Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM

Trichoderma spp. VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH PHỔ BIẾN

TRÊN CÂY HỒ TIÊU

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn :

TS. NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện

TRẦN HÀ PHƯƠNG HẢO

:

MSSV: 1211100073

Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên: TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO.

Sinh ngày 26 tháng 10 năm 1994 tại tỉnh Tiền Giang.

Quê quán: Xã Tân Lập 1 – huyện Tân Phước – tỉnh Tiền Giang.

MSSV: 1211100073

Lớp: 12DSH02

Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Tôi xin cam đoan:

- Đồ án tốt nghiệp là thành quả từ sự nghiên cứu hoàn toàn thực tế trên cơ sở các

số liệu thực tế và được thực hiện theo hướng dẫn của giáo viên hướng dẫn.

- Đồ án được thực hiện hoàn toàn mới, là thành quả của riêng tôi, không sao chép

theo bất cứ đồ án tương tự nào.

- Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn các nguồn tài liệu

trong báo cáo và danh mục tài liệu tham khảo.

- Mọi sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế của nhà trường, tôi xin hoàn toàn

chịu trách nhiệm.

Tp.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2016

Sinh viên

TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO

LỜI CẢM ƠN

Qua 4 năm học tập và rèn luyện tại trường Trường Đại học Công Nghệ

TP.HCM, được sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy

cô khoa Môi Trường – Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về

lý thuyết và thực hành trong suốt thời gian học tập. Và trong thời gian thực hiện đồ án

tại Công Ty TNHH Điền Trang, tôi có nhiều cơ hội áp dụng kiến thức học ở trường

vào môi trường thực tế ở công ty, đồng thời học hỏi được nhiều kinh nghiệm làm việc

của các anh chị tại công ty.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Công ty TNHH Điền Trang đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho để tôi có thể thực hiện đề tài tốt nghiệp tại công ty. Em

cảm ơn các anh, chị ở phòng Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Điền Trang

đã hỗ trợ, chia sẽ và giúp đỡ cho em trong thời gian thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai, người đã hết lòng hướng

dẫn, chỉ bảo và tận tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, nơi là chỗ dựa

vững chắc cho con trong suốt thời gian học tập.

Trong quá trình viết luận văn báo cáo, do kiến thức còn hạn hẹp nên không

tránh khỏi những thiếu sót trong cách hiểu và những lỗi trình bày, tôi rất mong nhận

được ý kiến đóng góp của quý thầy cô và Ban lãnh đạo nhà trường, các anh chị trong

công ty để giúp bài báo cáo tốt nghiệp của tôi đạt kết quả tốt hơn.

Tp.HCM, ngày 30 tháng 07 năm 2016

Sinh viên

TRẦN HÀ PHƢƠNG HẢO

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................................. i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................v

DANH MỤC CÁC B ẢNG ................................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ............................................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................................. viii

MỞ ĐẦU................................................................................................................................... 1

Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1 1.

Tình hình nghiên cứu .............................................................................................. 2 2.

3. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 3

Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................................... 3 4.

Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................................ 3 5.

Các kết quả đạt đƣợc của đề tài ............................................................................ 3 6.

7. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp ............................................................................... 4

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 5

1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu ........................................................................................ 5

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây hồ tiêu ................................................................. 5

1.1.2. Phân bố địa lý ..................................................................................................... 5

1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu ........................................................... 6

1.1.3.1. Tình hình sản xuất ....................................................................................... 6

1.1.3.2. Tình hình tiêu thụ ........................................................................................ 9

1.1.4. Tình hình nghiên cứu dịch hại cây hồ tiêu ở Thế giới và Việt Nam....... 11

1.1.4.1. Thế Giới ..................................................................................................... 11

1.1.4.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 12

1.2. Một số nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu ..................................................... 14

1.2.1. Nấm Phytophthora spp. .................................................................................. 14

i

1.2.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora spp ..................................... 14

Đồ án tốt nghiệp

1.2.1.2. Vòng đời .................................................................................................... 15

1.2.1.3. Phytophthora gây bệnh trên cây hồ tiêu................................................. 16

1.2.2. Nấm Fusarium spp. ......................................................................................... 18

1.2.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium spp. ........................................... 18

1.2.2.2. Vòng đời .................................................................................................... 20

1.2.2.3. Fusarium gây bệnh trên cây hồ tiêu ....................................................... 21

1.2.3. Nấm Colletotrichum spp. ................................................................................ 23

1.2.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Colletotrichum spp................................... 23

1.2.3.2. Vòng đời .................................................................................................... 25

1.2.3.3. Colletotrichum gây bệnh trên cây hồ tiêu .............................................. 26

1.3. Biện pháp sinh học trong quản lý bệnh hại cây trồng ................................... 27

1.3.1. Lịch sử biện pháp sinh học............................................................................. 27

1.3.1.1. Thế giới ....................................................................................................... 27

1.3.1.2. Việt Nam ..................................................................................................... 28

1.3.2. Khái niệm........................................................................................................... 28

1.3.3. Ưu và nhược điểm của biện pháp sinh học trong nông nghiệp ............... 28

1.3.3.1. Ưu điểm ...................................................................................................... 28

1.3.3.2. Nhược điểm ................................................................................................ 29

1.3.4. Các ứng dụng sinh học trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu............. 29

1.4. Nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh cây trồng .................................. 31

1.4.1. Nấm Trichoderma spp..................................................................................... 31

1.4.1.1. Phân loại ................................................................................................... 31

1.4.1.2. Sự phân bố của nấm Trichoderma spp ................................................... 31

1.4.1.3. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 32

1.4.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học ..................................................... 33

1.4.1.5. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh cây trồng ............................................ 34

ii

1.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp của nấm Trichoderma ................................ 38

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây .................................................................. 38

1.4.2.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng................................................ 39

1.4.2.3. Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. ....................... 40

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 41

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .............................................................. 41

2.2. Vật liệu ...................................................................................................................... 41

2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh .................................................. 41

2.2.1.1. Nấm đối kháng ........................................................................................... 41

2.2.1.2. Nấm gây bệnh ............................................................................................ 41

2.2.2. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng ............................................................... 41

2.2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 41

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................................... 42

2.3.1. Phương pháp thu mẫu..................................................................................... 42

2.3.1.1. Thu mẫu đất (Theo TCVN 4046 – 85) ................................................... 42

2.3.1.2. Thu mẫu bệnh............................................................................................. 42

2.3.2. Phân lậpTrichoderma spp. và nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu ....... 44

2.3.2.1. Phân lập nấm Trichoderma spp. trong đất ........................................... 44

2.3.2.2. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu ... 45

2.3.2.3. Phân lập nấm Fusarium gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu ........... 46

2.3.2.4. Phân lập nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây hồ tiêu ..... 47

2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm ................................................... 48

2.3.4. Xác định hoạt tính cellulose: Phương pháp khuếch tán trên thạch ....... 49

2.3.5. Xác định khả năng đối kháng ........................................................................ 49

2.3.6. Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu. .................................................................................... 50

iii

2.3.6.1. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Phytophthora sp. (phân lập trong mẫu đất trồng tiêu)........................................... 50

Đồ án tốt nghiệp

2.3.6.2. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Fusarium sp. (phân lập từ rễ cây tiêu bị bệnh chết chậm)..................................... 51

2.3.6.3. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm Colletotrichum sp. (phân lập từ lá cây hồ tiêu bị bệnh thán thư) ......................... 51

2.3.7. Phương pháp phân tích số liệu ...................................................................... 51

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 52

3.1. Kết quả phân lập nấm Trichoderma spp. .......................................................... 52

3.2. Kết quả phân lập nấm bệnh................................................................................. 55

3.2.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp....................................................... 55

3.2.2. Kết quả phân lập nấm Fusarium sp. ............................................................ 56

3.2.3. Kết quả phân lập nấm Colletotrichum sp. ................................................... 57

3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng Trichoderma ..... 61

3.4. Đánh giá khả năng đối kháng Trichoderma spp. với nấm bệnh đã đƣợc phân lập............................................................................................................................... 63

3.4.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp. ......... 63

3.4.2. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu................................................................................................... 67

3.4.3. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu................................................................................................................ 72

3.4.4. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây tiêu .............................................................................................................. 77

3.4.5. Tổng hợp khả năng đối kháng của các Trichoderma spp. với 3 nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu ..................................................................................... 83

KẾT LUẬN ............................................................................................................................ 85

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................... 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 87

PHỤ LỤC 1 .............................................................................................................................. 1

iv

PHỤ LỤC 2 ............................................................................................................................ 10

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

VPA: Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam

IAA: Acid indolacetic

EU: Liên minh châu Âu (European Union)

USD: Đô la Mỹ (United States dollar)

ITC: Trung tâm thương mại quốc tế

CABI: Tổ chức phi lợi nhuận

PDA: Potato Dextro Agar

CMC: Carboxy methyl cellulose

DRBC: Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol

WA: Water agar

NPK: Nitơ photpho kali (Ure – lân – kali)

ĐK: Đối kháng

ĐC: Đối chứng.

v

NSC: Ngày sau cấy

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu năm 2014 ......................................... 7

Bảng 1.2: Giá tổng hợp của tiêu đen và tiêu trắng (Đơn vị: USD) .................................. 10

Bảng 1.3: Tần suất xuất hiện sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu tại ba vùng điều tra............ 12

Bảng 3.1: Mật số nấm Trichoderma trong đất Bình Phước .............................................. 52

Bảng 3.2: Số chủng Trichoderma bắt ra ở mỗi vườn......................................................... 52

Bảng 3.3: Các chủng Trichoderma spp. phân lập từ các mẫu đất tỉnh Bình Phước ..... 54

Bảng 3.4: Bán kính tản nấm Trichoderma spp. sau các ngày nuôi cấy ........................... 64

Bảng 3.5: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Phytophthora sp................... 68

Bảng 3.6: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Fusarium sp.......................... 73

Bảng 3.7: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với Colletotrichum sp. ............... 78

Bảng 3.8: Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với Phytophthora sp. sau 3

vi

NSC và Fusarium sp., Colletotrichum sp. sau 7 NSC. ...................................................... 83

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1.1: Tăng trưởng về số lượng hồ tiêu ở Đông Nam Á và các quốc gia khác ..... 8

Biểu đồ 1.2: Nhập khẩu hồ tiêu của 28 quốc gia EU từ một số nước Đông Nam Á ..... 11

giai đoạn 2010 – 2014 (đơn vị: USD) .................................................................................. 11

Biểu đồ 3.1 Đường kính phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. ............. 61

Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Phytophthora sp. 5 NSC ....... 70

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Fusarium sp. 7 NSC .............. 75

vii

Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Colletotrichum sp. 7NSC...... 80

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Bản đồ phân bố các vùng trồng tiêu tại Việt Nam .............................................. 6

Hình 1.2: Các sản phẩm của cây hồ tiêu................................................................................ 9

Hình 1.3: Chu kì sống của Phytophthora ............................................................................ 15

Hình 1.4: Triệu chứng của bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu ........................................... 16

Hình 1.5: Thiệt hại của bệnh chết nhanh ............................................................................ 18

Hình 1.6: Fusarium gây cây héo rủ và các loại bào tử ...................................................... 20

Hình 1.7: Triệu chứng của bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu............................................. 22

Hình 1.8: Thiệt hại của bệnh chết chậm .............................................................................. 23

Hình 1.9: Cọng mang bào tử đính và bào tử đính của nấm Colletotrichum ................... 24

Hình 1.10: Triệu chứng của bệnh thán thư trên cây hồ tiêu .............................................. 26

Hình 1.11: Thiệt hại do nấm Colletotrichum gây ra .......................................................... 27

Hình 1.12: Nấm Trichoderma mọc trong tự nhiên............................................................. 32

Hình 1.13: Khuẩn lạc của nấm Trichoderma Harzianum ................................................. 32

Hình 1.14: Vách tế bào Rhizoctonia solani bị enzyme của Trichoderma chọc thủng... 35

Hình 1.15: Nấm Trichoderma (vàng) ký sinh trên nấm Pythium (xanh) ........................ 36

Hình 1.16: Sự phát triển rễ cây giữa việc sử dụng và không sử dụng Trichoderma ..... 39

Hình 1.17: Gia tăng sản lượng ớt với hạt giống xử lý và không xử lý Trichoderma .... 39

Hình 2.1: Thu mẫu đất ........................................................................................................... 42

Hình 2.2: Thu mẫu lá tiêu bệnh thán thư ............................................................................. 43

Hình 2.3: Lấy mẫu rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm ............................................... 43

Hình 2.3: Bẫy nấm Phytophthora bằng cánh hoa hồng ..................................................... 46

Hình 2.4: Rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm .............................................................. 47

Hình. 3.1: Nấm Trichoderma trên môi trường DRBC sau 3 ngày. .................................. 52

Hình 3.2: Hình thái đ ại thể và vi thể của nấm Trichoderma sp. phân lập từ đất ............ 53

Hình 3.3: Cánh hoa hồng bị chuyển màu và đặt trên môi trường WA ............................ 55

viii

Hình 3.4: Nấm Phytophthora sp. trên trường PDA ........................................................... 55

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.5: Bào tử và các du động bào tử của Phytophthora sp. dưới hính hiển vi ......... 56

Hình 3.6: Nấm Fusarium sp. trên môi trường WA ............................................................ 56

Hình 3.7: Nấm Fusarium sp. trên môi trường PDA........................................................... 57

Hình 3.8: Đại bào tử và các tiểu bào tử của nấm Fusarium sp......................................... 57

Hình 3.9: Tơ nấm Colletotrichum sp. phát triển từ mẫu lá bệnh ...................................... 58

Hình 3.10: Nấm Colletotrichum sp. trên môi trường PDA ............................................... 58

Hình 3.11: Bào tử nấm Colletotrichum sp. ......................................................................... 59

Hình 3.12: Khả năng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp. ................... 62

Hình 3.13: Hình thái chủng nấm Trichoderma sp. phát triển qua các ngày ................... 63

Hình 3.14: Các chủng Trichoderma có khả năng phủ kín đĩa sau 4 ngày nuôi cấy....... 66

Hình 3.15: Trichoderma sp. đối kháng với Phytophthora sp. theo dõi qua các ngày ... 67

Hình 3.16: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Phytophthora sp. và đĩa nấm Phytophthora sp. sau 7 ngày nuôi c ấy .................................................................. 71

Hình 3.17: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với Fusarium sp. theo dõi qua các ngày. 72

Hình 3.18: Chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium sp. và đĩa nấm bệnh Fusarium sp. sau 7 ngày nuôi cấy........................................................... 76

Hình 3.19: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. ...................... 77

Hình 3.20: Khuẩn ty Trichoderma sp. quấn chặt lấy khuẩn ty Colletotrichum sp......... 81

ix

Hình 3.21: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Colletotrichum sp. sau 7 ngày nuôi cấy và đĩa nấm bệnh Colletotrichum sp. sau 5 ngày nuôi cấy............. 82

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Hồ tiêu là một trong những loại cây công nghiệp xuất khẩu chủ lực của nước ta.

Sản lượng xuất khẩu hồ tiêu hằng năm đứng hàng đầu thế giới. Theo Hiệp hội hồ tiêu

Việt Nam (VPA), sản lượng hồ tiêu trong tháng 11 năm 2015 của cả nước xấp xỉ

khoảng 124.000 tấn, kim ngạch đạt gần 1,2 tỷ, tăng 2,8 % giá trị so với năm 2014. Do

giá trị xuất khẩu cao nên diện tích trồng tiêu ngày càng tăng. Trong đó, Bình Phước

dẫn đầu cả nước về diện tích và sản lượng, tổng diện tích trồng tiêu trên toàn tỉnh là

13.000 ha và cho sản lượng trên 30.000 tấn/năm. Để đạt được năng suất cao, nhiều hộ

nông dân đã bón quá nhiều phân vô cơ đến mức báo động: 1200 kg N, 1230 kg P2O5 và

1425 kg K2O/ha, vượt 4 - 5 lần khuyến cáo phân bón cho cây tiêu (Đỗ Trung Bình,

2013). Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào phân bón hóa học mà hệ

sinh vật đất và chất lượng đất cũng bị tàn phá nghiêm trọng.

Đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng trong đất bị mất cân đối, tồn dư các chất

độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát

sinh một số dịch hại không dự báo trước, việc trồng trọt về sau ngày càng khó khăn

hơn. Trong những năm gần đây hiện tượng chết nhanh và chết chậm trên cây tiêu diễn

ra khá phổ biến ở nhiều vùng với tỷ lệ cây bệnh từ 10 – 15 %. Thậm chí, có nhiều vườn

có tỷ lệ thiệt hại lên đến 80 – 90 % (Lê Văn Trịnh, 2009). Bệnh đã gây thiệt hại nặng

hàng trăm hecta hồ tiêu trong tỉnh Bình Phước. Trước tình hình đó, các biện pháp sinh

học được xem là giải pháp giúp giảm lượng phân bón, tăng năng suất cây trồng và thân

thiện với môi trường.

Hiện nay, theo định hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững, có giá trị xuất

khẩu cao, việc tăng cường sử dụng những chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong

canh tác cây trồng đang được chú trọng. Chế phẩm nấm Trichoderma được ứng dụng

1

phổ biến vì chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản và quan trọng nhất là hiệu quả đem lại

Đồ án tốt nghiệp

cao. Trichoderma là một loại vi nấm hoại sinh trong đất có khả năng đối kháng các vi

nấm gây bệnh thực vật với phổ tác động rộng, thông qua ba cơ chế bao gồm ký sinh,

tiết ra kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của nấm bệnh (Nguyễn Văn Đĩnh

và cộng sự, 2007), đặc biệt là không gây hại cho con người và thân thiện với môi

trường.

Xuất phát từ những yêu cầu trên, việc phân lập các chủng nấm Trichoderma ở

trong đất, có khả năng đối kháng tốt với các nấm Phytophthora, Fusarium,

Colletotrichum, làm nguồn vật liệu để sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma là lý do mà

em chọn đề tài: ―Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm

gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu‖.

2. Tình hình nghiên cứu

 Trong nước

Nguyễn Ngọc Phúc năm 2005, đã tiến hành khảo sát mật độ Trichoderma trong

đất và mối liên hệ của chúng với các yếu tố môi trường như: pH, độ ẩm, hàm lượng

Mg, Ca,… Từ đó, phân lập các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với

các nấm bệnh

Đỗ Thu Hà và Lê Tố Nga (2015) phân lập các chủng nấm trong đất tại Đà Nẵng

và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng đối kháng tốt với chủng nấm Fusarium,

Colletotrichum gây bệnh trên cây ớt, lên men xốp tạo chế phẩm sinh học.

Phạm Thị Thiên (2014) đã khảo sát khả năng kết hợp một số chủng Bacillus có

khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh IAA với nấm Trichoderma sp. để kiểm soát

sinh học nấm Pythium sp. và Fusarium sp. gây bệnh trên cây hồ tiêu.

Trần Kim Loan và cộng sự (2008) thuộc viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam,

với chế phẩm sinh học Trichoderma (Tricho – VN) phòng trừ bệnh do nấm

2

Phytophthora gây ra trên cây hồ tiêu.

Đồ án tốt nghiệp

 Nước ngoài

S. Goswami và cộng sự (2015) các chủng Trichoderma được phân lập từ đất của

vườn chè ở Ấn Độ được đánh giá khả năng đối kháng chống lại mầm bệnh trên cây

trà, chủ yếu là nấm Pestalotia theae và Fusarium solani.

Mausam Verma và cộng sự (2007), 18 chủng Trichoderma từ đất của các vùng

khác nhau ở Ấn Độ được phân tích về khả năng kiểm soát sinh học chống lại bệnh bạc

lá khoai môn, mầm bệnh chính là Phytophthora colocasiae.

3. Mục đích nghiên cứu

Tìm ra các chủng nấm Trichoderma spp. có khả năng đối kháng với nấm bệnh

Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp., làm cơ sở cho việc sử dụng

trong phòng trừ nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập một số chủng Trichoderma spp. trong đất trồng tiêu tại một số vườn

thuộc tỉnh Bình Phước.

Phân lập các nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu: Phytophthora sp. gây bệnh chết

nhanh, Fusarium sp. gây bệnh chết chậm và Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư.

Khảo sát đối kháng của nấm Trichoderma spp. phân lập được trong đất với các

nấm Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. gây bệnh phổ biến trên cây

hồ tiêu trong điều kiện phòng thí nghiệm.

5. Phƣơng pháp nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp thường quy trong nghiên cứu khoa học.

6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài

Dựa hình thái đại thể, hình thái vi thể và tốc độ tăng trưởng, người thực hiện đề

tài đã phân lập được 34 chủng Trichoderma khác nhau hoàn toàn từ các mẫu đất ở tỉnh

Bình Phước.

Phân lập được 3 chủng nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu là Phytophthora

3

sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. từ đất và các mẫu bệnh.

Đồ án tốt nghiệp

Trong số 34 chủng Trichoderma spp. có 8 chủng đối kháng 100 % với

Phytophthora sp., 3 chủng đối kháng 100 % với Fusarium sp và 18 chủng có khả năng

đối kháng 100 % với Colletotrichum sp. Chủng BP2_B.2 có khả năng đối kháng cao

với cả 3 chủng nấm bệnh chỉ sau 3 ngày nuôi cấy.

Khảo sát sinh enzyme cellulase, chủng BP3_03.4 có hoạt tính enzyme rất mạnh.

Ứng dụng tốt trong phân hủy các hữu cơ, dùng làm compost.

7. Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp

“Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh

phổ biến trên cây hồ tiêu”, có tất cả 3 chương gồm:

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nguồn gốc, phân

bố, tình hình sản xuất, tiêu thụ và thực trạng canh tác cây hồ tiêu ở Việt Nam. Qua đó,

trình bày các đặc điểm sinh học cũng như triệu chứng, thiệt hại của một số nấm bệnh

phổ biến trên cây hồ tiêu như nấm Phytophthora spp., nấm Fusarium spp., nấm

Colletotrichum spp. Từ đó, đưa ra các kết quả nghiên cứu và ứng dụng của các biện

pháp sinh học trong nông nghiệp, nổi bật là nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh

hại trên cây hồ tiêu, cụ thể như khả năng phân hủy chất hữu cơ hay những cơ chế đối

kháng với nấm bệnh cây trồng.

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương

pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm

tiến hành đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu

tập trung ở phần thu mẫu, phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh, cũng như

đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm bệnh bằng

phương pháp sử lý số liệu thống kê SAS.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình bày kết quả phân lập nấm

Trichoderma spp. và nấm bệnh. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của nấm

4

Trichoderma với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu đã được phân lập.

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây hồ tiêu

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố cây hồ tiêu [22]

Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) thuộc họ Piperaceae, là một loại dây leo thân gỗ

lâu năm. Có nguồn gốc từ bang Tây Ghats (Ấn Độ), được trồng cách nay khoảng 6.000

năm (Sasikumar và cộng sự, 1999; Ravindran và cộng sự, 2000). Hạt tiêu đen là một

loại gia vị phổ biến được sử dụng để tăng hương vị cho nhiều loại món ăn trên toàn thế

giới. Ở Ấn Độ, hồ tiêu được mệnh danh là ―Vua của các loại gia vị‖.

Ở Việt Nam, cây hồ tiêu mọc hoang được tìm thấy từ trước thế kỷ XVI, nhưng

đến thế kỷ XVII mới được trồng. Đến cuối thế kỷ XIX, hồ tiêu được trồng với diện tích

tương đối khá lớn ở Phú Quốc, Hòn Chồng và Hà Tiên (Kiên Giang), chủ yếu do người

Hoa gốc ở đảo Hải Nam theo Mạc Cửu di cư vào Hà Tiên. Cũng trong khoảng thời

gian này và đầu thế kỷ XX, cây hồ tiêu theo chân các chủ đồn điền người Pháp phát

triển lên vùng Bình Long, Bà Rịa - Vũng Tàu, Quảng Trị và Quảng Nam.

1.1.2. Phân bố địa lý

Hồ tiêu là loại cây đặc trưng ở vùng nhiệt đới, thích hợp trong điều kiện mưa đều. Nhiệt độ thích hợp khoảng 20 – 30oC, nhiệt độ đất ở độ sâu 30 cm trong khoảng 25 - 28oC. Hồ tiêu là cây ưa bóng trong giai đoạn cây con, ánh sáng tán xạ thích hợp

cho yêu cầu sinh trưởng, phát dục và phân hoá mầm hoa. Giai đoạn tiêu ra hoa đậu

quả, nuôi quả đến khi quả chín, cây tiêu cần nhiều ánh sáng. Việc có đủ ánh sáng trong

giai đoạn nuôi quả giúp giảm rụng quả non và tăng dung trọng hạt tiêu [66].

Hồ tiêu thường được trồng nhiều ở những vùng có khí hậu nóng, ẩm như: Ấn

Độ, Hải Nam (Trung Quốc), Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Thái Lan,... Ngoài các

vùng này, hồ tiêu còn được trồng phổ biến ở Brazil và Madagascar. Ở Việt Nam, tiêu

5

được trồng chủ yếu ở vùng Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Kiên Giang (Phú Quốc).

Đồ án tốt nghiệp

(Nguồn: Syngenta, Kỹ thuật canh tác hồ tiêu)

Hình 1.1: Bản đồ phân bố các vùng trồng tiêu tại Việt Nam

1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu

1.1.3.1. Tình hình sản xuất

Vào thế kỷ XVII, cây hồ tiêu đã trở thành cây công nghiệp có nhiều tiềm năng và

triển vọng không những của nông nghiệp Việt Nam mà của cả thế giới. Sự phát triển

ngoạn mục này bắt đầu từ những năm 1983 - 1990, khi giá hồ tiêu trên thị trường thế

giới tăng cao. Diện tích trồng tiêu của Việt Nam đã liên tục tăng và đạt gần 9.200 ha, từ

400 ha vào những năm 1970. Với tốc độ tăng bình quân năm 1996 là 27,29 %, diện

tích canh tác của Việt Nam đã vượt mức 50.000 ha vào năm 2004. Trong hơn 5 năm

6

trở lại đây, từ cuối năm 2008 đến nay khi giá tiêu tăng gấp đôi các năm trước và đến

Đồ án tốt nghiệp

năm 2011 giá tiêu đã đạt mức kỷ luật 5,500 - 5,800 USD/tấn đối với tiêu đen và 8,000

– 8,500 USD/tấn tiêu trắng, đã gia tăng diện tích trồng tiêu lên nhanh chóng [11]. Tăng

nhanh từ 60.000 ha năm 2013, tăng lên 85.000 ha năm 2014, tăng khoảng 25.000 ha

gần bằng 41,7%. Năm 2015 mặc dù chưa có thống kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích

hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam,

2015).

Tây Nguyên là vùng trồng tiêu lớn nhất của cả nước với tổng diện tích năm 2014

là 43.938,9 ha. Đông Nam Bộ có 34.285,6 ha. Còn lại là các tỉnh Duyên Hải Nam

Trung Bộ có 3.022,9 ha, Bắc Trung Bộ có 3.599,3 ha, Đồng bằng Sông Cửu Long có

744,2 ha (Theo số liệu Tổng Cục Thống kê Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015).

Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu năm 2014

Tổng Diện tích Trồng mới Năng suất Sản lƣợng Tỉnh diện tích thu hoạch (Ha) (Tạ/Ha) (Tấn) (Ha) (Ha)

Tổng cộng 85.591 13.927,5 58.526,6 25,9 151.760,8

Duyên hải Nam 3.022,9 508,1 2.249,0 15,1 3.393,2 Trung Bộ

Tây Nguyên 43.938,9 8.200,5 26.422,2 31,4 83.076,0

Đông 34.285,6 4.871,5 26.344,3 23,2 61.047,9 Nam Bộ

Đồng bằng

sông 744,2 69,0 613,9 25,9 1.591,8

Cửu Long

(Nguồn: Theo số liệu của Tổng Cục Thống kê, số liệu sơ bộ, 2015)

7

Bắc 3.599,3 278,5 2.897,2 9,2 26.520 Trung Bộ

Đồ án tốt nghiệp

Năng suất hồ tiêu của Việt Nam có sự khác biệt giữa các vùng trồng tiêu. Năm

suất bình quân của cả nước năm 2006 đạt 21,19 tạ/ha, năm 2014 đạt đến 25,9 tạ/ha.

Vùng Tây Nguyên có năng suất bình quân cao nhất 31,4 tạ/ha (năm 2014), trong khi

đó các tỉnh Bắc Trung Bộ chỉ có 9,2 tạ/ha, bằng 29,3% của các tỉnh Tây Nguyên. Các

tỉnh có năng suất cao như: Gia Lai đạt 39,4 tạ/ha, Đắk Lắk đạt 30,7 tạ/ha, Bình Phước

28,7 tạ/ha và Kiên Giang đạt 26 tạ/ha (Theo số liệu Tổng Cục Thống kê Hiệp Hội hồ

tiêu Việt Nam, 2015). Dựa vào các số liệu thống kê cho thấy những năm gần đây hồ

tiêu được phát triển khá nhanh ở Việt Nam, nhất là các tỉnh ở Tây Nguyên và Đông

Nam Bộ.

Biểu đồ 1.1: Tăng trưởng về số lượng hồ tiêu ở khu vực Đông Nam Á

và các quốc gia khác

(Nguồn: Nedspice, năm 2014)

Trong định hướng phát triển ngành hồ tiêu Việt Nam, Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn vừa phê duyệt Quy hoạch phát triển Ngành hồ tiêu Việt Nam

đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030 nhằm tăng năng suất và giá trị ngành hồ tiêu

8

đáp ứng nhu cầu thị trường, đặc biệt là thị trường xuất khẩu; khai thác lợi thế về đất

Đồ án tốt nghiệp

đai, nguồn nước, khí hậu, thời tiết để phát triển hồ tiêu theo hướng sản xuất hàng hóa,

tập trung, hiệu quả và bền vững. Mục tiêu của quy hoạch là phấn đấu đến năm 2020,

tầm nhìn 2030 diện tích trồng hồ tiêu cả nước duy trì ổn định ở mức 50.000 ha, năng

suất đạt 30 tạ/ha, sản lượng đạt 140.000 tấn và sản phẩm tiêu chất lượng cao đạt 90 %

(Quyết định 1442 về quy hoạch phát triển Ngành hồ tiêu Việt Nam đến năm 2020, tầm

nhìn 2030 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ngày 27/06/2014).

1.1.3.2. Tình hình tiêu thụ

Hình 1.2: Các sản phẩm của cây hồ tiêu

Hồ tiêu là một trong những loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế và giá trị xuất

khẩu cao. Trên thị trường thế giới, các sản phẩm hồ tiêu được giao dịch ở các dạng:

tiêu đen, tiêu trắng, tiêu xanh và dầu nhựa tiêu [39].

Từ năm 2003, Việt Nam đã bắt đầu xuất khẩu tiêu trắng, tuy vậy lượng tiêu trắng

9

xuất khẩu chiếm tỷ trọng không đáng kể. Số lượng tiêu trắng xuất khẩu hàng năm tăng

Đồ án tốt nghiệp

lên, chất lượng tiêu trắng ngày càng được nâng cao đáp ứng nhu cầu khách hàng của

thị trường thế giới. Việc gia tăng mặt hàng xuất khẩu tiêu trắng đã làm tăng đáng kể giá

trị xuất khẩu hồ tiêu của nước ta [39].

Bảng 1.2: Giá tổng hợp của tiêu đen và tiêu trắng (Đơn vị: USD)

Tiêu đen Tiêu trắng Tháng 2015 2013 2014 2013 2014 2015

9.166 6.584 7.633 1 9.033 10.157 12.729

9.007 6.749 6.863 2 9.167 9.712 12.945

8.959 6.567 6.664 3 9.070 9.464 12.830

8.964 6.437 7.115 4 9.086 10.330 12.657

8.885 6.348 7.648 5 9.024 10.330 12.657

6.237 7.821 6 8.982 10.413

6.292 8.995 7 9.067 11.412

6.399 9.407 8 9.064 12.461

6.823 9.726 9 9.117 12.806

7.068 9.770 10 9.360 13.023

7.460 9.866 11 9.842 12.008

(Nguồn: Cục Xúc tiến Thương mại, tháng 7/2015)

7.858 9.666 12 10.562 13.649

Từ năm 1999, Việt Nam trở thành nước sản xuất tiêu lớn thứ 3 thế giới chỉ sau

Ấn Độ và Indonesia và là nước xuất khẩu hạt tiêu lớn thứ 2 thế giới sau Indonesia. Và

hiện nay, Việt Nam đứng đầu thế giới về sản lượng xuất khẩu hồ tiêu, chiếm tới 50 %

sản lượng xuất khẩu của toàn thế giới. Hồ tiêu Việt Nam hiện được xuất khẩu tới gần

80 quốc gia và các vùng lãnh thổ. Đặc biệt là xuất khẩu các loạt hàng chất lượng cao

10

vào Mỹ, Nhật và các nước EU ngày càng tăng [19].

Đồ án tốt nghiệp

350000

323479

321692

300000

278080

200000

250000

150000

92017

88861

100000

72025

50000

693

185

134

145

136

152

32

20

12

0

2012

2013

2014

Indonesia Thái Lan Campuchia Bangladesh Việt Nam

Biểu đồ 1.2: Nhập khẩu hồ tiêu của 28 quốc gia EU từ một số nước Đông Nam Á

(Nguồn: Trung tâm thương mại quốc tế ITC, tháng 10/2015)

giai đoạn 2010 – 2014 (đơn vị: USD)

1.1.4. Tình hình nghiên cứu dịch hại trên cây hồ tiêu ở Thế giới và Việt Nam

1.1.4.1. Thế Giới [16]

Bọ ăn lá, Longitarsus nigripennis là sâu hại nghiêm trọng nhất trên tiêu ở Ấn Độ

và phạm vi ảnh hưởng của nó là 20 – 30 % ở vùng đồng bằng của Malabar (bắc Kerala)

và 5 – 10 % ở Wynad và Travancore (nam Kerala).

Rệp vảy, Lepidosaphes piperis là côn trùng gây hại chủ yếu trên tiêu ở vùng

cao. Một số loài khác được ghi nhận trên tiêu ở Ấn Độ, Lepidosaphes piperis và

Aspidiotus destructor.

Chín loài rệp sáp có tên lần lượt là Icerya sp., I. aegyptiaca, Planococcus sp., P.

citri, P. minor, Ferrisia virgate, Pseudococcus sp., P. longispinus và P. orchidicola

được ghi nhận gây hại trên tiêu. Rệp sáp thường gây hại trên những bộ phận non của

11

cây tiêu như chồi non, lá non, quả non, thường không quan sát được triệu chứng gây

Đồ án tốt nghiệp

hại rõ ràng trên vườn; Tuy nhiên, sự gây hại nghiêm trọng của P. longispinus trên chồi

non làm héo cây con trong vườn ươm. Planococcus sp. gây hại các bộ phận dưới đất

làm biến vàng dẫn đến chết những dây tiêu non trên đồng và trong vườn ươm.

Bọ cánh cứng ăn lá được ghi nhận trên tiêu gồm Neculla pollinaria, Pagria

costatipennis, Hermaeophaga sp. và Lanka sp. ở Kerala và Tegyrius sp. ở Karnataka,

Eugnathus curvus và Myllocerus sp. tất cả những loài này thường ăn lá non tạo thành

những lỗ nhỏ.

1.1.4.2. Ở Việt Nam [16], [17], [24]

Bảng 1.3: Tần suất xuất hiện sâu bệnh hại trên cây hồ tiêu tại ba vùng điều tra

Tần suất xuất hiện (%) Mức độ Dịch hại gây hại Đông Nam Bộ Tây Nguyên Quảng Trị

Chết nhanh 77,5 +++ 54,3 60,2

Chết chậm 62,0 ++ 56,1 54,0

Bệnh virus 37,8 + 27,4 39,5

Thán thƣ 22,1 ++ 12,6 15,6

Rệp sáp 84,4 ++ 67,8 75,1

Tuyến trùng 41,5 ++ 35,7 47,8

(Nguồn: Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam, năm 2016)

Khác 8,7 + 6,5 3,9

Nguyên nhân làm giảm năng suất, diện tích và chất lượng hồ tiêu của nước ta hiện

nay chủ yếu là nấm bệnh và sâu hại. Theo CABI có khoảng 44 loài dịch hại trên cây hồ

tiêu, riêng Việt Nam theo nghiên cứu của Diệp Hồ Tùng và cộng sự (1999) có 22 loài

sâu bệnh hại tiêu ở Phú Quốc.

Hồ Ngọc Thành đã tiến hành nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh chết nhanh

12

hồ tiêu ở Xuân Lộc - Đồng Nai là do nấm Phytophthora spp. gây ra. Ông phân lập từ

Đồ án tốt nghiệp

cây hồ tiêu bị bệnh và lây bệnh nhân tạo cho tiêu trong vườn ươm, tiêu sản xuất thì cả

hai trường hợp đều bị chết nhanh sau 7 – 9 ngày.

Theo Nguyễn Ngọc Châu (1995) thì thành phần bệnh hại hồ tiêu ở Tân Lâm -

Quảng Trị có tới 65 loài, trong đó tuyến trùng 49 loài, nấm bệnh 7 loài. Trong số 49

loài tuyến trùng ký sinh có 4 loài ký sinh gây hại nặng trên cây hồ tiêu là Meloidogyne

incognita gây sần rễ có khả năng gây thành dịch trên diện rộng, Radophlus reniformis

gây đen nụ, Xyphenema amenicanum mang virus gây vàng lá tiêu, Pratrichodorus

nanus mang virus gây bệnh xắn lá tiêu. Trong 7 loài nấm bệnh, gây bệnh chủ yếu là

thán thư (Collectotrichum goeosprioides), đen lá (Lasiodiplodia theobromae), thối rễ

(Fusarium solani).

Theo Nguyễn Vĩnh Trường và cộng sự (2001) khi phân tích mẫu đất bị bệnh chết

nhanh ở Tân Lâm - Quảng trị và Long Khánh - Đồng Nai xác định nấm gây chết héo là

Phytophthora capsicii.

Một số nghiên cứu về tuyến trùng hại rễ hồ tiêu của Vũ Thị Nga (2003) ở Bình

Long cũng cho thấy các giống Meloidogyne encognita, Criconemoides sp.,

Helicotylenchus sp., Tylencherhynchus sp. đều có tỷ lệ xuất hiện 100 % trong các mẫu

đất phân lập.

Theo Nguyễn Thị Chắt (2001) dịch hại chính trên cây hồ tiêu tại Phú Yên, Bình

Phước và Bà Rịa – Vũng Tàu gồm: mối Coptotermes sp., rầy nâu Toxoptera sp., rệp

sáp giả một cặp đuôi ngắn Pseudococcus sp., rệp sáp giả vằn Ferrisia virgate, ruồi

trắng Aleyrodicus sp., bọ đầu dài Lophobaris sp., Diconocoris sp. và Meloidogyne sp.

Nhìn chung tình hình bệnh hại hồ tiêu ở Việt Nam cũng có diễn bến tương tự

trong khu vực và thế giới, đôi lúc còn phức tạp hơn. Đó là những khó khăn, thách thức

đòi hỏi chúng ta phải có những nghiên cứu chắc chắn và xây dựng được một chiến lược

13

về phòng trừ bệnh hại hồ tiêu có hiệu quả.

Đồ án tốt nghiệp

1.2. Một số nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu

1.2.1. Nấm Phytophthora spp.

1.2.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora spp [46]

Theo A. Drenth và B. Sendall (2004) có thể xác định một số loài Phytophthora

thông qua các đặc điểm hình thái: túi bào tử, bào tử áo (chlamydospores) và sự trương

phồng của sợi nấm, tạo tiếp hợp tử và sinh sản hữu tính là dị tản hoặc đồng tản:

 Túi bào tử:

o Hình thái (hình dạng, kích thước, tỷ lệ chiều dài: chiều rộng), các túi bào

tử thời kỳ già yếu (phát tán nang bào tử).

o Chiều dài cuống trên túi bào tử.

o Sự phát triển của các túi bào tử.

o Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử được sinh ra.

Một số loài Phytophthora tạo ra túi bào tử trên các bề mặt của môi trường thạch.

Tuy nhiên, nhiều loài cần phải được nuôi cấy trong môi trường nước, dung dịch muối

khoáng hoặc dịch pha loãng được chiết từ đất trước khi chúng tạo ra các túi bào tử.

Điều quan trọng là nấm Phytophthora tạo ra các túi bào tử rất phụ thuộc vào ánh sáng.

 Bào tử áo (chlamydospores) và sự trương phồng của sợi nấm

Bào tử áo là bào tử vách dày có chức năng như một bào tử nghỉ. Chúng có thể là

một sợi đốt (hình thành giữa các sợi nấm) hoặc ở tận cùng (đầu của sợi nấm). Chúng

khác nhau từ sự trương phồng của sợi nấm. Các hình thái của bào tử áo không khác

biệt nhiều giữa loài và do đó các bào tử rất ít sử dụng trong việc xác định loài. Tuy

nhiên, sự hiện diện (P. palmivora) hay không có (P. heveae) bào tử áo có thể dễ dàng

xác định loài.

 Sinh sản hữu tính

Khoảng một nửa số loài Phytophthora là đồng tản (homothallic) chúng sản xuất

bộ phận sinh sản đực, bộ phận sinh sản cái và bào tử động trên cùng một môi trường.

14

Số còn lại là dị tản (heterothallic). Dạng dị tản tạo ra túi giao tử (túi giao tử đực và túi

Đồ án tốt nghiệp

noãn) chỉ khi có sự hiện diện của một dòng phân lập mọc đối trên cùng môi trường.

Việc xác định loài nấm thuộc nhóm đồng tản hay dị tản phụ thuộc vào túi bào tử đực

của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực nằm quanh thân túi noãn) hay paragynuos

(túi giao tử đực nằm tiếp theo túi noãn).

1.2.1.2. Vòng đời [23]

(Nguồn: SI-AMMOUR, năm 2002)

Hình 1.3: Chu kì sống của Phytophthora

Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty

(Mycelium) phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào tử vô

tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia). Túi bào tử

này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường giảm. Chúng phóng

thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều nhau (Heterokont

flagella). Những bào tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền và cuối

cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian chúng hình thành vách

tế bào. Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst). Bào tử áo

(Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô tính. Cấu trúc hữu

15

tính bao gồm túi giao tử đực (Antheridium – bộ phận sinh sản đực) và túi noãn

Đồ án tốt nghiệp

(Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi giao tử đực

và túi noãn. Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn

lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi thụ tinh từ

túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau khi được thụ

tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một hay

nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản

(Heterothallic) (có hai kiểu lai A1 và A2) chẳng hạn như P. infestans. Số còn lại là

những loài nấm đồng tản (Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri.

1.2.1.3. Phytophthora gây bệnh trên cây hồ tiêu

 Triệu chứng

Hình 1.4: Triệu chứng của bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu

Nấm Phytophthora tồn tại trong đất dạng ngủ vào mùa khô và bắt đầu hoạt động

nhiều trong mùa mưa khi ẩm độ đất tăng lên. Bệnh có 2 giai đoạn tồn tại là trong

16

không khí và trong đất:

Đồ án tốt nghiệp

Nấm tồn tại trong không khí gây bệnh trên lá, thân và hoa. Bệnh xuất hiện trên lá

non, mọc gần mặt đất với triệu chứng xuất hiện như: đốm màu nâu đen, sau đó lây lan

nhanh chóng, rồi lan khắp hết lá. Những đốm trên lá có đặc điểm đáng chú ý là có lớp

tơ ở mép vết bệnh. Lá bị bệnh sẽ rụng sớm. Thêm vào đó, nấm gây bệnh tấn công phần

thân non và gây thối thân. Khi thân hoặc nhánh xuất hiện triệu chứng nhiễm bệnh, tán

lá phía trên chuyển sang màu vàng và đôi khi biểu hiện ―héo lá‖. Bệnh gây hại trên lá,

dẫn đến rụng lá với các mức độ khác nhau, trên các nhánh khác nhau, tùy theo mức độ

gây hại của bệnh. Tuy nhiên, sự nhiễm bệnh trên lá không làm chết cây. Bệnh làm cây

giảm sức đề kháng.

Khi mùa mưa bắt đầu, ẩm độ đất tăng lên, hệ thống rễ phát triển mạnh, những rễ

tơ dễ bị xâm nhiễm. Bào tử nấm trong đất xâm nhập vào cây qua rễ tơ, sau đó lây lan

sang rễ chính, cuối cùng là vùng cổ rễ, hoặc vùng gốc cây. Dựa vào mức độ xâm nhiễm

của bệnh, cây sẽ biểu hiện thông qua nhiều triệu chứng khác nhau như: tán lá chuyển

vàng, gãy thân ở các đốt, héo và rụng lá. Khi bệnh xuất hiện ở phần gốc cây, toàn bộ

cây sẽ tàn lụi và làm chết cây vì thế nông dân gọi bệnh này là bệnh chết nhanh. Bệnh

lây lan dần sang các cây bên cạnh và dẫn đến chết cây hàng loạt.

 Thiệt hại

Ở Việt Nam, bệnh chết nhanh hay còn gọi là thối gốc, rễ trên cây tiêu, đã gây

thiệt hại lớn cho người trồng tiêu trên cả nước, làm năng suất hồ tiêu hàng năm giảm

15 – 20 %, nhiều vườn tiêu bị thiệt hại lên tới 100 %, do không có kinh nghiệm phòng

trừ, quản lý bệnh, sử dụng thuốc hóa học không đúng cách và đặc biệt là sử dụng lại

giống đã bị nhiễm bệnh (Trần Thu Hà, 2013). Thực tế cho thấy đã có nhiều phương

pháp được bà con nông dân áp dụng, tuy nhiên vì một số lý do nên kết quả không được

cao. Hơn nữa, hiện nay ở Việt Nam chưa có giống tiêu chống chịu được bệnh chết

nhanh.

Theo số liệu tổng hợp của Chi cục Trồng trọt – Bảo vệ Thực vật Bình Phước

17

(Trung tâm Bảo vệ Thực vật, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn), hồ tiêu toàn

Đồ án tốt nghiệp

tỉnh hiện có 11.600 ha, tăng hơn 1.000 ha so năm 2013. Tuy nhiên diện tích tiêu chết vì

bệnh đang tăng nhanh. Bệnh chết nhanh được coi là bệnh nan y với cây tiêu đang gia

tăng so với năm 2013. Cụ thể, đến ngày 15/9, bệnh chết nhanh có 347 ha. Đứng đầu là

thị xã Bình Long với 238 ha nhiễm bệnh chết nhanh (159 ha nhẹ và 79 ha mức trung

bình). Bệnh chết nhanh chỉ sau 2 tuần là chết nọc do nấm tấn công bộ rễ làm cây héo

nhanh, người trồng tiêu không thể cứu chữa dẫn đến thiệt hại cả vườn.

Hình 1.5: Thiệt hại của bệnh chết nhanh [38]

1.2.2. Nấm Fusarium spp.

1.2.2.1. Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium spp.

Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) [14]. Fusarium gồm

nhiều loài khác nhau, gây nhiều loại bệnh trên cây trồng. Tuy nhiên, nhiều loài nấm

Fusarium là nấm hoại sinh sống phổ biến trong đất. Fusarium là nguyên nhân chính

của bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu.

Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Lấp kín mạch gỗ sẽ cản

18

trở quá trình vận chuyển nước làm héo cây, Fusarium spp. cũng sản xuất một số chất

Đồ án tốt nghiệp

độc tiết vào mạch dẫn cây chủ làm héo rũ. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi

nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Cơ thể dinh dưỡng dạng sợi đa bào,

phân nhánh phức tạp, giữa các vách ngăn có lỗ nhỏ ở giữa. Trong tế bào có một hoặc

nhiều nhân. Vách tế bào bằng chitin, glucan [17].

Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là 25 – 30oC. Nấm Fusarium phát triển

nhanh trên môi trường PDA và hình thành tản nấm có hình dạng tơi xốp, lan rộng trên

môi trường nuôi cấy. Mặt trên của tản nấm có màu trắng, vàng cam hoặc tím hồng. Mặt

dưới không màu, vàng cam hay màu nâu.

 Sinh sản sinh dƣỡng

Sợi nấm: Từ một sợi nấm riêng rẽ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ sinh trưởng và

phân nhánh thành hệ sợi nấm.

Bào tử áo hình thành ở các sợi nấm trong mô cây bị nhiễm bệnh. Chúng cũng có

thể được hình thành từ đại bào tử có nguồn gốc từ khối bào tử trên các tổn thương.

Bào tử áo là những tế bào hơi tròn, tế bào chất được cô đặc lại [53], có màng

dày bao bọc, thỉnh thoảng vách tế bào xù xì hoặc có sắc tố [56]. Ở bào tử này, chất

dinh dưỡng được chuyển từ tế bào bên cạnh làm phồng lên, chứa nhiều chất dự trữ và

có thể chịu đựng những điều kiện bất lợi trong một thời gian khá dài. Khi gặp điều kiện

thuận lợi, chúng sẽ nảy mầm và phát triển thành sợi nấm mới [17].

 Sinh sản vô tính

Ở các loài Fusarium có 2 loại: đại bào tử và tiểu bào tử.

Đại bào tử được hình thành từ thể bình trên cuống bào tử có nhánh hay không có

nhánh [17]. Đại bào tử lớn có kích thước 3 – 8 µm x 11 - 70 μm. Hầu hết các loài

Fusarium, đại bào tử có từ 3 - 7 vách ngăn, tuy nhiên có nhiều loài có từ 1 - 3 vách

ngăn (F. dimerum, F. dlamini, F. poae) hoặc nhiều hơn 7 vách ngăn (F.

decemcellulare, F. coccophilum) [17]. Đại bào tử có hình lưỡi liềm.

Tiểu bào tử có kích thước 2 – 4 µm x 4 - 8 μm, được hình thành từ cuống bào tử

19

phân sinh phân nhánh hoặc không phân nhánh, mọc trực tiếp từ sợi nấm hoặc tụ lại

Đồ án tốt nghiệp

thành dạng bọc giả trên đầu cành hoặc hình thành dạng chuỗi [45]. Bào tử có 0 - 1 vách

ngăn (đặc biệt có loài có 2 - 3 vách ngăn). Bào tử có nhiều hình dạng khác nhau như:

hình cầu, hình liềm, hình trứng, hình chùy [51].

Hình 1.6: Fusarium gây cây héo rủ (A), và các loại bào tử : đại bào tử đính (C), tiểu bào tử đính (D), (Phialide = thể bình , mycelium = khuẩn ty) (B), terminal chlamydospore = bào tử vách dày hoàn chỉnh (E) [2]

1.2.2.2. Vòng đời [57]

Vòng đời của Fusarium bắt đầu với giai đoạn hoại sinh khi nấm tồn tại trong đất

ở dạng bào tử hậu. Bào tử hậu không hoạt động cho đến khi được kích thích nảy mầm

bằng cách sử dụng chất dinh dưỡng từ đỉnh sinh trưởng của các rễ tơ của cây. Sau khi

nảy mầm, tản nấm phát triển và bào tử được hình thành trong 6 - 8 giờ, bào tử hậu

trong 2 - 3 ngày. Sau khi xâm nhập vào các tế bào biểu bì của cây ký chủ, nấm tiếp tục

xâm nhập vào bên trong rễ của cây và sự phát triển của bệnh thấm qua mạch trong.

Trong các giai đoạn của bệnh, các loại nấm phát triển trong các hệ thống mạch sau đó

20

là các tế bào nhu mô lân cận, sản xuất với số lượng lớn các bào tử và bào tử hậu. Các

Đồ án tốt nghiệp

tác nhân gây bệnh tồn tại trong mảnh vỡ cây bệnh trong đất như sợi nấm và trong tất cả

các bào tử của nó, nhưng hầu hết thường là bào tử hậu.

1.2.2.3. Fusarium gây bệnh trên cây hồ tiêu

 Triệu chứng

Cây tiêu có biểu hiện sinh trưởng chậm, lá úa vàng. Lá, hoa, các đốt và trái cũng

rụng dần từ dưới gốc lên ngọn. Cây bị bệnh kém phát triển, năng suất thấp, bộ rễ cây

thường bị thối. Quan sát thấy trên rễ có nhiều mụn u sưng, vết thâm đen. Gốc thân, cổ

rễ bị thâm đen, thối khô. Các bó mạch bên trong bị chuyển màu thâm đen.

Do bộ rễ bị tổn thương, quá trình thoát nước, vận chuyển muối khoáng bị gián

đoạn nên cây mới bị bệnh có biểu hiện sinh trưởng kém, lá bị vàng và rụng dần, cây

còn nhỏ có thể bị chết khô hoàn toàn. Trường hợp cây tiêu bị bệnh nhẹ thì dây tiêu

không chết nhưng sinh trưởng không bình thường và cằn cỗi. Khi bệnh nặng, toàn bộ

gốc thân cây bệnh có các vết nâu đen, dần dần vết bệnh lan rộng làm thối lớp vỏ gốc,

bó mạch của thân cây hóa nâu gốc, sau đó cây chết khô. Thời gian từ khi có biểu hiện

bị bệnh đến khi chết có thể kéo dài cả năm. Bệnh làm chết cả khóm hoặc chỉ chết 1 - 2

21

dây.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.7: Triệu chứng của bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu

 Thiệt hại

Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (1991) cho biết ở tất cả các vùng

trồng tiêu của Việt Nam đều gặp những vườn tiêu chết toàn bộ, chỉ còn trơ lại cây nọc,

gây thiệt hại rất lớn. Bệnh làm chết cả tiêu kiến thiết cơ bản và tiêu kinh doanh. Có 10

– 30 % diện tích tiêu bị hại nặng không có khả năng cho thu hoạch. Một số vùng trồng

tiêu lâu năm ở Phú Quốc, Quảng Trị và Quảng Bình bệnh này phát triển mạnh tạo

thành dịch lớn, gây thiệt hại nặng nề và đe dọa ngành sản xuất tiêu ở đây [33].

Theo số liệu tổng hợp của Chi cục Trồng trọt – Bảo vệ Thực vật (Trung tâm Bảo

vệ Thực vật, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) ở tỉnh Bình Phước năm 2014,

bệnh chết chậm gây hại 774 ha, trong đó mức độ nhẹ 556 ha, mức độ trung bình 218

ha. Trong đó, đứng đầu là thị xã Bình Long với 650 ha bị nhiễm bệnh chết chậm, trong

đó 447 ha ở mức độ nhẹ, 203 ha mức trung bình. Cây tiêu sinh trưởng kém nhưng

22

không làm tiêu chết ngay mà giảm năng suất.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.8: Thiệt hại của bệnh chết chậm [30]

1.2.3. Nấm Colletotrichum spp.

1.2.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm Colletotrichum spp.

Phân loại các loài nấm Colletotrichum chủ yếu dựa vào các đặc điểm điển hình

của hình thái khuẩn lạc, tản nấm, hình dạng, kích thước bào tử, lông gai và giác bám.

Nấm Colletotrichum thuộc bộ nấm đĩa dài (Molanconiales) của lớp nấm bất toàn

(Deuteromycetes). Đặc điểm của lớp nấm này là sợi nấm có vách ngăn và dịch trong

suốt [40].

Ở giai đoạn sinh sản hữu tính, Colletotrichum thuộc lớp nấm nang Ascomycete

có tên là Glomerella cũng cho ra dạng bào tử đơn bào. Ở giai đoạn sinh sản vô tính,

bào tử đính đơn bào có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ, không màu và đôi khi

có giọt dịch bên trong bào tử [32].

Bào tử túi hình trụ hoặc hình chùy, kích thước 35 – 80 µm x 8 – 14 µm [32].

23

Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, đầu hơi tù, đỉnh

Đồ án tốt nghiệp

tròn, không có vách ngăn, kích thước từ 9 – 24 µm x 3 – 6 µm [41]. Bào tử nảy mầm

và hình thành giám bám màu nâu, hình ovan, kích thước 6 – 20 µm x 4 - 12 µm [32].

Theo Đinh Thị Mỹ Lệ (2005) những loài có dạng bào tử hình liềm thì rất dễ

phân biệt, những loài có dạng bào tử hình trụ thì có thể dễ bị nhầm lẫn. Tuy nhiên, sự

xác định các loài nấm có bào tử dạng thẳng có thể phức tạp bởi vì bào tử của các loài

nấm có dạng thẳng rất giống nhau về hình thái nhưng những đặc điểm của khuẩn lạc

thì rất đa dạng [32].

Đa số khuẩn lạc nấm Colletotrichum có dạng hình tròn, mép rìa của khuẩn lạc

có dạng mép rìa tròn hoặc mép rìa gợn sóng. Trên môi trường PDA, tản nấm có màu

trắng xám nhạt đến màu xám đậm. Khuẩn lạc phát triển bằng phẳng hoặc có sự phân

tầng.

Hình 1.9: Cọng mang bào tử đính và bào tử đính của nấm Colletotrichum (Seta =

cuống bào tử, germtubes = ống mầm, hyphae stroma = khuẩn ty dinh dưỡng, conidium

24

(dia) = bào tử đính, conidiophore = cọng mang bào tử đính [2]

Đồ án tốt nghiệp

Theo Lê Hoàng Lệ Thủy (2004) thì Barnet và cộng sự (1998) mô tả ổ nấm

Colletotrichum có dạng đĩa đài tròn hoặc dạng gối, có gai cứng ở mép rìa đĩa đài và

giữa ổ nấm, có sáp sẫm màu, nhọn ở đầu và có vách ngăn (Phạm Văn Kim, 2002), đĩa

cành thuôn về phía đỉnh, phồng nhẹ ở phần gốc, kích thước chiều dài khoảng 500 µm,

đường kính 4 – 8 µm, có từ 1 – 4 vách ngăn (CABI, 2003) [32].

Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4oC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là tử 25 – 29oC và độ ẩm cao, trong điều kiện này nấm gây hại nghiêm trọng

cho cây trồng.

1.2.3.2. Vòng đời [55]

 Chu kỳ sinh sản vô tính

Đĩa đài của nấm Colletotrichum trên cây bị nhiễm bệnh tạo ra bào tử, bào tử phát

tán nhờ gió, cũng có thể lây lan bởi mưa, nước mưa văn lên các cây khác. Khi bào tử

tiếp xúc với cây chủ, nó thâm nhập vách tế bào. Một khi bên trong cây chủ, nấm

Colletotrichum sinh trưởng và phát triển hệ sợi nấm. Các triệu chứng của nhiễm nấm

Colletotrichum xuất hiện khi hệ sợi nấm phát triển xuyên qua bề mặt vết thương bộ

phân ký chủ và sản xuất các đĩa dài.

 Chu kỳ sinh sản hữu tính

Colletotrichum có hình thức sinh sản đặc biệt tạo ra các sợi nấm riêng biệt thay vì

một hệ sợi nấm. Các sợi nấm riêng lẽ này là một hình thức sinh sản hữu tính của

Colletotrichum. Hai sợi nấm riêng lẽ khác nhau của Colletotrichum dính vào với nhau

và tạo ra một bào tử mới thông qua sinh sản hữu tính. Bào tử này được gọi là một

ascospore (bào tử nang), và nó có thể tồn tại trong môi trường trong một thời gian rất

dài. Sinh sản hữu tính tạo ra con đa dạng di truyền và đa dạng di truyền này sẽ giúp

25

Colletotrichum tồn tại trong điều kiện và môi trường khác nhau.

Đồ án tốt nghiệp

1.2.3.3. Colletotrichum gây bệnh trên cây hồ tiêu

 Triệu chứng

Nấm tồn tại trong đất, không khí và xác bã thực vật. Bệnh phát triển nhiều trong

điều kiện vườn tiêu chăm sóc kém, thiếu phân bón, tưới nước không đều trong mùa

khô.

Đầu tiêu lá xuất hiện những đốm lớn màu vàng nhạt, sau đó chuyển thành màu

nâu rồi đậm dần thành màu đen, rìa vết bệnh có quầng đen. Hình dạng của những đốm

này không nhất định. Khi vết bệnh già, ở rìa vết bệnh sẽ xuất hiện những quầng sáng

màu vàng ngăn cách phần mô khỏe mạnh và mô đã nhiễm bệnh. Bệnh gây hại ở đầu

hoặc mép lá, sau đó lan rộng dần, làm lá khô đen và rụng.

Bệnh thường xuất hiện quanh năm nhưng nhiều nhất là vào mùa mưa. Nếu

không xử lý kịp thời, bệnh có thể lây lan qua gié bông, gié quả làm bông và quả bị khô

đen. Hoặc gây hại trên thân nhánh làm tháo đốt, khô cành. Bệnh cũng có thể bùng phát

kèm theo khi tiêu bị bệnh chết nhanh.

Hình 1.10: Triệu chứng của bệnh thán thư trên cây hồ tiêu [43]

 Thiệt hại

Vườn tiêu bị nấm thán thư tấn công làm các gié tiêu bị rụng, bệnh làm quả mới

tượng bị khô và lép, còn các đốt thân thì thường ngắn lại, cây tiêu cằn cỗi ra bông ít,

chùm bông ngắn, tỉ lệ đậu trái thấp, giảm năng suất và sản lượng. Khả năng lây lan của

26

nấm bệnh thán thư nhanh, diện rộng.

Đồ án tốt nghiệp

Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, nhiều vườn tiêu đang trong giai

đoạn ra hoa, kết trái bị rụng bông và trái non rất nhiều, có vườn rụng tới 70 - 80%.

Nguyên nhân là chủ yếu là thời tiết diễn biến thất thường, thiếu dinh dưỡng, bệnh thán

thư, …

Hình 1.11: Thiệt hại do nấm Colletotrichum gây ra

1.3. Biện pháp sinh học trong quản lý bệnh hại cây trồng

1.3.1. Lịch sử biện pháp sinh học

1.3.1.1. Thế giới

Trước thế kỷ 18, Người Trung Quốc đã biết dùng kiến vàng trong vườn cam quýt,

bọ rùa trong việc hạn chế rệp muội.

Đến năm 1685, Martin Lister đã ghi nhận là ong cự chui từ sâu ong non bộ cánh

vảy là kết quả của ong cái đã đẻ trứng vào sâu non.

Sách báo thế kỷ 18 đã có nhiều tài liệu công bố về côn trùng ký sinh và côn trùng

bắt mồi như Gedert, Reaumur, Darwin,… Reaumur là người đầu tiên khuyến cáo biện

pháp sinh học.

Trong thế kỷ 19, đã có nhiều công trình nghiên cứu về phân loại, sinh học và sinh

thái các thiên địch của sâu hại.

Năm 1908, Porter đã chứng minh được rằng các hoạt động của vi sinh vật gây

27

bệnh cây trồng có thể ức chế bằng các sản phẩm trao đổi chất của nó. Wood và Tveit

Đồ án tốt nghiệp

năm 1955 đã đưa ra 3 cơ chế đối kháng giữa vi sinh vật là cạnh tranh, kháng sinh và

tiêu diệt nhau.

1.3.1.2. Việt Nam

Trước kia, nông dân đã biết dùng kiến vàng để trừ sâu hại trong vườn cam quýt.

Từ thập niên 1970, Biện pháp sinh học ở nước ta mới đã đạt được một số thành tựu,

các nghiên cứu tập trung vào 2 hướng:

 Bảo vệ duy trì và phát triển quần thể thiên địch có sẵn.

 Bổ sung thiên địch vào sinh quần cây trồng nông lâm nghiệp.

1.3.2. Khái niệm

Theo Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự (2004), Biện pháp sinh học là dùng các sinh

vật để khống chế hay tiêu diệt các sinh vật hại, rộng hơn là dùng các sinh vật, sản phẩm

của chúng để kìm hãm sinh vật hại, làm cho chúng giảm số lượng và độc tính, không

gây hại với các loại sinh vật có ích an, toàn với sức khỏe con người và môi trường.

1.3.3. Ưu và nhược điểm của biện pháp sinh học trong nông nghiệp

1.3.3.1. Ưu điểm

Không gây ô nhiễm môi trường, an toàn cho người và động vật. Ngoài ra còn phù

hợp với phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam.

Hiệu quả kinh tế cao, sinh vật có khả năng tồn tại lâu trong quần xã, kiểm soát sự

phá hoại của sinh vật gây hại.

Không ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng nông sản. Trong khi biện pháp hoá

học để lại dư lượng thuốc bảo vệ thực vật cao, gây ngộ độc và ảnh hưởng đến sức khoẻ

con người.

Phóng thích thiên địch tốn ít thời gian hơn phun thuốc và không gây mùi khó chịu

như sử dụng thuốc hóa học, nhất là trong nhà kính nóng ẩm. Việc phóng thích thiên

địch được tiến hành ngay sau khi gieo trồng, nông dân có thể kiểm tra sự thành công

của biện pháp này chỉ cần một vài lần kiểm tra sau đó nhưng đối với biện pháp hoá học

28

cần sự kiểm ta thường xuyên trong suốt vụ.

Đồ án tốt nghiệp

Các chế phẩm sinh học và thiên địch tiêu diệt được nhiều loài sinh vật gây hại, có

sức tàn phá lớn.

Các biện pháp đấu tranh sinh học duy trì được hệ sinh thái trong tự nhiên góp

phần bảo vệ các loài sinh vật.

1.3.3.2. Nhược điểm

Tác động thường chậm nên không có khả năng dập dịch.

Nghiên cứu và nhân nuôi cần trang thiết bị và kinh phí cao.

Sản phẩm sinh học thường chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Quy trình

áp dụng khắt khe, đòi hỏi người sử dụng phải có trình độ nhất định.

Sinh vật, thiên địch rất nhạy cảm và dễ tổn thương. Khi du nhập nhiều loài thiên

địch về Việt Nam, chúng không phát triển, hiệu quả sử dụng không cao (chưa thích

nghi được với môi trường).

Khi tiêu diệt sinh vật gây hại này lại tạo điều kiện cho các sinh vật gây hại khác

phát triển. Một loài thiên địch có thể vừa là sinh vật có lợi vừa là sinh vật có hại.

1.3.4. Các ứng dụng sinh học trong quản lý bệnh hại trên cây hồ tiêu

Các nhà khoa học đã sử dụng chế phẩm sinh học chitin, chitosan và chitosan

oligomer cho cây hồ tiêu, tách chiết từ vỏ tôm cua, côn trùng, vách tế bào nấm. Đây là

những thành phần không độc hại, phân hủy sinh học nhanh và an toàn với môi trường.

Ở cây tiêu kiến thiết cơ bản, các thành phần chitosan và chitosan oligomer có

hoạt tính kích thích tăng trưởng hồ tiêu, tăng số lượng vi sinh vật có lợi, hạn chế nấm

gây hại trong đất và tăng cường hệ thống đề kháng. Ứng dụng vào tiêu kinh doanh, các

chế phẩm được tưới cho tiêu ba lần, mỗi lần cách nhau 15 ngày. Sau ba tháng, số lượng

nấm mốc và xạ khuẩn có trong đất tăng lên nhanh chóng [7]. Hầu hết số xạ khuẩn và

nấm mốc này có khả năng tổng hợp các loại enzyme làm tan vách tế bào của các loại

nấm gây bệnh và một số côn trùng, giúp cho cây hồ tiêu có khả năng làm tăng đề

29

kháng với các loại nấm bệnh trong đất.

Đồ án tốt nghiệp

Trong quá trình canh tác, khi bón các chế phẩm chitosan và chitosan oligomer đã

làm giảm đáng kể số lượng nấm Fusarium và tuyến trùng gây hại trên cây hồ tiêu. Mặt

khác, khi phun chế phẩm chitosan oligomer nồng độ 200 mg/l lên lá, lượng diệp lục

trong lá cây hồ tiêu tăng gần 50 %. Cây được kích thích sinh trưởng thân dây chính và

các cành nhánh phát triển nhanh hơn [7].

Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm tại Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông

Nghiệp miền Nam đã cho kết luận là các chủng nấm Trichoderma và Bacillus có khả

năng ức chế và bào mòn vách tế bào của các chủng nấm Phytophthora spp., Fusarium

spp., và Sclerotium spp. làm cho các nấm bệnh này không phát triển được hoặc bị tiêu

diệt. Theo Nguyễn Văn Tuất (2012), các chủng nấm Trichoderma, Glioclacdium có

hàm lượng chitinase giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh với các nấm gây bệnh,

trong quá trình đó chúng tiết ra hệ enzyme phân hủy tế báo nấm gây bệnh, các enzyme

này có đốc tính rất mạnh với nấm bệnh và được coi là nhân tố tích cực trong phòng trừ

bệnh hại cây trồng. Thực tế, ứng dụng các chế phẩm Trichoderma và Bacillus trên

đồng ruộng phòng trị bệnh chết nhanh cho hồ tiêu có hiệu lực rất cao.

Chế phẩm Pseudomonas có khả năng ngăn chặn sự phát triển và phát tán lây lan

của nấm bệnh, khống chế các bệnh do nấm Phytophthora, Fusarium, Palmivora… gây

bệnh chết nhanh, chết chậm, xì mủ, thối lở cổ rễ,… có khả năng thẩm thấu vào bên

trong tế bào, phân bổ kháng sinh cho thân, cành, lá, rễ, bảo vệ bộ rễ, thân tăng sức đề

kháng chống lại nấm bệnh.

Anisaf SH - 01 có thành phần là Polyphenol được chiết xuất từ thực vật không

gây độc hại cho cây trồng, vật nuôi, đảm bảo vệ sinh an toàn nông sản và bảo vệ môi

trường sinh thái. Các nhà khoa học Trung tâm Phát triển Công nghệ cao thuộc Viện

Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã triển khai nghiên cứu ứng dụng của thuốc

trên cây hồ tiêu. Kết quả cho thấy sản phẩm có tác dụng phòng trừ rệp sáp, hạn chế

bệnh vàng lá, tuyến trùng, hồ tiêu ở nồng độ 1 %, lượng nước thuốc sử dụng là 3 - 5

30

lít/cây, sử dụng theo đường phun cả cây với kết hợp với tưới gốc. Ngoài việc sử dụng

Đồ án tốt nghiệp

thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật Anisaf SH - 01, các nhà nghiên cứu đồng thời sử dụng

các chế phẩm Anisaf SH - 01 (1) và Anisaf SH - 01 (2) nhằm hỗ trợ quá trình hấp thu

dinh dưỡng của cây trồng và cải tạo chất lượng đất [42].

1.4. Nấm Trichoderma spp. trong quản lý bệnh cây trồng

1.4.1. Nấm Trichoderma spp.

1.4.1.1. Phân loại [26]

Nấm Trichoderma spp. là một trong những vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc

định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn

chưa được biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác

biệt về hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính.

Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc:

 Giới (Kingdom): Fungi

 Ngành (Division): Ascomycota

 Lớp (Class): Euascomycetes

 Bộ (Order): Hypocreales

 Họ (Family): Hypocreaceae

 Chi (Genus): Trichoderma

1.4.1.2. Sự phân bố của nấm Trichoderma spp [26]

Nấm Trichoderma spp. khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường

đất. Hầu hết các dòng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu

rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết,

hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác. Khi

quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loài nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài

Trichoderma. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội kí sinh

với thực vật. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau có yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác

31

nhau. Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ

Đồ án tốt nghiệp

mật thiết với nhau. Nhìn chung, các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất acid nhiều

hơn ở vùng đất trung tính hoặc kiềm.

(Nguồn: Google hình ảnh)

Hình 1.12: Nấm Trichoderma mọc trong tự nhiên

1.4.1.3. Đặc điểm hình thái [26]

Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma spp. Ông cho

rằng: Tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau.

Khuẩn ty (sợi nấm) có tốc độ phát triển rất nhanh, trên môi trường PDA ban đầu

có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở

một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch của môi trường PDA hóa

vàng.

32

Hình 1.13: Khuẩn lạc của nấm Trichoderma Harzianum [25]

Đồ án tốt nghiệp

Một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định. Cuống bào tử là một

nhóm sợi nấm bện vào nhau. Số loài khác có cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay

những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), có

kích thước từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc,

những nốt sần dạng này được tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động

như chồi mầm.

Bào tử đính của Trichoderma mọc ở đỉnh của cuống sinh bào tử, mang các bào

tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ

chất nhầy. Bào tử có hình bầu dục với kích thước khoảng 3 – 5 µm x 2 – 4 µm, rất

hiếm khi bào tử của nấm này có hình cầu. Vách bào tử trơn láng, tuy nhiên ở một vài

loài Trichoderma (T. viride) bào tử có vách xù xì như có nhiều mụn cơm (Mecray,

2002).

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử áo (chlamydospores) nên nấm Trichoderma

có khả năng tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.

Chlamydospores dạng hình cầu méo, đơn bào, mặc dù cũng có một số loài có khả năng

hình thành nên các bào tử áo đa bào (Papavizas, 1985), Chlamydospores là những cấu

trúc dạng ngủ, làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma trong môi trường không

được cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm

phòng trừ sinh học.

1.4.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học [26]

Đa số các chủng nấm Trichoderma phát triển tốt ở pH 4.5 – 6.5, nhiệt phát triển tối ưu thường là 25 – 30oC. Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn

lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau.

Trichoderma có thể sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic

(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là hai enzyme

33

chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm bệnh.

Đồ án tốt nghiệp

Trong quá trình sinh sản vô tính của nấm Trichoderma, có thể xảy ra hiện tượng

đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và

tác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa

dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo

ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là

những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh học

kiểm soát mầm bệnh thực vật

1.4.1.5. Cơ chế đối kháng nấm gây bệnh cây trồng

Nhiều cơ chế được ứng dụng trong phòng trừ sinh học của Trichoderma spp. đối

với nấm gây bệnh, ba cơ chế đối kháng chính là ký sinh, cạnh tranh và tiết ra kháng

sinh.

 Kháng sinh

Godtfredson và Vangedal (1965) đã mô tả hoạt chất amin của Trichoderma là

một hợp chất có 3 đơn vị isopren như một hợp chất kháng sinh. Dennis và Webster

(1971) đã báo cáo, acetaldehyde là thành phần kháng sinh dễ bay hơi được sản xuất bởi

Trichoderma. Trên đĩa cấy Trichoderma đối kháng sự phát triển của P. meadii gần như

hoàn toàn. Với P. vexans và R. solani, đối kháng không hoàn toàn vì tỷ lệ phát triển

của R. solani và P. vexans cao hơn P. meadii. Các nghiên cứu cho thấy, một lượng dịch

tiết của Trichoderma có đặc tính kháng sinh. Sản phẩm của nấm Trichoderma là một

34

acid bazơ đơn chưa bão hòa ở thể hoạt động chống lại những loài nấm gây bệnh [54].

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.14: Vách tế bào của nấm Rhizoctonia solani bị enzyme của nấm Trichoderma

chọc thủng và sau đó xâm nhập vào [15]

T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của

Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles được sản xuất bởi T. hamatum, T.

harzianum, T. viride, T. koningii, T. polysporum hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở

loài T. atroviride và T. viride tiết 6 - pentyl alpha-pyrone (α – pyrones) có hương dừa,

hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy mầm của những noãn bào tử

nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và Botrytis cinnerea. Peptaibols do T.

polysporum, T. harzianum, T. koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên

kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ

thành tế bào ngăn chăn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại

mầm bệnh. Steroids (viridin) là một độc tố thực vật có hiệu lực như một loại thuốc diệt

cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, được sản xuất bởi T. virens [26].

35

 Ký sinh

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.15: Nấm Trichoderma (vàng) ký sinh trên nấm Pythium

(xanh) trên hạt đậu Hà Lan [15]

Theo Chet (1990) nấm Trichoderma ký sinh gồm 4 giai đoạn [18]:

o Nhận ra vật chủ nhờ tính hướng hóa chất, nấm ký sinh phân nhánh hướng về

những nấm đã được định trước (do những nấm này tiết ra các hóa chất).

o Sự nhận dạng đặc hiệu do sắp xếp bởi lectin trên bề mặt tế bào của nấm và mầm

bệnh.

o Trichoderma ký sinh và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các

dạng móc hay giác bám.

o Tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease có khả năng bào mòn thành tế

bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ.

Trong nghiên cứu invitro, đối kháng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh R.

solani và P. meadii, hoạt động ký sinh của Trichoderma đã được quan sát trên sợi nấm

của mầm bệnh trong những sợi nấm cuộn, quá trình thâm nhập và sự tiêu biến sợi nấm.

Như sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa sợi nấm và mầm bệnh thường xuyên được theo dõi

36

qua nét đặc trưng trên Trichoderma. Weinding (1932) đã theo dõi sợi nấm

Đồ án tốt nghiệp

Trichoderma phát triển gần kề sợi nấm Rhizoctonia, cuộn xung quanh và sau đó tìm

thấy mọc bên trong nấm bệnh [54].

 Cạnh tranh [25], [26], [54].

Trichoderma cạnh tranh với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng

cách hút hết dưỡng chất một cách thụ động bằng những bào tử chống chịu

(chlamydospores).

Cạnh tranh mô già hoặc mô chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây

bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng

để từ đó xâm nhập vào những mô khoẻ). Nấm Trichoderma sử dụng những mô già và

mô chết của cây chủ, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và tiêu diệt đường

xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp.

Cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây kích thích

sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp. (gây bệnh cho

cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp.

bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Pythium spp. không thể nảy mầm.

Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm

nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của

mầm bệnh.

Các nghiên cứu với T. viride và T. harzianum để kiểm soát bệnh thối rữa than, rễ đã cho thấy rằng với một mật độ 105 CFU/gram đất trồng đã cho sự hiệu quả giảm bớt

bệnh hại. Điều này cho thấy rằng với một mức độ nhất định Trichoderma sẽ cho sự

cạnh tranh với các mầm bệnh trong đất trồng. Wells (1988) nghĩ rằng sự có mặt ở khắp

mọi nơi của Trichoderma ở đất nông nghiệp và đất tự nhiên khắp thế giới là bằng

chứng trực tiếp cho thấy chúng vừa cạnh tranh không gian và vừa cạnh tranh nguồn

37

dinh dưỡng.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp của nấm Trichoderma

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông

Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy

hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông

Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho ta thấy:

1.4.2.1. Khả năng kiểm soát bệnh cây

Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho

cây trồng. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối

kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và

Fusarium [6].

Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề

mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi

tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng

hoặc rệp sáp gây ra. Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như

―thuốc kháng sinh‖, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh

đồng thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy

chúng [31].

Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích

thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các

chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây [6].

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có

khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có

38

khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm.

Đồ án tốt nghiệp

1.4.2.2. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Hình 1.16: Sự phát triển của hệ rễ cây trồng giữa việc sử dụng

và không sử dụng Trichoderma [25]

Ghi chú: Without T-22: không được xử lí với T-22

With T-22: đã xử lí với T-22

Hình 1.17: Sự gia tăng sản lượng trên cây ớt với hạt giống được xử lý

và không xử lý Trichoderma [25]

Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ. Trichoderma

bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác. Nó tiết ra đất những

39

chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả

Đồ án tốt nghiệp

năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ

tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma

bám vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều

cao của cây, tăng năng suất cây trồng.

Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số

lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như

bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán [6].

1.4.2.3. Khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan.

Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà

trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình

phân hủy hữu cơ được nhanh chóng. Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để

bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất. Phân giải nhanh

các chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm

bệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn.

Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó

được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được

bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên

cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho

năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ

với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón

100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trể hơn và ít gây hại cho

cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón

100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001) [14]. Với những hiệu quả mà chế

phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng chế phẩm sinh học thay cho

việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng,

40

góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp.

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ ngày 24 tháng 3 đến ngày 15 tháng 6, tại phòng Nghiên

cứu và Phát triển của Công ty TNHH Điền Trang, số 67, Đường 16, Khu phố 4,

Phường Cát Lái, Quận 2, TP.HCM.

2.2. Vật liệu

2.2.1. Nguồn gốc nấm đối kháng, nấm gây bệnh

2.2.1.1. Nấm đối kháng

Các chủng nấm đối kháng Trichoderma được phân lập từ mẫu đất thu thập tại

vườn trồng tiêu thuộc huyện Bù Gia Mập và Bù Đốp, tỉnh Bình Phước. Các chủng nấm

Trichoderma sau khi được phân lập sẽ tiến hành khảo sát khả năng đối kháng với nấm

Colletotrichum sp., Fusarium sp., Phytophthora sp. gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu.

2.2.1.2. Nấm gây bệnh

Nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên lá, Fusarium sp. gây bệnh chết

chậm, Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu được phân lập từ các

vườn hồ tiêu bị nấm bệnh tấn công ở tỉnh Bình Phước.

2.2.2. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng

Một số trang thiết bị và hóa chất phục vụ cho nghiên cứu đề tài được cung cấp

bởi Công ty TNHH Điền Trang.

2.2.3. Môi trường nuôi cấy

Môi trường DRBC (Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol)

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

Môi trường CMC (Carboxy methyl cellulose)

41

Môi trường WA (Water Agar).

Đồ án tốt nghiệp

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp thu mẫu

2.3.1.1. Thu mẫu đất (Theo TCVN 4046 – 85)

Các mẫu đất được lấy trên vườn theo quy tắc đường thẳng góc: Mỗi vườn lấy 5

mẫu, một mẫu ở trung tâm và bốn mẫu ở 4 góc vườn. Ở mỗi điểm chiếu theo rìa tán lá

tiêu, đào một hố nhỏ sâu 15 cm, sau đó dùng dao nạo một lớp đất mỏng đều đặn từ trên

xuống dưới theo chiều thẳng đứng, lấy khoảng 200 g. Mẫu sau khi lấy được đựng trong

bao zip, ghi rõ tên vườn, vị trí cây lấy mẫu,… Đánh số vào vị trí cây lấy mẫu.

Hình 2.1: Thu mẫu đất

2.3.1.2. Thu mẫu bệnh

Các phương lấy mẫu bệnh ở lá, thân và rễ. (QCVN 01 – 172: 2014).

 Thu mẫu bệnh ở lá

Lấy những lá tiêu trên bề mặt xuất hiện những vùng bị nâu vàng hay màu đen với

nhiều hình dạng cũng như kích cỡ khác nhau ở khắp mặt lá. Bề mặt bên ngoài vết bệnh

có màu vàng ngăn cách giữa phần lá chưa bị bệnh và đã bị bệnh, phần bị bệnh bên

trong là những vòng tròn đồng tâm và có những viền đen bao bọc phía bên ngoài.

Đựng mẫu rễ trong bao zip, ghi rõ ngày lấy mẫu, ký tự mã hóa mẫu và đánh dấu vị trí

42

cây lấy mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.2: Thu mẫu lá tiêu bệnh thán thư

 Thu mẫu bệnh ở rễ

Đào rễ tơ ở độ sâu 15 - 20 cm và cách gốc 20 - 30 cm. Chọn những rễ tơ có triệu

chứng các chấm đen, vết thối trên rễ và đầu mút. Dựng mẫu rễ vào bao zip, ghi rõ ngày

lấy mẫu, ký hiệu mã hóa mẫu và đánh dấu vị trí cây lấy mẫu. Mẫu lấy về phân lập càng

sớm càng tốt, trong trường hợp nếu không phân lập được thì bảo quản trong điều kiện khô ráo ở nhiệt độ 14 – 20oC.

43

Hình 2.3: Lấy mẫu rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2. Phân lập nấm Trichoderma spp. và nấm bệnh phổ biến trong đất và

trên cây hồ tiêu

2.3.2.1. Phân lập nấm Trichoderma spp. trong đất (TCVN 4833 – 89, TCVN

4881 - 89)

 Quy trình

Trộn đều mẫu

Mẫu đất

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml nước muối sinh lý

Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-2, 10-3

Đổ đĩa (môi trường DRBC nguội 40 - 45oC) và lắc đều

Hút 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào đĩa petri, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần

Ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 – 3 ngày

Đọc kết quả: đếm khuẩn lạc đặc

Làm thuần

44

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng,riêng lẻ

Đồ án tốt nghiệp

 Thuyết minh quy trình

30 mẫu đất thu thập từ 6 vườn hồ tiêu thuộc tỉnh Bình Phước (mỗi vườn lấy 5

mẫu), dùng để phân lập nấm Trichoderma spp. theo phương pháp của Aneza (2002).

Cân 25 g đất/mẫu cho vào bình tam giác chứa 225 ml nước cất vô trùng, đặt 15

phút trên máy lắc, pha loãng dung dịch mẫu bằng cách lấy 1 ml dung dịch đất cho vào

ống nghiệm có chứa 9ml nước cất vô trùng, đồng nhất mẫu và nước cất bằng máy

vortex.

Sau đó, tiếp tục pha loãng ra các nồng độ 10-2, 10-3. Dùng micropipette vô trùng riêng cho từng độ pha loãng, hút 1 ml dung dịch mẫu ở mỗi nồng độ 10–1, 10–2, 10–3

vào đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần.

Môi trường DRBC nguội 40 – 45oC, đổ môi trường vào đĩa petri đã hút mẫu.

Lắc dàn đều mẫu, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa petri, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 – 3

ngày. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng, riêng lẻ. Tiến hành làm thuần trên môi trường

PDA.

Theo dõi từng ngày, ủ ở nhiệt độ phòng 4 – 5 ngày. Quan sát dưới kính hiển vi.

Cấy chuyền, tiếp tục làm thuần trên môi trường PDA.

2.3.2.2. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu

Mẫu đất bệnh được thu thập ở các cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh, tiến hành chẩn

đoán nhanh sự hiện diện của nấm Phytophthora bằng phương pháp bẫy cánh hoa hồng.

Phương pháp được thực hiện như sau:

o Thu thập mẫu đất ở gốc cây tiêu bị chết nhanh.

o Cân 100 g đất, hòa vào nước cất vô trùng trong cốc tỉ lệ 1 phần đất: 2 phần

nước. Khuấy nhẹ đất trong cốc, để lắng xuống trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm).

o Cắt cánh hoa hồng (hoa màu hồng hay màu đỏ) có kích thước 0,5 x 0,5 cm thả

vào cốc nước.

45

o Để yên cốc qua đêm ở nhiệt độ phòng.

Đồ án tốt nghiệp

o Quan sát cánh hoa hồng sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày. Khi thấy cánh hoa bị

chuyển màu, đem quan sát dưới kính hiển vi. Nếu thấy xuất hiện các bào tử hình

trứng có vách mịn, du động bào tử chuyển động trong nước, thì đem đặt cánh

hoa hồng lên môi trường WA.

o Theo dõi sự phát triển của sợi nấm trên môi trường WA. Tiến hành làm thuần,

dùng que cấy lấy ít tơ nấm cấy sang môi trường PDA. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ

phòng. Quan sát đĩa cấy nấm Phytophthora mọc hình bông cúc, ít sợi nấm, tơ

nấm màu trắng bông xốp.

Hình 2.3: Bẫy nấm Phytophthora bằng cánh hoa hồng

2.3.2.3. Phân lập nấm Fusarium gây bệnh chết chậm trên cây hồ tiêu

Mẫu bệnh được thu thập từ các rễ cây hồ tiêu có triệu chứng thâm đen, hư thối.

Sau khi thu mẫu về, tiến hành phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Rửa mẫu dưới vòi nước đang chảy để loại bỏ đất và bụi bẩn. Nhúng dụng cụ trong cồn 90o và hơ khô trên ngọn lửa. Khử trùng bề mặt rễ bằng dung dịch Javen 1 %

khoảng 10 - 15 giây, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô

46

trùng.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.4: Rễ tiêu có triệu chứng bệnh chết chậm

Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng mẫu cấy nhỏ 1 - 2 mm ở phần ranh

giới giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó cấy lên môi trường WA. Dùng kẹp ấn nhẹ

những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa môi trường.

Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ

phòng trong 3 - 5 ngày cho đến khi tản nấm phát triển, quan sát hàng ngày dưới kính

hiển vi để kiểm tra các sợi nấm mọc từ các mẫu cấy. Cấy truyền lên môi trường PDA,

làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.

2.3.2.4. Phân lập nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây hồ tiêu

Mẫu bệnh được thu thập từ các lá tiêu có những đốm màu nâu hay đậm dần thành

màu đen, rìa vết bệnh có quầng đen.

Rửa sạch mẫu lá dưới vòi nước đang chảy. Sau khi rửa sạch có thể nhìn thấy rõ những triệu chứng điển hình của bệnh thán thư. Nhúng các mẫu vào dung dịch cồn 70o

để khử trùng bề mặt khoảng 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô trên giấy thấm vô trùng. Nhúng dụng cụ trong cồn 90o và hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn.

Dùng kéo cắt mẫu thành những mẫu cấy nhỏ khoảng 3 – 5 mm, là phần ranh giới

giữa mô bệnh và mô khỏe, cấy vào môi trường WA.

Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ phòng. Quan sát hàng ngày dưới kính hiển vi để kiểm tra

47

các sợi nấm mọc từ các mẫu cấy. Cấy truyền chúng sang môi trường PDA cho đến khi

Đồ án tốt nghiệp

thu được nấm thuần. Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm. Cấy

truyền chúng sang môi trường PDA cho đến khi thu được nấm thuần.

2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm

 Hình thái đại thể:

Dùng que cấy vô trùng lấy ít sợi nấm, cấy điểm vào giữa đĩa petri có đổ một lớp

mỏng môi trường thạch. Ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát khuẩn lạc theo từng ngày.

Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm:

o Kích thước, hình dạng khuẩn lạc để biết tốc độ phát triển của nó.

o Màu sắc khuẩn lạc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc.

o Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra.

o Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên môi trường.

o Đặc điểm của mép khuẩn lạc.

o Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt khuẩn lạc.

 Hình thái vi thể: Dùng phương pháp phòng ẩm.

Chuẩn bị môi trường thích hợp, đổ vào các đĩa petri.

Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa petri. Sau đó, đặt ba

thanh đũa tre lên đĩa rồi đặt lame lên ba thanh đũa tre.

Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA

chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng,

lấy sinh khối nấm đã làm thuần cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đó đậy lamelle

lên trên khối thạch.

Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử. Lấy

lam ra, nhuộm nấm bằng phương pháp nhuộm methylene blue.

Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 20X về các đặc điểm sau:

o Hình dạng cuống sinh bào tử.

o Hình dạng thể bình.

48

o Hình dạng các thể bọng.

Đồ án tốt nghiệp

o Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn.

o Đặc điểm bào tử đính, Màu sắc, kích thước bào tử.

2.3.4. Xác định hoạt tính cellulose: Phương pháp khuếch tán trên thạch

 Nguyên tắc

Cellulase tác động lên cơ chất CMC trong môi trường thạch. CMC bị phân hủy

thành các đường khử làm độ đục của môi trường bị giảm và trở nên trong suốt khi

nhuộm bằng Lugol. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh hoạt tính của enzyme.

 Tiến hành

Dùng que cấy vô trùng lấy ít sợi nấm Trichoderma từ đĩa môi trường PDA đã

được làm thuần, rồi cấy 1 điểm lên tâm đĩa môi trường CMC và ủ 4 ngày ở nhiệt độ

phòng.

Sau 4 ngày, đổ dung dịch lugol vào đĩa môi trường CMC nuôi cấy nấm, để yên 5

phút rồi đổ lugol thừa ra và tiến hành đo đường kính vòng phân giải. Ở mỗi chủng, tiến

hành thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Xác định khả năng sinh enzyme cellulase bằng cách đo kích thước vòng phân giải

và kích thước tản nấm [8].

o D – d ≥ 25 mm: hoạt tính enzyme rất mạnh.

o D – d ≥ 20 mm: hoạt tính enzyme mạnh.

o D – d ≥ 15 mm: hoạt tính enzyme trung bình.

o D – d ≥ 10 mm: hoạt tính enzyme yếu.

Trong đó:

D: đường kính vòng phân giải CMC (mm).

d: đường kính phát triển của tản nấm sau 4 ngày (mm).

2.3.5. Xác định khả năng đối kháng

Phương pháp đồng nuôi cấy: Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với

các chủng nấm gây bệnh trong điều kiện in vitro được đánh giá bằng phương pháp

49

đồng nuôi cấy trên môi trường PDA. Các tương tác nhóm đã được khảo nghiệm bằng

Đồ án tốt nghiệp

phần trăm phát triển của vòng ức chế theo công thức sau (Fokkema, 1976;

Dhanasekaran và cộng sự, 2012):

Trong đó:

RĐC: Bán kính vòng phát triển của nấm gây bệnh trên đĩa đối chứng (mm)

RĐK: Bán kính vòng phát triển của nấm gây bệnh trên đĩa đối kháng (mm)

Mức độ đối kháng của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh được phân thành 4

cấp và đánh giá mức độ kháng (Trần Kim Loang và cộng sự, 2009). Tóm tắt như sau:

o Đối kháng cao (+++): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≥60%.

o Đối kháng trung bình (++): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≥40-59.

o Đối kháng yếu (+): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≤40-20.

o Không đối kháng (-): Nấm Trichoderma ức chế nấm gây bệnh ≤19.

2.3.6. Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm

bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu.

2.3.6.1. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm

Phytophthora sp. (phân lập trong mẫu đất trồng tiêu).

34 chủng nấm Trichoderma đựợc đánh giá khả năng đối kháng đối với sự phát

triển của nấm Phytophthora sp. gây hại ở cây hồ tiêu trên môi trường PDA, trong điều

kiện phòng thí nghiệm. Khuẩn ty nấm Trichoderma và Phytophthora sp. (đường kính

0,5 cm) được cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri ở hai vị trí đối diện, trong đó

khoảng cách giữa 2 dòng nấm là 7 cm và vị trí cấy khuẩn ty tính cạnh đĩa petri là 1 cm.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 34 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

 Chỉ tiêu theo dõi

Ghi nhận bán kính khuẩn ty nấm Trichoderma và Phytophthora sp. ở các thời

50

điểm 2, 3, 4, 5, 7, 9 và 11 ngày sau khi cấy.

Đồ án tốt nghiệp

2.3.6.2. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm

Fusarium sp. (phân lập từ rễ cây tiêu bị bệnh chết chậm)

34 chủng nấm Trichoderma đựợc đánh giá khả năng đối kháng đối với sự phát

triển của nấm Fusarium gây hại ở cây hồ tiêu trên môi trường dinh dưỡng PDA, trong

điều kiện phòng thí nghiệm. Khuẩn ty nấm Trichoderma và Fusarium (đường kính 0,5

cm) được cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri ở hai vị trí đối diện, trong đó

khoảng cách giữa 2 dòng nấm là 7 cm và vị trí cấy khuẩn ty tính cạnh đĩa petri là 1 cm.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 34 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

 Chỉ tiêu theo dõi

Ghi nhận bán kính khuẩn ty nấm Trichoderma và Fusarium sp. ở các thời điểm 2,

3, 4, 5, 7, 9 và 11 ngày sau khi cấy.

2.3.6.3. Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm

Colletotrichum sp. (phân lập từ lá cây hồ tiêu bị bệnh thán thư)

34 chủng nấm Trichoderma đựợc đánh giá khả năng đối kháng đối với sự phát

triển của nấm Colletotrichum gây hại ở cây hồ tiêu trên môi trường PDA, trong điều

kiện phòng thí nghiệm. Khuẩn ty nấm Trichoderma và Colletrotrichum sp. (đường

kính 0,5 cm) được cấy trên môi trường PDA trong đĩa petri ở hai vị trí đối diện, trong

đó khoảng cách giữa 2 dòng nấm là 7 cm và vị trí cấy khuẩn ty tính cạnh đĩa petri là

1cm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 34 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

 Chỉ tiêu theo dõi

Ghi nhận bán kính khuẩn ty nấm Trichoderma và Colletotrichum sp. ở các thời

điểm 2, 3, 4, 5, 7, 9 và 11 ngày sau khi cấy.

2.3.7. Phương pháp phân tích số liệu

Tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và SAS (Statistical

51

Analysis System) 9.1

Đồ án tốt nghiệp

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập nấm Trichoderma spp.

Xác định những vườn cần lấy mẫu, tiến hành thu thập mẫu đất và phân lập nấm

Trichoderma trên môi trường DRBC.

Hình. 3.1: Nấm Trichoderma trên môi trường DRBC sau 3 ngày.

Dựa trên mô tả đặc điểm hình thái điển hình của nấm Trichoderma của Gary J.

Samuels (2004). Có 75 chủng nấm Trichoderma được phân lập từ 30 mẫu đất (mỗi

vườn lấy 5 mẫu).

Bảng 3.1: Mật số nấm Trichoderma trong đất Bình Phước

Vƣờn BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6

Mật số Trichoderma 1070 1990 2440 890 222 465 (CFU/g)

Bảng 3.2: Số chủng Trichoderma bắt ra ở mỗi vườn

Vƣờn BP1 BP2 BP3 BP4 BP5 BP6

52

Số chủng Trichoderma đƣợc 19 15 24 3 9 5 phân lập trong mỗi vƣờn

Đồ án tốt nghiệp

Nhận xét:

- Mặc dù các vườn được lấy mẫu ở các điều kiện tự nhiên khác nhau, tuy nhiên

tất cả các vườn đều có sự hiện diện Trichoderma. Từ đó cho thấy, Trichoderma

là giống vi nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thích hợp với nhiều điều kiện.

Bên cạnh đó, kết quả phân lập cho thấy có nhiều trường hợp phân lập cùng 1

chủng Trichoderma nhưng hiện diện trong 2 vườn. Điều này chứng tỏ các chủng

Trichoderma có thể tồn tại trong nhiều khu vực địa lí khác nhau. Kết quả này

phù hợp với nhận định của Turner và cộng sự (1997).

- Giữa các vườn có sự lặp lại các chủng Trichoderma nên dựa vào hình thái đại

thể và hình thái vi thể, người thực hiện đề tài bắt được 34 chủng có đặc điểm

hình thái khác nhau trong tổng số 75 chủng Trichoderma phân lập từ 30 mẫu đất

(phụ lục 1).

53

Hình 3.2: Hình thái đại thể và vi thể của nấm Trichoderma sp. phân lập từ đất

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.3: Các chủng nấm Trichoderma spp. phân lập từ các mẫu

đất của tỉnh Bình Phước

Trichoderna spp. phân lập Trichoderna spp. phân lập

tại huyện Bù Gia Mập tại huyện Bù Đốp STT

Vƣờn 1 Vƣờn 2 Vƣờn 3 Vƣờn 4 Vƣờn 5

BP4_01.1 1 BP1_01.1 BP2_02.4 BP3_01.1 BP5_03

2 BP1_01.3 BP2_03.3 BP3_01.2 BP5_B.2 _

_ _ 3 BP1_02 BP2_03.4 BP3_01.3

_ _ 4 BP1_02.3 BP2_03.5 BP3_02.1

_ _ 5 BP1_04.1 BP2_04.2 BP3_02.2

_ _ 6 BP1_04.3 BP2_04.3 BP3_02.3

_ _ 7 BP1_B BP2_04.4 BP3_02.4

_ _ BP2_B.1 BP3_02.5 8 _

_ _ BP2_B.2 BP3_03.3 9 _

_ _ _ BP3_03.4 10 _

_ _ _ BP3_04.2 11 _

_ _ _ BP3_04.3 12 _

_ _ _ BP3_04.5 13 _

_ _ _ BP3_B.4 14 _

54

_ _ _ BP3_B.7 15 _

Đồ án tốt nghiệp

3.2. Kết quả phân lập nấm bệnh

3.2.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp.

Hình 3.3: Cánh hoa hồng bị chuyển màu và đặt trên môi trường WA

Sau 2 – 3 ngày bẫy Phytophthora, có 23 mẫu đất làm cánh hoa hồng chuyển

màu. (Trong đó, vườn BP1, BP2, BP3, BP4 có tất cả mẫu đất đều làm chuyển màu

cánh hoa hồng). Đặt các mẫu cánh hoa hồng đã chuyển màu lên môi trường WA), sau

4 ngày đĩa nấm bệnh xuất hiện sợi nấm mọc lên.

Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm mọc trên môi trường WA, cấy điểm sang đĩa

môi trường PDA. Sau 2 ngày thu được khuẩn lạc nấm Phytophthora sp. có những đặc

điểm (Hình 3.4) như: màu trắng, mọc tỏa ra theo hình bông cúc. Kết quả này cũng

tương tự như nghiên cứu Lê Quang Luân, 2014.

55

Hình 3.4: Nấm Phytophthora sp. trên trường PDA

Đồ án tốt nghiệp

Để khẳng định mẫu nấm thu được là Phytophthora sp. tiếp tục xem dưới kính

hiển vi. Kết quả nhận thấy du động bào tử (Hình 3.5 A) và bào tử (Hình 3.5 B), so sánh

với mô tả của Nguyễn Vĩnh Trường (2008) đây chính là nấm Phytophthora sp. gây

A

B

bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu.

Hình 3.5: Bào tử (A) và các du động bào tử (B) của nấm

Phytophthora sp. dưới hính hiển vi

3.2.2. Kết quả phân lập nấm Fusarium sp.

Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh trên môi trường WA, từ mẫu bệnh xuất hiện sợi

nấm mọc ra và lan ra môi trường (Hình 3.6).

Hình 3.6: Nấm Fusarium sp. trên môi trường WA

Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên môi trường WA, cấy điểm sang đĩa môi

56

trường PDA, tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc

Đồ án tốt nghiệp

nấm Fusarium sp. có những đặc điểm (Hình 3.7) như: màu trắng nhạt, mọc tỏa ra theo

cấu trúc hình tròn, bề mặt khuẩn lạc xốp.

Hình 3.7: Nấm Fusarium sp. trên môi trường PDA

Để khẳng định mẫu nấm thu được là Fusarium sp., tiếp tục quan sát dưới kính

hiển vi. Kết quả quan sát cho thấy đại bào tử (Hình 3.8 A) có dạng hình liềm và tiểu

bào tử (Hình 3.8 B) có dạng hình chùy. Như vậy, các đặc điểm hình thái đại thể và hình

thái vi thể của nấm tương đồng với các đặc điểm của Fusarium gây bệnh chết chậm

trên cây hồ tiêu.

Hình 3.8: Đại bào tử (A) và các tiểu bào tử (B) của nấm Fusarium sp.

3.2.3. Kết quả phân lập nấm Colletotrichum sp.

Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh trên môi trường WA, từ mẫu bệnh xuất hiện sợi

57

nấm mọc ra và lan ra môi trường (Hình 3.9).

Tơ nấm Colletotrichum sp.

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.9: Tơ nấm Colletotrichum sp. phát triển từ mẫu lá bệnh

Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên môi trường WA, cấy điểm sang đĩa môi

trường PDA, tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc

nấm Colletotrichum sp. có những đặc điểm (Hình 3.10) như: màu trắng sữa, mọc tỏa ra

theo cấu trúc hình tròn, giữa tản nấm phồng lên và xẹp dần về phía mép, kết quả này

cũng tương tự nghiên cứu Phạm Đình Quân (2009).

Hình 3.10: Nấm Colletotrichum sp. trên môi trường PDA

Để khẳng định mẫu nấm thu được là Colletotrichum sp., tiếp tục quan sát dưới

kính hiển vi. Kết quả quan sát thấy bào tử (Hình 3.11) có dạng hình trụ, so sánh với

mô tả của Trần Thị Hà Giang (2014) đây chính là nấm Colletotrichum sp. gây bệnh

58

thán thư trên cây hồ tiêu.

Đồ án tốt nghiệp

59

Hình 3.11: Bào tử nấm Colletotrichum sp.

Đồ án tốt nghiệp

3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma

30

25.7a

20

15

12.5b

10.7bc

10.3bcd

25

10bcdef

9.3bcdefg

7.7cdefg

7defghi

6.7efghij

6ghijk

6ghijk

4.7hijklm 4ijklmn

5.5hijkl

5

3.3jklmn

2lmn

1.5mn

1n 1n

0

Biểu đồ 3.1 Đường kính phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp.

61

10.2bcde 9.2bcdefg 10 7defghi 5.8ghijk 6.5ghijk 4.5hijklmn 5.5hijkl 4.3hijklmn 5hijklm 5hijklm 4.5hijklmn 3.5ijklmn 3.3jklmn 3.5ijklmn 3klmn

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật là một trong những yếu tố quyết

định khả năng phân giải các chất hữu cơ. Kết quả quan sát đường kính vòng phân giải

cellulose của các chủng Trichoderma phân lập được ở biểu đồ 3.1 cho thấy, tất các

chủng Trichoderma khảo sát đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase phân giải

cellulose. Nhưng nhìn chung khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng

Trichoderma khảo sát đều yếu và rất yếu. Trong đó, chủng Trichoderma BP3_B4 và

BP3_B7 có đường kính vòng phân giải chỉ 1 mm. Bên cạnh các chủng có khả năng

sinh enzyme cellulose yếu, chủng Trichoderma BP3_03.4 lại có khả năng phân giải

cellulose mạnh, đường kính vòng phân giải là 25,7 mm.

62

Hình 3.12: Khả năng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma spp.

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Đánh giá khả năng đối kháng Trichoderma spp. với nấm bệnh đã đƣợc

phân lập

3.4.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm Trichoderma spp.

phân lập từ đất

63

Hình 3.13: Hình thái chủng nấm Trichoderma sp. phát triển qua các ngày

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.4: Bán kính tản nấm Trichoderma spp. sau các ngày nuôi cấy

Bán kính tản nấm Trichodema spp. (cm) sau các ngày

nuôi cấy Các chủng Trichoderma

3NSC 4NSC 5NSC

45,7ef 70,7cde 80a BP1_01.1

BP1_01.3

52,7d 43,7efghi 72,0cd 75,0abc 80a 80a BP1_02

BP1_04.1

51,0d 41,7ghij 72,3bcd 56,0jklm 80a 73,0c BP1_02.3

BP1_04.3

50,7d 46,3e 73,3bcd 75,7abc 80a 80a BP1_B

BP2_02.4

53,7cd 43,0efghi 78,0ab 54,0klm 80a 70,3cd BP2_03.3

61,7b 80,0a 80a BP2_03.4

BP2_03.5

45,3efg 37,0k 72,7bcd 52,7lm 80a 65,0d BP2_04.2

BP2_04.3

65,3b 31,3l 80,0a 43,7n 80a 58,3e BP2_04.4

BP2_B.1

57,0c 80,0a 80,0a 80,0a 80a 80a BP2_B.2

44,7efgh 63,3fgh 80a BP3_01.1

BP3_01.2

41,0hij 32,0l 50,7m 42,7n 70,3cd 55,3e BP3_01.3

BP3_02.1

40,7ijk 42,7efghij 58,0hijkl 58,0hijkl 72c 78,9ab BP3_02.2

64

39,0jk 57,3ijkl 80a BP3_02.3

Đồ án tốt nghiệp

41,0hij 62,3fghi 80a BP3_02.4

BP3_02.5

54,3cd 42,0fghij 80,0a 61,0ghij 80a 80a BP3_03.4

BP3_03.3

46,0e 41,0hij 71,0cd 58,0hijkl 80a 74,3bc BP3_04.2

BP3_04.3

44,0efghi 45,7ef 64,7fg 58,0hijkl 80a 80a BP3_04.5

41,3hij 68,0def 80a BP3_B.4

BP3_B.7

43,3efghi 53,3cd 59,7ghijk 74,0bc 80a 80a BP4_01.1

BP5_03

44,0efghi 41,7ghij 65,0efg 58,7hijk 80a 80a BP5_B.2

Sự tăng trưởng của nấm là một chỉ tiêu quan trọng để lựa chọn chủng vi sinh vật

ứng dụng tạo chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng. Kết quả ở bảng 3.4

cho thấy đa số các chủng Trichoderma đều phát triển rất nhanh trên môi trường PDA.

Sau 5 ngày nuôi cấy, tản nấm phát triển đầy đĩa với bán kính 80 (mm). Đặc biệt chủng

Trichoderma BP2_B.2 có tốc độ tăng trưởng cao nhất, tản nấm phát triển đầy đĩa chỉ

sau 3 ngày nuôi cấy. Nhưng bên cạnh đó, vẫn có những chủng Trichoderma như

BP2_04.2, BP2_04.4 và BP3_01.3 mà người thực hiện đề tài phân lập có khả năng sinh

trưởng yếu. Sau 5 ngày nuôi cấy, bán kính tăng trưởng trung bình sau 3 lần khảo sát chỉ

65

đạt gần 65 mm.

Đồ án tốt nghiệp

66

Hình 3.14: Các chủng Trichoderma có khả năng phủ kín đĩa sau 4 ngày nuôi cấy

Đồ án tốt nghiệp

3.4.2. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết

nhanh trên cây hồ tiêu

67

Hình 3.15: Trichoderma sp. đối kháng với Phytophthora sp. theo dõi qua các ngày

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.5: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. đối với

Phytophthora sp. sau các ngày theo dõi

Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi

Các chủng Trichoderma 3NSC 4NSC 5NSC

BP1_01.1 55,9cd 44,7gh 74,7bc 71,1cd 81,1bcd 78,2def BP1_01.3

46,4fgh 61,3f 74,8efg BP1_02

BP1_04.1

52de 44,7gh 73,3bc 59,6fg 81,5bcd 70,0hij BP1_02.3

BP1_04.3

55,3cd 49,2ef 74,7bc 61,8f 85,2b 78,2def BP1_B

BP2_02.4 47,5fg 43,0hi 67,6de 61,8f 79,2cde 70,4ghij BP2_03.3

62,1b 73,8bc 82,9bc BP2_03.4

BP2_03.5

51,9de 31,6lmn 67,1e 58,2fg 78,5cdef 67,0jkl BP2_04.2

BP2_04.3

48,6efg 24,8o 59,6fg 48,4mno 66,3jklm 57,4pq BP2_04.4

BP2_B.1 46,9fhg 74,0a 75,5b 100a 79,6cd 100a BP2_B.2

BP3_01.1 36,2ik 39,6ij 52,9ijk 56,4ghi 66,7jkl 66,3jklm BP3_01.2

34,5klm 49,3klmno 59,3opq BP3_01.3

BP3_02.1

68

35,0klm 32,8klmn 50,2jklmn 49,3klmno 61,1nop 58,2pq BP3_02.2

Đồ án tốt nghiệp

36,2kj 57,3gh 74,3fgh BP3_02.3

BP3_02.4

34,5kml 39,5ij 51,6jklm 53,8hij 61,5nop 63,3lmno BP3_02.5

BP3_03.4

35,6ikl 29,4n 52,4jkl 46,2o 68,9ijk 55,6q BP3_03.3

BP3_04.2 31,6lmn 36,2jk 46,7no 53,3ij 56,3q 64,0lmn BP3_04.3

33,3klmn 50,7jklm 64,4klmn BP3_04.5

BP3_B.4

31,1mn 36,7jk 58,7fg 51,1jklm 73,0ghi 61,1nop BP3_B.7

BP4_01.1

54,5c 31,6lmn 72,0bc 48,9lmno 79,6cd 61,5nop BP5_03

69

36,7jk 52,0jklm 61,8mnop BP5_B.2

Đồ án tốt nghiệp

120

100a

100

82.9bc

79.2cde

81.5bcd

78.2def

79.6cd

79.6cd

66.7jkl

78.2def

64.4klmn

80

74.3fgh

70.4ghij

66.3jklm

63.3lmno

64lmn

61.1nop

56.3q

61.5nop

57.4pq

60

40

81.1bcd 85.2b 73ghi 68.9ijk 78.5cdef 67jkl 74.8efg 70hij 66.3jklm 61.1nop 59.3opq 61.8mnop 61.5nop 58.2pq 55.7q

20

Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ (%) đối kháng của nấm Trichoderma spp. với nấm Phytophthora sp. 5 NSC

70

0

Đồ án tốt nghiệp

Khả năng đối kháng là chỉ tiêu quyết định và là yếu tố quan trọng nhất thể hiện

hiệu quả ức chế của vi sinh vật trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Tỷ lệ đối kháng của

các chủng Trichoderma khảo sát được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy các chủng

Trichoderma phân lập được trong đất Bình Phước đều có khả năng ức chế nấm

Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu trong điều kiện phòng thí

nghiệm. Sau 4 ngày nuôi cấy, chủng nấm Trichoderma BP2_B.2 có khả năng ức chế

100 % nấm Phytophthora sp. theo cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống,

nhờ vào tốc độ phát triển nhanh. Sau 11 ngày nuôi cấy, 8 chủng Trichoderma khác là

BP1_01.1, BP1_04.1, BP1_04.3, BP1_B, BP2_02.4, BP2_03.4, BP2_B.1 và BP4_01.1

cũng có khả năng đối kháng 100 % nấm Phytophthora sp (Phụ lục 2). Bên cạnh đó,

ngoài khả năng cạnh tranh dinh dưỡng thì sự đối kháng nấm bệnh còn phụ thuộc vào

ĐC

khả năng tiết kháng sinh, enzyme chitinase và các yếu tố cơ học khác.

71

Hình 3.16: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Phytophthora sp. và đĩa nấm Phytophthora sp. sau 7 ngày nuôi cấy

Đồ án tốt nghiệp

3.4.3. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết

chậm trên cây hồ tiêu

72

Hình 3.17: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với Fusarium sp. theo dõi qua các ngày.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.6: Tỷ lệ (%) đối kháng Trichoderma spp. với Fusarium sp. sau

các ngày theo dõi

Tỉ lệ (%) đối kháng sau các ngày theo dõi

Các chủng Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC

BP1_01.1 12,1cdefg 15,1bcde 36,4ijklm 37,1hijkl 52,0efghij 52,0efghij BP1_01.3

10,6cdefg 41,2fghi 53,5defghij BP1_02

BP1_04.1

12,1cdefg 15,1bcde 37,2hijkl 34,3klmn 52,3defghij 47,3ijk BP1_02.3

BP1_04.3

16,7bcd 13,6cdef 43,1defgh 42,2efghi 56,6defgh 53,5defghij BP1_B

BP2_02.4 15,1bcde 13,6cdef 44,0cdefg 34,3jkml 57,4defg 48,1hijk BP2_03.3

15,1bcde 48,1cde 61,2cd BP2_03.4

BP2_03.5

12,1cdefg 10,7cdefg 40,2fghij 27,4no 55,8defghi 40,3kl BP2_04.2

BP2_04.3

22,7b 12,1cdefg 50,0c 19,6p 60,5de 38,0l BP2_04.4

BP2_B.1 12,1cdefg 100a 44,1cdefg 100a 69,7bc 100a BP2_B.2

BP3_01.1 15,1bcde 9,1defg 49,0cd 25,5op 59,7def 75,2b BP3_01.2

10,7cdefg 31,4lmno 45,7jkl BP3_01.3

BP3_02.1

73

15,1bcde 15,2bcde 37,3hijkl 30,4mno 51,2fghij 49,6ghij BP3_02.2

Đồ án tốt nghiệp

6,0fg 42,1efghi 55,0defghi BP3_02.3

BP3_02.4

12,1cdefg 7,6efg 46,1cdef 100a 58,1defg 100a BP3_02.5

BP3_03.4

12,1cdefg 10,7cdefg 32,4lmn 71,6b 48,0hijk 100a BP3_03.3

BP3_04.2 12,1cdefg 12,1cdefg 32,4lmn 43,1defgh 48,0hijk 50,7ghij BP3_04.3

4,5g 34,3jklm 51,2fghij BP3_04.5

BP3_B.4

9,1defg 16,2bcd 41,2fghi 39,2ghijk 57,3defg 52,0efghij BP3_B.7

BP4_01.1

10,7cdefg 18,2bc 42,2efghi 49,0cd 55,0defghi 77,5b BP5_03

12,1cdefg 48,1cde 59,7def BP5_B.2

Kết quả đánh giá tính đối kháng của các chủng Trichoderma spp. phân lập trong

đất Bình Phước đối với nấm Fusarium sp. gây bệnh chết chậm ở cây hồ tiêu trên môi

trường dinh dưỡng PDA (Bảng 4.4 và Hình 4.5) cho thấy, các chủng Trichoderma spp.

đều có khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. ở thời điểm sau 7 ngày nuôi câý.

Phần lớn các chủng Trichoderma đối kháng nấm Fusarium sp. ở mức độ trung bình từ

40 – 59 %. Nhưng bên cạnh đó vẫn có các chủng có khả năng đối kháng cao lên đến

74

100 % như BP2_B.2 sau 3 ngày nuôi cấy và BP3_03.3, BP3_2.5 sau 7 ngày nuôi cấy.

Đồ án tốt nghiệp

120

100a

100a

100a

77.5b

75.2b

80

69.7bc

52efghij

61.2cd

100

60.5de

51.2fghij

59.7def

51.2fghij

55defghi

52efghij 52.3defghij

53.5defghij

48hijk

53.5defghij 47.3ijk

38l

40

20

0

Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ (%) đối kháng của Trichoderma spp. với Fusarium sp. 7 NSC

75

57.3defg 57.4defg 59.7def 58.1defg 55defghi 56.6defgh 60 55.8defghi 49.6ghij 50.7ghij 45.7jkl 52efghij 48.1hijk 48hijk 40.3kl

Đồ án tốt nghiệp

76

Hình 3.18: Chủng Trichoderma spp. có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium sp. và đĩa nấm bệnh Fusarium sp. sau 7 ngày nuôi cấy

Đồ án tốt nghiệp

3.4.4. Trichoderma spp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán

thư trên cây tiêu

77

Hình 3.19: Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp.

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.7: Tỷ lệ (%) đối kháng nấm Trichoderma spp. đối với nấm Colletotrichum sp. qua các ngày theo dõi

Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi

Các chủng Trichoderma 3NSC 5NSC 7NSC

BP1_01.1 6,4ghi 1,6i 59,8cde 49,0ijkl 69,6de 68,2def BP1_01.3

6,3ghi 51,0ghijkl 63,7efghij BP1_02

BP1_04.1

9,5fgh 0,0i 53,9efghij 41,2mn 67,4defg 57,1hijk BP1_02.3

BP1_04.3

1,6i 6,4ghi 50,0hijkl 59,8cde 100,0a 69,6de BP1_B

BP2_02.4 6,3ghi 3,2hi 51,0ghijkl 45,1lm 64,4defghi 57,8ghijk BP2_03.3

0,0i 48,1jkl 100,0a BP2_03.4

BP2_03.5

1,6i 0,0i 54,9defghi 33,4o 74,1cd 51,8kl BP2_04.2

BP2_04.3

20,6bcd 1,6i 55,9defgh 22,5p 66,7defgh 42,2lm BP2_04.4

BP2_B.1 0,0i 100,0a 52,0fghijk 100,0a 65,9defgh 100,0a BP2_B.2

BP3_01.1 22,2bc 12,7efg 57,2defg 52,0fghijk 70,4de 83,6bc BP3_01.2

20,6bcd 60,8cd 83,7bc BP3_01.3

BP3_02.1

78

22,2bc 19,0bcde 49,0ijkl 52,9fghij 62,2efghij 85,9b BP3_02.2

Đồ án tốt nghiệp

20,6bcd 51,9fghijk 65,9defgh BP3_02.3

BP3_02.4

17,5cde 17,4cde 46,1klm 67,7bc 62,9efghij 100,0a BP3_02.5

BP3_03.4

20,6bcd 14,3def 57,8cdef 48,1jkl 58,8fghijk 56,9hijk BP3_03.3

BP3_04.2 20,6bcd 25,4b 37,2no 54,9defghi 39,2m 100,0a BP3_04.3

22,2bc 59,8cde 69,6de BP3_04.5

BP3_B.4

17,5cde 20,6bcd 48,1jkl 48,1jkl 56,9hijk 54,9ijk BP3_B.7

BP4_01.1

3,2hi 20,6bcd 49,0ijkl 67,6b 49,0klm 71,6de BP5_03

79

20,6bcd 53,9efghij 53,9jk BP5_B.2

Đồ án tốt nghiệp

100a

100a

100a

100a

100a

120

85.9b

83.6bc

100 83.7bc

80

74.1cd

65.9defgh

65.9defgh

70.4de

67.4defg

69.6de 64.4defghi

66.7defgh

62.9efghij

62.2efghij

63.7efghij

57.8ghijk

56.9hijk

69.6de 68.2def 71.6de 69.6de

60

42.2lm

39.2m

58.8fghijk 56.9hijk 57.1hijk 54.9ijk 53.9jk 51.8kl 49klm

20

0

Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ (%) đối kháng của nấm Trichoderma spp. với Colletotrichum sp. 7NSC

80

40

Đồ án tốt nghiệp

Tất cả các chủng Trichoderma phân lập được đều có khả năng đối kháng với các

chủng Colletotrichum sp. ở các mức độ khác nhau (bảng 3.7). Các chủng Trichoderma

BP2_B.2, BP3_01.3, BP3_02.5 và BP5_03 có khả năng đối kháng Colletotrichum sp.

theo cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, nhờ vào tốc độ phát triển

nhanh. Bên cạnh tốc độ phát triển nhanh, các chủng Trichoderma còn lại còn có khả

năng kí sinh trên khuẩn ty nấm bệnh. Khuẩn ty Trichoderma áp sát và quấn chặt lấy

khuẩn ty Colletotrichum, hoặc tiết enzyme và ăn sâu vào bên trong khuẩn ty nấm bệnh

(hình 3.20). Trong một số trường hợp, rất có thể Trichoderma hút các chất dinh dưỡng

từ khuẩn ty nấm bệnh và phát triển rất mạnh, tạo nhiều bào tử hơn so với khi phát triển

trên môi trường PDA (BP3_02.5, BP3_03.3). Trong số 34 chủng Trichoderma sp. khảo

sát, sau 9 ngày nuôi cấy có đến 18 chủng khả năng đối kháng đạt hiệu quả tối đa (Phụ

lục 2).

Hình 3.20: Khuẩn ty Trichoderma sp. quấn chặt lấy khuẩn ty Colletotrichum sp.

81

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.21: Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Colletotrichum sp. sau 7 ngày nuôi cấy và đĩa nấm bệnh Colletotrichum sp. sau 5 ngày nuôi cấy

82

Đồ án tốt nghiệp

3.4.5. Tổng hợp khả năng đối kháng của các Trichoderma spp. với 3 nấm

bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu

Bảng 3.8: Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với Phytophthora sp. sau 3 NSC và Fusarium sp., Colletotrichum sp. sau 7 NSC.

Tỉ lệ đối kháng (%) sau các ngày theo dõi

Các chủng Trichoderma Phytophthora sp. Fusarium sp. sau Colletotrichum

sau 5 NSC sp. sau 7 NSC 7 NSC

BP1_01.1

81,1bcd 78,2def 52,0efghij 52,0efghij 69,6de 68,2def BP1_01.3

BP1_02

74,8efg 81,5bcd 53,5defghij 52,3defghij 63,7efghij 67,4defg BP1_04.1

BP1_02.3

70,0hij 85,2b 47,3ijk 56,6defgh 57,1hijk 100,0a BP1_04.3

78,2def 53,5defghij 69,6de BP1_B

BP2_02.4

79,2cde 70,4ghij 57,4defg 48,1hijk 64,4defghi 57,8ghijk BP2_03.3

BP2_03.4

82,9bc 78,5cdef 61,2cd 55,8defghi 100,0a 74,1cd BP2_03.5

BP2_04.2

67,0jkl 66,3jklm 40,3kl 60,5de 51,8kl 66,7defgh BP2_04.3

BP2_04.4 57,4pq 79,6cd 38,0l 69,7bc 42,2lm 65,9defgh BP2_B.1

100a 100a 100,0a BP2_B.2

BP3_01.1

66,7jkl 66,3jklm 59,7def 75,2b 70,4de 83,6bc BP3_01.2

83

Đồ án tốt nghiệp

59,3opq 45,7jkl 83,7bc BP3_01.3

BP3_02.1

61,1nop 58,2pq 51,2fghij 49,6ghij 62,2efghij 85,9b BP3_02.2

BP3_02.3

74,3fgh 61,5nop 55,0defghi 58,1defg 65,9defgh 62,9efghij BP3_02.4

BP3_02.5 63,3lmno 68,9ijk 100a 48,0hijk 100,0a 58,8fghijk BP3_03.4

55,6q 100a 56,9hijk BP3_03.3

BP3_04.2

56,3q 64,0lmn 48,0hijk 50,7ghij 39,2m 100,0a BP3_04.3

BP3_04.5

64,4klmn 73,0ghi 51,2fghij 57,3defg 69,6de 56,9hijk BP3_B.4

BP3_B.7

61,1nop 79,6cd 52,0efghij 55,0defghi 54,9ijk 49,0klm BP4_01.1

BP5_03 61,5nop 61,8mnop 77,5b 59,7def 71,6de 53,9jk BP5_B.2

Ở bảng 3.8, người thực hiện đề tài nhận thấy Trichoderma có phổ tác đông rộng.

Tuy nhiên, mức độ đối kháng của Trichoderma còn phụ thuộc vào chủng Trichoderma,

chủng nấm bệnh và thời gian cấy đối kháng.

Trong số 34 chủng phân lập trong đất Bình Phước, nổi trội nhất là chủng

Trichoderma BP2_B có khả năng đối kháng mạnh với cả 3 chủng nấm gây bệnh phổ

biến trên cây hồ tiêu là Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp. Đây là

một tác nhân hứa hẹn có nhiều triển vọng sản xuất các chế phẩm sinh học dùng trong

kiểm soát và phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng. Ngoài ra, còn các chủng BP1_04.3,

BP2_03.4 và BP3_02.5 cũng có khả năng đối kháng cao với 3 chủng nấm gây bệnh

phổ biến trên cây hồ tiêu.

84

Đồ án tốt nghiệp

KẾT LUẬN

Đã phân lập được 34 chủng nấm Trichoderma từ đất trồng hồ tiêu ở tỉnh Bình

Phước

Đã phân lập được nấm gây bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu: Phytophthora sp. gây

bệnh chết nhanh, Fusarium sp. gây bệnh chết chậm và Colletotrichum sp. gây bệnh

thán thư.

Các chủng nấm Trichoderma phân lập được trong đất đều sinh enzyme cellulase

yếu, vòng phân giải cellulose từ 1 – 12,5 mm sau 4 ngày nuôi cấy, trừ chủng BP3_03.4

có khả năng sinh enzyme cellulase mạnh, vòng phân giải cellulose 25,7 mm.

Các chủng nấm phân lập được đều sinh trưởng và phát triển mạnh trên môi

trường PDA, đặc biệt là các chủng BP2_B.1, BP2_B.2, BP2_03.4, BP2_04.3 và

BP3_02.5 chỉ sau 4 ngày đã phát triển đầy đĩa.

Có 9 chủng Trichoderma đối kháng 100 % với nấm Phytophthora sp. là

BP1_01.1, BP1_04.1, BP1_04.3, BP1_B, BP2_02.4, BP2_03.4, BP2_B.1, BP2_B.2 và

BP4_01.1.

Có 3 chủng Trichoderma đối kháng 100 % với nấm Fusarium sp. là BP2_B.2,

BP3_02.5 và BP3_03.3.

Có 18 chủng Trichoderma đối kháng 100 % với nấm Colletotrichum sp. là

BP1_01.1, BP1_04.3, BP2_02.4, BP2_03.4, BP2_03.5, BP2_B.1, BP2_B.2, BP3_01.1,

BP3_01.2, BP3_01.3, BP3_02.2, BP3_02.3, BP3_02.5, BP3_03.3, BP3_04.3,

BP4_01.1, BP5_03 và BP5_B.2.

Chủng nấm Trichoderma BP2_B.2 có khả năng đối kháng tốt với cả 3 nấm bệnh.

Chủng BP1_01.1, BP1_04.3, BP2_02.4, BP2_03.4 và BP4_01.1 có khả năng đối kháng

tốt với Phytophthora sp và Colletotrichum sp. Chủng BP3_02.5 và BP3_03.3 đối

kháng tốt với nấm Fusarium sp. và Colletotrichum sp.

85

Đồ án tốt nghiệp

KIẾN NGHỊ

1. Tiến hành nghiên cứu hiệu quả của nấm Trichoderma spp. phân lập được từ đất

trong phòng trừ nấm bệnh Phytophthora sp., Fusarium sp. và Colletotrichum sp.

gây hại trên cây hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng.

2. Tiếp tục thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp.

phân lập được từ đất với nấm gây bệnh trên các loại cây trồng điển hình khác

như Neoscytalidium spp, Rhizoctonia solani, …

3. Định danh chính xác các chủng nấm Trichoderma spp. phân lập được từ trong

đất Bình Phước qua hình thái vi thể và sinh học phân tử.

4. Tiến hành tạo chế phẩm sinh học Trichoderma từ nguồn giống đã khảo sát, đặc

biệt là chủng BP2_B.2 dùng bổ sung vào phân bón hữu cơ vi sinh trong kiểm

soát nấm bệnh.

5. Tiếp tục phân lập thêm một số chủng Trichoderma spp. nhằm tìm ra những

chủng có tính đối kháng mạnh đối với nấm bệnh phổ biến trên cây hồ tiêu và

các loại cây trồng khác.

86

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƢỚC

[1] Bộ Trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Phê duyệt quy hoạch phát

triển ngành hồ tiêu Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030, 27/06/2014,

Quyết định, số 1442/QĐ – BNN – PT.

[2] Cao Ngọc Điệp, Giáo trình Thực tập môn nấm học.

[3] Cục Xúc tiến Thương mai (2015), Sản lượng và tiêu thụ hồ tiêu trên thế giới: con

số và dự báo.

[4] Cục xúc tiến thương mại (2015), EU: Thị trường nhập khẩu hồ tiêu tiềm năng cho

các nước khu vực Đông Nam Á – Phần 1.

[5] Cục Xúc tiến Thương mại (2015), Thị trường tiêu thụ thế giới 5/2015 và dự báo

[6] Dương Hoa Xô (2005), Vai trò nấm đối kháng Trichoderma trong kiểm soát vi

sinh, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh.

[7] Đại học Tây Nguyên (2013), Sử dụng chế phẩm sinh học trong canh tác hồ tiêu.

[8] Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân

lập từ đất Quảng Nam - Đà Nẵng. Luận án tiến sĩ, Đại Học Sư Phạm Hà Nội.

[9] Đỗ Trung Bình (2016), Sản xuất hồ tiêu hữu cơ ở Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ

thuật miền Nam Việt Nam

[10] Đỗ Trung Bình (2013), Sản xuất hồ tiêu Việt Nam thách thức và cơ hội, Báo cáo

tổng kết đề tài cấp bộ, Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam

[11] Hiệp Hội Hồ tiêu Việt Nam (4/2014), Ngành Hồ tiêu Việt Nam.

[12] Hiệp Hội Hồ tiêu Việt Nam (2014), Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu

năm 2014.

[13] Hoàng Minh Tiến (2011), Đấu tranh sinh học, Bài giảng. [14] Huỳnh Văn Phục (2006), Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma spp.

đối với nấm Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và cây

bắp, luận văn, Trường Đại học Nông Lâp, TP.HCM.

87

Đồ án tốt nghiệp

[15] Hứa Võ Thành Long (2010). Sản xuất bào tử nấm Trichoderma spp. làm thuốc

trừ nấm bệnh cây trồng, Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học,

Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

[16] Khóa luận ―Điều tra diện tích canh tác và diễn biến của một số loài sâu bệnh hại

chính trên cây tiêu tại huyện Buôn Đôn – tỉnh Đắk Lắk‖ (2014).

[17] Khóa luận ―Nghiên cứu nấm Fusarium spp. gây hại trên cây hồ tiêu ở Quảng

Trị‖, luận văn (2010).

[18] Lại Hà Tố Hoa (2006), Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS

– rDNA và vùng TEF, Đại học Nông Lâm, TP.HCM

[19] Lê Quang Bình (2014), Phân tích thực trạng kinh doanh xuất khẩu hồ tiêu Việt

Nam vào thị trường Mỹ và giải pháp thúc đẩy xuất khẩu đến năm 2020, báo cáo

thực hành nghề nghiệp, trường Đại học Tài Chính – Marketing

[20] Lê Văn Trịnh (2009), Nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng và

nấm bệnh vùng rễ cà phê và hồ tiêu, Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nước, Viện

Bảo vệ Thực Vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

[21] Mi Phương (2012), Chữa bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu bằng vi khuẩn, Báo

Gia Lai.

[22] Nguyễn Công Thành, Phòng Nghiên cứu cây công nghiệp, Viện Khoa học Kỹ

thuật Nông nghiệp miền Nam, 08/2014.

[23] Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh (2008), Định danh nấm Phytophthora spp. bằng

các kỹ thuật sinh học phân tử, luận văn kỹ sư, Trường Đại học Nông Lâm,

TP.HCM

[24] Nguyễn Ngọc Châu (1995), Thành phần sâu bệnh hại hồ tiêu ở Tân Lâm –

Quảng Trị. Tạp chí bảo vệ thực vật 1/1995

[25] Nguyễn Ngọc Phúc (2005), Bước đầu khảo sát mối quan hệ giữa sự hiện diện

Trichoderma và các yếu tốt của đất, luận văn tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm,

TP.HCM.

88

Đồ án tốt nghiệp

[26] Nguyễn Thị Khả Tú (2007), Định danh và phân nhóm nấm Trichoderma spp.

phân lập tại Việt Nam, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP.HCM

[27] Ngô Trường (2015), ―Khắc tinh‖ bệnh chết nhanh chết chậm, Khuyến nông,

Nông nghiệp Việt Nam

[28] Nguyễn Văn Đĩnh và cộng sự (2004), Giáo trình Biện pháp sinh học trong bảo

vệ thực vật, Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

[29] Nguyễn Vịnh (2014), Bình Phước: Diện tích tiêu chết vì bệnh tăng nhanh, báo

Bình Phước.

[30] Nguyễn Vịnh (2014), Đồng Nai: hơn 600 hecta tiêu bị sâu bệnh. [31] Nguyễn Vịnh (9/2012), Một số ích lợi của vi nấm Trichoderma, Mục: Trồng và

chăm sóc tiêu.

[32] Phạm Đình Quân (2009), Nghiên cứu bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) hại

quả ớt tại Hải Dương vụ đông xuân năm 2008 – 2009 và biện pháp phòng trừ, luận

văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

[33] Phạm Ngọc Dung (2011), Nghiên cứu ứng dụng các giải pháp khoa học công

nghệ quản lý tổng hợp bệnh hại chủ yếu trên cây hồ tiêu nhằm nâng cao hiệu quả

sản xuất và thu thập cho người dân nghèo tỉnh quản trị, Báo cáo tổng kết, Bộ Nông

nghiệp và Phá triển Nông thôn.

[34] Phạm Thị Ngọc Lan (2012). Giáo trình thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản

Đại học Huế.

[35] TCVN 4046 – 85, Đất trồng trọt – Phương pháp lấy mẫu

[36] TCVN 4833-89 (ISO 4833-1978), Hướng dẫn chung đếm vi sinh vật kỹ thuật

đếm khuẩn lạc ở 300C

[37] TCVN 4881-89 (ISO 6887-1983 ), Hướng dẫn chung về cách pha chế dung dịch

pha loãng để kiểm nghiệm vi sinh vật

[38] Tây Đô – Nguồn: SGGP.or.vn, Tây Nguyên ồ ạt trồng tiêu phá vỡ quy hoạch,

nuôi mầm dịch bệnh.

89

Đồ án tốt nghiệp

[39] Tôn Nữ Tuấn Nam (2008), Đánh giá chất lượng và thị trường hồ tiêu tại Việt

Nam, báo cáo, dự án Quản lý bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên miền Trung.,

TP.HCM.

[40] Trần Mỹ Duyên (2009), Khảo sát khả năng tạo bào tử của nấm Colletotrichum

spp. môi trường nhân tạo, luận văn tốt nghiệp kỹ sư nông học, Đại học Cần Thơ.

[41] Trần Thị Hà Giang (2014), Nghiên cứu bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) và

biện pháp phòng trừ tại Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình, Học viên Nông nghiệp Việt

Nam, Hà Nội

[42] Trung tâm Phát triển Công nghệ cao, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam (2015), Nghiên cứu phát triển và ứng dụng một số chế phẩm có nguồn

gốc sinh học trong canh tác chè, cà phê, hồ tiêu theo hướng phát triển bền vững tại

Tây Nguyên.

[43] Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam Việt Nam (04/2016), Bệnh thán thư.

[44] Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam, Bệnh chết nhanh, 04/2016.

[45] Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), Bệnh cây nông nghiệp, Nhà xuất bản

Nông Nghiệp Hà Nội, Hà Nội.

TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI

[46] André Drenth và David I. Guest (2004), Diversity and Management of

Phytophthora in Southeast Asia, BPA Print Group Pty Ltd. Melbourne, Australia

[47] Aneza K. R., 2002. Experoments in microbiology plant pathology tissue culture

and mushroom production technolog.

[48] Byron Caughey (2012), Advantages & Disadvantages of Biological Control.

[49] Canan Usta (2013), Microorganisms in Biological Pest Control — A Review

(Bacterial Toxin Application and Effect of Environmental Factors) (pg.290-291)

90

Đồ án tốt nghiệp

[50] Dhanasekaran D., Thajuddin N., Panneerselvam A. (2012). Applications of

Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine. Fungicides for Plant and

Animal Diseases, p. 34.

[51] (Gagkaeva T. (2008) Introduction to Fusarium taxonomy, St. Petersburg,

Russia.

[52] Ken Pegg and Andrew Manners (2014), Fusarium a formidable nursery

pathogen, Agri – science Queensland, Department of Agriculture, Fisheries and

Forestry, Ecosciences Precinct, GPO Box 267, Brisbane QLD

[53] Lin X và Heitman J. (2005), Chlamydospore Formation during Hyphal Growth

in Cryptococcus neoformans, American Society for Microbiology.

[54] R.K.Upadhyay, K.G.Mukerji và B.P.Chamola (2000), Biocontrol potential and

its exploitation in sustainable agricultural – Volume 1: Crop diseases, weeds and

nematodes (pg.229-230).

[55] Sachiko Schott, Life cycle of Colletotrichum, Ehow.

[56] Seifert K. (1996), Fusarium interactive key, Agriculture and Agri - Food

Canada.

[57] Susan Groenewald (2005), Biology, pathogenicity and diversity of Fusarium

oxysporum f.sp. cubense, Publisher University of Pretoria.

[58] Vinit Kumar Mishra (2010) In vitro antagonism of Trichjoderma species against

Pythium aphanidermatum Phytology, p. 28-35.

TÀI LIỆU INTERNET

[59] http://angiang.made-in-vietnam.com/san-pham/tieu-trang-7ce926fb

[60] http://catex.vn/estore/default.aspx?sid=41&pid=219&san-pham=562

[61] http://www.dtk.com.vn/nong-san-xuat-khau/ho-tieu.html

[62] http://dungduyen.com/chi-tiet/san-xuat-ho-tieu-bang-phuong-phap-sinh-hoc-

p21719a204666.htm#.V54ZvtJ97IV

91

Đồ án tốt nghiệp

[63] http://www.suckhoevasacdep.vn/tin-tuc/tinh-dau-tieu-den-10ml.html

[64] Syngenta, Kỹ thuật canh tác hồ tiêu

http://www3.syngenta.com/country/vn/vi/library/agronomy/speciality/Pages/peppe

r.aspx

[65] www.hippocampus-bildarchiv.de

[66] http://www.caytieuvn.com/p/blog-page.html

[67] http://rausach.com.vn/forum_posts.asp?TID=5831&PN=2

92

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC 1

Hình thái đại thể và hình thái vi thể của các chủng Trichoderma spp. phân lập

trong đất Bình Phƣớc.

Hình thái đại thể Hình thái vi thể

BP1_01.1

BP1_01.3

BP1_02

1

Đồ án tốt nghiệp

BP1_02.3

BP1_04.1

BP1_04.3

BP1_B

2

Đồ án tốt nghiệp

BP2_02.4

BP2_03.3

BP2_03.4

BP2_03.5

3

Đồ án tốt nghiệp

BP2_04.2

BP2_04.3

BP2_04.4

BP2_B.1

4

Đồ án tốt nghiệp

BP2_B.2

BP3_01.1

BP3_01.2

BP3_01.3

5

Đồ án tốt nghiệp

BP3_02.1

BP3_02.2

BP3_02.3

BP3_02.4

6

Đồ án tốt nghiệp

BP3_02.5

BP3_03.3

BP3_03.4

BP3_04.2

7

Đồ án tốt nghiệp

BP3_04.3

BP3_04.5

BP3_B.4

BP3_B.7

8

Đồ án tốt nghiệp

BP4_01.1

BP5_03

BP5_B.2

9

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC 2

Các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm Phytophthora sp. sau

7 và 9 ngày theo dõi

10

Đồ án tốt nghiệp

Các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng cao với Colletotrichum sp.

sau 9 và 11 ngày theo dõi

11

Đồ án tốt nghiệp

12

Đồ án tốt nghiệp

5 NGAY NUOI CAY 09:50 Thursday, August 17, 2016 3

The GLM Procedure t Tests (LSD) for D NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 66 Error Mean Square 6.078134 Critical Value of t 2.65239 Least Significant Difference 5.3392

Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 80.000 3 BP1_01.1 A A 80.000 3 BP1_01.3 A A 80.000 3 BP1_02 A A 80.000 3 BP3_04.3 A A 80.000 3 BP1_04.1 A A 80.000 3 BP1_04.3 A A 80.000 3 BP1_B A A 80.000 3 BP2_02.4 A A 80.000 3 BP3_03.3 A A 80.000 3 BP2_03.4 A A 80.000 3 BP2_03.5 A A 80.000 3 BP2_B.2 A A 80.000 3 BP2_04.3 A A 80.000 3 BP3_B.4

Bán kính tản nấm Trichoderma sau 5 ngày nuôi cấy

13

A A 80.000 3 BP2_B.1 A A 80.000 3 BP3_02.5 A A 80.000 3 BP3_01.1 A A 80.000 3 BP5_B.2

A

A 80.000 3 BP3_02.4 A A 80.000 3 BP4_01.1 A A 80.000 3 BP3_04.5 A A 80.000 3 BP3_02.3 A A 80.000 3 BP3_B.7 A A 80.000 3 BP3_03.4 A A 80.000 3 BP5_03 A B A 78.667 3 BP3_02.2 B B C 74.333 3 BP3_04.2 C C 73.000 3 BP1_02.3 C C 72.000 3 BP3_02.1 C D C 70.333 3 BP 3_01.2 D C D C 70.333 3 BP2_03.3 D D 65.000 3 BP2_04.2 E 58.333 3 BP2_04.4 E E 55.333 3 BP3_01.3

Đồ án tốt nghiệp

14

Đồ án tốt nghiệp

Môi trƣờng trƣờng Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol

Thành phần môi trƣờng Số lƣợng Đơn vị

g Glucose 10

g Peptone 5

g 1 K2HPO4

g 0,5 MgSO4

ml Dichloran (0,2% W/v trong ethanol) 1

ml Rose Bengal 0,5

g Chloramphenicol 0,1

g Agar 15

ml Nước cất 1000

Môi trƣờng PDA (Potato Dextrose Agar)

Thành phần: Dịch chiết khoai tây: 250 g

Dextrose: 20 g

Agar: 20 g

Nước cất: 1000 ml

Môi trƣờng CMC (Carboxy methyl cellulose)

0,4 g Thành phần: NaNO3:

0,2 g K2HPO4:

0,1 g MgSO4:

KCl: 0,1 g

CMC: 1%

Agar: 2%

Nước cất: 1000 ml

Môi trƣờng WA (Water Agar)

Thành phần: Agar: 20 g và Nước cất: 1000 ml

15