độ 200 mg/ml cao hơn ciprofloxacin một cách có ý nghĩa

thống kê (p < 0,05). Còn đối với các chủng còn lại thì hoạt tính của TcEE ở các

nồng độ khảo sát tương đương hoặc thấp hơn (đối với V. harveyi).

So với kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng tách chiết bằng ethanol

ở các nồng độ 50 - 100 – 150 – 200 mg/ml của Bonanome (2009) đối với vi khuẩn

Virio spp. cho thấy rằng cao chiết ethanol từ lá bàng có khả năng ức chế mạnh đối

với 3 chủng vi khuẩn V. alginolyticus, V. harveyi, V. cholerae (đường kính vòng ức

chế từ 13– 19 mm). Và cũng theo nghiên cứu của Andrianjafy N. (2005) thì TcEE

ức chế mạnh đối với chủng V. parahaemolyticus (đường kính vòng ức chế 13 -17

mm) ở nồng độ 100 mg/ml – 150 mg/ml – 200 mg/ml.

3.2.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn gây

bệnh cơ hội trên da

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết từ các dung môi

20

)

a

18

a

m m

a

16

a

14

b

b

b

b

b

b

b

b

b

12

NĐ 50 mg/ml

10

NĐ 100 mg/ml

( ế h c c ứ g n ò v

NĐ 150 mg/ml

8

NĐ 200 mg/ml

6

h n í k

Ciprofloxacin (500µg/ml)

4

2

g n ờ ư Đ

0

Vi khuẩn chỉ thị

P. aeruginosa

S. aureus

E. feacalis

khác nhau đối với một số vi khuẩn khác được trình bày ở hình 3.6

Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội

72

trên da.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả hình 3.6 cho thấy TcEE có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với 3 chủng

gây bệnh cơ hội trên da khảo sát (đường kính vòng ức chế từ 11 – 17 mm) và ức chế

3/3 chủng ở ¾ các nồng độ khảo sát. Ở nồng độ 50 mg/ml, TcEE chỉ ức chế được

chủng E. feacalis và không thể hiện hoạt tính ức chế đối với 2 chủng còn lại, điều

này có ý nghĩa là nồng độ 50 mg/ml khá thấp không đủ hoạt lực để ức chế các

chủng vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da khảo sát. Trong khi đó, các nồng độ 100

mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml ức chế 3/3 chủng khảo sát với hoạt tính ức chế tăng

dần. Điều này có ý nghĩa là nồng độ TcEE càng cao thì hoạt tính ức chế càng mạnh.

So với hoạt tính kháng khuẩn của ciprofloxacin (500 µg/ml), hoạt tính ức chế vi

khuẩn gây bệnh cơ hội trên da của TcEE ở nồng độ 200 mg/ml cao hơn

ciprofloxacin một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

So với kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng tách chiết bằng ethanol

ở các nồng độ 50 - 100 – 150 – 200 mg/ml của Boulamatsis, A (2009) đối với vi

khuẩn gây bệnh cơ hội trên da cho thấy rằng cao chiết ethanol từ lá bàng có khả

năng ức chế mạnh đối với chủng vi khuẩn E. feacalis (đường kính vòng ức chế từ

13– 18 mm). Và cũng theo nghiên cứu của Jersek B. (2009), thì TcEE ức chế mạnh

đối với chủng S. aureus, P. aeruginosa (đường kính vòng ức chế 15 -18 mm) ở

nồng độ 100 mg/ml – 150 mg/ml – 200 mg/ml.

3.2.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn và kết quả xác định nồng độ ức

chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với 20 vi khuẩn chỉ thị.

Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng ở nồng

độ 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml trên 20 nhóm vi khuẩn gây bệnh,

73

kết quả tổng hợp đo đường kính vòng ức chế được trình bày ở bảng 4.1

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% đối với 20 vi khuẩn chỉ thị

Nồng độ 50 mg/ml

Nồng độ 100 mg/ml

Nồng độ 150 mg/ml

Nồng độ 200 mg/ml

Ciprofloxacin (*)

E. Coli

11,00 ± 0,00b

16,00 ± 1,00a

13,20 ± 0,29b

11,50 ± 1,80b

13,30 ± 0,58b

ETEC

NA

14,70 ± 0,58b

31,00 ± 0,50a

12,40 ± 1,35b

12,70 ± 1,53b

E. Coli0208

NA

15,00 ± 1,00a

13,20 ± 0,29ab

11,20 ± 1,37b

14,00 ± 1,00a

E.0157:H7

NA

15,00 ± 1,00a

12,30 ± 0,29b

11,50 ± 1,32b

13,00 ± 1,00b

L. innocua.

NA

16,00 ± 1,73a

12,00 ± 0,50b

11,30 ± 2,99b

10,70 ± 0,58b

L. monocytogenes

NA

16,00 ± 1,00a

12,20 ± 0,29ab

10,60 ± 0,51b

10,70 ± 0,58b

S. dublin.

10,30 ± 0,58b

17,30 ± 0,58a

12,20 ± 0,76ab

12,60 ± 1,25ab

14,70 ± 1,53ab

S. enteritidis

9,00 ± 0,00c

12,70 ± 0,58ab

13,00 ± 0,50ab

12,10 ± 1,40b

14,30 ± 0,58a

S. typhii

NA

14,70 ± 0,58a

12,50 ± 0,50a

12,80 ± 1,57a

13,00 ± 2,65a

S. typhimurium

NA

16,70 ± 0,58a

11,00 ± 0,00b

10,90 ± 2,48b

14,00 ± 1,00ab

S. boydii

NA

14,30 ± 0,58a

NA

13,60 ± 0,51a

12,70 ± 0,58a

S. flexneri

NA

14,70 ± 1,53a

13,20 ± 0,29a

10,10 ± 1,01b

14,30 ± 1,15a

S. sonnei

11,00 ± 1,00b

15,00 ± 1,00b

33,70 ± 1,61a

11,20 ± 1,37b

13,00 ± 0,00b

V. alginolyticus

10,00 ± 1,00c

16,70 ± 0,58a

16,70 ± 0,29a

12,10 ± 3,15bc

15,00 ± 1,00ab

V. cholerae

9,50 ± 0,50c

16,00 ± 1,00a

13,30 ± 0,58abc

10,90 ± 0,85bc

13,70 ± 3,21ab

V. harveyi

7,00 ± 0,50d

15,70 ± 0,58b

18,00 ± 0,50a

14,70 ± 3,72bc

13,00 ± 0,00ab

V. parahaemolyticus

NA

17,00 ± 1,00a

11,30 ± 0,29b

10,70 ± 5,04b

11,00 ± 1,00a

P. aeruginosa

NA

15,00 ± 1,00a

12,20 ± 0,58b

12,60 ± 0,66b

14,30 ± 1,15a

S. aureus

NA

17,00 ± 2,00a

12,20 ± 0,29b

12,50 ± 1,32b

12,70 ± 1,53b

E. feacalis

11,00 ± 2,00b

16,00 ± 0,00a

12,00 ± 0,50b

11,90 ± 2,06b

11,3 ± 0,58b

(*) Nồng độ Ciprofloxacin tương ứng với nhóm Vibrio spp. là 8µg/ml và đối với các chủng vi sinh vật chỉ thị còn lại là 500µg/ml. NA: Non activity

74

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào bảng 3.1 có thể kết luận rằng cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol

70% ở nồng độ 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml có phổ hoạt động và hoạt tính

kháng khuẩn cao trên 6 nhóm vi khuẩn gây bệnh với đường kính vòng ức chế từ 8,5

mm đến 13,5 mm.

Tất cả kết quả nhận được trong những thí nghiệm cho thấy rằng: cao chiết lá

bàng EtOH 70% có khả năng ức chế 20/20 chủng vi khuẩn gây bệnh khảo sát với

đường kính vòng kháng từ 9,83 – 12,83 mm. Đồng thời, cao chiết này thể hiện hoạt

tính tốt nhất ở tất cả các nhóm vi khuẩn Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella

spp., Shigella spp, Vibrio spp. và nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. Riêng

nhóm Listeria spp. và nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da, khi so sánh với đối

chứng kháng sinh, cao chiết từ EtOH 70% ở nồng độ 100 mg/ml có hoạt tính tương

đương với Ciprofloxacin (500 µg/ml), riêng chủng Vibrio spp. đối chứng là

Ciprofloxacin (8 µg/ml) một cách có ý nghĩa về mặt thống kê (p< 0,05).

Theo kết quả nghiên cứu của Nashahira và ctv (2010), tác giả đã khảo sát hoạt

tính kháng khuẩn cao chiết lá của Terminalia catappa với dung môi EtOh 70% ở

nồng độ 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml trên một số chủng vi khuẩn

khảo sát tương tự trong phòng thí nghiệm. Kết quả đường kính vòng ức chế đối với

các chủng E.dublin, S.typhimurium, V.parahaemolyticus, V.alginocyticus, S.aureus

rất cao. Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH 70% của 3

loài thực vật thuộc chi Terminalia với nồng độ cao chiết 50 mg/ml trên chủng:

S.sonnei, E. feacalis, V.alginolyticus, V.cholerae và V.harveyi thì chúng đều có khả

năng ức chế đối với các chủng vi khuẩn này (Taharina và ct, 2006).

Theo đó, dựa vào nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Ngọc Lan (2011) khi khảo

sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng bằng dung môi EtOH 70% (nồng độ

100 mg/ml) trên cùng 20 chủng vi khuẩn khảo sát cho kết quả kháng 20/20 vi khuẩn

với đường kính vòng kháng từ 13 mm – 15mm. Trong thí nghiệm này, cao chiết

EtOH 70% từ lá bàng ở cùng nồng độ 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200

mg/ml cũng thể hiện khả năng ức chế 20/20 vi khuẩn gây bệnh khảo sát với đường

75

kính cao hơn 9 mm – 18 mm.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Từ những cơ sở thực nghiệm trên, tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh và xác định sự hiện diện của một số thành

phần hóa học của cao chiết lá bàng từ EtOH 70%.

Dựa vào kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ

dung môi ethanol 70%, tiến hành thí nghiệm khảo sát xác định nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết lá bàng từ EtOH

70% ở các nồng độ 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml. Kết quả xác định

nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 20 chủng vi khuẩn gây bệnh được trình bày ở

bảng 3.1

Dựa vào bảng 3.1 có thể nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

cao chiết lá bàng EtOH 70% đối với 20 chủng vi khuẩn gây bệnh biến động từ 50

mg/ml đến 100 mg/ml. Giá trị chỉ số MIC của cao chiết EtOH 70% đối với hầu hết

các nhóm vi khuẩn là 100 mg/ml ngoại trừ chủng E.coli, S.enteritidis, S.dublin,

E.feacalis, S.sonnei của nhóm vi khuẩn Shigella spp., chủng V.alginolyticus,

V.cholerae và V.harveyi của nhóm Vibrio spp. có giá trị MIC là 50 mg/ml.

Ở nồng độ , cao chiết EtOH 70% có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn

gây bệnh tiêu chảy (Escherichia coli), nhóm vi khuẩn đường ruột (Salmonella spp.),

nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da, 2 chủng V.cholerae và V.harveyi củ nhóm

vi khuẩn gây bệnh tả (Vibrio spp.), 2 chủng S.boydii và S.sonnei của nhóm vi khuẩn

gây viêm dạ dày, ruột và bệnh lỵ (Shigella spp.), nhóm Listeria spp., đặc biệt là

chủng L.monocytogenes gây bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm dạ dày

ruột, đồng thời cũng là nguyên nhân gây ra trẻ chết sải sinh, đẻ non và sẩy thai ở

phụ nữ. Đối với chủng S.flexneri của nhóm vi khuẩn Shigella spp., 3 chủng

V.alginolyticus và V.cholerae và V.harveyi của nhóm Vibrio spp. thì giá trị MIC của

cao chiết EtOH 70% tối thiểu là 50 mg/ml sẽ ức chế sự phát triển của các loại vi

khuẩn này, giá trị này cao gấp 2 lần so với 17 chủng còn lại.

S.boydii là chủng vi khuẩn gây bệnh lỵ khá nguy hiểm ở người, chủng vi

khuẩn này không nhạy cảm với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 500 µg/ml

76

nhưng chúng lại bị ức chế bởi cao chiết EtOH 70% với nồng độ tối thiểu là 100

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

mg/ml. Điều này cho thấy chủng S.boydii khá nhạy cảm với cao chiết lá bàng EtOH

70%.

So với nghiên cứu chỉ số MIC của cây Rosmarinus officinalis L. đối với

chủng L.monocytogenes của Rozman (2009) là 2,500 µg/ml, trong khi đó ở cao

chiết EtOH 70% từ lá bàng trên chủng L.monocytogenes thì có giá trị MIC là 100

mg/ml. Ngoài ra, trong nghiên cứu của Salem (2014) về giá trị MIC của cao chiết

EtOH 70% từ cây Sycomorus đối với chủng Shi.flexneri là 30 mg/ml, xét cao chiết

EtOH 70% của lá bàng có giá trị MIC trên chủng Shi.flexneri là 100 mg/ml. Nghiên

cứu của Mon (2011) về giá trị MIC của cây A.japonica trên chủng V.cholerae là 5

mg/ml, và cũng với chủng vi khuẩn này ở cao chiết EtOH 70% của lá bàng giá trị

MIC là 50 mg/ml.

Từ các kết quả trên có thể thấy chỉ số MIC của cao chiết EtOH 70% từ lá

bàng cao hơn so với các nghiên cứu khác trên cùng một chủng vi khuẩn chỉ thị khảo

sát. Nguyên nhân có thể do sử dụng phương pháp khác nhau và nhiều yếu tố khách

quan khác ảnh hưởng nên dẩn đến giá trị MIC của các cây khác nhau trên cùng 1

chủng thì khác nhau.

3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của TcEE

Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học của TcEE

Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả

Carbohydrat + Molisch

+ Fehling

+ Barfoed

Saponin + Foam

Alkaloid - Mayer

77

- Dragendorff

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Hager -

Wagner -

Cardiac glycoside Legal +

Keller killiani +

Anthraquinone glycoside Bontrager +

Flavonoid Alkaline +

Shinoda +

Ferric chloride +

Phenolic compound Lead acetate +

Gelatin +

Tannin Ferric chloride +

Lead acetate +

Salkowski Steroid -

Libermann Burchard -

Amino acid Ninhydrin -

Chú thích: (+): dương tính; (-): âm tính

Dựa vào kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết lá bàng từ EtOH

70% được trình bày ở bảng 3.2 nhận thấy rằng trong dung môi EtOH 70% có khả

năng tách chiết được rất nhiều hợp chất từ lá bàng bao gồm các hợp chất thông

thường và cả những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thông thường

được tìm thấy trong cao chiết EtOH 70% của lá bàng thấy có sự hiện diện của hầu

hết các nhóm cacbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều dương

tính) nhưng không thấy sự hiện diện của amino acid. Trong cao chiết lá bàng EtOH

78

70% có sự hiện diện của nhiều nhóm các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

các loại hợp chất trong saponin, cardiac glycoside, flavonoid, nhóm các hợp chất

phenol, tannin.

Trong công trình nghiên cứu của Phạm Văn Ngọt và ctv (2015), lá và vỏ của

loài Đước xanh (Rhizophora mucronata) và Bần trắng (Sonneratia alba) được li

trích trong nước và ức chế sự sinh trưởng của P.aeruginosa có chứa các hợp chất

tannin và phenol và một số hợp chất khác chưa được nhận diện là tác nhân ức chế

sinh trưởng của vi khuẩn P.aeruginosa.

Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết lá bàng nói

riêng là do chúng có các thành phần flavonoid, hợp chất phenol, tannin quyết định.

Trong khi đó, trên hợp chất phenolic thấy sự tồn tại của các dẫn chất như catechol,

epicatechin, cinnamic acid, hypericin warfarin hay trong hợp chất của flavonoid có

dẫn chất flavone và flavonols, ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất

ellagitannin, ở hợp chất terpennoids, tinh dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các

dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp

với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein, các chức năng trên

giúp tiêu diệt vi sinh vật. Từ những kết quả định tính trên có thể kết luận rằng cao

chiết lá bàng từ EtOH 70% có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh do có sự hiện

diện của các hợp chất flavonoid, phenol, tannin.

3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của TcEE đến vi khuẩn V. alginolyticus

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của TcEE đối với vi khuẩn V. alginolyticus được thể

79

hiện qua hình 3.5. và 3.6.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Mật độ tế bào

6

5,8

5,6

5,4

NĐ 0,1 mg/ml

o à b

5,2

NĐ0,2 mg/ml

ế t ộ đ

NĐ0,4mg/ml

5

t ậ

M

NĐ0,6 mg/ml

4,8

NĐ0,8 mg/ml

4,6

Đối chứng

4,4

4,2

0h

3h

6h

12h

24h

36h

Thời gian khảo sát

OD600nm

1,8

1,6

1,4

NĐ 0,1 mg/ml

1,2

NĐ0,2 mg/ml

D O

1

NĐ0,4mg/ml

0,8

í

NĐ0,6 mg/ml

ị r t a G

0,6

NĐ0,8 mg/ml

0,4

Đối chứng

0,2

0

0h

3h

6h

12h

24h

36h

Thời gian khảo sát

Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào

Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện giá trị OD600nm

Thí nghiệm được tiến hành đối với vi khuẩn V. alginolyticus nuôi cấy ở mật độ

106 CFU/ml. TcEE được thử nghiệm ở 5 nồng độ: 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml,

0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml và được khảo sát tại các thời điểm như sau: 0h – 3h – 6h –

80

12h – 24h – 36h. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy ở các nồng độ khác nhau thì khả

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

năng kháng khuẩn của TcEE cũng tăng dần theo nồng độ cao. Và cũng theo thời

gian thì hoạt tính kháng khuẩn của TcEE cũng tăng dần.

Tại thời điểm 0 giờ mật độ vi khuẩn đều giống nhau là 7,03x104 cfu/ml. Ở thời

điểm 3 giờ, mật độ vi khuẩn bắt đầu tăng lên nhưng do sự ức chế của TcEE nên số

lượng tăng lên của vi khuẩn cũng giảm dần theo nồng độ của TcEE thời gian càng

dài thì hoạt tính kháng khuẩn của TcEE càng tốt ở khoảng thời gian khảo sát 6 giờ,

12 giờ , 24 giờ, 36 giờ.

Ở các nồng độ tại các thời điểm thì mật độ vi khuẩn thấp hơn so với mật độ vi

khuẩn của mẫu đối chứng. Mật độ thấp hơn là do hoạt tính sinh học của TcEE ức

chế vi khuẩn phát triển. Dựa vào hình 3.7. và hình 3.8. ta có thể thấy ở nồng độ 0,8

mg/ml thì khả năng kháng V. alginolyticus là tốt nhất ở thời điểm 36 giờ.

Theo kết quả nghiên cứu của Saxena Jyoti và ctv (2012), tác giả đã khảo sát ảnh

hưởng của TcEE theo thời gian với chủng chỉ thị là V. alginolyticus ở các nồng độ

tương tự như trong thí nghiệm. Kết quả là ở nồng độ 0,6 – 0,8 mg/ml thì hoạt tính

kháng khuẩn mạnh dần theo thời gian và ức chế sự phát triển của vi khuẩn là tốt

nhất.

Theo đó, dựa vào kết quả nghiên cứu của Colceriu Svetlana và ctv (2011) khi

khảo sát ảnh hưởng của TcEE đến nhóm vi khuẩn Vibrio spp. theo thời gian cũng

cùng nồng độ đang khảo sát thì cũng cho kết quả là hoạt tính ức chế vi khuẩn V.

alginolyticus ở nồng độ 0,8 mg/ml là tốt nhất. Qua kết quả phân tích trên chúng tôi

có thể kết luận rằng TcEE có hoạt tính ức chế sự phát triển của vi khuẩn V.

alginolyticus rất tốt.

Tóm lại, với các kết quả khảo sát ban đầu về hoạt tính sinh học của lá bàng,

nhận thấy rằng đây là một loại thảo dược có hoạt tính sinh học tương đối cao. Dung

môi EtOH 70% cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh, thể hiện qua khả năng ức chế tốt

nhất ở cả 6/6 nhóm vi khuẩn gây bệnh khảo sát đặc biệt là đối với các nhóm vi

khuẩn gây bệnh đường ruột E.coli, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp. Đồng

thời chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% từ lá bàng đối với các nhóm vi khuẩn

81

gây bệnh cũng tương đối thấp càng chứng minh được hiệu quả kháng khuẩn mạnh

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

của chúng. Trong cao chiết ethanol 70% từ lá bàng có sự hiện diện của rất nhiều

hợp chất có hoạt tính sinh học: hợp chất phenol, tannin, flavonoid, saponin,

glycoside; những hợp chất này tạo nên hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng. Do đó, lá

bàng cần phải được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học nói chung và

khả năng trị bệnh tiêu chảy nói riêng nhằm tìm ra phương thuốc mới, hiệu quả nhằm

82

thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

2.3. Kết luận

- Dung môi ethanol 70% là dung môi tách chiết cho hiệu suất thu hồi cao tốt

đối với lá bàng..

- Cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% có khả năng kháng khuẩn tốt

đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị.

- Ở nồng độ 50mg/ml TcEE ức chế được 8 chủng vi khuẩn E.coli, S.dublin,

S.enteritidis, S.sonnei, V.alginolyticus, V.cholerae, V.harveyi, E.feacalis.

- Ở nồng độ 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml TcEE ức chế cả 20 chủng vi

khuẩn chỉ thị

- Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với vi khuẩn E.coli, S.dublin,

S.enteritidis, S.sonnei, V.alginolyticus, V.cholerae, V.harveyi, E.feacalis là 50

mg/ml còn 12 chủng vi khuẩn còn lại là 100 mg/ml.

- Trong cao chiết ethanol 70% từ lá bàng có sự hiện diện của rất nhiều hợp

chất có hoạt tính sinh học: hợp chất phenol, tannin, flavonoid, saponin, triterpenoid,

glycoside; những hợp chất này tạo nên hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng.

- TcEE có khả năng ức chế tốt sự phát triển của chủng vi khuẩn

V.alginolyticus theo thời gian.

2.4. Đề nghị

- Qua các kết luận trên có thể nhận thấy rằng lá bàng cần phải được tiếp tục

nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học nói chung và khả năng trị bệnh tiêu chảy

nói riêng nhằm tìm ra phương thuốc mới, hiệu quả nhằm thay thế thuốc kháng sinh

trong điều trị bệnh.

- Cần tiến hành thử nghiệm độc tính của TcEE trên Artermia.

- Xác định chỉ số nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ethanol 70% ở các

nồng độ chia nhỏ.

83

- Xác định cấu trúc, định danh sơ bộ cây bàng.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp (2007), Thực tập vi sinh vật học, Nhà

xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội.

2. Nguyễn Thị Hằng và ctv (2015). Hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của

loài tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe Pentandra (L) MIQ).

3. Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2012). Phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực

vật, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Hà Nội.

4. TS.Đặng Văn Hoài (2009 – 2010), Hóa hữu cơ NK bài 2: steroid và cholesterol,

Đại học Y dược TPHCM.

5. Nguyễn Thị Thu Hương (2011). Bước đầu tiên nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn của cao chiết từ tỏi (Allium sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở

người.

6. Trần Công Khánh (2008). Cây thuốc trong xóa đói giảm nghèo. Tuyển tập công

trình KH của VACNE về “Bảo vệ môi trường và Phát triển bền vững”, 1988 –

2008, tr. 371 – 374.

7. TS Phan Văn Kiệm (2008). Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một

số cây thuốc dân tộc Việt Nam nhằm tạo sản phẩm thuốc có giá trị cao phục vụ

cuộc sống.

8. Phạm Thanh Kỳ (1998). Bài giảng dược liệu – tập II. Nhà xuất bản Trung tâm

thông tin thư viện – Trường đại học Dược Hà Nội.

9. Đỗ Tất Lợi (1992), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXBKHKT.

10. Hoàng Ngân (2013), Bệnh tả và cách điều trị bệnh tả hiệu quả, Tạp chí sức khỏe

và đời sống.

11. Phạm Thị Bích Ngọc (2011), Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải

sản đông lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học Công Nghệ TPHCM.

12. Quỳnh Ngọc (2013), Flavonoid – Bảo vệ sức khỏe an toàn, NXB Trung tâm

thông tin KH&CN TPHCM.

13. Phạm Minh Nhựt (2013). Thực hành vi sinh đại cương. Trường Đại học Công

84

Nghệ TPHCM.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

14. Vũ Xuân Tạo (2011), Nghiên cứu Alkaloid & quy trình tách chiết một số chất có

bản chất là alkaloid, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên

TPHCM.

15. Lâm Phạm Huệ Tâm (2015). Đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi tách chiết

đến hoạt tính kháng khuẩn của cây Medinilla sp. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư

Công nghệ sinh học, trường Đại học Công Nghệ TPHCM.

16. Trần Thị Ngọc Thanh (2012), Nghiên cứu tách chiết và định danh một số

Phytoncid chủ yếu từ củ nén ở Quảng Nam, Luận Văn thạc sĩ khoa học, Trường

Đại học Đà Nẵng.

17. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội

18. Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu, tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội

19. Lê Ngọc Thùy Trang (2013), Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả

năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantatum. Khóa

luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Công Nghệ

TPHCM.

20. Đái Thị Xuân Trang và ctv (2015). Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng

oxy hóacủa cao methanol cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas MERR).

TÀI LIỆU TRÍCH DẪN TỪ INTERNET

21. Võ Thị Thanh Kiều (2016). Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học

trong một số dịch chiết của lá và nhân quả bàng, Đại Học Đà Nẵng.

http://123doc.org/document/4136421-nghien-cu-u-chie-t-ta-ch-xa-c-di-nh-tha-nh-

pha-n-ho-a-ho-c-trong-mo-t-so-di-ch-chie-t-cu-a-la-va-nhan-qua-ba-ng.htm

https://vi.wikipedia.org/wiki/B%C3%A0ng

22. Nguyễn Hoàng (2016). Thông tin chi tiết cây Bàng ta. C.TY TNHH CAY

XANH HOÀNG NGUYỄN

http://cayxanhdothi.com.vn/san-pham/cay-xanh-cong-trinh/cay-bang-ta

23. Nguyễn Hữu Toàn (2009). Thầy thuốc của bạn. Phòng khám Đông Y

85

https://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/bang.htm

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

24. Nguyễn Thị Hoa (2011). Độc lực và thành phần protein của các chủng vi khuẩn

Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại

các bè nuôi thương phẩm ở khánh hòa. Đại học Nha Trang

http://123doc.org/document/1788554-doc-luc-va-thanh-phan-protein-cua-cac-

chung-vi-khuan-vibrio-alginolyticus-phan-lap-tu-ca-chem-lates-calcarifer-bi-benh-

lo-loet-tai-cac-be-nuoi-thuong-.htm

25. Lương Văn Tiến và ctv (2015). Kết quả nghiên cứu bước đầu về thành phần háo

học của dầu hạt lai (Aleurites moluccana), Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt

Nam.

http://vafs.gov.vn/vn/wp-content/uploads/sites/2/2015/04/11-Dau-Lai-Tien.pdf

26. Nguyễn Tấn Thịnh (2013), Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp trong cây

lược vàng, trường Đại học Công Nghệ TPHCM.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-thanh-phan-hop-chat-thu-cap-trong-

cay-luoc-vang-callisa-fragrans-lindl-wood-52390/

27. Dương Văn Sĩ (2010), Tìm hiểu về vi khuẩn Streptococcus faecalis

(Enterococcus faecalis), chuyên đề tốt nghiệp, Trường Dại học Nông Lâm

TPHCM.

http://www.zbook.vn/ebook/tim-hieu-ve-vi-khuan-streptococcus-faecalis-

enterococcus-faecalis-mon-kiem-nghiem-chat-luong-thuc-pham-ban-trinh-chieu-

29121/

28. Th.s Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv (2010), Báo công nghệ và chế biến rau trái,

Trường Đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-chat-khang-khuan-thuc-vat-52967/

29. Trần Trường Hận (2010), Hợp chất thiên nhiên.

86

http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/4329903

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

30. GV Bùi Thị Hài Hòa và sinh viên thực hiện (2012), Chuyên Đề: Độc tố E.coli,

Viện Đại học Mở Hà Nội.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/chuyen-de-doc-to-ecoli-61023/

31. BS Nguyễn Văn Minh Hoàng (2013), Đặc điểm Shigella spp. gây tiêu chảy tại

bệnh viện Nhiệt Đới TPHCM, bệnh viện Nhiệt Đới TPHCM.

http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-dac-diem-vi-khuan-shigella-gay-benh-tieu-chay-

cap-tai-benh-vien-nhiet-doi-thanh-pho-ho-chi-minh-40933/

32. Phùng Trung Hùng và công tác viên (2013), Đại cương carbohydrate.

http://docsachysinh.com/dsys-ebook/Phan1/chuong14/index.html

33. Nguyễn Phương Hà Linh Linh (2011). Cấu tạo, tính chất và vai trò của

carbohydrate.

http://tailieu.vn/doc/cau-tao-tinh-chat-va-vai-tro-cua-carbohydrate-887289.html

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

34. Abba D., Inabo, H. I., Yakubu, S. E. and Olonitola, O. S. (2009), Phytochemical

analysis and antibacterial activity of some powered herbal preparations

marketed in Kaduna metropolis, Full Lengh Research Article.

35. Abou-Karam, M., and W. T. Shier (1990), A simplified plaque reduction assay

for antiviral agents from plants, Demonstration of frequent occurrence of

antiviarl activity in higher plants. J. Nat. Prod. 53:340-344.

36. Aibinu I.E., Akinsulire O.R., Adenipekun T. and Odugbemi T.A.T. (2007). In

vitro

antimicrobial activity of crude extracts from plants bryophyllum pinnatum and

kalanchoe crenata, Afr. J. Traditional Complementary and Alternative

Medicines, 4 (3), 338-344.

87

37. Boulamatsis A, Jersek B (2009). Investigate the antimicrobial activity of the tree

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

38. Anonymous (1996). The Indian Pharmacopoeia. 3rd edition. Government of

India , New Delhi, Ministry of Health and family welfare

39. Babuselvam M., Farook K.A.M., Abideen S., Mohamed M.P and Uthiraselvam

M. (2012). Screening of antibacterial activity of mangrove plant extracts against

fish and shrimp pathogens, International Journal of Applied Microbiology

Science, 1 (3), 20 – 25.

40. Tongdonmuan, Khanom, W Nunsong (2010). Evaluation of the antimicrobial

activity of ethanol extracts from the leaves

41. Burt S (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential

applications in foods – a review. Int J Food Microbiol. 2004;94(3):233-53.1999;

12(4):564-82.

42. Hadacek F., Greger H., (2000). Yesting of antifungal natural products:

methodologies, comparability of results and assay choice. Phytochem Anal., 11:

137-147.

43. Kris-Etherton, P,M,; Hecker, K.D., Bonanome, A., Coval, S.M., Binkoski, A.E.,

food: their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer. American

Journal of Medicine. 113:7S-88S.

44. Bonanome, Greger H, Pachontis (2000). The antimicrobial activity of the leaf

extracts to the pathogenic bacteria.

45. Karkare S., Adou E, Cao S., Brodie P., Miller J. S., Andrianjafy N. M.,

Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I.

(2007), Cytotoxic cardenolide glycosides of Roupellina (Strophanthus) boivinii,

The Madagascar rainforest, J Nat Prod, pp:70:1766 – 1770.

46. Kotzekidou, P.; Giannakidis, P., Boulamatsis, A. (2008).Antimicrobial activity

of some plant extracts and assential oils against foodborne pathogens in vitro

and on the fate of inoculated pathogens in chocolate. LWT41: 119 – 127.

47. Manson, M.M. (2003). Cancer prevention – the potential for diet to modulate

88

molecular signalling. Trends in Molecular Medicine.9: 11 – 18.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

48. Rayes A. A.H. (2012), Screening of some natural and cultivated plants in sudia

arabia fight infections and inhibit growth of pathogenic bacteria, Faculty of

Applied Sciences, Umm A1 – Qura University Mark Saudi Arab.

49. Rozman T., Jersek B. (2009), Antimicrobial activity ò rosemary extracts

(Rosmarimus officinalis L.) against diferent species of Listeria, Acta agricuturae

Slovenica.

50. Salem W. M., Sayed W. F., Haridy M. and Hassan N. H. (2014), Antibacterial

actiity of Calotropis procera and Ficus sycomorus extracts on some pathogenic

microorganisms, African Journal of Biotechnology.

51. Saxena Mamta and Saxena Jyoti (2012), Phytochemical screening of Acorus

calamus and Lantana Camara, International Research Journal of Pharmacy.

52. Andrianjafy N, Chitmanat (2005). Potential for the effect of leaf extracts on the

growth of V.alginolyticus on shrimp.

53. Vamanu Emanuel, Vamanu Adrian, NitaSultana and Colceriu Svetlana (2011).

Antioxidant and Antimicrobial Activities of Ethanol Extracts of Cynara

Scolymus (Cynarae folium, Asteraceae Family), Tropical Journal of

Pharmaceutical Research December 2011; 10 (5): 777 - 783.

54. Yadav P. D., Bharadwaj N. S. P., Yedukondalu M., Methushala C. H., Ravi K.

(2013), Phytochemical evaluation of nyctanthes arbortristis, nerium oleander

and catharathnus roneus, Indian Journal of Research in Pharmacy and

89

Biotechnology

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HIỆU SUẤT THU HỒI CAO CHIẾT

LÁ BÀNG TỪ DUNG MÔI ETHANOL 70%

A.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol

70%

HIỆU SUẤT (%) DUNG MÔI ETHANOL 70%

1 23,9025

2 23,3950

1

3 24,3075

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT LÁ BÀNG TỪ DUNG MÔI

ETHANOL 70% TRÊN 20 CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNH

B.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn

Escherchia coli (d= 6 m

Nồng độ 50 mg/ml Nồng độ 100 mg/ml

Nồng độ 150 mg/ml

Nồng độ 200 mg/ml

Ciprofloxacin 500µg/ml

Vi khuẩn chỉ thị

11

11

11

13

12

9,5

13

14

15

17

13

16

13

13,5

E. Coli

13

11

13,7

12,5 14

11

14

15

30,5

15

31

31,5

ETEC

-

-

-

13

12,7

11

10

14

15

14

15

13

16

13

13,5

E. Coli0208

-

-

-

13

13

11

10,5 14

12

14

16

12,5

15

12

12,5

E.0157:H7

-

-

-

13

B.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩnListeria

spp (d= 6 mm)

Vi khuẩn chỉ thị

Nồng độ 50 mg/ml Nồng độ 100 mg/ml

Nồng độ 150 mg/ml

Nồng độ 200 mg/ml

Ciprofloxacin 500µg/ml

17

12

12,5

L. innocua.

14,7

9

10,3 10

11

14

17

11,5

-

-

-

11

16

12

12,5

L. monocytogenes

10,7

11

10

11

11

15

17

12

-

-

-

10

2

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

B.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn Samonella

spp (d= 6 mm)

Vi khuẩn chỉ thị

Nồng độ 50 mg/ml Nồng độ 100 mg/ml

Nồng độ 150 mg/ml

Nồng độ 200 mg/ml

Ciprofloxacin 500µg/ml

S. dublin.

11

10

10

14

12

11,7 13

16

17

17

12

12.5

13

18

15

S. enteritidis

10.7

13.5

12

15

14

13

12

13,5

9

9

13

13

12,5

9

14

S. typhii

13,3

14

11

10

14

15

14

13

-

-

15

12

12,5

-

15

S. typhimurium

13,7

9

10

13

14

16

17

11

-

-

17

11

11

-

15

B.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn Shigella

spp (d= 6 mm)

Vi khuẩn chỉ thị

Nồng độ 50 mg/ml Nồng độ 100 mg/ml

Nồng độ 150 mg/ml

Nồng độ 200 mg/ml

Ciprofloxacin 500µg/ml

S. boydii

-

-

13,7

13

14

13

13

14

14

-

15

-

-

-

12

S. flexneri

-

-

11

10,3

9

13

15

15

16

13

13

13

13,5

-

15

S. sonnei

10

12

11

12,7

10

11

13

13

15

16

35,5

14

33

32,5

13

3

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

B.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn Virio spp

(d= 6 mm)

Vi khuẩn chỉ thị

Nồng độ 50 mg/ml Nồng độ 100 mg/ml

Nồng độ 150 mg/ml

Nồng độ 200 mg/ml

Ciprofloxacin 500µg/ml

V. alginolyticus

10

11

15,3

12

9

14

16

16

17

16,5

16

16

9

15

17

9,5

10

11,7

11

10

10

16

17

16

13

13

14

V. cholerae

9

15

15

11

13,3

12

19

13

13

16

16

17,5

18

18,5

V. harveyi

10

0

13

15

V. parahaemolyticus

-

-

14,3

13

5

10

11

18

17

11,5

11,5

11

-

12

16

B.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn gây bệnh

cơ hội trên da (d= 6 mm)

Vi khuẩn chỉ thị

Nồng độ 50 mg/ml Nồng độ 100 mg/ml

Nồng độ 150 mg/ml

Nồng độ 200 mg/ml

Ciprofloxacin 500µg/ml

13,3

12,5

12

13

15

14

16

12,5

11,5

12,5

-

P. aeruginosa

-

-

15

15

14

12

11,5 11

13

17

15

12

12

12,5

-

S. aureus

-

-

14

19

E. feacalis

11

13

14,3

105

11

11

12

16

16

12

11,5

12,5

9

11

16

4

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG

KHUẨN CỦA CAO CHIẾT LÁ BÀNG TỪ DUNG MÔI ETHANOL 70% ĐỐI VỚI

CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH

C.1. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn Escherchia coli

C.1.1. E. Coli

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 46.06666667 11.51666667 12.56 0.0007 Model

10 9.16666667 0.91666667 Error

14 55.23333333 Corrected Total

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 16.0000 NĐ 200 mg/ml 3

B 13.3333 NĐ 150 mg/ml 3

B 13.0000 Ciprofloxacin 3

B 11.5000 NĐ 100 mg/ml 3

5

B 11.0000 NĐ 50 mg/ml 3

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp C.1.2. ETEC

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 718.5433333 239.5144444 201.84 <.0001 Model

8 9.4933333 1.1866667 Error

11 728.0366667 Corrected Total

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 31.0000 3 Ciprofloxacin

B 14.6667 3 NĐ 200 mg/ml

B 12.6667 3 NĐ 150 mg/ml

B 12.4000 3 NĐ 100 mg/ml

C.1.3. E. Coli0208

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

22.85583333 7.61861111 7.72 0.0095 3 Model

7.89333333 1.1866667 8 Error

11 30.74916667 0.98666667 Corrected

6

Total

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 15.0000 3 NĐ 200 mg/ml

A 14.0000 3 NĐ 150 mg/ml

B A 13.3333 3 Ciprofloxacin

B 11.2333 3 NĐ 100 mg/ml

C.1.4. E.0157:H

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 20.06250000 6.68750000 6.98 0.0127 Model

8 7.66666667 0.95833333 Error

27.72916667 Corrected Total 11

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 15.0000 NĐ 200 mg/ml 3

B 13.0000 NĐ 150 mg/ml 3

B 12.3333 Ciprofloxacin 3

7

B 11.5000 NĐ 100 mg/ml 3

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

C.2. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩnListeria spp

C.2.1. L. innocua.

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 51.66666667 17.22222222 5.51 0.0239 Model

8 25.01333333 3.12666667 Error

76.68000000 Corrected Total 11

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 16.000 3 NĐ 200 mg/ml

B 12.000 3 Ciprofloxacin

B 11.333 3 NĐ 100 mg/ml

B 10.667 3 NĐ 150 mg/ml

C.2.2. L. monocytogenes

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 53.9933333 17.9977778 2.60 0.1241 Model

8 55.2933333 6.9116667 Error

8

109.2866667 Corrected Total 11

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 16.000 3 NĐ 200 mg/ml

B 10.600 3 NĐ 150 mg/ml

B A 12.167 3 Ciprofloxacin

B 10.667 3 NĐ 150 mg/ml

C.3. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn Samonella spp

C.3.1 S. Dublin

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 87.6840000 21.9210000 1.99 0.1725 Model

10 110.2933333 11.0293333 Error

197.9773333 Corrected Total 14

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 17.333 3 NĐ 200 mg/ml

B A 12.567 3 NĐ 100 mg/ml

B A 12.167 3 Ciprofloxacin

B A 11.333 3 NĐ 150 mg/ml

9

B A 10.333 3 NĐ 50 mg/ml

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

C.3.2. S. Enteritidis

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 46.99733333 11.74933333 20.40 <.0001 Model

10 5.76000000 0.57600000 Error

52.75733333 Corrected Total 14

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 14.3333 3 NĐ 150 mg/ml

B A 13.0000 3 Ciprofloxacin

B A 12.6667 3 NĐ 200 mg/ml

B 12.0667 3 NĐ 100 mg/ml

C 9.0000 3 NĐ 50 mg/ml

C.3.3. S. Typhii

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 8.59333333 2.86444444 1.14 0.3897 Model

8 20.09333333 2.51166667 Error

10

28.68666667 Corrected Total 11

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 14.667 3 NĐ 200 mg/ml

A 13.000 3 NĐ 150 mg/ml

A 12.767 3 NĐ 100 mg/ml

A 12.500 3 Ciprofloxacin

C.3.4. S. Typhimurium

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 68.32250000 22.77416667 12.21 0.0024 Model

8 14.92666667 1.86583333 Error

83.24916667 Corrected Total 11

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 16.667 3 NĐ 200 mg/ml

B A 14.000 3 NĐ 150 mg/ml

B 11.000 3 Ciprofloxacin

11

B 10.900 3 NĐ 100 mg/ml

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

C.4. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn Shigella spp

C.4.1. S. Boydii

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

2 43.5088889 21.7544444 2.11 0.2023 Model

6 61.8600000 10.3100000 Error

105.3688889 Corrected Total 8

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean Cao N

A 14.333 3 NĐ 200 mg/ml

A 13.567 3 NĐ 100 mg/ml

A 9.333 3 NĐ 150 mg/ml

C.4.2. S. Flexneri

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 39.70916667 13.23638889 10.57 0.0037 Model

8 10.02000000 1.25250000 Error

12

49.72916667 Corrected Total 11

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

14.6667 3 NĐ 200 mg/ml A

14.4333 3 NĐ 150 mg/ml A

13.1667 3 Ciprofloxacin A

10.1000 3 NĐ 50 mg/ml B

C.4.3. S. Sonnei

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 1237.970667 309.492667 36.75 <.0001 Model

10 84.226667 8.422667 Error

1322.197333 Corrected Total 14

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

33.667 Ciprofloxacin 3 A

15.000 NĐ 200 mg/ml 3 B

13.000 NĐ 150 mg/ml 3 B

11.000 NĐ 50 mg/ml 3 B

13

7.900 NĐ 100 mg/ml B

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

C.5. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn Virio spp

C.5.1. V. Alginolyticus

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 97.2440000 24.3110000 9.85 0.0017 Model

10 24.6933333 2.4693333 Error

121.9373333 Corrected Total 14

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 16.667 3 NĐ 200 mg/ml

A 16.167 3 NĐ 150 mg/ml

B A 15.000 3 Ciprofloxacin

B C 12.100 3 NĐ 100 mg/ml

C 10.000 3 NĐ 50 mg/ml

C.5.2. V. Cholerae

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 77.1106667 19.2776667 7.62 0.0044 Model

10 25.2933333 2.5293333 Error

14

102.4040000 Corrected Total 14

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping N Cao Mean

A 16.000 3 NĐ 200 mg/ml

B A 13.667 3 NĐ 150 mg/ml

B A C 13.333 3 Ciprofloxacin

B C 10.900 3 NĐ 100 mg/ml

C 9.500 3 NĐ 50 mg/ml

C.5.3. V. Harveyi

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 68.76000000 22.92000000 36.48 <.0001 Model

8 5.02666667 0.62833333 Error

73.78666667 Corrected Total 11

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 17.0000 NĐ 200 mg/ml 3

B 13.6000 NĐ 100 mg/ml 3

C 11.3333 Ciprofloxacin 3

15

C 11.0000 NĐ 150 mg/ml 3

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

C.5.4. V. Parahaemolyticus

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 16.58916667 5.52972222 7.14 0.0119 Model

8 6.19333333 0.77416667 Error

22.78250000 Corrected Total 11

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 15.0000 3 NĐ 200 mg/ml

A 14.3333 3 NĐ 150 mg/ml

B 12.6000 3 NĐ 100 mg/ml

B 12.1667 3 Ciprofloxacin

C.6. Kết quả xử lý số liệu thống kê khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết

lá bàng từ dung môi ethanol 70% trên nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da

C.6.1. P. aeruginosa

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 16.58916667 5.52972222 7.14 0.0119 Model

8 6.19333333 0.77416667 Error

16

22.78250000 Corrected Total 11

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

15.0000 3 NĐ 200 mg/ml A

14.3333 3 NĐ 150 mg/ml A

12.6000 3 NĐ 100 mg/ml B

12.1667 3 Ciprofloxacin B

C.6.2. S. Aureus

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

3 47.08333333 15.69444444 7.69 0.0096 Model

8 16.33333333 2.04166667 Error

63.41666667 Corrected Total 11

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

17.000 3 NĐ 200 mg/ml A

12.667 3 NĐ 150 mg/ml B

12.500 3 NĐ 100 mg/ml B

17

12.167 3 Ciprofloxacin B

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp C.6.3. E. Feacalis

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

The ANOVA Procedure

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

4 41.77066667 10.44266667 11.00 0.0011 Model

10 9.49333333 0.94933333 Error

51.26400000 Corrected Total 14

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N Cao

A 16.0000 3 NĐ 200 mg/ml

B 12.2667 3 NĐ 100 mg/ml

B 12.0000 3 Ciprofloxacin

B 12.0000 3 NĐ 50 mg/ml

18

B 11.3333 3 NĐ 150 mg/ml

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC D. CÁCH PHA CÁC LOẠI THUỐC THỬ

 Thuốc thử Molisch

Hòa tan 5g α – napthol vào ethanol 95% và pha loãng thành 100 ml.

 Thuốc thử Fehling

Thuốc tử Fehling A: 34,6 g CuSO4.5H2O được hòa tan hoàn toàn trong nước

cất, sau đó tiếp tục định mức đến 500 ml.

Thuốc thử Fehling B: hòa tan 125g KOH và 173g Kali Natri tartrate.7H2O

vào nước cất và định mưc cho đến 500 ml.

 Thuốc thử Barfoed

Cân 66,5g Copper (II) acetate monohydrate hòa tan vào dung dịch gốm 10

ml acid acetic glacial vào 1000ml nước cất. Hỗn hợp trên được mang đi đun và

khuấy cho đến khi tan hoàn toàn.

 Thuốc thử Mayer

Hòa tan 1,358g HgCl2 trong 60ml nước cất. Tiếp tục cân 5g KI hòa tan trong

10ml nước cất. Sau đó tiến hành trộn 2 dung dịch trên lại với nhau và định mức

bằng nước cất đến 100ml.

 Thuốc thử Dragendroff: gồm 2 dung dịch:

Dung dịch A: hòa tan 0,5g Bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml acid

acetic 20%.

Dung dịch B: dung dịch KI 40% hòa tan trong nước cất.

Khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B và 70 ml nước cất.

 Thuốc thử Hager

Hòa tan 1g acid picric vào 100 ml nước cất, sau đó lọc dung dịch trên và thu

19

dịch lọc.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

 Thuốc thử WaGner

Hòa tan 2g I2 và 6g KI vào nước cất và định mức đến 100 ml. Thuốc thử là

dung dịch tan hoàn toan, tránh sự tiếp xúc ánh sáng.

 Natri nitro prusside

20

Hòa tan 1g Natri nitroferricyanide vào 10 ml nước cất.

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC E. HÌNH ẢNH KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO CHIẾT LÁ BÀNG TỪ

ETHANOL 70%

A

E.1 Mẫu lá bàng và dung dịch chiết

B

C

Hình A. Mẫu lá bàng khô

21

Hình B. Mẫu lá bàng khô ngâm trong môi ethanol 70%; Hình C. Dịch chiết lần 1

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

D

E

Hình D. Dịch chiết lần 2 Hình E. Dịch chiết lần 3

F

G

E.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

I

H

Hình F. Đĩa đã trang vi khuẩn Hình G. Đĩa hút TcEE

22

Hình H. Vòng kháng khuẩn V. alginolyticus Hình I. Vòng kháng khuẩn S. boydii

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

E.3. Kết quả dương tính với các thành phần hóa học

J

K

L

- Kết quả dương tính với carbohydrate

Hình J. Thử nghiệm Molisch test; Hình K. Thử nghiệm Fehling test; Hình L. Thử nghiệm

Barfoed’s test

M

- Kết quả dương tính với thử nghiệm xác định saponin

23

Hình M. Thử nghiệm Foam test

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

N

- Kết quả dương tính với thử nghiệm xác định Cardiac glycoside

Hình N. Thử nghiệm Legal’s test

O

- Kết quả dương tính với thử nghiệm xác định Phenolic compound

24

Hình O. Thử nghiệm Gelatin test

GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt

Đồ án tốt nghiệp

E.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng cao chiết lá bàng từ ethanol 70% đến vi

S

R

khuẩn V. Alginolyticus.

U

T

Hình R. Khuẩn lạc V.alginolyticus ở 10-2 Hình S. Khuẩn lạc V.alginolyticus ở 10-4

25

Hình T. Khuẩn lạc V.alginolyticus ở 10-5 Hình R. Khuẩn lạc V.alginolyticus ở 10-6