Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất bằng phương pháp kết tủa nước chua

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan toàn bộ nội dung đồ án tốt nghiệp là của riêng em. Các kết

quả nghiên cứu đƣa ra trong đồ án này do em tự tìm hiểu, phân tích một cách trung

thực, khách quan, không sao chép của bất kỳ kết quả nghiên cứu nào của các tác giả

khác. Nội dung của đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các

nguồn sách, tạp chí đƣợc liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Linh Chi

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Qua hơn 3 tháng thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng chitosan

hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất theo phương pháp kết tủa

bằng nước chua” đến nay đã đƣợc hoàn thành.

Em xin cám ơn BGH trƣờng Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

cùng tất cả quý Thầy Cô, bạn bè trong phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học –

Thực phẩm – Môi trƣờng đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt

đề tài.

Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn đến TS. Nguyễn Lệ Hà, Cô đã tận tình giúp

đỡ và hƣớng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.

Bên cạnh những nỗ lực của bản thân thì đây vẫn là một lĩnh vực khá mới, đòi

hỏi chuyên môn sâu và kinh nghiệm thực tế. Song, do bản thân còn nhiều hạn chế

về kiến thức, kinh nghiệm cũng nhƣ gặp phải một số khó khăn trong việc sƣu tầm

tài liệu và những thông tin cần thiết có liên quan đến đề tài nên những thiếu sót

trong việc phân tích, trình bày đồ án là không thể tránh khỏi. Em rất mong nhận

đƣợc sự chỉ dẫn thêm từ quý Thầy Cô.

Kính chúc mọi ngƣời luôn dồi dào sức khỏe, vui vẻ và luôn thành công trong

công việc.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 07 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Linh Chi

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iii

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... v

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1

2. Mục đích và nội dung nghiên cứu ....................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về đậu hũ ......................................................................................... 3

1.1.1. Giới thiệu về đậu nành ............................................................................... 3

1.1.1.2.1. Tính tan ................................................................................................. 4

1.1.2. Quy trình sản xuất đậu hũ........................................................................... 6

1.1.3. Các chỉ tiêu chất lƣợng của đậu hũ .......................................................... 11

1.1.4. Những nguyên nhân và biến đổi gây hƣ hỏng đậu hũ .............................. 13

1.2. Tổng quan về chitin - chitosan ........................................................................ 15

1.2.1. Giới thiệu về chitin – chitosan ................................................................. 15

1.2.2. Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan ..................................................... 16

1.2.3. Tính chất của chitosan .............................................................................. 18

1.2.4. Các phƣơng pháp thu nhận chitosan ........................................................ 25

1.2.5. Chitosan tan trong nƣớc (WSC) ............................................................... 28

1.2.6. Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm ................................................. 30

CHƢƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 34

2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 34

2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 34

2.1.2. Vật liệu ..................................................................................................... 34

2.2. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 34

2.2.1. Chuẩn bị cho nghiên cứu .......................................................................... 34

2.2.3. Tiến hành thí nghiệm ................................................................................ 37

i

Đồ án tốt nghiệp

2.2.4. Phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 38

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 39

3.1. Một số thông số cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu ........................... 39

3.2. Nghiên cứu quá trình biến đổi của đậu hũ trong thời gian bảo quản .............. 39

3.2.1. Khảo sát biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh ...................................................................................... 39

3.2.2. Khảo sát độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh .................................................................................................. 42

3.2.3. Khảo sát chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh ..................................................... 44

3.2.4. Khảo sát chỉ tiêu nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh ............................................................ 46

3.2.5. Khảo sát chỉ tiêu E. coli trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh ................................................................................. 48

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 51

4.1. Kết luận ........................................................................................................... 51

4.2. Kiến nghị......................................................................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 53

ii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU: colonies forming unit, đơn vị hình thành khuẩn lạc

EMB: Eosine Methylene Blue Agar

MPN: most probable number

MR: Methyl Red

PCA: Plate Count Agar

PDA: Potato Dextrose Agar

SCA: Simmon Citrate Agar

TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam

TPC: tổng vi sinh vật hiếu khí

VP: Voges – Proskauer

WSC: chitosan hòa tan trong nƣớc

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.3. Hàm lƣợng acid amin không thay thế trong protein đậu nành ........................ 4

Bảng 1.4. So sánh hai phƣơng pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành ...................... 10

Bảng 1.5. Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997) ..................................... 11

Bảng 1.6. Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011) .................................. 12

Bảng 1.7. Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78)................................................... 12

Bảng 1.8. Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phƣơng pháp hóa học

và sinh học ...................................................................................................................... 27

Bảng 1.9. Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosan tan

trong nƣớc ...................................................................................................................... 29

Bảng 2.1. Các phƣơng pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của dung dịch ngâm

đậu hũ ............................................................................................................................. 38

Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu đƣợc xác định của đậu hũ dùng trong nghiên cứu ................ 39

Bảng 3.2. Giá trị pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và

nhiệt độ lạnh ................................................................................................................... 39

Bảng 3.3. Giá trị độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và

nhiệt độ lạnh ................................................................................................................... 42

Bảng 3.4. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở

nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh .................................................................................... 44

Bảng 3.5. Mật độ nấm men nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt

độ thƣờng và nhiệt độ lạnh ............................................................................................. 46

Bảng 3.6. Số lƣợng E. coli giả định trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt

độ thƣờng và nhiệt độ lạnh ............................................................................................. 48

iv

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ quy trình sản xuất đậu hũ ....................................................................... 7

Hình 1.2. Cấu tạo hóa học của chitin ............................................................................. 16

Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của chitosan ......................................................................... 17

Hình 1.4. Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosan .............................................................. 27

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................... 36

Hình 3.1. Biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ

lạnh ................................................................................................................................. 40

Hình 3.2. Biến đổi độ đục của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh..... 43

Hình 3.3. Biến đổi về tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm ở nhiệt độ

thƣờng và nhiệt độ lạnh .................................................................................................. 45

Hình 3.4. Biến đổi về nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng

và nhiệt độ lạnh .............................................................................................................. 47

Hình 3.5. Biến đổi về E. coli giả định của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và

nhiệt độ lạnh ................................................................................................................... 49

v

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Đậu hũ là một sản phẩm đƣợc ƣa chuộng của ngƣời châu Á, thích hợp cho

nhiều đối tƣợng do dễ tiêu hóa, dễ sử dụng, ít cholesterol và chất béo bão hòa… rất

tốt cho sức khỏe của con ngƣời.

Tuy nhiên, đậu hũ khó bảo quản và dễ hƣ hỏng do thành phần giàu dinh

dƣỡng và chứa hàm lƣợng nƣớc cao, thời hạn sử dụng cao nhất của đậu hũ là từ 1

đến 2 ngày trong điều kiện bình thƣờng (Dotson và cộng sự, 1977; Kovats và cộng

sự, 1984). Vì vậy, nhiều ngƣời sản xuất đã bổ sung thạch cao, chất phụ gia hoặc

chất bảo quản trong quá trình sản xuất để kéo dài thời gian bảo quản, điều này gây

ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.

Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm ra các chất bảo quản có hoạt

tính sinh học để thay thế cho chất bảo quản hóa học, và một trong những chất đó là

chitosan. Chitosan là polysaccharide nhiều thứ hai sau cellulose đƣợc tìm thấy trong

tự nhiên, đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng chitosan trong thực tế

nhƣ nông nghiệp, công nghiệp, y dƣợc, bảo vệ môi trƣờng, chất bảo vệ hoa quả,…

Một số nƣớc nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc đã có nghiên cứu khoa học về ứng

dụng chitosan vào bảo quản đậu hũ. Ở Việt Nam chƣa có báo cáo khoa học nào về

đề tài này, vì vậy, chúng tôi muốn thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng

chitosan hòa tan trong nước vào bảo quản đậu hũ được sản xuất bằng phương pháp

kết tủa nước chua” trong điều kiện khí hậu cũng nhƣ nguồn nguyên liệu của Việt

Nam.

2. Mục đích và nội dung nghiên cứu

Mục đích chung của đồ án là nghiên cứu khả năng sử dụng chitosan hòa tan

trong nƣớc để kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ sản xuất theo phƣơng pháp kết tủa

bằng nƣớc chua. Để đạt đƣợc mục đích này, nghiên cứu tập trung vào một số nội

dung sau:

- Phân tích một số chỉ tiêu cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu.

Trang 1

Đồ án tốt nghiệp

- Theo dõi biến đổi chất lƣợng của đậu hũ thông qua dung dịch ngâm đậu hũ

trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh.

Trang 2

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về đậu hũ

1.1.1. Giới thiệu về đậu nành

1.1.1.1. Khái quát về đậu nành

Đậu nành là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại đƣợc trồng từ

hơn 5000 năm trƣớc, có tên khoa học là Glycine Maxx Merril.

Bảng 1.1. Thành phần của hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2006)

Thành Tỷ lệ Protein Lipid Tro Chất bột

phần của (%) (%) (%) (%) đƣờng (%)

hạt

100,0 40,0 21 4,9 34 Đậu hạt

90,3 43,0 23 5,0 29 Tử diệp

8,0 8,8 1 4,3 86 Vỏ đậu

2,4 41,1 11 4,4 43 Mầm

Bảng 1.2. Thành phần protein đậu nành (Ngô Thế Dân và cộng sự, 1998)

Phân đoạn Hàm lƣợng Thành phần Phân tử lƣợng

(S) (%) (Da)

Chất ức chế trypsin 8000 – 20000 15 2

150000 35 7 – conglicinine

62000 – amylase

102000 Lipoxygenase

110000 Hemagglutinin

40 Glycinin 320000 - 350000 11

600000 10 15

Trang 3

Đồ án tốt nghiệp

Đậu nành cũng nhƣ tất cả các hạt khác đều chứa enzyme cần thiết cho quá

trình nảy mầm. Về mặt công nghệ thì enzyme quan trọng của đậu nành là

lipoxygenase. Enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa acid béo không bão hòa,

gây mùi hôi cho đậu nành.

Bảng 1.3. Hàm lƣợng acid amin không thay thế trong protein đậu nành

Các acid amin Giá trị (%)

không thay thế

Tryptophan 1,28

Leucine 7,78

Isoleucine 4,54

Valine 4,80

Threonine 3,86

Lysine 6,38

Methionine 1,26

Phenylalanine 4,94

Trừ methionine quá thấp, các acid amin khác của đậu nành có thành phần

gần giống thịt.

1.1.1.2. Tính chất của protein đậu nành

1.1.1.2.1. Tính tan

Trong protein đậu nành, globulin không tan trong nƣớc trong khi phosphate

canxi, acid phititic có thể làm cho protein đậu tan đến 90%. Tuỳ loại thực phẩm mà

tính tan này đƣợc ƣa chuộng hoặc không. Ở đây ta lợi dụng tính chất trái ngƣợc, đó

là đặc tính kết tủa của protein đậu nành. Protein đậu kết tủa ở pI = 4,5.

Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hƣởng bởi lực ion. Ở pH=6,8 lực

ion ít ảnh hƣởng, ở pH = 2 lực ion làm giảm tính tan, ở pH = 4,7 lực ion làm tăng

tính tan.

Trang 4

Đồ án tốt nghiệp

Tính tan của protein đậu nành còn bị ảnh hƣởng bởi chế độ xử lý nhiệt. Nhiệt

xử lý làm biến tính và giảm tính tan của protein đậu nành, sau đó một số protein có

thể phân cắt thành các thành phần nhỏ hơn và tan lại.

1.1.1.2.2. Khả năng hấp thụ và giữ nước

Khả năng hấp thụ và giữ nƣớc của protein dựa trên tƣơng tác giữa protein –

protein và protein – nƣớc. Khi nồng độ protein tăng, khả năng hấp thụ nƣớc tăng.

Khi pH thay đổi thì sự tích điện của protein cũng thay đổi. Do đó, ở điểm

đẳng điện, sự hút nƣớc là thấp nhất vì tƣơng tác giữa protein – protein rất chặt chẽ.

Ở pH cao hơn và thấp hơn pI, sự hấp thụ và giữ nƣớc của protein tăng.

Khi nhiệt độ tăng, khả năng hấp thụ nƣớc giảm vì giảm các liên kết hydro

nhƣng làm tăng các liên kết khác nhƣ liên kết disunfide…

1.1.1.2.3. Khả năng tạo gel

Protein đậu nành có khả năng tạo gel. Khi đó protein tạo mạng lƣới giữ các

phân tử nƣớc lại cho thực phẩm chứa nhiều nƣớc và có sự liên kết chặt chẽ nhƣ cấu

trúc của agar.

Khi protein bị biến tính, các cấu trúc bậc cao bị phá hủy, các mạch

polypeptide duỗi ra, tiến lại gần nhau, tiếp xúc và tạo nên mạng lƣới không gian

tƣơng đối chặt chẽ.

Các yếu tố gây tạo gel:

 Sử dụng nhiệt: khi dịch sữa protein đậu nành có nồng độ cao đƣợc

đun nóng ở pH trung tính thì sẽ tạo gel.

 Sử dụng pH đẳng điện: ở pH đẳng điện, protein có khả năng tạo gel.

 Sử dụng các muối của ion kim loại hóa trị 2: nhờ liên kết giữa Ca2+,

Mg2+ và nhóm carboxyl.

1.1.1.2.4. Khả năng tạo kết cấu

Protein đậu nành có khả năng tạo sợi tốt. Khi protein bị phân ly, chuỗi

polypeptide duỗi mạch và cho qua khuôn đúc sẽ định hƣớng đƣợc các phân tử

protein và các sợi hình thành.

Trang 5

Đồ án tốt nghiệp

1.1.1.2.5. Khả năng tạo nhũ

Trong phân tử protein đậu nành có đầu ƣa nƣớc và ƣa béo nên có khả năng

làm bền hệ nhũ tƣơng chất béo/nƣớc.

Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tạo nhũ:

 pH: ở điểm đẳng điện, khả năng hòa tan là thấp nhất nên khả năng tạo

nhũ giảm.

 Nhiệt độ: gia nhiệt và cô đặc làm đông tụ protein nên làm giảm độ bền

của nhũ tƣơng, nhƣng do khả năng tạo gel đã tạo nên lớp màng protein và chất béo

(tàu hũ ki).

1.1.2. Quy trình sản xuất đậu hũ

1.1.2.1. Quy trình sản xuất đậu hũ

Trang 6

Đồ án tốt nghiệp

Đậu nành

Loại bỏ tạp chất

Ngâm hạt

Đãi vỏ

Xay ƣớt

Dịch sữa đậu thô

Bã Lọc

Sữa đậu

Gia nhiệt

Nƣớc chua

Kết tủa

Nƣớc Ép

Đậu hũ

Hình 1.1. Sơ đồ quy trình sản xuất đậu hũ

Trang 7

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2.2. Thuyết minh quy trình

1.1.2.2.1 Loại bỏ tạp chất

Mục đích: loại bỏ các tạp chất cơ học nhƣ hạt sâu mọt, rơm, hạt lép khô, đất,

đá,… có trong nguyên liệu.

1.1.2.2.2. Ngâm hạt

Mục đích: ngâm hạt nhằm mục đích làm hạt đậu hút nƣớc và trƣơng nở, làm

mềm cấu trúc hạt đậu, dễ dàng cho công đoạn xay đậu và trích lọc protein đậu nành.

Khi đó các phần tử nƣớc có tính lƣỡng cực sẽ tác động lên protein, lipid, glucid,

cellulose.

Quá trình này xảy ra hai giai đoạn:

 Giai đoạn đầu xảy ra quá trình solvat hóa. Ở giai đoạn này các liên kết

trong hạt đậu chƣa bị phá vỡ.

 Giai đoạn hai xảy ra khi các phân tử nƣớc tiếp tục tác động và làm

phá vỡ liên kết các phân tử trong hạt đậu, chuyển chúng sang trạng thái dịch

thể keo linh động nằm trong các tế bào hạt đậu.

Thời gian ngâm:

 Nhiệt độ ngoài trời từ 15oC – 25oC, ta ngâm 5 – 6 giờ.

 Nhiệt độ ngoài trời từ 25oC – 30oC, ta ngâm 3 – 4 giờ.

 Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đậu đạt 55% - 65% là tốt

nhất.

1.1.2.2.3. Đãi vỏ

Mục đích: Sau khi ngâm, vỏ tách khỏi hạt đậu nành, tránh một số thành phần

không mong muốn có trong vỏ hạt nhƣ sắc tố, chất chát,… đi vào sữa đậu khi

xay, làm giảm chất lƣợng của đậu hũ.

1.1.2.2.4 Xay

Mục đích: Dùng lực cơ học để phá vỡ tế bào, nhằm giải phóng protein, lipid,

glucid,... Nhờ có nƣớc hòa tan các chất này và sẽ chuyển chúng sang dạng huyền

phù.

Trang 8

Đồ án tốt nghiệp

Các biến đổi:

 Kích thƣớc hạt đậu nành giảm đáng kể thành các hạt mịn.

 Nhiệt độ tăng do ma sát giữa các hạt rắn trong quá trình xay.

 Hóa lý: đây là biến đổi quan trọng vì các chất dinh dƣỡng trong đậu

nành đƣợc trích ly vào nƣớc, đậu nành chuyển từ trạng thái hạt rời thành hỗn hợp

huyền phù gọi là sữa đậu nành thô.

 Hóa sinh: có thể xảy ra phản ứng oxy hóa do enzyme lipoxygenase

xúc tác. Enzyme này đƣợc giải phóng ra khi tế bào hạt đậu bị phá vỡ. Tuy nhiên,

phản ứng xảy ra không đáng kể vì quá trình xay đƣợc thực hiện trong nƣớc.

1.1.2.2.5. Lọc

Sau khi xay ta có một dung dịch huyền phù, gồm có dung dịch keo và

những chất rắn không tan trong nƣớc. Trong quá trình tách dung dịch keo khỏi

các chất rắn sẽ xảy ra hiện tƣợng các chất rắn sẽ giữ trên mặt nó những tiểu

phần keo, vì vậy phải dùng nƣớc rửa lại phần bã. Lƣợng nƣớc dùng để rửa

không nên quá nhiều.

1.1.2.2.6. Gia nhiệt

Mục đích gia nhiệt:

 Ức chế enzyme và tiêu diệt toàn bộ các hệ vi sinh vật có mặt trong sữa.

 Loại bỏ những hợp chất gây mùi khó chịu trong dịch sữa.

 Phá vỡ lớp solvat (lớp nƣớc bao quanh) tạo điều kiện cho các phần tử

sữa gần lại nhau hơn và dễ keo tụ hơn.

Các biến đổi:

 Độ nhớt của dịch sữa giảm khi nhiệt độ tăng.

 Một số phản ứng phân hủy xảy ra làm tổn thất các thành phần dinh

dƣỡng trong dịch sữa.

 Các thành phần đƣờng khử và acid amin tham gia phản ứng Maillard

làm cho dịch sữa bị sậm màu.

1.1.2.2.7. Kết tủa

Một số phƣơng pháp kết tủa protein đậu nành:

Trang 9

Đồ án tốt nghiệp

- Kết tủa bằng ion kim loại kiềm thổ kết hợp với nhiệt độ.

 Các muối đông tụ protein đậu nành: CaSO4, MgSO4, CaCl2, MgCl2…

 Quá trình cho chất đông tụ vào đơn giản, dễ kiểm soát, có thể chỉ cho

một lần vào dung dịch.

 Cơ chế đông tụ: đông tụ bằng muối của ion kim loại kiềm thổ xảy ra

theo hai bƣớc:

+ Bƣớc 1: protein bị biến tính bởi nhiệt, các mạch polypeptide duỗi ra

làm lộ các gốc –COO-.

+ Bƣớc 2: cation hóa trị 2 (kim loại kiềm thổ) cho vào sẽ liên kết các

mạch protein lại với nhau nhờ các gốc –COO-, làm cho khối protein bị đông tụ.

- Kết tủa bằng acid thực phẩm kết hợp với nhiệt độ.

 Các acid thực phẩm đƣợc dùng làm tác nhân gây đông tụ protein nhƣ:

acid acetic, acid lactic, acid citric, glucono – delta – lactone (GDL)… Trong các

acid nói trên, acid lactic đƣợc sử dụng nhiều nhất.

 Acid lactic: có dạng lỏng, không thuận lợi cho việc vận chuyển, sử

dụng. Ở các cơ sở sản xuất đậu hũ quy mô gia đình, ngƣời ta dùng nƣớc chua – là

acid lactic đƣợc tạo ra bằng cách lên men phần nƣớc trong của sữa đậu nành sau khi

tách protein.

 Cơ chế đông tụ:

+ Bƣớc 1: nhiệt sẽ làm biến tính protein, các mạch polypeptide duỗi ra và

sẽ làm lộ ra các nhóm kỵ nƣớc nằm bên trong.

+ Bƣớc 2: acid hữu cơ cho vào sẽ cung cấp H+ trung hòa các điện tích âm

của các mạch polypeptide bị biến tính bởi nhiệt, giúp tạo các liên kết kỵ nƣớc và

disunfide, dẫn đến sự tập hợp protein.

Bảng 1.4. So sánh hai phƣơng pháp đông tụ protein trong sữa đậu nành

Các yếu tố Đông tụ bằng acid thực phẩm Đông tụ bằng CaSO4

Sản phẩm có pH = 5 – 5,5, khả Thời gian bảo quản Sản phẩm có pH = 6 – 6,8

nên thời gian bảo quản năng ức chế vi sinh vật cao nên

ngắn. bảo quản lâu hơn.

Trang 10

Đồ án tốt nghiệp

Không có mùi thơm đặc Có mùi thơm đặc trƣng của đậu Mùi vị

trƣng của đậu nành nành

Bìa đậu mềm, cầm dẻo tay, màu Trạng thái bìa đậu Bìa đậu bị cứng, ngả màu

vàng trắng kem

Để lại dƣ lƣợng kim loại An toàn cho sức khỏe ngƣời Ảnh hƣởng đến sức

nặng nhƣ Cu, Pb, Hg… dùng khỏe ngƣời dùng

gây nguy hiểm cho sức

khỏe con ngƣời

1.1.2.2.8. Ép và định hình thành khuôn bánh

Sau khi chắt gạn nƣớc xong, cho ngay hoa đậu kết tủa vào khuôn ép để loại

nƣớc, tạo khối cho sản phẩm. Thời gian ép định hình khoảng 10 phút, dùng vật nặng

với khối lƣợng cố định để ép.

1.1.3. Các chỉ tiêu chất lượng của đậu hũ

Bảng 1.5. Chỉ tiêu cảm quan của đậu hũ (TCVN 4978 : 1997)

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

Sản phẩm có dạng hình hộp đáy chữ nhật, không bị vỡ nát. Hình dạng

Cho phép không quá 20% sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ.

Khối lƣợng sản phẩm bị mất góc và sứt mẻ không quá 5%.

Bề mặt màu trắng ngà, mặt cắt màu trắng Màu sắc

Mùi thơm, vị ngon của đậu hũ không có mùi ôi, chua, khê và Mùi vị

các mùi vị lạ khác.

Không có cát sạn, mảnh vụn của cháy đậu và các loại tạp chất Tạp chất

khác.

Bề mặt đậu hũ mịn, sờ vào hơi ráp tay, không mủn bột. Khi Trạng thái

sản xuất xong, để nguội ở nhiệt độ phòng, đậu hũ phải dẻo,

khi cầm ở giữa miếng đậu không bị nứt. Mặt cắt của đậu hũ

Trang 11

Đồ án tốt nghiệp

mịn, nhẵn. trên mặt cắt ngang của đậu hũ có lỗ hổng không

quá 3. Ăn sống có cảm giác béo ngậy, dai. Miếng đậu khi ráng

phải nở đều.

Bảng 1.6. Chỉ tiêu vi sinh của đậu hũ (Lê Văn Việt Mẫn, 2011)

Vi sinh vật Giới hạn cho phép trong 1g sản phẩm

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (cfu/g) 3.105

Coliforms 50

Escherichia coli 3

Clostridium perfringens 0

Salmonella 0

Bacillus cereus 10

Staphylococcus aureus 10

Clostridium botulinum 0

Bảng 1.7. Chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ (TCVN 49 : 78)

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

Hàm lƣợng nƣớc 83%

Hàm lƣợng protein 10%

Hàm lƣợng lipid 4.5%

Hàm lƣợng chất xơ 0.7%

Độ chua tính theo % trọng lƣợng (tính 0,9 0,1

theo acid acetic)

Tạp chất và bã cháy Không có

Trang 12

Đồ án tốt nghiệp

1.1.4. Những nguyên nhân và biến đổi gây hư hỏng đậu hũ

1.1.4.1. Những nguyên nhân gây hư hỏng đậu hũ

Có 2 nguyên nhân cơ bản dẫn đến giảm chất lƣợng và hƣ hỏng thực phẩm:

do hoạt động của vi sinh vật và do hoạt động sinh lý, sinh hóa của nguyên liệu.

Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ độ ẩm môi trƣờng, ánh sáng, không khí cũng ảnh

hƣởng không nhỏ tới chất lƣợng của thực phẩm.

Các vi sinh vật gây hƣ hỏng bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và một

số loại tảo, kí sinh trùng, virus... Khi xâm nhập vào thực phẩm, đầu tiên vi sinh vật

sẽ phát triển về mặt số lƣợng, trong quá trình đó chúng tiết ra các sản phẩm thải,

làm biến đổi màu sắc, trạng thái, mùi vị của thực phẩm dẫn đến hƣ hỏng hoặc giảm

chất lƣợng thực phẩm.

Vi khuẩn có khả năng tiết ra nhiều enzyme hỗn hợp có thể phân hủy đƣợc tất

cả các thành phần protein, glucid, lipid có trong thực phẩm. Sự lên men glucid hình

thành các acid hữu cơ làm cho môi trƣờng trở nên acid. Trong quá trình này, các

acid đƣợc tạo thành nhƣ acid acetic, acid lactic, … ức chế vi sinh vật gây thối. Nấm

men, nấm mốc tiêu thụ các acid làm cho môi trƣờng trở nên trung tính. Vi sinh vật

gây thối bắt đầu phát triển chuyển hóa protid thành peptid, acid amin,… và cuối

cùng là các chất đơn giản bay hơi có mùi khó chịu nhƣ NH3, H2S, indol, phenol,…

Quá trình hƣ hỏng đậu hũ luôn bắt đầu từ bề mặt sau đó mới đi dần vào bên

trong. Thƣờng trong giai đoạn đầu các vi khuẩn chứa enzyme hỗn hợp sẽ nhân lên

trƣớc và hoạt động mạnh mẽ để khai phá nguyên liệu, sau đó đến lƣợt các vi khuẩn

chứa enzyme đơn tiến hành phân hủy thực phẩm một cách mạnh mẽ và triệt để.

Cùng với các enzyme do vi sinh vật tiết ra thì đồng thời những enzyme có sẵn trong

bản thân khối thực phẩm cũng bị kích hoạt và tham gia vào các phản ứng phân hủy

làm tăng tốc độ hƣ hỏng của thực phẩm.

Đậu hũ là loại thực phẩm chứa nhiều protein, glucid và lipid. Mặt khác, hàm

lƣợng nƣớc trong đậu hũ rất cao, đây là môi trƣờng thuận lợi cho vi sinh vật gây hƣ

hỏng phát triển.

Trang 13

Đồ án tốt nghiệp

1.1.4.2. Những biến đổi của đậu hũ trong quá trình hư hỏng

- Biến đổi protein:

Từ các chất đạm tạo ra các chất nhƣ: amoniac, phenol, indol…và các amin

nhƣ: putresin, tyramin, histamin,…

Yếu tố quyết định tốc độ quá trình hƣ hỏng là nhiệt độ, độ ẩm tƣơng đối của

không khí và mức độ nhiễm vi sinh vật ban đầu. Quá trình biến đổi protein thể hiện

qua các dạng thối rữa, lên mốc, đổi màu, hóa nhầy…

- Sự lên men thối: quá trình lên men thối đƣợc chia làm 3 giai đoạn:

 Quá trình thủy phân protein dƣới tác dụng của enzyme protease do vi sinh

vật tiết ra tạo thành nhiều sản phẩm trung gian và cuối cùng là acid amin.

 Quá trình khử acid amin thành amoniac, acid (acetic, propyonic, butyric),

rƣợu (propyolic, butylic, amylic), H2S, indol, skatol.

 Các chất hữu cơ đƣợc tạo thành do sự phân hủy sơ bộ acid amin lại tiếp

tục chuyển hóa. Tùy theo loại vi sinh vật và điều kiện môi trƣờng mà các hợp chất

đó bị oxy hóa hoàn toàn cho ra các hợp chất vô cơ nhƣ CO2, H2O, NH3, H2S. Trong

điều kiện kỵ khí sẽ cho ra các acid hữu cơ, rƣợu, amin, trong đó có nhiều chất độc

và mùi hôi thối.

Các vi khuẩn hiếu khí hoạt động mạnh nhƣ Bacterium Vulgaris, Bacterium

Paecalis, Pseudomonas Fiuoresen,… vi khuẩn yếm khí nhƣ Bacillus Spectogennes,

Bacillus Putripicus, Bacillus Putripiciens, Bacillus Postamus, Clostridium

Butulinum, Clostridium Sporogenes…

- Sự lên men chua:

Trong quá trình lên men chua xảy ra hàng loạt các quá trình: quá trình tăng

sinh khối của vi sinh vật tạo ra acid lactic, quá trình ức chế sự phát triển của vi

khuẩn gây thối bởi acid lactic và muối. Quá trình này xảy ra 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: đƣờng và các chất hòa tan có trong dịch bào của mô thực vật

đƣợc thẩm thấu ra ngoài tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật khác

phát triển.

Trang 14

Đồ án tốt nghiệp

 Giai đoạn 2: Trong giai đoạn này, sinh khối của vi khuẩn lactic đạt cao

nhất. Đồng thời acid lactic tích tụ nhiều, pH của dịch giảm. Do tác dụng của vi

khuẩn lactic mà các vi khuẩn gây thối phát triển rất nhanh. Cuối giai đoạn này

lƣợng acid lactic tích tụ cực đại nên quá trình chyển sang giai đoạn 3.

 Giai đoạn 3: Vi khuẩn lactic chết dần trong khi nấm mốc và nấm men lại

tăng dần số lƣợng. Acid lactic bắt đầu giảm nên sản phẩm hƣ hỏng nhanh.

- Biến đổi lipid:

 Sự hóa chua lipid (sự thủy phân): sự tạo thành gốc tự do do hoạt động của

enzyme. Dạng phân giải lipid này liên quan đến cả hai quá trình thủy phân lipid và

sự oxy hóa acid béo do hoạt động của enzyme lipoxydase. Quá trình thủy phân lipid

gây ra do vi sinh vật hoặc enzyme lipase nội tại. Bƣớc đầu tiên của phản ứng này là

sự thủy phân triglyceride tạo thành glycerol và các acid béo tự do. Glycerol làm

tăng độ nhớt, nhầy của chất béo. Các acid béo tạo ra càng nhiều càng làm cho thực

phẩm bị chua (chỉ số acid tăng cao, chất lƣợng chất béo giảm).

 Oxy hóa: dƣới tác động của enzyme lipoxydase và oxy không khí. Sau khi

thủy phân các sản phẩm glycerin và các chất béo tiếp tục bị oxy hóa tạo ra nhiều sản

phẩm khác nhau, trong đó nhiều sản phẩm độc hại nhƣ: peroxyde, hydroperoxyde,

ceton,… Các sản phẩm này làm cho thực phẩm có mùi khó chịu.

1.2. Tổng quan về chitin - chitosan

1.2.1. Giới thiệu về chitin – chitosan

Chitin, chitosan là những polysaccharide tồn tại trong tự nhiên với sản lƣợng

rất lớn (đứng thứ 2 sau cellulose).

Chitin lần đầu tiên đƣợc tìm thấy trong nấm bởi nhà khoa học ngƣời Pháp

Braconnot vào năm 1811, nó cũng đƣợc tách ra từ biểu bì của sâu bọ và đƣợc đặt

tên là chitin, có nghĩa là bao bọc, tức là vỏ bọc của cuộc sống trong tiếng Hy Lạp,

bởi nhà khoa học ngƣời Pháp Odier vào năm 1823.

Và chất đƣợc khử acetyl từ chitin đã đƣợc khám phá bởi Roughet vào năm

1859, nó đƣợc đặt tên là chitosan bởi nhà khoa học ngƣời Ðức Hoppe Seyler vào

năm 1894. Chitosan (đƣợc chuyển hoá từ chitin) rất độc đáo, là polymer hữu cơ tự

Trang 15

Đồ án tốt nghiệp

nhiên duy nhất mang điện tích dƣơng do có những nhóm amino tự do tích điện

dƣơng, điều này khiến cho chitosan có những thuộc tính đặc biệt hơn nhóm amide

của chitin.

Cho đến hôm nay, việc sử dụng hợp chất thiên nhiên này vẫn còn rất ít, vì

chitin/chitosan dù dồi dào nhƣng lại ở các nguồn phân tán quá rộng, đặc biệt hàm

lƣợng chứa trong các nguồn ấy thƣờng nhỏ, không đạt hiệu quả kinh tế (giá thành

điều chế chitosan còn rất đắt). Hơn nữa, cả chitin và chitosan đều rất khó tan trong

các dung môi thông thƣờng và các phản ứng hoá học nhằm biến tính chúng đều tốn

kém và có hiệu suất thấp.

1.2.2. Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan

1.2.2.1. Cấu trúc hóa học của chitin

Chitin là polysaccharide mạch thẳng, có thể xem nhƣ là dẫn xuất của

cellulose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) đƣợc thay thế bằng nhóm acetyl

amino (-NHCOCH3) (cấu trúc I). Nhƣ vậy chitin là poly-(N-acety-2-amino-2-

deoxy-β-D-glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β-(C-1-4) glycoside.

Trong đó các mắt xích của chitin cũng đƣợc đánh số nhƣ của glucose.

Hình 1.2. Cấu tạo hóa học của chitin

Tên gọi: poly(1 – 4) – 2- acetamido – 2 – deoxy – β- D- Glucose

Trang 16

Đồ án tốt nghiệp

Công thức phân tử : [ C8H13O5N ]n

Phân tử lƣợng: Mchitin = (203,09)n

1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của chitosan

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế

nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2).

Chitosan đƣợc cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau bởi

các liên kết β-(1-4)-glycozide, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1,4)-2-amino-2-

deoxy-D-glucose hoặc là poly β-(1,4)-D-glucosamine (cấu trúc III).

Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của chitosan

Tên gọi: Poly(1,4) – 2- amino- 2- deoxy- β- D- glucose

Công thức phân tử: [ C6H11O4N ]n

Phân tử lƣợng: Mchitosan= (161,07)n

Qua cấu trúc hóa học của chitin và chitosan, ta thấy chitin chỉ có 1 nhóm

chức hoạt động là –OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hidoxyl

bậc 2 trong vòng 6 cạnh), còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH và –NH2,

do đó dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin.

Chitin có cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ở dạng rắn. Do

đó, các phƣơng pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, phƣơng pháp hoá học để

Trang 17

Đồ án tốt nghiệp

biến tính chitin cũng nhƣ việc sử dụng và lựa chọn các ứng dụng của chitin gặp

nhiều khó khăn.

Mặt khác, khả năng ứng dụng của chitin thƣờng thấp hơn so với các dẫn xuất

của nó nhƣ chitosan, glucosamine, vì vậy chitin thƣờng đƣợc sử dụng để điều chế

các dẫn xuất của nó. Chitosan là một chất có nhiều đặc tính hóa học thích hợp nên

đƣợc nghiên cứu sử dụng trong nhiều ngành lĩnh vực.

1.2.3. Tính chất của chitosan

1.2.3.1. Mức độ deacetyl hóa

Quá trình deacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân

tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao.

Mức độ deacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi

vì nó ảnh hƣởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này.

Mức độ deacetyl hóa của chitosan vào khoảng 56% - 99% (nhìn chung là 80%)

phụ thuộc vào loài giáp xác và phƣơng pháp sử dụng. Chitin có mức độ deacetyl

hóa khoảng 75% trở lên thƣờng đƣợc gọi là chitosan.

Phƣơng pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm thử

ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI…

1.2.3.2. Trọng lượng phân tử

Chitosan là polymer sinh học có khối lƣợng phân tử cao. Giống nhƣ cấu tạo,

khối lƣợng nguồn nguyên liệu và phƣơng pháp chế biến. Khối lƣợng chitin thƣờng

lớn hơn 1 triệu Da trong khi các sản phẩm chitosan thƣơng phẩm có khối lƣợng

khoảng 100,000 – 1,200,000 Da, phụ thuộc quá trình chế biến và loại sản phẩm.

Thông thƣờng, ở nhiệt độ cao, sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân

hủy chitosan. Giới hạn nhiệt độ là 280°C, sự phân hủy do nhiệt xảy ra và mạch

polymer nhanh chóng bị phá vỡ, do đó khối lƣợng phân tử giảm.

1.2.3.3. Độ nhớt

Độ nhớt là một nhân tố quan trọng để xác định khối lƣợng phân tử của

chitosan. Chitosan phân tử lƣợng cao thƣờng làm cho dung dịch có độ nhớt cao,

điều này có thể không mong muốn trong đóng gói công nghiệp.

Trang 18

Đồ án tốt nghiệp

Một số nhân tố trong quá trình sản xuất nhƣ mức độ deacetyl hóa, khối

lƣợng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ ảnh

hƣởng đến sản xuất chitosan và tính chất của nó. Quá trình loại protein trong dung

dịch NaOH 3% và sự khử trong quá trình khử khoáng làm giảm độ nhớt của dung

dịch chitosan thành phẩm. Tƣơng tự nhƣ vậy, độ nhớt của chitosan bị ảnh hƣởng

đáng kể bởi các biện pháp xử lý vật lý (nghiền, gia nhiệt, hấp khử trùng, siêu âm)

và hóa học (xử lý bằng ozone), trừ quá trình làm lạnh thì độ nhớt sẽ giảm khi thời

gian và nhiệt độ xử lý tăng. Dung dịch chitosan bảo quản ở 4°C đƣợc cho là ổn

định nhất.

1.2.3.4. Tính tan

Chitin tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, trong khi đó chitosan tan

trong các dung dịch acid có pH dƣới 6,0. Các acid hữu cơ nhƣ acetic, formic

và lactic thƣờng đƣợc sử dụng để hòa tan chitosan. Thƣờng sử dụng nhất là dung

dịch chitosan 1% tại pH 4,0. Chitosan cũng tan trong dung dịch HCl 1% nhƣng

không tan trong H2SO4 và H3PO4. Dung dịch acid acetic nồng độ cao tại nhiệt độ

cao có thể dẫn đến depolymer hóa chitosan. Ở pH cao, có thể xảy ra hiện tƣợng kết

tủa hoặc đông tụ, nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp poly_ion với chất keo

anion.

Tỉ lệ nồng độ giữa chitosan và acid rất quan trọng. Ở nồng độ dung môi

hữu cơ cao hơn 50%, chitosan vẫn hoạt động nhƣ là một chất gây nhớt giúp cho

dung dịch mịn. Một số nhân tố ảnh hƣởng đến dung dịch chitosan bao gồm nhiệt

độ và thời gian quá trình deacetyl hóa, nồng độ các chất kiềm, việc xử lý sơ bộ,

kích thƣớc của các phần tử.

1.2.3.5. Khả năng kết hợp với nước (WBC) và khả năng kết hợp với chất béo

(FBC)

Sự hấp thụ nƣớc của chitosan lớn hơn rất nhiều so với cellulose hay chitin.

Thông thƣờng, khả năng hấp thụ của chitosan khoảng 581 - 1150% (trung bình là

702%), và sự thay đổi trong thứ tự sản xuất nhƣ quá trình khử khoáng và khử

protein cũng ảnh hƣởng đáng kể đến khả năng giữ nƣớc và giữ chất béo. Sự khử

Trang 19

Đồ án tốt nghiệp

protein sau quá trình khử khoáng sẽ làm khả năng giữ nƣớc tăng. Bên cạnh đó

quá trình khử màu cũng là nguyên nhân làm giảm khả năng này của chitosan.

Khả năng hấp thụ chất béo của chitin và chitosan trong khoảng 315 - 170%,

chitosan có khả năng thấp hơn rất nhiều chitin. Bƣớc tẩy trắng trong quá trình sản

xuất làm giảm khả năng này cũng nhƣ ảng hƣởng đến độ nhớt của chitosan. Các

bƣớc tiến hành theo thứ tự: khử khoáng, khử protein, deacetyl hóa sẽ làm tăng khả

năng này hơn là theo thứ tự khử protein, khử khoáng, deacetyl hóa.

1.2.3.6. Khả năng tạo màng

Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm nhằm

hạn chế các tác nhân gây bệnh trong các sản phẩm đóng gói thịt, cá tƣơi hay đã qua

chế biến.

 Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng không

khí cho thực phẩm. Nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế,

nƣớc sẽ bị ngƣng đọng tạo môi trƣờng cho nấm mốc phát triển.

 Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tƣơng đƣơng với

một số chất dẻo vẫn đƣợc dùng làm bao gói.

 Màng chitosan làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả. Rau quả

sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lƣợng và giá trị. Rau quả

bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polymer hóa của oquinon. Nhờ

bao gói bằng màng chitosan mà ức chế đƣợc hoạt tính oxy hóa của các polyphenol,

làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lƣợng các hợp chất phenol ít

biến đổi, giữ cho rau quả tƣơi lâu hơn.

Cách tạo màng chitosan:

 Chitosan đƣợc nghiền nhỏ bằng máy để gia tăng bề mặt tiếp xúc.

 Pha dung dịch chitosan 3% trong dung dịch acid acetic 1,5%.

 Sau đó bổ sung chất phụ gia PEG - EG 10% (tỷ lệ 1:1) vào và trộn

đều, để yên một lúc để loại bọt khí.

 Sau đó đem hỗn hợp thu đƣợc quét đều lên một ống inox đã đƣợc

nung nóng ở nhiệt độ 64 - 65°C (ống inox đƣợc nâng nhiệt bằng hơi nƣớc).

Trang 20

Đồ án tốt nghiệp

 Để khô màng trong vòng 35 phút rồi tách màng.

 Lúc này ngƣời ta thu đƣợc một vỏ bóng có màu vàng ngà, không

mùi vị, đó là lớp màng chitosan có những tính năng mới ƣu việt.

1.2.3.7. Tính kháng khuẩn của chitosan

Cơ chế chính xác về hoạt động kháng khuẩn của chitosan, chitin và các dẫn

xuất của chúng vẫn chƣa đƣợc biết đến đầy đủ. Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chế

đƣợc quan tâm:

- Cơ chế thứ nhất:

Chitosan là đại phân tử tích điện dƣơng, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa

số tích điện âm, do đó xảy ra tƣơng tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị

hƣ hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện

những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo

của tế bào bị thoát ra ngoài dẫn đến tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon,

1999).

Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm

kháng lại E.coli, ngƣời ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm

tăng ảnh hƣởng của chitosan đến vi khuẩn. Nghiên cứu cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi

khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim

loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung

chitosan vào môi trƣờng, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện

dƣơng. Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp

hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện

dƣơng ở màng của vi khuẩn. Chitosan N – carboxybutyl – một polycation tự nhiên,

có thể tƣơng tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid có trên bề mặt vi

khuẩn, do đó làm dính kết một lƣợng vi khuẩn với nhau.

Cũng từ thí nghiệm này ngƣời ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hƣởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan nhƣ K+, Na+, Mg2+ và Ca2+. Nồng độ lớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hƣởng của Na+

đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus. Ngƣời ta cũng thấy rằng chitosan

Trang 21

Đồ án tốt nghiệp

có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn. Khi sử dụng chitosan thì một lƣợng lớn các ion K+ và ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus

aureus và nấm Candida albicans. Cả chitosan phân tử lƣợng 50 kDa và 5 kDa đều

kháng tốt hai loại trên nhƣng chitosan phân tử lƣợng 50 kDa làm mất nhiều gấp 2 - 4 lần ion K+ và ATP so với chitosan 5 kDa. Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn

khác nhau ở chitosan khối lƣợng phân tử thấp và cao. Hoạt động kháng khuẩn của

chitosan phân tử lƣợng khác nhau đã đƣợc nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn. Cơ chế

kháng khuẩn này đã đƣợc chứng minh dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào

vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra rằng khả năng này

giảm khi khối lƣợng nguyên tử tăng và tăng cao ở nồng độ pH thấp, giảm rõ rệt khi có mặt ion Ca2+, Mg2+. Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0,03 – 0,25%, thay đổi tùy

từng loài vi khuẩn và khối lƣợng phân tử của chitosan. Đối với vi khuẩn gram

dƣơng, chitosan 470 kDa có ảnh hƣởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus spp.,

trong khi với vi khuẩn gram âm, chitosan có khối lƣợng 1106 kDa mới có ảnh

hƣởng. Điều này là do vi khuẩn gram dƣơng nhạy cảm hơn, vi khuẩn gram âm có

lớp màng chắn bên ngoài (Zhong và cộng sự, 2008).

Theo Ming Kong và cộng sự (2008), tất cả các vi khuẩn gram âm có một

màng ngoài do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS). Sự ổn định của lớp

LPS thông qua tƣơng tác tĩnh điện với các cation hóa trị 2. Giống nhƣ EDTA,

chitosan loại bỏ các cation, việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng

ngoài.

Cơ chế hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn gram

dƣơng và gram âm (Zheng & Zhu, 2003). Trong nghiên cứu này, họ phân biệt tác

động của chitosan trên Staphylococcus aureus (gram dƣơng) và Escherichia coli

(gram âm). Đối với Staphylococcus aureus, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng

trọng lƣợng phân tử của chitosan. Trong khi đó, với E.coli, hoạt động kháng khuẩn

tăng lên khi giảm trọng lƣợng phân tử. Các tác giả gợi ý hai cơ chế khác nhau cho

hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trƣờng hợp của Staphylococcus aureus, các

chitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một màng polymer, ức chế các

Trang 22

Đồ án tốt nghiệp

chất dinh dƣỡng đi vào tế bào. (2) Đối với E.coli, chitosan trọng lƣợng phân tử thấp

sẽ đi vào các tế bào thông qua sự lan tỏa.

- Cơ chế thứ hai:

Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các

tƣơng tác làm biến đổi ADN, ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin và

tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các

thành phần dinh dƣỡng của vi sinh vật…(Sudarshan và cộng sự, 1992)

- Các cơ chế khác:

Chitosan kích hoạt một số hàng rào phòng thủ trên tế bào chủ: tiếp xúc với

các mô thực vật và kích thích tiết ra các enzyme bảo vệ nhƣ chitinase, chitosanase,

 - 1,3 - glucanase,... từ đó tiêu diệt vi sinh vật. Cơ chế này không đúng trong

trƣờng hợp sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì

khi đó chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với

các mô thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật.

Chitosan hoạt động nhƣ một tác nhân kìm hãm, liên kết có chọn lọc với kim

loại dạng vết do đó ức chế sự sản xuất chất độc và tăng trƣởng vi sinh vật (Cuero,

Osuji, Washington, 1991).

Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan:

- Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt động

ức chế vi khuẩn và nấm. Một trong các đồng phân của chitosan là N - carboxybutyl

chitosan có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh. Khi có

chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự

phát triển của những loài này. Ở nồng độ 0,1% và pH 5,6, chitosan kháng các loại

nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những

vi sinh vật mà trên thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitin – ß – glucan.

- Chitosan đã đƣợc cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật và

Hàn Quốc lần lƣợt từ năm 1983 và 1995. Chính hoạt động ức chế vi khuẩn của

chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó

có chức năng tăng cƣờng hoạt động kháng khuẩn nhƣ là một chất bảo quản tự

Trang 23

Đồ án tốt nghiệp

nhiên. Ở pH 5,5, với nồng độ 0,5 - 1% chitosan có tác dụng ức chế đến các loài

Staphylococcus aureus, E.coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes. Ở

pH 6,5 chỉ có Staphylococcus aureus bị ức chế ở nồng độ 0,5% trong khi các loài

khác vẫn phát triển ở nồng độ 2,5% (nồng độ cao nhất đã đƣợc nghiên cứu).

Chitosan phân tử nhỏ có tính kháng các tác nhân gây bệnh trên thực vật mạnh

hơn rất nhiều các chất phân tử lớn.

- Các hợp chất chitosan lactate và chitosan hydroglutamate cũng đƣợc sử

dụng nhƣ là tác nhân ức chế E.coli, Staphylococcus aureus và Saccharomyces

cerevisiae. Nồng độ chitosan lactate trong nƣớc cất có ảnh hƣởng mạnh nhất đến E.coli. Chƣa đến 1h, số lƣợng vi khuẩn này giảm khoảng 104, còn Staphylococcus aureus giảm đến 106. Đối với nấm men, chúng hoàn toàn ngừng hoạt động ở

nồng độ 1 mg/ml chitosan lactate sau 17 phút.

Độc tính của chitosan:

- Nghiên cứu về độ an toàn, độ độc tích lũy:

Chitosan đƣợc thử độ an toàn (LD50) trên 123 chuột trắng (18 – 21 g) chia 5

đợt, với liều lƣợng tăng dần 0,0025 - 0,020 g/ngày cho mỗi chuột. Theo dõi liên tục

trong 72 giờ. Kết quả chuột vẫn khỏe mạnh, không chuột nào chết.

Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02 g một ngày cho

một chuột, cho uống liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh bình thƣờng.

- Độc tính cấp:

Trên 5 lô chuột nhắt trắng (50 con) cho uống chitosan với liều lƣợng 9 g/kg

cân nặng, theo dõi liên tục 72 giờ: không có chuột nào chết, suy ra chỉ số điều trị là

250g theo đƣờng uống, chứng tỏ chitosan dùng an toàn.

- Độc tính tại chỗ

Kết quả nghiên cứu dƣợc lý cho thấy chitosan không gây tổn thƣơng các cơ

quan, không gây phù nề tại chỗ, không gây phản ứng giãn mạch tại chỗ trên thỏ và

chuột cống thực nghiệm.

- Kết quả

Trang 24

Đồ án tốt nghiệp

Chitosan đƣợc thử trên động vật thực nghiệm(chuột nhắc, chuột cống, thỏ),

kết quả cho thấy: chitosan không gây độc tính tại chỗ, không ảnh hƣởng đối với

trọng lƣợng cơ thể, trọng lƣợng gan, cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu hóa sinh trong

nƣớc tiểu của động vật thực nghiệm.

1.2.4. Các phương pháp thu nhận chitosan

Chitosan đƣợc sản xuất theo quy trình nhƣ sau:

Trang 25

Đồ án tốt nghiệp

Vỏ tôm

Rửa sạch, loại bỏ tạp chất

Xử lý NaOH 5%, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ phòng, 24h

Xử lý với Flavourzyme: tỷ lệ enzyme/phế liệu: 0,2% (w/w), nhiệt độ phòng, 24h

Rửa trung tính

Xử lý HCl 4%, thời gian 12h, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ phòng

Rửa trung tính

Làm khô

Chitin

Chuyển chitin thành chitosan:

Ngâm trong NaOH 60%, tỷ lệ 1:5 (w/v), nhiệt độ 65oC, thời gian 20h

Rửa trung tính

Làm khô

Chitosan

Trang 26

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4. Sơ đồ sản xuất và thu nhận chitosan

Theo Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007), hiện nay có hai nhóm

phƣơng pháp sản xuất chitin từ vỏ giáp xác là phƣơng pháp hóa học và sinh học,

trong đó phƣơng pháp hóa học tách chiết chitin là phƣơng pháp đã có từ rất lâu và

ngày nay vẫn là phƣơng pháp chính đƣợc áp dụng trong sản xuất polymer sinh học

này, còn phƣơng pháp sinh học mới đƣợc nghiên cứu áp dụng trong thời gian gần

đây với mục đích thay thế phƣơng pháp hóa học truyền thống tiêu hao nhiều hóa

chất và gây ô nhiễm môi trƣờng. Hai nhóm phƣơng pháp này giống nhau ở điểm là

chúng đều đƣợc thực hiện theo 3 công đoạn chính đó là: loại khoáng, loại protein,

loại các chất màu, tuy trình tự các công đoạn có thể phụ thuộc vào từng phƣơng

pháp cụ thể. Điểm khác nhau căn bản của hai nhóm phƣơng pháp này là ở cách loại

protein. Trong các phƣơng pháp sinh học, protein bị loại trong những điều kiện rất

“mềm” nhờ sử dụng hoạt tính proteolytic (phân hủy protein) của các enzyme thuộc

nhóm proteinase, còn trong các phƣơng pháp hóa học protein bị loại bằng acid và

kiềm.

Bảng 1.8. Tính chất chitosan sản xuất từ chitin chiết rút bằng phƣơng pháp hóa học

và sinh học (Phạm Thị Đan Phƣợng và Trang Sĩ Trung, 2012)

Tính chất Chitosan từ chitin Chitosan từ chitin chiết

chiết rút bằng phƣơng rút bằng phƣơng pháp

pháp hóa học sinh học

Màu sắc Trắng sáng Hồng, đục

Hàm lƣợng tro 0,98 0,6 1,89 0,03

(%)

Hàm lƣợng protein 0,93 0,1 1,95 0,05

(%)

Độ nhớt (cps) 930 66 1358 62

Độ deacetyl (%) 84,2 0,9 80,1 1,3

Độ tan (%) 99,7 0,2 97,7 1,6

Trang 27

Đồ án tốt nghiệp

Độ đục (NTU) 26,3 2,8 42,2 6,4

Kết quả cho thấy chitosan sản xuất từ hai loại chitin với quá trình khử protein

khác nhau thì tính chất khác nhau. Sử dụng quy trình khử protein bằng phƣơng pháp

sinh học có hàm lƣợng protein và khoáng còn lại cao hơn so với phƣơng pháp hóa

học nên ảnh hƣởng đến chất lƣợng chitosan thu đƣợc. Bên cạnh đó, độ nhớt và độ

deacetyl của chitosan cũng bị ảnh hƣởng rõ rệt bởi chất lƣợng chitin ban đầu. Độ

nhớt của chitosan từ chitin khử protein bằng phƣơng pháp sinh học thì cao hơn

nhƣng độ deacetyl thì thấp hơn so với mẫu chitosan từ chitin khử protein bằng

phƣơng pháp hóa học. Độ nhớt cao của phƣơng pháp xử lý sinh học có thể do khi

xử lý bằng Flavourzyme thì chitin ít bị cắt mạch so với phƣơng pháp hóa học.

Nhƣng hàm lƣợng protein và khoáng còn lại trong chitin đã làm giảm hiệu quả của

quá trình deacetyl, dẫn đến chitosan từ chitin xử lý sinh học có độ deacetyl thấp

hơn.

Chitosan từ chitin khử protein bằng phƣơng pháp sinh học có thể ứng dụng

vào các lĩnh vực nhƣ nông nghiệp và xử lý môi trƣờng (chất kích thích sinh học,

keo tụ trong xử lý môi trƣờng…) với yêu cầu về độ tinh sạch không cao thì phƣơng

pháp xử lý sinh học là một sự lựa chọn hợp lý vì đây là phƣơng pháp sản xuất thân

thiện với môi trƣờng.

1.2.5. Chitosan tan trong nước (WSC)

1.2.5.1. Điều chế chitosan tan trong nước

Chitosan tan trong nƣớc (WSC) đƣợc điều chế theo phƣơng pháp acetyl hóa.

Hòa tan 25 g chitosan trong 500 ml dung dịch acid lactic 3% thu đƣợc dung dịch A. Sau đó cho 150 ml cồn 96o vào dung dịch A, khuấy đều đƣợc dung dịch B. Cho 15 ml anhydride acetic vào 150 ml cồn 96o, khuấy đều ta đƣợc dung dịch C. Cho từ từ

C vào B, khuấy đều để thực hiện phản ứng acetyl hóa trong 2 giờ. Dung dịch

chitosan đã acetyl hóa đƣợc điều chỉnh pH về 7 – 7,5 bằng NH4OH 5% và đƣợc kết tủa bằng cồn 96o. Lọc kết tủa qua vải, rửa kết tủa bằng cồn 96o vài lần, sau đó sấy quạt cho bay hết dung môi cồn 96o, thu đƣợc chitosan tan trong nƣớc.

Trang 28

Đồ án tốt nghiệp

Chitosan tan trong nƣớc đƣợc điều chế theo phƣơng pháp trên có độ deacetyl

hóa DDA = 60,1% và có khối lƣợng phân tử trung bình là 249790 Da (Nguyễn Thị

Thanh Hải, 2012).

1.2.5.2. Tính chất của WSC

Theo Ying Chien Chung (2011), hoạt động kháng khuẩn của chitosan hòa tan

trong nƣớc đƣợc đánh giá trên 6 loại vi sinh vật: Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes, B. cereus, E.coli, Shigella dysenteriae và Salmonella typhimurium

ở các pH khác nhau của chitosan hòa tan trong nƣớc và chitosan hòa tan trong acid.

Kết quả của bài báo cáo này kết luận rằng, khả năng kháng khuẩn của chitosan tan

trong nƣớc cao hơn chitosan tan trong acid.

Bảng 1.9. Bảng so sánh các tính chất của chitosan tan trong acid và chitosan

tan trong nƣớc

Chitosan từ Chitosan từ

chitin sản xuất chitin sản xuất Chitosan tan Tính chất bằng phƣơng bằng phƣơng trong nƣớc

pháp hóa học pháp sinh học

Màu sắc Trắng sáng Hồng, đục Vàng

Hàm lƣợng tro (%) 0,98 ± 0,6 1,89 ± 0,03 0,05 ± 0,003

Hàm lƣợng protein (%) 0,93 ± 0,1 1,95 ± 0,05 0,2 ± 0,01

Độ deacetyl (%) 84,2 ± 0,9 80,1 ± 1,3 87 ± 2

Độ tan (%) 99,7 ± 0,2 97,1 ± 1,6 > 99%

Ngoài khả năng kháng khuẩn cao của chitosan tan trong nƣớc thì theo bảng

1.9 cho thấy hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng của chitosan tan trong nƣớc

thấp hơn so với chitosan tan trong acid nên có độ tan tƣơng đối cao (> 99%). Do

hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng của chitosan tan trong acid cao hơn

chitosan tan trong nƣớc nên độ deacetyl hóa của chitosan tan trong acid thấp hơn so

với chitosan tan trong nƣớc.

Trang 29

Đồ án tốt nghiệp

Tóm lại, chitosan tan trong nƣớc có độ tan tƣơng đối cao, độ deacetyl cao

hơn và khả năng kháng khuẩn của chitosan tan trong nƣớc tốt hơn chitosan tan

trong acid.

1.2.6. Ứng dụng của chitosan trong thực phẩm

1.2.6.1. Chất làm trong - Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả

Trong sản xuất nƣớc quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc. Thực tế hiện

nay đang sử dụng các chất làm trong nhƣ: genatin, bentonite, kali caseinate, tannin,

polyvinyl pirovinyl. Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ đi đục, giúp điều chỉnh acid

trong nƣớc quả.

Chitosan đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân lọc các chất lơ lửng trong nƣớc quả. Sử

dụng dung dịch chitosan 2% trong acid acetic 7% giúp làm giảm độ đục hiệu quả

hơn so với sử dụng bentonite và gelatin. Đối với nƣớc táo, khi sử dụng dung dịch

chitosan hòa tan trong acid malic 2%, ngƣời ta nhận thấy rằng độ đục giảm đáng kể

khi tăng lƣợng chitosan sử dụng từ 0,1 – 0,7 g/l nƣớc quả. Tuy nhiên, khi tăng lên

đến 1 g/l thì độ đục tăng lên, điều đó đƣợc giải thích là do sự bão hòa về tính chất

hấp phụ của chitosan.

Chitosan còn đƣợc dùng để điều chỉnh độ chua của nƣớc quả. Imeri và

Knorr (1998) đã nghiên cứu chitosan nồng độ 1,2% trong 2% acid ascorbic đối với

nƣớc ép cà rốt và táo, kết quả cho thấy chitosan làm giảm đáng kể lƣợng acid của

dịch ép.

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có ái lực lớn đối với hợp chất

pholyphenol chẳng hạn: catechin, proanthocianydin, acid cinamic, những chất mà

có thể biến màu nƣớc quả bằng phản ứng oxy hóa.

1.2.6.2. Bảo quản trứng gà tươi

Ở nhiệt độ thƣờng, trứng gà tƣơi bọc màng chitosan nồng độ 1,5% có bổ

sung 0,05% Sodium Benzoate hoặc 1% Sorbitol có khả năng duy trì hạng chất

lƣợng ở mức A đến 15 - 20 ngày sau khi đẻ.

Trong khi đó, trứng gà tƣơi không qua bọc màng chỉ duy trì hạng chất lƣợng

ở mức A không quá 5 ngày sau khi đẻ. Đồng thời các chỉ tiêu chất lƣợng khác (hao

Trang 30

Đồ án tốt nghiệp

hụt khối lƣợng, chỉ số màu lòng đỏ trứng) đều có biến đổi lớn hơn so với trứng có

xử lý màng bọc chitosan. Kết quả nghiên cứu của PGS.TS Trần Thị Luyến (Trƣờng

ĐH Nha Trang) và Th.S Lê Thanh Long (Trƣờng ĐH Nông Lâm Huế) đã cho thấy

màng bọc không tạo cảm giác khác lạ cho ngƣời sử dụng so với trứng gà tƣơi

thƣơng phẩm cùng loại về chất lƣợng cảm quan bề mặt.

Phƣơng pháp tạo màng trên vỏ đƣợc các nhà khoa học thực hiện nhƣ sau:

trứng gà tƣơi sau khi gà đẻ không quá 24 giờ, không rạn nứt, không có khuyết tật và

đạt tiêu chuẩn TCVN 1858 : 1986. Sau đó tiến hành lau sạch và nhúng trong dung

dịch bao màng chitosan đƣợc chuẩn bị gồm hỗn hợp dung dịch lọc bao gồm

chitosan 1,5% pha trong dung dịch acetic acid 1% bổ sung thêm SB 0,05%, hoặc

SOR 1%. Tiếp theo để khô tự nhiên và bảo quản ở nhiệt độ thƣờng nơi khô ráo

thoáng mát.

1.2.6.3. Sử dụng trong thực phẩm chức năng

Chitosan có khả năng làm giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu. Nếu

sử dụng thực phẩm chức năng có bổ sung 4% chitosan thì lƣợng cholesterol

trong máu giảm đi đáng kể chỉ sau 2 tuần. Ngoài ra chitosan còn đƣợc xem là chất

chống đông tụ máu. Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong máu và chống đông

tụ máu đƣợc biết là do không cho tạo các mixen. Điều chú ý là ở pH = 6 – 6,5

chitosan bắt đầu bị kết tủa, toàn bộ chuỗi polysaccharide bị kết lắng và giữ lại

toàn bộ lƣợng mixen trong đó. Chính nhờ đặc điểm quan trọng này chitosan đƣợc

ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm chức năng.

1.2.6.4. Thu hồi protein

Whey đƣợc coi là chất thải trong công nghiệp sản xuất phomat, nó có chứa

một lƣợng lớn lactose và protein ở dạng hòa tan. Nếu thải trực tiếp ra ngoài sẽ gây ô

nhiễm môi trƣờng, còn nếu xử lý nƣớc thải thì tốn kém do vận hành hệ thống dẫn

đến hiệu quả kinh tế không cao. Việc thu hồi protein trong whey đƣợc xem là

biện pháp làm tăng hiệu quả kinh tế của sản xuất phomat. Whey protein khi thu hồi

đƣợc bổ sung vào đồ uống, thịt băm và các loại thực phẩm khác. Nhiều phƣơng

pháp khác nhau đã đƣợc đƣa ra nhằm thu hồi protein và chitosan đƣợc coi là

Trang 31

Đồ án tốt nghiệp

mang lại nhiều hiệu suất phân tách cao nhất. Tỷ lệ chitosan để kết bông các hạt lơ

lửng là 2,15% (30 mg/l); độ đục thấp nhất ở pH 6,0. Nghiên cứu về protein thu

đƣợc bằng phƣơng pháp này: không hề có sự khác biệt về giá trị giữa protein có

chứa chitosan và protein thu đƣợc bằng đông tụ casein hoặc whey protein.

Ngoài thu hồi protein từ whey, ngƣời ta sử dụng chitosan trong thu hồi

các acid amin trong nƣớc của sản xuất đồ hộp , thịt, cá…

1.2.6.5. Phân tách rượu - nước

Chitosan đƣợc xử lý đặc biệt để tạo ra dạng màng rỗng. Với việc điều chỉnh tốc độ thẩm thấu (lƣợng chất lỏng đi qua màng khoảng 1 m3/h). Màng này đƣợc

sử dụng trong hệ thống phản ứng đòi hỏi không dùng nhiệt độ quá cao. Việc

phân tách này chỉ loại đi nƣớc, kết quả là hàm lƣợng ethanol có thể lên đến

80%.

1.2.6.6. Ứng dụng làm màng bao (bảo quản hoa quả)

Lớp màng không độc bao quanh bên ngoài khối nguyên liệu nhằm hạn chế sự

phát triển vi sinh vật bề mặt - một nguyên nhân chính gây thối hỏng thực phẩm.

N-O carboxymethy (NOCC) đƣợc xử lý đặc biệt từ phản ứng của chitosan và

monochloroacetic acid trong điều kiện kiềm, NOCC có thể hòa tan trong dung dịch

ở pH > 6 hoặc pH < 2. Màng NOCC dẻo có thể tạo thành ngay trong dung dịch

nƣớc đó. Lớp màng này có tính thấm chọn lọc các khí nhƣ oxy, cacbon dioxide mà

còn có khả năng phân tách hỗn hợp khí nhƣ: ethylene, ethane, acetylence.

Quả táo đƣợc nhúng hoặc phun bởi màng NOCC có thể giữ độ tƣơi hơn 6

tháng và độ acid trong khoảng 250 ngày nếu ở điều kiện bảo quản lạnh. Màng này

mang lại cho quả độ bóng sáng nhƣng trong và không nhớt khi cầm. Chúng dễ dàng

loại đi bằng rửa với nƣớc, NOCC cũng có hiệu quả đối với bảo quản các loại trái

cây khác nhƣ lê, đào, mận. Lê đƣợc xử lý với NOCC tỷ lệ bị mắc hỏng thịt cùi và

thối ít hơn so với lê ở không khí có tỷ lệ oxygen là 1 - 2%. Viện bảo vệ và chăm sóc

sức khỏe Canada đã chứng minh rằng việc sử dụng NOCC trên quả, khi sử dụng

không cần phải rửa và lột vỏ trƣớc khi ăn. Bởi vì NOCC vẫn chứa lƣợng amin tự

Trang 32

Đồ án tốt nghiệp

do, nó có thể có nhiều ở tính chất chitosan và ứng dụng trong chữa lành vết thƣơng

đang lên da non, giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu.

Màng chitosan cũng có lợi ích lớn với việc làm cứng thịt quả, ổn định acid.

Điều này đƣợc chỉ ra bởi nó làm giảm lƣợng anthocyanin chứa trong quả. Nấm là

thủ phạm chính dễ gây thối quả nhất trong khi đó ƣu điểm của chitosan nó có thể

kháng nấm. Thêm vào đó, màng chitosan gần giống nhƣ môi trƣờng bên ngoài mà

không gây ra nguyên nhân hô hấp kỵ khí, nó có thể hấp thu chọn lọc tới oxy nhiều

hơn là carbonic.

Ngoài việc sử dụng một mình màng chitosan, hiện nay ở Việt Nam có sự kết

hợp giữa bảo quản bởi màng chitosan và PE.

Quy trình bảo quản trái quýt đƣờng với thời gian tồn trữ đến 8 tuần. Bao

màng chitosan ở nồng độ 0,25% kết hợp với bao Polyethylene (PE) đục 5 lỗ với

đƣờng kính mỗi lỗ 1 mm và ghép mí lại bằng máy ép. Sau đó, bảo quản ở nhiệt độ 12oC. Với phƣơng pháp này, chất lƣợng bên trong trái nhƣ: hàm lƣợng đƣờng,

hàm lƣợng vitamin C... luôn ổn định, tỷ lệ hao hụt khối lƣợng thấp, màu sắc vỏ

trái đồng đều và đẹp.

1.2.6.7. Bánh mì

Park và cộng sự (2002) đã nghiên cứu tác động của chitosan đƣợc quét trên

bề mặt của bánh mì. Kết quả cho thấy chitosan nồng độ 1% trong 1% acid acetic

giúp làm giảm sự mất mát về khối lƣợng do màng chitosan có khả năng ngăn không

cho nƣớc thoát ra ngoài. Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng kháng khuẩn hạn chế sự

phát triển của vi sinh vật trên bánh mì.

1.2.6.8. Kim chi

Kim chi có bổ sung chitosan có thể kéo dài thời hạn sử dụng từ 2 – 6 lần so

với kim chi bình thƣờng. Bên cạnh đó, chitosan còn có khả năng ngăn chặn sự mềm

hóa của kim chi trong quá trình lên men.

Trang 33

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 2.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu

2.1.1. Nguyên liệu

Đậu hũ dùng để nghiên cứu đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp thủ công kết tủa

bằng nƣớc chua theo quy trình hình 1.1. Dịch sữa đậu dùng cho chế biến đậu hũ có nồng độ chất khô hòa tan là 5oBrix. Sau khi gia nhiệt đến 100oC, pH của dịch sữa là

6,5, dịch sữa đƣợc kết tủa bằng nƣớc chua có pH = 5,3 theo tỷ lệ nƣớc chua/dịch

sữa là 1/9, khuấy nhẹ hỗn hợp cho đến khi xuất hiện hoa đậu, lúc này pH của hỗn hợp là 6,1, nhiệt độ phải đƣợc duy trì ở 85 – 90oC.

Hoa đậu kết tủa đƣợc đổ vào khuôn dài 80 cm có lót vải mềm và ép bằng

thanh chặn, thời gian ép 15 phút tạo thành bánh đậu.

2.1.2. Vật liệu

Chitosan hòa tan trong nƣớc dùng cho nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi Trung

tâm công nghệ sinh học, trƣờng đại học Nha Trang. Chitosan hòa tan trong nƣớc có

các chỉ tiêu hóa sinh sau:

 Hàm lƣợng tro: 0,2 ± 0,01%

 Hàm lƣợng khoáng: 0,05 ± 0,003%

 Mức độ deacetyl (DD): 87 ± 2%

 Trọng lƣợng phân tử: 450 ± 47 kDa

2.2. Bố trí thí nghiệm

2.2.1. Chuẩn bị cho nghiên cứu

2.2.1.1. Chuẩn bị dung dịch ngâm

1 g chitosan hòa tan trong 100 ml nƣớc cất sẽ đƣợc chitosan 1%. Chuẩn bị 800 ml

dung dịch chitosan 0,2% và 800 ml dung dịch chitosan 0,4%.

2.2.1.2. Chuẩn bị đậu hũ

Đậu hũ sau khi ép bánh định hình đƣợc cắt thành miếng theo kích thƣớc:

chiều dài 7 cm – chiều rộng 4 cm – chiều cao 3 cm. Sau đó làm nguội ở nhiệt độ

Trang 34

Đồ án tốt nghiệp

thƣờng, miếng đậu sau khi đã nguội sẽ đƣợc cho vào hộp nhựa có kích thƣớc: chiều

dài 8 cm – chiều rộng 6 cm – chiều cao 3,6 cm đã đƣợc khử trùng bằng H2O2, đóng

nắp hộp và vận chuyển về phòng thí nghiệm.

2.2.2. Tiến hành thí nghiệm

Nghiên cứu tập trung vào 2 mảng công việc chính:

- Xác định các thông số cơ bản của nguyên liệu đậu hũ dùng trong nghiên

cứu, bao gồm: độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm lƣợng protein và lipid.

- Theo dõi quá trình bảo quản đậu hũ trong dung dịch chitosan với các nồng

độ khác nhau ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh thông qua các chỉ tiêu:

 pH

 độ đục

 tổng vi sinh vật hiếu khí

 nấm men – nấm mốc

 E. coli

Các nội dung nghiên cứu đƣợc thể hiện trên sơ đồ hình 2.1

Trang 35

Đồ án tốt nghiệp

Phân tích một số thành phần cơ bản:

 Độ ẩm

 Hàm lƣợng nito tổng Đậu hũ

 Hàm lƣợng lipid

 Hàm lƣợng tro tổng

Ngâm trong dung dịch chitosan

0% 0,4% 0,2%

Bảo quản

Nhiệt độ thƣờng Nhiệt độ lạnh

Kiểm tra một số chỉ tiêu:

 pH

Kiểm tra  độ đục

 TPC

 Nấm men, nấm mốc So sánh và kết luận

 E. coli

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Trang 36

Đồ án tốt nghiệp

Đậu hũ sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm đƣợc phân tích các thông số

ban đầu nhƣ: độ ẩm, hàm lƣợng tro, protein và lipid. Các mẫu đậu hũ đƣợc bảo

quản trong dung dịch chitosan 0%, 0,2% và 0,4%, thể tích dung dịch chitosan cho

mỗi hộp là 60 ml để đảm bảo đậu hũ ngập trong dung dịch. Sử dụng màng bọc thực

phẩm PE để bao kín miệng hộp, đóng nắp hộp. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ thƣờng ở

nơi thoáng mát và nhiệt độ lạnh.

Sau mỗi thời gian 0, 1, 3, 6, 9, 12 ngày bảo quản, lấy mẫu kiểm tra các chỉ

tiêu: pH, độ đục, tổng vi sinh vật hiếu khí, nấm men – nấm mốc, E. coli. Dựa vào số

liệu thu đƣợc, tiến hành phân tích và so sánh các chỉ tiêu giữa mẫu nghiên cứu và

mẫu đối chứng ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh rồi rút ra kết luận.

2.2.3. Tiến hành thí nghiệm

2.2.3.1. Thí nghiệm 1: Xác định các thành phần cơ bản của đậu hũ

Đậu hũ sau khi sản xuất đƣợc xác định các thành phần cơ bản nhƣ: độ ẩm,

hàm lƣợng tro, hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid.

Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ghi nhận và tính toán số liệu sau mỗi lần thí

nghiệm.

2.2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát những biến đổi chất lượng của đậu hũ thông qua

dung dịch ngâm được bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh

Để đánh giá chất lƣợng của đậu hũ cần theo dõi các chỉ tiêu sau:

 pH

 độ đục

 tổng vi sinh vật hiếu khí

 nấm men – nấm mốc

 E. coli

Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Ghi nhận và tính toán số liệu sau mỗi lần

thí nghiệm.

Trang 37

Đồ án tốt nghiệp

2.2.4. Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu

2.2.4.1. Phương pháp xác định chất lượng đậu hũ

- Độ ẩm của nguyên liệu đậu hũ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sấy ở

105oC đến khối lƣợng không đổi.

- Xác định hàm lƣợng nito tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl từ đó xác

định đƣợc hàm lƣợng protein của nguyên liệu đậu hũ.

- Xác định hàm lƣợng tro bằng phƣơng pháp nung ở nhiệt độ cao (600oC)

đến khối lƣợng không đổi.

- Xác định hàm lƣợng lipid của đậu hũ bằng phƣơng pháp Soxhlet.

2.2.4.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi

Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật của đậu hũ:

Bảng 2.1. Các phƣơng pháp xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của dung

dịch ngâm đậu hũ

STT Chỉ tiêu kiểm nghiệm Phƣơng pháp Đơn vị tính

Tổng số vi sinh vật hiếu khí Đổ đĩa, đếm khuẩn lạc CFU/ml 1

Nấm men – Nấm mốc Cấy trang, đếm khuẩn lạc CFU/ml 2

E.coli giả định MPN MPN/ml 3

Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu hóa lý của đậu hũ:

- Xác định pH của dung dịch ngâm đậu hũ bằng máy đo pH.

- Xác định độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bằng máy đo OD với bƣớc

sóng 800 nm.

2.2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu nhận đƣợc từ nghiên cứu đƣợc xử lý trên phần mềm Excel

2010 và phần mềm thống kê Statgraphics.

Trang 38

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Một số thông số cơ bản của đậu hũ dùng trong nghiên cứu

Đậu hũ sử dụng cho nghiên cứu đƣợc xác định một số thông số cơ bản. Kết

quả đƣợc trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu đƣợc xác định của đậu hũ dùng trong nghiên cứu

Tên chỉ tiêu Giá trị

Hàm lƣợng nƣớc (%) 64,2 %

Hàm lƣợng protein (%) 7,5 %

Hàm lƣợng lipid (%) 3,62 %

Hàm lƣợng tro (%) 1,76 %

Hàm lƣợng lipid và protein của đậu hũ thấp hơn so với các loại thực phẩm

khác có nguồn gốc từ động vật. Đậu hũ chứa hàm lƣợng nƣớc cao (64,2%) cùng với

sự có mặt của các thành phần dinh dƣỡng khác là môi trƣờng lý tƣởng cho vi sinh

vật phát triển.Vì vậy, đậu hũ khó bảo quản và thời gian bảo quản thƣờng không lâu.

3.2. Nghiên cứu quá trình biến đổi của đậu hũ trong thời gian bảo quản

3.2.1. Khảo sát biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ

thường và nhiệt độ lạnh

pH là một giá trị quan trọng để đánh giá chất lƣợng đậu hũ, độ pH chỉ thị giá

trị của sản phẩm hay xác định độ hƣ hỏng của thực phẩm. Kết quả đo đƣợc sau thí

nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Giá trị pH của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng

và nhiệt độ lạnh

Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung

quản chứng dịch ngâm đậu hũ

Nƣớc cất 0,2% 0,4%

5 3,8 3,8 Bảo quản ở 0

nhiệt độ 4,6 4,8 5,3 1

Trang 39

Đồ án tốt nghiệp

5,2 5,0 4,9 thƣờng 3

5,1 5,3 5,4 6

4,7 5,6 5,8 9

4,3 5,8 5,5 12

5 3,8 3,8 Bảo quản ở 0

nhiệt độ lạnh 6,5 6,2 6 1

6,4 6,3 6,3 3

6,4 6,4 6,3 6

6 6,1 6,4 9

5,7 6,1 6,1 12

7 pH

6

Nƣớc cất (thƣờng)

0.2% (thƣờng) 5 0.4% (thƣờng)

nƣớc cất (lạnh)

0.2% (lạnh)

4

0.4% (lạnh)

3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày

Hình 3.1. Biến đổi pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ

lạnh

Trang 40

Đồ án tốt nghiệp

Từ biểu đồ hình 3.1, có thể thấy các đƣờng biểu diễn pH ở nhiệt độ lạnh có

xu hƣớng tăng và ổn định sau các ngày bảo quản. Đến ngày thứ 12, các mẫu đậu hũ

ngâm ở nhiệt độ lạnh vẫn còn mùi thơm đặc trƣng của đậu hũ. Trong khi đó, ở nhiệt

độ thƣờng, pH của mẫu đối chứng có xu hƣớng giảm do không có chất bảo quản,

đậu hũ là thực phẩm chứa hàm lƣợng nƣớc cao, giàu protein, đây là môi trƣờng

thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Vi sinh vật lên men sẽ phát triển từ bề mặt đậu

hũ sau đó mới đi dần vào bên trong, kết quả của quá trình này là hình thành các acid

hữu cơ nhƣ acid lactic, acid acetic làm cho pH của dung dịch ngâm giảm tạo điều

kiện để các vi sinh vật khác phát triển gây hƣ hỏng đậu hũ. Đối với mẫu nghiên cứu

chitosan 0,2% và 0,4% ở nhiệt độ thƣờng, các đƣờng biểu diễn pH có xu hƣớng

tăng, nhƣng xét về mặt cảm quan thì ngày thứ 3 các mẫu này có mùi chua nhẹ và

đến ngày thứ 6 thì có dấu hiệu hƣ hỏng. Bên cạnh đó, độ pH của mẫu đối chứng,

mẫu nghiên cứu 0,2% và 0,4% chitosan khác biệt không đáng kể, điều này có thể

kết luận rằng nhiệt độ bảo quản có ảnh hƣởng đến độ pH của dung dịch nhiều hơn

nồng độ chitosan.

Qua xử lý thống kê, pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở 2 chế độ bảo quản

khác biệt có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05, dung dịch ngâm ở nhiệt độ lạnh có pH

cao hơn so với nhiệt độ thƣờng.

Ở nhiệt độ lạnh, các loài vi sinh vật sẽ bị ức chế nên quá trình này diễn ra

chậm hơn, mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu đƣợc bảo quản đến ngày thứ 12 vẫn

chƣa có dấu hiệu hƣ hỏng. Vì vậy, vẫn chƣa thể kết luận đƣợc rằng chitosan có ảnh

hƣởng đến pH của dung dịch ngâm hay không.

Về mặt cảm quan, khi bảo quản ở nhiệt độ thƣờng, các mẫu đậu hũ đƣợc

ngâm trong dung dịch chitosan 0,2% và 0,4% đã có mùi chua vào ngày thứ 6. Tuy

nhiên, quan sát trên biểu đồ hình 3.1, đƣờng biểu diễn của các mẫu này lại có xu

hƣớng tăng. Điều này cho thấy pH không phải là chỉ tiêu đáng tin cậy để đánh giá

mức độ hƣ hỏng của đậu hũ.

Trang 41

Đồ án tốt nghiệp

3.2.2. Khảo sát độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ thường

và nhiệt độ lạnh

Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định đƣợc sinh khối vi

sinh vật phát triển trong dung dịch ngâm, khi số lƣợng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến

việc tăng độ đục. Tuy nhiên, độ đục của dung dịch tăng cũng có thể do nồng độ của

cơ chất hay các chất lơ lửng có trong dịch ngâm. Kết quả đo đƣợc trình bày trong

bảng 3.3.

Bảng 3.3. Giá trị độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ

thƣờng và nhiệt độ lạnh

Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung

chứng dịch ngâm đậu hũ quản

Nƣớc cất 0,2% 0,4%

0 0,001 0,001 Bảo quản ở 0

nhiệt độ 0,333 0,094 0,169 1

thƣờng 0,596 0,163 0,299 3

0,572 0,207 0,411 6

0,623 0,399 0,438 9

0,734 0,572 0,599 12

0 0,001 0,001 Bảo quản ở 0

nhiệt độ lạnh 0,126 0,019 0,131 1

0,178 0,029 0,152 3

0,260 0,035 0,186 6

0,329 0,048 0,261 9

0,393 0,053 0,266 12

Trang 42

Đồ án tốt nghiệp

0,8

)

0,7

0,6

Nƣớc cất (thƣờng)

0,5

m n 0 0 8 D O

0.2% (thƣờng) 0,4 0.4% (thƣờng)

( c ụ đ

ộ đ

0,3 Nƣớc cất (lạnh)

0.2% (lạnh) 0,2

0.4% (lạnh) 0,1

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày

Hình 3.2. Biến đổi độ đục của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh

Thời gian bảo quản càng kéo dài, độ đục của dung dịch ngâm càng tăng do

sự phát triển của vi sinh vật, các biến đổi hóa lý của đậu hũ và dung dịch ngâm.

Các đƣờng biểu diễn trên biểu đồ hình 3.2 cho thấy mẫu đối chứng bảo quản

ở nhiệt độ thƣờng có độ đục cao nhất. Vi sinh vật phân giải đậu hũ gây ra các vết

nứt trên bề mặt đậu hũ, các mảnh vỡ nhỏ từ đậu hũ tan vào dung dịch ngâm làm cho

độ đục của dung dịch ngâm tăng lên. Đối với mẫu chitosan 0,2% và 0,4% do có sử

dụng chất bảo quản nên độ đục của dung dịch thấp hơn so với mẫu đối chứng. Tuy

nhiên, ở nhiệt độ thƣờng, nồng độ chitosan 0,2% và 0,4% có thể không có tác dụng

ức chế tốt đối với sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Quan sát cảm quan cho

thấy ở nồng độ chitosan 0,2% và 0,4% có mức độ hƣ hỏng nhẹ hơn so với mẫu đối

chứng, biểu hiện là: trên bề mặt đậu hũ của mẫu 0,2% và 0,4% xuất hiện các vết nứt

nhỏ. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng vết nứt xuất hiện nhiều hơn, sâu hơn và sau 12

ngày bảo quản đậu hũ có hiện tƣợng vữa nát.

Trong điều kiện bảo quản lạnh, hầu hết các hoạt động của vi sinh vật đều bị

ức chế nên giá trị độ đục thấp hơn, nƣớc ngâm trong hơn, đậu hũ bảo quản đƣợc lâu

Trang 43

Đồ án tốt nghiệp

hơn so với điều kiện bảo quản thƣờng. Mẫu đối chứng có giá trị độ đục cao nhất do

không sử dụng chất bảo quản. So sánh giữa mẫu 0,2% và 0,4% cho thấy dung dịch

có nồng độ chitosan cao khi gặp môi trƣờng có tính acid sẽ bị kết tủa thành những

mảng trắng nên các mẫu nghiên cứu 0,4% chitosan có độ đục cao hơn các mẫu

nghiên cứu 0,2%.

3.2.3. Khảo sát chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ

bảo quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trƣởng và hình thành khuẩn lạc

trong điều kiện có sự hiện diện của oxy. Thông qua số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các

đĩa petri cho phép xác định đƣợc lƣợng vi sinh vật có trong môi trƣờng đó. Chỉ tiêu

tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực

phẩm, đánh giá nguy cơ hƣ hỏng của thực phẩm. Khi xử lý bảo quản đậu hũ không

có quá trình bài khí nên vẫn còn một lƣợng không khí tồn tại trong hộp, vi sinh vật

hiếu khí có thể nhiễm vào đậu hũ thông qua con đƣờng này, vì vậy phải xác định

chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí để đánh giá chất lƣợng sản phẩm. Mật độ vi sinh vật

hiếu khí trong dung dịch ngâm đƣợc trình bày trong bảng 3.4.

Bảng 3.4. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo

quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh

Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung

quản dịch ngâm đậu hũ chứng

Bảo quản ở 0

nhiệt độ 1

thƣờng 3

6

9

12

Bảo quản ở 0

nhiệt độ lạnh 0,2% 0,091.103 2,27.103 5,13.103 7,44.103 9,50.103 10,36.103 0,091.103 2,59.103 0,4% 0,091.103 1,98.103 2,92.103 9,15.103 10,25.103 11,86.103 0,091.103 2,32.103 Nƣớc cất 0,091.103 2,82.103 5,34.103 9,48.103 10,99.103 13,59.103 0,091.103 3,03.103 1

Trang 44

Đồ án tốt nghiệp

3

6

9

4,24.103 5,88.103 6,41.103 8,21.103 3,80.103 4,96.103 5,36.103 5,73.103 3,56.103 3,64.103 5,50.103 6,15.103 12

*1000 16

14

12

Nƣớc cất (thƣờng) 10

0.2% (thƣờng) 8 0.4% (thƣờng)

6 Nƣớc cất (lạnh)

0.2% (lạnh) 4

0.4% (lạnh)

2

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày

Hình 3.3. Biến đổi về tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm ở nhiệt độ

thƣờng và nhiệt độ lạnh

Kết quả xử lý thống kê cho thấy sự khác biệt về tổng vi sinh vật hiếu khí của

dung dịch ngâm giữa 2 chế độ nhiệt có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05, các mẫu đƣợc

bảo quản ở nhiệt độ thƣờng có số lƣợng vi sinh vật hiếu khí cao hơn mẫu bảo quản

ở nhiệt độ lạnh. Mặc dù khi nhìn trên sơ đồ có thể thấy sự khác biệt giữa mẫu đối

chứng và mẫu nghiên cứu nhƣng khi xử lý thống kê thì tổng vi sinh vật hiếu khí

giữa 2 mẫu khác biệt không đáng kể. Vì vậy, có thể thấy chitosan không ảnh hƣởng

nhiều đến chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí, yếu tố ảnh hƣởng đến chỉ tiêu này nhiều

nhất chính là nhiệt độ.

Trang 45

Đồ án tốt nghiệp

Hầu hết qua kiểm nghiệm đều bắt gặp vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên vi sinh

vật hiếu khí chỉ có giá trị chỉ thị về hiện trạng của sản phẩm hơn là dự báo về thời

hạn sử dụng của sản phẩm bởi khó xác định tỷ lệ vi khuẩn gây hƣ hỏng.

3.2.4. Khảo sát chỉ tiêu nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo

quản ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh

Trong thực phẩm, nấm men và nấm mốc hiện diện có thể làm thay đổi màu

của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hƣ hỏng hay thay đổi cơ cấu của

thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Vì vậy cần xác định

chỉ tiêu nấm men và nấm mốc để đánh giá chất lƣợng của mẫu, nguy cơ hƣ hỏng

cũng nhƣ mức độ vệ sinh trong quá trình bảo quản.

Bảng 3.5. Mật độ nấm men nấm mốc trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản

ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh

Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung

dịch ngâm đậu hũ quản chứng

Nƣớc cất 0,2% 0,4%

Bảo quản ở 0

nhiệt độ 1

thƣờng 3

6

9

0 0,09.103 1,71.103 3,45.103 9,91.103 16,01.103 0 0,02.103 0,27.103 1,36.103 4,68.103 7,36.103 0 0,02.103 0,18.103 2,82.103 5,73.103 9,23.103 12

Bảo quản ở 0

nhiệt độ lạnh 1

3

6

9

0 0,02.103 0,11.103 0,41.103 0,73.103 1,64.103 0 0,02.103 0,07.103 0,09.103 0,17.103 0,32.103 0 0,02.103 0,18.103 0,23.103 0,32.103 0,54.103 12

Trang 46

Đồ án tốt nghiệp

*1000 18

16

14

12

Nƣớc cất (thƣờng)

10 0.2% (thƣờng)

0.4% (thƣờng) 8

Nƣớc cất (lạnh) 6 0.2% (lạnh)

4 0.4% (lạnh)

2

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày

Hình 3.4. Biến đổi về nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng

và nhiệt độ lạnh

Các đƣờng biểu diễn trên biểu đồ hình 3.4 cho thấy số lƣợng nấm men – nấm

mốc của mẫu đối chứng bảo quản ở nhiệt độ thƣờng tăng cao nhất. Điều này có thể

đƣợc giải thích là do trong mẫu không có chất bảo quản, vi sinh vật phát triển mạnh

sinh ra nhiều acid, lúc này nấm men – nấm mốc sẽ sử dụng các sản phẩm mà vi sinh

vật đã phân hủy trƣớc đó để sinh trƣởng và phát triển. Ở nồng độ 0,2% và 0,4%,

nấm men – nấm mốc cũng phát triển mạnh nhƣng vẫn thấp hơn nhiều so với mẫu

đối chứng. Điều này có thể do nấm men và nấm mốc là những vi sinh vật có vách tế

bào có thành phần chitin nên hoạt tính kháng khuẩn của chitosan có hiệu quả rất

thấp đối với nấm men – nấm mốc, do đó số lƣợng nấm men - nấm mốc trong dung

dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng tăng mạnh.

Số lƣợng nấm men – nấm mốc trong dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng cao

hơn so với dung dịch ngâm trong nhiệt độ lạnh. Nhiệt độ thấp tuy không thể tiêu

diệt vi sinh vật nhƣng cũng có thể ức chế các hoạt động của chúng, mặt khác, nấm

Trang 47

Đồ án tốt nghiệp

men và nấm mốc thuộc nhóm vi sinh vật ƣa mát nên khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh

thì nấm men và nấm mốc phát triển rất chậm.

3.2.5. Khảo sát chỉ tiêu E. coli trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở nhiệt độ

thường và nhiệt độ lạnh

Số lƣợng hiện diện của E. coli trong thực phẩm chỉ thị mức độ vệ sinh trong

quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nƣớc uống hoặc dùng để chỉ

thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Kết quả thí nghiệm đã xác

định không phát hiện E. coli trong tất cả các mẫu. Số liệu đƣợc trình bày trong bảng

3.6 là số lƣợng E. coli giả định (coliforms chịu nhiệt).

Bảng 3.6. Số lƣợng E. coli giả định trong dung dịch ngâm đậu hũ bảo quản ở

nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh

Chế độ bảo Ngày Mẫu đối Nồng độ chitosan của dung

quản chứng dịch ngâm đậu hũ

Nƣớc cất 0,2% 0,4%

Bảo quản ở 0

nhiệt độ 1

thƣờng 3

6

9

0 0,27.102 0,28.102 0,34.102 0,40.102 0,38.102 0 0,15.102 0,38.102 0,39.102 0,58.102 0,66.102 0 0,34.102 0,42.102 0,43.102 0,75.102 0,95.102 12

Bảo quản ở 0

nhiệt độ lạnh 1

3

6

9

0 0,03.102 0,03.102 0,09.102 0,15.102 0,19.102 0 0,03.102 0,036.102 0,036.102 0,21.102 0,29.102 0 0,03.102 0,24.102 0,26.102 0,30.102 0,34.102 12

Trang 48

Đồ án tốt nghiệp

*100

1,2

1

0,8 Nƣớc cất (thƣờng)

0.2% (thƣờng) 0,6 0.4% (thƣờng)

Nƣớc cất (lạnh) 0,4 0.2% (lạnh)

0.4% (lạnh) 0,2

0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ngày

Hình 3.5. Biến đổi về E. coli giả định của dung dịch ngâm ở nhiệt độ thƣờng và

nhiệt độ lạnh

Kết quả xử lý thống kê cho thấy khác biệt về số lƣợng E. coli giả định của

dung dịch ngâm ở 2 chế độ nhiệt có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05, số lƣợng E. coli

giả định ở nhiệt độ thƣờng cao hơn so với nhiệt độ lạnh.

Ở nhiệt độ thƣờng, kết quả xử lý số liệu cho thấy có sự khác biệt về số lƣợng

E. coli giả định giữa mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu, số lƣợng E. coli ở mẫu

nghiên cứu thấp hơn so với mẫu đối chứng. Theo kết quả của phần 3.2.1, pH của

dung dịch ngâm có giá trị trung bình là 5,5, ở giá trị pH này chitosan có tác dụng ức

chế E. coli rất tốt nên số lƣợng vi khuẩn của mẫu nghiên cứu thấp hơn nhiều so với

mẫu đối chứng. Đối với mẫu đối chứng, số lƣợng E. coli giả định ở ngày thứ 9 (75

MPN/ml) đã vƣợt qua chỉ tiêu E. coli của TCVN (50 MPN/ml), trong khi đó mẫu

đậu hũ ngâm trong dung dịch 0,4% chitosan đến ngày thứ 9 và mẫu đậu hũ ngâm

trong dung dịch 0,2% chitosan đến ngày thứ 12 mới vƣợt qua chỉ tiêu của TCVN.

Điều này cho thấy chitosan đã thể hiện tính kháng khuẩn của mình và nồng độ ức

chế E. coli tốt nhất là 0,2%.

Trang 49

Đồ án tốt nghiệp

Ở nhiệt độ lạnh, số lƣợng E. coli của mẫu đối chứng và mẫu nghiên cứu

không có sự khác biệt do hoạt động của vi sinh vật đã bị ức chế, thời gian lấy mẫu

tƣơng đối ngắn nên chƣa thấy đƣợc những tác động của chitosan.

Từ phân tích trên có thể rút ra nhận xét:

- Nhiệt độ bảo quản có ảnh hƣởng đến chỉ tiêu E. coli của dung dịch ngâm,

trong đó đậu hũ đƣợc bảo quản ở nhiệt độ lạnh là tốt nhất.

- Chitosan có ảnh hƣởng đến chỉ tiêu E. coli của dung dịch ngâm và nồng độ

ngâm thích hợp nhất là 0,2%.

Trang 50

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Sau thời gian nghiên cứu, thực hiện đề tài cho phép rút ra những kết luận sau:

1. Xác định đƣợc một số chỉ tiêu của đậu hũ dùng trong nghiên cứu:

Tên chỉ tiêu Giá trị

Hàm lƣợng nƣớc (%) 64,2

Hàm lƣợng protein (%) 7,2

Hàm lƣợng lipid (%) 3,62

Hàm lƣợng tro (%) 1,76

Đậu hũ dễ hƣ hỏng và khó bảo quản do có độ ẩm cao, thành phần nhiều chất

dinh dƣỡng.

2. Nhiệt độ bảo quản là yếu tố ảnh hƣởng nhiều nhất đến chất lƣợng của đậu

hũ. Từ các phân tích trong phần kết quả và thảo luận cho thấy trong điều kiện bảo

quản lạnh luôn cho kết quả tốt hơn bảo quản thƣờng do vi sinh vật gây hƣ hỏng đậu

hũ chủ yếu là loài ƣa ấm và chịu lạnh kém. Ở nhiệt độ thấp, vi sinh vật bị ức chế

làm cho hoạt động sống và sinh trƣởng kém hơn so với nhiệt độ thƣờng, trong quá

trình bảo quản bằng nƣớc lạnh, vi sinh vật vẫn có thể phát triển nhƣng với tốc độ

chậm hơn so với việc bảo quản ở nhiệt độ thƣờng.

Khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh, do thời gian nghiên cứu ngắn, không thấy rõ

đƣợc những tác động của chitosan đối với các chỉ tiêu theo dõi của đậu hũ. Vì vậy

khi bảo quản ngắn hạn việc sử dụng chitosan là không cần thiết.

Khi bảo quản ở nhiệt độ thƣờng, chitosan tỏ ra có hiệu quả đối với nấm men,

nấm mốc, E. coli và độ đục dung dịch, những ảnh hƣởng của chitosan đối với chỉ

tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí và là không đáng kể. Tuy nhiên, xét về tổng thể thì

việc chitosan để kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ là cần thiết.

Trang 51

Đồ án tốt nghiệp

4.2. Kiến nghị

1. Cần kéo dài thời gian bảo quản đậu hũ ở nhiệt độ lạnh để có thể phân tích

rõ ràng hơn về những ảnh hƣởng của chitosan đối với các chỉ tiêu chất lƣợng của

đậu hũ.

2. Cần tiếp tục thử nghiệm thêm các nồng độ chitosan khác nhau để tìm ra

nồng độ bảo quản tối ƣu nhất.

3. Có thể nghiên cứu thêm một số phƣơng pháp sử dụng chitoan để bảo quản

đậu hũ nhƣ phối trộn chitosan vào đậu hũ sau giai đoạn kết tủa.

4. Kết hợp chitosan với một số chất bảo quản khác để nâng cao khả năng bảo

quản đậu hũ.

Trang 52

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Lê Văn Hòa, Nguyễn Bảo Vệ. “Nghiên cứu bảo quản tươi, kéo dài thời gian tồn

trữ trái cây tại Cần Thơ”. Đại Học Cần Thơ.

2. Lê Thị Lành, Nguyễn Thị Thanh Hải, Trần Thái Hòa (2012). Tổng hợp nano

vàng sử dụng chitosan tan trong nước làm chất khử và chất ổn định. Tạp chí khoa

học, số 5. Đại học Huế.

3. Trần Mạnh Lục (2008). Điều chế chitin/chitosan từ vỏ tôm và nghiên cứu ứng

dụng của màng chitosan trong bảo quản táo ta. Đại học Đà Nẵng.

4. Trần Thị Luyến, Lê Thanh Long (2007). Nghiên cứu bảo quản trứng gà tươi

bằng màng bọc chitosan kết hợp phụ gia. Tạp chí Khoa học - Công nghệ - Thuỷ

sản, số 1. Ðại học Nha Trang.

5. Lê Văn Việt Mẫn (2011). “Công nghệ chế biến thực phẩm”, NXB Đại học Quốc

gia.

6. Phạm Thị Đan Phƣợng, Trang Sỹ Trung (2012). Tính chất của chitin và chitosan

từ vỏ tôm thẻ chân trắng khử protein bằng phương pháp hóa học và sinh học. Tạp

chí Khoa học - Công nghệ - Thuỷ sản, số 3. Đại học Nha Trang.

7. Trần Linh Thƣớc (2010). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực

phẩm và mỹ phẩm, tái bản lần thứ sáu. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.

8. Nguyễn Thị Ngọc Tú (1995). Nghiên cứu chế tạo chitosan và xây dựng tiêu

chuẩn dược dụng dùng trong y tế. Viện hóa học, Trung tâm khoa học tự nhiên và

Công nghệ Quốc gia.

9. Vũ Hoàng Yến (2012). Phân tích thực phẩm. Trƣờng đại học công nghiệp

Tp.HCM.

Tài liệu nƣớc ngoài

10. Kie Hwan Chun, Byung Yong Kim (1997). The extension of tofu shelf – life

with water-soluble degraded chitosan as immersion solution. Korean J.Food SIC

technol.

Trang 53

Đồ án tốt nghiệp

11. H.K.No, S.P.Meyyers (2007). Applications of chitosan for improvement of

quality and shelf life of foods: A review. Journal of food science.

TRANG WEB THAM KHẢO

12. http://luanvan.net.vn/luan-van/luan-van-dieu-che-chitosan-theo-phuong-phap-

hoa-sinh-va-mot-so-ung-dung-cua-chitosan-20636/

13. http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-nghien-cuu-tim-hieu-ung-dung-chitosan-

36086/

14. http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-san-pham-dau-hu-53122/

15. http://tai-lieu.com/tai-lieu/de-tai-cong-nghe-san-xuat-dau-hu-cung-tau-hu-cung-

7870/

Trang 54

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC A

Phụ lục 1.1. Phƣơng pháp xác định độ ẩm

Nguyên lý: dùng sức nóng làm bay hết hơi nƣớc trong thực phẩm. Cân trọng

lƣợng thực phẩm trƣớc và sau khi sấy khô từ đó tính ra phần trăm nƣớc có trong thực phẩm. Mẫu đƣợc đem sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lƣợng không đổi.

Dụng cụ:

- Cân điện tử có độ chính xác 0,001 g. - Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ (105oC).

- Bình hút ẩm.

- Chén thủy tinh.

Tiến hành:

Cân chính xác 5 g mẫu phân tích cho vào chén cân đã biết trƣớc khối lƣợng. Cho chén vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 105oC trong khoảng 1 giờ. Sau đó lấy chén ra

cho vào bình hút ẩm, để nguội trong 30 phút, lấy chén ra, đem cân chính xác đến

0,001 g. Lặp lại quá trình sấy nhƣ trên cho đến khối lƣợng không đổi (mẫu đƣợc coi

là có khối lƣợng không đổi khi chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp nhỏ hơn 0,0005

g). Thời gian sấy mỗi lần tiếp theo là 30 phút.

Kết quả:

Độ ẩm của mẫu (X) đƣợc tính theo công thức:

( ) ( )

X = (%)

Trong đó:

G: trọng lƣợng chén sứ (g)

G1: trọng lƣợng chén sứ và mẫu trƣớc khi sấy (g)

G2: trọng lƣợng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)

Phụ lục 1.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro

Nguyên lý: dùng nhiệt độ cao (550 – 600oC) nung cháy hoàn toàn các chất

Trang 1

hữu cơ, phần còn lại sau khi nung là tổng số tro có trong thành phần cần xác định.

Đồ án tốt nghiệp

Dụng cụ: chén sứ, cân phân tích, lò nung, bình hút ẩm.

Tiến hành: Nung chén sứ ở nhiệt độ 600oC trong 1 giờ bằng lò nung. Hạ nhiệt độ chén sứ từ từ bằng cách cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC, để nguội rồi cho vào bình hút

ẩm. Sau đó đem cân chính xác 0,001 g.

Cho 3 g mẫu vào chén sứ và cân khối lƣợng chén sứ có chứa mẫu. Cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 600oC. Nung cho đến khi tro trắng

hoàn toàn.

Hạ nhiệt độ chén sứ tƣơng tự nhƣ trên rồi đem cân chén sứ có chứa tro.

Kết quả:

Hàm lƣợng tro của mẫu đƣợc tính theo công thức:

( ) ( )

X = (%)

Trong đó:

G: trọng lƣợng chén (g)

G1: trọng lƣợng của chén và mẫu (g)

G2: trọng lƣợng của chén và trọng lƣợng tro trắng sau khi đã nung và cân tới

khối lƣợng không đổi (g)

Phụ lục 1.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nito tổng số

Hàm lƣợng nito tổng số trong thành phần nguyên liệu đƣợc xác định bằng

phƣơng pháp Kjeldahl.

Nguyên lý:

Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm

mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do.

Định lƣợng NH3 bằng H2SO4.

Dụng cụ: bộ Kjeldahl

Trang 2

Tiến hành:

Đồ án tốt nghiệp

Vô cơ hóa mẫu: Cân 0,5 g mẫu cho vào bình Kjeldahl với 10 ml H2SO4 đậm

đặc và 5 g chất xúc tác ( K2SO4 và CuSO4). Để nghiêng bình Kjeldahl trên bếp và

đun từ từ cho đến khi thu đƣợc dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh

lơ của CuSO4, để nguội.

Cất đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nƣớc cất vào bình

Kjeldahl để tráng rồi cho vào bình cầu, tráng rửa bình Kjeldahl và phễu vài lần vào

bình cầu rồi cho khoảng 10 ÷ 15 ml NaOH 40%, vài giọt Tasiro vào bình cầu và

tiến hành cất đạm. Định lƣợng trực tiếp NH3 bay ra hòa tan trong bình hứng bằng

dung dịch H2SO4 0,1N. Sau khi đuổi hết NH3, chuẩn độ H2SO4 thừa bằng NaOH

0,1N.

Kết quả:

Hàm lƣợng nito toàn phần đƣợc tính theo công thức:

( )

N (%) =

Trong đó:

V1: số ml dung dịch H2SO4 dùng để đuổi hết NH3

V2: số ml dung dịch NaOH dùng để chuẩn độ

M: khối lƣợng mẩu dùng để vô cơ hóa mẫu (mg)

Phụ lục 1.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng lipid

Hàm lƣợng lipid đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Soxhlet

Nguyên lý:

Dùng dung môi nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do có trong thực phẩm.

Sau khi đuổi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lƣợng lipid có trong

thực phẩm.

Dụng cụ: bộ Soxhlet

Tiến hành:

Cân 1 g mẫu cho vào túi bằng giấy lọc (đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi

và cân). Sau đó cho túi mẫu vào ống chiết Soxhlet.

Trang 3

Cho ete vào 2/3 bình cầu. Cho nƣớc lạnh chảy qua ống sinh hàn.

Đồ án tốt nghiệp

Đun sôi cách thủy đến khi chất béo đƣợc chiết hết. Thời gian khoảng 8 ÷ 12

giờ (trong một giờ dung môi tràn từ ống chiết về bình chứa không ít hơn 5 ÷ 6 lần

và không nhiều hơn 8 ÷ 10 lần). Thử xem đã hết dung môi chƣa bằng cách lấy vài

giọt dung môi trong ống nhỏ lên trên mặt kính đồng hồ, để bay hơi nếu trên bề mặt

mặt kính đồng hồ không có vết loang coi nhƣ đã chiết xong.

Sau khi chiết xong, lấy túi mẫu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi,

sấy khô đến khối lƣợng không đổi và cân.

Kết quả:

Hàm lƣợng lipid đƣợc tính theo công thức:

( )

Hàm lƣợng lipid trong thực phẩm = (%)

Trong đó:

m: Khối lƣợng mẫu ban đầu (g)

G1: Khối lƣợng mẫu và giấy lọc trƣớc khi tách lipid (g)

G2: Khối lƣợng mẫu và giấy lọc sau khi tách lipid (g)

Phụ lục 1.5. Phƣơng pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí

Nguyên tắc:

Tổng số vi sinh vật hiếu khí đƣợc đếm bằng cách đỗ đĩa và ủ trong điều kiện

hiếu khí ở 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ

Môi trƣờng sử dụng:

- Môi trƣờng pha loãng mẫu: Buffer Peptone Water (BPW).

- Môi trƣờng nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA).

Tiến hành:

Hút 1 ml dịch ngâm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng BPW đã đƣợc hấp khử trùng ta đƣợc dung dịch pha loãng 10-1, làm tiếp tục để có độ pha loãng 10-2 và 10-3.

Dùng micropipet với các đầu tip vô trùng để chuyển 1 ml dịch pha loãng vào

Trang 4

giữa đĩa petri. Sau khi cấy, đổ vào đĩa 10 – 15 ml môi trƣờng PCA sau khi đƣợc hấp

Đồ án tốt nghiệp

khử trùng và làm nguội đến 45 – 50oC. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. Các đĩa đƣợc lật ngƣợc lại và ủ ở 37oC trong 48 giờ.

Kết quả:

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số

đếm từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ vi sinh vật hiếu khí trong thực

phẩm đƣợc tính nhƣ sau:

A = (CFU/ml)

Trong đó:

A: Số tế bào vi khuẩn trong mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn

n: Số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu cấy vào môi trƣờng (ml)

f: Độ pha loãng tƣơng ứng

Phụ lục 1.6. Phƣơng pháp xác định nấm men, nấm mốc

Nguyên tắc: Tổng nấm men, nấm mốc đƣợc xác định bằng cách cấy trang và ủ ở 30oC

trong 48 giờ.

Môi trƣờng sử dụng:

- Môi trƣờng pha loãng: Buffer Peptone Water (BPW)

- Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng dịch chiết khoai tây có bổ sung kháng

sinh.

Khoai tây 200g

Agar 2%

Kháng sinh chloramphenicol 2%

Nƣớc cất 1 lít

Trang 5

Tiến hành:

Đồ án tốt nghiệp

Hút 1 ml dịch ngâm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng BPW đã đƣợc hấp khử trùng ta đƣợc dung dịch pha loãng 10-1, làm tiếp tục để có độ pha loãng 10-2 và 10-3.

Đổ vào đĩa 10 – 15 ml môi trƣờng dịch chiết khoai tây đã đƣợc hấp khử

trùng, để nguội cho đến khi môi trƣờng đông lại. Dùng micropipet hút 0,1 ml dịch

ngâm mẫu cho vào đĩa, dùng que cấy trang trang đều mẫu trên bề mặt môi trƣờng cho đến khi khô. Sau khi cấy, ủ các đĩa ở 30oC trong 48 giờ.

Kết quả:

Đếm tất cả các khuẩn lạc nấm men, nấm mốc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ.

Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ nấm men –

nấm mốc trong thực phẩm đƣợc tính nhƣ sau:

A = (CFU/ml)

Trong đó:

A: Số tế bào vi khuẩn trong mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn

n: Số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu cấy vào môi trƣờng (ml)

f: Độ pha loãng tƣơng ứng

Phụ lục 1.7. Phƣơng pháp xác định mật độ E.coli

Nguyên tắc:

Mật độ E.coli đƣợc xác định bằng phƣơng pháp MPN (Most Probable

Number). Phƣơng pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu đƣợc pha loãng thành một dãy

thập phân liên tiếp và đƣa vào các ống nghiệm có chứa môi trƣờng thích hợp có

chứa ống Durnham, ủ và đọc số ống có kết quả dƣơng tính.

Môi trƣờng sử dụng:

- Môi trƣờng pha loãng: Buffer Peptone Water (BPW)

- Canh Lactose broth.

Trang 6

- Canh EC (E.coli medium)

Đồ án tốt nghiệp

- Môi trƣờng Eosine Methylene Blue Lactose agar (EMB)

Tiến hành:

Hút 1 ml dịch ngâm cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng BPW đã đƣợc hấp khử trùng ta đƣợc dung dịch pha loãng 10-1, làm tiếp tục để có độ pha loãng 10-2 và 10-3.

Hút 1 ml dịch mẫu đã pha loãng đầu tiên vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi

ống chứa 10 ml canh Lactose broth có bổ sung ống Durnham. Thực hiện tƣơng tự với dịch mẫu ở các độ pha loãng tiếp theo. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 24 giờ.

Ghi nhận các ống sinh hơi.

Dùng que cấy vòng cấy chuyển mẫu từ ống Lactose broth dƣơng tính sang các ống chứa canh EC broth và ủ ở 44oC trong 24 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi.

Đọc số lƣợng các ống sinh hơi. Số ống nghiệm cho phản ứng dƣơng tính của các

nồng độ pha loãng đƣợc tra theo bảng MPN (Mac Crady).

Dùng que cấy vòng chuyển một ít sinh khối từ các ống có sinh hơi trong môi trƣờng canh EC sang môi trƣờng thạch EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ.

Chọn các khuẩn lạc có hình đĩa, tròn, dẹt và có ánh kim tím. Các khuẩn lạc nghi

ngờ đƣợc cấy vào môi trƣờng canh tryptone, môi trƣờng MR – VP và simmon citrate agar (SCA) để thực hiện nghiệm pháp IMViC và đem ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Kết quả:

Mật độ E. coli đƣợc tính theo công thức:

A = Số Mac Crady * (MPN/ml)

Trong đó:

A: Mật độ E.coli có trong mẫu

Trang 7

f: nồng độ pha loãng (lấy nồng độ ở giữa trong 3 nồng độ pha loãng)

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC B

1.1. Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu

Analysis of Variance for pH - Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:nong do 0.0205556 0.0102778 2 0.04 0.9579

5 2.25828 9.48 0.0000 B:ngay 11.2914

1 7.0225 29.47 0.0000 C:nhiet do 7.0225

INTERACTIONS

2 0.205833 0.86 0.4337 AC 0.411667

25 0.238278 RESIDUAL 5.95694

35 TOTAL 24.7031

(CORRECTED)

- Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt

độ lạnh:

Multiple Range Tests for pH 2 by nhiet do

Method: 95.0 percent LSD

nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

Thƣờng 18 4.99444 0.115055 X

Lạnh 18 5.87778 0.115055 X

- Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng:

Multiple Range Tests for thuong by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

0 6 4.81667 X

Trang 8

0.2 6 5.05 X

Đồ án tốt nghiệp

0.4 6 5.11667 X

- Kết quả so sánh pH của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh:

Multiple Range Tests for lanh by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 6 5.81667 X

0.4 6 5.81667 X

0 6 5.96667 X

1.2. Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu

Analysis of Variance for do duc - Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:nong do 0.265285 2 0.132643 13.40 0.0001

B:nhiet do 0.389168 1 0.389168 39.31 0.0000

C:ngay 0.709442 5 0.141888 14.33 0.0000

INTERACTIONS

AB 0.0177141 2 0.00885703 .89 0.4214

RESIDUAL 0.247502 25 0.00990006

TOTAL 1.62911 35

(CORRECTED)

- Về nông độ:

Multiple Range Tests for do duc by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

0.2 12 0.135083 0.0286106 X

Trang 9

0.4 12 0.242833 0.0286106 X

Đồ án tốt nghiệp

12 0.345333 0.0286106 X 0

- Về nhiệt độ:

Multiple Range Tests for do duc by nhiet do

Method: 95.0 percent LSD

nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

18 .137111 .0233605 X L

18 .345056 .0233605 X T

- Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng:

Multiple Range Tests for thuong by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

6 0.2 0.239333 X

6 0.4 0.3195 X

6 0 0.476333 X

- Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh:

Multiple Range Tests for lanh by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 6 0.0308333 X

0.4 6 0.166167 X

Trang 10

0 6 .214333 X

Đồ án tốt nghiệp

1.3. Kết quả so sánh tổng vi sinh vật hiếu khí của dung dịch ngâm đậu hũ giữa

các mẫu

Analysis of Variance for tpc 2 - Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:nong do 9.03984 1.99 0.1573 4.51992 2

B:ngay 369.939 32.63 0.0000 73.9878 5

C:nhiet do 48.3025 21.30 0.0001 48.3025 1

INTERACTIONS

AC 0.34835 2 0.174175 0.08 0.9263

RESIDUAL 56.6802 25 2.26721

TOTAL 484.31 35

(CORRECTED)

- Về nhiệt độ:

Multiple Range Tests for tpc by nhiet do

Method: 95.0 percent LSD

nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

18 3.98072 .354903 X L

18 6.29739 .354903 X T

- Kết quả so sánh TPC của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng:

Multiple Range Tests for thuong by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 6 5.7985 X

0.4 6 6.04183 X

Trang 11

0 6 7.05183 X

Đồ án tốt nghiệp

- Kết quả so sánh độ đục của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh:

Multiple Range Tests for lanh by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

6 3.5435 X 0.4

6 3.75517 X 0.2

6 4.6435 X 0

1.4. Kết quả so sánh nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các

mẫu

Analysis of Variance for nmnm - Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

17.5645 A:nong do 2 8.78226 1.37 0.2732

93.3478 B:nhiet do 1 93.3478 14.53 0.0008

168.025 C:ngay 5 33.605 5.23 0.0020

INTERACTIONS

10.5442 AB 2 5.2721 .82 0.4516

160.563 RESIDUAL 25 6.42254

450.045 TOTAL 35

(CORRECTED)

- Về nhiệt độ:

Multiple Range Tests for nmnm by nhiet do

Method: 95.0 percent LSD

nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

L 18 0.270556 0.597334 X

Trang 12

T 18 3.49111 0.597334 X

Đồ án tốt nghiệp

- Kết quả so sánh nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt

độ thƣờng:

Multiple Range Tests for thuong by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

6 2.28167 X 0.2

6 2.99667 X 0.4

6 5.195 X 0

- Kết quả so sánh nấm men – nấm mốc của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt

độ lạnh:

Multiple Range Tests for lanh by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do1 Count Mean Homogeneous Groups

6 0.111667 X 0.2

6 0.215 X 0.4

6 0.485 X 0

1.5. Kết quả so sánh E.coli của dung dịch ngâm đậu hũ giữa các mẫu

Analysis of Variance for ecoli - Type III Sums of Squares

Source Sum of Df Mean F- P-

Squares Square Ratio Value

MAIN EFFECTS

A:nong do .216572 .108286 8.01 . 21 2

B:nhiet do .642669 .642669 47.52 . 0 1

C:ngay .912514 .182503 13.50 . 0 5

INTERACTIONS

Trang 13

AB .0350056 2 .0175028 1.29 .2918

Đồ án tốt nghiệp

RESIDUAL .338069 25 .0135228

TOTAL 2.14483 35

(CORRECTED)

- Về nồng độ:

Multiple Range Tests for ecoli by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

12 0.18 0.0339333 X 0.2

12 0.231667 0.0339333 X 0.4

12 0.364167 0.0339333 X 0

- Về nhiệt độ:

Multiple Range Tests for ecoli by nhiet do

Method: 95.0 percent LSD

nhiet do Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups

18 0.125 0.0277064 X L

18 0.392222 0.0277064 X T

- Kết quả so sánh E.coli của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ thƣờng:

Multiple Range Tests for thuong by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

0.2 6 0.278333 X

0.4 6 0.36 X

0 6 0.538333 X

Trang 14

- Kết quả so sánh E.coli của dung dịch ngâm đậu hũ ở nhiệt độ lạnh:

Đồ án tốt nghiệp

Multiple Range Tests for lanh by nong do

Method: 95.0 percent LSD

nong do Count Mean Homogeneous Groups

6 0.0816667 X 0.2

6 0.103333 X 0.4

Trang 15

6 0.19 X 0