Đồ án tốt nghiệp: Phân lập các chủng nấm Trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở Đồng Nai và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với các nấm gây bệnh trong đất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM TRICHODERMA SPP. TỪ ĐẤT

HỒ TIÊU Ở ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG

CỦA CHÚNG VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH TRONG ĐẤT

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Hoàng Vũ

MSSV: 1151110426

Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

- - - - - - - - -- - - - - - - - -

Tôi tên: Nguyễn Hoàng Vũ

Sinh ngày 29 tháng 07 năm 1993

Sinh viên lớp 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP

Hồ Chí Minh

Tôi xin cam đoan : Đề tài "Phân lập và tuyển chọn chủng nấm Trichoderma sp trên

đất hồ tiêu ở Đồng Nai" do Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai hướng dẫn là đề tài của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Những thông tin tham khảo trong

khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.

Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo

viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hoàng Vũ

LỜI CẢM ƠN

- - - - - - - - -- - - - - - - - -

Để hoàn thành đề tài này ngoại sự nổ lực, cố gắng của bản thân, em còn nhận được

sự hỗ trợ rất nhiều từ nhiều người, tôi chân thành gửi lời "CẢM ƠN" tới :

Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những

người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi

điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay.

Ngôi trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó

suốt bốn năm học qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh

nghiệm trong cuộc sống.

Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, các thầy cô trong bộ

môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã trang

bị cho tôi những kiến thức cơ bản, làm nền móng để tôi thực hiện đề tài và làm tốt công

việc sau này.

Cô T.S Nguyễn Thị Hai đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho

em thực hiện tốt đề tài này.

Các bạn trong lớp đã cỗ vũ, khích lệ tinh thần cho em trong suốt thời gian thực

hiện đồ án.

MỤC LỤC

MỤC LỤC ......................................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ v

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ vi

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3

1. 1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma ............................................................. 3

1. 1.1. Vị trí phân loại Trichoderma ......................................................................... 3

1. 1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Trichoderma .............................................. 4

1. 1.3. Đặc điểm một số chủng Trichoderma ở Việt Nam ...................................... 5

1. 1.4. Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật ................................ 8

1.1.4.1 Nguyên tắc chung ..................................................................................... 8

1.1.4.2 Cơ chế đối kháng ...................................................................................... 9

1. 2 Hiệu quả phòng trừ nấm gây hại của nấm Trichoderma ............................. 18

1. 3 Giới thiệu về cây hồ tiêu .................................................................................. 19

1.3.1 Nguồn gốc cây tiêu .......................................................................................... 19

1.3.2 Công dụng của cây tiêu .................................................................................. 19

1.3.3 Đặc điểm hình thái của cây tiêu (Phạm Văn Biên và cộng sự, 1990. ........ 20

1. 4 Bệnh hại trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng trừ ....................................... 22

1.4.1 Bệnh hại chính trên hồ tiêu .......................................................................... 22

1.4.1.1 Bệnh chết nhanh ..................................................................................... 23

1.4.1.2 Bệnh chết chậm ....................................................................................... 24

1.4.1.3 Bệnh virus hại hồ tiêu ............................................................................ 25

1.4.2 Biện pháp phòng trừ ..................................................................................... 25

1.4.2.1 Biện pháp canh tác ................................................................................. 25

1.4.2.2 Biện pháp hóa học .................................................................................. 26

1.4.2.3 Biện Pháp sinh học ................................................................................. 26

1.4.2.4 Biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) ..................................... 26

1. 5 Một số nấm bệnh hại trong đất.................................................................... 27

1.5.1 Phytophthora .................................................................................................. 27

1.5.1.1 Vị trí và phân loại ................................................................................... 27

1.5.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc ............................................................. 28

1.5.1.3 Nấm Phytophthora gây bệnh cây trồng ................................................ 30

1.5.2 Fusarium sp .................................................................................................... 32

1.5.2.1 Vị trí phân loại ........................................................................................ 32

1.5.2.2 Đặc điểm hình thái , cấu trúc của Fusarium ....................................... 33

1.5.2.3 Nấm Fusarium gây bệnh cho cây trồng ở việt nam ............................ 34

1.5.3 Rhizoctonia solani .......................................................................................... 35

1.5.3.1 Vị trí và phân loại ................................................................................... 35

1.5.3.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc ............................................................. 36

1.5.3.3 Nấm Rhizoctonia gây hại cho cây trồng ............................................... 36

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 39

2.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................... 39

2.2 Thiết bị dụng cụ vật liệu ............................................................................... 39

2.3 Vật liệu ............................................................................................................ 40

2.3.1 Vi sinh vật nghiên cứu .................................................................................. 40

2.3.2 Môi trường ..................................................................................................... 41

2.4 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 42

2.4.1 Phân lập nấm Trichoderma trên đất hồ tiêu .............................................. 43

2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000). ............ 43

2.4.1.2 Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................. 43

2.4.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm......................................................... 43

2.4.2.1 Quan sát đại thể nấm ............................................................................. 43

2.4.2.2 Quan sát vi thể nấm ............................................................................... 44

2.4.3 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase,

chitinase). (Tô Duy Khương, 2007) ............................................................. 45

2.4.4 Đánh giá tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm

bệnh (Fokkema, 1976)................................................................................... 46

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê. ........................................................... 47

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 48

3.1 Kết quả phân lập nấm Trichoderma từ đất hồ tiêu. ...................................... 48

3.2 Đặc điểm của các chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu

......................................................................................................................... 48

iii

3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của 8

chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu bị bệnh. ............. 53

3.4 Đánh giá khả năng đối kháng với các chủng nấm bệnh trong đất và đất hồ

tiêu của các chủng Trichoderma phân lập được. ................................................. 56

3.4.1 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1. ........................................ 57

3.4.2 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 ........................................ 61

3.4.3 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani....................................... 65

3.4.4 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp. ............................................... 69

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 74

4.1 Kết luận .............................................................................................................. 74

4.2 Kiến Nghị: .......................................................................................................... 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 75

PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 1

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải Chitin của 8 chủng nấm Trichoderma sau

hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) .................................................................................... 53

Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải Cellulose chủa 8 chủng nấm Trichoderma

sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm) ............................................................................. 55

Bảng 3.3 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1 của các chủng

Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ............................................................ 57

Bảng 3.4 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 của các chủng

Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ............................................................ 61

Bảng 3.5 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani của các chủng

Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ............................................................ 65

Bảng 3.6 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp của các chủng Trichoderma

spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy. ................................................................................... 69

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cuống bào tử trần ở nấm T.hazrianum (trái) và T.aggresivum (phải). .. 5

Hình 1.2: Trichoderma atroviride. ................................................................................. 5

Hình 1.3: Trichoderma hazianum. ................................................................................. 6

Hình 1.4: Trichoderma koningii. .................................................................................... 7

Hình 1.5: Trichoderma hamatum ................................................................................... 7

Hình 1.6: Trichoderma viride . ....................................................................................... 8

Hình 1.7: Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus ............. 11

Hình 1.8: Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào .......................... 12

Hình 1.9: Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh. ...................................... 13

Hình 1.10: Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh

được tiết ra từ Trichoderma hazianum ....................................................................... 15

Hình 1.11: Nấm Trichoderma cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với các

nấm bệnh khác. .............................................................................................................. 17

Hình 1.12: Cây hồ tiêu với trái chưa chín (https://vi.wikipedia.org/wiki/Hồ_tiêu) 19

Hình 1.13: Hình ảnh chu kỳ sống của Phytophthora ................................................. 29

Hình 1.14: Bệnh Héo Fusarium trên cây chuối do Fusarium oxysporum

f.cubensesp...................................................................................................................... 34

Hình 1.15: Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra ...................................................... 38

Hình 3.1: Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5,

TT6, TT7, TT8 sau 3 và 5 ngày. ................................................................................... 49

Hình 3.2: Hình ảnh sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT1, TT2,

TT5, TT6, TT7, T2. ....................................................................................................... 51

Hình 3.3: Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT3, TT4 sau 3 và

5 ngày. ............................................................................................................................. 52

Hình 3.4: Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT3 ........................... 52

Hình 3.5: Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT4 ........................... 53

Hình 3.6: Hình ảnh vòng phân giải Chitin của các chủng nấm Trichoderma sp

phân lập được.. .............................................................................................................. 55

Hình 3.7: Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng nấm Trichoderma sp phân

lập được .......................................................................................................................... 56

Hình 3.8: Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp của 8 chủng nấm Trichoderma

spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. ............ 61

Hình 3.9: Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp2 của 8 chủng nấm Trichoderma

spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. ............ 65

Hình 3.10: Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia solani của 8 chủng nấm

Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối

chứng. .............................................................................................................................. 69

Hình 3.11: Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia sp của 8 chủng nấm Trichoderma

vii

sp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng. .............. 73

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU

Việt Nam hiện nay là một trong những nước đứng đầu về xuất khẩu hồ tiêu trên

thế giới . Các vùng trồng hồ tiêu chủ yếu ở nước ta tập trung từ Quảng Trị đến các

vùng đất đỏ cao nguyên Trung bộ, Đông Nam bộ và Đảo Phú Quốc. Từ năm 1995 trở

lại đây, cây hồ tiêu được phát triển với qui mô và tốc độ khá lớn, điển hình là các

tỉnh Đắc Lắc, Đắc Nông, Gia Lai, Bình Dương, Bình Phước, Quảng Trị, Phú Quốc và

Đồng Nai. Chỉ tính riêng hai tỉnh Đắc Lắc và Đắc Nông thì từ năm 1995 cho đến nay,

diện tích hồ tiêu mới phát triển lên tới gần 10000 ha. Định hướng của ngành sản xuất

hồ tiêu đến năm 2010 - 2020 giữ diện tích khoảng 50 000 ha, giá trị xuất khẩu đạt trên

240 triệu USD/ năm.

Tuy nhiên nhiều năm trở lại đây, dịch hại trên hồ tiêu phát sinh sinh và gây hại

đáng kể cho nhiều vùng sản xuất hồ tiêu tập trung (Báo nông nghiệp Việt Nam số ra

ngày 9/2 và 10/4/2007).

Thống kê của Cục BVTV cho thấy, tính tới cuối năm 2014, tổng diện tích hồ tiêu

nhiễm bệnh chết nhanh đã lên tới trên 2.000 ha, chiếm 2,5% tổng diện tích gieo trồng;

diện tích nhiễm bệnh chết chậm gần 3.300 ha, chiếm 4% tổng diện tích gieo trồng.

Bệnh chết nhanh đã xảy ra ở hầu hết các tỉnh trồng hồ tiêu, trong khi bệnh chết chậm

chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên và Đông Nam bộ (Cục Bảo vệ Thực vật, 2007).

Một trong những vi sinh vật quan trọng sống trong đất gây hại cho cây tiêu đó là

nấm Phytophthora sp. Nấm gây hiện tượng chết nhanh và phân bố rộng rãi trên thế

giới, đặc biệt là vùng Đông Nam Á, Châu Á, Úc. Ngoài ra còn có các loài nấm khác

gây chết cây như Fusarium sp , Rhizoctonia solani (Barbara, 2001). Theo Kularatne

(2002), các bệnh quan trọng nhất trên cây tiêu gồm bệnh chết nhanh do Phytophthora

sp, bệnh chết chậm do Fusarium sp. Đối với bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp.

là tác nhân gây bệnh chính (Kularatne, 2002).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Để kiểm soát được dịch bệnh này thì phương pháp hóa học không còn là một biện

pháp được tin dùng. Thay vào đó việc nghiên cứu để tìm ra những tác nhân sinh học

mang lại hiệu quả cao và thân thiện với môi trường đang là giải pháp được hướng đến.

Một trong số các tác nhân được đánh giá là có nhiều hứa hẹn đó là nấm

Trichoderma. Nhiều kết quả nghiên cứu về Trichoderma đã được thực hiện và đã đc

thương mại hóa. Tuy nhiên, hiệu quả của chế phẩm Trichoderma vẫn còn khá bấp

bênh. Các tác giả trong và ngoài nước đều thống nhất rằng, sự phân bố và điều kiện

môi trường sống của nấm Trichoderma có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh

enzyme, tiết kháng sinh và đối kháng nấm bệnh của chúng. Các chủng nấm có nguồn

gốc bản địa sẽ cho hiệu quả phòng trừ tốt hơn so với các chủng nhập cư. Xuất phát từ

nhận định này, sinh vien tiến hành đề tài PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM

TRICHODERMA SPP TỪ ĐẤT HỒ TIÊU Ở ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ

NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHÚNG VỚI CÁC NẤM GÂY BỆNH TRONG ĐẤT,

nhằm tìm ra các chủng có triển vọng để phòng trừ các loài bệnh hại có trong đất ở vùng

nghiên cứu.

Mục đích đề tài

➢ Tìm ra được chủng nấm Trichoderma trong đất hồ tiêu ở Đồng Nai có khả năng

đối kháng với tác nhân gây bệnh trong đất.

➢ Bổ sung thêm các chủng nấm Trichoderma có nguồn gốc ở vùng sinh thái mới

vào bộ sưu tập của phòng thí nghiệm trường Hutech.

Nội dung nghiên cứu

➢ Phân lập các chủng nấm Trichoderma từ đất cây hồ tiêu ở Đồng Nai.

➢ Đánh giá các đặc điểm sinh học của các chủng nấm Trichoderma phân lập được.

➢ Đánh giá khả năng đối kháng với các bệnh trong đất hồ tiêu của các chủng

Trichoderma phân lập được.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. 1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma

Trichoderma là loại nấm có mặt nhiều trong đất, các rễ cây, chúng có khả

năng phân hủy gỗ, các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật (Howell và cộng sự,

2003). Các chủng Trichoderma là thành phần chính trong hệ VSV của đất, đó có thể là

do khả năng trao đổi chất phong phú và cạnh tranh tích cực của chúng. Trichoderma

được cho là ít liên quan đến dịch bệnh ở thực vật sống, mặc dù một nhóm của

Trichoderma harzianum gây bệnh trên nấm thương mại. Năm 1996 thì Samuels đã đưa

ra đánh giá toàn diện về đặc tính sinh học của Trichoderma, kỹ thuật thu nhận được

enzyme tiết ra từ Trichoderma và khả năng kiểm soát sinh học của chúng (Tran

Nguyen Ha, 2010).

Nấm Trichoderma sp. thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm bất toàn (imperfect

fungi) Deuteromycetes, bộ nấm bông Moniliales, học Moniliaceae, chi Trichoderma

(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Nấm Trichoderma phát triển nhanh và sinh

nhiều bảo tử màu xanh lá cây (Huỳnh Văn Phục, 2006).

1. 1.1. Vị trí phân loại Trichoderma

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác

phân loại do còn nhiều đặc điểm chưa được biết đầy đủ. Persoon ex Gay ( 1801 )

phân loại Trichoderma như sau.

Giới Fungi

Ngành Ascomycota

Lớp Euascomycetes

Bộ Hypocreales

Họ Hypocreaceae

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Chi Trichoderma

Ainsworth và Sussman (1968) lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes,

bộ Moniliales, họ Moniliaceae.

Theo nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da silva (1997), Trichoderma thuộc

họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, các loài Trichoderma được chia thành 5

nhóm: Trichoderma, longibrachiatum, Saturisporum, pachybasium và Hypocreanum .

Theo GS Nguyễn Lân Dũng và một số tác giả khác, chi Trichoderma thuộc lớp

Deuteromycetes, bộ Moniliales họ Moniliaceae

1. 1.2. Đặc điểm hình thái và cấu trúc Trichoderma

Hầu hết chi Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính. Chúng sinh sản

bằng bào tử đính từ khuẩn ti khí sinh. Khuẩn ti khí sinh không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, phát triển nhanh trong MT nuôi cấy ở 25-30oC, thường không phát triển ở 35oC. Khuẩn lạc không màu trong MT thạch đường bột bắp hay trên MT giàu chất dinh dưỡng như PDA. BT hình thành trong vòng 1 tuần thành khối lỏng lẻo

hoặc rắn chắc có màu xanh, màu vàng và ít khi có màu trắng. Chất tạo màu vàng

thường chìm trong khối agar, đặc biệt trong môi trường PDA.

Cuống sinh BT phân nhánh cao (khó để xác định hoặc đo đếm) kết thành bụi

chặt hay lỏng, thường tạo nên những vòng đồng tâm đặc trưng hoặc hướng theo

khuẩn ty khí sinh. Những nhánh chính của cuống sinh BT tạo ra các nhánh bên có thể

kết cặp hoặc không, nhánh dài nhất xa phần đỉnh, thể bình phát sinh trực tiếp từ thân

chính gần đỉnh. Các nhánh có thể tái phân nhánh, với những nhánh thứ cấp thường kết

cặp.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.1 Cuống bào tử trần ở nấm T.hazrianum (trái) và T.aggresivum (phải)

(http://explow.com/Trichoderma).

1. 1.3. Đặc điểm một số chủng Trichoderma ở Việt Nam

• Trichoderma atroviride

Đặc điểm: Khuẩn lạc phát triển nhanh, đạt 8-9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở 20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 2- 14µm. Bào tử màu xanh, có hình cầu méo

hoặc bầu dục đường kính từ 4-12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt

hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa (Kubicek và Harman,1998) .

Hình 1.2 Trichoderma atroviride (http://explow.com/Trichoderma).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

• Trichoderma hazianum

Đặc điểm: Môi trường có nhiệt độ từ 15-350C, pH: 3,7-4,7 rất thích hợp cho sự phát triển của nấm (Dosmch và Gams, 1980). Khuẩn lạc phát triển nhanh, đường kính khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C. Bào tử đính có hình cầu méo đến bầu dục ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2,7- 3,2)x(2,5-2,8)µm.

Hình 1.3 Trichoderma hazianum (http://expow.com/Trichoderma).

• Trichoderma koningii

Đặc điểm:

Khuẩn lạc có đường kính 3-5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C, bào tử có

hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0-4,8)x(1,9-2,8)µm.

Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất mặt, nhưng ở độ sâu 120cm vẫn có sự hiện

diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 260C trở lên tùy theo nguồn

gốc của loài, pH: 3,7-6,0 (Huỳnh Văn Phục, 2006).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.4 Trichoderma koningii (http://explow.com/Trichoderma).

• Trichoderma hamatum

Đặc điểm:

Đường kính khuẩn lạc đạt 7cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 200C. Bào tử màu xanh lục,

trơn, dạng elip, có kích thước khác nhau tùy theo chủng (Domsch và Gams,1980).

Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3,7-4,7 là những điều kiện rất thuận lợi cho sự

phát triển của Trichoderma hamatum và chúng phát triển chậm lại ở 00C (Domsch và

Gams,1980).

Hình 1.5 Trichoderma hamatum (http://explow.com/Trichoderma).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

• Trichoderma viride

Đặc điểm:

Bào tử màu xanh lục, vách xù xì, dạng hình cầu, kích thước (4-5)x(2,5-3)µm.

(cook và baker, 1983).

Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai nguồn nitrogen đơn giản và phức tạp. Khi

Trichoderma tăng trưởng trên nguồn cacbonhydrate như là nguồn cacbon cho dinh

dưỡng thì ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate (Danielson và Davey, 1973).

Hình 1.6 Trichoderma viride (http://explow.com/Trichoderma).

1. 1.4. Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật

1.1.4.1 Nguyên tắc chung

Nghiên cứu về cơ chế đối kháng có ý nghĩa quan trọng bởi lẽ muốn sử dụng hiệu

quả nhất những tác nhân kiểm soát bệnh thực vật, chúng ta phải hiểu những tác nhân

đó làm việc như thế nào và giới hạn của chúng là gì. Trên cơ sở đó, tác động có hiệu

quả tới các khâu nuôi dưỡng, bảo quản và cuối cùng sử dụng những tác nhân kiểm soát

sinh học sao cho có thể khai thác tốt nhất khả năng kiểm soát bệnh của chúng. Nhiều

nghiên cứu từ trước tới nay đã chỉ ra rằng, Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế khác nhau

trong phòng trừ và tiêu diệt nấm bệnh như: hiện tượng kí sinh nấm, sự sản sinh kháng

sinh, sự tiết những enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh, khả nămg cạnh tranh mạnh

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

chất dinh dưỡng và không gian sống. Những cơ chế này không tách biệt nhau, và để

đối kháng với các chủng nấm bệnh thì chúng có thể kết hợp hai hay nhiều cơ chế trong

suốt quá trình ký sinh và tiêu diệt. Ví dụ, sự kiểm soát botrytis trên nho bởi

Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự ký sinh lên hạch nấm, cả hai

cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh (Huỳnh Văn Hiếu, 2009).

Cả cơ chế tạo ra chất kháng nấm và cơ chế ký sinh đều có thể liên quan đến sự

cạnh tranh dinh dưỡng, và sự sản xuất ra các chất độc được biết có ảnh hưởng đến tình

trạng dinh dưỡng của môi trường. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các chất

kháng sinh và các enzyme thủy phân không chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ

nhau trong cơ chế đối kháng ký sinh (Huỳnh Văn Hiếu, 2009).

Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh chủ

yếu bằng 2 cơ chế:

Thứ nhất: Nấm Trichoderma bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh.

Thứ hai: Nấm Trichoderma tiết ra các loại enzyme thủy phân.

Klein và Eveleigh (1998), thì cho rằng nấm Trichoderma tấn công trực tiếp bằng

cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân

tử nhỏ dễ hấp thu, đồng thời giúp cây trồng kháng lại bệnh (Huỳnh Văn Phục, 2006).

1.1.4.2 Cơ chế đối kháng

Nấm Trichoderma phát triển nhanh trong đất, nên chúng tăng nhanh về số lượng so

với các loài nấm khác (Saksena,1960). Chúng sẽ chiếm chỗ trước khi các loại nấm gây

bệnh xâm nhiễm vào mô cây trồng. Cơ chế ký sinh, đối kháng của các loài nấm đối

kháng thể hiện.

Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” ở vùng tiếp xúc giữa nấm đối kháng với nấm gây

bệnh xuất hiện sự quấn chặt của sợi nấm đối kháng quanh sợi nấm gây bệnh, sau đó xả

ra hiện tượng thủy phân thành vách sợi nấm bệnh, nhờ đó mà nấm đối kháng xâm nhập

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

vào bên trong sợi nấm, phá vỡ tế bào sợi nấm và tiêu diệt nấm gây bệnh.

Cơ chế tác động của các loài nấm đối kháng dựa trên cơ sở các loài nấm đối kháng

có khả năng sản sinh ra một số chất kháng sinh (thực chất là chất độc tố do nấm đối

kháng sản sinh ra nhưng không làm tổn hại đến sự sinh trưởng và phát triển của cây

trồng và không ảnh hưởng đến hệ VSV đối kháng ở trong đất và ở vùng rễ cây trồng):

Gliotoxin, Trichoderma viridin, Dermadin, Cyclosporin, Alamethicin, vv… Chất

kháng sinh do nấm đối kháng sản sinh ra có khả năng kìm hãm, ức chế quá trình sinh

trưởng của sợi nấm, đến quá trình xâm nhiễm ký sinh của nấm gây bệnh và có thể tiêu

diệt nấm gây bệnh (Huỳnh Văn Phục, 2006).

• Hiện tượng “giao thoa sợi nấm”

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Weidling (1932) đã

mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó

là “giao thoa sợ nấm”.

Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của nấm này lên

một nấm khác. Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính sau: đầu tiên

là sự nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn công, xuyên qua thành

tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh. Một số chi tiết của cơ chế này ở Trichoderma

đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ (Vũ Nguyên Thành, 2009).

Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá trình tấn

công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn.

Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh

Quan sát giai đoạn đầu tấn công chủng nấm bệnh. Trong giai đoạn đầu này có thể

chia làm 4 bước:

Bước 1: Nấm Trichoderma phát hiện nấm bệnh .

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hướng hóa chất, nó ký

sinh phân nhánh hướng về nấm bệnh đã được định trước (do những nấm này tiết ra hóa

chất). Ngoài ra, chúng có thể nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự

nhiên hay hóa học (qua trung gian là pectin trên bề mặt tế bào của nấm bệnh) (Trần Thị

Thanh Thuần, 2009).

Bước 2: Sợi nấm bám sát vào nấm bệnh

Sau khi phát hiện nấm bệnh, chúng nhanh chóng phát triển về hướng nấm bệnh và

phân nhánh để tăng diện tích diện tích tiếp xúc với nấm bệnh (Mark Schubert and

Siegfried Fink, 2008).

Bước 3: Phát triển cuống bào tử và bào tử đính Sau khi đã tiếp xúc được với nấm

bệnh, chúng bắt đầu tăng sinh cuống bào tử đính và hình thành các bào tử đính.

Bước 4: Tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh

Hình 1.7 Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus (Mark

Schubert and Siegfried Fink, 2008).

Kết thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh

và chẩn bị bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào

Trichoderma sản sinh ra một số enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh và cũng có

thể sinh những kháng sinh peptaibol.

Hình 1.8 Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào (Susanne

Zeilinger và cộng sự, 2003)

Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thành những lỗ

thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh.

Giai đoạn 3: Tấn công vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh

Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm bệnh, phá

huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó (Vũ Nguyên Thành, 2009).Sự

phá hủy các chất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi (Hứa

Võ Thành Long, 2010).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.9 Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh

(http://explow.com/Trichoderma).

• Cơ chế tiết kháng sinh

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký

sinh đã làm cho nấm bệnh chết. Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của

nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động

của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh (Hứa Võ

Thành Long, 2010).

Howell (1987), thấy rằng những chủng Trichoderma virens đột biến mất khả năng

ký sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm

bệnh R. solani tương đương với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh

không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng

sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một

trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học. Những kháng sinh này có thể ức

chế mạnh sự sinh trưởng của những VSV khác. Khả năng sinh kháng sinh của các loài,

các chủng không giống nhau, chúng gồm: Gliotoxin: chất kháng sinh này được R.

Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do nấm Trichoderma lignorum sinh ra. Gần

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

đây được xác định lại là do nấm Trichoderma virens sinh ra. Chất gliotoxin có phổ tác

động rộng lên nhiều VSV: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium,

Rhizoctonia…) (Vũ Nguyên Thành, 2009). Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh

thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh

này được phát hiện năm 1945. Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc

tố thực vật, có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào

tử nấm. Được sản xuất từ Trichoderma virens (Trần Thị Thanh Thuần, 2009).

Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được hai chất kháng sinh

Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài Trichoderma koningii và

Trichoderma aureoviride. Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do

Trichoderma sinh ra có liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine,

anthraquinones, butenolides, isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do

Trichoderma harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và

valinotricin do Trichoderma virens sinh ra (Vũ Nguyên Thành, 2009).

Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt

các hợp chất hóa học. Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể

được phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl- α –pyrone

(6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii)

peptaibol.

Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22 aminoacid có

chứa nhiều α -aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa một amino

alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus [11] do Trichoderma polysporum,

hazianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong

sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn

chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh (Trần

Thị Thanh Thuần, 2009).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.10 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh

được tiết ra từ Trichoderma hazianum (Mark Schubert and Siegfried Fink,

2008).

Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của

Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh.

Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum bổ sung vào môi

trường nuôi cấy của chủng Pythium ultimum. Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) môi

trường có chứa kháng sinh 6PP được tiết ra từ chủng Trichoderma hazianum, ức chế sự

phát triển của chủng Pythium ultimum. Ở đĩa (2) môi trường không chứa kháng sinh

6PP, không thấy sự ức chế chủng Pythium ultimum.

• Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống

Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu quả trong

điều khiển sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ý nghĩa hết sức

quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với vi sinh vật.

Cơ chế này cũng được ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học điều khiển

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

các bệnh do nấm. Nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc

cạnh tranh với nấm bệnh về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư

trước so với các nấm bệnh. Do đó, chúng chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng

của nấm bệnh (Green et al., 1996; Martin et al., 1985).

Trichoderma có khả năng cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis sp. và

Sclerotina sp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng

chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử

dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm

Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis sp. và

Sclerotina sp (Trần Thị Thanh Thuần, 2009).

Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Phytium

sp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào

tử Phytium sp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy

mầm của nấm Phytium sp. bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Phytium

sp. không thể nảy mầm. Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách

chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản

sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009).

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn cacbon, nitơ và yếu tố tăng trưởng khác với

nấm bệnh. Trichoderma hazianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây bệnh

trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại những

vùng bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự cạnh

tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T. hazianum sử dụng đế kiểm soát nấm

bệnh F. oxysporum. Trichoderma có thể hòa tan tốt các chất dinh dưỡng vô cơ trong

môi trường rễ cây như: đồng, photpho, sắt, mangan, kẽm và natri giúp cho cây hấp

thu tốt các nguồn dinh dưỡng này. Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng làm giảm

mức oxy hóa của các kim loại để tăng độ hòa tan của những kim loại này, và cũng có

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

thể sản xuất ra các thể mang sắt (siderophores) để vận chuyển các nguyên tố vi lượng

như sắt. Nhờ vào khả năng sinh ra siderophores hiệu quả cao do đó cạnh tranh mạnh

mẽ với khả năng hấp thu sắt của nấm khác đặc biệt là nấm bệnh. Bị thiếu sắt các đỉnh

sinh trưởng mới của nấm bệnh không được hình thành (Vũ Nguyên Thành, 2009).

Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại bỏ mầm

bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma

tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzym bảo vệ và các hợp chất

kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần,

2009).

Hình 1.11 Nấm Trichoderma cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với các

nấm bệnh khác.

(http://nimbivip.com/Sites/Web/ProDetail.aspx?ID=5111617740)

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

1. 2 Hiệu quả phòng trừ nấm gây hại của nấm Trichoderma

Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra Trichoderma có thể ký sinh trên các loại

nấm bệnh và khả năng tiết kháng sinh. Năm 1932 Weinding và các cộng sự đã mô tả

chi tiết quá trình ký sinh lên nấm bệnh Rhizoctonia solani của Trichoderma, từ việc

cuộn xung quanh các sợi nấm bệnh, thâm nhập và sau đó phá hủy tế bào của nấm chủ.

Ông cũng đã mô tả khả năng tiết kháng sinh để tiêu diệt hai chủng Rhizotonia và

Sclerotinia và đặt tên nó là gliotoxin. Trong những năm nghiên cứu này, thì nhiều kết

quả tương tự khác cũng đã được báo cáo bởi các nhà bệnh lý học thực vật. Ví dụ: chất

kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma virens thể hiện sự ức chế mạnh mẽ đối với

Pythium ultinum và Phytothora (Howell và Stipanovic,1995).

Sử dụng chế phẩm Trichoderma để kiểm soát hiệu quả các bệnh gây ra trên

cây trồng đã và đang được quan tâm rất lớn, một số sản phẩm thương mại của nấm

Trichoderma được sản xuất ở các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử

dụng trên một loạt các loại cây trồng. Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử,

sợi nấm và bào tử vách dày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái

rắn hoặc chất lỏng lên men.(Harman và các cộng sự, 2004).

Thật vậy, nhiều nghiên cứu ở nước ta đã phần nào khẳng định vai trò quan trọng

của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây hại như: Nghiên cứu về khả năng đối

kháng của Trichoderma nội địa với nấm Phytophthora gây bệnh trên cây sầu riêng

(Dương Minh, 2006), Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa

Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học

Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng

ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm

Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam

quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như

Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

1. 3 Giới thiệu về cây hồ tiêu

Hình 1.12 Cây hồ tiêu với trái chưa chín (https://vi.wikipedia.org/wiki/Hồ_tiêu)

1.3.1 Nguồn gốc cây tiêu

Tiêu có nguồn gốc từ vùng Ghat miền tây Ấn Độ, ở đây có nhiều giống tiêu hoang

dai, mọc rất lâu đời. Sau đó, tiêu được người Hindu mang tới Java (Indonesia) vào

khoảng 600 năm sau công nguyên. Cuối thế kỷ 12, tiêu được trồng ở Mã Lai. Đến thế

kỷ 18, tiêu được trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào đầu thế kỷ 20 thì tiêu được trồng

nhiều ở các nước nhiệt đới như Châu Phi với Mandagasca, Nigieria, và Châu Mỹ với

Brazil, Mexico,…

Tiêu được du nhập vào đông dương từ thế kỷ 17 nhưng mãi đến thế kỷ 18 mới bắt

đầu phát triển mạnh khi một số người Trung Hoa di dân vào Campuchia ở vùng dọc bờ

biển vịnh Thái Lan như Konpong, Trach, kep, kampot và tiêu vào Đồng Bằng Sông

Cửu Long qua ngõ Hà Tiên của tỉnh Kiên Giang, rồi sau đó lan dần đến các tỉnh khác

ở miền Trung-Tây Nguyên như Thừa Thiên Huế, Quảng Trị, Đăk Lăk, Gia Lai, Đăk

Nông,…

1.3.2 Công dụng của cây tiêu

Tiêu là loại cây trồng có thể sống lâu năm và có giá trị kinh tế cao. Tiêu được sử

dụng làm gia vị, trong y dược, trong công nghiệp hương liệu và làm chất trừ côn trùng.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên rất thích hợp cho

việc chế biến các món ăn. Vì vậy mà tiêu đã trở thành gia vị được dùng rất phổ biến

trên thế giới.

Trong y dược: Do có sự hiện diện của chất piperin, tinh dầu và nhựa có mùi thơm,

cay, nóng đặc biệt, tiêu có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon miệng. Ngoài

ra, tiêu còn có tác dụng làm ấm bụng, thường dùng chung với gừng để chữa chứng tiêu

chảy, ói mửa khi ăn nhằm món lạ, dùng chung với hành lá trong tô cháo giải cảm…

Tuy nhiên, khi dùng quá nhiều tiêu có thể gây táo bón, kích thích niêm mạc dạ dày, gây

sốt, viêm đường tiểu và có khi gây tiểu ra máu.

Trong công nghiệp hương liệu: Chất piperin trong hạt tiêu được thủy phân thành

piperidin và acid piperic. Oxy hóa acid piperic bằng permanganate kali (KMnO4), thu

được piperonal (helotropin nhân tạo) có mùi hương tự nhiên như heliotropin và

coumarin, dùng để thay thế các hương liệu này trong kỹ nghệ làm nước hoa. Tinh dầu

tiêu với mùi thơm đặc biệt được sử dụng trong công nghiệp hương liệu và hóa dược.

Trừ côn trùng: Trước kia, Người ta dùng dung dịch chiết xuất từ hạt tiêu xay tẩm

vào da trong khi thuộc để ngừa côn trùng phá hoại, nhưng từ khi xuất hiện các loại

thuốc hóa học công dụng và rẻ tiền hơn thì tiêu không còn dược sử dụng trong lĩnh vực

này nữa (Phạm Văn Biên, 1989).

1.3.3 Đặc điểm hình thái của cây tiêu (Phạm Văn Biên và cộng sự, 1990.

Rễ cọc: Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới có rễ cọc. Rễ này đâm sâu xuống

mặt đất đến độ sâu 2.5 m, làm nhiệm vụ chính là hút nước.

Rễ cái: Các rễ này cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước. đối với cây tiêu trồng

bằng giâm cành, sau khi trồng ra ngoài được một năm, các rễ cái này có thể ăn sâu đến

2m.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Rễ phụ: Các rễ phụ mọc thành từng chum, phát triển theo chiều ngang, rất dày đặc,

phân bố ở độ sâu 15-40 cm, làm nhiệm vụ hút nước và hút dinh dưỡng trong đất để

nuôi cây.

Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, không chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ cái

ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng thì phải

thường xuyên cải tạo và làm cho đất dược tơi xốp, tăng hàm lượng mùn. Chỉ cần úng

nước từ 12-24 giờ thì bộ rễ cây tiêu đã bị tổn thương đáng kể và có thể dẫn tới việc hư

thối và dây tiêu có thể bị chết dần.

Rễ bám: mọc ra từ các đốt trên thân ở trên không, làm nhiệm vụ chính là giúp cây

tiêu bám vào choái, vách tường… để vươn cao. Khả năng hút nước và hút chất dinh

dưỡng của rễ bám rất hạn chế, gần như không đáng kể.

Thân, Cành , Lá: Tiêu thuộc loại thân thảo mềm dẻo được phân thành nhiều đốt, tại

mỗi đốt có một lá đơn, hình trái tim, mọc cách. ở nách lá có các mầm ngủ có thể phát

sinh thành các cành tược, cành lươn, cành có trái tùy thuộc theo từng giai đoạn phát

triển của cây tiêu.

Cành tược (cành vượt): Thường phát sinh từ mầm nách của những cây tiêu nhỏ

hơn 1 tuổi. Đối với cây trưởng thành, cành tược phát sinh từ các mầm nách trên khung

cành thân chính phía dưới thấp của trụ tiêu, và thường là cành cấp 1. Đặc điểm của

cành tược là góc độ phân cành nhỏ, dưới 450, cành mọc tuong đối thẳng. Cành tược có

sức sinh trưởng mạnh, khỏe, thường được dùng để giâm cành thân giống.

Cành lươn: cành phát sinh từ mầm nách gần sát gốc của bộ khung thân chính của

cây tiêu trưởng thành. Đặc trưng của cành lươn là có dạng bò sát đất là có lóng rất dài.

Cành lươn cũng được dùng để nhân giống, tuy vậy, và cây thường ra hoa, trái chậm

hơn so với cành tược nhưng tuổi thọ lại dài và năng suất cao.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Cành cho trái (còn gọi là cành ác hay cành ngang): Đó là cành mang trái, thường

phát sinh từ mầm nách trên cây tiêu lớn hơn một năm tuổi. Đặc trưng của cành ác là

góc độ phân cành lớn, mọc ngang, độ dài của ngành ngắn hơn 1 m, cành khúc khuỷu và

lóng rất ngắn, cành cho trái trên bộ khung cây tiêu đa số là cành cấp hai trở lên. Cành

cho trái nếu đem giâm cành cũng ra rễ, cho trái rất sớm. Tuy vậy, cây phát triển chậm,

không leo mà mọc thành bụi vì lóng đốt không có rễ bám hoặc rất ít. Cây mau cỗi và

năng suất thường thấp.

Hoa, quả: Cây tiêu ra hoa dưới dạng hoa tự hình gié, treo lủng lẳng, dài 7-12 cm

tùy giống tiêu và tùy điều kiện chăm sóc. Trên gié hoa có bình quân 20-60 hoa xếp

thành hình soắn ốc, hoa tiêu lưỡng tính hay đơn tính.

Trái tiêu thuộc loại trái hạch, không có cuống, mang một hạt hình cầu. Từ khi hoa

xuất hiện đầy đủ cho đến khi trái chín kéo dài từ 7-10 tháng chia làm các giai đoạn sau:

Hoa tự xuất hiện đầy đủ đến khi hoa nở thụ phấn: 1-1,5 tháng.

Thụ phấn, phát triển trái (4-5,5 tháng): Giai đoạn này tiêu lớn nhanh về kích thước

và đạt độ lớn tối đa của trái, đây là giai đoạn tiêu cần nước và dinh dưỡng nhất.

Trái chín (2-3 tháng): Trong giai đoạn này hạt bắt đầu phát triển, đạt đường kính

tối đa. Trái tiêu thường chín tập trung vào các tháng 1-2 trong năm, đôi khi kéo dài đến

các tháng 4-5 do các lứa hoa ra trễ và cũng tùy theo giống.

1. 4 Bệnh hại trên cây hồ tiêu và biện pháp phòng trừ

1.4.1 Bệnh hại chính trên hồ tiêu

Theo Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam, căn cứ vào các kết quả điều tra

nghiên cứu trong và ngoài nước, người ta đã xác định trên cây hồ tiêu có trên 40 loại

sâu, bệnh gây hại trên cây hồ tiêu và cây trồng, vật liệu được sử dụng làm “ choái”

cho cây tiêu. Tuy nhiên trên những vùng trồng hồ tiêu chính ở nước ta theo các tác

giả: Theo Ngô Vĩnh Viễn (2007), trên hồ tiêu có ba nhóm dịch hại có ý nghĩa kinh tế

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

và cần được quan tâm nghiên cứu giải quyết là: Bệnh chết nhanh, bệnh chết chậm và

bệnh do virus.

1.4.1.1 Bệnh chết nhanh

Triệu chứng bệnh chết nhanh:

Bệnh gây hại trên tất cả các vùng trồng hồ tiêu ở nước ta. Triệu chứng bệnh

thường quan sát rõ nét nhất và điển hình nhất vào cuối mùa mưa và đầu mùa khô.

Ban đầu các đầu chóp rễ làm rễ biến màu và có mầu nâu nhạt hay mầu nâu thấm

nước, sau chuyển sang màu nâu đen, rễ bị thối và không cung cấp đủ nước và dinh

dưỡng cho cây và cây bị héo nhanh, mép lá hơi co lại và trở nên vàng trước khi

rụng, sau khi lá rụng quả bắt đầu bị nhăn nheo và khô. Trên thân cây bị bệnh

thường quan sát thấy mạch dẫn trong thân bị đen. Bệnh có thể quan sát thấy trong

mùa mưa từng nhánh cây bị héo xanh vào mùa mưa và có thể chết từng phần trên

“nọc tiêu”. Nhiều khi trong mùa mưa bệnh cũng gây thối chùm hoa và chùm quả

(Đoàn Nhân Ái, 2007).

Bệnh chết nhanh là nguyên nhân gây suy thoái vườn tiêu ở nhiều địa phương

như: Cam Lộ- Quảng Trị, Chư Sê - Gia Lai, Xuân Lộc - Đồng Nai, Phú Quốc - Kiên

Giang ...Các vùng tiêu từ Đà Nẵng trở vào thường biểu hiện chết nhanh rõ nhất vào

cuối tháng 12 đầu tháng giêng ( lúc kết thúc mùa mưa chuyển sang mùa khô), các

tỉnh từ đèo Hải Vân trở ra biểu hiện của bệnh lại rõ hơn ở cuối tháng tháng 4 đầu

tháng năm - khi gió mùa đông bắc không còn gây mưa ở vùng này (Cục Bảo vệ Thực

vật, 2007).

Nguyên nhân gây bệnh chết nhanh.

Có nhiều công trình nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh chết nhanh và đi đến

thống nhất bệnh do nấm Phytophthora gây ra. Những nghiên cứu mới nhất của

trường Đại học tổng hợp Sydney trong khuôn khổ của dự án ACIAR đã cho thấy có

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

tới 3 loài nấm Phytophthora tham gia gây triệu chứng chết nhanh: Phytophthora

capsici, P. nicotianae, P.cinnamomi, trong đó loài nấm Phytophthora capsici là phổ

biến hơn ở tất cả các vùng trồng tiêu. Điều tra nghiên cứu tại Đắc Nông thì Viện

Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam cũng thu được kết quả tương tự. Bằng phương

pháp bẫy du động bào tử bằng cánh hoa hồng ( hoặc một số hoa có cánh hoa có

mầu ) đã phát hiện còn có sự tham gia của nấm Pythium - một loại nấm cùng họ

với nấm Phytophthora (Đoàn Nhân Ái, 2007)

Nguyễn Tăng Tôn (2005) cho rằng bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora

capsici là bệnh quan trọng nhất hiện nay trên cây tiêu ở Việt Nam. Ngoài ra

một số nấm gây bệnh khác như Fusarium sp., Pythium sp., Rhizoctonia solani

cũng là các tác nhân quan trọng góp phần gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu.

1.4.1.2 Bệnh chết chậm

Triệu chứng bệnh chết chậm

Bệnh chết chậm thường có triệu chứng vàng lá từ từ, nhiều khi cây hồ tiêu bị

bệnh 2 - 3 năm sau mới chết. Cây bị bệnh kém phát triển, năng suất thấp. Bộ rễ cây

thường bị hủy hoại. Tùy thuộc vào từng vùng mà trên rễ có biểu hiện thâm đen, khó

khăn trong việc cung cấp nước và dinh dưỡng. Quan sát thấy trên rễ có nhiều mụn

u sưng, vết thâm đen trên rễ do tập đoàn tuyến trùng gây ra. Gốc thân, cổ rễ bị

thâm đen, thối khô. Các bó mạch trong thân bị chuyển mầu thâm đen. Trong điều

kiện mùa khô rệp sáp gây hại trên rễ cũng gây triệu chứng héo vàng. Nhiều địa

phương mối cũng tham gia gây hại. Triệu chứng chết chậm biểu hiện rõ ràng cả

trong mùa khô và trong mùa mưa. Rõ ràng bệnh chết chậm hay hiện tượng vàng lá

chết dây từ từ là một hội chứng rất phức tạp. Đây là hội chứng phức hợp do nhiều

nguyên nhân gây ra (Đoàn Nhân Ái, 2007).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Tác nhân gây bệnh chết chậm

Thu thập mẫu bệnh ở nhiều địa phương khác nhau mà chủ yếu tại Quảng Trị,

Đắc Nông thì Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam ghi nhận có nhiều tác nhân

tham gia: Tuyến trùng vùng rễ, rệp sáp, mối, nấm Fusarium sp.Nhiều mẫu bệnh

thu thập tại các tỉnh trồng tiêu còn có sự hiện diện của cả nấm Phytophthora và

Pythium. Phân tích bộ rễ cây sau khi trồng còn ghi nhận sự hiện diện của tập

đoàn tuyến trùng tuyến trùng mà đặc biệt là tuyến trùng u sưng (Ngô Thị Xuyên,

2002).

1.4.1.3 Bệnh virus hại hồ tiêu

Bệnh vi rút trên hồ tiêu được biết đến với tên gọi “ tiêu điên”. Cây mới bị bệnh

trên lá có triệu chứng khảm hay còn gọi là hoa lá, lá nhỏ lại và cây phát triển còi cọc.

Giai đoạn cuối, các đốt thân sưng lên và các đốt xít gần nhau, nhiều khi gây hiện

tượng “nổ đốt - tháo đốt” . Bệnh gây hại làm cho vườn tiêu phát triển chậm, dần dần

tàn lụi và giảm năng suất rõ rệt (Cục Bảo vệ Thực vật, 2007).

1.4.2 Biện pháp phòng trừ

1.4.2.1 Biện pháp canh tác

Làm đất: Đất là nơi lưu tồn của nhiều mầm bệnh khác nhau, do đó đất trở thành

nguồn dự trữ, tích lũy và lây lan mầm bệnh. Khi cày bừa đất chúng ta đã thay đổi lý

tính, cấu trúc, nhiệt độ và ẩm độ trong đất từ đó thay đổi môi trường sống của các tác

nhân bệnh. Ngoài ra việc cày đất còn giúp vùi các tác nhân gây bệnh xuống dưới sâu

làm chúng khó hoặc không thể phát triển bình thường.

Luân canh: Luân canh giúp chúng ta cắt đứt nguồn lương thực của một số tác

nhân gây bệnh chuyên tính, nhờ đó giảm bớt mật số mầm bệnh. Luân canh còn giúp

những cây trồng lạ tiết ra những chất ức chế mầm bệnh của cây trồng trước đó, ngoài

ra các chất từ rễ cũng giúp kích thích các vi sinh vất đối kháng (Phạm Văn Kim và

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

ctv, 2000).

Xen canh: Việc trồng xen canh dẫn đến giảm mật độ ký chủ trên đơn vị diện tích,

giảm thiểu sự tiếp xúc giữa các rễ cùng loại cây với nhau, từ đó hạn chế các mẩm

bệnh lây lan qua rễ cũng như đất, thường phân bố không đều và ở dạng lưu tồn, khi

chúng chuyển sang dạng hoạt động và gây hại do sự tiếp xúc của cây ký chủ, hoặc do

các chất kích thích tiết ra từ rễ cây ký chủ. Do đó việc xen canh làm giảm đáng kể

tình trạng kích thích này, mầm bệnh dưới dạng tồn lưu chứ không gây hại (Phạm

Văn Kim và ctv, 2000).

Sử dụng giống kháng

Nghiên cứu chọn tạo ra các giống tiêu có khả năng chịu tốt với các tác nhân

bệnh.

1.4.2.2 Biện pháp hóa học

Có thể phòng trị bệnh vùng rễ bằng thuốc hóa học như khử đất bằng Kitazin

10H. khi có bệnh mới xuất hiện có thể xịt một số loại thuốc thường dùng sau: Copper

B, Kitazin 50ND hoặc Validacin. Tuy nhiên việc xử lý đất bằng phương pháp hóa

học thường rất tốn kém và lâu dài sẽ ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái (Phạm Văn

Biên, 1989).

1.4.2.3 Biện Pháp sinh học

Trong đất, nấm gây bệnh thường được khống chế bởi một số vi sinh vật đối

kháng như Trichoderma sp, Gliocladium sp, vi khuẩn Pseudomonas sp, Bacillus sp.

Do đó việc tao môi trường đất cân đối bằng kỹ thuật nông học đam bảo cho sự tồn tại

và khống chế lẫn nhau của các vi sinh vật đối kháng và vi sinh vật gây bệnh, tránh sự

bộc phát bệnh là hướng nghiên cứu mang nhiều kết quả tốt đẹp (Phạm Văn Biên,

1989).

1.4.2.4 Biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM)

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Biện pháp ICM cho cây tiêu bao gồm việc sử sụng giống ít bị nhiễm bệnh, hom

giống tốt, phát hiện và phòng trừ dịch hại kịp thời, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực

vật thân thiện với môi trường và áp dụng đúng kỹ thuật, khuyến cáo sản xuất nông

nghiệp tốt (GAP) như bồi dưỡng đất, dùng cây họ đậu làm cây che phủ nhằm tạo môi

trường đất tốt và cây tiêu khỏe, giúp cây chống chịu với dịch hại và điều kiện bất lợi

từ môi trường (Tôn Nữ Tuấn Nam, 2007).

1. 5 Một số nấm bệnh hại trong đất

1.5.1 Phytophthora

1.5.1.1 Vị trí và phân loại

Tên của giống nấm bệnh Phytophthora có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp (Phyto có

nghĩa là thực vật; phthora có nghĩa là vật phá hoại ). Phytophthora infestans còn được

biết như loài nấm gây nên nạn mất mùa khoai tây ở Ailen. Nó đã phá hoại trên diện

rộng những vụ mùa chính của khoai tây trong suốt hai năm 1845 và 1846. Căn bệnh

này đã gây nên tác hại nghiêm trọng về kinh tế và xã hội cho đất nước này, đó là nạn

đói và sự ra đi của hai triệu cư dân. Sau đó vài thập kỷ nó lại gây nên một cuộc tranh

cải lớn về bệnh tàn lụi muộn, Anton de Bary cũng như Rev. Miles Joseph Berkeley

trước đó đã khẳng định: giống nấm này có thể là nguyên nhân chính gây nên bệnh tàn

lụi muộn. Và cho đến năm 1876 nó có tên là Phytophthora infestans (Bary). Bệnh

Phytophthora đã được nghiên cứu sâu ở châu Âu. Tuy nhiên đây lại là bệnh khá phổ

biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều bệnh nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây

ăn quả quan trọng ở những vùng này: như bệnh thối rễ, thối lỡ cổ rễ, loét thân, tàn lụi

lá và thối trái (Ngô Vĩnh Viễn, 2003).

Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn thuộc lớp Oomycetes, có mặt khắp

mọi nơi trên thế giới và có hơn 1.000 cây kí chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở

thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi Phytophthora cinnamomi được tìm thấy ở

vùng nhiệt đới thì Phytophthora palmivora, Phytophthora. parasitica và Phytophthora

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

citrophthora là đặc trưng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; Phytophthora infestans,

Phytophthora syringae và Phytophthora fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới.

➢ Ngành : Chromista

➢ Lớp : Oomycetes

➢ Bộ : Peronosporales

➢ Họ: Pythiaceae

➢ Giống: Phytophthora

1.5.1.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Ta có thể xác định một số loài Phytophthora thông qua một số đặc điểm hình

thái sau (A. Drenth và B. Sendall, 2004):

Túi bào tử

• Hình thái túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, chiều rộng,…), hệ gai

của túi, tính rụng sớm của chúng.

• Chiều dài của cuống trên túi bào tử.

• Sự tăng sinh của túi bào tử.

• Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó túi bào tử sinh ra.

Một số loài Phytophthora tạo ra bào tử ngay trên môi trường Agar, trong khi

nhiều loài khác cần dược nuôi cấy trong nước, dung dịch muối khoáng và dịch trích từ

đất pha loãng trước khi chúng tạo ra bào tử. Điều quan trọng hơn là sự tạo ra bào tử

trên Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.13 Hình ảnh chu kỳ sống của Phytophthora

Khi Phytophthora được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, khuẩn ty

(Mycelium) của nó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướt chúng tạo ra những bào

tử vô tính được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặc túi bào tử động (Zoosporangia).

Túi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hoặc khi nhiệt độ môi trường

giảm. Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoospores) với hệ lông roi không đều

nhau (Heterokont flagella). Những bào tử động sau khi được phóng thích sẽ bơi lội

hàng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn tròn hay kết kén. Sau một thời gian

chúng hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này, bào tử được gọi là kén hay nang (Cyst).

Bào tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng hình cầu hay oval, là một cấu trúc nghỉ vô

tính. Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực (Antheridium - bộ phận sinh sản đực)

và túi noãn ( Oogonium - bộ phận sinh sản cái). Quá trình giảm phân hình thành nên túi

giao tử đực và túi noãn.

Đây chỉ là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn

lưỡng bội đóng vai trò quyết định trong suốt chu kì sống của chúng. Các vòi thụ tinh từ

túi giao tử đực sẽ thoát vị đưa nhân của giao tử đực vào noãn. Hợp tử sau khi được thụ

tinh sẽ nảy mầm ở điều kiện thích hợp tùy thuộc vào sự kết hợp của trứng với một hay

nhiều ống giao tử đực. Giống Phytophthora bao gồm một số loài nấm dị tản

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

(Heterothallic) chẳng hạn như P.infestans. Số còn lại là những loài nấm đồng tản

(Homothallic) bao gồm cả P. sojae hoặc P. porri (Nguyễn Thân, 2004).

1.5.1.3 Nấm Phytophthora gây bệnh cây trồng

Theo Kularatne (2002), các bệnh quan trọng nhất trên cây tiêu gồm bệnh chết

nhanh do Phytophthora. Đối với bệnh chết nhanh do nấm Phytophthora sp. là tác

nhân gây bệnh chính. Bệnh chết nhanh trước tiên được ghi nhận là do nấm

Phytophthora palmivora, nhưng sau đó nấm được đặt lại tên Phytophthora palmivora

MF4 (Tsao et al., 1985). Tên nấm bệnh được Alizadeh and Tsao (1985) đã xác định

lại chủng Phytophthora palmivora MF4 phân lập từ cây ca cao và hồ tiêu với tên

Phytophthora capsici, theo nghĩa rộng, và cuối cùng là Phytophthora capsici sensu

lato (Tsao and Alizadeh, 1988).

Việc làm cỏ trong vườn tiêu bị bệnh sẽ làm phát tán bệnh nhanh hơn

(Manohara và cộng sự, 2002), và nấm gây bệnh có thể tồn tại 20 tuần trong đất ở độ

thủy dung 100%. Bệnh thối rễ chết nhanh do P. capsici gây thất thoát sản lượng từ 5–

10 % hàng năm ở Mã Lai.

Ngoài ra Ở Việt Nam tình hình bệnh do phyhtopthora diễn biến rất phức tạp

trên những loại cây trồng khác.

Bệnh tàn lụi lá trên cây cà chua và khoai tây Được nghiên cứu ở vùng đồng

bằng sông Hồng trong những năm 1960. Tác nhân gây bệnh là Phytophthora

infestans. Bệnh xuất hiện hàng năm từ tháng 12 đến tháng 3 khi điều kiện khí hậu

lạnh và ẩm; gây mất mùa 30 – 70%, trong trường hợp xấu bệnh gây mất mùa toàn bộ

(Vũ, 1973).

Ở Khoai sọ bệnh tàn lụi lá gây ra bởi Phytophthora colocasiae được xem là

bệnh chính trên khoai sọ ở Bắc Việt Nam.

Bệnh thối nõn ở dứa là một trong những bệnh chính gây mất năng suất dứa.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Bệnh được tìm thấy ở tất cả các vùng trồng dứa trên khắp đất nước gồm Thừa Thiên

Huế, Nghệ An, Hà Tây, Bắc Giang, Thanh Hóa và Ninh Bình. Tác nhân gây bệnh là

Phytophthora cinnamomi và Phytophthora nicotianae, điều này được chứng minh bởi

các thí nghiệm trong nhà kính được kiểm soát tại Viện BVTV quốc gia ở Hà Nội năm

2001.

Phytophthora citrophthora được báo cáo đầu tiên trên cam ở đồng bằng sông

Cửu Long trong những năm 1950 và không được theo dõi mãi đến những năm 1970,

khi bệnh có mặt ở tất cả các vùng trồng cam quýt, như vùng Thanh Trà ở Thừa Thiên

Huế, Ninh Bình ở Tiền Giang. Phytophthora citrophthora tấn công thân và quả, với

các biểu hiện triệu chứng, làm chảy nhựa và thối quả.

Phytophthora palmivora là tác nhân gây bệnh ở sầu riêng, bao gồm thối rễ, loét

thân, thối trái và rụng lá. Nó được tìm thấy trong tất cả các vùng trồng sầu riêng ở

những vùng cả miền Nam và miền Trung Việt Nam.

Bệnh đốm đen trên cây mận đã làm giảm lượng thu hoạch một cách đáng kể ở

tỉnh Bắc Hà và Mộc Châu. Phytophthora cactorum được nhận biết là tác nhân gây

bệnh.

Trong những năm 1960, bắt đầu có những nghiên cứu quan tâm đến bệnh trên

cao su ở Việt Nam. 19 bệnh ảnh hưởng đến cao su ở Việt Nam, rụng lá, sọc đen và

loét thân gây ra bởi các loài Phytophthora. Phytophthora palmivora được phân lập từ

khoảng 70% cây cao su bị bệnh sọc đen, trong khi Phytophthora botryosa được tìm

thấy trên 75 – 80% từ lá và trái của những cây cao su bị rụng lá. Cả hai loài

Phytophthora palmivora và Phytophthora botryosa được biết là tác nhân gây bệnh

trên cao su ở tất cả các vùng trồng trên đất nước (Đang Vu Thi Thanh và cộng sự,

2004).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

1.5.2 Fusarium sp

1.5.2.1 Vị trí phân loại

Chi Fusarium là một chi nấm có số lượng loài đã được mô tả đặc biệt lớn,

trên một nghìn loài, nhưng cũng là một chi nấm mà số lượng loài đến nay còn được

chấp hận so với số lượng loài đã được mô tả nói trên chiếm một tỉ lệ rất nhỏ: trên dưới

1% hoặc 3-4% tùy các tác giả khác nhau. Nguyên nhân do khả năng biến dị rất cao của

các chủng thuộc chi Fusarium trên các cơ chất tự nhiên. Những nghiên cứu về phân

loại học chi Fusarium từ đầu thế kỷ này, đặc biệt từ những năm 1950 trở lại đây đã

có những đổi mới như kỹ thuật nuôi cấy đơn BT, các kỹ thuật hiển vi khác được cải

tiến, trước hết là các đặc điểm phân loại của mỗi loài đã được nghiên cứu có hệ

thống và do đó đã có những giới hạn cho những đặc điểm đó khá rõ rệt (Lại Văn Ê,

2003).

Theo Nguyễn Lân Dũng ( 1979) phân loại Fusarium như sau:

Giới: Mycetae (fungi)

Ngành: Eumycota

Ngành phụ: Deuteromycotina (The imperfect fungi)

Lớp: Hyphomycetes

Bộ: Hyphales (Moniliales)

Họ: Hypocreaceae

Chi: Fusarium

1955: Bilai đề nghị một hệ thống gồm 26 loài tập hợp trong 9 nhóm loài.

1977: Bilai bổ sung vào chi này thêm 5 loài nữa.

1971: Booth bổ sung thêm các đặc điểm của bộ máy mang bào tử trần của

nhiều loài và căn cứ vào đặc điểm này cùng với các đặc điểm hình thái và nuôi cấy

khác, đã đề nghị 12 nhóm loài với 44 loài và được chấp nhận hoặc mô tả mới của chi

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Fusarium.

Về chi Fusarium ở 3 nước Đông Dương, Bugnicourt (1939) đã phát hiện và

mô tả 29 loài và thứ ký sinh trên 112 loài cây Hạt kín và 3 loài côn trùng. Các loài và

thứ này đã được kiểm tra lại và đựợc xác định là thuộc 11 loài và thứ còn giá trị, 18

nhóm phân loại khác đã trở thành các tên đồng nghĩa (Bùi Xuân Đồng, 1986). Sau

Burnicourt, một số loài và thứ khác thuộc chi Fusarium đã được phát hiện và mô tả.

1.5.2.2 Đặc điểm hình thái , cấu trúc của Fusarium

Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển

màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Ở nấm

Fusarium lỗ ở chính giữa vách ngăn lớn hơn so với các lỗ khác.Thường sinh trưởng rất

nhanh, có màu trắng, hồng vàng, tím và thỉnh thoảng xuất hiện màu lục.

Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử

đính lớn (Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và BT vách dày (hậu BT -

Chlamydospores). BT đính lớn, thường nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh

ra từ cuống BT. Đầu và cuối BT lớn thuôn nhọn. Một vài loài BT lớn tách rời và

không gắn trên cuống BT, những tế bào sinh BT lớn gọi là thể bình (phialide).

Tiểu BT đính thường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được

sinh ra từ một thể bình hay những cuống BT phân nhánh hoặc không phân nhánh.

BT đính nhỏ thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu BT đính của Fusarium

rất giống BT của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường được qui vào nấm

Cephalosporium (Đỗ Tấn Dũng, 1996).

BT vách dày hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen

giữa các sợi nấm giả. Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra

và mọc các ống mầm nếu BT gặp điều kiện thuận lợi. Hậu BT hay BT vách dày rất

bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài (Trương Duy Lâm, 2006).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

1.5.2.3 Nấm Fusarium gây bệnh cho cây trồng ở việt nam

Nấm Fusarium là một trong những loài nấm gây thiệt hại về kinh tế quan trọng

nhất.Fusarium gồm nhiều loài khác nhau có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng

khác nhau. Nhiều loài sản sinh ra độc tố có độc tính cao, có ảnh hưởng đến động vật

hoang dã, thú nuôi và con người. Tuy nhiên có nhiều loài nấm Fusarium là nấm hoại

sinh phổ biến trong đất.Nấm này phân bố khắp các nơi trên thế giới, một vài loài có xu

hướng xuất hiện khắp nơi trong khi một số loài chủ yếu xuất hiện ở nhiệt đới, bán nhiệt

đới, ôn đới .

Thối bắp ngô, chủ yếu do Fusarium graminearum và Fusarium verticillioides

gây ra, ngày càng trở nên nghiêm trọng ở Việt Nam. Cả hai loài đều sản sinh độc tố

nấm tồn tại trong hạt

Hình 1.14 Bệnh Héo Fusarium trên cây chuối do Fusarium oxysporum

f.cubensesp. (Burgess LW và cộng sự, 2008) (a) các triệu chứng héo trầm

trọng, (b) triệu trứng nứt thân, (c) hóa nâu mạch dẫn. Héo Fusarium trên cẩm

chướng do F.oxysporum f.callistephisp. (d) héo trầm trọng gây chết cây, (e)

thân héo với nhiều khối bào tử phân sinh màu trắng trên bề mặt.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Bệnh héo vàng là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại cho cây trồng ở

nước ta, bệnh phổ biến ở hầu hết các vùng trồng cây khoai tây, cà chua, đậu đỗ. Hầu

hết các loài gây héo nằm trong nhóm Fusarium oxysporum complex. Nhóm Fusarium

oxysporum complex có rất nhiều dạng chuyên hóa khác nhau, mỗi nhóm gây hại trên

một nhóm kí chủ nhất định.

Một số dạng Fusarium solani gây thối cổ rễ cây con họ đậu như đậu Hà Lan,

đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trưởng thành. Các dạng khác có thể gây hại ở khu vực

gốc thân cây lớn, như cây vải, bị yếu đi do yếu tố môi trường làm stress và do các bệnh

khác.

Fusarium decemcellulare đã được phân lập từ cành nhãn bị thối ở miền bắc Việt

Nam (L. Burgess, thông tin chưa xuất bản) và từ cà phê ở Tỉnh Đắc Lắc (TS. Trần Kim

Loang, giao tiếp riêng).

Danh mục này chưa phải là đầy đủ và còn nhiều loài khác có thể có mặt ở Việt

Nam

1.5.3 Rhizoctonia solani

1.5.3.1 Vị trí và phân loại

Nấm Rhizoctonia là một nhóm nấm lớn, đa dạng và phức tạp, phân bố khá

rộng và được chia thành nhiều nhóm nấm khác nhau. Giai đoạn hữu tính liên quan

đến 3 giống: Thanatephorus (giai đoạn vô tính là Rhizoctonia solani Kuhn),

Ceratobasidium (giai đoạn vô tính là loài Rhizoctonia hai nhân), và Waitea (giai đoạn

vô tính là loài R. zeae Voorhees, R. oryzae Ryker và Gooch và những loài khác)

(Carling và Sumner, 1992).

Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp nấm bất toàn

Fungi imperfecti. Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus cucumeris

(Frank) Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, là nấm kí sinh không chuyên tính,

có phổ kí chủ rộng.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

1.5.3.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Ở giai đoạn vô tính, nấm phát triển ở dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn

non không màu, khi già chuyển sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa

bào, có đường kính từ 8 - 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh hơi

thắt lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1998).

Rhizoctonia solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm

phân nhánh (lobate hyphae), và các tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Phan

Minh Sang, 2003).

Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điểm của hạch rất thay

đổi. Hạch nấm khi còn non có màu trắng nhưng khi về già có thể có màu nâu, nâu đen,

nâu xám, trên vỏ có lông. Hạch nấm có hình dạng phức tạp, ít khi hình cầu, đáy phẳng,

bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976). Đường kính hạch nấm từ

1- 6 mm. Từng hạch nấm có thể liên kết lại với nhau tạo thành hạch nấm to (Ou,

1983). Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng khi già nổi lên do tế

bào phía ngoài hạch trở nên rỗng (dẫn theo Phạm Minh Sang, 2003).

Bào tử hậu ít gặp, chỉ phát sinh khi có ẩm độ rất cao. Sinh sản hữu tính tạo

đảm đơn bào, không màu, hình bầu dục, có từ 2 - 4 bào tử đảm, hình trứng hoặc hình

bầu dục dẹt. Ở nước ta chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1998). Bào tử đảm không có khả năng tồn tại lâu nhưng có vai trò lớn trong sự

biến đổi di truyền của nấm (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005).

1.5.3.3 Nấm Rhizoctonia gây hại cho cây trồng

Nấm Rhizoctonia solani phổ biến ở nhiều nơi và có thể gây bệnh cho trên

180 loại cây thuộc 60 họ thực vật khác nhau (Đường Hồng Dật, 1976). Quốc gia nào

cũng có bệnh do nấm này gây ra. Ngoài cây lúa, nấm còn gây bệnh trên lúa miến,

bắp, mía, đậu nành, đậu xanh. Nấm còn gây bệnh lở cổ rễ trên cà phê, trà, héo rũ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

dưa chuột và bầu bí, gây lở cổ rễ hại bông, héo vàng trên khoai tây (dẫn theo Nguyễn

Việt Long, 2001).

Bệnh héo rủ cây con, thối rễ, thối thân hay loét thân ở giai đoạn cây con hoặc

trưởng thành. Ngoài ra, nấm Rhizoctonia solani còn là nguyên nhân gây bệnh trên

một số cơ quan khác của cây như thối trái cà chua, khô lá hoặc những đốm đặc biệt

trên lá ở gần mặt đất (Agrios, 1997).

Haque (1975) đã phát hiện ra đậu phộng (Arachis hypoaea), ớt (Capcicum

annum), cà rốt (Daucus carota), đậu nành (Glycine max), bông vải (Gossypium sp.),

đại mạch (Hordeum vulgar), xà lách (Lactuca savita), lúa (Oryzae sativa), bắp (Zea

mays), cà chua (Lycopersicum esculentum) đều nhiễm R. solani (dẫn theo Hồ Viết

Thế, 2005).

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1998), nấm Rhizoctonia solani là loại

nấm bán ký sinh, có tính chuyên hóa rộng, phạm vi ký chủ bao gồm trên 180 loài

cây trồng khác nhau.

Ở Việt Nam, đậu nành, bắp, lúa miến (Shorgum vulgare), mía, và 27 loài cỏ

dại khác ở đồng bằng sông Cửu Long đều là ký chủ của nấm Rhizoctonia solani.

Trong khi đó ở Mỹ, có khoảng 550 loài ký chủ của nấm Rhizoctonia solani đã được

ghi nhận (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.15 Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra (a) triệu chứng nhọn như đầu

mác ở rễ bệnh, (b) bệnh khô vằn trên lúa, (c) hạch nấm trên bắp cải bị bệnh,

(d) bệnh trên vỏ ngô (Burgess LW và cộng sự, 2008).

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài: 03/03 đến 21/07/2015.

Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh

học, Thực phẩm và Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Tp.HCM.

2.2 Thiết bị dụng cụ vật liệu

Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

- Máy đo quang phổ UV-Vis 2550

- Máy ly tâm Universal 320

- Nồi hấp khử trùng (Autoclave)

- Máy lắc

- Kính hiển vi quang học

- Cân phân tích

- Tủ lạnh Toshiba

Dụng cụ

- Erlen 250 ml

- Đĩa petri

- Ống nghiệm

- Cốc thủy tinh 50ml, 100ml, 600ml, 1000ml.

- Ống đong 50ml, 100ml,

- Falcon

- Eppendorf

- Que cấy

- Đũa thủy tinh

- Bông thấm nước, bông không thấm nước (Bạch tuyến, Bảo thạch)

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

- Bao nhựa, dây thun, giấy báo

- Micropipet 1000µl, 100µl và đầu tuýp.

- Đèn cồn.

Hóa chất:

- D-Glucose

- CMC

- Chitin huyền phù

- NaNO3

- K2HPO4

- MgSO4

- MgSO4.7H2O

- NH4NO3

- MnSO4

- ZnSO4

- KCl

- FeSO4

- Agar

- Nước cất

- Cồn 700, 960

2.3 Vật liệu

2.3.1 Vi sinh vật nghiên cứu

Các chủng Trichoderma được phân lập từ đất vườn hồ tiêu lấy ở xã Xuân Đường,

huyện Cẩm Mỹ tỉnh Đồng Nai

Các chủng nấm bệnh Rhizoctonia solani, Fusarium sp gây bệnh héo trên cây bắp

và hai chủng Phytophthora spp (Phytophthora sp1 gây bệnh trên cây hồ tiêu và

Phytophthora sp2 gây bệnh trên cây ca cao) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Nghệ Sinh Học trường Hutech.

2.3.2 Môi trường

• Môi trường WA

Agar: 20g

Nước cất: 1000ml

• Môi trường ½ Potato D-glucose agar ( ½ PDA)

Nước chiết khoai tây : 100ml

10 g Glucose :

20 g Agar :

1000ml Nước cất :

PH = 5,5-6,0.

khử trùng 1atm/15 phút

• Môi trường Potato D-glucose agar ( PDA)

200ml Nước chiết khoai tây :

20 g Glucose :

20 g Agar :

1000ml Nước cất :

PH = 5,5-6,0.

khử trùng 1atm/15 phút

• Môi trường xác định hoạt tính chitinase

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

0,5 g NH4NO3

0,5 g MgSO4.7H2O

0,7 g K2HPO4

0,3 g KH2PO4

0,01 g FeSO4.7H2O

0,001 g ZnSO4

Cloramphenicol 0,005 g

Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít.

pH: 6-7

• Môi trường xác định hoạt tính cellulase

0,5 g NH4NO3

0,5 g MgSO4.7H2O

0,7 g K2HPO4

0,3 g KH2PO4

0,01 g FeSO4.7H2O

0,001 g ZnSO4

Cloramphenicol 0,005 g

CMC 1%

Nước cất định mức đến 1000ml

pH: 6-7

2.4 Phương pháp nghiên cứu

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

2.4.1 Phân lập nấm Trichoderma trên đất hồ tiêu

2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000).

Phân lập các chủng nấm ở Đồng Nai từ các mẫu đất.

Đối vối mẫu đất thì dùng dao vô trùng gạt bỏ lớp đất mặt và lấy mẫu đất ở độ sâu từ 5-

10cm. Các mẫu sau khi lấy xong thì được phân lập ngay trong vòng 24 giờ

2.4.1.2 phương pháp pha loãng mẫu

Cân 10 g mẫu đất,( đã nghiền nhỏ ) cho vào bình tam giác, cho thêm vào bình

90 ml nước muối sinh lý vô trùng và cho vào máy lắc 200 vòng / phút lắc 20 phút, thu lấy dịch lọc ta có độ pha loãng 10 -1 .

Lắc đều rồi hút 1ml dịch 10-1 cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước muối sinh lý vô trùng ta được dung dịch pha loảng 10-2 . Tiếp tục pha loãng như thế cho đến nồng

độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6

Dùng pipet hút 0,1 ml dịch lọc ở các nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6 nhỏ lên đĩa petri có chứa môi trường PDA. Dùng que cấy trang dàn đều khắp bề mặt thạch, giữ

nguyên que trang tiếp tục trang lên đĩa 2 và 3. Lật ngược đĩa lại rồi gói bằng giấy báo

và nuôi ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày.

Tách các khuẩn lạc riêng rẽ, cấy chuyền cho đến khi đạt độ thuần khiết thì cấy

chuyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm tiếp theo.

2.4.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm

2.4.2.1 Quan sát đại thể nấm

Quan sát đại thể nấm bằng cách tạo khuẩn lạc khổng lồ, cách tiến hành như sau:

- Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ các ống giống thạch nghiêng cho vào ống

nghiệm đựng 5 ml nước cất vô trùng , lắc đều tạo dung dịch huyền phù

- Dùng que cấy móc nhúng vào dịch huyền phu rồi nhanh chóng chấm một điểm

vào giữa đĩa petri có chứa môi trường PDA .

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 ngày để tạo khuẩn lạc khổng lồ, hàng ngày

lấy ra quan sát và mô tả các điểm sau:

+ Tốc độ phát triển của khuẩn lạc (đo đường kính của khuẩn lạc).

+ Hình dạng, kích thước

+ Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc (cả mặt trái và mặt phải).

+ Giọt tiết, sắc tố tiết vào môi trường (Nguyễn Thành Đạt và cộng sự, 2000).

2.4.2.2 Quan sát vi thể nấm

❖ Phương pháp phòng ẩm

Chuẩn bị các đĩa petri có chứa môi trường PDA thật mỏng ( khoảng 1mm ) Dùng

khoan nút chai khoan các thỏi thạch có đường kính 8 mm

Đặt một miếng thạch mỏng có kích thước 8 mm lên một miếng lam vô trùng. Cấy

nấm vào xung quanh của miếng thạch, đậy lamen lên. Cho miếng lam vào giữa đĩa

petri có sẵn một miếng giấy lọc hoặc bông đã được làm ẩm bằng nước cất vô trùng.

Đậy nắp đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày.

Sau 2 - 3 ngày, lấy lam kính ra, khẽ gỡ lá kính, nhỏ vào một giọt lactophenol và

quan sát hình thái nấm bằng kính hiển vi ở vật kính 40 và 100 về các đặc điểm như

– Khuẩn ty: hình dáng, màu sắc, vách ngăn, sự phân nhánh.

– Đặc điểm cơ quan sinh bào tử: cuống sinh bào tử, thể bình và bào tử.

❖ Phương pháp lamen nghiêng

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Cấy các chủng nấm váo các đĩa petri có chứa môi trường PDA sau đó, lấy một tấm lamen vô trùng đặt nghiêng một góc 30 – 45oC so với bề mặt thạch, nuôi ở nhiệt độ phòng 2- 3 ngày.

Sau 2-3 ngày lấy lá kính ra nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái

nấm sợi bằng kính hiển vi ở vật kính x40 và x100 về các đặc điểm như trên. (Nguyễn

Lân Dũng và cộng sự, 1978).

2.4.3 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase).

(Tô Duy Khương, 2007)

❖ Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự phân giải cơ chất chitin và cellulose bởi enzyme

chitinase và cellulase. Cơ chất bị phân giải tạo ra các đường khử. Các đường này

không cho phản ứng màu với lugol.

Vì vậy có thể khảo sát khả năng sinh enzyme Cellulase và Chitinase của các chủng

nấm khi nuôi cấy chúng trên môi trường có nguồn cơ chất cacbon duy nhất lần lượt là

CMC và huyền phù chitin. Khả năng sinh enzyme chitinase và cellulase của các chủng

nấm được đánh giá dựa vào đường kính vòng phân giải chitin và cellulose sau khi

nhuộm màu với thuốc thử lugol.

❖ Tiến hành:

– Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm: Cấy điểm các chủng nấm thí nghiệm lên môi

trường PDA và ủ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 7 ngày.

– Chuẩn bị môi trường: Pha nấu môi trường sinh cảm ứng rồi hấp khả trùng và đổ

đĩa, để nguội để tiến hành cấy nấm

Dùng khoan thạch hình trụ đục một miếng thạch (từ đĩa môi trường PGA đã nuôi

cấy nấm thí nghiệm) đặt lên tâm đĩa môi trường khảo sát hoạt tính có chứa 1% cơ chất

(CMC, huyền phù chitin) và ủ trong thời gian 2 ngày.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Sau 2 ngày, nhuộm màu môi trường bằng cách đổ dung dịch lugol vào đĩa thí

nghiệm để yên 5 phút, rửa lại bằng nước cất và tiến hành đo đường kính vòng phân

giải.

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri.

2.4.4 Đánh giá tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh

(Fokkema, 1976).

❖ Chuẩn bị nguồn nấm

Đĩa nấm Trichoderma gốc: Cấy điểm các chủng Trichoderma cần khảo sát vào

giữa đĩa thạch PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn đối kháng nấm bệnh.

Đĩa nấm bệnh gốc: Cấy điểm các chủng nấm bệnh cần khảo sát vào giữa đĩa thạch

PGA ủ ở nhiệt độ phòng (7 ngày) làm nguồn thử khả năng bị ức chế bởi nấm

Trichoderma

❖ Thí nghiệm đối kháng trực tiếp

Đĩa đối kháng: Dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch

có chứa nấm bệnh từ đĩa nuôi cấy nấm bệnh gốc, đặt khoanh thạch cách mép đĩa môi

trường PGA là 1cm. Sau 2 ngày cấy nấm bệnh. Tiến hành tương tự khoan lấy 1 khoanh

thạch có chứa nấm Trichoderma trên đĩa Trichoderma gốc, đặt vào đĩa có chứa nấm

bệnh, cách mép đĩa petri 1cm nhưng ở phía đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa thạch.

Đĩa đối chứng: Lấy khoanh thạch nấm bệnh, đường kính 5mm đặt tương tự trên đĩa

môi trường PGA cách mép đĩa petri 1cm và không cấy nấm Trichoderma sp.

Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Quan sát ghi nhận kết

quả sau 3, 5, 7 ngày nuôi cấy.

Tính tóa khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh cây trồng

Phần trăm ức chế nấm bệnh được tính theo công thức:

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

PIMG = (R1 – R2)/ R1 x 100

(%)

Đĩa đối chứng Đĩa đối kháng

Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp: R1: tản nấm bệnh trên đĩa đối chứng; R2:

tản nấm bệnh trên đĩa đối kháng cấy chung với nấm Trichoderma; T: tản nấm

Trichoderma trên đĩa đối kháng

R1: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối chứng khi không có cấy

Trichoderma (mm).

R2: đường kính tản nấm bệnh phát triển trong đĩa đối kháng khi có cấy Trichoderma

(mm).

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê.

-Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập nấm Trichoderma từ đất hồ tiêu.

Từ các mẫu đất hồ tiêu bị bệnh sinh viên đã phân lập được 8 mẫu nấm (TT1, TT2,

TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8) thuộc chi Trichoderma bằng phương pháp cấy trang

và cấy ria mẫu đất tiêu bị bệnh. Hình thái được xác định đến chi dựa trên khóa phân

loại của các tác giả Robert A. Samson, Allen S.Heekstra, Jens C.Frisvad ( 2004) và Bùi

Xuân Đồng (2000). Đặc điểm hình thái của các chủng nấm này được mô tả như sau:

3.2 Đặc điểm của các chủng nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu

Dựa vào đặc điểm hình thái của các chủng nấm, sinh viên tạm chia chúng thành 2

nhóm. Nhóm 1 gồm các chủng TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, TT8.

❖ Đặc điểm của các mẫu nấm Trichoderma thuộc nhóm 1

Đại thể: Tơ nấm dạng bông, màu trắng, đan xen nhau dày đặc hướng dạng tia từ

tâm ra ngoài mép đĩa. Bào tử màu xanh xuất hiện đan xen trong lớp tơ dày và đường

1 T T

2 T T

kính đạt từ 60 đến 80 mm vào ngày thứ 2. Đường kính tản nấm sau 3 ngày đạt 90 mm

5 T T

6 T T

7 T T

8 T T

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.1 Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, TT8 sau 3 và 5 ngày.

Đặc điểm vi thể:

Sợi nấm có vách ngăn. Cành bào tử phân nhánh nhiều. Bào tử đính có hình cầu,

vách trơn láng.

TT1

TT2

TT5

TT6

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

TT7

TT8

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.2 Hình ảnh sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT1, TT2, TT5, TT6, TT7, T2.

❖ Đặc điểm của các mẫu nấm Trichoderma thuộc nhóm 2

Đại thể: Bào tử màu xanh lục, mặt sau không màu, mép khuẩn lạc mịn có màu

trắng do tơ nấm phân bố nhiều ở phần này. Bào tử xanh nhạt xuất hiện, lan rộng và

đường kính đạt 60 đến 80 mm vào ngày thứ 2. Đến ngày thứ 3 tơ nấm lan rộng kín đĩa

petri đường kính 90mm.

3 T T

4 T T

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.3 Hình thái mặt trước và mặt sau theo thứ tự của nấm TT3, TT4 sau 3 và 5 ngày.

Vi thể: Sợi nấm có vách ngăn. Cành bào tử không phân nhánh. Bào tử đính có hình

cầu, màu xanh nhạt và mọc dày đặc thành khối cầu lớn trên cành bào tử, vách trơn

TT3

láng.

Hình 3.4 Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT3

TT4

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.5 Sợi nấm và cành sinh bào tử theo thứ tự của nấm TT4

3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của 8 chủng

nấm Trichoderma phân lập được trên đất hồ tiêu bị bệnh.

3.3.1 Khả năng sinh enzyme chitinase

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào chitinase của 8 chủng Trichoderma trên

môi trường khảo sát hoạt tính enzyme có bổ sung 1% chitin.

Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải Chitin của 8 chủng nấm Trichoderma spp sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm)

Đường kính vòng phân giải

CHỦNG Chitin (cm) sau 2 ngày nuôi

cấy

TT1 3,07b ±0,11

TT2 3,33ab ± 0,42

TT3 3,26ab ± 0,11

TT4 3,20ab ± 0,20

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

TT5 3,33ab ± 0,23

TT6 3,60a ± 0,20

TT7 3,33ab ± 0,42

TT8 3,53ab ± 0,12

Kết quả ở bảng trên cho thấy, cả 8 chủng nấm Trichoderma sp đều có khả năng

sinh enzyme chitinase ngoại bào tạo vòng phân giải. Theo Gary J. Samuels (2004) đây

là các enzyme phân giải vách tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với nấm

Trichoderma. Vòng phân giải biến động không nhiều, trong khoảng 3,07 đến 3,6 trong

đó chủng TT6 lớn nhất và nhỏ nhất là TT1.

Bên cạnh đó đường kính vòng phân giải Chitin khá lớn của các chủng nấm

Trichoderma cũng cho thấy triển vọng trong phòng trừ nấm bệnh gây hại cây trồng.

Do đó, sinh viên tiếp tục sử dụng 8 chủng nấm Trichoderma sp để nghiên cứu khảo

TT2

TT1

TT4

TT3

TT5

TT6

TT8

TT7

sát khả năng đối kháng với một số nấm bệnh gây hại cây trồng.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.6 Hình ảnh vòng phân giải Chitin của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được.

3.3.2 Khả năng sinh enzyme Cellulase

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase của 8 chủng Trichoderma trên

môi trường khảo sát hoạt tính enzyme có bổ sung 1% CMC.

Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải Cellulose chủa 8 chủng nấm Trichoderma sau hai ngày nuôi cấy. (đơn vị: cm)

Đường kính vòng phân giải

CHỦNG CMC (cm) sau 2 ngày nuôi

cấy

TT1 4,53b ± 0,23

TT2 4,53b ± 0,12

TT3 3,93c ± 0,12

TT4 5,13a ± 0,23

TT5 4,93ab ± 0,31

TT6 4,53b ± 0,31

TT7 4,47b ± 0,5

TT8 3,53c ± 0,31

Kết quả ở bảng trên cho thấy, cả 8 chủng nấm Trichoderma sp đều có khả năng

sinh enzyme Cellulase ngoại bào mạnh tạo vòng phân giải lớn, biến động trong khoảng

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

3,53 đến 5,13cm, vòng phân giải CMC mạnh nhất thuộc về chủng TT4 và thấp nhất là

chủng TT3.

Kích thước vòng phân giải CMC sau 2 ngày nuôi cấy cho thấy khả năng sinh

cellulase của các chủng nấm Trichoderma spp khá tốt cho thấy tiềm năng ứng dụng

trong phòng trừ nấm Phytophthora là rất cao. Do Phytophthora có một lớp vách được

TT1

TT2

TT3

TT4

TT5

TT7

TT6

TT8 2

cấu tạo chủ yếu bằng cellulose (Sophien kamoun và cộng sự, 1998).

Hình 3.7 Hình ảnh vòng phân giải CMC của các chủng nấm Trichoderma sp phân lập được.

3.4 Đánh giá khả năng đối kháng với các chủng nấm bệnh trong đất và đất hồ tiêu

của các chủng Trichoderma phân lập được.

Thí nghiệm đối kháng trực tiếp 8 chủng Trichoderma phân lập được với các chủng

nấm bệnh trong đất được cung cấp bởi phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường

Hutech là: Chủng nấm Phytophthora sp1 gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu,

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Phytophthora sp2 gây bệnh trên cây ca cao, nấm Fusarium sp. gây bệnh trên cây bắp

và Rhizoctonia solani.

Các thí nghiệm được bố trí trên môi trường PDA, kết quả được trình bày như sau:

3.4.1 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1.

Bảng 3.3 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp1 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy.

CHỦNG Tỉ lệ đối kháng (%) với Phytophthora sp1 của các chủng

Trichoderma spp ở các ngày sau cấy.

NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7

TT1 35,00NS ± 0,00 85,09NS ± 25,83 89,58ab ± 18,04

TT2 31,19NS ± 7,84 68,20NS ± 16,54 100,00a ± 0,00a

TT3 29,52NS ± 5,07 64,74NS ± 7,75 78,92ab ± 18,26

TT4 31,11NS ± 5,36 76,01NS ± 21,07 100,00a ± 0,00

TT5 29,44NS ± 4,19 83,09NS ± 24,49 100,00a ± 0,00

TT6 32,86NS ± 3,71 85,09NS ± 25,83 88,19ab ± 20,45

TT7 31,03NS ± 6,61 89,75NS ± 13,10 93,33a ± 11,55

TT8 37,70NS ± 2,52 63,77NS ± 2,84 69.83b ± 1,88

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Đặc điểm nấm bệnh Phytophthora sp1 bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày.

Số liệu ở Bảng 3.3 cho thấy, cả 8 chủng nấm Trichoderma spp khảo sát đều có khả

năng kháng nấm Phytophthora sp1 gây chết nhanh cây hồ tiêu. Các tỉ lệ đối kháng ở

các chủng không khác nhau ở thời điểm 3 và 5 ngày nuôi cấy. Sợi nấm Trichoderma

phát triển nhanh, tiếp xúc với sợi nấm bệnh và ngăn nấm bệnh phát triển sang vùng

chúng đã mọc và tỉ lệ đối kháng chỉ khoảng 29,51 đến 37,7 % ở ngày thứ ba sau nuôi

cấy. Sau đó tăng lên 63,77 đến 89,75% vào ngày thứ 5 sau nuôi cấy, ở thời điểm này

các nấm Trichoderma spp đã mọc kín các vùng thạch còn trống, một số đã mọc đè lên

tảng nấm bệnh. Ngày thứ 7 sau nuôi cấy tỉ, lệ đối kháng các chủng đã đạt đến 69-

100%, và có sự khác biệt rõ giữa các chủng khảo sát. Ba chủng TT4, TT5 và TT7 thể

hiện khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp1 rất tốt và có thể ức chế từ 93-100%

loài nấm hại này. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả khảo sát khả năng sinh

enzyme ngoại bào được trình bày ở các phần trên. Vì các chủng này vừa có khả năng

sinh enzyme cellulose cao nhưng cũng có khả năng sinh Chitinase tốt.

1 T T

2 T T

3 T T

4 T T

C Đ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

5 T T

6 T T

7 T T

8 T T

C Đ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.8 Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng.

3.4.2 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2

Bảng 3.4 Khả năng đối kháng với nấm Phytophthora sp2 của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy.

Tỉ lệ đối kháng (%) với Phytophthora sp2 của các chủng

Trichoderma spp

CHỦNG NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7

TT1 33,33NS ± 5,77 85,34 NS ± 9,71 93,33 ab ± 11,55

TT2 35 NS 73,71NS ± 13,16 100 a ± 13,16

TT3 29,44 NS ± 419 64,34 NS ± 3,53 78,28bc ± 9,54

TT4 30,11 NS ± 5 79,17 NS ± 19,09 100 a

TT5 30NS ± 5 87,25 NS ± 17,35 100 a

TT6 35,48 NS ± 242 84,75 NS ±21,63 86,84abc ± 22,79

TT7 31,67 NS ± 7,64 85,37 NS ± 9,71 94,29ab ± 9,1

TT8 37,07 NS ± 1,79 64,43 NS ± 1,72 72,5c ± 6,5

Đặc điểm nấm bệnh Phytophthora sp2 bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày.

Tương tự như khả năng đối kháng nấm aPhytophthora sp1, các chủng khảo sát đều

kháng tốt với nấm Phytophthora sp2 gây thối quả ca cao.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Ở các ngày đầu (3 đến 5 ngày sau cấy) các chủng đã tiêu diệt được 30 đến 87%

nấm Phytophthora sp2 nhưng chưa có sự khác biệt rõ về khả năng đối kháng của các

chủng.

Tỉ lệ đối kháng đạt trên 90% ở các chủng TT1, TT2, TT4, TT5 và TT7 vào ngày thứ 7.

Các chủng Trichoderma spp đã đối kháng, làm cho nấm bệnh tàn lụi gần như hoàn

toàn.

1 T T

2 T T

3 T T

4 T T

C Đ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

5 T T

6 T T

7 T T

8 T T

C Đ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.9 Hình ảnh đối kháng với Phytophthora sp2 của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng.

3.4.3 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani

Bảng 3.5 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy.

Tỉ lệ đối kháng (%) với Rhizoctonia solani của các chủng

Trichoderma spp

CHỦNG NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7

TT1 91,11 a ± 15,40 91,95ab ± 13,94 93,33ab ± 11,55

TT2 86,67 a ± 23,10 91,67ab ± 14,43 93,33ab ± 11,55

TT3 100,00 a ± 0,00 100,00 a ± 0,00 100,00 a ± 0,00

TT4 41,11b ± 8,39 79,21b ± 4,17 82,86b ± 2,86

TT5 100,00 a ± 0,00 92,22ab ± 13,47 93,33ab ± 11,46

TT6 78,47 a ± 18,67 89,81ab ± 9,04 100,00 a ± 0,00

TT7 100,00 a ± 0,00 94,25ab ± 9,95 95,24ab ± 8,25

TT8 78,47 a ± 18,67 88,49ab ± 9,99 90,47ab ± 8,25

Đặc điểm nấm bệnh Rhizoctonia solani bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày

Các chủng nấm khảo sát đều có khả năng đối kháng rất tốt với nấm Rhizoctonia

solani. Chỉ sau ba ngày nuôi cấy các chủng nấm Trichoderma spp (trừ chủng TT4 chỉ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

đối kháng 41,11% nấm Rhizoctonia solani) đã tiêu diệt từ 78 đến 100% nấm

Rhizoctonia solani. Có thể thấy tơ nấm Trichoderma mọc nhanh và lan sang phần tơ

nấm bệnh ức chế sự phát triển của nấm bệnh. Đến bảy ngày sau cấy, các chủng này đã

kìm hãm >90% nấm Rhizoctonia solani, riêng chủng TT4 tuy hiệu lực chậm nhưng đến

bảy ngày sau cấy cũng kìm hãm đến 82,86% nấm Rhizoctonia solani. Ở thời điểm này

nấm bệnh đã ngừng phát triển và bị lụi tàn gần như hoàn toàn.

Như vậy, các chủng nấm Trichoderma spp đều đối kháng tốt với nấm

Rhizoctonia solani. (Tỉ lệ đối kháng lớn hơn 82,86%)

1 T T

2 T T

3 T T

4 T T

C Đ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

5 T T

6 T T

7 T T

8 T T

C Đ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.10 Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia solani của 8 chủng nấm Trichoderma spp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng.

3.4.4 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp.

Bảng 3.6 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp của các chủng Trichoderma spp sau 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy.

Tỉ lệ đối kháng (%) với Fusarium sp của các chủng

Trichoderma spp

CHỦNG NGÀY 3 NGÀY 5 NGÀY 7

TT1 35,91ab ± 4,99 81,92ab ± 16,03 100a

TT2 21,69b ± 17,81 66,72bc ± 6,22 92,91 a ± 12,29

TT3 32,10ab ± 4,67 67,55bc ± 0,88 71,44bc ± 6,31

TT4 25,98ab ± 3,06 63,02c ± 2,46 62,03c ± 5,44

TT5 37,74ab ± 11,42 85,53 a ± 12,99 87,95ab ± 11,83

TT6 31,86ab ± 5,94 81,97ab ± 7,81 100a

TT7 37,99ab ± 2,97 68,55abc ± 4,77 84,57ab ± 13,49

TT8 39,70a ± 12,74 82,27ab ± 16,14 90 a ± 17,32

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Đặc điểm nấm bệnh Fusarium sp. bị ức chế theo thời gian 3, 5 và 7 ngày.

Số liệu ở Bảng 3.6 cho thấy, cũng như đối kháng với các loài nấm bệnh khác, các

chủng nấm Trichoderma spp khảo sát đều đối kháng tốt với nấm Fusarium sp. Ở 3

ngảy sau nhiễm, các chủng nấm có thể ức chế từ 21 đến 39,7% nấm Fusarium sp, tơ

nấm Trichoderma phát triển nhanh tiếp xúc đồng thời ngăn không cho nấm bệnh phát

triển sang vùng chúng đã mọc và đến 5 ngày tỉ lệ ức chế lên đến khoảng 63 đến 82%.

Bảy ngày sau cấy, TT1, TT2, TT6 và TT8 ức chế >90% nấm bệnh. Chủng TT7 và TT5

ức chế 84,57 đến 87,95% nấm Fusarium và thấp nhất là chủng TT4, chỉ ức chế 62,03%

nấm Fusarium sp.

1 T T

2 T T

3 T T

4 T T

C Đ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

5 T T

6 T T

7 T T

8 T T

1 T T

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.11 Hình ảnh đối kháng với Rhizoctonia sp của 8 chủng nấm Trichoderma sp theo thứ tự TT1, TT2, TT3, TT4, TT5, TT6, TT7, TT8 và đối chứng.

Khảo sát đều đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani. Các chủng TT1, TT2,

TT6, TT8 đối kháng rất Fusarium sp.

Điều này mở ra triển vọng cho việc nghiên cứu nhân nuôi các chủng nấm này,

bổ sung vào đất để quản lý các chủng na6m1ga6y bệnh côn trùng.

Các chủng Trichoderma spp khảo sát đều có khả năng ức chế tốt với các loài

nấm bệnh trong đất như Phytophthora sp1 gây hại cây hồ tiêu, Phytopthora sp2 gây

thối quả ca cao, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia sp gây bệnh héo trên cây bắp.

Với nhóm nấm Phytophthora sp1 và Phytophthora sp2, các chủng TT2, TT4,

TT5, TT7 có khả năng đối kháng tốt nhất

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận

– Đã phân lập được 8 chủng nấm Trichoderma spp từ đất hồ tiêu tại Đồng Nai có

khả năng sinh trưởng mạnh.

– Các chủng Trichoerma spp phân lập từ đất hồ tiêu có khả năng sinh enzyme

Chitinase và Cellulase khá tốt.

– Các chủng nấm Trichoderma spp phân lập có khả năng đối kháng với các bệnh

có trong đất như Phytophthora spp, Rhizoctonia solani, Fusarium sp.

– Các chủng TT2, TT4, TT5, TT7 đối đối kháng rất tốt nấm Phytophthora spp

– Tất cả các chủng đều đối kháng rất tốt nấm Rhizoctonia solani.

– Các chủng TT1, TT2, TT6, TT8 đối kháng tốt với nấm Fusarium sp.

4.2 Kiến Nghị:

– Tiếp tục khảo sát khả năng đối kháng của các chủng có triển vọng với các loài

nấm bệnh trong điều kiện invivo.

– Định danh các loài nấm Trichoderma spp phân lập được.

– Nghiên cứu khả năng nhân nuôi tạo chế phẩm từ các chùng nấm để trừ bệnh hại

trong đất.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƯỚC

1. Đoàn Nhân Ái (2007). Một số nguyên tắc phòng trừ bệnh chết nhanh trên cây tiêu,

Diễn Đàn khuyến nông @ công nghệ lần thứ 5, chuyên đề các giải pháp kỹ thuật nâng

cao năng suất, chất lượng và giá trị hồ tiêu.

2. Phạm Văn Biên (1989). Phòng trừ sâu bệnh hại tiêu, Nhà xuất bản nông nghiệp, 72

trang.

3. Phạm Văn Biên, Nguyễn Văn Tá, Mai Thị Vinh, Trần Minh Tú, Nghiêm Bảo Tuấn

(1990). Kết quả nghiên cứu sâu bệnh hại tiêu (Piper nigrum), Tạp chí nông nghiệp và

công nghiệp thực phẩm, số 339, tr 544-548.

4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000). Vi sinh vật học (tập

1,2), NXB Đại học và Trung học Chuyên nghiệp, Hà Nội.

5. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương,

Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

học (tập3), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước,

Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976). Một số phương pháp

nghiên cứu vi sinh vật học ( tập 2 & 3), NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

7. Đỗ Tấn Dũng (1996). Kết quả nghiên cứu phạm vi ký chủ của nấm Fusarium sp hại

trên một số giống cây trồng, cây cảnh và cỏ dại vùng Hà Nội năm 1996, Kết quả

nghiên cứu khoa học Khoa Trồng trọt, đại học nông nghiệp I. Nhà xuất bản nông

nghiệp Hà Nội.

8. Nguyễn Văn Đĩnh, Đỗ Tấn Dũng và Hà Quang Hùng (2004). Giáo trình biện

pháp sinh học trong bảo vệ thực vật, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

9. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000). Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục.

10. Lại Văn Ê (2003). Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ sinh

học nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani Kühn gây bệnh chết cây con trên

bông vải (Gossypium hirsutum L.), Luận văn thạc sĩ, khoa Nông Nghiệp, Đại Học Cần

Thơ.

11. Huỳnh Văn Hiếu (2009). Nghiên cứu sử dụng nấm sợi Aspergillus sp. và

Trichoderma sp. xử lý bã khoai mì để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh, Đại Học Bách

Khoa TpHCM: TpHCM.

12. Trần Nguyên Ha (2010). Using Trichoderma species for biologycal control of

plans pathogens in Viet Nam, Issaas.

13. Phạm Văn Kim (2000). Các nguyên lý bệnh hại cây trồng, Tài liệu học tập ngành

Nông Học và Trồng Trọt.

14. Trương Duy Lâm (2006). Như những đóa hồng. Tạp chí hoa cảnh số 10/ 2006.

15. Hứa Võ Thành Long (2010). Sản xuất bào tử nấm Trichoderma. sp làm thuốc trừ

nấm bệnh cây trồng, Đại Học Công Nghệ Tp.HCM.

16. Tôn Nữ Tuấn Nam (2007). Một số giải pháp kỹ thuật để phát triển sản xuất hồ tiêu

bền vững vùng Tây Nguyên, Diễn Đàn khuyến nông @ công nghệ lần thứ 5, chyên đề

các giải pháp kỹ thuật nâng cao năng suất, chất lượng và giá trị hồ tiêu.

17. Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với

Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúc và bắp, Đại học Nông

Lâm Tp.HCM: Tp.HCM.

18. Tôn Nữ Tuấn Nam (2007). Một số giải pháp kỹ thuật để phát triển sản xuất hồ tiêu

bền vững vùng Tây Nguyên, Diễn Đàn khuyến nông @ công nghệ lần thứ 5, chyên đề

các giải pháp kỹ thuật nâng cao năng suất, chất lượng và giá trị hồ tiêu.

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

19. Huỳnh Văn Phục (2006). Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với

Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúc và bắp, Đại học Nông

Lâm Tp.HCM: Tp.HCM.

20. Nguyễn Phạm Phương Thảo (2009). Vi nấm Trichoderma-giải pháp bảo vệ thực

vật bằng đấu tranh sinh học, Đại Học Sư Phạm Huế: Tp Huế.

21. Nguyễn Văn Tuất (2004). Nghiên cứu sản xuất xử dụng thuốc trừ sâu sinh học đa

chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật công nghệ sinh học, Bộ khoa học và

công nghệ Hà Nội.

22. Trần Thị Thanh Thuần (2009). Nghiên cứu xử lý vỏ cà phê bằng Trichoderma

viride và Aspergillus niger để sản xuất phân bón hữu cơ bán tổng hợp, Bách khoa

TPHCM.

23. Vũ Nguyên Thành (2009). Nghiên cứu khả năng đối kháng và tiềm năng ứng dụng

của một số chủng Trichoderma phân lập từ RNM trên một số nấm bệnh thực vật, Đại

Học Sư Phạm Hà Nội.

24. Nguyễn Thân (2004). Tuyển chọn một số dòng nấm Trichoderma sp. đối kháng với

nấm Phytophthora sp. gây bệnh chết nhanh cây hồ tiêu và bệnh xì mủ cây sầu riêng,

Luận án thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh.

25. Ngô Vĩnh Viễn, Bùi Văn Tuấn, Mai Thị Liên, Đặng Lưu Hoa, F. Benyon, và A.

Denth (2003). Kết quả điều tra bệnh thối nõn dứa do nấm Phytophthora gây ra, Hội

thảo quốc gia bệnh cây và sinh học phân tử, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội.

26.Cục Bảo vệ Thực vật (2007). Báo cáo tình hình sản xuất hồ tiêu và ảnh hưởng của

các loại dịch hại quan trọng tới sản xuất tại Việt Nam, Hội thảo sâu bệnh hại tiêu và

biện pháp phòng trừ Đắc Nông.

27.Ngô Thị Xuyên (2002). Kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne bằng phương pháp sinh

học. Hội thảo bệnh cây và sinh học phân tử, lần thứ nhất, Đại học Nông lâm TP. Hồ

ĐỐ ÁN TỐT NGHIỆP

Chí Minh, Nhà xuất bản Nông nghiệp.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

28. Chacón Mariola R. (2007). Microscopic and transcriptome analyses of early

colonization of tomato roots by Trichoderma harzianum, international microbiology.

29. Francesco Vinale (2008). Trichoderma–plant–pathogen interactions, Soil Biology

& Biochemistry.

30. Fokkema N. J. (1993). Oppurtunities and problems of control of foliar pathogens

with microorganisms, Pestic Sci, 37, 411-416.

31. Harman G. E., et al (2004) Trichoderma species--opportunistic, avirulent plant

symbionts, Nat Rev Microbiol.

32. Kularatne (2002). Pests and diseases of black pepper (Piper nigrum L.), in Sri

Lanka, Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper, Sarawak,

Malaysia.

33. Mark Schubert and Siegfried Fink (2008) In vitro screening of an antagonistic

Trichoderma strain against wood decay fungi. Arboricultural.

34. Sophien kamoun, et al (1998). Resistance of Nicotiana benthamiana to

Phytophthora infestans is Mediated by the Recognition of the Elicitor Protein INF1,

American Soclety of Plant Physlologlsts.

TÀI LIỆU INTERNET

35. http://explow.com/Trichoderma

36. https://vi.wikipedia.org/wiki/Hồ_tiêu

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU

Kết quả xử lý vòng phân giải Chitin

Summary Statistics for chitin

CHUNG Count Average

Standard deviation 0.11547 3.06667 3.33333 0.416333

3 3

Coeff. of variation 3.76533% 12.49%

Minimu m 3.0 3.0

Maximu m 3.2 3.8

Rang e 0.2 0.8

Stnd. skewness 1.22474 0.914531

C1 C2

3.26667 3.2 3.33333

0.11547 0.2 0.23094

3 3 3

3.5348% 6.25% 6.9282%

3.2 3.0 3.2

3.4 3.4 3.6

0.2 0.4 0.4

1.22474 0.0 1.22474

C3 C4 C5

3.6

0.2

3.33333 0.416333 3.53333 0.11547 3.33333 0.268112

3 3 3 24

5.55556% 12.49% 3.26802% 8.04336%

3.4 3.0 3.4 3.0

3.8 3.8 3.6 3.8

0.4 0.8 0.2 0.8

0.0 0.914531 -1.22474 0.875023

C6 C7 TR2 Total

F-Ratio 1.35

P-Value 0.2918

Sum of Squares Df Mean Square 7 0.613333 16 1.04 23 1.65333

Homogeneous Groups X XX XX XX XX XX X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

3.06667 3.2 3.26667 3.33333 3.33333 3.33333 3.53333 3.6

ANOVA Table for chitin by CHUNG Source 0.087619 Between groups 0.065 Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for chitin by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C1 C4 C3 C7 C5 C2 TR2 C6

Kết quả xử lý vòng phân giải CMC

Summary Statistics for CMC Average Count CHUNG

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd.

3 3 3 3 3 3 3 3 24

4.53333 4.53333 3.93333 5.13333 4.93333 4.53333 4.46667 3.53333 4.45

0.23094 0.11547 0.11547 0.23094 0.305505 0.305505 0.503322 0.305505 0.544538

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total

5.09427% 2.54713% 2.93568% 4.49883% 6.19267% 6.73908% 11.2684% 8.64637% 12.2368%

4.4 4.4 3.8 5.0 4.6 4.2 4.0 3.2 3.2

4.8 4.6 4.0 5.4 5.2 4.8 5.0 3.8 5.4

skewness 1.22474 -1.22474 -1.22474 1.22474 -0.6613 -0.6613 0.41407 -0.6613 -0.800171

0.4 0.2 0.2 0.4 0.6 0.6 1.0 0.6 2.2

F-Ratio 9.41

P-Value 0.0001

Homogeneous Groups X X X X X X XX X

ANOVA Table for CMC by CHUNG Sum of Squares Df Mean Square Source 0.78381 7 5.48667 Between groups 0.0833333 16 1.33333 Within groups 23 6.82 Total (Corr.) Multiple Range Tests for CMC by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG TR2 C3 C7 C6 C2 C1 C5 C4

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

3.53333 3.93333 4.46667 4.53333 4.53333 4.53333 4.93333 5.13333

Đối kháng với Phytophthora sp1

• Ba ngày

3 3 3 3 3 3 3 3 24

35.0 31.19 29.5233 31.11 29.4433 32.8567 31.0333 37.7 32.2321

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness 35.0 0.0 25.0 7.83571 25.0 5.0677 25.0 5.35689 25.0 4.19281 28.57 3.71236 25.0 6.61085 35.0 2.52389 25.0 4.95615

0.944998 0.577409 -1.0922 -0.415015 -1.22474 0.485219 -0.491632 -0.426266

0.0% 25.1225% 17.1651% 17.2192% 14.2403% 11.2987% 21.3024% 6.69466% 15.3765%

35.0 40.0 35.0 35.0 33.33 35.0 38.1 40.0 40.0

0.0 15.0 10.0 10.0 8.33 6.43 13.1 5.0 15.0

Sum of Squares Df Mean Square 7 170.538 16 394.422 23 564.96

24.3626 24.6514

F-Ratio 0.99

P-Value 0.4734

Homogeneous Groups X X X X X X X X

Summary Statistics for DKPHYTOPH3 CHUNG Count Average C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total ANOVA Table for DKPHYTOPH3 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKPHYTOPH3 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C5 C3 C7 C4 C2 C6 C1 TR2

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

29.4433 29.5233 31.0333 31.11 31.19 32.8567 35.0 37.7

• Năm ngày

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness 55.26 25.8307 55.26 16.5436 60.0 7.74969 60.53 21.0662 55.0 24.4925 55.26 25.8307 75.0 13.0951 60.53 2.83645 55.0 18.6331

44.74 -1.22474 31.58 0.966185 13.68 1.2183 39.47 1.07564 45.0 -1.1495 44.74 -1.22474 25.0 5.26 45.0

30.358% 24.2575% 11.9711% 27.7151% 29.4783% 30.358% 14.5901% 4.4477% 24.2094%

100.0 86.84 73.68 100.0 100.0 100.0 100.0 65.79 100.0

-0.965375 -1.11873 0.444709

3 3 3 3 3 3 3 3 24

F-Ratio 0.87

P-Value 0.5496

Sum of Squares Df Mean Square 7 2202.69 16 5782.78 23 7985.47

314.669 361.424

Homogeneous Groups X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

63.7733 64.7367 68.2 76.01 83.0867 85.0867 85.0867 89.7533

Summary Statistics for DKPHYTOPH5 CHUNG Count Average 85.0867 C1 68.2 C2 64.7367 C3 76.01 C4 83.0867 C5 85.0867 C6 89.7533 C7 63.7733 TR2 76.9667 Total ANOVA Table for DKPHYTOPH5 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKPHYTOPH5 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG TR2 C3 C2 C4 C5 C6 C1 C7

• Bảy ngày

0.0

0.0 0.0

3 3 3 3 3 3 3 3 24

20.1401% 0.0% 23.1416% 0.0% 0.0% 23.1874% 12.3718% 2.68695% 16.3206%

89.5833 18.0422 100.0 78.9167 18.2626 100.0 100.0 88.1933 20.4497 93.3333 11.547 69.8333 1.87639 89.9825 14.6857

31.25 -1.22474 0.0 1.22242 32.0 0.0 0.0 35.42 -1.22474 -1.22474 20.0 3.25 1.22474 35.42 -1.67808

68.75 100.0 68.0 100.0 100.0 64.58 80.0 68.75 64.58

100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 72.0 100.0

Sum of Squares Df Mean Square 7 2532.24 16 2428.18 23 4960.42

P-Value 0.0712

F-Ratio 2.38

361.749 151.761

Summary Statistics for DKPHYTOPH7 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total ANOVA Table for DKPHYTOPH7 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKPHYTOPH7 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG

Homogeneous Groups

Count Mean

X XX XX XX X X X X

TR2 C3 C6 C1 C7 C5 C4 C2

3 3 3 3 3 3 3 3

69.8333 78.9167 88.1933 89.5833 93.3333 100.0 100.0 100.0

Đối kháng với Phytophthora sp2

• Ba ngày

3 3 3 3 3 3 3 3 24

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness 30.0 5.7735 35.0 0.0 25.0 4.19281 25.0 5.00363 25.0 5.0 33.33 2.42046 25.0 7.63763 35.0 1.78979 25.0 4.71362

1.22474 -0.415015 -0.139635 0.0 0.602332 0.6613 -1.22474 -0.631288

17.3205% 0.0% 14.2403% 16.6178% 16.6667% 6.82269% 24.1188% 4.82856% 14.3874%

40.0 35.0 33.33 35.0 35.0 38.1 40.0 38.1 40.0

10.0 0.0 8.33 10.0 10.0 4.77 15.0 3.1 15.0

Sum of Squares Df Mean Square 7 174.329 16 336.689 23 511.018

24.9042 21.0431

F-Ratio 1.18

P-Value 0.3654

Homogeneous Groups X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

29.4433 30.0 30.11 31.6667 33.3333 35.0 35.4767 37.0667

Summary Statistics for DKPHYTOPH3 CHUNG Count Average 33.3333 C1 35.0 C2 29.4433 C3 30.11 C4 30.0 C5 35.4767 C6 31.6667 C7 37.0667 TR2 32.7621 Total ANOVA Table for DKPHYTOPH3 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKPHYTOPH3 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C3 C5 C4 C7 C1 C2 C6 TR2

• Năm ngày

Summary Statistics for DKPHYTOPH5 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum C1 C2

85.3667 9.71416 13.1551 73.71

11.3793% 17.8471%

75.0 60.53

94.26 86.84

3 3

Range 19.26 26.31

Stnd. skewness -0.471505 -0.0120939

6.97 37.5 32.5 40.0 19.26 3.29 40.0

-0.571278 0.6613 -1.0756 -1.12841 -0.471505 -0.939727 0.543057

60.53 62.5 67.5 60.0 75.0 62.5 60.0

67.5 100.0 100.0 100.0 94.26 65.79 100.0

3 3 3 3 3 3 24

5.4879% 24.1188% 19.88% 25.5191% 11.3793% 2.66564% 18.7229%

64.3433 3.5311 79.1667 19.0941 87.2533 17.346 84.7533 21.6283 85.3667 9.71416 64.43 1.71747 78.0487 14.613

F-Ratio 1.43

P-Value 0.2605

Sum of Squares Df Mean Square 7 1890.49 16 3020.91 23 4911.39

270.07 188.807

Homogeneous Groups X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

64.3433 64.43 73.71 79.1667 84.7533 85.3667 85.3667 87.2533

C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total ANOVA Table for DKPHYTOPH5 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKPHYTOPH5 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C3 TR2 C2 C4 C6 C7 C1 C5

• Bảy ngày

0.0 9.53704 0.0 0.0

3 3 3 3 3 3 3 3 24

100.0 100.0 86.84 100.0 100.0 100.0 100.0 80.0 100.0

80.0 100.0 68.0 100.0 100.0 60.53 82.86 68.75 60.53

12.3718% 0.0% 12.1832% 0.0% 0.0% 26.2404% 10.4954% 8.95888% 14.7389%

93.3333 11.547 100.0 78.28 100.0 100.0 86.8433 22.788 94.2867 9.89578 72.5 6.49519 90.6554 13.3616

-1.22474 20.0 0.0 18.84 -0.555203 0.0 0.0 39.47 -1.22474 17.14 -1.22474 11.25 1.22474 39.47 -2.06425

Sum of Squares Df Mean Square 7 2338.87 16 1767.39 23 4106.26

P-Value 0.0316

F-Ratio 3.02

334.124 110.462

Homogeneous Groups X XX XXX XX

Summary Statistics for DKPHYTOPH7 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total ANOVA Table for DKPHYTOPH7 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKPHYTOPH7 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG TR2 C3 C6 C1

Count Mean 3 3 3 3

72.5 78.28 86.8433 93.3333

XX X X X

C7 C5 C4 C2

3 3 3 3

94.2867 100.0 100.0 100.0

Đối kháng với Rhizoctonia solani

• Ba ngày

0.0 8.39025 0.0

0.0

Stnd. skewness -1.22474 -1.22474 0.413597 1.20767 1.20767 -2.12097

3 3 3 3 3 3 3 3 24

100.0 100.0 100.0 50.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

73.33 60.0 100.0 33.33 100.0 66.67 100.0 66.67 33.33

16.9004% 26.6469% 0.0% 20.4093% 0.0% 23.7936% 0.0% 23.7936% 26.1791%

91.11 15.3979 86.6667 23.094 100.0 41.11 100.0 78.4733 18.6716 100.0 78.4733 18.6716 84.4792 22.1159

P-Value 0.0014

F-Ratio 6.07

1167.63 192.261

Homogeneous Groups X X X X X X X X

Count Mean 41.11 3 78.4733 3 78.4733 3 86.6667 3 91.11 3 100.0 3 100.0 3 100.0 3

Summary Statistics for DKRhi 3 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range 26.67 C1 40.0 C2 0.0 C3 16.67 C4 0.0 C5 33.33 C6 0.0 C7 33.33 TR2 66.67 Total ANOVA Table for DKRhi 3 by CHUNG Sum of Squares Df Mean Square Source 7 8173.4 Between groups 16 3076.17 Within groups 23 11249.6 Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKRhi 3 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C4 C6 TR2 C2 C1 C7 C3 C5

• Năm ngày

0.0

Summary Statistics for DKRhi5 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range 24.14 C1 25.0 C2 0.0 C3 8.33 C4 23.33 C5 17.24 C6

91.9533 13.9372 91.6667 14.4338 100.0 79.2133 4.16584 92.2233 13.4696 9.03876 89.81

15.1569% 15.7459% 0.0% 5.25902% 14.6054% 10.0643%

75.86 75.0 100.0 75.0 76.67 82.76

100.0 100.0 100.0 83.33 100.0 100.0

3 3 3 3 3 3

Stnd. skewness -1.22474 -1.22474 -0.0737968 -1.22474 0.971996

10.5604% 11.2845% 11.4328%

82.76 82.14 75.0

100.0 100.0 100.0

17.24 17.86 25.0

-1.22474 1.20521 -0.772849

3 3 24

94.2533 9.95352 88.49 9.98569 90.9513 10.3983

Sum of Squares Df Mean Square 7 723.17 16 1763.7 23 2486.87

103.31 110.231

F-Ratio 0.94

P-Value 0.5055

Homogeneous Groups X XX XX XX XX XX XX X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

79.2133 88.49 89.81 91.6667 91.9533 92.2233 94.2533 100.0

C7 TR2 Total ANOVA Table for DKRhi5 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Method: 95.0 percent LSD CHUNG C4 TR2 C6 C2 C1 C5 C7 C3

• Bảy ngày

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness 80.0 11.547 80.0 11.547 100.0 0.0 80.0 2.855 80.0 11.547 100.0 0.0 85.71 8.25034 85.71 8.25034 80.0 8.64411

-1.22474 20.0 -1.22474 20.0 0.0 -0.00371509 5.71 -1.22474 20.0 0.0 14.29 -1.22474 14.29 1.22474 -1.34867 20.0

12.3718% 12.3718% 0.0% 3.44571% 12.3718% 0.0% 8.66298% 9.11908% 9.23804%

100.0 100.0 100.0 85.71 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

3 3 3 3 3 3 3 3 24

Sum of Squares Df Mean Square 7 630.001 16 1088.57 23 1718.58

90.0002 68.0359

F-Ratio 1.32

P-Value 0.3021

Homogeneous Groups X XX XX XX XX XX X X

Summary Statistics for DKRhi7 CHUNG Count Average 93.3333 C1 93.3333 C2 100.0 C3 82.8567 C4 93.3333 C5 100.0 C6 95.2367 C7 90.4733 TR2 93.5708 Total ANOVA Table for DKRhi7 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DKRhi7 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C4 TR2 C1 C5 C2 C7 C6 C3

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

82.8567 90.4733 93.3333 93.3333 93.3333 95.2367 100.0 100.0

Đối kháng với Fusarium sp

• Ba ngày

Stnd. skewness 0.386952 0.685072 1.22474 0.914531 -0.869943 -1.22474 0.509806 -1.22474 -1.38118

3 3 3 3 3 3 3 3 24

9.93 34.93 8.09 5.88 22.06 10.29 5.89 22.06 40.81

41.18 41.18 37.5 29.41 47.06 35.29 41.18 47.06 47.06

31.25 6.25 29.41 23.53 25.0 25.0 35.29 25.0 6.25

13.9073% 82.1108% 14.5476% 11.7785% 30.2642% 18.647% 7.8321% 32.0761% 30.1563%

35.9067 4.99364 21.6933 17.8126 32.1067 4.67076 25.98 3.06005 37.7467 11.4237 5.94093 31.86 37.99 2.97542 39.7067 12.7363 32.8737 9.91351

Sum of Squares Df Mean Square 7 839.851 16 1420.54 23 2260.39

P-Value 0.2905

F-Ratio 1.35

119.979 88.7835

Homogeneous Groups X XX XX XX XX XX XX X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3

21.6933 25.98 31.86 32.1067 35.9067 37.7467 37.99 39.7067

Summary Statistics for KHANANGDOIKHANG% CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total ANOVA Table for KHANANGDOIKHANG% by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for KHANANGDOIKHANG% by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C2 C4 C6 C3 C1 C5 C7 TR2

• Năm ngày

-0.998398

30.56 0.975895 12.44 0.0272811 -0.0605789 1.75 0.977689 4.68 25.0 0.879198 13.87 -1.2127 9.06 31.58 0.72163 39.47 2.20586

81.92 16.0312 66.7233 6.22017 67.5533 0.875119 63.02 2.45567 85.5267 12.9589 81.9733 7.80565 68.55 4.76862 82.2667 16.1448 74.6917 12.0413

19.5693% 9.32233% 1.29545% 3.89665% 15.1518% 9.52219% 6.95641% 19.6249% 16.1213%

69.44 60.53 66.67 61.11 75.0 72.97 63.16 68.42 60.53

100.0 72.97 68.42 65.79 100.0 86.84 72.22 100.0 100.0

3 3 3 3 3 3 3 3 24

Summary Statistics for DOIKHANG 5 CHUNG Count Average Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total ANOVA Table for DOIKHANG 5 by CHUNG Source Between groups

Sum of Squares Df Mean Square 7 1705.34

P-Value 0.0704

F-Ratio 2.39

243.62

16 23

101.842

1629.48 3334.82

•

Homogeneous Groups X XX XX XXX XX XX XX X

Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DOIKHANG 5 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C4 C2 C3 C7 C1 C6 TR2 C5

Count Mean 63.02 3 66.7233 3 67.5533 3 68.55 3 81.92 3 81.9733 3 82.2667 3 85.5267 3

• Bảy ngày

3 3 3 3 3 3 3 3 24

100.0 92.9067 71.4367 62.03 87.9533 100.0 84.5733 90.0 86.1125

Standard deviation Coeff. of variation Minimum Maximum Range Stnd. skewness 0.0 12.286 6.31445 5.43745 11.8265 0.0 13.4887 17.3205 15.3633

0.0 21.28 -1.22474 11.22 1.21273 10.56 0.810994 23.64 0.121792 0.0 1.12078 25.0 -1.22474 30.0 -0.886921 42.5

0.0% 13.224% 8.83922% 8.76584% 13.4464% 0.0% 15.9492% 19.245% 17.8409%

100.0 78.72 67.5 57.5 76.36 100.0 75.0 70.0 57.5

100.0 100.0 78.72 68.06 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

Sum of Squares Df Mean Square 7 3744.31 16 1684.39 23 5428.7

534.901 105.275

F-Ratio 5.08

P-Value 0.0034

Homogeneous Groups X XX XX XX X X X X

Summary Statistics for DOIKHANG7 CHUNG Count Average C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 TR2 Total ANOVA Table for DOIKHANG7 by CHUNG Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for DOIKHANG7 by CHUNG Method: 95.0 percent LSD CHUNG C4 C3 C7 C5 TR2 C2 C6 C1

Count Mean 62.03 3 71.4367 3 84.5733 3 87.9533 3 90.0 3 92.9067 3 100.0 3 100.0 3

Đồ án tốt nghiệp: Phân lập các chủng nấm Trichoderma spp. từ đất hồ tiêu ở Đồng Nai và đánh giá khả năng đối kháng của chúng với các nấm gây bệnh trong đất

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH