Đồ án tốt nghiệp: Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ

VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN

TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP. TRONG

THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ NHỚ

MSSV: 1151110243 Lớp: 11DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài đồ án là do tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của cô CN. Đỗ Thị Tuyến. Tôi cam đoan các kết quả nghiên cứu

đưa ra trong luận án này dựa trên các kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề

tài, hoàn toàn trung thực không sao chép bất kì kết quả nghiên cứu nào của tác giả

khác. Nội dung trong đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các

nguồn sách hay công trình nghiên cứu khác đều được đều được trích dẫn rõ ràng và

liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo. Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá tôi

xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nhớ

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với Ban

Giám Hiệu cùng các thầy cô của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí

Minh, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường

đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập tại trường cũng như đã

tạo điều kiện cho tôi thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho công việc sau này.

Để hoàn thành tốt khóa luận này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô

CN. Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên và

tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt

Đới đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài.

Bên cạnh sự cố gắng hết mình của bản thân, tôi cũng thầm biết ơn sự ủng hộ,

quan tâm và động viên của gia đình, bạn bè – những người thân yêu luôn là chỗ dựa

vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua.

Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong

sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Sinh Học Nhiệt

Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nhớ

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

Danh mục các chữ viết tắt ............................................................................................ v

Danh mục các hình ...................................................................................................... vi

Danh mục các bảng ....................................................................................................vii

Danh mục các sơ đồ ................................................................................................. viii

Danh mục các đồ thị ................................................................................................. viii

Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1

1.2. Mục đích ................................................................................................................ 2

1.3. Yêu cầu .................................................................................................................. 2

1.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 2

1.5. Kết cấu của đồ án .................................................................................................. 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3

2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp. ........................................................................ 3

2.1.1. Phân loại ............................................................................................................. 3

2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus ....................................................................... 4

2.1.3. Khả năng tạo bào tử ........................................................................................... 4

2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản ........................ 6

2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp. ............ 7

2.2. Enzyme protease.................................................................................................... 8

2.2.1. Giới thiệu chung về protease.............................................................................. 8

2.2.2. Phân loại protease ............................................................................................. 10

2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật ................................................... 12

2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease ............. 13

2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease ......... 15

2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật.......................................................................... 16

2.3. Trùn quế ............................................................................................................... 17

2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế ................................................................. 17

2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế ......................................................................... 18

i

Đồ án tốt nghiệp

2.3.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế ........................................................................... 19

2.3.4. Sự sinh sản và phát triển .................................................................................. 20

2.3.5. Tác dụng của trùn quế ...................................................................................... 20

2.3.6. Bổ sung Trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi ............................................... 22

2.4. Chế phẩm probiotics ............................................................................................ 24

2.4.1. Định nghĩa về Probiotics .................................................................................. 24

2.4.2.Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản ............................................... 24

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................... 26

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................................... 26

3.2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................... 26

3.2.1. Vật liệu ............................................................................................................. 26

3.2.2. Hóa chất ............................................................................................................ 27

3.2.3. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 28

3.3. Môi trường phân lập, định danh và giữ giống .................................................... 28

3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 29

3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm ............................................................................. 29

3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp. .................................................................. 30

3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp. .......................................................................... 30

3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp ..................................................................... 30

3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp.. ............................................................................ 30

3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp. ........................................................................ 30

3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ......................... 31

3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa ............................... 31

3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram ........................................................................... 31

3.4.3.2. Test khả năng di động ................................................................................... 33

3.4.3.3. Test catalase .................................................................................................. 33

3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh Indol .................................................................. 34

3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR) ..................................................................... 35

3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường .......................................................... 36

ii

Đồ án tốt nghiệp

3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học ........................................................ 36

3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn .................................................................................. 36

3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease .............................. 37

3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease ..... 37

3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease ..................................... 38

3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế .................... 38

3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu .......................................................... 38

3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế ..................... 39

3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng

Nitơ tổng số) ............................................................................................................... 40

3.4.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson

cải tiến ......................................................................................................................... 41

3.4.5.5. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin ................................... 44

3.4.6. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease.................... 45

3.4.6.1. Xác định nhiệt độ tối ưu ................................................................................ 45

3.4.6.2. Xác định pH tối ưu ........................................................................................ 45

3.4.7. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế ............................ 46

3.4.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất .............................................................................. 46

3.4.7.2. Khảo sát nồng độ enzyme ............................................................................. 47

3.4.7.3. Khảo sát thời gian thủy phân ........................................................................ 47

3.4.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm. ............................................................. 48

3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu .................................................. 49

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 50

4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp....................... 50

4.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm Probiotic ................... 50

4.1.2. Nhuộm Gram .................................................................................................... 52

4.1.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa ......................................................................... 52

4.1.3.1. Khả năng di động .......................................................................................... 52

4.1.3.2. Khả năng sinh catalase .................................................................................. 53

iii

Đồ án tốt nghiệp

4.1.3.3. Khả năng sinh indol ...................................................................................... 54

4.1.3.4. Thử nghiệm methyl red ................................................................................. 54

4.1.3.5. Khả năng lên men các loại đường ................................................................. 55

4.2. Đánh giá các hoạt tính sinh học .......................................................................... 58

4.2.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn ...................................................................... 59

4.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme protease ....................................................... 59

4.3. Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế ............................................ 60

4.4. Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế

phẩm............................................................................................................................ 61

4.4.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease ......................... 61

4.4.2. Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease ................................. 62

4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân ........ 63

4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy

phân ............................................................................................................................. 65

4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân ................... 67

4.8. Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn ........................................ 70

4.9. Quy hoạch thực nghiệm ...................................................................................... 71

4.10. Đánh giá hiệu quả sản phẩm ............................................................................. 77

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 78

5.1. Kết luận................................................................................................................ 78

5.2. Kiến nghị ............................................................................................................. 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 80

iv

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

OD Optical density

UI Unit International

MR Methyl red

CFU Colonies Form Unit

TCA Trichloroacetic acid

EDTA Etilendiamin tetraaxetic axit

NL Nguyên liệu

CPE Chế phẩm enzyme

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 2.1. Bacillus sp. ................................................................................................... 3

Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử ..................................................................................... 5

Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease............................................................................. 8

Hình 2.4. Trùn quế ..................................................................................................... 18

Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi .......................................................................... 22

Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập ............................................... 26

Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện

Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM ................................................................................... 27

Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu .................................................. 50

Hình 4.2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6 ....................................... 52

Hình 4.3. Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6 ................................... 53

Hình 4.4. Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6 ......................... 53

Hình 4.5. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh indol của 3 chủng 1, 5 và 6 ............... 54

Hình 4.6. kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6 .............................. 54

Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1 ..................... 55

Hình 4.8. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5 ..................... 56

Hình 4.9. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6 ..................... 57

vi

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease ............................ 13

Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá ......................................... 22

Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin ................................................... 42

Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ..................... 42

Bảng 3.3. Lập đường chuẩn Albumin ....................................................................... 44

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v) ................................................. 46

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%) ....................................................... 47

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân .......................................................... 48

Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm ......................... 51

Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát

..................................................................................................................................... 58

Bảng 4.3. Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng .............. 59

Bảng 4.4. Kết quả xác định vòng phân giải casein của enzyme protease thu nhận từ

3 chủng sau 48 giờ ...................................................................................................... 59

Bảng 4.5. Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân .................... 60

Bảng 4.6. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme thương

phẩm và enzyme chế phẩm ........................................................................................ 70

Bảng 4.7. Kết quả so sánh các chỉ tiêu giữa hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân ......

..................................................................................................................................... 70

Bảng 4.8. Mã hóa các biến số thực nghiệm theo các yếu tố ảnh hưởng ................... 71

Bảng 4.9. Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố...................................................... 71

Bảng 4.10. Kết quả hàm lượng acid amin theo thực nghiệm và theo phương trình hồi

quy .............................................................................................................................. 72

Bảng 4.11. Kết quả bj và bij ............................................................................................................................... 73

Bảng 4.12. Xử lý số liệu tại tâm ................................................................................ 73

Bảng 4.13. Bảng kiểm định Student .......................................................................... 74

Bảng 4.14. Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa các tỷ lệ trộn ................................ 77

vii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease........................................................................... 10

Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm ................................................................. 29

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm ....................... 61

Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm ............................... 63

Đồ thị 4.3. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng

độ cơ chất khác nhau .................................................................................................. 64

Đồ thị 4.4. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng

độ enzyme khác nhau ................................................................................................. 66

Đồ thị 4.5. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với các

mức thời gian khác nhau ............................................................................................ 68

viii

Đồ án tốt nghiệp

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm

enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời

sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn

nuôi, y tế,...và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự phát

triển của ngành chế biến thức ăn thủy sản. Trong những năm gần đây thủy sản đã trở

thành nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng nhu cầu tiêu

thụ trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản,

Hàn Quốc...Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ giống, sử dụng

thuốc hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm

môi trường và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản. Với mục đích bảo

vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không

bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại

thuốc, mà thay vào đó là các sản phẩm sinh học giúp tăng cường sức đề kháng bệnh,

tăng khả năng hấp thụ dưỡng chất, hay làm sạch môi trường nước bằng cách bổ sung

thêm những vi sinh vật có lợi. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm

các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo

sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại. Ngoài ra,

những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những hệ enzyme

vi sinh vật, hoặc những sản phẩm chuyển hóa trong quá trình lên men của chúng),

giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh.

Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu

cơ trong thức ăn chăn nuôi cũng là một trong những hướng nghiên cứu chính nhận

được nhiều sự quan tâm của cả các nhà khoa học và người chăn nuôi. Với hàm lượng

protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, là thức ăn lý tưởng

để nuôi thủy sản. Trùn còn chứa nhiều loại acid amin,vitamin, chất khoáng cần thiết

cho gia súc, gia cầm và thủy sản. Đặc biệt, thịt trùn còn có các loại kích thích tố sinh

trưởng tự nhiên mà trong bột cá không có. Thức ăn chăn nuôi có bột trùn sẽ không

1

Đồ án tốt nghiệp

có mùi tanh và khét của cá và dầu cá, hấp dẫn với vật nuôi, lại bảo quản được lâu hơn

thức ăn có dùng bột cá. Tuy nhiên protein có trong thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa

nên thủy phân bằng protease mang lại nhiều ưu điểm như: Không độc hại, cắt đứt các

liên kết peptid tạo các amino acid đơn giản giúp quá trình tiêu hóa, hấp thụ tốt hơn.

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và

ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. trong thức ăn chăn

nuôi thủy sản”.

1.2. Mục đích nghiên cứu

Chọn lọc được chủng Bacillus sp. có khả năng sinh enzyme protease cao.

Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân trùn quế bằng

enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp.

1.3. Nội dung nghiên cứu

Phân lập chủng Bacillus sp. từ các chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản.

Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế bằng

enzyme protease: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân.

So sánh khả năng thủy phân của enzyme protease thương phẩm và enzyme

protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp.

Tối ưu hóa thực nghiệm quá trình thủy phân trùn quế.

1.4. Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương

pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm statgraphics.

1.5. Kết cấu của đồ án

Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:

Chương 1: Mở đầu.

Chương 2: Tổng quan tài liệu.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Chương 4: Kết quả và thảo luận.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

2

Đồ án tốt nghiệp

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp.

2.1.1. Phân loại

Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong thời gian dài ở điều kiện bất lợi,

nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn.

Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau:

Giới: Bacteria

Ngành: Fimicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus

Chi Bacillus là một chi lớn, đa dạng và thuộc họ Bacillaceae. Với một số loài

thường gặp trong tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus

mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, bacillus Brevis,

Bacillus simplex,...

Hình 2.1. Bacillus sp.

(http://nuoitomsu.blogspot.com/2013/03/vai-tro-cua-vi-khuan-bacillus- sp-trong.html)

3

Đồ án tốt nghiệp

2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus (Nguyễn Thị Yến Thu, 2011)

Vi khuẩn Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que hay trực khuẩn, Gram

(+), đường kính khoảng 0,2 – 2 µm, dài 2 – 8 µm, thường ở dạng đơn hoặc chuỗi dài,

chiều dài của chúng phụ thuộc vào điều kiện môi trường trong suốt quá trình phát

triển. Phần lớn các chủng vi khuẩn Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng ở mức trung bình,

với nhiệt độ tối ưu vào khoảng 35 – 45oC, cũng có một số chủng có nhiệt độ tối ưu

khá cao khoảng 65oC.

Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có khả năng sinh catalase, bất động

hay di động nhờ tiêm mao, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được ở

điều kiện bất lợi trong thời gian dài như một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và

hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 – 11 nên đa số chúng

rất phổ biến trong tự nhiên và có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: đất,

nước, thức ăn,…

Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh, có mặt khắp nơi trong tự nhiên, phần lớn chúng

cư trú trong đất. Vi khuẩn Bacillus có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản

như đường, amino acid, các acid hữu cơ và có thể chuyển hóa các nguồn carbon như

methanol, cellulose hay lên men các hỗn hợp carbonhydrat tạo glycerol và butanediol.

Các chủng Bacillus được nghiên cứu nhiều do có khả năng tổng hợp được nhiều

loại enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose, phytase,... tùy thuộc vào

nguồn cơ chất khác nhau sẽ sinh enzyme khác nhau như nguồn cơ chất là cellulose

thì sẽ sinh tổng hợp enzyme cellulase,...Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là

enzyme thủy phân của các phân tử hữu cơ lớn, chính vì thế vi khuẩn này có nhiều

ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sản xuất chất tẩy rửa, công

nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ thuộc da,

công nghệ dệt và trong xử lý chất thải.

2.1.3. Khả năng tạo bào tử

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào tử trong

những điều kiện nhất định. Bào tử không hình thành trong suốt quá trình hoạt động

tăng trưởng và phân chia tế bào, thường khi gặp điều kiện bất lợi về môi trường, thiếu

4

Đồ án tốt nghiệp

dinh dưỡng,…thì nội bào tử mới được hình thành. Bào tử có hình oval và có khuynh

hướng phình ra ở một đầu, do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được

cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, tồn tại lâu

dài trong điều kiện khắc nghiệt.

Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:

 Hình thành vách ngăn.

 Sự tạo tiền bào tử.

 Tạo lớp vỏ bào tử.

 Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.

 Sự giải phóng bào tử.

Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử

www.biol.lu.se/cellorgbiol/membprot/pop sv.html

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân

tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành

tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử

phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải

và bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử

hút nước và bị trương ra. Sau đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát

5

Đồ án tốt nghiệp

triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai

Phương, 2004).

2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản

Sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus trong môi trường với một số lượng lớn sẽ

xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và

nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất

dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh

trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Thuận, 1976).

Triển vọng ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc

biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn

Bacillus như: B. subtilis, B. aterrimus. B. niger, B. pumilis, B. panis, B. vulgarus, B.

nigrificans, B. natto, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B.

mesentericus…đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò:

 Cải thiện sức khỏe, cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp và hỗ trợ tiêu hóa.

 Tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường nước như phân

hủy các chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 và H2S, giảm chất dư thừa tích tụ ở đáy

ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi.

 Ức chế các tác nhân gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng sinh, cạnh tranh

dinh dưỡng và môi trường sống.

 Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát

triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi trường luôn

ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này.

Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hoạt chất có

hoạt tính sinh học và ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã

nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp. đóng vai trò quan trọng trong việc cải

thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong quá trình chuyển đổi

vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp. làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các

chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Một số loài của nhóm vi

khuẩn Bacillus sp. (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium,…) dùng để làm

6

Đồ án tốt nghiệp

sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (protease, amylase, cellulase,

kitinase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi

sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng

thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính, Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả

năng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá

mức như Vibrio, Aeromnas,…(Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012).

2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp.

Vijayabaska et al. (2008) ứng dụng thành công các vi sinh vật có lợi mà cụ thể

là nhóm vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi cá rô phi nhằm hạn chế mầm bệnh do vi

khuẩn A. Hyrophila gây ra. Sugama, Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus BY

– 9 bổ sung vào bể (18 m3) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 106 CFU/ml. Kết quả cho

thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveji và tỉ lệ

sống của tôm ở giai đoạn OL  10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn (46,1%) so với

đối chứng (10,6%). Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi

khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao

nuôi được cải thiện, đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung Bacillus thấp

hơn so với đối chứng. Graslund et al., cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan đã

sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và

bùn đáy ao nuôi (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012).

Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu

cơ trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung

3 loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/ml

và 1 đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Kết quả cho ta thấy tỉ lệ sống ở nghiệm

thức B37 cao nhất (93,33 ± 1,65%), còn đối chứng thấp nhất (69,52 ± 1,65%) (p <

0,05). Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài và trọng lượng của tôm cao nhất ở

B37 lần lượt là 1,659 ± 0,034 mm/ngày và 0,45 ± 0,02 g/ngày, trong khi đó ở nghiệm

thức đối chứng là thấp nhất với các chỉ số tương ứng là 0,677 ± 0,017 mm/ngày và

0,14 ± 0,01 g/ngày. Như vậy hiệu quả xử lí môi trường của các chủng vi khuẩn bổ

7

Đồ án tốt nghiệp

sung được khẳng định, trong đó hiệu quả xử lý tốt nhất ở nghiệm thức dòng B37

(Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú, 2010).

Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus:

 Trong chăn nuôi: viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản

xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con. Từ năm 1983

đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất

thuận tiện cho người sử dụng. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một

số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM,

Probiotic.

 Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như

nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae...Ngoài ra còn ứng dụng

nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu sản xuất thử chế

phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá

chất, Bộ Nông Nghiệp tại TP. HCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải. Hồ Thị Mỹ

Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế

phẩm Subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp.

2.2. Enzyme protease

2.2.1. Giới thiệu chung về protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)

Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease

(http://www.hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghien- cuu/1241-ung-dung-enzyme-trong-nganh-cong-nghiep-.html)

8

Đồ án tốt nghiệp

Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy

phân liên kết peptide CONH của phân tử protein và cắt liên kết peptide giữa các

L  acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế

bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh

vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày

bê...). Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ưu điểm nhất như

vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc đã được gia tăng sử dụng như là một nguồn cung cấp

protease đã cải thiện được đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều

hơn. Đặc biệt vi khuẩn là nguồn sản xuất protease tương đối lí tưởng vì những ưu

điểm như: có hoạt tính mạnh như chỉ với một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng

cơ chất lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh

chóng, trong thời gian ngắn có thể thu được một lượng lớn enzyme. Hệ protease vi

sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu

trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng

nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật

thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng

rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học. Các

loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus,

Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus

oryzae, Aspergillus niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein gồm nhiều các amino

acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có

cấu trúc rất phức tạp và chúng phân giải các liên kết peptide tạo các acid amin đơn

giản, dễ hấp thu. Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương…

9

Đồ án tốt nghiệp

2.2.2. Phân loại protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).

Peptidase (Protease) (E.C.3.4)

Exopeptidase (E.C. 3.4.11-17) Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99)

Aminopeptidase

Cystein proteinase

Serine proteinase

Aspartic proteinase

Carboxypeptidase Metallo proteinase

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease

 Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất có thể chia protease thành hai nhóm:

 Endopeptidase: protease thủy phân peptide ở giữa mạch.

 Exopeptidase: protease phân cắt các liên kết peptide ở đầu mạch.

 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia

thành hai loại:

 Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi

polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một

tripeptide.

 Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi

polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

10

Đồ án tốt nghiệp

 Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine trong

trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc

tác của enzyme. Các Serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm

tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

 Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt

động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,

bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cysteine

proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất

rộng.

 Aspartic proteinase: hầu hết các Aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,

renin. Các Aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt

động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.

 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi

khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các Metallo proteinase

thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của

EDTA.

 Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

 Protease acid: pH = 2 – 4 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp

bánh kẹo.

 Protease trung tính: pH = 7 – 8 chúng thường được sản xuất từ các loài vi

khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus.

 Protease kiềm: pH = 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của các enzyme

protease này có serin.

Nhưng tác dụng tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất. Vì

cùng một protease của cùng một chủng vi khuẩn khi thủy phân casein, hemoglobin

hay gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.

11

Đồ án tốt nghiệp

 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:

 Protease động vật: có trong tụy tạng (đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài

nhất và có chứa nhiều enzyme nhất) và dạ dày bê.

 Protease thực vật: có 3 loại protease thực vật như Bromelain (thu từ quả, chồi

và vỏ dứa), Papain (có trong nhựa của lá, thân, quả đu đủ) và Ficin (thu được

từ nhựa cây cọ).

 Protease vi sinh vật: phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm

nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces

và một số và một số loại nấm men.

2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật

Protease có thể ở 2 dạng chính là protease nội bào (hiện diện trong tế bào) và

protease ngoại bào (được tiết vào môi trường nuôi cấy) và có những vai trò khác nhau

đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào thường phân giải protein

và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp

để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Cho đến nay, các loại protease ngoại bào được nghiên

cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào.

Vi sinh vật tiết ra enzyme ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các

phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptide). Các chất này tiếp

tục phân hủy thành các acid amin nhờ Peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào

tế bào rồi mới chuyển hóa thành acid amin. Một phần các acid amin này được vi sinh

vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được phân giải tạo thành

Protease

Peptidase

NH3 và các sản phẩm khác.

Polypeptid Protein Acid amin NH3

Quá trình này được gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa. Đó là quá trình chuyển

hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3) (trích Nguyễn Thị Ngọc Huyền,

2012).

12

Đồ án tốt nghiệp

Protease nội bào thì cho đến nay còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết

rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể

có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức

năng như phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào để hình thành các

acid amin và để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.

Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có

nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào

cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp

(Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân

huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá

trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích dẫn bởi Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).

Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease

Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc

Bacillus subtilis Streptomyces grisus Aspergillus oryzae

Bac. cereus Str. rimous Asp. niger

Bac. thermophillus Str. fradiae Asp. owamori

Bac. circulans Str. feacatis Asp. candidus

Bac. brevis Str. rectus var proteolyticus Asp. favus

Clostridium perfriugens Mucor pusilus

Cl. histoluticum Rhizopus niveus

Cl. porogens

(Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease

Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng

trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần

môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh

vật và tổng hợp enzyme.

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện

tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất

13

Đồ án tốt nghiệp

đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của

chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản

trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất

tương ứng của enzyme cần tổng hợp.

Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,

Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.

Về phương pháp nuôi cấy hiện nay người ta thường dùng hai phương pháp sau:

 Nuôi cấy bề mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát

triển trên bề mặt môi trường. Sử dụng môi trường nuôi dạng rắn hoặc bán rắn hay

trên bề mặt dạng lỏng.

Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng

khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung

dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme (Nguyễn

Đức Lượng, 2004).

Ở môi trường bán rắn để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng

môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Vi

sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường

và sinh tổng hợp enzyme nội bào và ngoại bào. Độ ẩm thích hợp của môi trường đặc

là 55  65%.

Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ

thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý. Nhưng nhược điểm

là tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa và tự động hóa.

 Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm)

Phương pháp này sử dụng môi trường dạng lỏng và được thực hiện trong những

thùng lên men. Trong thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống

cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ

thống diều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi

trường làm tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế

14

Đồ án tốt nghiệp

bào vi sinh vật đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh

sản và phát triển, làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật.

Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn diện tích và dễ cơ giới hóa nhưng nhược

điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát.

2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease

(Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009)

Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật

chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, thời gian hoạt

động, thành phần môi trường...

Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh

tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi

loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp và có khác nhau trong khoảng từ 40oC – 60oC,

đa số hoạt độ của protease cao nhất ở 50oC. Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh vật sinh

tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ, bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao

hơn nhiệt độ thích hợp và chịu ảnh hưởng của cơ chất, pH môi trường và thời gian

tác dụng…Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hoạt động thích hợp thì hoạt động của protease

giảm vì nhiệt độ cao làm biến đổi hay hư hỏng cấu trúc của enzyme. Nhiệt độ mà

protease mất hoàn toàn hoạt độ gọi là nhiệt độ tới hạn. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC

đa số protease vi khuẩn bị giảm hoạt tính nhưng không bị mất hoạt độ, do đó hoạt

động của protease có thể tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên cũng có một số protease

bị mất hoạt tính trong quá trình đông khô.

Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi

trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi

trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại,

trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease

trong môi trường. Vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất,

trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ

bền của protease. Đa số protease vi khuẩn đều bền ở pH trung tính từ 6,2 – 7,4, pH

thích hợp cho nhiều protease gần bằng 7.

15

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hưởng của độ thông khí: có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp

protease và khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp thiếu

oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại tăng quá trình tổng hợp

protease, tuy nhiên sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự sinh tổng hợp protease và lượng

oxi thích hợp cho sự tổng hợp protease khác nhau ở các loại vi sinh vật.

Ảnh hưởng của độ ẩm: thông thường các loài vi khuẩn đòi hỏi độ ẩm cao hơn

nấm mốc, độ ẩm thích hợp nhất là khoảng 60 – 70%.

Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn để sinh

tổng hợp enzyme cực đại là khoảng 36 – 48 giờ. Tuy nhiên để phân giải protein đạt

hiệu suất cao nhất, đòi hỏi thời gian lâu hơn, để enzyme phân giải đối với cơ chất tự

nhiên.

Ảnh hưởng thành phần môi trường: thành phần môi trường như nguồn carbon,

nitơ, khoáng chất và các yếu tố vi lượng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của

enzyme. Nếu trong môi trường có chứa các yếu tố gây biến tính protease như acid

hoặc kiềm đặc hay muối kim loại nặng ở nồng độ cao thì protease sẽ bị mất hoạt tính.

2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)

Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực

phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như: ngành chế biến cá, thịt, sữa,

làm bánh mì, thuộc da, dệt, phim ảnh, dùng làm trong bia và nước quả hay trong sản

xuất rượu…

Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh

răng, kem bôi mặt…có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc

làm sạch cao răng chữa viêm lợi. Các loại xà phòng chứa protease có tác dụng tẩy mồ

hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở quần áo, drap ở bênh viện…

Trong công nghệ thực phẩm: protease ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa

và các sản phẩm từ sữa. Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và

cân đối nhất. Các sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa,

người ta đã cho ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau.

Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và tính

16

Đồ án tốt nghiệp

cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng như

trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường. Trong đó, mảng

sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú như là bơ, fomat, kefir,

yoghurt,…

Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các

thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do

dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh

mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông

đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Sản

xuất các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng.

Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm

tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ

sung vào thức ăn cho gia cầm và thủy sản.

Trong công nghiệp da: thành phần quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác

dụng của protease các chất nhờn được tách ra, một số sợi liên kết collagen bị phá hủy.

Kết quả là da có độ mềm nhất định giúp tách lông thú ra khỏi da dễ dàng mà không

làm ảnh hưởng đến chất lượng của da.

2.3. Trùn quế

2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế

Trùn quế có tên khoa học là Perionyx excavates, có vị trí phân loại:

Ngành: Annelides (ngành giun đốt)

Phân ngành: Clitellata (phân ngành có đai)

Lớp: Olygochaeta (lớp giun ít tơ)

Họ: Megascocidae (họ cự dẫn)

Chi: Pheretima

Loài: Perionyx excavatus (trùn quế)

Trùn quế là động vật không xương sống, cơ thể phân đốt, phần đầu thoái hóa,

có mang đai sinh dục, các hệ bên trong cơ thể như hệ tuần hoàn, hệ thần kinh, hệ bài

tiết…cũng sắp xếp theo đốt. Mỗi đốt mang một đôi hạch thần kinh giúp cho trùn ghi

17

Đồ án tốt nghiệp

nhận cảm giác và phản ứng đáp trả của cơ thể đối với môi trường ngoài rất nhạy bén.

Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ

đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với phần thể lớn và không có khả năng cải

tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất.

Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần hóa, nhập nội và đưa vào

nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loại trùn mắn đẻ, xuất hiện rải

rác ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch.

Hình 2.4. Trùn Quế

2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế

Kích thước trùn quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, bề ngang của con trưởng thành

có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, thân hơi dẹt, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi),

màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dài nối với

nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ (Bùi Minh Tuấn, 2012).

Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải CO2 trong môi

trường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều tuần, thậm

chí trong nhiều tháng.

Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm

cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng amoniac và urea. Trùn quế nuốt

thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi

nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó. Sau khi qua hệ thống tiêu hóa

với nhiều vi sinh vật cộng sinh, chúng thải qua phân ra bên ngoài và rất giàu dinh

dưỡng, những vi sinh vật cộng sinh có ích trong hệ thống tiêu hóa này theo phân ra

18

Đồ án tốt nghiệp

khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn có thể hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời

gian dài. Đây là một trong những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh

dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường

trong tự nhiên (Nguyễn Thị Xuân Thanh, 2009).

2.3.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế (Bùi Minh Tuấn, 2012)

Trùn quế rất nhạy cảm, thường sống trên mặt đất, thích sống nơi môi trường ẩm

ướt, tối, có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy và độ pH ổn định. Chúng phản ứng

mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn.Tế

bào da của trùn quế rất mỏng, thường xuyên tiết ra chất nhờn để bảo vệ cơ thể và

thích ứng với điều kiện chui rúc trong môi trường tối và ẩm.

Những điều kiện môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển

của trùn quế:

 pH: trùn quế chịu được phổ pH khá rộng từ 4  9 thích hợp nhất là 6,8  7,5;

nếu pH quá thấp chúng sẽ bỏ đi.

 Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp nhất với trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 35oC,

ở nhiệt độ khoảng 30oC và độ ẩm thích hợp, chúng sinh trưởng và sinh sản rất

nhanh. Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết, hoặc khi

nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi hoặc chết. Chúng có thể chết

khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thể tồn tại trong môi

trường nước có thổi oxy.

 Độ ẩm: nước là thành phần quan trọng chiếm 75 – 90% khối lượng cơ thể trùn

quế, độ ẩm thích hợp nhất cho trùn quế sinh trưởng và sinh sản là 60 – 70%.

 Không khí: trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải

CO2, do đó môi trường sống của chúng đòi hỏi phải thoáng khí, lưu ý loại bỏ

các chất khí có hại cho trùn như: Clo (Cl2), amoniac (NH3), H2S, SO2, SO3,

CH4,…

Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ

nào có thể phân hủy trong tự nhiên như rác đang phân hủy, phân gia súc, gia

19

Đồ án tốt nghiệp

cầm…Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn,

giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn.

Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rảnh, hoặc nơi có

nhiều chất hữu có dễ phân hủy và thối rữa như trong phân động vật, rác hoai mục.

Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi đây có nhiều rác thải hữu

cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường cao, không hấp dẫn và không

đảm bảo độ ẩm môi trường thường xuyên.

2.3.4. Sự sinh sản và phát triển (Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008)

Trùn quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định

và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam. Theo nhiều tài liệu, từ một cặp

ban đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 – 1.500 cá thể trong một

năm. Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu

của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được

hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng. Kén có hình dạng

thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu trắng đục,

sau chuyển sanh xanh nhạt rồi vàng nhạt, mỗi kén có thể nở từ 2 – 10 con.

Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3 mm, sau 5 –

7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một vằn đỏ

thẫm trên lưng. Khoảng từ 15 – 30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện

đai sinh dục, từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản. Con trưởng

thành khỏe mạnh có màu mận chín và có sắc ánh kim trên cơ thể.

2.3.5. Tác dụng của trùn quế

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy: hiếm có loài động vật nào có giá trị hấp

dẫn như trùn quế. Trùn quế được sử dụng trực tiếp hoặc phối trộn làm thức ăn cao

cấp nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản; thậm chí làm thực phẩm cho con người; dùng sản

xuất mỹ phẩm, dược phẩm; trùn phân hủy rác hữu cơ, bảo vệ môi trường; phân trùn

thải ra là một trong những loại phân hữu cơ thiên nhiên giàu dinh dưỡng nhất mà con

người từng biết.

20

Đồ án tốt nghiệp

Ứng dụng trong chăn nuôi: trùn quế là loại thức ăn giàu đạm, chất lượng cao để

tăng hàm lượng dinh dưỡng trong thức ăn cho gia súc, gia cầm và nhất là đối với các

loài thủy sản đồng thời còn có thể giảm chi phí cho thức ăn chăn nuôi.

Với hàm lượng protein cao của trùn quế tương đương với trong bột cá thường

dùng làm thức ăn chăn nuôi, thêm vào đó là thịt trùn quế có chứa các acid amin, lipit,

vitamin, khoáng chất, hay các loại kích thích tố sinh trưởng cao hơn trong bột cá

(A.F.Md. Hasanuzzaman, Sk.Z. Hossian, M. Das, 2010). Bột thức ăn chứa thịt trùn

quế không có mùi tanh hay mùi khét như bột cá nên có thể hấp dẫn được vật nuôi tốt

hơn và dễ bảo quản trong thời gian dài.

Trùn quế nhất là trùn tươi rất tốt làm thức ăn cho gà, lợn, thỏ và như một nguồn

bổ sung dinh dưỡng cho các loài thủy sản. Thêm vào đó trong thịt trùn quế còn chứa

một lượng thấp acid glutamic nên khi dùng làm thức ăn chăn nuôi hàng ngày sẽ giúp

tăng tốc độ sinh trưởng, tăng năng suất trứng, tăng khả năng sinh sản và sức kháng

bệnh của tôm, cá. Trùn quế rất dễ nuôi và sinh sản nhanh nên có thể sản xuất một

lượng lớn trùn trong thời gian ngắn giúp giảm giá thành thức ăn, có tiềm năng thay

thế cho nguồn protein động vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, đóng vai trò quan

trọng trong nuôi trồng và sản xuất thủy sản hiện nay.

Theo W.T.Mason (Đại học Phlorida – Mỹ): trùn, nhất là trùn tươi, là thức ăn lý

tưởng để nuôi thủy sản, nhất là sản xuất con giống ba ba, rùa, lươn, tôm, cá chình,

đặc biệt là nuôi cá tầm – một loài cá quý để ăn và sản xuất món trứng cá muối đắt

tiền. Nếu cho chúng ăn trùn tươi hằng ngày bằng 10 – 15% trọng lượng cơ thể sẽ tốt

hơn bất cứ loại thức ăn nào khác, tốc độ sinh trưởng sẽ tăng từ 15 – 40%, năng suất

trứng tăng lên 10%. Nếu trộn 2 – 3% bột trùn dùng để nuôi, năng suất sẽ tăng trên

30%, giá thành thức ăn giảm 40 – 60%, đồng thời tăng sức sinh sản và khả năng

kháng bệnh của tôm, cá. Điều này rất có ý nghĩa khi thức ăn chăn nuôi đắt đỏ như

hiện nay.

Hiệp hội nuôi gà của Mỹ cho rằng: trùn là phương án hàng đầu cung cấp protein

chất lượng cao, rẻ nhất, dễ nhất cho vật nuôi, đặc biệt là gà, thì năng suất trứng tăng

17 – 25%, tốc độ sinh trưởng tăng 56 - 100%. Đặc biệt nếu nuôi gà bằng thức ăn có

21

Đồ án tốt nghiệp

trùn tươi thì hầu như gà không bị bệnh; trong khi nếu nuôi gà không có trùn thì tỷ lệ

mắc bệnh cúm gà 16 – 40%. Trùn quế còn chứa trên 8% axit glutamic, nên khi sử

dụng làm thức ăn chăn nuôi thì vật nuôi khỏe, chóng lớn, đẻ khỏe, ít bệnh tật và sẽ

cho thịt thơm ngon hơn hẳn so với vật nuôi thông thường. Vì vậy ngày càng có nhiều

hãng sản xuất thức ăn công nghiệp quan tâm đưa bột trùn vào thức ăn chăn nuôi để

tạo sự khác biệt so với thức ăn thông thường, nâng cao khả năng cạnh tranh sản phẩm

trên thị trường.

Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá

Chỉ tiêu Bột trùn Bột cá

Protein (%) 45,60 – 47,53 37,87 – 61,28

Lipit (%) 7,59 – 8,47 4,18 – 8,88

Tro (%) 23,54 – 24,88 18,68 – 44,36

Độ ẩm (%) 67,84 – 74,08 8,26 – 31,53

(A.F.Md. Hasanuzzaman, Sk.Z. Hossian, M. Das, 2010)

2.3.6. Bổ sung trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi

Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi

(http://trunque.blogspot.com)

22

Đồ án tốt nghiệp

Nguyễn Minh Triết (2008) thử nghiệm trùn quế và chế phẩm vi sinh lên sinh

trưởng và phát triển của vịt xiêm. Khảo sát mức độ trùn quế 5%, chế phẩm vi sinh

5‰ và 10‰ vào khẩu phần thức ăn cho vịt xiêm trong giai đoạn từ 1 – 84 ngày. Kết

quả cho thấy trọng lượng bình quân của các nghiệm thức thí nghiệm (1886,9; 1723,1;

1891,9) cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (1400,6) và hệ số chuyển hóa thức ăn

của nghiệm thức thí nghiệm (3,7765; 3,8601; 3,4928) cũng thấp hơn hẳn so với

nghiệm thức đối chứng (5,54).

Trong nghiên cứu của Sakthika.T, Ronald. J, Siva Kumar.V, Felicitta. J (2014)

khảo sát sự ảnh hưởng trong bữa ăn của cá cho ăn thức ăn viên (NT1) và cá cho ăn 2

bữa ăn khác nhau từ trùn quế được nuôi bằng cây lục bình nước (NT2), kiểm tra các

thông số tăng trọng của cá sau 60 ngày cho thấy: cá được nuôi ở NT2 cho tỉ lệ tăng

trọng lên 51,87%, tốc độ tăng trưởng tăng 22,22%, giảm 51,43% tỷ lệ chuyển đổi

thực phẩm và tăng hiệu quả protein lên 55,29% so với NT1. Điều này có ý nghĩa về

mặt sinh thái và giá trị kinh tế trong ngành thủy sản.

Theo tác giả C.O. Monebi và A. Ugwumba (2013) khảo sát sự ảnh hưởng của

tỷ lệ thức ăn bột trùn thay cho bột cá đến trọng lượng và tốc độ tăng trưởng của cá

giống từ 0, 5, 25, 50, 75, 100% bột trùn (NT1, NT2, NT3, NT4, NT5). Kết quả cho

thấy trọng lượng cơ thể cá giống tăng 5% mỗi ngày trong vòng 9 tuần và giảm dần từ

tuần thứ 10 trừ cá nuôi ở NT5, tốc độ tăng trưởng cao nhất trong cá nuôi ở NT3 là

1,5% còn thấp nhất đối với cá nuôi ở NT1 là 1,2%. Tỷ lệ cá sống cao từ 72 – 73,3%

ở NT3, NT4, NT5 và thấp nhất ở NT1 và NT6. Tỷ lệ hiệu quả protein cao nhất ở NT3

(1,0) và thấp nhất ở NT6 (0,5), tỷ lệ chuyển đổi thức ăn cao nhất ở NT6 (3,1) và thấp

nhất ở NT4 (1,6). Sự khác biệt giữa NT1 và NT6 là không đáng kể nhưng khác nhau

đáng kể so với NT3, NT4, NT5. Vậy việc thay thế bột cá sang bột trùn từ 50 – 75%

phù hợp với hiệu suất tăng trưởng và khả năng sử dụng chất dinh dưỡng của cá giống.

23

Đồ án tốt nghiệp

2.4. Chế phẩm probiotics

2.4.1. Định nghĩa về Probiotics

Có rất nhiều định nghĩa về probiotics như probiotics là những vi khuẩn hoặc

nấm men có ích hỗ trợ khôi phục lại sự cân bằng trong đường ruột. Chúng còn được

gọi là “vi khuẩn thân thiện” hay “lợi khuẩn”, những vi khuẩn này được bổ sung vào

chế độ ăn nhằm cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột để cải thiện sức khỏe.

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001): “Probiotics là các vi sinh vật sống khi

đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho

vật chủ”.

Định nghĩa của Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO): “Probiotics là những vi

sinh vật sống khi được sử dụng với một lượng tương thích sẽ mang lại lợi ích cho sức

khỏe của vật chủ”.

Định nghĩa khác: “Probiotics là vi sinh vật sống bổ sung trong thức ăn vật nuôi,

gây tác động có lợi cho vật chủ bởi sự cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường

ruột” (Isolauri et al., 2004).

2.4.2. Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản (Nguyễn Thị Ngọc

Huyền, 2012)

Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2007) probiotic là hỗn hợp bổ sung mang bản chất

của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên

kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức

ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng

khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất

lượng của môi trường sống. Probiotics là công nghệ thân thiện với môi trường và

đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu

của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học

cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng

phân giải các chất hữu cơ, làm sạch và ổn định môi trường nước mà còn làm tăng

năng suất gấp hai lần so với đối chứng.

24

Đồ án tốt nghiệp

Ngày nay việc đưa những sản phẩm probiotics vào nuôi trồng thủy sản đang

được quan tâm và ứng dụng nhiều với những lợi ích như:

 Cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh hay tạo ra những hoạt chất ức chế kìm hãm

sự phát triển của chúng.

 Cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của động

vật thủy sản.

 Giúp cải thiện hệ tiêu hóa cho vật nuôi nhờ những vi sinh vật hữu ích đường

ruột có trong thức ăn.

 Hấp thu hay phân hủy các thức ăn thừa, vật chất hữu cơ thải ra trong môi trường

nước giúp cải thiện môi trường.

 Kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu của tôm cá, nâng cao sức đề kháng.

Ngoài ra, việc ứng dụng những vi sinh vật hữu ích vào môi trường ao nuôi không

những cải thiện chất lượng nước, phát triển bền vững mà còn gia tăng năng suất,

gia tăng tỷ lệ sống, giảm thiểu mầm bệnh trong môi trường và cải thiện hệ số

thức ăn.

25

Đồ án tốt nghiệp

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian tiến hành từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015 tại phòng thí nghiệm

trường đại học Công Nghệ TP. HCM.

3.2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

3.2.1. Vật liệu

Trùn quế tươi được mua tại trại nuôi trùn ở trung tâm công nghệ sinh học 

Quận 12  Thành phố Hồ Chí Minh.

Enzyme thương phẩm: enzyme Alcalase (sản phẩm thương mại của công ty

Novozyme, thành phố Hồ Chí Minh).

Nguồn vi sinh vật: phân lập các chủng Bacillus sp. từ những chế phẩm đang

được lưu hành tại các đại lý buôn bán thức ăn thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long.

Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập

26

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp.,

Staphylococcus aureus– Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM

3.2.2. Hóa chất

Hóa chất dùng pha môi trường: Agar, pepton, giá đậu, cao nấm men, NaCl.

Hóa chất khảo sát đặc tính sinh hóa: MgSO4, K2HPO4, NH4H2PO4, phenol red,

bromothymol blue.

Thuốc thử: H2O2, methyl red, phenol red, Kovacs’.

Thuốc nhuộm Gram: Gentian violet, Lugol, Fucshin

Hóa chất chuẩn pH: NaOH (0,1 N), HCl (0,1 N).

Dung dịch Tyrosine chuẩn

Dung dịch casein 1%

Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 5%

Dung dịch albumin: 0,1%

Thuốc thử Folin đã được pha sẵn.

Dung dịch thuốc thử Lowry gồm:

 Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1 N thành 100 ml.

 Dung dịch B: cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrate natri

1% tạo thành 100 ml.

27

Đồ án tốt nghiệp

 Dung dịch C: là hỗn hợp của dung dịch A và B theo tỷ lệ 49 : 1 (sử dụng

trong ngày).

3.2.3. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Các máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu được sử dụng trong phòng thí

nghiệm của trường đại học Công Nghệ TP. HCM.

- Cân điện tử - Tủ sấy, tủ ấm

- Kính hiển vi quang học - Bể ủ nhiệt

- Nồi hấp thanh trùng - Tủ cấy vô trùng

- Bình tam giác - Máy lắc

- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu - Máy đo pH

- Máy đo OD - Máy khuấy từ

- Máy Kjeldahl - Máy li tâm

Các dụng cụ khác như: Ống nghiệm, đĩa petri, đầu tuýp, đũa thủy tinh, lam kính,

cốc thủy tinh, que trang, que cấy, pipetman, pipet, ống đong, nồi đun, bếp điện, giấy

lọc, bông thấm...

3.3. Môi trường phân lập, định danh và giữ giống

Môi trường phân lập và giữ giống (MT1): môi trường nước chiết giá đậu pepton

cao nấm men agar. (Phụ lục 1.1)

Môi trường nhân giống: môi trường nước chiết giá đậu pepton cao nấm men

(MT2). (Phụ lục 1.2)

Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: môi trường Clark cluck, môi trường lên

men các loại đường. (Phụ lục 1.6; 1.7)

28

Đồ án tốt nghiệp

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm

Mẫu chế phẩm Probiotic

Cấy giống Hoạt hóa giống

Test IMVIC

Phân lập chủng Bacillus sp. Thuần khiết giống Pha loãng mẫu

Quan sát, nhuộm Gram

Test khả năng sử

Định danh bằng phương pháp sinh lý, sinh hóa dụng đường Test khả năng di động

Định tính khả năng sinh enzyme protease Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Xác định hoạt tính sinh học

Xác định nhiệt độ tối ưu: 35oC đến 65oC

Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến

Xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease Xác định pH tối ưu: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5

Xác định thành phần nguyên liệu trùn tươi

Tối ưu hóa quá trình Thủy phân trùn quế

Khảo sát nồng độ Enzyme tối ưu: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3(%) Khảo sát thời gian thủy phân: Từ 0  20 giờ

Khảo sát nồng độ cơ chất tối ưu: 5, 10, 15, 20, 25, 30 (%)

Xác định hàm lượng acid amin bằng phương pháp Lowry Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm

29

Đồ án tốt nghiệp

3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp.

3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp.

Tiến hành hoạt hóa giống vi sinh vật từ 6 chế phẩm vi sinh: cân 0,1 g cho mỗi

chế phẩm bổ sung vào môi trường MT2, sau đó ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 18 –

24 giờ.

Mẫu trước khi nuôi cấy đều phải đem hoạt hóa giống với mục đích: giúp cho

quá trình nuôi cấy diễn ra nhanh hơn và vi sinh vật hoạt động trở lại sau thời gian bảo

quản trong chế phẩm.

3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp.

Phân lập chủng Bacillus sp. từ chế phẩm sinh học thức ăn chăn nuôi thủy sản

trên môi trường MT1.

Hút 1 ml mẫu đã hoạt hóa cho vào 9 ml nước muối sinh lý (đã khử trùng), lắc

đều để có độ pha loãng 10-1. Sau đó pha loãng thành các nồng độ 10-2,10-3, 10-4,10-5,

10-6, 10-7. Hút 0,1 ml mẫu từ 3 nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 cho vào môi trường thạch MT1

đã chuẩn bị trong các đĩa petri vô trùng, dùng que trải dàn đều dịch trên bề mặt đĩa

thạch. Đĩa sau khi cấy được ủ từ 1 đến 2 ngày ở nhiệt độ 37oC. Mỗi nồng độ được

trải trên 2 đĩa môi trường MT1.

Khi khuẩn lạc mọc, quan sát hình thái, màu sắc để lựa chọn sơ bộ khuẩn lạc

thuộc chủng Bacillus sp. Khuẩn lạc đặc trưng được tách ra và cấy ria nhiều lần để tạo

dòng thuần chủng, sau đó cấy vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm, giữ

giống ở nhiệt độ thấp (< 4oC).

3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp.

Cấy các giống Bacillus sp. đã được hoạt hóa cấy sang ống thạch nghiêng chứa

môi trường MT1. Ủ khoảng 37oC trong 48 giờ. Sau đó đem giữ lạnh và cấy chuyền

giống hàng tháng.

3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp.

Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang erlen có chưa môi trường MT2, nuôi cấy

lắc ở nhiệt độ thường trong vòng 2 giờ. Dịch tăng sinh sau đó được được xác định

mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

30

Đồ án tốt nghiệp

3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (Nguyễn Đức

Lượng và ctv, 2006)

 Nguyên tắc

Trên môi trường MT1, xem như mỗi tế bào sẽ phát triển thành 1 khuẩn lạc, dựa

vào số khuẩn lạc mà ta xác định được số lượng tế bào trong một lượng mẫu ban đầu.

 Cách tiến hành

Chuẩn bị 15 – 20 ml dung dịch môi trường MT1 đã được hấp khử trùng và đổ

MT vào mỗi đĩa petri, để nguội. Pha loãng thập phân mẫu bằng nước cất đã hấp khử

trùng để được dịch pha loãng từ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Hút 0,1 ml các dung dịch

trên vào từng đĩa môi trường MT1 đã được chuẩn bị trước, mỗi nồng độ cấy vào 2

đĩa. để tránh mất nước cho môi trường, ủ ở nhiệt độ phòng và sau 48 giờ ghi nhận kết

quả số khuẩn lạc trên các đĩa (25 – 300). Nhân số khuẩn lạc đếm đươc trên đĩa petri

với hệ số pha loãng, tính giá trị trung bình số khuẩn lạc từ 1 g hay 1 ml mẫu.

Số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu ban đầu được tính theo công thức:

(CFU/ml)

∑ N n1∗ v1 ∗f1 + n2∗ v2∗ f2+ . . .+ ni ∗ vi ∗ fi

Số khuẩn lạc =

Với:

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa có từ 25 – 300 khuẩn lạc.

ni: số đĩa có khuẩn lạc trong khoảng đếm được ở một nồng độ pha loãng i.

vi: thể tích dịch pha loãng I cho vào mỗi đĩa petri.

fi: bậc pha loãng.

CFU: (Colonies Form Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc.

3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa

3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram

 Mục đích

Giúp ta phân biệt vi khuẩn thành hai nhóm lớn: vi khuẩn Gram dương (Gram 

positive) bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm (Gram  genative) bắt màu hồng. Ngoài

ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống.

31

Đồ án tốt nghiệp

 Nguyên tắc

Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptodoglycan

có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể  iod. Trong khi đó lớp thành tế bào của vi

khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có lớp màng lipid đôi bên ngoài.

Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể  iod, mẫu được xử lý tiếp với cồn

96o, làm mất nước của lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm

giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến tế bào giữ phức hợp tím tinh thể  iod

bên trong tế bào.

Đối với vi khuẩn Gram âm, cồn 96o đóng vai trò làm chất hòa tan lớp lipid đôi

bên ngoài. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể  iod.

Sau đó khi nhuộm lại với thuốc thử Fuchsin thì tế bào vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu

hồng của thuốc thử Fushin.

 Cách tiến hành

Bước 1: cho một giọt nước cất lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh

khối từ khuẩn lạc, trang đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn (nhằm

làm vết bôi mau khô, giết chết tế bào vi sinh vật, cố định vi sinh vật).

Bước 2: nhỏ một giọt thuốc nhuộm Crystal/Gentian Violet lên vết mẫu đã được

cố định trong vòng 30 giây, rửa lại bằng nước cất (tránh để tia nước tiếp xúc trực tiếp

với mẫu).

Bước 3: nhỏ một giọt dịch Iot/Lugol lên vết mẫu trong vòng 1 phút đến, sau đó

rửa lại bằng nước cất.

Bước 4: tẩy cồn 96o cho đến khi hết màu thuốc nhuộm (khoảng 30 giây), sau đó

rửa ngay bằng nước cất.

Bước 5: nhỏ một giọt thuốc thử Fuchsin lên vết mẫu trong khoảng một phút, sau

đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi

với độ phóng đại 100X với lớp dầu khoáng.

 Quan sát:

Gram “+” sẽ bắt màu tím; Gram “” sẽ bắt màu hồng.

32

Đồ án tốt nghiệp

3.4.3.2. Test khả năng di động

 Mục đích

Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm.

 Nguyên tắc

Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiêm mao có nhiều ở vi khuẩn

hình que, một số vi khuẩn hình cầu. Khả năng di động là một trong những căn cứ có

thể dùng để phân biệt vi sinh vật. Khả năng này được quan sát dựa vào sự tăng trưởng

và di động của vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm. (+) khi vi sinh vật

mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Là () khi vi sinh vật

chỉ mọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong.

 Tiến hành

Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar. Môi trường được đun tan và

phân phối vào ống nghiệm. Các ống nghiệm này được hấp khử trùng và làm nguội ở

trạng thái đứng.

Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần chủng, cấy bằng cách đâm

sâu đầu que cấy vào giữa ống thạch đứng chứa môi trường thạch có 0.5% agar. Các

ống môi trường được ủ ở 37oC trong 24  48 giờ rồi quan sát.

Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chúng

có khả năng di động. Còn nếu vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy mà không mọc lan ra

xung quanh thi chứng tỏ chúng không có khả năng di động.

3.4.3.3. Test catalase

 Mục đích

Xác định xem vi sinh vật có enzyme catalase hay không.

 Nguyên tắc

Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy ý chứa chuỗi chuyền điện tử có

cytochrome đều có enzyme catalase (trừ Streptococcus sp.). Enzyme này là một trong

các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương

bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kị khí tùy ý.

33

Đồ án tốt nghiệp

Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với

oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyền điện tử tạo H2O2.

Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalase âm tính nhưng đặc biệt

có một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalase dương tính gọi là

“catalase giả” như P. pentosaceus do chúng không nhạy cảm với cyanide và azidem

và không chứa nhóm giả của Hame (C34H32O4N2Fe).

 Tiến hành

Dùng que cấy lấy sinh khối khuẩn lạc thuần trên môi trường MT1 đặt lên lam

sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khuẩn lạc. Hoặc có thể thử trên đĩa petri, nhỏ trực

tiếp H2O2 30% lên khuẩn lạc trên bề mặt thạch và quan sát hiện tượng sủi bọt bằng

mắt thường.

 Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện.

 Phản ứng (): không có bọt khí xuất hiện.

 Lưu ý

Khi thử nghiệm trên lame không được đảo lộn trình tự tiến hành. Nên dùng

khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian từ 18 – 24 giờ để tránh phản ứng âm tính giả. H2O2

30% không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung

dịch và kiểm tra hoạt tính trước khi dùng.

3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh indol

 Mục đích

Phát hiện các vi sinh vật có khả năng sinh indol  các vi sinh vật có hệ enzyme

tryptophanase.

 Nguyên tắc

Tryptophan là một acid amin có thể bị chuyển hóa bởi một số vi sinh vật có hệ

enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm có chứa gốc indol và các dẫn xuất của

chúng trong môi trường canh trypton. Trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử

Kovacs’ hay Ehrlish’s. Indol sẽ kết hợp với thuốc thử para –

dimethylaminobenzaldehyde (có trong thuốc thử Kovacs’) tạo thành phức chất

quinon có màu đỏ.

34

Đồ án tốt nghiệp

Chuẩn bị: môi trường canh Trypton, thuốc thử Kovacs’.

 Cách tiến hành

Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn từ môi trường thạch cấy vào trong môi trường

canh Trypton và nuôi vi khuẩn ở 37oC khoảng 24 – 48 giờ, nhỏ vài giọt ether vào

canh khuẩn để kéo indol lên trên bề mặt môi trường, thêm thêm vài giọt thuốc thử

Kovacs’. Để yên 3 phút, quan sát hiện tượng và đọc kết quả.

Quan sát môi trường:

 Phản ứng dương tính (+): xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường.

 Phản ứng âm tính (-): không xuất hiện vòng màu đỏ (môi trường không

đổi màu).

3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR)

 Mục đích

Xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid trong môi trường

glucose.

 Nguyên tắc

Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng đường glucose có trong môi trường làm

cho pH môi trường giảm (sinh axit). Khi đó, thuốc thử methyl-red vẫn giữ nguyên

màu đỏ (MR dương tính). Ngược lại, nếu vi sinh vật không sử dụng nguồn glucose

mà chỉ sử dụng nguồn nitrogen trong môi trường làm cho pH môi trường trở nên kiềm

và thuốc thử methyl-red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng (MR âm tính).

Chuẩn bị: môi trường Clark Lubs, thuốc thử methyl-red, ống giống vi khuẩn.

 Cách tiến hành

Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào trong ống nghiệm chứa môi trường

Clark Lubs, nuôi ở nhiệt độ 37oC – 2 - 5 ngày. Sau đó, nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử methyl

– red vào ống nghiệm và đọc kết quả.

Quan sát môi trường:

 Phản ứng MR dương tính: môi trường có màu đỏ.

 Phản ứng MR âm tính: môi trường màu vàng.

35

Đồ án tốt nghiệp

3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường

 Mục đích

Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn carbonhydrate của các vi sinh vật.

 Nguyên tắc

Vi sinh vật có khả năng khác nhau trong việc sử dụng các nguồn carbon khác

nhau để tăng trưởng, khi sử dụng các nguồn carbon để lên men, tùy vào phương thức

lên men mà các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2 .

Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH của môi trường

dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.

 Phương pháp

Môi trường lên men các loại đường: glucose, saccharose, galactose và lactose

với pH 7,4. Chỉ thị pH môi trường là phenol red, màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH

môi trường dưới 6,8 (môi trường bị acid hóa). Bổ sung đường với nồng độ 1% và

chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm và khử trùng ở nhiệt

độ 121oC trong 10 phút. Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ

và đọc kết quả.

Quan sát môi trường:

 Phản ứng (-): môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ.

 Phản ứng (+): môi trường chuyển sang vàng.

3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học

3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn

 Nguyên tắc

Dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trong môi trường thạch, nơi có chất

kháng sinh khuếch tán đến thì nơi đó vi sinh vật kiểm định không phát triển được và

tạo ra vòng vô khuẩn trên môi trường thạch đĩa (Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007).

 Cách tiến hành

Trong thí nghiệm chúng tôi dùng phương pháp đục lỗ thạch và đo vòng kháng

khuẩn. Chọn 3 vi khuẩn gây bệnh đường ruột gồm: E.coli, Salmonella và

Staphylococcus để khảo sát tính kháng khuẩn của các chủng Bacillus sp.

36

Đồ án tốt nghiệp

Nuôi vi khuẩn Bacillus sp. trong môi trường MT2 ở nhiệt độ phòng, sau 36 giờ

lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng. Sau đó, đổ 15 ml môi trường MT1 vào các đĩa

petri đã khử trùng, để nguội chờ môi trường đông đặc. Tiếp theo dùng khuyên đục lỗ

đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng (đường kính

khoảng 0,5 cm). Dùng pipet hút 1 ml vi khuẩn kiểm định vào môi trường và trải đều,

sau đó dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn Bacillus sp. đã được lọc nhỏ vào các giếng

trong đĩa petri, để khô và ủ trong 48 giờ trong tủ ấm. Sau thời gian nuôi cấy thích

hợp, đo đường kính vòng kháng khuẩn.

3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease

Để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn Bacillus sp

chúng tôi tiến hành thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường MT1

có bổ sung 1% cơ chất casein.

Nuôi vi khuẩn Bacillus sp. trong môi trường MT2 ở nhiệt độ phòng, sau 36 giờ

lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng. Sau đó, đổ 15 ml môi trường MT1 có chứa

casein vào các đĩa petri đã khử trùng, để nguội chờ môi trường đông đặc. Tiếp theo

dùng khuyên đục lỗ đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành

các giếng (đường kính khoảng 0,7 cm).

Dùng pipet hút 0,1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn Bacillus sp. đã được lọc nhỏ vào

các giếng trong đĩa petri, để đĩa vào tủ lạnh 2 tiếng để dịch có thể khuyếch tán đều

vào môi trường, sau đó để vào tủ ấm. Sau 48 giờ thử bằng thuốc thử HgCl2 1% nhỏ

lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh enzyme protease thì sẽ tạo một vòng trong

suốt xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với

HgCl2. Các vùng chưa phân giải sẽ có màu trằng đục mờ.

3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease

Chuẩn bị và cấy vào môi trường MT3 với lượng giống sử dụng là 10%, độ ẩm

60 – 65%. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.

37

Đồ án tốt nghiệp

3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease

Sau khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp

protease, đem sấy khô ở nhiệt độ 45oC trong 48 giờ sau đó say thành bột và cho vào

túi kín. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh nơi ẩm thấp.

Cân 10 g bột xay nhuyễn trên rồi bổ sung nước cất cho đủ 100 ml, ta thu được

dịch enzyme pha loãng 10 lần. Nghiền, lắc cho enzyme tan đều vào trong nước và

đem đi ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút và thu dịch lỏng phía trên. Tiếp tục kết

tủa enzyme bằng cồn trong điều kiện lạnh và ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút

và thu tủa. Tiếp tục hòa tan kết tủa vào dung dịch đệm và pha loãng sao cho OD đo

được bằng phương pháp Anson cải tiến trong khoảng giữa của đường chuẩn.

3.4.5. Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế

3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu

 Nguyên tắc

Thịt trùn quế sau khi xay và sấy ở 105oC thì toàn bộ lượng nước trong nguyên

liệu bị bốc hơi. Từ đó ta xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu.

 Tiến hành

Sấy đĩa hoặc khay men ở 90oC – 100oC trong 30 phút, để nguội trong không khí

và cân chính xác đến 0,01 g. Tùy thuộc vào lượng nước có mẫu mà lấy khoảng 100

– 500 g mẫu vào đĩa. Cho đĩa đựng mẫu vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 60 – 65oC trong

4 – 5 giờ. Sau khi sấy, lấy đĩa ra và để nguội trong không khí 3 – 4 giờ cho mẫu trở

lại trạng thái khô tự nhiên trong không khí, đem cân. Tiếp theo cho đĩa mẫu vào tủ

sấy và sấy cho đến lúc khối lượng giữa hai lần liên tiếp không chênh lệch nhau quá.

 Chỉ tiêu theo dõi

Hàm lượng nước ban đầu (X1 ) tính bằng phần trăm theo công thức:

(𝐺1− 𝐺2) ∗ 100 𝐺

X1 =

Trong đó:

G1: khối lượng đĩa hoặc khay có mẫu thử trước khi sấy, tính bằng g.

G2: khối lượng đĩa hoặc khay có mẫu thử sau khi sấy, tính bằng g.

G: khối lượng mẫu thử, tính bằng g.

38

Đồ án tốt nghiệp

3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế

 Nguyên tắc

Tro thô là phần vật chất của mẫu còn lại sau khi nung (vô cơ hóa) ở nhiệt độ

550oC – 700oC trong 4 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm, sau đó cân tính sự chênh

lệch trước và sau khi nung, xác định hàm lượng khoáng trong mẫu.

 Dụng cụ và hóa chất

Cân phân tích có độ chính xác 0,002 g.

Chén nung bằng sứ chịu nhiệt có dung tích 30 – 35 ml. Chén nung đã được nung

ở nhiệt độ 500 – 550oC trong 1 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân P0.

Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (± 10oC).

HNO3 đậm đặc.

Kẹp sắt, bình hút ẩm, nước cất.

 Tiến hành

Mẫu trùn tươi, xử lý sơ bộ (cô cạn, sấy 150oC nghiền lấy mẫu trung bình) thời

gian 12:00 – 12:30 giờ.

Cân 1 ± 0,001 g vào chén nung đã biết P0 (trọng lượng bì). Đặt chén nung vào

lò nung (t = 100oC) để mẫu cháy hết khói đen, đóng cử lò nung, điều chỉnh nhiệt độ

600oC và nung trong 4 giờ đến khi mẫu có màu trắng hay màu xám xanh là được.

Nếu mẫu chưa cháy hết, tiếp tục nung thêm 1 giờ. Làm nguội tro (thấm ướt tro bằng

nước cất và thêm vào 10 – 15 giọt HNO3 đậm đặc). Nung chén mẫu ở nhiệt độ 600oC

cho đến khi được tro hóa hoàn toàn. Hạ nhiệt độ khoảng 200oC, làm nguội trong bình

hút ẩm (15 phút) và đem cân P2 lặp lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng

không đổi.

 Chỉ tiêu theo dõi

Khối lượng mẫu trước và sau khi nung, khối lượng chén P0.

% Chất mất khi nung = ( P1 – P2 ) x 100/ mg mẫu

% Khoáng tổng số = ( P2 – P0) x 100/mg mẫu

Trong đó:

P0: khối lượng chén nung trước khi nung.

39

Đồ án tốt nghiệp

P1: khối lượng mẫu và chén trước khi nung.

P2: khối lượng mẫu và chén sau khi nung.

3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định

lượng Nitơ tổng số)

 Nguyên tắc

+ bằng dung dịch kiềm và hứng NH3 thoát ra bằng

Dưới tác dụng của H2SO4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ

+. Đẩy NH4

đều chuyển thành NH4

dung dịch acid.

 Vật liệu thí nghiệm

 Mẫu được sấy khô.

 Hóa chất: H3BO4 4%, HCl 0,25 N, H2SO4 đậm đặc, NaOH 32%, methyl

đỏ, bromocresol xanh lá, cồn 96o, nước cất.

 Dụng cụ: bộ phá mẫu Kjeldahl, bếp đun, cối chày sứ, bình định mức, bình

tam giác, ống hút, máy cất đạm Parnas Wargner.

 Tiến hành

 Xác định và phá mẫu (vô cơ hóa mẫu)

Cân 0,1 g mẫu đã sấy khô, nghiền kĩ rồi cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 g chất

súc tác (selenium 60 g, K2SO4 865 g, CuSO4 75 g) và 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc,

nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu bằng cách đun nhẹ cho hỗn hợp tan ra vào

dung dịch bên trong.

Khi thời gian phá mẫu kết thúc, để ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút), trộn

đều, để nguội và tiến hành chưng cất mẫu.

 Chưng cất mẫu

Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30 ml dung dịch NaOH 32%.

Khởi động quy trình chưng cất, dịch chưng cất được thu từ bình thu có bổ sung trước

20 ml acid boric 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng cất khi thu được khoảng 125 –

150 ml dịch chưng cất.

 Chuẩn độ: bằng HCl 0,25 N. Dừng chuẩn độ khi xuất hiện mất màu xanh.

40

Đồ án tốt nghiệp

 Chỉ tiêu theo dõi

Dung dịch mất màu xanh

Thông qua số HCl 0,25 N người ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH3

và do vậy biết được số lượng NH3 giải phóng từ mẫu: trung bình cứ 1 ml HCl 0,25

N tương ứng với 0,0035 g nitơ hữu cơ.

Kết quả tính toán thể hiện theo Nitơ hữu cơ hoặc Nitơ tổng số.

𝑚

%Nts = 𝐻𝐶𝑙 0,25𝑁∗0,0035 ∗ 100 Với m: trọng lượng mẫu.

Phần trăm Nitơ tổng số (%): thông thường protein chứa khoảng 16% N. Khí

NH3 nhận được khi chưng cất nhân với hệ số quy đổi là 100/16 gần = 6,25 sẽ cho

𝑚

biết giá trị protein tương đương (hay NH3 tổng). Protein Ʃ = 𝐻𝐶𝑙 0,25𝑁∗0,35 ∗ 6,25 Với m: trọng lượng mẫu.

3.4.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp

Anson cải tiến

 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme protease

có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy

phân bằng dung dịch acid trichloacetic (TCA). Định lượng sản phẩm được tạo thành

trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu. Dựa

vào đồ thị chuẩn của Tyrosine để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên.

 Hóa chất

HCl 0,2 N.

Đệm phosphate pH 7 (0,05M).

Dung dịch casein 1%: hòa tan 1 g casein vào 90 ml dung dịch đệm phosphate

0,05 M. Đun tan casein, sau đó điều chỉnh pH bằng HCl 1 N hoặc NaOH 1 N tới pH

= 7. Chuyển sang bình định mức 100ml và bổ sung dung dịch đệm phosphate tới

vạch.

Na2CO3 6%: hòa tan 6 g Na2CO3 trong nước cất và định mức tới 100 ml.

Dung dịch (TCA) 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cất, sau đó chuyển sang bình

định mức và định mức tới 100 ml, lắc đều.

41

Đồ án tốt nghiệp

Dung dịch Tyrosine 1 mM (1 µmol/ml): cân 181,19 mg/ml tyrosine tinh khiết

hòa tan trong dung dịch HCl 0,2 N và chuyển sang bình định mức 100 ml, định mức

tới vạch ta được dung dịch gốc 10 mM. Khi sử dụng pha loãng dung dịch gốc 10 lần

bằng HCl 0,2 N thu được dung dịch tyrosine 1 mM.

Thuốc thử Folin-Ciocalteu (FC) (pha loãng 5 lần).

Dung dịch enzyme chế phẩm thô.

 Cách tiến hành

Dựng đường chuẩn Tyrosine theo bảng

Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin

Ống nghiệm Dung dịch hóa chất ĐC 1 2 3 4 5

Dung dịch Tyrosine chuẩn (1 µmol/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 0 1

Dung dịch HCl 0,2 N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 1

5 5 5 5 5 5 Dung dịch Na2CO3 (ml)

Thuốc thử FC (ml) 1 1 1 1 1 1

Nồng độ Tyrosine tương ứng (1 µmol/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 0 1

Lắc đều, để yên ở 37oC/30 phút. Sau Đó đo độ hấp thu dung dịch ở bước sóng

750 nm, lấy mẫu đối chứng (ĐC) làm mẫu trắng.

Vẽ đường chuẩn Tyrosine bằng phần mềm excel, xác định phương trình đường

chuẩn và hệ số tương quan R2.

Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu

Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng

Dung dịch enzyme (ml) 0 1

Ổn định nhiệt độ enzyme: 37oC/5 phút

Casein 1% ở 37oC (ml) 2 2

Phản ứng enzyme: Ủ ở 37oC/20 phút

TCA (ml) 2,5 2,5

Dung dịch enzyme (ml) 1 0

42

Đồ án tốt nghiệp

Kết tủa cơ chất còn dư: Lắc đều, ủ ở 37oC/30 phút. Lọc lấy dịch loại bỏ kết tủa

Dịch lọc (ml) 1 1

5 5 Na2CO3 (ml)

FC pha loãng (ml) 1 1

Phản ứng tạo phức với FC: Ủ ở 37oC/30 phút

Đo độ hấp thu ở 750 nm ATN AĐC = 0

 Cách tính

Định nghĩa đơn vị Anson: Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong

điều kiện thí nghiệm (37oC, pH 7,6...) thủy phân Casein trong một phút tạo thành sản

phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước

sóng 750 nm tương ứng với 1 µmol Tyrosine trong đường chuẩn.

Hàm lượng Tyrosine được giả phóng do enzyme protease thủy phân được tính

dựa vào đường chuẩn Tyrosine (từ (ATN-AĐC) suy ra X µmol/ml Tyrosine sinh ra).

Hoạt tính dung dịch enzyme pha loãng:

= HT1 (U ml)⁄ X ∗ 5,5 ∗ F 𝑣 ∗ 20

X∗5,5 ∗ F ∗ V

Hoạt tính chế phẩm enzyme thô

v∗20∗m

HT0 (U/g) =

Trong đó:

X: nồng độ tyrosine suy ra từ đường chuẩn (µmol/ml).

5,5: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng thủy phân (ml).

V: thể tích dung dịch toàn bộ enzyme thu được từ chế phẩm (ml).

𝑣: thể tích dịch lọc đem phản ứng tạo màu (1ml).

20: thời gian thủy phân cơ chất (phút).

m: khối lượng chế phẩm enzyme đem đi xác định hoạt tính (g).

F: độ pha loãng mẫu enzyme.

43

Đồ án tốt nghiệp

3.4.5.5. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng protein

 Nguyên tắc

Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của các acid

amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau

có hàm lượng các acid amin này giống nhau. Khi cho protein tác dụng với thuốc thử

Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cường độ màu của phức chất này tỷ lệ với

hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là hàm lượng acid amin). Vì thế ta có thể dùng

phương pháp so màu để xác định hàm lượng acid amin.

 Tiến hành thí nghiệm

Hóa chất:

Dung dịch mẫu protein có trong thịt trùn quế.

Dung dịch thuốc thử Folin (pha loãng 2 lần)

Dung dịch Albumin 0,1%

Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1 N thành 100 ml.

Dung dịch B: cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch Citrat natri 1%

tạo thành 100 ml.

Dung dịch C: là hỗn hợp của 2 dung dịch A và B được pha theo tỷ lệ 49 : 1 (chỉ

pha để dùng trong ngày).

Dụng cụ, thiết bị: buret 25 ml, ống nghiệm, pipet, bình định mức, erlen,…

Bảng 3.3. Lập đường chuẩn Albumin

Ống 1 4 3 5 ĐC 2

50 0 Nồng độ protein µg/ml 100 150 200 250

Albumin 0,1% (ml) 0,5 2 1,5 0 2,5 1

9,5 8 8,5 10 7,5 9 H2O

Dung dịch C (49:1) (ml) 2 2 2 2 2 2

0,2 0,2 0,2 0,2 Thuốc thử Folin (9 ml) 0,2 0,2

Lắc đều và để yên một lúc sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 750 nm. Từ đó

dựng đường chuẩn. Cách xác định hàm lượng protein trong dịch nghiên cứu ta tiến

hành tương tự như phần xây dựng đồ thị chuẩn.

44

Đồ án tốt nghiệp

 Chỉ tiêu theo dõi

Trị số mật độ quang (OD) của những ống mẫu được đối chiếu với đường biểu

diễn biến thiên để suy ra hàm lượng protein có trong dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml).

Hàm lượng protein trong một g mẫu được tính theo công thức:

a ∗ 10−3 ∗ n m

mg protein/g =

Trong đó:

a*10-3 : nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (mg/ml).

n: độ pha loãng mẫu.

m: khối lượng mẫu sử dụng (g).

3.4.6. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease

3.4.6.1. Xác định nhiệt độ tối ưu

Sau khi thu được dịch chiết enzyme protease, tiến hành thực hiện các thí nghiệm

xác định hoạt tính protease của enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến. Hút 1 ml

dung dịch enzyme mẫu, để ổn định ở các nhiệt độ trong 5 phút, sau đó hút 2 ml dung

dịch casein (1%) giữ ở các mức nhiệt độ khác nhau trong 20 phút, sau đó hòa tan vào

2,5 ml dung dịch TCA 5% lắc đều và giữ ở các mức nhiệt độ khác nhau trong 30 phút.

Sau đó lọc và hút 1 ml dịch lọc và thêm vào ống nghiệm 5 ml dung dịch Na2CO3, 1

ml thuốc thử FC rồi để yên 30 phút sau đó đo OD ở bước sóng 750 nm.

Nhiệt độ phản 35 40 45 50 55 60 65 ứng (oC)

Sau đó xác định được nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease dựa

vào đồ thị chuẩn.

3.4.6.2. Xác định pH tối ưu

Dựa vào mức nhiệt độ tối ưu để thực hiện thí nghiệm xác định hoạt tính protease

với các giá trị pH khác nhau. Hút 1 ml dung dịch enzyme mẫu, để ổn định ở các nhiệt

độ trong 5 phút, sau đó hút 2 ml dung dịch casein (1%) giữ ở các mức nhiệt độ khác

nhau trong 20 phút, sau đó hòa tan vào 2,5 ml dung dịch TCA 5% lắc đều và giữ ở

45

Đồ án tốt nghiệp

các mức nhiệt độ khác nhau trong 30 phút. Sau đó lọc và hút 1 ml dịch lọc và thêm

vào ống nghiệm 5 ml dung dịch Na2CO3, 1 ml thuốc thử FC rồi để yên 30 phút sau

đó đo OD ở bước sóng 750 nm.

6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 pH

Xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease thu được dựa vào

đồ thị chuẩn.

3.4.7. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein Trùn quế

3.4.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất

Sau khi xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính của enzyme ở thí

nghiệm 3.4.6.1 và 3.4.6.2, ta tiến hành thí nghiệm thủy phân với thời gian thủy phân

là 4 giờ, thể tích dịch cơ chất là 30ml và nồng độ enzyme cho vào mẫu là 1%. Tiến

hành thủy phân cơ chất với các nồng độ như sau:

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v)

Nghiệm thức Nồng độ cơ chất (%)

1 5

2 10

3 15

4 20

5 25

6 30

Thể tích dùng cho quá trình khảo sát là 30 ml/erlen gồm cả cơ chất và enzyme,

ở mỗi nồng độ gồm 1 erlen thử không và 3 erlen thử thật. Sau khi cho enzyme vào

mỗi nồng độ cơ chất khác nhau, đối với erlen thử không thì sau 4 giờ mới bổ sung

enzyme đã bất hoạt bằng cách đun sôi, rồi tiến hành pha loãng để đo hàm lượng acid

amin. Đối với mẫu thử thật thì sau khi ủ 4 giờ trong bể ủ nhiệt ở 50oC ta tiến hành

pha loãng 100 lần. Sau khi bất hoạt và pha loãng, tiến hành ly tâm ở 4000 vòng/15

phút để thu dịch nổi. Dịch thu được sau khi ly tâm, pha loãng 50 lần và cho vào các

46

Đồ án tốt nghiệp

ống nghiệm tương ứng 1 ml (không cho vào ống thử không), thêm vào mỗi ống 2 ml

dung dich C đã được pha và 0,2 ml thuốc thử Folin, sau đó thêm nước vào các ống

nghiệm để được 5 ml. Các ống nghiệm được để yên trong vòng 10 phút rồi đem đo

OD (750 nm) và dựa vào đồ thị chuẩn để xác định hàm lượng acid amin trong dịch

thủy phân. Thực hiện đối với enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm (enzyme

thu được từ chế phẩm lên men bán rắn vi khuẩn Bacillus sp.).

3.4.7.2. Khảo sát nồng độ enzyme

Sau khi xác định được nồng độ cơ chất tối ưu cho từng enzyme. Nhiệt độ, thời

gian thủy phân và thể tích dịch thủy phân tương tự như ở thí nghiệm 3.4.7.1 với nồng

độ cơ chất tối ưu ta tiến hành thay đổi nồng độ enzyme với các các nồng độ khảo sát

như sau:

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%)

Nghiệm thức Nồng độ enzyme(%)

1 0,5

2 1

3 1,5

4 2

5 2,5

6 3

Quá trình thủy phân và thu được dịch khảo sát được thực hiện như ở thí nghiệm

3.4.7.1, dịch li tâm được đo OD (750 nm). Sau đó dựa vào đồ thị chuẩn để chọn nồng

độ enzyme tối ưu.

3.4.7.3. Khảo sát thời gian thủy phân

Sau khi chọn được nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme tối ưu ta tiến hành khảo

sát thời gian thủy phân để xác định độ bền nhiệt của enzyme ở các thời điểm khác

nhau từ 0 giờ tới 20 giờ, mỗi thời điểm khảo sát cách nhau 2 giờ. Quá trình thực hiện

và thu nhận dịch khảo sát tương tự như ở thí nghiệm trên. Sau đó cũng đem đi đo OD

(750 nm) và dựa vào đồ thị chuẩn để chọn thời gian thủy phân tối ưu.

47

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Nghiệm thức Thời gian thủy phân (giờ)

0 1

2 2

4 3

6 4

8 5

10 6

12 7

14 8

16 9

18 10

20 11

3.4.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm. (Nguyễn Cảnh, 1993), (N.X.

ÊGÔRÔV và Nguyễn Lân Dũng, 1976)

Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nồng

độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân đến khả năng

thủy phân của enzyme protease lên protein của Trùn quế, xác định được điều kiện tối

ưu để tối ưu hóa quá trình thủy phân.

Từ điều kiện cơ sở tiến hành tối ưu hóa các yếu tố trên. Qui hoạch thực nghiệm

theo yếu tố 2n là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố nghiên

cứu. Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức

độ là trên (+) và dưới (-). Trung tâm của thực nghiệm là điều kiện cơ sở đã xác định

được.

48

Đồ án tốt nghiệp

3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu

Các thí nghiệm trên đều được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố,

mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Kết quả thí nghiệm được xử lý sai số, vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm

Microsoft Excel 2013 và xử lí trống kê bằng phần mềm stragraphic 7.0 để so sánh

các nghiệm thức trong mỗi thí nghiệm.

Sau khi thu nhận kết quả của phương pháp quy hoạch thực nghiệm, tiến hành

thủy phân protein của Trùn quế trong điều kiện tối ưu nhất để phục vụ cho các ứng

dụng trong chăn nuôi sau này.

Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hưởng

đến quá trình thủy phân protein. Qua kết quả từ các thí nghiệm, lấy kết quả trung bình

để chọn ra thông số tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo và cũng chính là thông số tối

ưu của quá trình nghiên cứu.

49

Đồ án tốt nghiệp

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp.

4.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm Probiotic

Trong quá trình tiến hành nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus sp.

từ nguồn chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy sản đang được lưu hành trên

thị trường với mục đích chính làm tăng khả năng thu nhận được các chủng có đặc

tính probiotic cao cũng như khả năng sinh enzyme protease, khả năng kháng các vi

khuẩn gây bệnh, có khả năng chống chịu tốt với môi trường đã được các nhà sản xuất

tuyển chọn trước đó.

Quá trình phân lập được thực hiện trên môi trường MT1 (phụ lục 1), ủ ở 37oC,

24 giờ trong tủ ấm. Sau khi khuẩn lạc mọc, chọn các khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện

các thí nghiệm tiếp theo và cấy chuyền giữ giống dùng cho các thí nghiệm sau này.

Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1.

Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu

Kí hiệu: W  ZYME (1), VIME  BITECH (2), EPICIN  PONDS (3), PROBIOTIC

(4), BIO  MORAR’S (5), BIO  PRO (6)

50

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm

STT TÊN CHẾ PHẨM Mật độ (CFU/g) 4,3 x 105 W – ZYME 1 Mật độ trên nhãn (CFU/g) 9 x 108

2 VIME - BITECH 2,5 x 105 6 x 109

3 EPICIN – PONDS 7,6 x 105 5 x 109

4 PROBIOTIC 0 7 x 108

5 BIO – MORAR’S 7 x 105 7 x 108

6 BIO - PRO 9 x 105 8 x 108

 Kết luận:

 Chế phẩm PROBIOTIC: Không phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus sp.

như đã được công bố trên nhãn sản phẩm.

 Các mẫu chế phẩm còn lại: Phân lập được một chủng Bacillus sp. nhưng

mật độ không đạt so với mật độ được công bố trên nhãn sản phẩm.

Từ 6 chế phẩm trên, sau khi tiến hành phân lập theo phương pháp ở mục 3.4.2,

ủ ở 37oC trong 48 giờ, kết quả cho thấy: Mẫu 1 (W-zyme), 5 (Bio – Morars) và 6

(Biopro) có khuẩn lạc màu trắng ngà, bề mặt khô hơi nhăn, mép rìa của khuẩn lạc hơi

nhăn và bám chặt vào bề mặt môi trường thạch.

Mẫu 2 (Vime – Bitech) và mẫu 3 (Epicin – ponds) có nhiều khuẩn lạc không

đồng nhất, bề mặt ướt tạo nhớt.

Tiếp theo tiến hành thu nhận các chủng thuần khiết bằng phương pháp cấy ria

trên đĩa thạch môi trường MT1 (phụ lục 1), mật độ tế bào giảm dần theo vết cấy và

các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ được cấy và bảo quản trong

ống thạch nghiêng để tiếp tục khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa đặc trưng của

chủng vi khuẩn Bacillus sp.

51

Đồ án tốt nghiệp

4.1.2. Nhuộm Gram

Vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn Gram dương nên trong bước tiến hành định danh

chúng ta thực hiện nhuộm Gram đầu tiên. Tiến hành nhuộm Gram khi vi khuẩn còn

non (trong 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn có thể trở thành Gram âm.

Sau khi làm tiêu bản nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào của 3 chủng dưới

kính hiển vi quang học, kết quả được thể hiện ở hình 4.2.

Hình 4.2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6

Kết quả cho thấy vi khuẩn bắt màu tím của thuốc nhuộm (Gram dương), có dạng

hình que ngắn, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi.

4.1.3. Kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa

Tiến hành thí nghiệm khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus sp:

Thử nghiệm khả năng di động, khả năng sinh catalase, khả năng sinh indol, thử

nghiệm methyl red và khả năng lên men các loại đường.

4.1.3.1. Khả năng di động

Các chủng được cấy thẳng vào môi trường thạch đứng chứa 0,5% agar, ủ ở

370C, sau 24 giờ quan sát vết cấy.

Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường

thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không

mọc theo vết cấy. Kết quả được thể hiện trên hình 4.3.

52

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.3. Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6

Kết quả cho thấy trong 3 mẫu thử nghiệm, chủng vi khuẩn 5 và 6 mọc dọc theo

vết cấy và lan ra môi trường xung quanh, chủng 1 mọc dọc theo vết cấy từ đáy ống

nghiệm lên đầu bề mặt thạch và không lan ra môi trường xung quanh.

 Kết luận: Chủng 5 và 6 có khả năng di động và là vi khuẩn hiếu khí.

4.1.3.2. Khả năng sinh catalase

Ở loài vi khuẩn có enzyme catalase thì vi khuẩn có khả năng chuyển hóa H2O2

thành H2O và O2, khi cho H2O2 lên sinh khối của vi khuẩn sẽ có hiện tượng sủi bọt

khí do sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2.

Thử trên đĩa petri: nhỏ trực tiếp H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề

mặt thạch, ghi nhận nếu có sự sủi bọt xung quanh sinh khối. Kết quả được thể hiện ở

hình 4.4.

Hình 4.4. Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6

Kết quả ở thí nghiệm trên cho thấy chủng số 1 không sủi bọt khí (catalase âm

tính), hai chủng 5 và 6 đều sủi bọt khí (catalase dương tính).

53

Đồ án tốt nghiệp

 Kết luận: hai chủng 5 và 6 đều có khả năng sinh enzyme catalase và là vi khuẩn

hiếu khí.

4.1.3.3. Khả năng sinh indol

Nuôi cấy 3 chủng trong môi trường canh Trypton. Sau 24 – 48 giờ nhỏ vài giọt

thuốc thử Kovac’. Kết quả thể hiện ở hình 4.5.

Hình 4.5. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh Indol của 3 chủng 1, 5 và 6

 Kết luận: Kết quả thí nghiệm trên cho thấy cả 3 chủng đều âm tính (không có

khả năng sinh indol).

4.1.3.4. Thử nghiệm methyl red

Cấy một ít sinh khối vào môi trường Clark – Clubs, ủ ở nhiệt độ thích hợp

trong khoảng 2 – 5 ngày. Nhỏ lên môi trường 2 – 3 giọt thuốc thử methyl – red và

đọc kết quả. Kết quả thể hiện ở hình 4.6.

Hình 4.6. Kết quả thử nghiệm Methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6

54

Đồ án tốt nghiệp

 Kết luận: Kết quả cả 3 chủng đều dương tính với thuốc thử Methyl – red.

4.1.3.5. Khả năng lên men các loại đường

Vi khuẩn Bacillus có khả năng lên men các loại đường thông thường là

saccharose và glucose, làm giảm pH môi trường. Là một trong những phản ứng để

đánh giá nhóm vi khuẩn Bacillus.

Thí nghiệm được được thực hiện trên các loại đường sau: saccharose, maltose,

mannitol, galactose, glucose, lactose, xylose, rhamnose, sorbitol, arabinose. Ủ ở 37oC

trong vòng 24 – 48 giờ, quan sát khả làm đổi màu phenol red. Kết quả được thể hiện

ở hình 4.7, 4.8, 4.9.

Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1

55

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.8. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5

56

Đồ án tốt nghiệp

Hình 4.9. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6

 Kết luận:

 Đối với đường glucose, maltose, xylose, rhamnose, arabinose, manitol: cả

3 chủng 1, 5 và 6 đều có khả năng lên men và đổi màu phenol red.

 Đối với đường saccharose, galactose, lactose: chỉ có chủng 5 và 6 có khả

năng lên men và làm đổi màu phenol red.

 Đối với đường sorbitol: cả 3 chủng 1, 5 và 6 đều không có khả năng lên

men và đổi màu phenol red.

57

Đồ án tốt nghiệp

Từ các thí nghiệm khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa trên chúng tôi có bảng kết

quả sau:

Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát

Ký hiệu chủng Đặc điểm 5 6 1

Nhuộm Gram Gram + Gram + Gram +

Khả năng di động + + -

Catalase + + -

Indol - - -

Methyl red + + +

Khả năng len men các loại đường

Saccharose + + -

Galactose + + -

Glucose + + +

Lactose - + -

Maltose + + +

Xylose + + +

Rhamnose + + +

Arabinose + + +

Manitol + + +

Sorbitol - - -

(Chú thích: “+”: Dương tính; “”: Âm tính)

 Kết luận: theo khóa phân loại Bergey qua các bước quan sát hình thái , thử

nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa có thể kết luận 2 chủng vi khuẩn 5 và 6 được

phân lập trên 2 mẫu chế phẩm Bio – Morars và Biopro là Bacillus sp.

4.2. Đánh giá các hoạt tính sinh học

Tiếp tục thực hiện các thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng

sinh enzyme protease để tuyển chọn được chủng có hoạt tính sinh học cao sử dụng

trong lên men trên môi trường bán rắn.

58

Đồ án tốt nghiệp

4.2.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn

Dùng phương pháp đục lỗ thạch và đo vòng kháng khuẩn để xác định khả năng

kháng khuẩn của 3 chủng 5 và 6 đối với các vi khuẩn kiểm định: Chủng E.coli,

Salmonella sp, S. aureus. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3.

Bảng 4.3. Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng

Kí hiệu chủng Hoạt tính kháng khuẩn (D – d, mm)

E. coli Salmonella S. aureus

10 5 2 1

16 8 5 5

20 10 12 6

Từ kết quả trên cho thấy cả 3 chủng đều có khả năng kháng khuẩn và mạnh nhất

là chủng số 6 với các vi khuẩn kiểm định: E.coli, Salmonella, S. aureus lần lượt (D –

d = 20, 10, 12), và thấp nhất ở chủng số 1 (D – d = 10, 5, 2).

4.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme protease

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường có chứa 1% casein. Định tính khả

năng sinh enzyme protease của 3 chủng Bacillus sp. bằng phương pháp đục lỗ thạch.

Nhỏ dịch nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng đã được ly tâm ở 4000 vòng/ phút

trong 15 phút để thu dịch chiết enzyme ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới) vào giếng, sau

48 giờ tiến hành thử thuốc thử và theo dõi sự xuất hiện của vòng phân giải xung quanh

giếng và đo đường kính vòng phân giải của các enzyme quanh giếng. Kết quả đo

được thể hiện ở bảng 4.4.

Bảng 4.4. Kết quả xác định vòng phân giải Casein của enzyme

protease thu nhận từ 3 chủng sau 48 giờ

STT Enzyme protease (D – d, mm)

22 1

24 5

27 6

59

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả trên cho thấy cả 3 mẫu vi khuẩn đã phân lập được đều có khả năng

sinh enzyme protease, tốt nhất ở chủng số 6 (D – d = 27 mm) và thấp nhất ở chủng

số 1 (D – d = 22 mm). Theo Brown (2005), vi khuẩn không thể thực hiện sự thực bào

do thành tế bào cứng nên chúng bài tiết ra các enzyme ngoại bào đê thủy phân các

đại phân tử lớn, như protease thủy phân protein, amylase thủy phân tinh bột thành

các amino acid và monosaccharide sau đó vận chuyển vào tế bào cho quá trình trao

đổi chất. (trích Lê Mỹ Phương, 2008).

Sau các kết quả khảo sát, chủng số 6 có khả năng kháng khuẩn mạnh và khả

năng sinh enzyme protease cao nên được chọn để tiếp tục tiến hành lên men bán rắn

thu enzyme protease thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

4.3. Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế

Dùng thịt trùn quế tươi để làm cơ chất cho các thí nghiệm khảo sát quá trình

thủy phân. Tiến hành xác định những thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế dùng

để thủy phân. Kết quả được trình bày trong bảng 4.5.

Bảng 4.5. Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân

Chỉ tiêu phân tích Hàm lượng

Nitrogen tổng số (g/100g NL) 10,99

68,54 Protein tổng (%) (Nts x 6,25)

Độ ẩm (%) 80,04

Khoáng tổng số (%) 23,77

Theo kết quả phân tích ở trên cho thấy trong thịt trùn có hàm lượng đạm tổng

số và protein tổng số cao.

Ứng dụng trùn quế vào thức ăn chăn nuôi làm tăng hàm lượng đạm hữu cơ và

với hàm lượng protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, làm

thức ăn lý tưởng để nuôi thủy sản đang được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên protein

có trong thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa nên thủy phân bằng protease mang lại

nhiều ưu điểm và hết sức cần thiết, vì trùn quế là nguồn cơ chất khá phong phú và

phổ biến ở nước ta.

60

Đồ án tốt nghiệp

4.4. Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ

chế phẩm.

Sau khi lên men bán rắn để thu chế phẩm enzyme (CPE), chế phẩm được phơi

khô bằng quạt gió rồi xay nhuyễn để vào túi kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng, dùng

để xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình thủy phân protein trùn quế.

4.4.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease

Mỗi loại enzyme có một khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp và khi nhiệt độ

tăng trong khoảng nhiệt độ tối thích thì tốc độ phản ứng thủy phân tăng, đến một

ngưỡng nhất định hoạt động của enzyme sẽ giảm mạnh. Với từng enzyme, nhiệt độ

thích hợp có thể thay đổi khi thay đổi pH, cơ chất, thời gian phản ứng,…

Kết quả thí nghiệm được ghi nhận ở đồ thị 4.1. Theo kết quả phân tích ANOVA

và bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát cho thấy có sự khác biệt về mặt

thống kê giữa các nghiệm thức khảo sát nhiệt độ (P  value < 0,05). Trong đó, ở nhiệt

độ 55oC cho hoạt tính enzyme cao nhất (phụ lục 3, 4, 5).

Ảnh hưởng của nhiệt độ

250

) g / U

200

150

100

( e s a e t o r P e m y z n e h n

50

í t t ạ o H

0

30

40

50

60

70

Nhiệt độ (0C)

Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính enzyme chế phẩm

61

Đồ án tốt nghiệp

Từ kết quả ở đồ thị 4.1 cho thấy enzyme protease thu được có khoảng nhiệt độ

hoạt động tốt từ 50oC đến 55oC với hoạt tính thấp nhất ở 35oC là 147,3 U/g và tăng

dần ở các mức nhiệt độ từ 40oC đến 50oC hoạt tính của enzyme protease thu được từ

chế phẩm tối ưu ở mức nhiệt độ 55oC là 225,4 U/g. Khi ở nhiệt độ thấp, enzyme vẫn

hoạt động nhưng khá thấp và tăng dần khi nhiệt độ tăng lên. Khi nhiệt độ tăng cao

hơn nhiệt độ hoạt động thích hợp (55oC) thì hoạt động của enzyme giảm vì nhiệt độ

cao sẽ làm biến tính enzyme nên hoạt tính enzyme bắt đầu giảm mạnh chỉ còn 176,7

U/g ở nhiệt độ 65oC. Từ kết quả trên, ta chọn nhiệt độ tối ưu là 55oC cho các thí

nghiệm tiếp theo. Kết quả này phù hợp với kết quả báo cáo của tác giả Saurabh, S.

Jasmine, I. Pritesh, G. and Rajendra Kumar, S (2007).

4.4.2. Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease

PH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân và với từng enzyme, pH

thích hợp phù thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, cơ chất, dung dịch đệm… PH ảnh

hưởng đến mức độ ion hóa có chất, enzyme, phức hợp enzyme  cơ chất và đặc biệt

là ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Ở thí nghiệm này, hoạt tính enzyme được khảo

sát ở các mức pH như sau: 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0. 8,5.

Kết quả thí nghiệm được ghi nhận ở đồ thị 4.2. Theo kết quả phân tích ANOVA

và bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát cho thấy có sự khác biệt về mặt

thống kê giữa các nghiệm thức khảo sát pH (P  value < 0,05). Trong đó, ở pH 7,5

cho hoạt tính enzyme cao nhất (phụ lục 6, 7, 8).

62

Đồ án tốt nghiệp

Ảnh hưởng của pH

350

) g / U

300

250

200

150

100

( e s a e t o r P e m y z n e h n

50

0

5.5

6

6.5

8

8.5

9

7

í t t ạ o H

7.5 pH ban đầu

Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính enzyme chế

phẩm Kết quả thu được ở đồ thị 4.2 cho thấy enzyme chế phẩm hoạt động tốt trong

khoảng pH từ 7,0 8,0 với và hoạt tính của enzyme cao nhất ở giá trị pH 7,5 là 302,2

U/g. Hoạt tính enzyme thấp nhất ở giá trị pH 6 là 187,6 U/g. Với mức pH có giá trị

cao hơn 7,5, hoạt tính enzyme giảm dần chỉ còn 219,4 U/g ở giá trị pH 8,5 vì khi pH

qua thấp hay quá cao có thể làm biến tính enzyme. Kết quả cho thấy giá trị pH tối ưu

cho hoạt động của enzyme protease là 7,5. Theo báo cáo của Singh, N. Batra, R.C.

Sobti (2000) pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease thu được từ vi khuẩn

Bacillus sp. SSR1 là 8, tuy có sự chênh lệch nhưng không đáng kể nhưng kết quả này

phù hợp với kết quả báo cáo của F Soundra Josephine và cộng sự (2012).

4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân

Tiến hành khảo sát nồng độ cơ chất lần lượt là: 5%, 10%, 15%, 20%, 25% và

30%, bổ sung nồng độ enzyme là 1%, nhiệt độ 55oC và dung dịch đệm pH 7,5. Sau

khi thủy phân trong thời gian là 4 giờ, lấy mẫu ra thu dịch thủy phân và đem đi đo

OD (750 nm) để xác định hàm lượng acid amin theo phương pháp Lowry và chọn ra

nồng độ cơ chất tối ưu cho phản ứng.

63

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả thí nghiệm được ghi nhận ở đồ thị 4.3. Theo kết quả phân tích ANOVA

và bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát cho thấy có sự khác biệt về mặt

thống kê giữa các nghiệm thức khảo sát nồng độ cơ chất (P  value < 0,05). Trong

đó, ở nồng độ cơ chất là 15% thì hàm lượng acid amin thu được đạt cao nhất khi dùng

enzyme thương phẩm và ở nồng độ cơ chất là 20% thì hàm lượng acid amin thu được

đạt cao nhất khi dùng enzyme chế phẩm (phụ lục 9, 10, 11, 12, 13, 14).

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

600

i

500

n m a d

400

i c a

) g n ứ h c i ố đ

300

Enzyme thương phẩm Enzyme chế phẩm

i ớ v

g n ợ ư

200

l

o s

100

%

(

m à H

0

0

10

30

40

20 Nồng độ cơ chất (%)

Đồ thị 4.3. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau quá trình thủy phân với nồng độ cơ chất khác nhau

 Nhận xét:

 Thủy phân bằng enzyme thương phẩm:

Kết quả trên đồ thị 4.3 ta thấy với nồng độ cơ chất từ 5  10% thì hàm lượng

acid amin tăng dần, cụ thể là ở nồng độ cơ chất 5% thì % hàm lượng acid amin so với

đối chứng đạt được gấp 3,08 lần và gấp 3,37 lần ở nồng độ cơ chất 10%. Nồng độ cơ

chất tối ưu cho quá trình thủy phân là 15% (% hàm lượng acid amin so với đối chứng

đạt được gấp 4,45 lần). Sau đó giảm dần ở các nồng độ tiếp theo với nồng độ ở 30%

thì % hàm lượng acid amin so với đối chứng đạt gấp 3,99 lần.

 Thủy phân bằng enzyme chế phẩm:

64

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả trên đồ thị 4.3 ta thấy với nồng độ cơ chất từ 5  15% thì hàm lượng

acid amin tăng dần, cụ thể là ở nồng độ cơ chất 5% thì % hàm lượng acid amin so với

đối chứng đạt được gấp 2,02 lần, gấp 2,31 lần ở nồng độ cơ chất 10% và gấp 2,89 lần

ở nồng độ cơ chất 15%. Nồng độ cơ chất tối ưu cho quá trình thủy phân là 20% (%

hàm lượng acid amin so với đối chứng đạt gấp 3,26 lần). Sau đó giảm dần ở các nồng

độ tiếp theo với nồng độ ở 30% thì % hàm lượng acid amin so với đối chứng đạt gấp

2,86 lần.

 Giải thích:

Khi nồng độ cơ chất thấp thì hàm lượng acid amin se tăng tuyến tính với sự gia

tăng nồng đồ cơ chất. khi nồng độ cơ chất thấp thì lượng enzyme bổ sung vào còn dư

sẽ thủy phân hết protein có trong nguyên liệu dẫn đến nồng độ cơ chất tăng thì hàm

lượng acid amin tăng.

Ở nồng độ cơ chất tối ưu vì lượng enzyme bổ sung vào vừa đủ để thủy phân hết

protein có trong nguyên liệu nên hàm lượng acid amin sẽ đạt cực đại.

Khi nồng độ cơ chất vượt qua ngưỡng cực đại thì lượng enzyme bổ sung vào là

không đủ nên các enzyme sẽ bị bão hòa bởi lượng cơ chất đó nên hàm lượng acid

amin sẽ giảm xuống.

 Kết luận:

Dựa vào kết quả trên cho thấy sử dụng enzyme chế phẩm đạt hàm lượng acid

amin tương đối cao so với dùng enzyme thương phẩm cho quá trình thủy phân thịt

trùn quế (đạt 71,59%). Do đó tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tiếp theo với nồng độ

cơ chất thủy phân là 15% khi dùng enzyme thương phẩm và 20% khi dùng enzyme

chế phẩm.

4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình

thủy phân

Sau khi chọn được nồng độ cơ chất tối ưu, tiến hành khảo sát nồng độ enzyme

tham gia vào quá trình phản ứng với các nồng độ lần lượt là: 0,5%; 1%; 1,5%; 2%;

2,5%; 3%. Bổ sung nồng độ enzyme là 1%, nhiệt độ 55oC, dung dịch đệm pH 7,5 và

thủy phân trong vòng 4 giờ. Quá trình thủy phân được thực hiện tương tự như mục

65

Đồ án tốt nghiệp

4.5. Dịch thủy phân đem đi đo OD (750 nm) để xác định hàm lượng acid amin và

chọn ra nồng độ enzyme tối ưu cho phản ứng. Kết quả được trình bày đồ thị 4.4.

Kết quả thí nghiệm được ghi nhận ở đồ thị 4.2. Theo kết quả phân tích ANOVA

và bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát cho thấy có sự khác biệt về mặt

thống kê giữa các nghiệm thức khảo sát nồng độ enzyme (P  value < 0,05). Trong

đó, ở nồng độ enzyme là 1,5% thì hàm lượng acid amin thu được đạt cao nhất khi

dùng enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm (phụ lục 15, 16, 17, 18, 19, 20).

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

600

500

i

400

n m a d

Enzyme thương phẩm

300

) g n ứ h c i ố đ

Enzyme chế phẩm

i ớ v

i c a g n ợ ư

200

l

o s

100

%

(

m à H

0

0

1

2

4

3 Nồng độ enzyme (%)

thủy phân với nồng độ Enzyme khác nhau

Đồ thị 4.4. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình

 Nhận xét:

 Thủy phân bằng enzyme thương phẩm:

Kết quả trên đồ thị 4.4 ta thấy với nồng độ enzyme từ 0,5  1% thì hàm lượng

acid amin tăng dần, cụ thể là ở nồng độ enyme 0,5% thì % hàm lượng acid amin so

với đối chứng đạt được gấp 2,99 lần và gấp 3,82 lần ở nồng độ enzyme 1%. Nồng độ

enzyme tối ưu cho quá trình thủy phân là 1,5% (% hàm lượng acid amin so với đối

chứng đạt được gấp 4,55 lần). Sau đó giảm dần ở các nồng độ tiếp theo với nồng độ

ở 3% thì % hàm lượng acid amin so với đối chứng đạt gấp 4,07 lần.

66

Đồ án tốt nghiệp

 Thủy phân bằng enzyme chế phẩm:

Kết quả trên đồ thị 4.4 ta thấy với nồng độ enzyme từ 0,5  1% thì hàm lượng

acid amin tăng dần, cụ thể là ở nồng độ enyme 0,5% thì % hàm lượng acid amin so

với đối chứng đạt được gấp 2,25 lần và gấp 2,82 lần ở nồng độ enzyme 1%. Nồng độ

enzyme tối ưu cho quá trình thủy phân là 1,5% (% hàm lượng acid amin so với đối

chứng đạt được gấp 3,50 lần). Sau đó giảm dần ở các nồng độ tiếp theo với nồng độ

ở 3% thì % hàm lượng acid amin so với đối chứng đạt gấp 2,81 lần.

 Giải thích:

Khi nồng độ enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều vì vậy

hàm lượng acid amin sẽ tăng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme.

Khi đạt đến nồng độ enzyme tối ưu thì lượng cơ chất sẽ bị thủy phân hoàn toàn

nên hàm lượng acid amin thu được sau thủy phân đạt cực đại.

Tuy nhiên khi nồng độ enzyme quá lớn, cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc

độ phản ứng của enzyme nên hàm lượng acid amin thu được sẽ giảm dần.

 Kết luận:

Kết quả trên cho thấy so với dùng enzyme thương phẩm, các thí nghiệm sử dụng

enzyme chế phẩm đạt hàm lượng acid amin tương đối cao so với dùng enzyme thương

phẩm cho quá trình thủy phân thịt trùn quế (đạt 72,28%). Vì vậy nồng độ enzyme

dùng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo là 1,5%.

4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân

Sau khi xác định nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme tối ưu cho quá trình thủy

phân, tiếp tục tiến hành khảo sát thời gian thủy phân với khoảng thời gian từ 0 giờ

đến 20 giờ để xác định hàm lượng acid amin và chọn thời gian tối ưu cho quá trình

thủy phân thủy phân. Quá trình thủy phân được thực hiện như mục 4.6. Dịch thủy

phân đem đi đo OD (750 nm) để xác định hàm lượng acid amin và chọn ra nồng độ

enzyme tối ưu cho phản ứng.

Kết quả thí nghiệm được ghi nhận ở đồ thị 4.5. Theo kết quả phân tích ANOVA

và bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát cho thấy có sự khác biệt về mặt

thống kê giữa các nghiệm thức khảo sát thời gian thủy phân (P  value < 0,05). Trong

67

Đồ án tốt nghiệp

đó, ở thời gian là 14 giờ thì hàm lượng acid amin thu được cao nhất khi dùng enzyme

thương phẩm và ở thời gian 16 giờ khi dùng enzyme chế phẩm (phụ lục 21, 22, 23,

24, 25, 26).

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

600

500

i

400

n m a d

Enzyme thương phẩm

) g n ứ h c i ố đ

300

i ớ v

i c a g n ợ ư

Enzyme chế phẩm

l

200

o s

%

(

m à H

100

0

0

5

10

25

15 20 Thời gian thủy phân (giờ)

Đồ thị 4.5. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình

thủy phân với các mức thời gian khác nhau

 Nhận xét

Từ kết quả trên đồ thị 4.5 cho thấy ở thời gian 0 giờ thì hàm lượng acid amin

thu được là rất thấp chỉ có 0,01% so với đối chứng, từ 2 giờ trở đi thì hàm lượng acid

amin thu được tăng tuyến tính với sự gia tăng thời gian thủy phân, hàm lượng acid

amin tăng chậm từ 2  6 giờ đầu, cụ thể: ở thời gian đầu từ 2 giờ đến 6 giờ thì % hàm

lượng acid amin so với đối chứng tăng từ 227,4% (gấp 2,27 lần) đến 315,3% (gấp

3,16 lần) khi dùng enzyme thương phẩm và tăng từ 167,4% (gấp 1,67 lần) đến 213,1%

(gấp 2,13 lần) khi dùng enzyme chế phẩm, tiếp tục tăng mạnh dần ở các thời gian

khảo sát tiếp theo và hàm lượng acid amin đạt cực đại tại thời gian thủy phân ở 14

giờ (% hàm lượng acid amin so với đối chứng đạt gấp 4,75 lần khi dùng enzyme

thương phẩm) và đạt cực đại ở 16 giờ khi dùng enzyme chế phẩm (% hàm lượng acid

amin so với đối chứng đạt gấp 3,57 lần). Sau đó hàm lượng acid amin giảm dần tới

68

Đồ án tốt nghiệp

20 giờ (% hàm lượng acid amin so với đối chứng đạt gấp 4,26 lần khi dùng enzyme

thương phẩm và đạt gấp 3,20 lần khi dùng enzyme chế phẩm).

 Giải thích:

Khảo sát ở thời gian 0h thì % hàm lượng acid amin so với đối chứng rất thấp

chỉ có 0,01% ( 0) cho thấy ở thời gian 0h thì enzyme chưa kịp thủy phân vì do không

đủ thời gian để enzyme tiếp xúc và phân cắt protein trong nguyên liệu.

Hàm lượng acid amin tăng chậm ở thời gian từ 2 giờ đến 6 giờ đầu vì lúc này

enzyme bắt đầu tiếp xúc và phân cắt protein trong nguyên liệu. Thời gian tiếp xúc

càng dài thì hàm lượng acid amin thu được sau thủy phân càng nhiều.

Đến khi đạt thời gian tối ưu thì enzyme enzyme có đủ thời gian hoạt động để

thủy phân hoàn toàn protein trong nguyên liệu nên hàm lượng acid amin sẽ đạt cực

đại.

Nếu thời gian kéo dài thì trong mẫu sẽ có sự hiện diện của vi sinh vật và sử dụng

mất một phần protein nên hàm lượng acid amin sẽ giảm và đây cũng là nguyên nhân

làm cho nguyên liệu chuyển sang hiện tượng tự phân làm tăng nồng độ NH3 tạo ra

mùi hôi trong mẫu thí nghiệm nếu thời gian thủy phân kéo dài quá lâu.

 Kết luận:

Tiến hành thủy phân trùn quế với thời gian tối ưu là 14 giờ đối với enzyme

thương phẩm và 16 giờ đối với enzyme chế phẩm.

Tuy có sự khác biệt giữa thời gian thủy phân khi dùng enzyme thương phẩm và

enzyme chế phẩm nhưng không đáng kể vì hàm lượng acid amin thu được khi sử

dụng enzyme chế phẩm là tương đối cao, đạt 73,16% so với dùng enzyme thương

phẩm cho quá trình thủy phân thịt trùn quế.

Khi sử dụng enzyme thương phẩm sẽ thủy phân tốt hơn nhưng có giá thành đắt

hơn so với khi sử dụng enzyme chế phẩm thủy phân thì hàm lượng acid amin thu

được cũng tương đối cao mà giá thành rẻ hơn. Vì vậy, để giảm giá thành sản xuất ta

sử dụng enzyme chế phẩm cho quá trình thủy phân.

69

Đồ án tốt nghiệp

4.8. Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn

Tiến hành thủy phân thịt trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn theo bảng

4.6. Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa thịt trùn quế thủy phân bằng enzyme thu

nhận từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp. và thịt trùn quế thủy phân bằng

enzyme thương phẩm Alcalase của công ty Novozyme được trình bày trong bảng 4.7.

Bảng 4.6. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme

thương phẩm và enzyme chế phẩm

Điều kiện Enzyme chế phẩm Enzyme thương phẩm

55 55 Nhiệt độ (0C)

7,5 8 pH

20 15 Nồng độ cơ chất (%)

1,5 1,5 Nồng độ enzyme (%)

16 14 Thời gian thủy phân (giờ)

Bảng 4.7. Kết quả so sánh các chỉ tiêu giữa hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân

Thịt trùn sau thủy phân

Chỉ tiêu Thủy phân bằng Thủy phân bằng

enzyme chế phẩm enzyme thương phẩm

0,23 0,29 Nitrogen tổng số (g/100g SP)

1,46 1,82 Protein tổng (%)

Sau các thí nghiệm 4.5, 4.6 và 4.7 hàm lượng acid amin thu được sau thủy phân

có sự chênh lệch giữa dùng enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm, nhưng sự

chênh lệch không quá cao, hàm lượng acid amin của trùn quế sau thủy phân bằng

enzyme chế phẩm thu được đạt từ 70 – 75% so với thủy phân bằng enzyme thương

phẩm. Và từ bảng kết quả trên cho thấy không có sự khác biệt nhiều giữa thịt trùn

được thủy phân bằng enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm nên enzyme thu

được từ chế phẩm lên men bán rắn vi khuẩn Bacillus sp được chọn để thực hiện các

thí nghiệm tối ưu hóa.

70

Đồ án tốt nghiệp

4.9. Quy hoạch thực nghiệm

Từ kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân, thí nghiệm tối

ưu hóa được thực hiện với 4 yếu tố là nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ và

thời gian thủy phân ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế từ enzyme

chế phẩm và giữ nguyên giá trị pH tối ưu cho các thí nghiệm.

Bảng 4.8. Mã hóa các biến số thực nghiệm theo các yếu tố ảnh hưởng

Mức dưới Mức cơ sở Mức trên Khoảng Các biến số (-) (0) (+) biến thiên

1 1,5 2 0,5 X1: Nồng độ Enzyme (%)

15 20 25 5 X2: Nồng độ cơ chất (%)

50 55 60 5 X3: Nhiệt độ thủy phân (oC)

14 16 18 2 X4:Thời gian thủy phân (giờ)

Bảng 4.9. Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố

Số thí Biến số mã hóa Kí hiệu

nghiệm hàng X1 X2 X3 X4

“1” - 1 - - -

X1 - 2 + - -

X2 - 3 - + -

X1X2 - 4 + + -

X3 - 5 - - +

X1X3 - 6 + - +

X2X3 - 7 - + +

X1X2X3 - 8 + + +

X4 + 9 - - -

X1X4 + 10 + - -

X2X4 + 11 - + -

X1X2X4 + 12 + + -

X3X4 + 13 - - +

X1X3X4 + 14 + - +

71

Đồ án tốt nghiệp

- + + X2X3X4 15 +

+ + + X1X2X3X4 16 +

0 0 0 - 17 0

0 0 0 - 18 0

0 0 0 - 19 0

Từ bảng trên ta thực hiện 3 thí nghiệm ở mức cơ sở và 16 thí nghiệm với mức

biến thiên của các yếu tố. Tiến hành thu dịch chiết sau thủy phân ở 3 mức thời gian

và xác định hàm lượng acid amin bằng phương pháp Lowry.

Bảng 4.10. Kết quả hàm lượng acid amin theo thực nghiệm và phương trình hồi quy

Biến số mã hóa Số thí Y Ŷ (Y- Ŷ)2 nghiệm X1 X2 X3 X4

1 15 50 239.62 243.72 16.81 1 14

2 15 50 246.55 248.11 2.43 2 14

1 25 50 246.98 247.64 0.44 3 14

2 25 50 251.57 254.78 10.30 4 14

1 15 60 188.22 183.36 23.62 5 14

2 15 60 260.90 260.09 0.66 6 14

1 25 60 191.58 191.67 0.01 7 14

2 25 60 246.83 242.87 15.68 8 14

1 15 50 278.81 279.62 0.66 9 18

2 15 50 403.19 408.05 23.62 10 18

1 25 50 270.53 274.49 15.68 11 18

2 25 50 428.54 428.45 0.01 12 18

1 15 60 285.20 283.64 2.43 13 18

2 15 60 303.73 299.62 16.89 14 18

1 25 60 305.61 302.40 10.30 15 18

2 25 60 316.27 315.61 0.44 16 18

1,5 20 55 384.03 - - 17 16

72

Đồ án tốt nghiệp

18 1,5 20 55 16 379.51 - -

19 1,5 20 55 16 381.94 - -

(với Y là hàm lượng acid amin theo thực nghiệm, Ŷ là hàm lượng acid amin

theo phương trình hồi quy).

Phương trình hồi quy có dạng:

Ŷ = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 + b12x12 + b13x13 + b14x14 + b23x23 + b24x24 +

b34x34 + b123x123 + b124x124 + b134x134 + b234x234 + b1234x1234

16 i=1

Các hệ số trong phương trình hồi quy được xác định như sau:

bj = ∑ XjiYi 16

Các hiệu ứng tương tác được xác định tương tự như những hiệu ứng tuyến tính:

16 i=1

Yi bij = ∑ (XjXi) i 16

Dựa vào công thức tính hệ số, kết quả Y ở bảng ma trận và phần mềm excel thu

được kết quả bj và bij như sau:

Bảng 4.11. Kết quả bj và bij

bo b1 b2 b3 b4 b12 b13 b14

279,01 28,19 3,23 -19,10 44,98 0,37 -8,55 10,76

b23 b24 b34 b123 b134 b234 b1234 b124

-0,45 3,02 -4,57 -3,54 -23,10 2,44 -1,65 2,85

Để kiểm định tính ý nghĩ của các hệ số trong phương trình hồi quy và sự tương

thích của phương trình hồi quy có thực nghiệm, ta cần tìm phương sai tái hiện ở 3 thí

nghiệm tại tâm.

Xử lý số liệu tại tâm

Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm tại tâm

Bảng 4.12. Xử lý số liệu tại tâm

STT

0 YTB

𝐘𝐮

0 (𝐘𝐮

∑(𝐘𝐮

0 3 ∑ YTB u=1 3

𝟎 𝐘𝐮 384,03 379,51 381,94

𝟎 − YTB 2,20 -2,32 0,11

=381,83 1 2 3

𝟐 0 ) 𝟎 − YTB 4,84 5,38 0,01

𝟐 0 ) 𝟎 − YTB 10,23

73

Đồ án tốt nghiệp

Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy theo chuẩn Student.

(Yu

3 ∑ u=1

Xác định phương sai tái hiện:

= 5,12

=

2 = Sth

2 0 ) 0 − YTB n−1

10,23 2

Suy ra Sth = 2,262 (với n = 3 là số thí nghiệm tại tâm).

2,262

= 0,566

Phương sai các hệ số:

=

Sbj =

4

Sth √N

(Với N = 16 thí nghiệm)

Dựa vào công thức tính hệ số, kết quả Y ở bảng ma trận và phần mềm Excel ta

có kết quả bj và bij như sau:

Bảng 4.13. Bảng kiểm định Student

STT bj Sbj tj

0 279,01 493,38

1 28,19 49,85

2 3,23 5,71

3 -19,10 38,78

4 44,98 79,53

12 0,37 0,66

13 -8,55 15,12

14 10,76 19,02 0,566 23 -0,45 0,80

24 3,02 5,34

34 -4,57 8,08

123 -3,54 6,25

124 2,85 5,03

134 -23,10 40,85

234 2,44 4,31

1234 -1,65 2,92

74

Đồ án tốt nghiệp

Đánh giá mức ý nghĩa theo tiêu chuẩn Student

> tlt (với tlt: ở mức p = 0,05, bậc tự do f = n -1 = 2)

tj =

|bj| Sbj

Tra bảng tiêu chuẩn student với t(0,05, 2) = 4,303.

tj có ý nghĩa khi tj > t(p;f). vì vậy những giá trị tj< t(p;f) sẽ bị loại ra khỏi phương

trình hồi quy.

= 493,38 > 4,3

t0 =

|b0| Sbj

Tương tự tính được:

t1 = 49,85 > 4,3 t13 = 15,12 > 4,3 t134 = 40,85 > 4,3

t2 = 5,71 > 4,3 t14 = 19,02 > 4,3 t234 = 4,31 > 4,3

t3 = 38,78 > 4,3 t23 = 0,80 < 4,3 t123 = 6,25 > 4,3

t4 = 79,53 > 4,3 t24 = 5,34 > 4,3 t124 = 5,03 > 4,3

t12 = 0,66 < 4,3 t34 = 8,08 > 4,3 t1234 = 2,92 < 4,3

Vì t0, t1,t2, t3, t4, t13, t14, t24, t34, t134,t234, t123, t124> tlt,còn t12, t23, t1234< tlt nên chỉ

có các hệ số b0, b1,b2, b3, b4,b13,b14,b24, b34, b134, b234, b123, b124là có ý nghĩa, còn hệ

số b12, b23, b1234 là không có ý nghĩavà cần loại ra khỏi phương trình.

Vậy phương trình hồi quy có dạng

Ŷ = 279,01+ 28,19*X1+ 3,23*X2– 19,10*X3 + 44,98*X4 – 8,55*X13 +

10,76*X14+ 3,02*X24– 4,57*X34– 3,54*X123 +2,85*X124– 23,10*X134+ 2,44*X234

Đánh giá mức độ tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher.

Tính các giá trị Ŷ: Kết quả được trình bày trong Bảng 4.

∑

139,54

16 u=1

Phương sai tương thích:

=

= 46,51

2 = Stt

2 (Y − Ŷ) N−l

3

2 = 5,12

Với N: số thí nghiệm = 16 và l: hệ số có ý nghĩa = 13.

Vì phương sai tái hiện: Sth

75

46,51

Đồ án tốt nghiệp

5,12

2 Stt 2 = Sth

= 9,1= Ftn (1) F =

Giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0,95, f1 = N – l, f2 = n – 1 tra bảng Fisher:

F(1  p; Nl; n  1)= F(0,05; 3; 2) = 19,16 = Flt (Fisher của lý thuyết) (2).

Ghi chú:

f1: N – l (N = 16 là số thí nghiệm, l = 13 là số nghiệm thực).

f2: là bậc tự do của thí nghiệm lại tâm.

Điều kiện để mô hình tương thích là: Ftn < Flt

Từ (1) và (2) suy ra được: 9,1 < 19,16

Suy ra Ftn < Flt

Vậy phương trình hồi quy: Ŷ = 279,01+ 28,19*X1+ 3,23*X2 – 19,10*X3 +

44,98*X4 – 8,55*X13 + 10,76*X14+ 3,02*X24 – 4,57*X34 – 3,54*X123 +2,85*X124–

23,10*X134+ 2,44*X234 tương thích với thực nghiệm.

Từ kết quả thực nghiệm, rút ra kết luận sau:

Trong các yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình thủy phân protein trùn

quế, yếu tố thời gian ảnh hưởng có ảnh hưởng lớn nhất (b4 = 44,98). Nhìn vào kết

quả trên cho thấy khi tăng thời gian thủy phân thì mức độ thủy phân thịt trùn sâu hơn,

hiệu suất thủy phân và hàm lượng acid amin đạt được cao hơn. Tuy nhiên không nên

kéo quá dài thời gian thủy phân vì như vậy không những làm giảm hoạt tính của

enzyme, tăng hàm lượng NH3 mà còn không mang ý nghĩa về kinh tế.

Tiếp theo là nồng độ enzyme (b1 = 28,19): khi tăng nồng độ enzyme thì tốc độ

thủy phân diễn ra nhanh hơn, hiệu suất thủy phân và hàm lượng acid amin đạt được

cao hơn. Tuy nhiên nồng độ enzyme không nên tăng quá cao vì khi đó tốc độ và hiệu

suất thủy phân tăng không đáng kể sẽ ảnh hưởng đến giá thành của sản phẩm.

Nhiệt độ thủy phân (b3 = 19,10) ảnh hưởng không đáng kể vì khi nhiệt độ từ

60oC trở lên hoạt tính enzyme protease sẽ giảm mạnh. Và cuối cùng là nồng độ cơ

chất (b2 = 3,23) có ảnh hưởng rất nhỏ.

Khi nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân thịt trùn bằng enzyme protease

thu được từ chế phẩm lên men bán rắn vi khuẩn Bacillus sp. cho thấy có sự tương tác

76

Đồ án tốt nghiệp

lẫn nhau giữa các yếu tố đến quá trình thủy phân. Trong đó, sự tương tác của nồng

độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân là cao nhất (b134 = 23,10).

Kết quả thủy phân cho thấy điều kiện thủy phân đạt hàm lượng acid amin cao

nhất ở thí nghiệm thứ 12 (428,5 mg/g) với 4 yếu tố: nồng độ cơ chất là 25%; nồng độ

enzyme là 2%; thời gian thủy phân là 18 giờ và nhiệt độ thủy phân là 50oC.

4.10. Đánh giá hiệu quả sản phẩm

Sau khi tiến hành các thí nghiệm tối ưu hóa cho quá trình thủy phân trùn quế

bằng enzyme chế phẩm đã thu được % hàm lượng acid amin so với đối chứng là

441,3%. Sản phẩm sau khi thu nhận được trộn với chế phẩm lên men vi khuẩn Bacilus

sp. ở các tỷ lệ khác nhau.

1:1 1:2 1:3 Tỷ lệ dịch : chế phẩm

Bảng 4.14. Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa các tỷ lệ trộn

Tỷ lệ Chỉ tiêu 1:1 1:2 1:3

7,18 6,13 5,26 Nitrogen tổng số (g/100g SP)

44,84 38,28 32,89 Protein tổng (%)

48,34 35,96 30,10 Độ ẩm (%)

Từ bảng trên cho thấy ở tỷ lệ trộn 1:1 hàm lượng acid amin tổng là cao nhất,

bên cạnh đó độ ẩm ở tỷ lệ này cũng khá cao, nên để mang lại lợi ích kinh tế cho sản

phẩm mà hàm lượng acid amin cũng khá cao chúng tôi chọn tỷ lệ 1:2 để tiến hành

trộn và thu sản phẩm cuối cùng để làm thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên để sản phẩm có

thể đưa ra thương mại cần có những nghiên cứu sâu hơn.

77

Đồ án tốt nghiệp

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

Sau quá trình nghiên cứu đã phân lập, chọn lọc và giữ được 3 chủng Bacillus

sp. từ các các chế phẩm probiotic trên thị trường. Sau khi khảo sát các đặc điểm hình

thái, sinh lý, sinh hóa và các hoạt tính sinh học của các chủng đã được phân lập, 3

trong 6 chủng phân lập từ chế phẩm gồm W-zyme(1), Bio – Morars(5) và Biopro(6)

là có hoạt tính sinh học cao nhất, nhưng trong đó chủng (6) là có hoạt tính nổi trội

hơn và được chọn để lên men bán rắn sinh enzyme protease phục vụ cho các thí

nghiệm tiếp theo.

Enzyme chế phẩm có hoạt tính thủy phân protein cao nhất ở nhiệt độ là 550C và

pH là 7,5.

Phần trăm hàm lượng acid amin hòa tan so với đối chứng đạt cao nhất là 475,3%

khi dùng enzyme thương phẩm và 357,0% khi dùng enzyme chế phẩm trong quá trình

thủy phân thịt trùn ở các điều kiện như sau:

Điều kiện Enzyme chế phẩm Enzyme thương phẩm

55 55 Nhiệt độ (0C)

7,5 8 pH

20 15 Nồng độ cơ chất (%)

1,5 1,5 Nồng độ enzyme (%)

16 14 Thời gian thủy phân (giờ)

Sau kết quả của quá trình tối ưu hóa thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến quá

trình thủy phân thịt trùn gồm: nhiệt độ thủy phân là 500C; nồng độ enzyme là 2%;

nồng độ cơ chất là 25% và thời gian thủy phân là 18 giờ.

78

Đồ án tốt nghiệp

5.2. Đề nghị

Do giới hạn về thời gian và điều kiện của phòng thí nghiệm nên có nhiều vấn

đề chưa thể thực hiện được, nếu đề tài đươc tiếp tục, tôi xin có các đề xuất sau để

nghiên cứu bổ sung thêm:

Các phép thử sinh lý, sinh hóa sơ bộ chỉ cho độ tin cậy khoảng 80% nên cần

tiến hành nhiều phép thử sinh hóa hơn để thu được kết quả định danh chính xác hơn.

Tiếp tục tiến hành tuyển chọn, sàng lọc các chủng Bacillus sp. có hoạt tính sinh

học cao hơn. Kiểm tra tính đối kháng của Bacillus sp. trên nhiều đối tượng vi khuẩn

khác gây bệnh cho chăn nuôi nói chung và thủy sản nói riêng, sản xuất thử nghiệm

chế phẩm probiotic từ Bacillus sp.

Thực hiện các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme để xác định hiệu

suất và độ tinh sạch của enzyme protease.

Tiếp tục tiến hành thêm các thí nghiệm xác định hiệu suất thủy phân và hiệu

suất thu hồi đạm hòa tan trong dịch thủy phân.

Xác định các chỉ tiêu Nitơ acid amin và Nitơ ammoniac.

Tiến hành các thí nghiệm leo dốc để tìm ra điều kiện thủy phân thích hợp nhất

trong quá trình thủy phân trùn quế bằng protease từ Bacillus sp.

Nghiên cứu thêm điều kiện để bảo quản chế phẩm thu được và sản phẩm đạm

trùn sau khi trộn vào chế phẩm để không làm giảm giá trị dinh dưỡng.

79

Đồ án tốt nghiệp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Đức Lượng 2002. Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại học

quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 371 trang.

2. Lê Đỗ Mai Phương 2004. Phân lập và giám định vi khuẩn Bacillus subtilis trong

tự nhiên, bước đầu khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và enzyme protease.

LVTN, Trường Đại học Mở bán công thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

3. Lê Minh Cẩm Ngọc 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm

probiotic, tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm.

LVTN, Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí

Minh, Việt Nam.

4. Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận 1976. Một số phương pháp nghiên cứu

vi sinh vật học. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật.

5. Nguyễn Vĩnh Phước 1977. Vi sinh vật Thú y. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà

Nội.

6. Nguyễn Đức Lượng 2004. Công Nghệ Enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

thành phố Hồ Chí Minh, 534 trang.

7. Nguyễn Lân Dũng (Dịch). Thực hành vi sinh vật học, 1983. Nhà xuất bản Đại

học và Trung học Chuyên nghiệp, Hà Nội.

8. Nguyễn Văn Bảy 2006. Hướng dẫn kĩ thuật nuôi Trùn quế. Nhà xuất bản Nông

nghiệp, thành phố Hồ chí Minh.

9. Lê Thị Thùy Linh 2008. Ảnh hưởng của hỗn hợp chế phẩm probiotic và Trùn

quế (Perionyx excavates) trên sinh trưởng và năng suất của gà Lương Phượng.

LVTN, khoa Công Nghệ Sinh Học. Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ

Chí Minh.

10. Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo 1986. Vi Sinh học. Nhà xuất bản giáo

dục thành phố Hồ Chí Minh.

11. Tiêu Thị Ngọc Thảo 2008. Nghiên cứu thu nhận protease từ canh trương nuôi

cấy Bacillus subtilis và ứng dụng trong thủy phân protein Trùn quế. LVTN,

80

Đồ án tốt nghiệp

Khoa Công Nghệ Sinh Học. Trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí

Minh, Việt Nam.

12. Nguyễn Minh Triết 2008. Ảnh hưởng của trùng quế (Perionyx excavatus) và

chế phẩm vi sinh lên sinh trưởng và phát triển của vịt xiêm (Cairina

moschata).LVTN, Khoa Công Nghệ Sinh Học. Trường Đại học Nông Lâm

thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

13. Đặng Ngọc phương Uyên 2007. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất và

khảo sát tính đối kháng với vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. LVTN,

Khoa công Nghệ Sinh Học. Trường Đại học Nông lâm thành phố Hố Chí Minh,

Việt Nam.

14. Phạm Thị Ánh Hồng 2003. Kỹ thuật Sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

thành phố Hồ Chí Minh, 217 trang.

15. PSG.TS Nguyễn Thọ 2009. Thí nghiệm Công Nghệ Thực Phẩm. Giáo trình,

157 trang.

16. Huỳnh Minh Thư 2008. Khảo sát hệ enzyme thủy phân Amylase, Protease từ

các chủng Bacillus subtilis và thử nghiệm chế phẩm Probiotic. LVTN, Khoa

Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

17. Nguyễn Cảnh 1993. Qui hoạch thực nghiệm. Đại học Bách khoa Thành phố Hồ

Chí Minh.

18. Nguyễn Thị Thùy 2011. Tối ưu hóa môi trường lên men bán rắn và tinh sạch

enzyme glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae. LVTN, Khoa Công Nghệ

Sinh Học. Trường Đại học Bình Dương, Việt Nam.

19. Lê văn Việt 2007. Khảo sát khả ăng sinh tổng hợp enzyme của một số chủng

Bacillus subtilis và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic. LVTN, Khoa Sinh

Học. Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

20. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết 2006. Thí nghiệm

Công nghệ Sinh học – Thí nghiệm Vi Sinh vật học, tập 2. Nhà xuất bản Đại học

Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 463 trang.

81

Đồ án tốt nghiệp

21. Nguyễn Thị Ngọc Huyền 2012. Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng

Vibrio. LVTN, Khoa Thủy Sản. Trường Đại Học Cần Thơ, Việt Nam.

22. Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú 2010. Ảnh hưởng của vi khuẩn

Bacillus (B8, B37 VÀ B18) lên chất lượng nước bể tôm sú (Penaeus monodon).

Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sản lần thứ 4, 28 – 41.

23. Trần Thị Nhã Uyên 2010. Nghiên cứu và thu nhận Enzyme Protease từ các

chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần giờ. LVTh.s Sinh Học. Trường Đại học

Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

24. Nguyễn Thị Trần Thụy 2009. Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus

phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm. LVTh.s Sinh Học. Trường Đại học Sư

Phạm Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

25. Nguyễn Thị Xuân Thanh 2009. Nghiên cứu ứng dụng đạm thủy phân từ Trùn

quế (Perionyx excavatus) để nuôi cấy vi sinh vật. LVTN, Khoa công nghệ Sinh

học. Trường đại học cần thơ, Việt Nam.

26. Bùi Minh Tuấn 2012. Ứng dụng mô hình nuôi giun đỏ để xử lý rác thải hữu cơ

quy mô hộ gia đình. LVTN, Trường Đại học Nông lâm Thái nguyên.

27. Lê Mỹ Phương 2008. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong ao nuôi tôm sú

(Penaeus monodon) tại Sóc Trăng. LVTN, Trường Đại học Cần Thơ.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

28. Myeong-Hoon Joo, Sung-Ho Hur, Yong-Soo Han and Ji-Yeon Kim 2007.

Isolation, Identification, and Characterization of Bacillus strains from the

Traditional Korean Soybean-fermented Food, Chungkookjang. Journal of

Applied Biological Chemistr, Vol. 50, Issue 4, 202 – 210.

29. J. Singh, N. Batra, R.C. Sobti 2001. Serine alkaline protease from a newly

isolated Bacillus sp. SSR1. Process Biochemistry 36, 781–785.

30. Folasade M. Olajuyigbe 2013.Optimized production and properties of

thermostable alkaline proteasefrom Bacillus subtilis SHS-04grown on

groundnut (Arachis hypogaea) meal. Advances in Enzyme Research, Vol.1,

No.4, 112-120.

82

Đồ án tốt nghiệp

31. A.F.Md. Hasanuzzaman, Sk.Z. Hossian1 and M. Das 2010. Nutritional

potentiality of earthworm (Perionyx excavatus) for substituting fishmeal used

in local feed company in Bangladesh. Mesopot. J. Mar. Sci, 25 (2): 134 – 139.

32. Sakthika.T, Ronald. J, Siva Kumar.V, Felicitta. J 2014. Growth of Mystus

montanus fed with two different Earthworm meal. International journal of

environmental sciences,V0l.4, No. 4, ISSN 0976 – 4402.

33. Hanan S. Alnahdi 2012. Isolation and screening of extracellular proteases

produced by new Isolated Bacillus sp. Journal of Applied Pharmaceutical

Science, Vol. 2 (9), 071-074, ISSN 2231-3354.

34. F Soundra Josephine, Ramya V S, Neelam Devi, Suresh Babu Ganapa2,

Siddalingeshwara K. G1. Venugopal. N and Vishwanatha T (2012). Journal of

Microbiology and Biotechnology Research, 2 (1):163-168, ISSN : 2231 –3168.

35. Saurabh, S. Jasmine, I. Pritesh, G. and Rajendra Kumar, S 2007. Enhanced

productivity of serine alkaline protease by Bacillus sp. using soybean as

substrate. Malaysian Journal of Microbiology, Vol 3(1),1-6.

36. C. O. Monebi và A. Ugwumba 2013. Utilization of the earthworm, Eudrilus

eugeniae in the diet of Heteroclarias fingerlings.International Journal of

Fisheries and Aquaculture, Vol. 5(2), 19-25.

TÀI LIỆU INTERNET

37. http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-cac-phuong-phap-dinh-luong-protein-52844/

38. http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-xay-dung-mot-phuong-phap-cho-phep-

xac-dinh-nhanh-va-tuong-doi-chinh-xac-ham-luong-cac-axit-amin-va-protein-

10544/

39. http://giaoan.violet.vn/present/show/entry_id/1905803

40. http://khotailieu.com/luan-van-do-an-bao-cao/khoa-hoc-tu-nhien/sinh-

hoc/cac-phuong-phap-dinh-luong-protein.html

41. http://nuoitomsu.blogspot.com/2013/03/vai-tro-cua-vi-khuan-bacillus-sp-

trong.html

83

Đồ án tốt nghiệp

42. http://www.hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghien-

cuu/1241-ung-dung-enzyme-trong-nganh-cong-nghiep-.html

43. http://trunque.blogspot.com

84

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các thành phần môi trường dùng trong thí nghiệm

1.1. Môi trường giữ giống Bacillus sp.

Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar: (MT1)

Giá đậu 200 g

Pepton 5 g

Cao nấm men 2 g

NaCl 25 g

Agar 20 g

Nước cất vừa đủ 1000 ml

Khử trùng ở 1 atm, trong vòng 20 phút. pH = 7.

1.2. Môi trường tăng sinh vi khuẩn Bacillus sp.

Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton: (MT2)

Giá đậu 200 g

Pepton 5 g

Cao nấm nem 2 g

NaCl 25 g

Nước cất vừa đủ 1000 ml

1.3. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp Protease

Môi trường cám gạo đậu nành trấu (MT3) với hàm lượng giống 10% và nồng

độ cơ chất 70:15:15 (Cám gạo : Đậu nành : Trấu).

Cám gạo 140 g

Đậu nành 30 g

Trấu 30 g

NaCl 1,5 g

2 g NH4H2PO4

1,75 g CaCO3

Nước 60 %

1.4. Môi trường đếm khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus sp.

1

Đồ án tốt nghiệp

Giá đậu 200 g

Pepton 10 g

Cao nấm men 2 g

Agar 20 g

Nước cất vừa đủ 1000 ml

1.5. Môi trường tăng sinh vi khuẩn

NaCl 5 g

Pepton 10 g

Cao thịt 5 g

1000 ml Nước cât

1.6. Môi trường Clark Lubs

Pepton 7 g

Glucose 5 g

5 g KH2PO4

Nước cất vừa đủ 1000 ml

pH = 6.9

1.7. Môi trường lên men các loại đường

Cao thịt 5 g

Pepton bột 10 g

Đường 10 g

Phenol red 0.018 g

Nước cất vừa đủ 1000 ml

pH = 7.4

1.8. Môi trường canh Trypton

g 1 L – tryptophan

NaCl g 1

g 3,13 K2HPO4

g 0,27 KH2PO4

Nước cất 200 ml

2

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 2 Các đường chuẩn

Đường chuẩn Tyrosine

1.2

) l

m

1

y = 2.5691x - 0.0194 R² = 0.9964

0.8

0.6

0.4

0.2

/ l o m µ ( e n i s o r y T ộ đ g n ồ N

0

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

OD λ750nm

OD Linear (OD)

Đường chuẩn Albumine

300

) l

250

y = 1175,3x - 1,1452 R² = 0,9966

200

m / g µ ( n

150

100

50

i e t o r p ộ đ g n ồ N

0

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

OD λ750nm

OD Linear (OD)

3

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 3 Số liệu hoạt tính protein dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme protease

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1 2 3

151,0 144,6 146,4 147,3 1

165,1 163,0 161,2 163,1 2

187,0 173,3 184,2 181,5 3

211,8 215,3 208,6 211,9 4

224,1 221,6 230,5 225,4 5

195,2 195,5 196,6 195,7 6

175,4 178,2 176,4 176,7 7

Phụ lục 4 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt

tính enzyme protease

ANOVA Table for NHIET DO by HOAT TINH ENZYME PROTEASE

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square 6 14 20 2222.71 14.5643 13336.3 203.9 13540.2 F-Ratio 152.61 P-Value 0.0000

Summary Statistics

NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 442.0 489.3 544.5 635.7 676.2 587.3 530.0 3905.0 Average Standard deviation Standard error 147.333 163.1 181.5 211.9 225.4 195.767 176.667 185.952 3.30051 1.95192 7.23809 3.35112 4.59021 0.737111 1.41892 26.0194 1.90555 1.12694 4.17892 1.93477 2.65016 0.425572 0.819214 5.6779

4

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 5 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt

tính enzyme protease

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for NHIET DO by HOAT TINH ENZYME PROTEASE

Count Mean Homogeneous Groups

NT1 NT2 NT7 NT3 NT6 NT4 NT5 3 3 3 3 3 3 3 147.333 X X 163.1 X 176.667 X 181.5 X 195.767 X 211.9 X 225.4

Phụ lục 6 Số liệu hoạt tính protein dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm khảo sát

sự ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme protease

Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1 2 3

188,4 188,8 185,6 187,6 1

234,7 207,5 201,5 214,6 2

254,9 259,1 257,3 257,1 3

294,4 306,8 305,4 302,2 4

243,5 243,2 240,4 242,4 5

217,4 219,2 221,6 219,4 6

Phụ lục 7 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH đến hoạt

tính enzyme protease

ANOVA Table for PH by HOAT TINH ENZYME PROTEASE

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 76.40 4762.18 62.3294 23810.9 747.953 24558.9 5 12 17 P-Value 0.0000

5

Đồ án tốt nghiệp

Summary Statistics

Average Standard deviation Standard error

NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Total Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 562.8 643.7 771.3 906.6 727.1 658.2 4269.7 187.6 214.567 257.1 302.2 242.367 219.4 237.206 1.74356 17.6922 2.10713 6.79117 1.70978 2.10713 38.0084 1.00664 10.2146 1.21655 3.92088 0.98714 1.21655 8.95867

Phụ lục 8 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giá trị pH đến hoạt

tính enzyme protease

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for PH by HOAT TINH ENZYME PROTEASE

Count Mean Homogeneous Groups

187.6 X 214.567 X X 219.4

242.367 X

NT1 NT2 NT6 NT5 NT3 NT4 3 3 3 3 3 3 257.1 302.2 X X

Phụ lục 9 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân thịt trùn bằng

enzyme thương phẩm

Nồng độ Thí % so với cơ chất TBĐC TBTN Trung bình nghiệm đối chứng (%)

1 29,7 95,3 320,9

2 29,7 94,6 318,5 308,1 5

3 29,7 84,6 284,8

6

Đồ án tốt nghiệp

1 30,6 102,3 334,3

2 30,6 101,8 332,7 337,6 10

3 30,6 105,8 345,8

1 31,1 138,8 446,3

2 31,1 137,5 442,1 444,8 15

3 31,1 138,7 446,0

1 31,5 132,9 421,9

2 31,5 136,9 434,6 434,2 20

3 31,5 140,5 446,0

1 31,6 135,3 428,2

2 31,6 132,4 419,0 424,7 25

3 31,6 134,9 426,9

1 31,5 121,8 386,7

2 31,5 120,5 382,5 399,3 30

3 31,5 135,0 428,6

Phụ lục 10 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên

quá trình thủy phân thịt trùn bằng enzyme thương phẩm

ANOVA Table FOR HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO CO CHAT

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square 5 12 17 9414.12 213.98 47070.6 2567.76 49638.4 F-Ratio 44.00 P-Value 0.0000

Summary Statistics

5% 10% 15% 20% 25% Count 3 3 3 3 3 Sum 924.2 1012.8 1334.4 1302.5 1274.1 Average Standard deviation Standard error 308.067 337.6 444.8 434.167 424.7 20.1852 7.14633 2.34307 12.0558 4.97896 11.6539 4.12593 1.35277 6.96044 2.8746

7

Đồ án tốt nghiệp

30% Total 3 18 1197.8 7045.8 399.267 391.433 25.4901 54.0361 14.7167 12.7364

Phụ lục 11 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

lên quá trình thủy phân thịt trùn bằng enzyme thương phẩm

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO CO CHAT

Count Mean Homogeneous Groups

5% 10% 30% 25% 20% 15% 3 3 3 3 3 3 308.067 X X 337.6 399.267 X 424.7 XX 434.167 X X 444.8

Phụ lục 12 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân thịt trùn bằng

enzyme chế phẩm

Nồng độ % so với cơ chất Thí nghiệm TBĐC TBTN Trung bình đối chứng (%)

1 203,4 29,3 59,6

2 205,5 202,6 29,3 60,2 5

3 199,0 29,3 58,3

1 241,3 29,8 71,9

2 245,3 230,9 29,8 73,1 10

3 206,0 29,8 61,4

1 282,8 30,2 85,4

2 289,4 289,1 30,2 87,4 15

3 295,0 30,2 89,1

8

Đồ án tốt nghiệp

1 30,4 92,2 303,3

2 30,4 107,3 353,0 325,8 20

3 30,4 97,6 321,1

1 30,8 90,0 292,2

2 30,8 94,5 306,8 308,1 25

3 30,8 100,2 325,3

1 30,6 85,5 279,4

2 30,6 87,7 286,6 286,5 30

3 30,6 89,8 293,5

Phụ lục 13 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên

quá trình thủy phân thịt trùn bằng enzyme chế phẩm

ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO CO CHAT

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 27.29 6709.69 245.838 33548.4 2950.06 36498.5 5 12 17 P-Value 0.0000

Sum 607.9 692.6 867.2 977.4 924.3 859.5 4928.9 Average Standard deviation Standard error 202.633 230.867 289.067 325.8 308.1 286.5 273.828 3.31713 21.6278 6.10683 25.1811 16.5882 7.05053 46.3354 1.91514 12.4868 3.52578 14.5383 9.57723 4.07063 10.9214 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Summary Statistics Count 3 3 3 3 3 3 18 5% 10% 15% 20% 25% 30% Total

Phụ lục 14 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

lên quá trình thủy phân thịt trùn bằng enzyme chế phẩm

9

Đồ án tốt nghiệp

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO CO CHAT

Count Mean Homogeneous Groups

5% 10% 30% 15% 25% 20% 3 3 3 3 3 3 202.633 X X 230.867 X 286.5 X 289.067 XX 308.1 X 325.8

Phụ lục 15 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme thương phẩm lên quá trình thủy phân

Nồng độ Thí % so với enzyme TBĐC TBTN Trung bình nghiệm đối chứng (%)

1 284,0 28,8 81,8

2 306,9 299,0 28,8 88,4 0,5

3 305,9 28,8 88,1

1 378,6 29,0 109,8

2 375,9 381,6 29,0 109,0 1

3 390,3 29,0 113,2

1 457,5 31,3 143,2

2 458,5 455,3 31,3 143,5 1,5

3 449,8 31,3 140,8

1 449,8 31,3 140,8

2 452,7 451,8 31,3 141,7 2

3 452,7 31,3 141,7

1 429,6 31,4 134,9

2 425,5 430,4 31,4 133,6 2,5

3 436,0 31,4 136,9

10

Đồ án tốt nghiệp

1 31,3 121,5 388,2

2 31,3 127,0 405,8 406,6 3

3 31,3 133,3 425,9

Phụ lục 16 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme

thương phẩm lên quá trình thủy phân thịt trùn

ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO ENZYME

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 97.16 10289.8 105.901 51448.8 1270.81 52719.6 5 12 17 P-Value 0.0000

Summary Statistics

0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% Total Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 896.8 1144.8 1365.8 1355.2 1291.1 1219.9 7273.6 Average Standard deviation Standard error 298.933 381.6 455.267 451.733 430.367 406.633 404.089 7.47224 4.41928 2.74853 0.966667 3.05523 10.891 13.1258 12.9423 7.65441 4.7606 1.67432 5.29182 18.8638 55.688

Phụ lục 17 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme

thương phẩm lên quá trình thủy phân thịt trùn

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO ENZYME

Count Mean Homogeneous Groups

0,5% 1% 3% 2,5% 2% 1,5% 3 3 3 3 3 3 298.933 X 381.6 X 406.633 X 430.367 X 451.733 X 455.267 X

11

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 18 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme chế phẩm lên quá trình thủy phân

TBĐC TBTN Trung bình Thí nghiệm % so với đối chứng Nồng độ enzyme (%)

1 27,8 62,3 224,1

2 27,8 64,1 230,6 224,6 0,5

3 27,8 60,9 219,1

1 28,4 81,5 287,0

2 28,4 81,0 285,2 281,7 1

3 28,4 77,5 272,9

1 29,4 101,0 343,5

2 29,4 102,3 348,0 350,3 1,5

3 29,4 105,7 359,5

1 30,8 100,4 326,0

2 30,8 102,4 332,5 329,5 2

3 30,8 101,7 330,2

1 30,9 89,4 289,3

2 30,9 95,7 309,7 306,8 2,5

3 30,9 99,3 321,4

1 30,8 85,9 278,9

2 30,8 85,4 277,3 281,3 3

3 30,8 88,6 287,7

Phụ lục 19 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme chế

phẩm lên quá trình thủy phân thịt trùn

ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO ENZYME

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 74.98 5828.12 77.7261 29140.6 932.713 30073.3 5 12 17 P-Value 0.0000

12

Đồ án tốt nghiệp

Average Standard deviation Standard error

Summary Statistics Count 3 3 3 3 3 3 18

0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% 3% Total Sum 673.8 845.1 1051.0 988.7 920.4 843.9 5322.9 224.6 281.7 350.333 329.567 306.8 281.3 295.717 5.76628 7.67398 8.25126 3.29596 16.2453 5.6 42.0597 3.32916 4.43058 4.76387 1.90292 9.37923 3.23316 9.91357

Phụ lục 20 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme

chế phẩm lên quá trình thủy phân thịt trùn

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by NONG DO ENZYME

Count Mean Homogeneous Groups

0,5% 3% 1% 2,5% 2% 1,5% 3 3 3 3 3 3 224.6 X X 281.3 X 281.7 X 306.8 329.567 X 350.333 X

Phụ lục 21 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân thịt trùn bằng enzyme

thương phẩm

TBĐC TBTN Trung bình Thời gian (giờ) Thí nghiệm

1 % so với đối chứng 0,01 31,1 31,4

2 0,01 0,01 31,1 31,4 0

3 0,01 31,1 32,7

1 228,6 31,1 71,1

2 230,2 227,4 31,1 71,6 2

3 223,5 31,1 69,5

13

Đồ án tốt nghiệp

1 278,5 31,1 86,6

2 275,9 277,6 31,1 85,8 4

3 278,5 31,1 86,6

1 314,5 31,1 97,8

2 315,4 315,5 31,1 98,1 6

3 316,7 31,1 98,5

1 363,3 31,1 113,0

2 371,4 368,6 31,1 115,5 8

3 371,1 31,1 115,4

1 415,4 31,1 129,2

2 412,5 412,9 31,1 128,3 10

3 410,6 31,1 127,7

1 441,8 31,1 137,4

2 440,2 442,1 31,1 136,9 12

3 444,4 31,1 138,2

1 475,9 31,1 148,0

2 474,0 475,3 31,1 147,4 14

3 476,2 31,1 148,1

1 451,4 31,1 140,4

455,1 2 455,9 31,1 141,8 16

3 457,9 31,1 142,4

1 441,8 31,1 137,4

2 442,8 441,4 31,1 137,7 18

3 439,5 31,1 136,7

1 429,6 31,1 133,6

2 426,0 31,1 132,5 426,3 20

3 423,2 31,1 131,6

14

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 22 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá

trình thủy phân thịt trùn khi dùng enzyme thương phẩm

ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 7930.42 52898.3 6.6703 528983. 146.747 529130. 10 22 32 P-Value 0.0000

Summary Statistics

0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 16h 18h 20h Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 33 Sum 95.5 682.3 832.9 946.6 1105.8 1238.5 1326.4 1426.1 1365.2 1324.1 1278.8 11622.2 Average Standard deviation Standard error 31.8333 227.433 277.633 315.533 368.6 412.833 442.133 475.367 455.067 441.367 426.267 352.188 0.750555 3.49905 1.50111 1.10604 4.59239 2.4173 2.11975 1.19304 3.32916 1.69214 3.20832 128.59 0.433333 2.02018 0.866667 0.638575 2.65141 1.39563 1.22384 0.688799 1.92209 0.976957 1.85233 22.3846

Phụ lục 23 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá

trình thủy phân thịt trùn khi dùng enzyme thương phẩm

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN

Count Mean Homogeneous Groups

31.8333 X 227.433 X 277.633 X 315.533 X

368.6

0h 2h 4h 6h 8h 10h 20h 3 3 3 3 3 3 3 X 412.833 X 426.267 X

15

Đồ án tốt nghiệp

18h 12h 16h 14h 3 3 3 3 441.367 X 442.133 X 455.067 X 475.367 X

Phụ lục 24 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân thịt trùn bằng enzyme

chế phẩm

Thời gian Thí % so với TBĐC TBTN Trung bình (giờ) nghiệm đối chứng

1 30,3 31,4 0,01

2 30,3 32,4 0,01 0,01 0

3 30,3 30,4 0,01

1 30,3 50,7 167,3

2 30,3 51,3 169,3 167,4 2

3 30,3 50,2 165,7

1 30,3 60,3 199,0

2 30,3 57,5 189,8 195,9 4

3 30,3 60,3 199,0

1 30,3 65,1 214,9

2 30,3 63,9 210,9 213,1 6

3 30,3 64,7 213,5

1 30,3 80,8 266,7

2 30,3 79,7 263,0 256,3 8

3 30,3 72,5 239,3

1 30,3 84,8 279,9

2 30,3 85,3 281,5 279,5 10

3 30,3 84,0 277,2

16

Đồ án tốt nghiệp

1 30,3 90,5 298,7

2 30,3 93,1 307,3 299,9 12

3 30,3 89,0 293,7

1 30,3 100,1 330,4

2 30,3 99,8 329,4 328,7 14

3 30,3 98,9 326,4

1 30,3 109,5 361,4

2 30,3 106,3 350,8 357,0 16

3 30,3 108,7 358,7

1 30,3 100,0 330,0

2 30,3 101,6 335,3 332,5 18

3 30,3 100,6 332,0

1 30,3 98,6 325,4

2 30,3 97,7 322,4 320,4 20

3 30,3 94,9 313,2

Phụ lục 25 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá

trình thủy phân thịt trùn khi dùng enzyme chế phẩm

ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN

Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 75.74 27270.4 360.049 272704. 7921.09 280625. 10 22 32 P-Value 0.0000

Summary Statistics

0h 2h 4h 6h 8h Count Average Standard deviation Standard error 0.950438 1.8037 5.31162 2.02978 14.8669 0.548736 1.04137 3.06667 1.17189 8.58338 31.3667 167.433 195.933 213.1 256.333 3 3 3 3 3 Sum 94.1 502.3 587.8 639.3 769.0

17

Đồ án tốt nghiệp

10h 12h 14h 16h 18h 20h Total 3 3 3 3 3 3 33 246.2 298.567 328.733 357.3 332.433 320.333 249.794 59.7611 8.80076 2.08167 5.69298 2.67644 6.35715 93.5899 34.5031 5.08112 1.20185 3.28684 1.54524 3.6703 16.2919 738.6 895.7 986.2 1071.9 997.3 961.0 8243.2

Phụ lục 26 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá

trình thủy phân thịt trùn khi dùng enzyme chế phẩm

Method: 95.0 percent LSD

Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by THOI GIAN

Count Mean Homogeneous Groups

0h 2h 4h 6h 10h 8h 12h 20h 14h 18h 16h 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 31.3667 X 167.433 X 195.933 XX X 213.1 X 246.2 256.333 X 299.9 X 320.333 XX 328.733 XXX 332.433 XX X 357.3

Phụ lục 27 Số liệu hàm lượng acid amin dùng cho xử lý thống kê ở thí nghiệm tối

ưu hóa thực nghiệm

Nghiệm Thí % so với TBĐC TBTN Trung bình thức nghiệm đối chứng

1 28,1 66,7 237,4

2 28,1 68,0 242,0 239,6 1

3 28,1 67,3 239,5

18

Đồ án tốt nghiệp

1 249,1 27,5 68,5

2 247,3 27,5 68,0 246,5 2

3 243,3 27,5 66,9

1 244,6 27,6 67,5

2 249,3 27,6 68,8 247,0 3

3 247,1 27,6 68,2

1 253,3 27,6 69,9

2 251,8 27,6 69,5 251,6 4

3 249,6 27,6 68,9

1 188,7 28,3 53,4

2 189,8 28,3 53,7 188,2 5

3 186,2 28,3 52,7

1 262,9 28,3 74,4

2 259,7 28,3 73,5 260,9 6

3 260,1 28,3 73,6

1 194,2 27,7 53,8

2 195,3 27,7 54,1 191,6 7

3 185,2 27,7 51,3

1 266,9 29,0 77,4

2 264,1 29,0 76,6 264,8 8

3 263,4 29,0 76,4

1 277,8 30,2 83,9

2 277,5 30,2 83,8 278,8 9

3 281,1 30,2 84,9

1 411,6 30,3 124,7

2 401,7 30,3 121,7 403,2 10

3 396,4 30,3 120,1

19

Đồ án tốt nghiệp

1 29,3 79,8 272,4

270,5 11 2 29,3 79,6 271,7

3 29,3 78,4 267,6

1 29,2 125,7 430,5

2 29,2 124,8 427,4 428,5 12

3 29,2 124,9 427,7

1 30,4 87,5 287,8

2 30,4 87,0 286,2 285,2 13

3 30,4 85,6 281,6

1 29,5 89,7 304,1

2 29,5 90,4 306,4 303,7 14

3 29,5 88,7 300,7

1 29,7 89,8 302,4

2 29,7 90,7 305,4 305,6 15

3 29,7 91,8 309,1

1 29,3 91,4 311,9

2 29,3 91,4 311,9 316,3 16

3 29,3 95,2 324,9

1 28,8 110,6 384,0

2 28,8 109,3 379,5 381,8 17

3 28,8 110,0 381,9

Phụ lục 28 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa

ANOVA Table for HAM LUONG ACID AMIN by 4 YEU TO KHAO SAT

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio 993.69 13332.8 13.4175 213325. 456.193 213781. 16 34 50 P-Value 0.0000

Source Between groups Within groups Total (Corr.)

20

Đồ án tốt nghiệp

Summary Statistics

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 51 Average Standard deviation Standard error Sum 239.633 718.9 246.567 739.7 247.0 741.0 251.567 754.7 188.233 564.7 260.9 782.7 191.567 574.7 264.8 794.4 278.8 836.4 403.233 1209.7 270.567 811.7 428.533 1285.6 285.2 855.6 303.733 911.2 305.633 916.9 316.233 948.7 381.8 1145.4 14592.0 286.118 1.32958 1.71399 1.35769 1.07445 1.0651 1.00664 3.19913 1.06927 1.15326 4.45434 1.49703 0.98714 1.85831 1.65563 1.93764 4.33333 1.3 9.15619 2.3029 2.96873 2.3516 1.861 1.84481 1.74356 5.54106 1.85203 1.9975 7.71514 2.59294 1.70978 3.2187 2.86764 3.35609 7.50555 2.25167 65.3883

Phụ lục 29 Bảng phân hạng thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa

Multiple Range Tests for HAM LUONG ACID AMIN by 4 YEU TO KHAO

Method: 95.0 percent LSD

SAT

Count Mean Homogeneous Groups

NT5 NT7 NT1 NT2 NT3 NT4 NT6 NT8 NT11 NT9 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 188.233 X 191.567 X X 239.633 X 246.567 X 247.0 X 251.567 X 260.9 XX 264.8 X 270.567 X 278.8

21

Đồ án tốt nghiệp

NT13 NT14 NT15 NT16 NT17 NT10 NT12 3 3 3 3 3 3 3 285.2 303.733 305.633 316.233 381.8 403.233 428.533 X X X X X X X

Phụ lục 30 Kết quả hàm lượng độ ẩm của thịt trùn tươi

Thí nghiệm G (g) G1 (g) G2 (g) độ ẩm (%) TB

2,0009 24,50 23,04 72,91 1

2,0012 23,34 21,61 86,27 80,02 2

2,0037 24,88 23,26 80,88 3

Phụ lục 31 Kết quả hàm lượng khoáng của thịt trùn tươi

khoáng TS Thí P0 (g) P1 (g) P2 (g) TB (%) nghiệm

22,50 24,50 22,74 23,78 1

21,34 23,36 21,54 20,33 23,77 2

22,88 24,92 23,15 27,21 3

Phụ lục 32 Kết quả Nitrogen tổng số và protein tổng của thịt trùn tươi

%Nts (g/100g VHCl 0,25N TB %Pr tổng TB m (ml) NL)

0,1 2,9 63,44 10,15

0,1 3,1 10,97 68,54 67,81 10,85

0,1 3,4 74,38 11,90

22

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 33 Hình ảnh thiết bị

Hình 1. Nồi hấp khử trùng Hình 2. Lò nung

Hình 17. Máy ly tâm Hình 18. Cân phân tích 4 số

23

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3. Hệ thống vô cơ hóa mẫu

Hình 4. Hệ thống chưng cất bán tự động

24

Đồ án tốt nghiệp

Hình 5. Kính hiển vi Hình 6. Tủ ấm

Hình 8. Bình hút ẩm Hình 7. Máy lắc

Hình 10. Cân kỹ thuật Hình 9. Máy đo pH

25

Đồ án tốt nghiệp

Hình 11. Tủ sấy Hình 12. Tủ cấy

Hình 14. Bếp điện Hình 13. Bể điều nhiệt

Hình 15. Máy đo OD Hình 16. Máy nghiền

26

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục 34 Hình ảnh thí nghiệm

Hình 19. Kết quả khả năng kháng vi khuẩn E. Coli của 3 chủng 1, 5 và 6

Hình 20. Kết quả khả năng kháng vi khuẩn Salmonella sp. của 3 chủng 1, 5 và 6

Hình 21. Kết quả khả năng kháng vi khuẩn S. aureus của 3 chủng 1, 5 và 6

27

Đồ án tốt nghiệp

1 5 6

Hình 22. Vòng phân giải của chủng 1, 5 và 6 sau 48

Hình 23. Mẫu trước và sau khi vô cơ hóa

Hình 28. Mẫu đo hàm lượng acid amin trong dịch sau khi thủy phân

28

Đồ án tốt nghiệp

Hình 25. Dịch tăng sinh Bacillus sp. Hình 24. Thịt trùn quế

Hình 27. Nuôi cấy Bacillus sp. trên môi trường bán rắn Hình 26. Chế phẩm Bacillus sp. sau lên men

Hình 29. Pha loãng dịch tăng sinh bằng nước muối sinh lý

29