Đồ án tốt nghiệp: Phân lập, chọn lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu CO2 và định hướng làm giảm hiệu ứng nhà kính

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN

QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG HẤP THỤ CO2 VÀ ĐỊNH HƯỚNG LÀM

GIẢM HIỆU ỨNG NHÀ KÍNH

Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH

HVCH NGÔ ĐỨC DUY

Sinh viên thực hiện : CHÂU TUẤN VĂN

MSSV: 1411100262 Lớp: 14DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng

dẫn thầy Ngô Đức Duy, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới. Những số liệu và kết

quả phân tích trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kì nguồn tài

liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt

nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài

báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án.

Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực

hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Viện Khoa học ứng dụng Hutech và

trước ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ngày … tháng … năm 2018

Sinh viên thực hiện

Châu Tuấn Văn

LỜI CÁM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ

Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn , em đã hoàn

thành tốt báo cáo này. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

TS. Hoàng Quốc Khánh, Trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học

Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện

cho em được làm đề tài.

Thầy Ngô Đức Duy, TS. Nguyễn Hoàng Dũng và chị Loan phòng Vi Sinh ứng

dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã

tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt

nghiệp.

Các bạn lớp 14DSH01 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian

học tập và thực hiện đề tài.

Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều kiện

cho con ăn học thành người có ích cho xã hội.

Đồ Án Tốt Nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................. i

DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................... ii

DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... iii

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1

2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................................... 2

3. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 3

4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 3

5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 3

6. Các kết quả đạt được của đề tài ............................................................................ 4

7. Kết cấu của đề tài ................................................................................................. 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 5

1.1 Tổng quan về khí CO2 (Carbon dioxide) ................................................................... 5

1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc khí CO2 ...................................................................... 5

1.1.2 Lợi ích của khí CO2 ........................................................................................... 5

1.1.3 Tác hại của khí CO2 ........................................................................................... 6

1.1.4 Tình hình phát thải khí CO2 trên thế giới và Việt Nam ..................................... 8

1.1.5 Các biện pháp giảm thiểu khí thải CO2 ........................................................... 10

1.2 Tổng quan về vi khuẩn quang hợp .......................................................................... 12

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp ......................................................... 12

1.2.2 Nguyên lý chung quá trình quang hợp và khả năng cố định CO2 .................... 14

1.2.3 Ảnh hưởng các nhân tố hóa lý đến sinh trưởng vi khuẩn quang hợp .............. 16

1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn quang hợp .................................................................. 16

1.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử………………………….18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 19

2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu ......................................................... 19

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................ 19

2.1.2 Thời gian nghiên cứu ....................................................................................... 19

2.1.3 Đối tưởng nghiên cứu....................................................................................... 19

Đồ Án Tốt Nghiệp

2.1.4 Nguồn mẫu ....................................................................................................... 19

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 20

2.2.1 Hóa chất ........................................................................................................... 20

2.2.2 Dụng cụ ............................................................................................................ 21

2.2.3 Thiết bị ............................................................................................................. 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 21

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu ....................................................................................... 21

2.3.2 Quy trình phân lập và định danh ...................................................................... 23

2.3.3 Phương pháp tăng sinh mẫu ............................................................................. 23

2.3.4 Phương pháp phân lập mẫu .............................................................................. 23

2.3.5 Phương pháp, kỹ thuật nhuộm Gram ............................................................... 23

2.3.6 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng vi khuẩn ở các nồng độ muối khác

nhau………………………………………………………………………………...24

2.3.7 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng và sử dụng nguồn CO2 của vi khuẩn

quang hợp………………………………………………………………………….24

2.3.8 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn………………………..…………….25

2.3.9 Khuyếch tán DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction

(PCR)……………………………………………………………………………....26

2.3.10 Gỉai trình tự DNA và định danh……………………………..………….….27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN………………………………………….28

3.1 Kết quả thu mẫu……………………………………………………………….….33

3.2 Kết quả tăng sinh mẫu.............................................................................................33

3.3 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái..................................................................36

3.4 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn ........................................................................ 38

3.5 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn ....................................................................... 41

3.6 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ CO2………………………………………..…46

3.7 Định danh ................................................................................................................ 49

3.7.1 Ly trích, thu nhận DNA ................................................................................... 49

3.7.2 Kết quả PCR ..................................................................................................... 49

3.8 kết quả định danh………………………………………………………………….50

3.8.1 Trình tự vung gene của 4 chủng RL1, CM23, CM24, CM34.3………….…..50

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.8.2 Thiết lập cây phát sinh loài……………………………………………….….52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 53

4.1 Kết luận.................................................................................................................... 53

4.2 Kiến nghị ................................................................................................................. 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 54

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................. 56

Đồ Án Tốt Nghiệp

Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BIM : Basic Isolation Media

LHQ : Liên Hợp Quốc

NCBI : National Center for Biotechnology Information

PCR : Polymerase Chain Reaction

rDNA : Ribosomal Deoxyribo Nucleic Acid

rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid

i

Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ về chu trình Calvin…………………………………………………..15

Hình 2.1 Mô phỏng vị trí lấy mẫu tại Đức Hòa (A) và Ngọc Hiển (B)………………19

Hình 2.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp……………………...22

Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm thổi khí vào môi trường lỏng………………………….25

Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA………………………………………..27

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập và làm

thuần trên môi trường BIM agar……………………………………………………...38

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn được quan sát dưới ống kính

hiển vi với vật kính 100X……………………………………………………………..40

Hình 3.3 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 5‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày....41

Hình 3.4 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 10‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày...42

Hình 3.5 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 15‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày..42

Hình 3.6 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 20‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày...43

Hình 3.7 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 25‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày..43

Hình 3.8 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 30‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày..44

Hình 3.9 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 35‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày..44

Hình 3.10 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 40‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày.45

Hình 3.11 Kết quả ly trích DNA của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8

trên gel agarose 1%.......................................................................................................49

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3,

RL1 trên gel agarose 1%...............................................................................................49

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng bộ kit của 5 chủng

CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1%..................................................50

Hình 3.14 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene…………….……52

ii

Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Khí thải CO2 toàn cầu, giai đoạn 2000 – 2017……………………….……9

Bảng 1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn tía lưu huỳnh và không lưu huỳnh ……….13

Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy………………………….21

Bảng 3.1 Danh sách các nguồn mẫu từ Long An và Cà Mau………………….….....29

Bảng 3.2 Danh sách mẫu tăng sinh từ các nguồn mẫu Long An và Cà Mau……..….33

Bảng 3.3 Hình ảnh một số ống mẫu tăng sinh có sự thay đổi màu rõ rệt………..…...34

Bảng 3.4 Danh sách các chủng đã được phân lập từ 38 ống mẫu tăng sinh…….…...36

Bảng 3.5 Kết quả đặc điểm hình thái vi khuẩn……………………………………....38

Bảng 3.6 Giá trị OD660nm của các chủng cao hơn 0,3 ở nồng độ 4% sau 7 ngày….…46

Bảng 3.7 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 1…..46

Bảng 3.8 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 3…..47

Bảng 3.9 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 5…..48

iii

Đồ Án Tốt Nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Sự nóng lên toàn cầu (Global Warming) đã và đang là một trong những vấn đề

nguy hại có tầm ảnh hưởng to lớn trên toàn thế giới. Nóng lên toàn cầu là hiện tượng

nhiệt độ trung bình của bề mặt Trái đất tăng lên, dẫn đến tình trạng biến đổi khí hậu.

Những nhân tố có thể làm cho sự biến đổi khí hậu xuất hiện là thay đổi bức xạ khí

quyển, bao gồm các quá trình như biến đổi bức xạ mặt trời, độ lệch quỹ đạo của Trái

Đất, quá trình kiến tạo núi, kiến tạo trôi dạt lục địa và sự thay đổi nồng độ khí nhà

kính. Khí thải CO2 có lẽ là một trong những nhân tố chính dẫn đến hiện tượng trên là

do sự phát thải đáng kể của khí thải này từ các hoạt động đốt cháy nhiên liệu hóa thạch

cùng các loại khí thải khác, khiến lượng nhiệt bị giữ lại trong bầu khí quyển, do đó dẫn

đến nhiệt độ Trái đất tăng lên.

Biến đổi khí hậu không còn là một thuật ngữ, giả thuyết mơ hồ được nghiên cứu

bởi những nhà khí tượng học đưa ra, hiện tượng này dần trở thành một mối đe dọa

hàng đầu đối với nhân loại và sự sống trên trái đất. Việt Nam được đánh giá là một

trong những quốc gia bị ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu do có bờ biển dài. Cụ

thể là, thời tiết ở Việt Nam những năm gần đây ngày càng bất thường có thể kể đến

như hạn hán, ngập lụt, sạt lở, giông tố, bão lũ có diễn biến phức tạp, ảnh hưởng

nghiêm trọng đến nền kinh tế phụ thuộc nhiều vào sản xuất nông nghiệp của nước ta.

Trước sự thách thức trên, Công ước Khung của Liên Hợp Quốc về biến đổi khí

hậu (United Nations Framework Convention on Climate Change) được thành lập cùng

với sự tham gia của 155 quốc gia trong đó có Việt Nam nhằm chung tay góp sức cải

thiện môi trường bằng cách hạn chế sự phát thải tối đa và duy trì sự ổn định khí nhà

kính trong khí quyển ở mức có thể ngăn ngừa sự can thiệp nguy hiểm của con người

đối với hệ thống khí hậu. Những biện pháp để giảm thiểu khí thải CO2 hiệu quả thông

qua những hành động hằng ngày như là: chuyển dần sang đi bộ, đạp xe đạp,chạy xe

điện, hạn chế sự dụng xe máy, ô tô; hạn chế sự dụng nguồn năng lượng từ củi ,than đốt

hay gas, thay thế bằng năng lượng mặt trời; tích cực trồng cây,…Ngoài ra, rất nhiều

giải pháp công nghệ, hóa học, sinh học được đề xuất trong và ngoài nước để có thể

cứu vác kịp thời sự hiểm họa này. Trong đó con đường sinh học hiện đại được xem là

1

Đồ Án Tốt Nghiệp

có triển vọng, những công nghệ, chế phẩm bắt nguồn từ vi sinh vật được sử dụng trong

xử lý môi trường có hiệu quả suốt thập kỷ qua. Cho nên con đường tìm kiếm vi sinh

vật cụ thể là các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng cố định CO2 là một bước đi

mới nhằm giải quyết vấn đề cấp bách trên.

Các chủng vi khuẩn quang hợp, đặc biệt là quang dị dưỡng có khả năng sử dụng

CO2 là nguồn carbon để duy trì sự sống thông qua nhiều con đường cố định carbon

khác nhau. Trong đó có thể kể đến chu trình Calvin là chu trình quan trong nhất trong

quá trình cố định CO2 . Việt Nam là một đất nước được đánh giá cao về tính đa dạng

sinh học, có triển vọng tốt cho việc nghiên cứu và phân lập các chủng vi khuẩn có khả

năng trên, đóng vai trò quan trọng trong việc giải quyết khí thải nói riêng và sự nóng

lên toàn cầu nó chung, là bước đệm để triển khai cho những đề tài nghiên cứu mới về

sau.

Chính vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Phân lập, chọn lọc

và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu Carbon dioxide

và định hướng làm giảm hiệu ứng nhà kính”

2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

• Nghiên cứu trong nước

− Nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng vi khuẩn Rhodobacter để sử lý chất hữu cơ và

Sulfide trong nước nuôi trồng thủy hải sản của Thạc sĩ Mỵ Trần Hương Trà được

công bố vào năm 2015. Khả năng xử lý chất hữu cơ trong môi trường nước thải

nuôi trồng thủy hải sản giả định của chủng vi sinh vật này khá cao, với hiệu suất

xử lý từ 58 – 87%. Hiệu suất xử lý Sulfide trong môi trường nước thải nuôi trồng

thủy sản giả định của chủng vi sinh vật này sau 7 là từ 86.7-100%, gần như loại bỏ

hoàn toàn Sulfide [1].

− Phân lập, đánh giá các đặc điểm sinh học và định danh phân tử các chủng vi khuẩn

quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu của Nguyễn Thị

Hương Giang được công bố vào năm 2012. Đề tài nghiên cứu đặc điểm và khả

năng tăng trưởng từ những môi trường nước khác nhau, từ đó tiến hành thu nhận

sinh khối, ứng dụng và sản xuất chế phẩm vi sinh hữu hiệu trong xử lý nước thải

môi trường [2].

2

Đồ Án Tốt Nghiệp

• Nghiên cứu ngoài nước

− Phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp sản xuất coenzyme Q10 của Fang

LC, Huang XF, Du ZH, Yuan J, Wei H, Cheng HH, Liu Y được công bố vào năm

2005. Trong đề tài này, 13 chủng vi khuẩn quang hợp tía được phân lập và xác

định hàm lượng sản sinh coenzyme Q10 cao nhất, định hướng và ứng dụng trong y

học và sức khỏe [3].

− Phân lập, định danh và tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng vi khuẩn quang hợp từ hải

sản nhằm muc đích xử lý nước thải của Prasertsan P, Choorit W, Suwanno S.

Đuọc công bố vào năm 1993. Đề tài chủ yếu nghiên cứu điều kiện tăng trưởng tối

ưu của vi khuẩn quang hợp tía, khả năng sản sinh sinh khối trong các yếu tố khác

nhau, định hướng xử lý nước thải môi trường, [4]

3. Mục tiêu đề tài

Xây dựng bộ sưu tập vi khuẩn quang hợp và định danh tới mức các loài vi khuẩn

quang hợp có khả năng hấp thụ CO2.

4. Nội dung nghiên cứu

− Phân lập vi khuẩn quang hợp, gram âm, hiếu hoặc kị khí, hóa tự dưỡng hoặc dị

dưỡng từ nguồn nước trồng lúa thuộc các tỉnh Long An, Cà Mau.

− Kiểm tra hình thái , các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được

− Chọn lọc các dòng vi khuẩn có khả năng cố đinh CO2 bằng cách khảo sát sự tăng

trưởng của chúng trong điều kiện dinh dưỡng có sục khí CO2.

− Định danh đến loài các chủng bằng phương pháp giải trình tự DNA mã hóa cho

ribosome 16S.

− Bảo quản giống bằng phương pháp lạnh sâu có bổ sung 15% glycerol

− Ly trích DNA và khuyếch đại đoạn gene các chủng mong muốn bằng phương pháp

PCR. Định danh tới loài bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S, phân tích trình

tự và xây dựng cây phát sinh loài.

5. Phương pháp nghiên cứu

− Phương pháp phân lập, làm thuần và tăng sinh vi khuẩn quang hợp.

− Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng kỹ thuật nhuộm Gram.

3

Đồ Án Tốt Nghiệp

− Phương pháp khảo sát khả năng chịu mặn của vi khuẩn bằng phương pháp đo

OD660.

− Phương pháp khảo sát khả năng hấp thu CO2.

− Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA.

− Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi 27F và 1492R.

− Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5

5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0).

6. Các kết quả đạt được của đề tài

− Kết quả phân lập và làm thuần đuọc các chủng vi khuẩn quang hợp chịu mặn cao

và có khả năng hấp thu CO2.

− Kết quả thu nhận được bộ gene DNA.

− Kết quả khuyếch đại đoạn gene bằng phương pháp PCR.

6. Kết cấu của đề tài

Đề tài bao gồm 4 chương

Chương 1: tổng quan tài liệu

Chương 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: kết quả và biện luận

Chương 4: kết luận và kiến nghị

4

Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về khí CO2 (Carbon dioxide)

1.1.1 Khái niệm và nguồn gốc khí CO2

Carbon dioxide, có công thức hóa học là CO2, hay còn đuọc biết đến tên gọi khác

là Carbonic anhydride, carbonic acid. Carbon dioxide là một loại khí không màu nặng

hơn hơn không khí. Carbon dioxide không cháy. Ở nồng độ thấp, khí carbon dioxide

không có mùi. Ở nồng độ cao, nó có độ sắc nét, có tính axit mùi. Ở nhiệt độ bình

thường, carbon dioxide không phản ứng với nhiều vật liệu khác . Carbon dioxide hòa

tan trong nước để tạo thành cacbonic axit. Nó có thể dễ dàng và an toàn hóa lỏng, kiên

cố hóa, xử lý và lưu trữ.[5]

Carbon dioxide thu được từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm cả khí thoát ra từ

các núi lửa, sản phẩm cháy của các hợp chất hữu cơ và hoạt động hô hấp của các sinh

vật sống hiếu khí. Nó cũng được một số vi sinh vật sản xuất từ sự lên men và sự hô

hấp của tế bào.

Khí carbon dioxide thải vào khí quyển do việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch

"chiếm 99,4% lượng khí thải CO2 trong năm 2013" [6]. Carbon dioxide là khí nhà

kính lâu đời quan trọng nhất trong khí quyển Trái đất. Kể từ khi cuộc cách mạng công

nghiệp phát thải nhân loại - chủ yếu từ việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch và phá rừng -

đã nhanh chóng tăng nồng độ của nó trong khí quyển, dẫn đến sự nóng lên toàn cầu.

Carbon dioxide cũng gây ra acid hóa đại dương bởi vì nó hòa tan trong nước để tạo

thành carbonic acid. [7]

1.1.2 Lợi ích của khí CO2

Ngày nay, tác hại khí thải CO2 là một trong những đề tài xôn xao và nhức nhối

trong xã hội hiện nay. Nhưng chúng ta không thể phủ nhận rằng, ngay từ đầu khí thải

nhà kính này là một nhân tố vô cùng quan trọng và ý nghĩa cho sự sống muôn loài trên

trái đất. Đã có một khoảng thời gian dài hành tinh xanh này bị nhấn chìm và phủ đầy

bởi các dải băng lục địa, có nghĩa rằng sự biến đổi khí hậu xảy ra khi nhiệt độ giảm

xuống lâu dài, đó chính là thời kỳ Kỷ băng hà. Nhưng nhờ có hoạt động núi lửa giải

phóng CO2 và chính nhờ nó đã làm bầu khí quyển ấm hơn và hình thành sự sống đa

dạng, phức tạp như bây giờ.

5

Đồ Án Tốt Nghiệp

Trong cái nhìn thực tế hơn, khí CO2 giúp ích cho cây cối phát triển và hữu dụng

trong nền Công nghiệp, thực phẩm,y học và các hoạt động đời sống thường ngày. Cụ

thể là, Trong công nghệ thực phẩm, CO2 được sử dụng để tạo gas cho nhiều thức uống,

lưu trữu và vận chuyển thực phẩm đông lạnh,…Trong công nghiệp, khí CO2 được

dùng để vận hành các hệ thống khí nén trong nhà máy, làm giảm độ ẩm trong hệ thống

giúp kéo dài tuổi thọ, và ít tốn chi phí bảo trì. Không những thế, CO2 còn là khí bơm

và lựa chọn trong phẫu thuật nội sôi vì chúng không màu, không dễ cháy.

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, mặc dù CO2 là khí thải độc hại, nhưng xét về kinh

tế, hóa chất này vẫn có thể biến thành nguyên liệu thân thiện với môi trường trong

ngành công nghiệp hóa chất. Chúng ta hiện đang sản xuất nhiều loại hóa chất cần thiết

từ CO2 như thuốc bảo vệ thực vật, nhựa, thuốc trừ sâu, phân bón, salicylic acid, nhiên

liệu và các nguyên liệu khác.

1.1.3 Tác hại của khí CO2

Khi trái đất ấm lên nhờ có khí thải CO2 từ thiên nhiên để cân bằng sự sống, thấy

được lợi ích từ khí thải này, con người đã lạm dụng chúng quá mức thông qua những

hoạt động trực tiếp và gián tiếp, sự biến đổi khí hậu một lần nữa đã và đang thay đổi

khiến cho trái đất nóng dần lên, thuật ngữ “Sự Nóng lên toàn cầu” bắt đầu được đề cập

tới để miêu tả vấn đề trên.

Lượng khí CO2 tồn tại trong bầu khí quyển vẫn đang ngày một tăng lên

mức báo động. Những tác hại có thể được kể đến như: ô nhiễm môi trường ảnh hưởng

đến chất lượng cuộc sống và sức khỏe con người và sinh vật khác; khởi tạo ra các

thiên tai như hạn hán, ngập lụt, sạt lở, giông tố, bão lũ; làm băng tan chảy nước biển

dâng cao; phá hủy hệ sinh thái; gây ra hiệu ứng nhà kính, biến đổi khí hậu,..

Trái đất đang ngày càng nóng lên và con người nhận ra những tác hại rõ ràng từ sự

nóng lên toàn cầu này: nền nông nghiệp rối loạn, cơ sở hạ tầng xuống cấp cùng với

nguồn năng lượng dần cạn kiệt…5 tác hại kinh hoàng của sự nóng lên toàn cầu có thể

được đề cập đến là:

1. Thiếu lương thực, thực phẩm

Chỉ theo tính toán riêng ở Mỹ, năng suất cây trồng của ngô, lúa mì hay bông ở

vùng thung lũng trung tâm California sẽ giảm đến 30% trong vài thập kỉ tới.

6

Đồ Án Tốt Nghiệp

Nguyên nhân được cho là do sự tăng lượng carbon trong không khí, sự sụt giảm về

số lượng loài ong dẫn đến quá trình thụ phấn bất thành…

Ngoài ra, biến đổi khí hậu cũng sẽ ảnh hưởng đến giá thành chế biến, lưu trữ và

vận chuyển lương thực, đẩy giá lương thực tăng cao do tăng nhu cầu về nguồn nước và

năng lượng. Điều này gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế cũng như người tiêu

dùng.[8]

2. Khủng hoảng năng lượng

Nhu cầu năng lượng ngày càng tăng tạo nên một vòng luẩn quẩn của biến đổi khí

hậu. Từ năm 1970, nhu cầu sưởi ấm của toàn cầu đã giảm trong khi nhu cầu làm mát

tăng vọt.

Nhiệt độ sẽ ngày càng tăng lên trong các thập kỉ tới, sự gia tăng nhanh chóng của

dân số toàn cầu cũng kéo theo nhu cầu sử dụng năng lượng ngày một tăng. Điều này

góp phần thúc đẩy sự phát triển trong việc xây dựng các nhà máy – nguyên nhân gây

ra biến đổi khí hậu.

Trong khi đó, lượng mưa được dự báo sẽ giảm đến 40% ở một số nơi, làm giảm

lượng nước – một thành phần quan trọng trong sản xuất thủy điện. Do đó, khủng

hoảng năng lượng sẽ là một cơn ác mộng thực sự.[8]

3. Phá hỏng cơ sở hạ tầng

Cơ sở hạ tầng giao thông vận tải đã “lão hóa” sẽ không thể chống chọi tốt trước

khí hậu khắc nghiệt. Càng ngày, thiên nhiên càng trở nên hung dữ và đáng sợ hơn với

những cơn bão hàng năm được nhận xét là vô cùng mạnh.

Theo thống kê, siêu bão Sandy tàn phá nước Mỹ năm ngoái đã cướp đi hơn 90

mạng người và gây thiệt hại gần 50 tỷ USD (hơn 1 triệu tỷ VNĐ) đối với nền kinh tế

hàng đầu thế giới này.

Chính sự xuống cấp, “lão hóa” của cơ sở vật chất theo năm tháng cũng như trải

qua các thiên tai sẽ là một bất lợi lớn khi cần vận chuyển các mặt hàng thiết yếu như

thực phẩm, nhiên liệu, nước đến nơi cần trợ giúp.[8]

4. Gây hạn hán

Nhiệt độ Trái đất tăng kéo theo sự gia tăng của nạn hạn hán ở khắp nơi. Lưu lượng

nước chỉ là hữu hạn nhưng nhu cầu sử dụng vẫn tăng nhanh, đặc biệt ở một số nước

đang phát triển.

7

Đồ Án Tốt Nghiệp

Nạn hạn hán hoành hành ở nhiều nơi và ngày càng tồi tệ hơn. Nguy cơ hạn hán

kéo dài rất dễ xảy ra, điều này gây nguy hiểm đến sự phát triển của nền nông nghiệp

cũng như các ngành công nghiệp phụ thuộc vào nước.[8]

5. Không khí ngày càng bị ô nhiễm nặng

Sự ấm lên của Trái đất cũng kéo theo tình trạng ô nhiễm không khí. Tình trạng ô

nhiễm khói bụi dài hạn cũng ảnh hưởng tới quá trình hình thành mây và lượng mưa,

khiến các điều kiện thời tiết khắc nghiệt trầm trọng thêm.

Sự gia tăng lượng ozon trong khí quyển dẫn đến việc nhiều người mắc bệnh về

phổi và theo tính toán, số lượng bệnh nhân hen suyễn dự kiến sẽ tăng đến 10% tại các

đô thị lớn.

Các nhà khoa học cho rằng, lượng khí carbon ngày một dày đặc sẽ gây ảnh hưởng

lớn đến các bệnh nhân bị dị ứng.[8]

1.1.4 Tình hình phát thải khí CO2 trên thế giới và Việt Nam

Khí thải CO2 liên quan đến năng lượng toàn cầu đã tăng 1,4% trong năm 2017,

tăng 460 triệu tấn (Mt), và đạt mức cao lịch sử 32,5 Gt. Sự tăng trưởng của năm ngoái

là sau ba năm phát thải bằng phẳng và tương phản với mức giảm mạnh cần thiết để

đáp ứng các mục tiêu của Hiệp định Paris về biến đổi khí hậu. Sự gia tăng lượng khí

thải carbon, tương đương với lượng phát thải 170 triệu xe, là kết quả của tăng trưởng

kinh tế toàn cầu mạnh mẽ 3,7%, giá nhiên liệu hóa thạch thấp hơn và nỗ lực tiết kiệm

năng lượng yếu hơn. Ba yếu tố này đã góp phần thúc đẩy nhu cầu năng lượng toàn cầu

tăng 2,1% vào năm 2017. Tuy nhiên, xu hướng phát triển khí thải ngày càng không

phổ biến. Trong khi hầu hết các nền kinh tế lớn nhìn thấy sự gia tăng phát thải carbon,

một số nền kinh tế khác lại suy giảm, chẳng hạn như Hoa Kỳ, Anh, Mexico và Nhật

Bản. Sự suy giảm lớn nhất đến từ Hoa Kỳ, nơi mà lượng khí thải giảm 0,5%, hoặc 25

Mt, xuống còn 4810 Mt CO2, đánh dấu năm thứ ba liên tiếp suy giảm. Trong khi

chuyển đổi từ than sang khí đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm phát thải

trong những năm trước, năm ngoái, sự suy giảm là kết quả của việc sản xuất điện dựa

trên năng lượng tái tạo cao hơn và sự suy giảm nhu cầu điện. Tỷ trọng tái tạo trong sản

xuất điện đạt mức kỷ lục 17%, trong khi tỷ trọng điện hạt nhân giữ ổn định ở mức

20%.[9]

8

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bảng 1.1 Khí thải CO2 toàn cầu, giai đoạn 2000 - 2017

(Nguồn trích từ International Energy Agency, 2017)

Trên lộ trình phấn đầu thành một nước công nghiệp, những năm qua, Việt Nam đã

đạt được những bước tiến đáng kể trong công tác giảm nghèo và nâng cao phúc lợi xã

hội. Tuy nhiên, chính sự phát triển này cũng là một trong những nguyên nhân làm tăng

nhanh lượng phát thải khí CO2.

Mặc dù chưa có nghĩa vụ phải cắt giảm phát thải khí nhà kính nhưng lượng khí

nhà kính của Việt Nam rất đáng báo động, đặc biệt mức phát thải đang liên tục tăng, từ

mức trên 21 triệu tấn CO2 trong năm 1990 lên 150 triệu tấn năm 2000. Dự tính lượng

CO2 này sẽ tăng lên 300 triệu tấn vào năm 2020. Trong đó lĩnh vực năng lượng phát

thải khí nhà kính nhiều nhất với 141.171 triệu tấn chiếm 53,1% tổng phát thải, tiếp

theo là lĩnh vực nông nghiệp với 88.355 triệu tấn chiếm 33,2% tổng phát thải. [10]

Sự tăng nhanh về phát thải khí nhà kính đã góp phần không nhỏ đến việc làm trầm

trọng hơn thời tiết cực đoan của Việt Nam. Thống kê cho thấy, trong vòng 10 năm trở

lại đây, các loại thiên tai như: Bão, lũ, lụt, lũ quét, sạt lở đất, úng, hạn hán, xâm nhập

mặn và các thiên tai khác đã làm chết và mất tích hơn 9.000 người, giá trị thiệt hại về

tài sản ước chiếm khoảng 1,5% GDP/năm. Ðiều đáng lo ngại, những biến động bất

thường của thời tiết, khí hậu đã đe dọa nghiêm trọng đến an ninh lương thực và phát

triển nông nghiệp do bị thu hẹp diện tích đất nông nghiệp, cũng như tác động lớn đến

sinh trưởng, năng suất cây trồng, thời vụ gieo trồng.[10]

9

Đồ Án Tốt Nghiệp

1.1.5 Các biện pháp giảm thiểu khí thải CO2

Song song với thực trạng hiện nay, các phương pháp giảm thiểu khí thải CO2 là

một trong những vấn đề nhức nhói. Những biện pháp đề xuất phải phù hợp với ngân

sách và đồng thời hiệu quả cao.

Một số các biện pháp hóa học, vật lý để giảm thiểu khi nhà kính có thể kể đến như:

− Phương pháp xử lý khí CO2 Hấp thụ bằng dung dịch etanolamin

− Phương pháp xử lý khí CO2 Hấp thụ bằng dung dịch amoniac

− Các phương pháp xử lý khí CO2 Hấp thụ bằng nước

− Hấp thụ CO2 bằng huyền phù CaCO3

− Hấp phụ vật lý của các phương pháp xử lý khí CO2

− Hấp phụ vật lý của các phương pháp xử lý khí CO2

Một số biện pháp thông thường mà hằng ngày chúng ta có thể lam được như:

Tái sử dụng và tái chế

Góp phần giảm thiểu chất thải bằng cách chọn các sản phẩm tái sử dụng thay vì

dùng một lần. Mua sản phẩm với bao bì tối thiểu sẽ giúp giảm chất thải. Bạn có thể tái

chế giấy, nhựa, báo, thủy tinh và lon nhôm… bất cứ lúc nào. Bằng cách tái chế một

nửa số rác thải sinh hoạt của bạn, bạn có thể giảm khoảng 1,2 tấn khí CO2 mỗi

Hạn chế sử dụng lò sưởi và điều hòa nhiệt độ

năm.[10]

Hãy làm cho ngôi nhà, căn phòng của bạn được kín kẽ bằng cách sử dụng các loại

cửa cách âm, cách nhiệ có thể làm giảm chi phí sưởi ấm, làm mát của bạn hơn 25%.

Bạn chỉ cần cài đặt nhiệt lớn cao 2 độ vào mua đông và thấp hơn 2 độ vào mùa hè có

thể tiết kiệm khoảng 2 tấn CO2 mỗi năm.[10]

Lái xe thông minh và hạn chế sử dụng xe cá nhân

Ít xe cá nhân có nghĩa là lượng khí thải ít hơn. Đi bộ và đi xe đạp để tiêt kiệm

năng lượng và là hình thức tuyệt vời để tập thể dục, khám phá hệ thống giao thông

cộng đồng của bạn. hoặc bạn có thể đi chung xe làm hoặc đi học.

Khi bạn lái xe, để đảm bảo xe của bạn chạy một cách hiệu quả. Hãy giữ lốp xe

luôn căng, như vậy có thể cải thiện hơn 3% lượng xăng của bạn, không chỉ giúp bạn

tiết kiệm ngân sách mà còn giúp giảm 20 kg CO2 trong khí quyển. [10]

10

Đồ Án Tốt Nghiệp

Mua những sản phầm tiết kiệm năng lượng hiệu quả

Hãy mua một chiếc xe tiết kiệm nhiên liệu tốt. Thiết bị gia dụng hiện nay có một

loạt các sản phẩm tiết kiệm năng lượng, và bóng đèn huỳnh quang nhỏ gọn được thiết

kế để cung cấp ánh sáng trông tự nhiên hơn trong khi sử dụng ít năng lượng hơn so với

bóng đèn sợi đốt.

Tránh các sản phẩm đi kèm như bao bì dư thừa , đặc biệt là các bao bì mà không

thể tái chế được. Nếu bạn giảm rác thải hộ gia đình của bạn bằng 10 phần trăm, bạn có

thể tiết kiệm 500 tấn CO2 mỗi năm. [10]

Sử dụng ít nước nóng.

Đặt bình đun nước nóng ở nhiệt độ vùa phải, và bọc nó trong một tấm chăn cách

nhiệt nếu nếu đã sử dụng được 5 năm. Mua vòi hoa sen chảy chậm để tiết kiệm nước

nóng và giảm khoảng 350 kg CO2 mỗi năm. Giặt quần áo và rửa mọi thứ bằng nước

lạnh, sự thay đổi đó của một mình bạn có thể tiết kiệm ít nhất 500 kg CO2 mỗi

năm. [10]

Tiết kiện điện.

Tiết kiệm điện và giảm sự nóng lên toàn cầu bằng cách tắt đèn khi ra khỏi phòng.

Và hãy nhớ tắt ti vi và máy tính của bạn khi bạn không sử dụng chúng . Tắt nước khi

bạn không sử dụng nó. Trong khi đánh răng hay rửa xe, tắt nước cho đến khi bạn thực

sự cần nó để rửa. Bạn sẽ làm giảm hóa đơn tiền nước của bạn và giúp bảo tồn một

nguồn tài nguyên quan trọng.[10]

Trồng một cây

Nếu bạn có điều kiện thì hãy bắt đầu, trong quá trình quang hợp, cây cối và các

loài thực vật khác hấp thụ CO2 và tạo ra 02. Họ là một phần không thể thiếu của chu

kỳ trao đổi không khí tự nhiên trên trái đất, nhưng có quá ít để đối phó sự gia tăng

lượng khí carbon dioxide gây ra bởi phương tiện giao thông, sản xuất và các hoạt động

khác của con người. Một cây sẽ hấp thụ khoảng một tấn carbon dioxide trong suốt

cuộc đời của nó. [10]

11

Đồ Án Tốt Nghiệp

1.2 Tổng quan về vi khuẩn quang hợp

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp (VKQH)

Nhóm vi khuẩn quang hợp nhờ có sắc tố diệp lục. Chất diệp lục vi khuẩn khác với

chất diệp lục của thực vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi. Chúng sử dụng

nguồn hidro là sunfit thiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản

phẩm phụ dạng oxi hóa. Bao gồm: vi khuẩn lưu huỳnh lục,vi khuẩn không lưu huỳnh

lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh.[1]

• Vi khuẩn lưu huỳnh lục

Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kị khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô

cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a cùng với b, c hoặc e, chứa

carotene nhóm 5, hệ thống quang hợp liên quan đến các lục thể (chlorosom) và độc lập

với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp

thường sử dụng H2, H2S hay S. Hạt lưu huỳnh tíchc lũy bên ngoài tế bào, không có khả

năng di động, một số loài có túi khí; tỷ lệ G+C là 48-58%.Gồm có các chi:

Chlorodium, Prosthecochloris, Pelodictyon, Ancalichliris, Chloroherpeton.[12]

• Vi khuẩn không lưu huỳnh lục

Thuộc nhóm này là vi khuẩn đa bào, dạng sợi, thường kỵ khí không bắt buộc,

thường là quang dị dưỡng (photoheterotrop), có loài quang tự dưỡng hoặc hóa dị

dưỡng. Tế bào có chứa chlorophyll a và c, trong điều kiện kỵ khí thấy có chlorosom.

Dùng để làm nguồn điện tử (electron donors) trong quang dị dưỡng là glucose, amino

acid, acid hữu cơ, trong quang tự dưỡng là H2, H2S. Di động bằng phương thức trường

(gliding), tỷ lệ G + C là 53-55%. Chi điển hình là Chloroflexux, Chloronema.[12]

• Vi khuẩn quang hợp tía

Vi khuẩn quang hợp tía là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạng cầu xoắn,

hình que ngắn, hình phẩy… đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Các loài vi khuẩn quang

hợp tía đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài sinh sản bằng cách nảy chồi.

Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá

trình quang hợp kỵ khí. VKQH tía thường có màu hồng đến màu đỏ tía, sắc tố quang

hợp chính là bacteriocholorophyll a hoặc b. Cơ quan quang hợp là màng quang hợp

được gắn với tế bào. [1]

12

Đồ Án Tốt Nghiệp

Vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh

Thuộc nhóm này là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng quang tự dưỡng vô

cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b , hệ thống quang hợp

chứa các màng hình cầu hay hình phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng

làm nguồn cho điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng H2, H2S hay

S . Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ lệ G+C là 45-

70%.[13]

Vi khuẩn quan hợp tía không lưu huỳnh.

Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị dưỡng hữu cơ

(photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng vô

cơ không bắt buộc (trong tối là hoá dị dưỡng hữu cơ- chemoorganoheterotrophs). Tế

bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình

phiến (lamellar) gắn với màng sinh chất. Để dùng làm nguồn cho điện tử (electron

donors) trong quang hợp thường sử dụng chất hữu cơ, đôi khi sử dụng hợp chất lưu

huỳnh dạng khử hoặc H2. Có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, hoặc không di

động, một số loài có túi khí (gas vesicles), tỷ lệ G+C là 61-72%.[13]

Bảng 1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn tía lưu huỳnh và không lưu huỳnh

Ví dụ Đặc điểm

Vi khuẩn tía lưu huỳnh (grammaproteobacteria) Nhóm/loài

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (alpha- hoặc

betaproteobacteria)

Một số loài chính Vi khuẩn tía lưu huỳnh: Allochromatium

vinosum, Thiocapsa roseopersicina.

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh: Rhodobacter

capsulatus, Rhodobacter sphaeroides,

Rhodospirillum rubrum, Rhodopseudomonas

palustris

Sắc tố/ màu sắc của huyền phù tế bào BChl a hoặc b, carotenoid chính,

spirilloxanthin, speherodene, lycopene,

13

Đồ Án Tốt Nghiệp

rhodopsin và dẫn xuất của chúng

Màu sắc huyền phù tế bào: tía, đỏ tía, đỏ, tía-

tím, cam, nâu, vàng-nâu (với những loài chứa

BChl a), xanh hoặc vàng (với những loài chứa

BChl b)

Vị trí sắc tố trong tế bào Nằm trong lớp màng sinh chất, được sắp xếp

thành dạng ống, dạng màng, dạng túi hoặc dạng

phiến lamellae.

Phổ hấp thụ cực đại của tế bào sống Những loài chứa BChl a gần 800nm và những

vùng có bước sống từ 815-960nm

Với những loài chứa BChl b: 835-850 nm và

1010-1040 nm

2-, H2, Fe2+

Chất cho electron/ giọt lưu huỳnh

Sulfide, S0, 𝑆2𝑂3 Nếu S0 được hình thành từ quá trình oxi hóa

sulfide thì S0 được tích lũy trong tế bào, và điều

này chỉ xảy ra ở vi khuẩn tía có lưu huỳnh

Quang tự dưỡng/ hô hấp tối Vi khuẩn tía lưu huỳnh bị hạn chế về số lượng

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh đa dạng về số

lượng

(Nguồn trích từ Mỵ Trần Hương Trà, 2015)

1.2.2 Nguyên lý chung quá trình quang hợp và khả năng cố định CO2 ở vi khuẩn

Tất cả vi khuẩn quang hợp đều chứa sắc tố quang hợp. Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn

được gọi là bacteriochlorophyll, chlorophyll và bacteriochlorophyll còn được gọi là

chất dệp lục và chất khuẩn lục. Chất diệp lục, khuẩn lục và huyết sắc có cấu trúc tương

tự nhau, đó là một vòng pocphiril do 4 nhân pirol liên kết với nhau. Lõi của chất diệp

lục và chất khuẩn lục là Mg, còn lõi của của huyết sắc tố là Fe, chất diệp lục a khác với

chất khuẩn lục a, b, c, d, e ở gốc 7 gốc R (từ R1 đến R7).[14]

Chúng thuộc loại tự dưỡng quang năng, có thể sử dụng CO2 làm nguồn carbon tổng

hợp nên chất hữu cơ của cơ thể, dưới tác động của năng lượng ánh sáng mặt trời.

Phương trình có thể biểu diễn như sau:

14

Đồ Án Tốt Nghiệp

2CO2 + H2S + 2H2O…(CH2O) + H2SO4

Trong quá trình oxy hóa H2S, lưu huỳnh được tích lũy. Sau đó S được chuyển hóa

thành SO4 và dần dần ra ngoài. Vi khuẩn cũng có thể dung đồng thời H2S nhu chất cho

H trong cả quá trình quang hợp.[14]

Khi quang hợp, chu trình calvin, hệ thống cố định notơ, hệ thống DMSO/DMSOR

được tế bào sử dụng để duy trì thế oxy hóa khử. Các phản ứng của chu trình calvin cho

phép CO2 có chức năng thu nhận các lực khử dư thừa do trao đổi chất các chất hữu cơ

nhu malate, succinate. Do đó, vai trò của chu trình calvin trong suốt quá trình sinh

trưởng quang dị dưỡng là giữ thế cân bằng oxy hóa khử trong tế bào. Khi tế bào sinh

trưởng trong điều kiện quang tự dưỡng thì vai trò chủ yếu của chu trình calvin là cố

định CO2 để tổng hợp vật liệu tế bào. Chính nhời tính lưỡng cực này mà chu trình

calvin có vai trò điều khiển giữa hai quá trình quang tự dưỡng và quang dị dưỡng. [1]

(Nguồn trích từ Mike Jones, 2010)

Hình 1.1 Sơ đồ về chu trình Calvin

15

Đồ Án Tốt Nghiệp

1.2.3 Ảnh hưởng các nhân tố hóa lý đến sinh trưởng vi khuẩn quang hợp tía

1. Độ pH

Quang hợp của vi khuẩn quang hợp tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3-11.

Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6-7.[15]

2. Cường độ ánh sáng

Vi khuẩn quan hợp tía sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh ở môi

trường có ánh sáng đỏ, ngoài ra chúng có thể phát triển quang dưỡng và trong bóng

tối.[15]

3. Nhiệt độ

Quang hợp của vi khuẩn có thể xảy ra ở nhiệt độ lên tới 570C và xuống tới 00C.

Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ở 300C. [16]

4. Các yếu tố khác

Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như là chất cho

điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM. Nếu trong môi trường sống có nồng độ sulfide quá

cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng .Ngoài ra nồng độ NaCl trong môi trường cũng

ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn tía. Có loài sống được trong môi trường

nước biển có độ mặn từ 8-11%NaCl. [17]

1.2.4 Ứng dụng của vi khuẩn quang hợp

Vi khuẩn quang hợp dần trở nên phổ biến hơn khi những mặt lợi ích của chúng được

thể hiện rõ qua thời gian. Chúng được sử dụng trong xử lý nhiều loại nước thải có

nguồn gốc nông nghiệp, chăn nuôi, chế biến nông sản, nuôi trồng thủy hải sản, thậm

chí cả công nghiệp khai thác dầu khí. Sinh khối của nhóm vi khuẩn này còn rất giàu

dinh dưỡng nên có thể sử dụng như một nguồn thức ăn tươi sống trong nuôi giống

thủy hải sản.

Làm thuốc làm sạch chất nước của nước nuôi trồng

Trong quá trình nuôi hải sản, định kỳ cho một lượng vi khuẩn quang hợp thích hợp

vào nước nuôi, có thể làm mất ion N trong nước và các vật sinh ra do phân giải vật

hữu cơ khác từ đó đạt tới việc không thay nước mà vẫn có thể giữ được môi trường

nước tốt. Ðiều đó chủ yếu là do vi khuẩn quang hợp ở trong nước có thể lợi dụng vật

hữu cơ làm vật cung ứng H để tiến hành tác dụng quang hợp, đồng thời với việc loại

16

Đồ Án Tốt Nghiệp

bỏ vật ô nhiễm, bản thân vi khuẩn quang hợp cũng sinh sôi tăng trưởng, đạt tới tác

dụng tuần hoàn ưu việt.[18]

Dự phòng và điều trị bệnh

Do sự sinh sôi nhanh chóng của vi khuẩn quang hợp, mà hạn chế sự sinh sôi của

khuẩn khác gây bệnh. Theo thông báo, vi khuẩn quang hợp có tác dụng rõ rệt đối với

bệnh đỏ vỏ tôm, bệnh đen mang, bệnh khuẩn dạng sợi. Và khuẩn quang hợp trong quá

trình chuyển hoá có thể sinh ra loại men chống độc tố bệnh (men phân giải trypsin, có

tác dụng dự phòng và chữa trị bệnh tôm cá). Theo thông báo, vi khuẩn quang hợp có

thể điều trị bệnh loét mang của cá chép do vi khuẩn dính gây nên. Theo thông báo

khác, dùng vi khuẩn quang hợp ít hơn 10 lần, đối với cá chép bị bệnh có lỗ, cá chình bị

bệnh mốc nước và đỏ vây, bệnh cảm nhiễm do bị sát thương của cá trác đen, tắm thuốc

từ 10 -15 phút, sau lại đem nuôi trong nước có thả một lượng thích hợp vi khuẩn

quang hợp, độ nửa tháng có thể chữa khỏi. Sử dụng lâu dài trong ao nuôi cua, có thể

tránh xảy ra bệnh thiếu máu.[18]

Làm thức ăn cho ấu thể tôm cá

Vi khuẩn quang hợp có giá trị dinh dưỡng rất cao hàm lượng prôtêin đạt trên 60%,

đồng thời còn chứa vitamin nhóm B phong phú và folacin, sinh vật tố và chất thúc lớn

sinh vật chưa biết, chấy lượng của nó thì men không có cách gì so sánh được. Còn

khuẩn thể của vi khuẩn quang hợp rất nhỏ (chỉ là 1/20 của tảo tiểu cầu), do đó, còn là

thức ăn vừa miệng nhất của ấu thể cá, tôm, nhuyễn thể có vỏ. Trong quá trình nuôi ấu

thể cá, tôm, nhuyễn thể có vỏ ứng dụng vi khuẩn quang hợp có thể nâng cao tỷ lệ

sống, tăng nhanh sự sinh trưởng, giảm bớt lượng nước thay. Cuối cùng nguyên nhân

của nó, một là làm sạch nước, cải thiện môi trường nước, hai là làm thức ăn cho ấu thể,

ba là vi khuẩn quang hợp sau khi trở thành loài ưu thế của khối nước, vật chất sinh

trưởng do nó giải phóng ra có thể làm cho một số nguyên nhân bệnh khó tồn tại, có thể

giảm bớt bệnh của ấu thể, từ đó nâng cao tỷ lệ sống của ấu thể.[18]

Làm chất phụ gia cho thức ăn có chất lượng

Vi khuẩn quang hợp gồm vật chất sống có nhiều loại công năng thúc đẩy sinh

trưởng và vật hoá hợp chất béo (nhân tố sinh trưởng) v.v Do đó, nó có thể trực tiếp

làm chất phụ gia cho thức ăn. nếu trong thức ăn cho thêm vi khuẩn quang hợp thì

không cần phải thêm chất phụ gia vào thức ăn nữa. Vì giá thành không cao, thông

17

Đồ Án Tốt Nghiệp

thường trong thức ăn tăng 0,5 -1% là có thể tăng rõ rệt hiệu quả thức ăn và tỷ lệ tăng

trọng. Căn cứ kết quả thí nghiệm cho biết, vi khuẩn quang hợp dùng cho nuôi cá chình

Nhật Bản tỷ lệ tăng trọng có thể cao tới 10%, dùng để nuôi tôm he dưới 8 mm, mỗi

mẫu có thể tăng sản lượng 12% dùng để nuôi cá nước ngọt, mỗi mẫu có thể tăng sản

lượng 25%.[18]

1.3 Phương pháp định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào vật liệu di

truyền là một phương pháp tin cậy, có độ chính xác cao, tiến hành trong thời gian

ngắn, không cần nuôi cấy, khắc phục được một nhược điểm lớn của phương pháp định

danh truyền thống là phải nuôi cấy, tiến hành nhiều phản ứng sinh hóa phức tạp, tuy

nhiên đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại, cơ sở dữ liệu, thông tin về đặc điểm di

truyền của đối tượng cần nghiên cứu đầy đủ. Trình tự gen 16S rDNA với chiều dài

khoảng 1500 bp mã hóa cho cấu trúc phân tử 16S ribosome thể hiện sự tiến hóa của hệ

thống vi sinh và là một công cụ tuyệt vời để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh loài. Lý

do để sử dụng những trình tự này làm chỉ thị phân tử đó là cấu trúc phân tử rRNA là

yếu tố cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp protein ở tất cả các hệ thống tế bào. Do đó

gen mã hóa cấu trúc 16S rDNA có tính bảo tồn cao, chứa những vùng tương đồng giữa

các loài. Nếu giữa các loài có mối quan hệ họ hàng thì độ tương đồng càng cao [19].

Để thể hiện lịch sử tiến hóa của một nh1om các loài có mối quan hệ với nhau, các

phương pháp giải trình tự đoạn gene 16S rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài

hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học và

tin học (sinh tin học). Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trong

ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất

với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro

1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp

những thông tin có liên quan đến tiến hóa.

18

Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Làm việc tại Phòng Vi sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới 9/621 Xa lộ Hà Nội, phường

Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 03/2018 – 07/2018

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn quang hợp, có khả năng cố định CO2 từ các nguồn nước từ ruộng

lúa

2.1.4 Nguồn mẫu

Nguồn mẫu phân lập được thu tại rừng ngập mặn huyện Ngọc Hiển thuộc tỉnh Cà Mau

nằm ở vị trí 8066’65’’ vĩ độ Bắc, 105000’28’’ Kinh độ Đông và Đức Hòa thuộc tỉnh

Long An nằm ở vị trí 100 90’23’’ vĩ độ Bắc, 106041’85’’ Kinh độ Đông

B A

Hình 2.1 Mô phỏng vị trí lấy mẫu tại Đức Hòa (A) và Ngọc Hiển (B)

19

Đồ Án Tốt Nghiệp

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất sửng dụng để nhuộm Gram vi khuẩn

− Dung dịch Iodine

− Dung dịch Crystal Vilolet

− Dung dịch Safranin

− Dung dịch Methanol

Hóa chất sử dụng ly trích trong DNA

− Agarose

− Đệm CTAB

− Chloroform Isoamyl alchol

− Isopropanol, Etanol

− TAE 1X

− Loading dye

Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR

− Nước khử ion

− Thang DNA 1kb

− MyTaq Mix DNA Polymerase

− Cặp primer: 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

20

Đồ Án Tốt Nghiệp

Hóa chất sử dụng tron tinh sạch DNA

− Nước khử ion

− Buffer PB

− Buffer PE

Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn BIM (Basic Isolation Media)

Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy

Nước cất (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 NaCl NaHCO3 Yeast extract Glycerol pH 1 L 1 g 0.5 g 0.2 g 2 g 5 g 1.5 g 1.5 g 7

(Nguồn trích từ Brown, 2012)

Thêm 2,5% Agar để được môi trường thạch.

Môi trường được hấp khử trùng ở 121℃ trong vòng 15 phút

2.2.2 Dụng cụ

Ống nghiệm, erlen, đĩa petri, que cấy, ống đong, ống nhỏ giọt, lam kính, bao tay,…

2.2.3 Thiết bị

Pipepette, micropipepette, microwave, cân phân tích, kính hiển vi, pH kế, tủ sấy, nồi

hấp autoclave, tủ cấy, tủ lạnh, máy ly tâm, bình khí CO2, máy PCR, máy điện di,…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Vi khuẩn quang hợp phân bố rộng rãi trong tự nhiên như ở các vùng ao, hồ, đặc

biệt là các vùng ao lúa có ánh nắng chiếu rọi cao . Các mẫu thu thập được kiểm tra pH

trước khi thu.

Dụng cụ thu mẫu bao gồm túi nilon dày, ly nhựa. Ta sử dụng ly nhựa để múc nước

ao ruộng cùng với vớt 1 lớp đất trồng dày khoảng 2-3 cm phân phối vào trong bịch

nilon. Lưu ý rằng mỗi vùng thu mẫu tương ứng với mỗi ly nhựa khác nhau, tránh sự

lây nhiễm từ ao này sang ao khác. Sau đó bịch mẫu được cột chặt bằng dây thun, ký

hiệu tên mẫu, địa điểm thu mẫu và vận chuyển về địa điểm nghiên cứu để tiến hành

phân lập.

21

Đồ Án Tốt Nghiệp

2.3.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp cố định CO2

Mẫu

Tăng sinh 10 ngày

Pha loãng mẫu đến 10-3

Phân lập

Ủ 3 -4 ngày ở nhiệt độ phòng, nơi có ánh nắng chiếu rọi

Làm thuần

Cấy ria làm thuần mẫu 2 lần

Kiểm tra hình thái

khuẩn lạc

Nhuộm gram và soi kính

Khảo sát sự tăng trưởng ở

các nồng độ muối khác nhau

Kiểm tra khả năng

cố định CO2

Bảo quản giống

Định danh

Hình 2.2 Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn quang hợp

22

Đồ Án Tốt Nghiệp

2.3.3 Phương pháp tăng sinh mẫu

Môi trường lỏng cơ bản BIM được sử dụng để tăng sinh các nguồn mẫu. Môi

trường lỏng được chuẩn bị và phân phối vào ống nghiệm với thể tích 10 ml, sau đó

mẫu nước được đổ vào ống môi trường sao cho mẫu gần ngập đầy miệng ống nghiệm

để tránh sự sinh trưởng của tảo. Tất cả mọi thao tác đều thực hiện trong tủ cấy vô

trùng, các ống sau đó được đặt ở vị trí có sự tiếp xúc của ánh nắng mặt trời và quan sát

sự thay đổi màu sắc trong vòng 10 ngày.

2.3.4 Phương pháp phân lập mẫu

Đối với nguồn mẫu phân lập trực tiếp, tiến hành pha loãng mẫu nước ở các nồng

độ khác nhau từ 10-1, 10-2, 10-3 nhằm thu được các khuẩn lạc riêng rẽ khi ta trải đĩa,

mỗi nồng độ pha loãng tương ứng với 1 ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Ta

hút 1 ml từ nguồn mẫu cho vào ống thứ nhất để được nồng độ 10-1, tiếp theo ta hút 1

ml từ ống có nồng độ 10-1 cho vào ống thứ 2 để đạt nồng độ 10-2, và làm tương tự đối

với ống thứ 3 để đạt nồng độ 10-3

Ta phân lập bằng cách cấy trải 0,1 ml dịch nuôi cấy ở mỗi nồng độ pha loãng lên

môi trường thạch BIM, ủ ỏ nhiệt độ phòng trong 2 – 3 ngày.

Sau khi khuẩn lạc hình thành trên bề mặt đĩa môi trường, ta tiến hành chọn những

khuẩn lạc có hình dạng và màu sắc khác nhau và cấy chuyền 2 -3 lần để sang đĩa thạch

khác để thu được khuẩn lạc đồng nhất

Đối với mẫu tăng sinh, tiến hành pha loãng ống tăng sinh đến nồng độ 10-3, cấy

trải trên bề mặt đĩa thạch BIM với thể tích 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng như trên

Sau khi các chủng vi khuẩn đã được làm thuần sẽ được đem đi nhuộm Gram để

quan sát đặc điểm hình thái và màu sắc

2.3.5 Phương pháp, kỹ thuật nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn

thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế

bào. Các hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật này bao gồm: Crystal Violet, Lugol,

Safranin và cồn 960

Cách tiến hành:

1. Sử dụng que cấy vòng vô trùng lấy một ít khuẩn lạc thuần mà ta mong muốn trên

đĩa thạch trải và hòa vào 1 – 2 giọt nước cất được nhỏ trên giữa phiến kính Lamen.

23

Đồ Án Tốt Nghiệp

Để cố định tế bào, ta sử dụng kẹp thủy tinh để gắp phiến kính và hơ lửa trên ngọn

đèn cồn cho đến khi bề mặt kính khô.

2. Tiếp đến ta nhỏ 1 – 2 giọt thuốc nhuộm Crystal Violet trên vị trí mà ta cố định

khuẩn lạc trước đó và để yên trong vòng 50 – 60 giây. Sau đó ta rửa sạch thuốc

nhuộm bằng bình tia có chứa nước cất và thấm khô.

3. Tiếp theo, ta nhỏ 1 -2 giọt thuốc nhuộc Lugol ở vị trí có định khuẩn lạc trong vòng

50 – 60 giây. Sau đó ta rửa nước và thấm khô.

4. Sau khi nhỏ Lugol, ta nhỏ vài giọt cồn 960 trên phiến kính trong vòng 10 – 15 giây

để tẩy màu, rửa nước và thắm khô

5. Cuối cùng, nhuộm bằng dung dịch Safranin bằng cách nhỏ 1 – 2 giọt trong vòng 50

– 60 giây, rửa nước thấm khô.

Các mẫu trên sau đó được đem đi quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học, quan

sát ở vật kính 100X và chụp ảnh bằng màn hình LCD được kết nối với thiết bị

2.3.6 Phương pháp khảo sát sự tăng trưởng của vi khuẩn ở các nồng độ muối

khác nhau

Các chủng vi khuẩn sau khi quan sát hình thái được khảo sát khả năng tăng trưởng

qua các nồng độ muối khác nhau trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung NaCl nồng

độ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 phần nghìn. Ta tiến hành dung que cấy chuyển khuẩn lạc

thuần chủng cho vào môi trường lỏng có các nồng độ muối khác nhau. Thời gian theo

dõi trong vòng 7 ngày liên tục

Khả năng tăng trưởng được theo dõi thông qua dịch huyền phù của tế bào thông

qua máy đo OD tự động Bio - Rad ở bước song 660.

2.3.7 Phương pháp khảo sát khả năng tăng trưởng và sử dụng nguồn CO2 của vi

khuẩn quang hợp

Sau khi khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ muối khác

nhau. Ta tiến hành kiểm tra sự hấp thụ CO2 của các chủng

Ta sử dụng que cấy chuyển khuẩn lạc thuần chủng và hòa tan vào nước cất vô

trùng, tiến hành đo OD đạt giá trị khoảng 0,1 nhằm có lượng tế bào đầu vào cân bằng

giữa các chủng khảo sát, ly âm và thu hồi tế bào và cho môi trường BIM lỏng và bổ

sung hỗn hợp khí H2: O2: CO2 theo thời gian 8 phút: 1 phút: 2 phút thông qua bình nén

khí có đưởng ống kết nối với một kim tiêm vô trùng, đâm xuyên qua ống nấp nhựa ống

24

Đồ Án Tốt Nghiệp

nghiệm, thổi khí trực tiếp vào môi trường lỏng. Qua đó, một đầu ống tiêm khác cũng

được bố trí như trên, nhưng không tiếp xúc với môi trường và không kết nối với bình

khí, đầu kim tiêm này nhằm mục đích dẫn các thành phần khí không cần thiết có trong

Các thành phần khí không cần thiết

Ống dẫn kết nối với bình khí

Kim tiêm

Môi trường lỏng BIM

ống nghiệm ra bên ngoài. Lô đối chứng không bổ sung hỗn hợp khí như trên.

Hình 2.3 Mô hình thí nghiệm thổi khí vào môi trường lỏng

Khả năng tăng trưởng được theo dõi thông qua quan sát sự gia tăng liên tục độ đục

của môi trường.

2.3.8 Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn

DNA có kích thước lớn, mọi việc chiết tách cần phải tránh mọi tác nhân cơ học, hoá

học tới phân tử DNA này.Việc tách DNA từ tế bào vi khuẩn được chia làm bốn bước cơ bản:

1. Nuôi cấy và thu sinh khối

Tùy từng loại vi khuẩn mà người nghiên cứu chuẩn bị môi trường và điều kiện

nuôi cấy khác nhau như nhiệt độ, độ pH, và điều kiện dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của

vi khuẩn.Tách tế bào ra khỏi dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm và làm sạch tế bào. Thông

thường khoảng 1.000ml dịch nuôi cấy li tâm và thu lấy khoảng 10ml cặn vi khuẩn.

2. Phá vỡ màng tế bào và giải phóng các thành phần bên trong

Acid nucleic được giải phóng ra khỏi màng tế bào bằng phương pháp hóa học và

sinh học để thu dịch chiết tế bào.Enzyme lysozyme là một enzyme có trong lòng trắng trứng hoặc

phage T4, có khả năng phá vỡ thành phần trùng hợp của thành tế bào. EDTA (TrilonB) tạo phức với

25

Đồ Án Tốt Nghiệp

Mg+2 dạng hòa tan và làm vỡ thành tế bào. Đồng thời EDTA ngăn không cho enzyme

trong tế bào phân hủy DNA. Người ta còn có thể phá vỡ màng tế bào và giải phóng

DNA ra khỏi liên kết histon bằng chất tẩy rửa SDS (Sodium Derecyl Sylfat) hoặc enzyme

protease. Các chất phá vỡ màng này làm li giải màng, tách rời các phần tử lipit và gây ra sự gẫy

màng tế bào.

3. Làm sạch DNA từ dịch chiết tế bào

Loại bỏ các thành phần không mong muốn như protein, lipit và các thành phần

khác bằng kế ttủa phân đoạn. Mẫu được lắc mạnh trong hệ dung môi phenol-

chloroform để biến tính, kết tủa protein và giải phóng acid nucleic vào dung dịch lỏng.

Protein bị biến tính sẽ tách ra khỏi pha nước có chứa DNA sẽ được tách ra nhờ ly tâm. Dịch

nổi gồm acid nucleic và nước được hút ra và tiếp tục phân hủy RNA bằng enzyme RNase.

Sau đó, tách DNA và nước để thực hiện bước phân tích tiếp theo.

4. Thu hồi DNA dạng đặc

Mục đích của bước này là thu DNA dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân

hủy của enzyme. Có 2 phương pháp kết tủa:

Kết tủa DNA trong etanol với sự có mặt Na+nồng độ cao, nhiệt độ thấp, tỷ lệ giữa

etanol và mẫuphân tích là 3:1.- Kết tủa trong izopropanol, tỷ lệ giữa rượu và mẫu là 1:1.

Với phương pháp này không cần sự cómặt của muối và loại được DNA có phân tử

lượng thấp. Ly tâm cao tốc và thu nhận DNA dạng cô đặc.Trong cả hai phương pháp,

DNA thu được sẽ rửa trong etanol-70% để loại izopropanol và muối để thu được DNA

tinh khiết.

2.3.9 Khuếch tán DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)

Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR là 27F (5’- AGAGTTTGATCCTGG

CTCAG-3’) và 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACG ACTT-3’), cặp mồi phổ rộng

đặc trưng cho vi khuẩn. Thành phần phản ứng PCR 16S rRNA gồm có: 1 μl 27F và 1

μl 1492R (pmol/μl), 12.5 μl nước sinh học phân tử, 9.5 μl master mix (Bioline, Anh)

và 1 μl mẫu DNA. Tổng thể tích phản ứng là 25 μl. Thông số của chu trình phản ứng

PCR 16S rRNA được thể hiện như trong hình

26

Đồ Án Tốt Nghiệp

Hình 2.4 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA

Sau phản ứng PCR, ta tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm ly trích DNA, sản phẩm

PCR trên gel 1% agarose

1 gram bột agarose hòa vào 100ml dung dịch đệm Tris – acetate – EDTA (TAE),

gia nhiệt để agarose tan hoàn toàn. Sau khi nhiệt độ gel xuống còn 50 – 55oC thì tiến

hành đổ gel và lắp lược 8 giếng vào khuôn điện di. Khi miếng gel đặc lại hoàn toàn

thì cho vào buồng điện di chứa đệm TAE sao cho dung dịch cao hơn mặt gel 3 – 5

mm.

Tiến hành trộn sản phẩm ly trích DNA/PCR vào dịch Loading dye (6X) theo tỷ lệ

5:1 (v/v, μl). Nạp hỗn hợp vào trong các giếng. Tiến hành điện di mẫu với điện thế

90V trong khoảng 20 – 30 phút. Sau khi điện di, miếng gel được nhuộm trong dung

dịch ethidium bromide trong 15 phút, rửa lại bằng nước trong 2 phút. Cuối cùng quan

sát vệt DNA xuất hiện trên gel dưới ánh sáng UV.

2.3.10 Giải trình tự DNA và định danh

Mẫu sản phẩm PCR kèm theo mồi xuôi 27F được gửi tới công ty Nam Khoa

Biotek để thực hiện giải trình tự một chiều. Kết quả gửi về công ty sẽ được đọc bằng

phần mềm MEGA5 (http://www.megasoftware.net/). Chọn vùng trình tự ổn định và

so sánh với ngân hàng BLAST của NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để

tìm ra các chủng tương đồng. Kết quả chấp nhận khi mức tương đồng trình tự đạt trên

98%. Dựa vào cây phát sinh loài kết hợp hình thái, khả năng sinh hóa của các chủng

để định danh ở mức cấp loài.

27

Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Từ 63 mẫu nước ban đầu thu thập từ Long An và Cà Mau, tiến hành phân lập được

44 chủng vi khuẩn trên trường thạch BIM. Kết quả thu nhận được là, 12 chủng vi

khuẩn được phân lập và làm thuần từ 22 mẫu nước ao ruộng từ Long An; 32 chủng vi

khuẩn được phân lập và làm thuần từ 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn Cà Mau.

Từ 44 chủng tiếp tục tiến hành sàng lọc sơ bộ các chủng không thuộc nhóm vi

khuẩn quang hợp thông qua quan sát đặc điểm hình thái bằng kỹ thuật nhuộm Gram

so sánh với đặc điểm hình thái của vi khuẩn quang hợp, hầu hết các vi khuẩn quang

hợp đều bắt Gram (+) và có hình thái đa dạng như hình cầu, oval, trứng, que,... Sau khi

chọn lọc các chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái thích hợp, tiến hành khảo sát khả

năng sinh trưởng thông qua các nồng độ muối khác nhau và khả năng cố định CO2 để

lựa chọn những chủng vi khuẩn tốt nhất đáp ứng cả 2 thí nghiệm trên.

Sau hai thí nghiệm trên đã chọn ra 5 chủng đại diện trên tổng số 44 chủng ban đầu,

5 chủng vi khuẩn này được tiến hành ly trích DNA và khuyếch đại đoạn gene bằng kỹ

thuật PCR và tinh sạch bằng bộ kit The QIAquick PCR Purification (QIAGEN). Sản

phẩm PCR được giải trình tự.

5 chủng vi khuẩn được chọn lọc để định danh bao gồm : RL1.2, CM23.1, CM24.1,

CM34.3

3.1 Kết quả thu mẫu

Các mẫu nước được thu nhận từ các ao ruộng ở huyện Đức Hòa, thuộc tỉnh Long

An và rừng ngập mặn huyện Ngọc Hiển thuộc tỉnh Cà Mau thu nhận được 22 mẫu

nước ruộng ở Đức Hòa, 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn ở Ngọc Hiển.

Các mẫu nước từ ao ruộng thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vi trí 100 90’23’’ vĩ độ

Bắc, 106041’85’’ Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ở Ấp 2 và Ấp 4, xã Hữu

Thạnh .

Các mẫu nước từ rừng ngọc mặn thuộc huyện Ngọc Hiển nằm ở vị trí 8066’65’’ vĩ

độ Bắc, 105000’28’’ Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ở Liên tiểu khu 104 –

Xã Viên An Đông, rừng phòng hộ Nhưng Miên.

28

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bảng 3.1 Danh sách các nguồn mẫu từ Long An và Cà Mau

Hình ảnh một số mẫu được thu thập từ Long An Mẫu Mẫu Địa điểm thu mẫu Tên mẫu Tên mẫu

RL1 pH ban đầu 3.7 RL2 pH ban đầu 4.17

ấp 2 – xã Nhị Thành, huyện Thủ Thừa, Long An

RL3 4.3 RL4 3.12

ấp 2- xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An

RL5 3.8 RL6 4.8

ấp 2 – xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An

29

Đồ Án Tốt Nghiệp

RL7 3.78 RL8 5.17

ấp 2 – xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An

RL9 5.23 RL10 6.94

ấp 4 – xã Hựu Thạnh, huyện Đức Hòa, Long An

30

Đồ Án Tốt Nghiệp

Hình ảnh một số mẫu được thu thập từ Cà Mau

6.07 CM1 6.3 CM2

Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau

6.24 CM3 6.4 CM4

Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau

CM5 6.23 CM6 6.53

Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau

CM7 6.4 CM8 6.33

Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau

31

Đồ Án Tốt Nghiệp

CM9 6.43 CM10 6.32

Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau

CM11 6.43 CM12 6.32

Rừng ngập mặn Ngọc Hiển, tỉnh Cà Mau

Từ 22 mẫu nước từ ao ruộng huyện Đức Hòa, thuộc tỉnh Long An, nhìn chung giá

trị pH được đo ban đầu trước khi thu mẫu nằm trong ngưỡng từ 3.12 cho đến dưới 6,94

điều này cho ta thấy rằng môi trường nguồn mẫu ta thu được có tính acid cao.

So sánh với 41 nguồn mẫu tại Cà Mau, các mẫu nước từ rừng ngập mặn này có giá

trị pH cao hơn hẳn so với nguồn mẫu tại Long An, giá trị pH các mẫu nằm trong

ngưỡng từ 6,03 đến 6,88, điều này cho thấy rằng môi trường tại nguồn mẫu thu được

mang tính kiềm và thích hợp cho sự phát triển nhóm vi khuẩn quang dưỡng.

Theo Hunter và cộng sự, năm 2009, vi khuẩn quang hợp phát triển tối ưu ở điều

kiện pH= 6 – 7 [15], cho nên nhiều khả năng cho thấy rằng nguồn mẫu từ Cà Mau là

nguồn mẫu tốt khi phân lập số lượng vi khuẩn quang hợp sẽ nhiều hơn so với các mẫu

thu được tại Long An.

32

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.2 Kết quả tăng sinh mẫu

Tiến hành tăng sinh các mẫu nước bằng cách đổ gần ngập đến miệng ống nghiệm

có chứa 10 lít môi trường lỏng BIM, khóa chặt ống bằng nắp vặn nhựa và đem mẫu

tăng dưới ánh sáng tự nhiên trong một khoảng thời gian 10 ngày. Những ống nghiệm

tăng sinh thành công sẽ có màu đỏ nâu cho đến đỏ tía được đem đi phân lập.

Bảng 3.2 Danh sách mẫu tăng sinh thành công từ các nguồn mẫu Long An và Cà Mau

STT Chủng STT Chủng pH pH

1 RL1 3.70 CM18 6.66 20

2 RL6 5.87 CM19 5.43 21

3 RL7 3.78 CM22 6.62 22

4 RL8 5.17 CM23 6.50 23

5 RL10 6.94 CM24 6.60 24

6 RL13 4.27 CM25 6.47 25

7 RL22 4.05 CM26 6.48 26

8 CM2 6.07 CM27 6.47 27

9 CM4 6.24 CM29 6.53 28

10 CM6 6.53 CM30 6.88 29

11 CM7 6.46 CM31 6.50 30

12 CM8 6.33 CM32 6.65 31

13 CM9 6.43 CM33 6.51 32

14 CM10 6.32 CM34 6.61 33

15 CM11 6.43 CM35 6.67 34

16 CM12 6.34 CM37 6.53 35

17 CM13 6.52 CM38 6.43 36

18 CM14 6.37 CM39 6.63 37

19 CM17 6.36 CM40 6.44 38

33

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bảng 3.3 Hình ảnh một số ống mẫu tăng sinh có sự thay đổi màu rõ rệt

STT Thời gian Mẫu tăng sinh thanh công Mẫu tăng sinh không thanh công

1 10 ngày tăng sinh

2 10 ngày tăng sinh

3 10 ngày tăng sinh

4 10 ngày tăng sinh

34

Đồ Án Tốt Nghiệp

5 10 ngày tăng sinh

Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy, nguồn mẫu tăng sinh thành công từ Cà Mau cao hơn

so với nguồn mẫu Long An.

Từ 22 mẫu được thu thập tại Long An, trong đó có 7 mẫu tăng sinh chuyển dần

sang đỏ sau 10 ngày, chiếm tỉ lệ 31.8% .

Từ 41 mẫu được thu thập tại Cà Mau, trong đó có 31 mẫu tăng sinh chuyển dần

sang đỏ sau 10 ngày, chiếm tỉ lệ 75.6% .

Tỉ lệ các nguồn mẫu tại Cà Mau cao gấp gần 2,5 lần nguồn mẫu tại Long An. Bên

cạnh đó, dựa vào kết quả lập luận tại mục 3.1 kết quả thu mẫu, các nguồn mẫu tại Cà

Mau cho kết quả tốt hơn do sự ảnh hưởng của pH, khi giá trị pH của các mẫu từ rừng

ngập mặn có ngưỡng giá trị phù hợp với ngưỡng giá trị phát triển tối ưu mà ta đã đề

cập phía trên, pH = 6 -7.

35

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.3 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái

Từ 38 ống tăng sinh thành công có màu nâu đỏ sang đỏ tía từ các nguồn mẫu Long

An và Cà Mau, tiến hành phân lập và làm thuần thu được 44 chủng. Các chủng được

mô tả hình thái khuẩn lạc theo bảng 3.4

Bảng 3.4 Danh sách các chủng đã được phân lập từ 38 ống mẫu tăng sinh

STT Ký hiệu Nguồn Mô tả khuẩn lạc

chủng phân lập

Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn RL1.2 RL1 1

RL1.4 RL1 Tròn, bóng, lồi, màu cam, rìa trơn 2

RL3.1 RL3 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 3

RL4.1 RL4 Tròn, trắng ngà, lồi, rìa trơn 4

RL5.1 RL5 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 5

RL5.2 RL5 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 6

RL8.1 RL8 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 7

RL11.1 RL11 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 8

RL10.1 RL10 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 9

RL14.1 RL14 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 10

RL14.2 RL14 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 11

RL19.1 RL19 Tròn, nhẵn, lồi, trắng đục, rìa trơn 12

RL20.1 RL20 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 13

CM6.1 CM6 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 14

CM7.1 CM7 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 15

CM11.1 CM11 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 16

17 CM12.1b CM12 Tròn, bóng, lồi, ngả vàng, rìa trơn

18 CM12.2 CM12 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

19 CM20.1b CM20b Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

20 CM20.2b CM20b Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn

CM23.1 CM23 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 21

CM24.1 CM24 Tròn, bóng, lồi, đỏ, rìa trơn 22

CM27.1 CM27 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 23

36

Đồ Án Tốt Nghiệp

24 CM28.1 CM28 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

25 CM30.1 CM30 Tròn, bóng, lồi, hồng nhạt, rìa trơn

26 CM19.1 CM19 Tròn, lồi, vàng, rìa trơn

27 CM19.2 CM19 Tròn, lồi, trắng đục, rìa trơn

28 CM19.3 CM19 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn

29 CM34.1 CM34 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

30 CM34.2 CM34 Tròn, bóng, lồi, ngả vàng, rìa trơn

31 CM34.3 CM34 Tròn, bóng, lồi, đỏ, rìa trơn

32 CM35.1 CM35 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn

33 CM37.1 CM37 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

34 CM40.1 CM40 Tròn, bóng, lồi, vàng cam, rìa trơn

35 CM40.2 CM40 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

36 CM9.1 CM9 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn

37 CM10.1 CM10 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

38 CM25.1 CM25 Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn

39 CM39.1 CM39 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

40 CM31.1 CM31 Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn

41 CM31.2 CM31 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn

42 CM18.1 CM18 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn

43 CM33.1 CM33 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn

44 CM13.1 CM13 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn

37

RL1

RL8

RL34.3

RL23

RL24

RL10

O

Đồ Án Tốt Nghiệp

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập và làm

thuần trên môi trường BIM agar

Tiến hành nhuộm Gram để quan sát đặc điểm vi thể, cũng như xác định được

nhóm vi khuẩn thuộc Gram âm hay Gram dương

3.4 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn

Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang. Kết quả của 43 chủng được

thể hiện qua bảng 3.4 bên dưới

Bảng 3.5 Kết quả đặc điểm hình thái vi khuẩn

STT Ký hiệu Hình dạng Gram Ký hiệu Hình dạng Gram

STT chủng chủng

RL1.2 Oval CM27.1 Oval - - 23 1

RL1.4 Que, phẩy CM28.1 Que ngắn, cong - + 24 2

RL3.1 Oval CM30.1 Oval - - 25 3

RL4.1 Cầu CM19.1 Que - - 26 4

RL5.1 Oval CM19.2 Oval - + 27 5

RL5.2 Oval CM19.3 Que + + 28 6

RL8.1 Cầu CM34.1 Que - - 29 7

38

Đồ Án Tốt Nghiệp

RL10.1 Oval 8 - 30 CM34.2 Oval -

RL11 Oval 9 + 31 CM34.3 Oval -

RL14.1 Cầu 10 + 32 CM35.1 Que ngắn -

RL14.2 Oval 11 + 33 CM37.1 Que dài, cong -

RL19.1 Cầu 12 + 34 CM40.1 Oval -

RL20.1 Oval 13 + 35 CM40.2 Que ngắn, cong -

CM6.1 Que, cong 14 - 36 CM9.1 Que, ngắn -

CM7.1 Oval 15 - 37 CM10.1 Oval -

CM11.1 Que, cong 16 - 38 CM25.1 Que -

CM12.1b Que ngắn, cong 17 - 39 CM39.1 Oval +

CM12.2 Que dài, cong 18 - 40 CM31.1 Oval -

CM20.1b Que ngắn, cong 19 - 41 CM31.2 Cầu -

CM20.2b Oval 20 - 42 CM18.1 Oval +

CM23.1 Oval 21 - 43 CM33.1 Que +

CM24.1 Oval 22 - 44 CM13.1 Que, cong -

Tất cả vi khuẩn quang hợp đều bắt màu tím Gram (+), cho nên qua kỹ thuật

nhuộm Gram, ta có thể loại suy ra những chủng vi khuẩn không nằm trong nhóm các

chủng bắt Gram (+).

Từ bảng kết quả 3.4 được đề cập phía trên, 44 chủng vi khuẩn ban đầu, có đến 33

chủng bắt màu hồng Gram (-), tức có khoảng 11 chủng vi khuẩn bắt màu tím Gram (+)

chiếm 25% trên tổng số chủng ban đầu.

Từ 12 chủng phân lập có nguồn mẫu từ Long An, có đến 8 chủng vi khuẩn bắt

Gram (+), chỉ có 4 chủng bắt Gram (-). Qua đó, số lượng chủng vi khuẩn bắt Gram (-)

từ 32 chủng phân lập tại Cà Mau lại chiếm tỉ lệ cao hơn so với những chủng bắt Gram

(+), chỉ có 3 chủng bắt Gram (+).

Qua đó cho ta thấy rằng, môi trường từ khu vực lấy mẫu ở Cà Mau có thể có số

lượng vi khuẩn quang hợp khả nghi sinh sống cao hơn môi trường từ khu vưc lấy mẫu

ở Long An

39

Đồ Án Tốt Nghiệp

Sau khi chọn lọc những chủng vi khuẩn Gram (-), ta tiếp tục tiến hành khảo sát

khả năng sinh trưởng của các chủng quan tâm trong môi trường có bổ sung các nồng

RL1

RL8

RL34.3

RL23

RL10

RL24

O

độ muối khác nhau, nhằm xem khả năng chịu mặn của chúng và tiến hành sàng lọc.

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của một số chủng vi khuẩn được quan sát dưới ống kính

hiển vi với vật kính 100X

40

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.5 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn

Để tiếp tục chọn lọc và loại suy để chọn ra vi khuẩn quang hợp. Ta tiến hành khảo

sát khả năng sinh trưởng của chúng ở các nồng độ muối khác nhau, cụ thể là môi

trường lỏng BIM có bổ sung NaCl lần lượt: 5‰, 10‰, 15‰, 20‰, 25‰, 30‰,

35‰, 40‰. Thời gian theo đõi là 7 ngày, sự tăng trưởng vi khuẩn được đo bằng máy

đo độ đục tự động ở bước sóng 660.

Vi khuẩn quang hợp có khả năng thích nghi với nồng độ muối cao, điều nay giúp

ta có thể loại ra những chủng vi khuẩn không thích nghi với nồng độ muối khắc

nghiệt.

Dưới đây là những số liệu đuọc thống kê theo dạng biểu đồ cột, biểu đồ miêu tả sự

tăng trưởng của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ muối thấp tới cao với giá trị OD đo

1

được la trục tung, thời gian theo dõi từng ngày là trục hoành.

NaCl 5‰

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

0

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

1

Ngày 1

NaCl 5‰

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 5

Hình 3.3 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 5‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

Ở nồng độ muối 5‰, đa số các chủng vi khuẩn đều thích nghi ở điều kiện muối này.

Có một số chủng phát triển tốt có thể nói đến như: CM24.1 và 28.1 có giá trị OD tăng

liên tục đạt trên 0,8 và không có dấu hiệu sụt giảm cho tới ngay khảo sát thứ 7. Một số

chủng sau từ ngày khảo sát thứ 1 đến ngày khảo sát thứ 7 phát triển không có sự gia

tăng đáng kể như là: RL1, RL8, 19.1, CM40.2 khi giá trị OD dưới 0,2.

41

1

Đồ Án Tốt Nghiệp

NaCl 10‰

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

0

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

1

Ngày 1

NaCl 10‰

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 1

Hình 3.4 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 10‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

Ở nồng độ muối 10‰, khả năng thích nghi của những chủng vi khuẩn này cao hơn so

với nồng độ muối 5‰. Điển hình có nhiều hơn hai chủng có giá trị OD cao hơn

ngưỡng 0,8 như: RL8, CM24.1, CM28.1 ở ngày khảo sát thứ 7 và CM35.1 ở ngày

0.8

khảo sát thứ 5.

NaCl 15‰

0.6

0.4

D O

0.2

0

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 1

NaCl 15‰

D O

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Hình 3.5 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 15‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

Ở nồng độ muối cao hơn, sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn cải thiện hơn khi có

nhiều chủng đạt giá trị OD cao hơn 0,4 sau 7 ngày khảo sát. Trong đó có 2 chủng đạt

42

Đồ Án Tốt Nghiệp

giá trị OD gần bằng 1 và 1 chủng có giá trị OD vượt qua 0,8 lần lượt là CM35.1,

1

CM20.1 và CM28.1.

NaCl 20‰

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

0

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

1

Ngày 1

NaCl 20‰

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 1

Hình 3.6 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 20‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

Chúng ta có thể thấy rằng, ở nồng độ muối 20‰, các chủng vi khuẩn sinh trưởng ổn

định so với 3 nồng độ muối trước đó. Tỷ lệ những chủng sinh trưởng kém dưới 0,2

chiếm 0% vào ngày thứ 7 khảo sát. Bên cạnh đó, tỷ lệ chủng chủng phát triển tốt đạt

giá trị OD vượt mức 0,8 lại không cao khi chỉ có chủng là: CM11.1 và RL10.

0.8

NaCl 25‰

0.6

0.4

D O

0.2

0

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

1

NaCl 25‰

0.8

D O

0.6 0.4

0.2

0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Hình 3.7 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 25‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

43

Đồ Án Tốt Nghiệp

Nồng độ muối cang cao, thì sự phát triển ổn định cũng cao. Sự tăng trưởng của các

chủng vi khuẩn có chiều hướng đi lên trong 7 ngày khảo sát nhưng không chênh lệnh

quá cao 0.8

NaCl 30‰

0.6

0.4

D O

0.2

0

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

NaCl 30‰

D O

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Hình 3.8 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 30‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

Ở nồng độ muối cận kề độ mặn nước biển. Các chủng vi khuẩn có sự sụt giảm rõ rệt

trong 7 ngày khảo sát, số lượng các chủng phát triển kém lên tới 6 chủng đó là: RL1,

RL8, RL4, RL10, CM12.1, CM13.1. Điều đáng lưu ý rằng, không có chủng nào đạt

0.6

giá trị OD cao hơn 0,8 ở ngày khảo sát cuối cùng.

NaCl 35‰

0.4

D O

0.2

0

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

1.2

NaCl 35‰

1

0.8

0.6

D O

0.4

0.2

0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Hình 3.9 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 35‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

44

Đồ Án Tốt Nghiệp

Ở nồng độ muối ngang với độ mặn nước biển, nhiều chủng phát triển không tốt, số lớn

các chủng nằm trong ngưỡng dưới 0,4. Một số chủng phát triển trên ngưỡng 0,6 vào

ngày khảo sát cuối cùng. Chỉ có 1 chủng đạt giá trị OD cao hơn 1 vào ngày thứ 5 là

CM12.1, nhưng sau đó mau chóng tụt giảm trong ngày thứ 7, và ở mức dưới 0,4.

NaCl 40‰

0.5 0.4

0.3

D O

0.2

0.1

0

RL1 RL4 RL3 CM24.1 CM19.2 CM40.1 CM25.1 CM23.1

RL8 RL10 CM39.1 CM31.1 CM19.1 CM31.2 CM10.1 CM34.3

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

0.8

NaCl 40‰

0.6

0.4

D O

0.2

0

CM34.2 CM37.1 CM27.1 CM12.1 CM11.1 CM6.1 CM35.1 CM12.1

CM34.1 CM28.1 CM30.1 CM7.1 CM20.1 CM40.2 CM13.1 CM9.1

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 3

Ngày 4

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7

Hình 3.10 Giá trị OD660nm ở nồng độ muối 40‰ của các chủng vi khuẩn sau 7 ngày

Ở nồng độ muối cao hơn nước biển, sự tăng trưởng các chủng tại ngày khảo sát thứ 7

khả quan hơn so với nồng độ muối 35‰ trước đó, chỉ có 2 chủng có giá trị OD thấp

hơn 0,2 đo là RL4, CM40.2, chiếm 6,2% tổng thể. Còn lại tất cả các chủng phát triển

tống ở giá trong OD trong ngưỡng từ 0,2 đến 0,6. Không có chủng nào phát triển vượt

mức giá trị 0,8.

Kết quả cho thấy, tất cả các chủng vi khuẩn đều thích nghi với các nồng độ muối

khác nhau, và sinh trưởng tốt trong khoảng 0.5% đến 2.5%. Qua đó càng về sau, nồng

độ muối càng cao, khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cũng giảm dần, cụ thể

là trong khoảng 3% đến 4%. Việc loại suy sẽ chọn lọc ra những chủng có khả năng

sinh trưởng tốt ở nồng độ 4% ở ngay khảo sát thứ 7, giá trị OD nằm trong khoảng 0,21

– 0,571, cho nên ta sẽ lấy giá trị trung bình OD là 0,3 làm móc để tuyển chọn vi khuẩn.

Nhóm thực hiện đề tài đã chọn ra 14 chủng được thể hiện ở bảng dưởi.

45

Đồ Án Tốt Nghiệp

Bảng 3.6 Giá trị OD660nm của các chủng cao hơn 0,3 ở nồng độ 4% sau 7 ngày

STT Ký hiệu chủng STT Ký hiệu chủng OD660nm OD660nm

1 RL1.2 0,342 8 CM23 0.385

2 RL8 0,328 9 CM34.3 0.429

3 RL10 0,393 10 CM28.1 0.435

4 CM34.2 0.354 11 CM27.1 0.549

5 CM40.1 0,373 12 CM30.1 0.571

6 CM24.1 0.378 13 CM12.1 0.327

7 CM31.2 0.311 14 CM11.1 0.336

Ta có 14 chủng có khả năng chịu mặn cao. Tuy nhiên, trong tự nhiên có một số

chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn cao hơn vi khuẩn quang hợp. Cho nên khảo sát

khả năng hấp thụ CO2 là bước đi tiếp theo để loại bỏ những chủng vi khuẩn không có

khả năng hay có khả năng hấp thụ CO2 kém, qua đó tuyển chọn những chủng vi khuẩn

có khả năng hấp thụ CO2 cao.

3.6 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ CO2

Sau khi tuyển chọn những chủng vi khuẩn chịu mặn cao, ta tiến hành khảo xác khả

năng hấp thụ CO2 của các chủng này. Ta bổ sung hỗn hợp khí H2: O2: CO2 theo thời

gian 8 phút: 1 phút: 2 phút vào môi trường lỏng BIM có bổ sung vi khuẩn. Khả năng

tăng trưởng được theo dõi thông qua độ đục của môi trường. Lô đối chứng không sục

hỗn hợp khí trên và bổ sung vi khuẩn. Kết quả hấp thụ CO2 được thể hiện ở các bảng

bên dưới.

0.45

0.4

0.35

0.3

0.25

D O

Đối chứng

0.2

Hấp thu CO2

0.15

ị r t a í G

0.1

0.05

0

2

1

1

1

2

0

3

1

1

1

1

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1 L R

8 L R

4 3

1 1

0 4

4 2

1 3

3 2

4 3

8 2

7 2

0 3

2 1

0 1 L R

Bảng 3.7 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 1

46

Đồ Án Tốt Nghiệp

Các chủng vi khuẩn ở lô đối chứng không có bổ sung khí CO2 có sự tăng trưởng

không cao, có giá trị OD chỉ ở mức 0,15 trở xuống. Bên cạnh đó, khi có bổ sung

nguồn CO2, sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn cao hơn rõ ràng so với lô đối

chứng. Điển hình một số chủng có giá trị OD cao như: CM34.2, CM24.1, CM23.1,

CM34.3, CM28.1, RL1, RL8..những chủng này đạt ở ngưỡng trên 0,3. Một số chủng

còn lại nằm trong khoảng từ 0,15 cho tới dưới 0,3.

1.2

1

0.8

D O

0.6

Đối chứng

0.4

Hấp thu CO2

ị r t a í G

0.2

0

Bảng 3.8 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 3

Bước sang ngày thứ 3, các chủng được bổ sung CO2 tăng lên đáng kể, đồng thời lô đối

chứng cũng tăng theo. Các chủng vi khuẩn đạt giá trị OD trên 0,3 được mô tả ở bảng

3.7 ngày nay đã tăng vọt lên trên ngưỡng 0,6 đó là các chủng CM40.1, CM24.1,

CM23.1, CM34.3, CM28.1, CM27.1, CM30.1, RL1, RL8, RL10; trong đó 2 chủng đạt

giá trị OD vượt mức 0,8 và 1 chủng vượt mức 1 lần lượt là CM24.1, CM28.1, CM34.3

va RL1. Ở lô đối chứng, đa số các chủng chạm ở mức giá trị OD dưới 0,4, một số

chủng phát triển kém hơn 0,2.

47

Đồ Án Tốt Nghiệp

D O

ị r t a í G

Bảng 3.9 Giá trị OD660nm, khả năng hấp thụ CO2 của các chủng vi khuẩn ngày 5

Ở lần khảo sát cuối cùng, chiều hướng tăng trưởng của các chủng vi khuẩn ngày

càng đi lên, lô đối chứng tăng trưởng không đáng kể và đạt giá trị OD dưới 0,4. Qua

đó có 2 chủng vi khuẩn sinh trưởng kém nhất trong số 14 chủng khảo sát là CM34.2,

CM11.1. Các chủng phát triển ở mức khá như: CM40.1, CM31.2, CM28.1, CM27.1,

CM30.1, CM12.1 nằm trong ngưỡng giá trị OD từ 0,4 đến dưới 0,8. Đặc biệc có đến 6

chủng vi khuẩn đạt giá trị OD cao nhất vượt mức 0,8 là CM24.1, CM23.1, CM34.3,

RL1, RL8, RL10. Trong đó có 2 chủng vi khuẩn đạt giá trị OD xấp xỉ 1,4 là CM24.1,

RL1.

Gía trị OD được biểu diễn trên biểu đồ cột cho ta thấy rằng khi bổ sung khí CO2,

lượng sinh khối sinh ra sẽ nhiều hơn lô đối chứng (không bổ sung CO2). Ngoài ra, sau

3 lần khảo sát, ta thấy rằng chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 phát triển đồng đều

và tốt nhất, nhu cầu CO2 đối với chúng cực kì cao

Cho nên 4 chủng vi khuẩn này sẽ được lựa chọn để tiến hành ly trích DNA, tiến

gần hơn với giai đoạn định danh.

48

Đồ Án Tốt Nghiệp

3.7 Định danh

CM24

CM23

CM34

RL1

.1

.1.1

.4.1

3.7.1 Ly trích, thu nhận DNA

Hình 3.11 Kết quả ly trích DNA của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1, RL8

trên gel agarose 1%

Từ hình 3.8, cho thấy kết quả ly trích bộ gen của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3,

RL1, RL8 đều tốt. Từ đó, tiếp tục sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR

để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA

3.7.2 Kết quả PCR

Sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gene 16S DNA với cặp mồi 27F và 1492R cho kết

quả trên gel agarose 1%, kích thước gene khoảng từ 1500bp khi so sáng với thang

DNA ladder

RL1

CM34

CM23

CM24

.4.1

.4.1

.1

DNA có kích thước 10000bp.

1500bp

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 5 chủng CM24.1, CM23.1, CM34.3,

RL1 trên gel agarose 1%

49

Đồ Án Tốt Nghiệp

Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR, sản phẩm sản phẩm được tinh sạch bằng bộ kit The

CM24

DNA ladder

RL1

CM34

CM23

.1

.4.1

.4.1

QIAquick PCR Purification.

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng bộ kit của 5 chủng

CM24.1, CM23.1, CM34.3, RL1 trên gel agarose 1%

3.8 Kết quả định danh

Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự tại công ty Nam Khoa thì kết quả được

gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng: ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5

5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và ngân hàng gene, dựng cây phát sinh loài.

3.8.1 Trình tự vùng gene của 4 chủng RL1, CM23, CM24, CM34.3

RL1:GCTAGTTGTATACCGTGCAGTCGAGCGAGTCTTCGAGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGA

ACGTGCCATTTGCTTCGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGAATGTGCCCTATGGGGGAAAGATTT

ATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAG

CTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG

GAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGATCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGA

TCTTTCAGGTGGGAAGATAATGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTA

ATACGGAGGGGGCTAGCGTTATTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTCAGAGG

TGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGAAACTCCC

CM24:AAGTCGAAGTCTTCGGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTGCTTCGGAA

TAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGAATGTGCCCTATGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCG

CGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCA

GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGC

AAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGATCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGATCTTTCAGGTGGGAAGATAA

TGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTT

ATTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACC

CTGGAACTGCCTTTGAAACTCCCGATCTTGAGGTCGAGAGAGGTG

CM34.3:GGACACATAACAGAGAGCGTCTGAATCGTCGCTTCTGGATGAGCCTGGCGGACGGGTGAATAACACT

TGGACGCGGTGCCGTTTGGTGGCATAACTCATGGAAACTTGGGCTCATACGGTATGTGCCCTTGTGGGGAAGG

ATTATCGGCATTGGAGGGGCCGTCGTCTGATGTTCTACTTGGGTAGGTAAAGGCGTCCGAAGGCGACGATCAA

50

TATCTGGTCTGAGAGGATGATGCCCGCGTTTGCGACGGACACAGGGCCCACACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG

GGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAA

ATTCTTTCACCGGGGACGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGG

TAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGCGGACATTTAAGTCAGG

GGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTTGATACTGGG

Đồ Án Tốt Nghiệp

CM23:ATAATCCCACCGATGGTCGGCTGCCTCCTCTTGCGAGGTTGGCGCACCGCCTTCGGGTAGAACCAATTC

CCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGTCATGCTGTTACGCGATTACTAG

CGATTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACAGCTTTTTGGGATTAACCCATTGT

CACTGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAACCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCACACCTTCCTCC

GGCTTATCACCGGCAGTTTCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGACGTGGGTTGCGCTCGTTGC

CGGACTTAACCGAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGCGATCCAGCCGAACT

GAAGGAACCATCTCTGGAACCGCGATCGCCATGTCAAGGGTTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAA

CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT

51

Đồ Án Tốt Nghiệp

Rhodobacter sp. JA487

38

Rhodobacter johrii

Rhodobacter sphaeroides

3.8.2 Thiết lập cây phát sinh loài

RL1

Rhodobacter sp. KCI-b

Rhodobacter sp. UTW6 -29

CM23

CM24

CM23 CM24

68

CM34.3

Hình 3.14 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene

Chủng RL1 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter sp. JA487 và

Rhodobacter sphaeroides có mức độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh

trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng RL1 là loài Rhodobacter

sphaeroides

Chủng CM23 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter sphaeroides và

Rhodobacter sp. UTW6-29 có mức độ tương đồng lần lượt là 100% và 99%. Dựa vào

kết qủa so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng CM23 là

loài Rhodobacter sphaeroides

Chủng CM24 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter sphaeroides,

Rhodobacter johrii và Rhodobacter sp. JA487 có mức tương đồng lần lượt là 100%,

99%, 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình

thái thì chủng CM2 là loài Rhodobacter sphaeroides

Chủng CM34.3 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodobacter KCI-b,

Rhodobacter johrii và Rhodobacter sp. UTW6-29 có mức tương đồng lần lượt là 99%,

100%, 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gene và so sánh kết quả đặc điểm hình

thái thì chủng CM34.3 là loài Rhodobacter johrii

52

Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1.Kết luận

Từ 22 mẫu nước thu thập từ ao ruộng Long An và 41 mẫu nước từ rừng Ngọc

Hiển, Cà Mau, phân lập tổng cộng được 44 chủng vi khuẩn. Sau đó tiến hành kiểm tra

hình thái khuẩn lạc thông qua kỹ thuật nhuộm Gram, kết quả chọn lọc được 33 chủng

vi khuẩn bắt Gram(-)

Những chủng vi khuẩn này tiếp tục được khảo sát khả năng chịu mặn, kết quả cho

thấy ở nồng độ muối 40‰, chỉ có 14 chủng vi khuẩn phát triển tốt và ổn định.

Từ 14 chủng vi khuẩn này, tiến hành khảo sát khả năng hấp thu CO2 và chọn lọc

được 4 chủng có khả năng tăng trưởng cao nhất đó là RL1, CM23, CM24, CM34.3.

Kết quả hình thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty cho thấy rằng chủng RL1, CM23,

CM24 có khả năng thuộc loài Rhodobacter sphaeroides. Còn chủng CM34.3 có khả

năng thuộc loài Rhodobacter johrii. Các chủng đều cho kết quả tương đồng 100% khi

so sánh các dữ liệu gene của các chủng trên ngân hàng NCBI.

2. Kiến nghị

Do lượng thời gian có giới hạn nên quá trình nghiên cứu vẫn còn một số vấn đề chưa

được thực hiện. Cần thực hiện thêm một số khảo sát:

• Tối ưu hóa điều kiện tăng trưởng các chủng vi khuẩn quang hợp

• Khảo sát các đặc điểm sinh hóa đối với các chủng đã phân lập

• Khảo sát sự hấp thụ CO2 qua các tỉ lệ thời gian khác nhau. Qua đó xác định khả

năng hấp thụ tối ưu và lượng CO2 mất đi thông qua các phương pháp phân tích, cụ

thể là phương pháp sắc kí khí

53

Đồ Án Tốt Nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Mỵ Trần Hương Trà. 2015. Nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng vi khuẩn

Rhodobacteria để xử lý chất hữu cơ và Sulfide trong nước

[2] Nguyễn Thị Hương. 2012. Phân lập, đánh giá các đặc điểm sinh học và định danh

phân tử các chủng vi khuẩn quang hợp tía phục vụ chế tạo chế phẩm vi sinh vật hữu

hiệu.

[3] Fang LC, Huang XF, Du ZH, Yuan J, Wei H, Cheng HH, Liu Y. 2005. Isolation

and identification of a photosynthetic bacteria producing coenzyme Q10

[4] Prasertsan P, Choorit W, Suwanno S. 1993. Isolation, identification and growth

conditions of photosynthetic bacteria found in seafood processing wastewater.

[5] Michael Knaggs. 2012. Air Products and Chemicals, Inc.: Demonstration of CO2

Capture and Sequestration of Steam Methane Reforming Process Gas Used for Large-

Scale Hydrogen Production

[6] Maha Harbaoui Zrelli. 2016. Renewable energy, non-renewable energy, carbon

dioxide emissions and economic growth in selected Mediterranean countries

[7] Washington, DC: The National Academies Press. 2010. Ocean Acidification: A

National Strategy to Meet the Challenges of a Changing Ocean

[8] Viện Khoa Học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. 2013. Tác hại kinh hoàng của

khí hậu tới con người

[9] International Energy Agency. 2017. Global Energy & CO2 Status Report

[10] Duy Hữu. 2015. Việt Nam đứng trong Top các quốc gia phát thải nhiều khí nhà

kính

[11] Thân Mạnh. 2014. 10 điều bạn có thể làm để giảm sự nóng lên của trái đất

[12] Nguyen Uyen. 2011. Vi khuẩn lưu huỳnh màu lục (Green sulfure bacteria)

[13] Nguyễn Lân Dũng. 2005. Các nhóm vi khuẩn chủ yếu

[14] Nguyễn Như Khanh. 2016. Qúa trình quang hợp ở vi khuẩn

[15] Hunter, N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., Beatty, J.Th. (Eds.). 2009. The Purple

Phototrophic Bacteria

[16]. Beverly K. Pierson and Richard W. Castenholz. 1974 .A Phototrophic Gliding

Filamentous Bacterium of Hot Springs, Chloroflexus aurantiacus, gen. and sp. nov

54

Đồ Án Tốt Nghiệp

[17] Mack et al. 1993. Rhodospirillum sodomense,sp.nov., a Dead Sea Rhodospirillum

species.

[18] Hà Trang. 2002. Tổng thuật theo Châu Giang Thuỷ sản,

[19] Janda JM, Abbott SL. 2007. 16S rRNA gene sequencing for bacterial

identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls

55

Đồ Án Tốt Nghiệp

PHỤ LỤC A: Kết quả phân lập các mẫu từ tỉnh Long An và tỉnh Cà Mau.

56

Đồ Án Tốt Nghiệp

57

Đồ Án Tốt Nghiệp

PHỤ LỤC B: Hình ảnh lấy mẫu thực tế tại Long An và Cà Mau

58

Đồ Án Tốt Nghiệp

59

Đồ Án Tốt Nghiệp

PHỤ LỤC C: Kết quả vùng gene bảo tồn các chủng định danh

Chủng CM23

60

Đồ Án Tốt Nghiệp

RL1

61

Đồ Án Tốt Nghiệp

CM24

62

Đồ Án Tốt Nghiệp

CM34.3

63

Đồ Án Tốt Nghiệp

64

Đồ Án Tốt Nghiệp

65