Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinnis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ

MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Hoàng Quân

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Thanh Hằng

MSSV: 1311100026

Lớp: 13DSH01

TP. Hồ Chí Minh, năm 2017

Đồ án tố t nghiê ̣p

LỜ I CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nô ̣i dung trong đồ án tố t nghiê ̣p là công trình nghiên cứ u thực sự củ a tôi dướ i sự hướ ng dẫn củ a ThS. Nguyễn Hoàng Quân – cán bộ kỹ thuật

tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM. Đề tài đươ ̣c tiến hành nghiên cứ u thực

nghiê ̣m ta ̣i phò ng Thực nghiê ̣m Cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh Ho ̣c Tp.

HCM. Các số liê ̣u và kết quả có trong nghiên cứ u là hoàn toàn trung thực.Tôi xin

hoàn toàn chi ̣u trách nhiê ̣m về lờ i cam đoan này.

Tp. HCM, ngà y 20 thá ng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiê ̣n

Nguyễn Thị Thanh Hằng

Đồ án tố t nghiê ̣p

LỜ I CẢM ƠN

Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến

Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ trang

thiết bị giúp em hoàn thành đề tài.

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công

Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy cô khoa

Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như

dạy bảo và truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích giúp em hoàn thành khóa học cùa mình.

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Hà Thị Loan – Phó Giám đốc Trung

tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM và ThS. Nguyễn Hoàng Quân đã tận tình hướng

dẫn và chỉ bảo kiến thức cho em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp.

Em xin cảm ơn toàn thể anh chị đang làm việc tại Trung tâm và các bạn sinh

viên cùng làm đề tài tại Trung tâm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài.

Con xin cám ơn ba mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng con khôn lớn.

Cám ơn anh chị em và người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp

đỡ và luôn cổ vũ tinh thần cho em.

Em xin chân thành cảm ơn.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2017

Sinh viện thực hiện

Nguyễn Thị Thanh Hằng

Đồ án tố t nghiê ̣p

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... i

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................... iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

2. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................... 1

3. Đố i tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứ u ...................................................................... 2

4. Mục đích nghiên cứu .......................................................................................... 2

5. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2

6. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 3

7. Kết quả đạt được ................................................................................................. 3

8. Bố cục đồ án ....................................................................................................... 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4

1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật ...................................................... 4

1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ................ 4

1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................... 5

1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro ................................. 8

1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật ............... 9

1.2. Giới thiệu về chi Stachys ............................................................................... 17

1.3. Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis) ................................................ 19

1.3.1. Phân loại ............................................................................................... 19

Đồ án tố t nghiê ̣p

1.3.2. Đặc điểm sinh học và công dụng ......................................................... 19

1.3.4. Thành phần hóa học ............................................................................. 21

1.3.5. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................ 22

1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys ................................................................. 23

1.4.1. Kháng viêm và giảm đau ...................................................................... 24

1.4.2. Chống oxy hóa ..................................................................................... 24

1.4.3. Chống lo âu .......................................................................................... 25

1.4.4. Kháng khuẩn ....................................................................................... 26

1.5. Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys ............................................ 27

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 29

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 29

2.2. Vật liệu và phương pháp ................................................................................ 29

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 29

2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất ...................................................... 29

2.2.3. Môi trường nghiên cứu ......................................................................... 30

2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy .................................................................... 30

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 30

2.3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 30

2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 31

2.4.1. Pha môi trường nuôi cấy ...................................................................... 31

2.4.2. Các thao tác trong phòng cấy .............................................................. 32

2.4.3. Bố trí thí nghiệm .................................................................................. 32

Đồ án tố t nghiê ̣p

2.4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng

nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. ...................................................................... 32

2.4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của

cây sùng thảo ............................................................................................................. 33

2.4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của gía thể đến sự sinh trưởng của

cây sùng thảo ngoài vườn ươm ................................................................................. 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 37

3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây

sùng thảo. .................................................................................................................. 37

3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo ......................... 42

3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn

ươm ........................................................................................................................... 47

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 52

4.1. Kết luận .......................................................................................................... 52

4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 53

1. Tài liệu Tiếng Việt ............................................................................................ 53

2. Tài liệu Tiếng Anh ............................................................................................ 53

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 1

Phu ̣ lu ̣c A: Thành phần môi trường MS ................................................................. 1

Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis) .......................... 2

Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4 ................. 3

Đồ án tố t nghiê ̣p

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây sùng thảo ............................................................................................ 19

Hình 1.2. Củ sùng thảo .............................................................................................. 20

Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân

cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................. 39

Hình 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi

cấy. ............................................................................................................................ 46

Hình 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn

vườn ươm sau 4 tuần trồng ....................................................................................... 51

Đồ án tố t nghiê ̣p

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng ........................ 10

Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi ....... 33

Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ ................................... 34

Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai

đoạn vườn ươm ......................................................................................................... 35

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân

cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. ............................................................................ 38

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4

tuần nuôi cấy. ............................................................................................................ 43

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn

vườn ươm sau 4 tuần trồng ....................................................................................... 48

Đồ án tố t nghiê ̣p

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau 4 tuần

nuôi cấy ..................................................................................................................... 39

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân

cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................. 39

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần

nuôi cấy ..................................................................................................................... 44

Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây sùng thảo giai đoạn vườn

ươm sau 4 tuần trồng ................................................................................................. 48

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn

iii

vườn ươm sau 4 tuần trồng ....................................................................................... 49

Đồ án tố t nghiê ̣p

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid

2,4-D

2,4,5-T Trichlorophenoxyacetic acid

ABA Abscisic acid

BA

Benzyl Adenine

CNSH

Công Nghệ Sinh Học

ĐC

Đối chứng

GA Gibberellin

IAA

3-Indole acetic acid

IBA

3-Indole butyric acid

MS

Murashige – Skoog

NAA

Napthalene Acetic Acid

PhG Phenylpropanoid Glycosides

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

Đồ án tố t nghiê ̣p

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam có một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu, trong số hơn 12.000

loài thực vật tại Việt Nam thì có gần 4.000 loài có công dụng làm thuốc với vùng phân

bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý hiếm trên thế giới

như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng,

Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú,… Theo kết quả điều

tra và đánh giá tại một số vùng, trồng cây dược liệu đem lại giá trị kinh tế to lớn hơn bất

kỳ loại cây lương thực, thực phẩm nào (có thể thu nhập trên 100 triệu đồng/ha).

Tuy nhiên theo báo cáo tháng 9/2016 của Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền (Bộ Y

tế) cho biết hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các

loại, nhưng Việt Nam mới chỉ tự cung cấp được khoảng 20% nguyên liệu để phục vụ

việc sản xuất thuốc trong nước, còn khoảng 80 - 85% vẫn phải nhập khẩu từ nước ngoài

(chủ yếu nhập từ Trung Quốc) và mới chỉ có 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn

gốc rõ ràng, rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay.

Cây sùng thảo là một loại cây đã được trồng làm thực phẩm ở nhiều nơi trên thế

giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp…. Củ sùng thảo giàu dinh dưỡng và chứa nhiều

hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe. Các bộ phận của cây và các chiết xuất từ cây sùng

thảo đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh,

bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi ở Trung Quốc. Các nghiên cứu về các loài cùng chi và

nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Stachys affinnis đã chứng minh chúng chứa

nhiều hoạt chất thứ cấp có nhiều công dụng như kháng viêm, chống oxy hóa, ngừa loãng

xương, điều trị ung thư, bệnh tiểu đường,….

Nắm bắt những cơ sở khoa học thực tiễn và nhu cầu của thị trường, nhóm nghiên

cứu đã tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo

(Stachys affinnis).

2. Ý nghĩa của đề tài

Đồ án tố t nghiê ̣p

• Ý nghĩa khoa học

- Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học.

- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung thông

tin về cây sùng thảo, kỹ thuật nhân giống in vitro cây sùng thảo.

- Kết quả nghiên cứu có thể là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu

tiếp theo của cùng đối tượng hoặc một số giống cây có giá trị khác.

- Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân

tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học.

• Ý nghĩa thực tiễn

- Xây dựng quy trình nhân giống cây sùng thảo, tạo ra cây giống có chất lượng

cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.

3. Đố i tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứ u

Đố i tươ ̣ng nghiên cứ u đươ ̣c sử du ̣ng trong đề tài này là cây sùng thảo vitro

đươ ̣c cung cấp từ phò ng nuôi cấy mô ta ̣i phò ng Thực nghiê ̣m cây trồng thuộc Trung

tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM.

Pha ̣m vi nghiên cứ u trong đề tài này là tâ ̣p trung khảo sát ảnh hưở ng củ a chất

điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA lên quá trình nhân chồi, tạo rễ của cây sùng thảo

và khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể: mụn xơ dừa, tro trấu,… đến sự sinh trưởng

của cây sùng thảo.

4. Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi

và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi

nhân giống in vitro.

- Đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở giai

đoạn vườn ươm.

5. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn

thân cây sùng thảo.

Đồ án tố t nghiê ̣p

- Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo.

- Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai

đoạn vườn ươm.

6. Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiê ̣m đươ ̣c bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố . Mỗi thí nghiê ̣m gồ m 3 – 5 nghiê ̣m thứ c, các nghiê ̣m thứ c thí nghiê ̣m đươ ̣c lă ̣p la ̣i ba lần. Các số liê ̣u thu thâ ̣p đươ ̣c xử lý thố ng kê bằ ng phần mềm SAS 9.4 và chương trình MicroSoft Excel 2016®.

7. Kết quả đạt được

- Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho quá trình nhân

chồi từ đoạn thân cây sùng thảo.

- Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ cây sùng thảo.

- Xác định được loại giá thể thích hợp để trồng cây sùng thảo khi trồng cây

con in vitro ngoài vườn ươm.

8. Bố cục đồ án

Kết cấu của đồ án gồm 4 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Đồ án tố t nghiê ̣p

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào đã trả qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh

dấu bằng những sự kiện chính sau:

Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa

ra khái niệm tế bào.

Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế

bào.

Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ

quan sinh dục.

Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm

nhưng không thành công.

Năm 1904, Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài

họ Cải Crucifers.

Năm 1922, Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro.

Năm 1924, Blumenthal và cộng sự tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy hình

thành callus tử rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic.

Năm 1925, Knudson L, Bot. Gaz làm hạt phong lan nảy mầm in vitro.

Năm 1929, Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà

hợp khi lai ở Linum spp.

Năm 1934, Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một

phytohormone thực vật đầu tiên thuộc có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân

chia tế bào.

Năm 1936, LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau.

Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành

công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non

ở cà rốt.

Năm 1942, Gautheret lần đầu theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong

nuôi cấy mô sẹo thực vật.

Năm 1944, Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy

mô thuốc lá in vitro.

Năm 1950, Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước

dừa.

Năm 1951, Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và

phát sinh cơ quan.

Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai

tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công.

Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của

kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở

mô nuôi cấy.

Năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất

auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).

Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế bào

thực vật – môi trường MS.

Năm 1964 – 1998, hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô tế

bào thực vật như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gen để lai tạo

giống mới, thương mại hóa sản phẩm nuôi cây mô (Dương Tấn Nhựt, 2011).

1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Dương Công Kiên (2003), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào

thực vật như:

1.1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực

vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên).

Đồ án tố t nghiê ̣p

Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Từ một đỉnh

sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều

chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây

hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân

giống thông thường khác.

1.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình

thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu

trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân

giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành

chồi.

Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô

sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy

nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo.

1.1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt tên máy lắc có

tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất

hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi

cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống

như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế

bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid,…).

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách

ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô

sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường

có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia

phóng xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng.

Đồ án tố t nghiê ̣p

1.1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần

Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và

duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận

của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu và enzyme) trong điều kiện nuôi cấy

thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh

thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền). Khi mất thành tế bào, hai tế bào trần

có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây

trồng. quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài

hoặc khác loài (khoai tây, cà chua).

Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc, tế bào trần dễ dàng hấp thu các

AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh,

năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần

đang được nghiên cứu và hoàn thiện .

1.1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử hoặc

hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo

cây đơn bội. Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội. Nuôi cấy

bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống

thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới. Nuôi cấy

bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa

nước, thuốc lá, ngô,…

1.1.2.6. Nuôi cấy protoplast

Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách

từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong

môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều

triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới

ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều

đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào

trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm

cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng

trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như

trong công tác giống cây trồng .

1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro

Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng

cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige (1974) đã chia quy trình

nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và một giai đoạn tiếp sau in vitro:

1.1.3.1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro

Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã được khử trùng

và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới. Giảm tỷ lệ mẫu

nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này. Theo Yildiz

(2012), mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng thành. Giai

đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần.

1.1.3.2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro

Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất.

Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm

cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò

của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin).

1.1.3.3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con

Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi

trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong

giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm

kích thích sự hình thành rễ.

Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ

thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định.

1.1.3.4. Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên

Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống

hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên (Hazarika, 2003). Sự biến

Đồ án tố t nghiê ̣p

động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong

việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên.

Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò

quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in vitro vào

thực tiễn. Tuy nhiên, đối với cây hoa chuông do toàn thân được phủ một lớp lông tơ

dày, thân lá chứa nhiều nước nên giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu gặp nhiều khó khăn

(số lượng mẫu nhiễm và chết rất cao). Vì vậy, để tăng hiệu quả của giai đoạn này

cần lựa chọn được hóa chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan sinh dưỡng

đưa vào nuôi cấy.

1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật

1.1.4.1. Sự lựa chọn mẫu cấy

Theo Mantell và cộng sự (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải

có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng. Mô non như

đỉnh chồi nách, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một

cây (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Thời vụ và giai đoạn sinh trưởng của cây mẹ có

ảnh hưởng hoàn toàn khác nhau tới khả năng tái sinh, phát sinh hình thái của mô nuôi

cấy (Mamaril và Lopez, 1997).

1.1.4.2. Khử trùng mô thực vật

Các mô cấy hầu hết là các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, lá,

rễ, thân, củ,… tùy theo sự tiếp xúc của môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa

ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào

môi trường nuôi cấy in vitro, các mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để

loại bỏ hết các nguồn tạp nhiễm (Bhojwani và Razdan, 1996)

Khử trùng mẫu cấy là một việc làm khó vì mẫu sống không thể khử trùng bằng

nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải

được khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là

hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, oxy già,… Các mẫu cấy sau khi chọn

phải rửa phải ngâm rửa mẫu bằng xà phòng dưới dòng chảy rồi mới cho vào ngâm

trong dung dịch khử trùng. Hiệu quả xử lý các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ

Đồ án tố t nghiê ̣p

và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề mặt

các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử trùng

trước tiên người ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70o trong 30 giây, sau

đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.

Việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử

lý trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm phần lớn là bụi tóc, tay, quần áo vì

vậy trong khi cấy phải rửa tay bằng xà phòng, lau cồn 70o tới khuỷa tay,…

Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng

Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả

Hypochorite calcium 9 – 10 5 – 30 Rất tốt

Hypochorite sodium 0,5 - 5 5 – 50 Rất tốt

Hydro peroxide 10 – 12 5 – 15 Tốt

Nước bromie 1 – 2 2 – 10 Rất tốt

2 – 10 0,1 – 1 Trung bình HgCl2

Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá tốt

1.1.4.3. Carbon và nguồn năng lượng

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng, vì vậy cần phải bổ sung nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy để cung cấp

năng lượng (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Hai loại đường thường được sử dụng là

sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Nồng độ

sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn

sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Laneri; Franconi; Altavista, 1990).

Đồ án tố t nghiê ̣p

1.1.4.4. Các khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây

trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, S, Ca và Mg

được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp chất khoáng để cấu tạo tế bào, mô thực

vật được sử dung với nồng độ trên 30 ppm (Torres, 1989).

- Nguồn Nitơ (N): mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các dạng

nitơ khoáng như amon và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ

như amino acid. Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3,

NaNO3 hoặc NH4NO3. Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc

NH4NO3. Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ

của NO3+ và NH4+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy

và mục đích nghiên cứu.

- Nguồn Phospho (P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực

vật. Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, nucleic acid

và tham gia cấu trúc màng. Hai dạng P thường được dùng nhất là Na2H2PO4.7H2O và

KH2PO4 (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2011).

- Nguồn Kali (K): K giú p tăng khả năng thẩm thấu qua màng tế bào, điều chỉnh pH và lươ ̣ng nướ c ở khí khổ ng, hoa ̣t hoá enzyme, có liên quan đến quang hơ ̣p và tổ ng hơ ̣p hydrate carbon, giú p vâ ̣n chuyển hydrate carbon, tổ ng hơ ̣p protein, cải thiê ̣n khả

năng sử du ̣ng ánh sáng khi gă ̣p điều kiê ̣n bất lơ ̣i. K thường được cung cấp cho môi

trường nuôi cấy ở dạng kali nitrat (KNO3), kali clorua (KCl2), kali phosphat(

KH2PO4) (Dương Công Kiên, 2003).

- Nguồn Canxi (Ca): Canxi có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do

đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến

giữa của thành tế bào (Trần Văn Minh, 1997). Sự hoạt động của nhiều enzyme của

thực vật cũng phụ thuộc vào Ca2+ vì canxi là đồng yếu tố với những enzyme phân

giải ATP. Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng

thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin.

Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào. Số lượng lớn Ca2+

Đồ án tố t nghiê ̣p

gắn trên thành tế bào đóng vai trò chủ yếu trong củng cố độ vững chắc cho thành tế

bào và điều hoà cấu trúc màng tế bào.Canxi được cung cấp dưới dạng muối canxi

nitrat Ca(NO3)2. 4H2O, canxi clorua CaCl2. 6H2O (Dương Tấn Nhựt, 2009).

- Nguồn Magie (Mg): Magie là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp

lục tố và nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme vận chuyển phosphate.

Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuyếch tán vào trong tế bào như K+ vì vậy có

vai trò như một cation trung hòa các cation và các acid hữu cơ. Magie được cung cấp

dưới dạng magie sulphat MgSO4.7H2O (Dương Tấn Nhựt, 2011).

1.1.4.5. Các khoáng vi lượng

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng

của mô và tế bào thực vật còn được gọi là các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố vi

lượng cần cung cấp là: Fe,Zn, B, Mn, Cu, I, Mo, Ni,… (Torres, 1989).

1.1.4.6. Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông

thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của

chúng (White, 1943).

Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1),

acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamin là một vitamin căn bản

cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamin thường được sử dụng với

nồng độ biến thiên từ 0,1 – 10 mg/l. Acid nicotinic thường được bổ sung vào môi

trường nuôi cấy với nồng độ 0,1 – 5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1

– 10 mg/l. Myo-inositol có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp tế bào,

thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ cao

50 - 100 mg/l (Dương Công Kiên, 2003).

1.1.4.7. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một

hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần

thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống

tốt cho mô và các tổ chức (Torres, 1989). Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này

Đồ án tố t nghiê ̣p

thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh

của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính

sau đây.

a. Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường gặp trong tự nhiên,

có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ do Went và Thimann (1937) phát hiện ra. Auxin

vận chuyển hướng cực: từ đỉnh chồi ngọn tới cơ quan khác.

Auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và giãn nở của tế bào đặc biệt

theo chiều ngang làm tế bào phình ra. Bên cạnh đó auxin còn kích thích sự phân chia

và kéo dài tế bào. Tuy nhiên các ảnh hưởng đến sự giãn nở và phân chia tế bào trong

tác động hỗ trợ với các phytohoocmon khác (Skoog và Miller, 1957).

Auxin cũng gây ra tính hướng động của cây (hướng sáng và hướng đất), gây

ra hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ, sự sinh trưởng của quả và tạo

quả không hạt. Ngoài ra auxin còn kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả; ảnh hưởng đến sự

vận động của chất nguyên sinh; ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp và trao đổi

chất.

Những auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: IBA (3-indolebutiric

acid), IAA (3-indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic acid), 2,4-D (2,4-D-

dichlorophenoxyaxetic acid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic acid). Trong số các

auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin

sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường

tạo và phát triển callus (Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, 1993).

b. Cytokinin

Cytokinin là nhóm phytohormone có mặt ở tất các các loại cây trồng, hình

thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Cytokinin vận chuyển không hướng cực, có thể

hướng ngọn hoặc hướng gốc.

Cytokinin có ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của

thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ auxin/cytokinin

có ý nghĩa quyết định trong sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo rễ, tạo

Đồ án tố t nghiê ̣p

chồi hay tạo phôi vô tính. Cytokinin cũng có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất

như quá trình sinh tổng hợp nucleic acid, protein, chlorophyll và ảnh hưởng đến các

hoạt động sinh lý của cây. Có ba loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy

mô là BA, kinetin và zeatin (Trần Văn Minh, 1997).

Kinetin đươ ̣c Skoog (1957) phát hiê ̣n ngẫu nhiên trong khi chiết xuất acid

nucleic, kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm

DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. Zeatin thực chất là một dẫn xuất của

adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng. BA

tuy là cytokinin tổ ng hơ ̣p nhân ta ̣o nhưng có hoa ̣t tính ma ̣nh hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin.

c. Gibberellin (GA)

Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm

hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác

định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30,

mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến tranh

thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của

người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic

acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3.

Hiệu quả sinh lý rỏ rệt nhất của gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh

trưởng kéo dài của thân bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế

bào. Gebberellin cũng kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, do đó nó có tác dụng đặc

trưng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. Trong nhiều trường hợp

gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt. Ảnh hưởng đặc trưng của gibberellin lên sự ra

hoa là kích thích sự sinh trường kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Đối với sự sinh

trưởng của quả và tạo quả không hạt thì gibberellin có vai trò gần giống với auxin,

nó làm tăng kích thước quả và tạo nên quả không hạt (Hoàng Minh Tấn; Nguyễn

Quang Thạch, 1993).

Đồ án tố t nghiê ̣p

Trong nuôi cấy mô thực vật, tác dụng của gibberellin chưa thực sự rõ ràng.

Nhiều tác giả đã sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một số loại môi

trường chuyên dụng.

d. Abscisic acid (ABA)

Abscisic acid thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ

nghỉ của chồi; làm chậm sự ra hoa và sự nảy mầm của hạt; tham gia vào sự rụng lá,

hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả; ức chế sự kéo dài thân và gây

ra hiện tượng đóng khí khổng. Abscisic acid còn được xem là một hoocmon của

“stress” vì nó được hình thành mạnh để phản ứng với các stress hoặc điều kiện bất

thuận cảu môi trường và làm cho cây biến đổi để thích ứng với điều kiện môi trường

(Hoàng Minh Tấn; Nguyễn Quang Thạch, 1993).

Trong nuôi cấy mô và tế bào, abscisic acid có tác dụng tăng cường khả năng

chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy abscisic

acid được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định.

e. Ethylene

Ethylen thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng thực vật được tổng hợp trong

các mô đang xảy ra sự lão hóa hay sắp chín như ở trái. Ethylene gia tăng sự rụng lá

và trái, sự lão hóa; phá vỡ sự ngủ của chồi và hạt của một số loài; kích thích trổ hoa

ở một số loài thực vật không xác định (Lê Văn Hoàng, 2008).

1.1.4.8. Các chất hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro

a. Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van

Overbreek và cộng sự (Van Ovebreek và cộng sự, 1941). Sau đó, tác dụng tích cực

của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả

ghi nhận.Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất kích thích

sinh trưởng (George, 1993).

Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều

loại cây với nồng độ 5 – 20 % thể tích môi trường.

b. Dịch chiết khoai tây

Đồ án tố t nghiê ̣p

Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin B, C và các

khoáng vi lượng cần thiết như kaili, sắt, magie,… rất tốt cho sự sinh trưởng và phát

triển của mô, tế bào. Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan,

bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác. Nồng độ khoai tây thường sử dụng là 20

mg/l (Horst, 1990).

c. Dịch chiết nấm men

Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô

tế bào động vật với nồng độ thích hợp, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát

triển của mô và tế bào, lượng thường dùng là 1 g/l (Horst, 1990).

Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch thủy phân casein hydrolylase (0,1 – 1 %)

hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100 g/l (chuối xanh) nhằm tăng

cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.

1.1.4.9. Độ pH môi trường và agar

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong

nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần

thiết của thí nghiệm bằng NaOH hoặc HCl.

pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động

từ 5,5 - 6,0. Nếu pH cao hơn thì sẽ làm môi trường rất rắn trong khi pH thấp hơn lại

giảm khả năng đông đặc của agar (Dương Tấn Nhựt, 2009).

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hóa

môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1 %, đây là loại tinh bột đặc chế

từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxi

nếu môi tường lỏng và tĩnh. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá

cứng và ảnh hưởng tới sự khuyếch tán cũng như hấp thu dinh dưỡng của mô, tế bào

(Collin, 1998; Bhojwani & Razan, 1983). Nếu như agar không được tinh sạch có thể

làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể ảnh hưởng

đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những

tác động sinh lý trên mô thực vật (Griffis và cộng sự, 1991; Debergh, 1983; Halquist

và cộng sự, 1983)

Đồ án tố t nghiê ̣p

1.1.4.10. Than hoạt tính

Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường sẽ kích thích sự tăng trưởng của

mô thực vật do than hoạt tính kết hợp với các hoạt chất phenol độc do mô tiết ra trong

suốt thời gian nuôi cấy. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng

độ 0,5 – 3 %.

1.1.4.11. Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát sinh hình thái của mô

nuôi cấy. Các yếu tố ảnh hưởng như: cường độ chiếu sáng, chu kỳ chiếu sáng và

chất lượng ánh sáng.

Kết quả nghiên cứu của Vince-Pure (1994), Teresa và cộng sự (2007) đã chỉ ra

nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh hình thái

của mẫu cấy và chất lượng cây giống. Để mô cấy phát triển tốt thì phòng nuôi cấy

phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường

được giữ ở 25 – 28oC (Nguyễn Đức Thành, 2000).

1.2. Giới thiệu về chi Stachys

Chi Stachys là một trong những chi lớn nhất trong họ Lamiaceae, bao gồm

khoảng 300 loài xuất hiện ở vùng ôn đới và nhiệt đới. Chi này phân bố khắp thế giới

nhưng phổ biến nhất ở châu Âu và Đông Á. Sự đa dạng loài lớn nhất ở Đông Nam Á

(khoảng 154 loài). Chiết xuất từ các loài Stachys đã được sử dụng trong y học truyền

thống ở châu Âu để tiêu đờm, giảm ho, giảm các triệu chứng hen suyễn và đau tai.

Tại Liên bang Nga, có 37 loài Stachys sinh trưởng, trong đó có 12 loài được sử dụng

trong y học dân gian, một số loài được trồng làm cây cảnh. Phần thân trên của một số

loài được sử dụng để điều trị các vấn đề như rối loạn da, đau dạ dày, ung nhọt, hen

suyễn, viêm thấp khớp và ung thư (Gören, 2014).

Các loài Stachys cũng được sử dụng trong y học dân gian Bulgaria, Đức,

Afghanistan, và Trung Quốc. Loài S. recta đã được đưa vào sản xuất dược phẩm tại

Pháp và Mêhicô và được sử dụng trong liệu pháp vi lượng đồng căn. Nhiều loài thuộc

chi Stachys còn được sử dụng như một loại trà gọi là “trà núi”, có tác dụng an thần,

chống co thắt, lợi tiểu và tuần hoàn (Gören, 2014). Ngoài ra, các chế phẩm của

Đồ án tố t nghiê ̣p

Stachys còn được sử dụng làm thuốc chống viêm, làm lành vết thương, thuốc an thần,

kích thích sự co tử cung trong khi sinh và được sử dụng như một loại thuốc cầm máu.

Tác dụng an thần của các chế phẩm thuốc thu được từ Stachys mạnh hơn so với các

chế phẩm thu được từ Leonurus cardiaca.

Thành phần hóa học của chi Stachys bao gồm các loại tinh dầu, alkaloid,

flavonoid, tannin, iridoid, glycosides, choline, betaine, allantoin, turicine, các loại

đường (bao gồm tetrasaccharide stachyose có hoạt tính giống insulin) và nhiều thành

phần khác. Chúng có mặt trong tất cả các bộ phận của cây, bao gồm lá, thân, rễ và

củ. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã chứng minh rằng nuôi cấy tế bào S. sieboldii có

thể tạo ra glycosid verbascoside có đặc tính chống miễn dịch.

Hạt của các loài S. balansae, S. lanata, S. sylvatica, S. annua, S. palustris, S.

betoniciflora chứa 24 – 44 % chất béo. Các loại axit béo trong hạt của các loài thuộc

chi Stachys chứa triacylglycerols có nguồn gốc từ acid panmitic, stearic, oleic,

linoleic và linolenic. Triaeylglycerols của axit linoleic chiếm 60 – 70 % (trong tổng

số) - và của axit oleic chiếm 20 – 30 %, chiếm ưu thế trong chất béo của các loài

Stachys nghiên cứu, trong khi đó lượng triacylglycerols chủ yếu chứa axit béo no

chiếm từ 5 đến 10 %.

Đã có nhiều nghiên cứu về các loài thuộc chi Stachys cho thấy chúng có khả

năng điều trị các loại bệnh như tiểu đường, kháng viêm, an thần, chống oxi hóa, gây

độc với các tế bào ung thư,...

Đồ án tố t nghiê ̣p

1.3. Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis)

1.3.1. Phân loại

Giới (regnum): Plantae

(không phân hạng): Angiospermae

(không phân hạng) : Eudicots

Bộ (ordo): Lamiales

Họ (familia): Lamiaceae

Chi (genus): Stachys

Loài (species): Stachys affinis Hình 1.1. Cây sùng thảo

1.3.2. Đặc điểm sinh học và công dụng

Cây sùng thảo – Stachys affinis (Stachys sieboldii, Stachys tuberifera) còn

được gọi với tên khác là atisô Trung Quốc, là một loại cây thân thảo lâu năm có nguồn

gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, nơi chúng được trồng rộng rãi và lấy củ làm thực

phẩm.

Cây có chiều cao từ 30 đến 50 cm, lá có lông mọc đối xứng nhau và mép lá có

răng cưa, hoa nhỏ màu trắng hoặc màu hồng tím nở vào mùa hè. Vào cuối mùa thu,

dưới mặt đất hình thành các củ nhỏ giống như một chuỗi hạt ngọc trai màu trắng.

Củ sùng thảo có hình dạng giống sâu bướm, dài từ 2,5 đến 5,5 cm hoặc dài

hơn, dày 1,3 đến 2,5 cm. Khi ăn củ có vị man mát giống như atiso đỏ và thường được

chế biến bằng cách ngâm, xào, nấu súp hoặc ăn sống. Tại Trung Quốc và Nhật Bản,

củ sùng thảo còn được ngâm rượu làm thuốc chữa bệnh có tác dụng thanh nhiệt,

chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm và tăng cường hệ tiêu hóa.

Atisô Trung Quốc đã được sử dụng như một loại rau củ ở Trung Quốc từ thế

kỷ thứ tư. Kể từ thế kỷ XIX, cây sùng thảo được trồng ở châu Âu (Łuczaj và cộng sự,

2011), ở Pháp cây sùng thảo được gọi là “Crosnes”, chỉ thành phố Crosne, thuộc tỉnh

Essonne, nơi nó được trồng lần đầu tiên vào năm 1882.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Hình 1.2. Củ sùng thảo

Ở Trung Quốc, S. affinis được sử dụng như một phương thuốc truyền cổ truyền

điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh, bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi (Yamahara, Kitani,

Kobayashi & Kawahara, 1990; Feng và cộng sự, năm 2015).

Có một số nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết xuất từ củ sùng thảo giúp giảm

bớt sự rối loạn trí nhớ liên quan đến chứng mất trí và bệnh Alzheimer ở chuột thông

qua cơ chế chống oxy hóa (Harada, Tsujita, Ono, Miyagi, Mori & Tokuyama, 2015).

Chiết xuất methanolic từ S. affinis cũng đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ chuột

khỏi tác động gây tử vong của kali cyanide (Yamahara và cộng sự, 1990) và ức chế

hoạt động của enzyme hyaluronidase (Takeda, Fujita, Satoh & Kakegawa, 1985).

Trong một nghiên cứu khác, một đoạn polysaccharide chiết xuất từ củ của S.

affinis có khả năng thu hồi cao các anion superoxide, hydroxyl và các gốc tự do (Feng

và cộng sự, 2015). Theo những nghiên cứu của chúng tôi, các glycosides

phenylethanoid như acteoside và stachysoside C là những hoạt chất thứ cấp chính đặc

trưng trong củ của S.affinis (Yamahara và cộng sự, 1990). Đặc biệt, acteoside được

xem là một ức chế di căn ung thư hiệu quả (Hayashi, Nagamatsu, Ito, Yagita &

Suzuki, 1996). Củ của S. affinis còn có một nguồn stachyose phong phú (Łuczaj và

cộng sự, 2011), người ta đã chứng minh rằng stachyose có tác dụng hạ đường huyết

đáng chú ý ở chuột nhắt (Zhang và cộng sự, 2004).

Đồ án tố t nghiê ̣p

1.3.4. Thành phần hóa học

Phân tích các hóa chất thực vật từ chiết xuất ethanol của atisô Trung Quốc

thông qua sử dụng sắc ký cột (tách các hợp chất) cùng với dữ liệu NMR và MS (xác

định và mô tả cấu trúc) cho phép xác định 9 hợp chất, cụ thể là verbascoside (1),

leucosceptoside A (2), martynoside (3), harpagide (4), 8-O- acetyl-harpagide (5),

melittoside (6), 5- O-allosyloxy-aucubin (7), acid succinic (8), và stachyose (9).

Các hợp chất này thuộc bốn loại chất chuyển hóa tự nhiên khác nhau, cụ thể

là các phenylethanoid glycosides (PhG) (các hợp chất 1-3), iridoids (các hợp chất 4-

7), axit dicarboxylic (hợp chất 8) và oligosaccharides (hợp chất 9). Sự hiện diện của

PhG và các iridoid glycoside trong chiết xuất ethanol của atisô Trung Quốc hoàn toàn

phù hợp với sự phân loại thực vật hiện tại của loài.

Verbascoside (1) là một PhG phổ biến đã được tìm thấy ở S. affinis (Hayashi

và cộng sự, 1994) cũng như các thành viên khác của chi như: S. anisochila, S.

beckeana, S. plumosa, S. Alpina subsp. Dinarica, S. germanica subsp. Salviifolia và

S. tymphaea (Venditti và cộng sự, 2014). Từ khía cạnh sức khoẻ, verbascoside có một

số đặc điểm dược lý đáng chú ý, trong đó quan trọng nhất là kháng viêm, giảm đau,

chống oxy hóa và chống ung thư (Funes và cộng sự, 2009; Speranza và cộng sự,

2010).

Leucosceptoside A (2) và martynoside (3) cũng là PhGs, trước đây nó được

tìm thấy trong lá của S.affinis và các thành viên khác trong họ Lamiaceae (Nishimura

và cộng sự, 1991). Các hợp chất này có tính chất tương tự estrogen và khả năng chống

oxy hoá quan trọng (Papoutsi và cộng sự, 2006; Wang và cộng sự, 1996).

Harpagide (4), 8-O-acetyl-harpagide (5), melittoside (6) và 5-O-allosyloxy-

aucubin (7) đại diện cho tất cả các hợp chất mới của loài, trong khi chúng đã được

tìm thấy ở một số thành viên của chi Stachys trước đây và các chi liên quan của họ

Lamiaceae (Venditti và cộng sự, 2013a, 2013b). Cần lưu ý rằng harpagide (4) và 8-

O-acetyl-harpagide (5) được xem là các dấu hiệu hóa học của họ Lamiaceae, cũng

như các iridoids diglycosidic melittoside (6) và 5-O-allosyloxy-aucubin (7), đã được

phát hiện ở một số chi của họ Lamiaceae với mức độ gần gũi và phân loại chặt chẽ

Đồ án tố t nghiê ̣p

(Venditti và cộng sự, 2013a, 2013b). Từ quan điểm dược lý, tất cả những iridoid này

đều có những đặc tính sinh học quan trọng. Harpagide (4) có thể sử dụng để ngừa

loãng xương (Chung và cộng sự, 2016), và dẫn xuất acetyl của nó cũng cho thấy tác

dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, kháng virus và giảm đau (Xie, Tần

& Fang, 2005).

Melittoside (6) và 5-O-allosyloxy-aucubin (7) có khả năng chống oxy hoá ở

mức trung bình nhưng chúng có tác dụng kháng viêm (Samuelsen, 2000).

Axit succinic (8) là một hợp chất chuyển hóa thứ cấp đóng một vai trò như

một chất trung gian trong chu trình tế bào của axit citric ở cả thực vật và động vật.

Axit succinic có vai trò quan trọng trong y học và làm thực phẩm chức năng vì nó có

tác dụng chống co giật trong trường hợp oxy cao áp (Sanders, Currie & Woodhall,

1969), nó cũng có tác dụng giảm đau và an thần (Chen, Xin, Kong, Min & Li, 2003).

Axit hữu cơ này còn có tác dụng làm giảm lượng đường và cholesterol trong máu, nó

đã được chứng minh có ích trong điều trị bệnh đái tháo đường và các rối loạn chuyển

hóa khác (Vengerovskii, Khazanov, Eskina & Vasilyev, 2007).

Stachyose (9) là hợp chất dấu hiệu để nhận biết atisô Trung Quốc (Łuczaj và

cộng sự, 2011). Nó là một oligosaccharide được tìm thấy trong một số loại rau, đặc

biệt là ở trong hạt đậu, thường được sử dụng làm chất tạo ngọt thay thế cho sucrose

trong đồ uống (Nakakuki, 2002), cần lưu ý rằng đường này không tiêu hoá hoàn toàn

bằng enzyme trong cơ thể người, và có thể gây đầy bụng nghiêm trọng ở những người

nhạy cảm (Hu, 2005). Tuy nhiên, những nhược điểm nhỏ này không đáng kể so với

lợi ích của nó. Stachyose có tiềm năng cao trở thành chất tiền sinh học trong thực

phẩm chức năng (Yildiz, 2010), và nó có khả năng hạn chế sự gia tăng một số vi

khuẩn có hại (Smith, Roche, Trombe, Briles & Håkansson, 2002) cũng như làm giảm

nồng độ glucose huyết tương (Zhang và cộng sự, 2004).

1.3.5. Giá trị dinh dưỡng

S. affinis giàu protein, carbohydrate và vitamin. Có thể ăn sống, nấu, ngâm

rượu, làm salad, chế biến súp, làm gia vị (Mercier & Perennes, 1982), hoặc mài thành

bột và sử dụng để chế biến bánh quy. Củ của S. affinis rất giàu Fe2+, do đó củ sùng

Đồ án tố t nghiê ̣p

thảo là thực phẩm lý tưởng cho các bệnh nhân thiếu máu (Instituto Botanico Boreali-

Occidentali Academiae Sinicae, 1983).

Phân tích giá trị năng lượng của củ sùng thảo cho thấy cứ 100 g củ cung cấp

195 kcal. Carbohydrate (36,94 %) là chất dinh dưỡng đa lượng phổ biến nhất, trong

đó đường chiếm một phần quan trọng (14,07 %). Stachyose là thành phần chiếm tỷ

lệ lớn nhất trong phần đường.

Củ có 10,64 % protein, 0,53 % chất béo. Đáng chú ý là trong củ có một nguồn

chất xơ dồi dào (35 %), đây thành phần thực phẩm có tác dụng tốt với sức khoẻ. Hàm

lượng tro cao (8.44 %) do sự hiện diện của nhiều yếu tố đa lượng và vi lượng. Về mặt

này, atisô Trung Quốc cho thấy nồng độ K (2,36 %), P (0,41 %), Ca (0,38 %) và Mg

(0,22 %) và nồng độ Na thấp (0,008 %) (Stanley & Stephen, 2008).

Như đã biết khẩu phần ăn có chứa hàm lượng kali cao có thể bảo vệ khỏi nguy

cơ mắc bệnh tim mạch (Khaw & Barrett-Connor, 1987). Trên cơ sở này, việc sử dụng

atisô Trung Quốc không chỉ có lợi cho bệnh nhân bị tiểu đường (vì hàm lượng

stachyose cao) mà còn ở những người có vấn đề về tim. Hàm lượng kali cao phát hiện

trong củ có thể giải thích về truyền thống sử dụng củ sùng thảo ở Trung Quốc để điều

trị các bệnh về tim (Phong và cộng sự, 2015).

1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys

Các loài thực vật thuộc chi Stachys đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở

một số quốc gia để làm thuốc khử trùng, chống co thắt, tiêu đờm, giảm ho, làm dịu

các triệu chứng hen suyễn và đau tai, ức chế sự phát triển của khối u sinh dục và ung

thư lở loét. Các loại thảo mộc được sử dụng bên ngoài để điều trị vết thương và sắc

thuốc uống điều trị đau bụng dưới, chuột rút, chóng mặt, sốt, bệnh gout và rối loạn

kinh nguyệt. Các nghiên cứu dược phẩm đã chứng minh rằng các chiết xuất hoặc các

thành phần của cây thuộc chi Stachys có hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm, các

hoạt tính chống oxy hoá, giảm lo âu, kháng viêm, hạ huyết áp, hyaluronidase và chống

viêm thận.

Đồ án tố t nghiê ̣p

1.4.1. Kháng viêm và giảm đau

Hoạt tính kháng viêm của dung dịch chiết xuất thu được từ các bộ phận trên

mặt đất của mười loài Stachys Hungary đã được nghiên cứu thử nghiệm ở cơ thể

chuột bị gây phù nề bằng carrageenan sau khi tiêm vào ổ bụng và cho chuột uống

(Háznagy-Radnai và cộng sự, 2012).

Chiết xuất acetone và methanol của S. byzantina đã được chứng minh có vai

trò quan trọng trong việc ức chế cơn đau và quá trình viêm trong thí nghiệm sử dụng

hai mô hình viêm nhiễm: thử nghiệm formalin và thử nghiệm chứng phù nề do

carrageenan (Khanavi và cộng sự, 2005). Cả ba liều của acetone và methanol chiết

xuất từ S. byzantina (50, 100 và 200 mg/kg) đã ức chế đáng kể cơn đau trong giai

đoạn thứ hai của thử nghiệm formalin và tác dụng của liều thấp cao hơn. Cả hai chiết

xuất của S. byzanthina đều giảm phản ứng đau đớn hiệu quả hơn indomethacin - một

thuốc chống viêm không steroid (NSAID).

1.4.2. Chống oxy hóa

Có nhiều nghiên cứu cho thấy các loài thực vật thuộc chi Stachys là một nguồn

chất chống oxy hoá tự nhiên dồi dào.

Hoạt tính chống oxy hoá ở điều kiện in vitro của chiết xuất methanol thu được

từ các bộ phận trên mặt đất của S. spruneri đã được nghiên cứu cùng với 20 loài thực

vật khác thuộc họ Lamiaceae và cho thấy có tác dụng tương tự vitamin E (Couladis

và cộng sự, 2003).

Dung dịch chiết xuất từ S. iberica có hoạt tính chống oxy hoá trong điều kiện

in vitro khác nhau (Tepe và cộng sự, 2011). S. iberica có thành phần chất chống oxy

hoá tốt với khả năng ức chế acid linoleic là 88,14 % ở nồng độ 2 mg/ml, nhưng hoạt

tính loại bỏ tạp chất và hiệu ứng tạo phức chelate ở mức vừa phải (lần lượt là 46,63%

ở 1,0 mg/ml và 33,14 % ở 2 mg/ml).

Chiết xuất methanol từ các bộ phận trên mặt đất của bốn loài Stachys như S.

alpina, S. anisochila, S. beckeana và S. plumosa đã được nghiên cứu về tác dụng

chống oxy hoá của chúng (Kukic và cộng sự, 2006). Các chiết xuất được nghiên cứu

về khả năng chống oxy hoá tổng hợp (TAC), cùng với khả năng thu hồi gốc tự do và

Đồ án tố t nghiê ̣p

OH, và oxy hóa lipid. Sự tương quan cao giữa hàm lượng phenol tổng, TAC và thu

gốc tự do chỉ ra rằng polyphenol là chất chống oxy hoá chính. Tất cả các chiết xuất

Stachys, ngoại trừ S. plumosa, đều có hoạt tính chống gốc tự do với giá trị IC50 <50

lg/ml. Trong nồng độ từ 6,25 đến 50 lg/ml tất cả các chiết xuất thu được gốc OH có

tỷ lệ trên 40 %, với sự ức chế tối đa của chiết xuất S. beckeana là 64,97 %. Chiết xuất

S. plumosa đạt hoạt độ tối đa là 60,67 % ở 100 mg/ml. Các nghiên cứu trước đây đã

chứng minh sự hiện diện của phenylethanoid glycosides như acteoside, martinoside

và forsithoside B là thành phần chính của S. plumosa (Bankova và cộng sự, 1999).

Các hợp chất này được chứng minh là các chất chống oxy hoá mạnh (Aligianis và

cộng sự, 2003).

Sáu loài Stachys là S. cretica, S. germanica, S. hydrophila, Stachys nivea, S.

palustris, và S. spinosa đều có khả năng thu gốc DPPH (Conforti và cộng sự, 2009).

S. palustris cho thấy hiệu quả chống gốc tự do cao nhất với giá trị IC50 là 0,482 mg/ml.

Các hợp chất carbonylic (25,4 %), axit béo và este (24,2 %), sesquiterpenes đã bị oxy

hoá (10,6 %) là ba nhóm thành phần cấu thành dầu tinh dầu này. Các hợp chất có

nhiều nhất là caryophyllene oxide, hexahydrofarnesyl acetone, hexadecanoic acid,

(Z)-phytol, thymol và p-methoxyacetophenone. Những hợp chất này hoạt động như

chất chống oxy hoá (Ruberto và Baratta, 2000).

1.4.3. Chống lo âu

Trong một nghiên cứu gần đây đã chứng minh tác dụng an thần của tinh dầu

Stachys tibetica khi tiến hành thí nghiệm mô hình chữ thập nâng cao, thí nghiệm lỗ

hổng và thí nghiệm khu vực sáng/tối ở chuột (Kumar và cộng sự, 2012). Ở chuột

cống, tinh dầu của S. tibetica (liều 25 và 50 mg/kg) làm tăng cả thời gian và số lần ra

vùng cánh tay mở, giảm tỷ lệ quay lại vùng cánh tay đóng, điều đó cho thấy tác dụng

chống lo âu đáng kể.

Chiết xuất của S. alpina, S. anisochila, S. beckeana và S. plumosa được tiêm

dưới da những con chuột Wistar đực trưởng thành với liều lượng 100 - 400 mg/kg và

đem thí nghiệm trong thí nghiệm mô hình chữ thập nâng cao (EPM - Elevated Plus

Maze), thử nghiệm Grip và các hoạt động vận động tự nhiên, mục đích chính là để

Đồ án tố t nghiê ̣p

dự tính khả năng giảm lo lắng, giảm đau và giảm giãn cơ (Savic' và cộng sự, 2010).

S. beckeana ở liều 400 mg/kg gây ra hiệu ứng giống như bị ngộ độc ở bệnh nhân cao

áp (EPM), trong khi các thông số hoạt động có liên quan ở cùng một thử nghiệm cho

thấy hoạt tính an thần của S. alpina subsp. dinarica và S. plumosa.

Sự có mặt của chrysoeriol và các glycosides apigenin trong S. plumosa thể

hiện hoạt tính đặc trưng. Chrysoeriol 4’-O-α-D-glucopyranoside và chrysoeriol 7-O-

α-D glucopyranoside cho thấy hoạt tính bảo vệ thần kinh trong điều kiện in vitro (Ma

và cộng sự, 2005). Apigenin được mô tả là chất có hiệu quả giảm lo lắng rõ ràng ở

chuột, không gây dị ứng hoặc làm giãn cơ, phù hợp để trở thành một chất đối kháng

với benzodiazepine (Dekermendjian và cộng sự, 1999; Viola và cộng sự, 1995). Axit

chlorogenic, được tìm thấy trong cả bốn chất chiết xuất cũng cho thấy hiệu quả chống

lo âu trong các mô hình thí nghiệm lo lắng ở chuột, bao gồm thử nghiệm khu vực

sáng/tối, mô hình chữ thập nâng cao và thử nghiệm khám phá tự do (Bouayed và cộng

sự, 2007).

Linalool có mặt trong chiết xuất từ các loài Stachys được tiêm vào ổ bụng

chuột cũng cho thấy tác dụng an thần rõ rệt (bao gồm thôi miên, hạ nhiệt và chống co

giật) đã được chứng minh có hiệu quả an thần ở người (Linck và cộng sự, 2010).

1.4.4. Kháng khuẩn

Koutsaviti và cộng sự (2011) đã đánh giá khả năng ức chế sự tăng trưởng vi

khuẩn của tinh dầu S. spruneri đối với vi khuẩn Gram dương như: B. subtilis,

Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, S. aureus, Staphylococcus epidermidis;

các vi khuẩn Gram âm như E. coli , Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa và hai

chủng nấm Candida albicans phát hiện thấy tinh dầu có tác dụng ức chế đáng kể với

tất cả các vi sinh vật được thử nghiệm.

Tinh dầu thu được từ các bộ phận trên mặt đất của S. officinalis ở Serbia đã

được tiến hành thử nghiệm chống lại các vi khuẩn Gram dương như Bacillus subtilis

và Staphylococcus aureus, các vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhimurium, tạo ra các giá trị MIC (nồng

độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi sinh vật) trong khoảng 0,31 - 20,00 mg/ml

Đồ án tố t nghiê ̣p

(Lazarevìc và cộng sự, 2013). Tác dụng của chúng với vi khuẩn Gram dương cao hơn

các chủng Gram âm. Trong một nghiên cứu trước, tinh dầu của S. officinalis cho thấy

giá trị MIC là 1,0 mg/ml đối với S. aureus (Grujic-Jovanovic và cộng sự, 2004).

Các dung dịch chiết xuất, methanolic và dichloromethane của S. nivea thể hiện

tác dụng kháng Leishmania ở hình dạng ký sinh trùng nội bào không có roi (Di

Giorgio và cộng sự, 2008).

Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất methanol từ hoa khô của S. byzantina,

S. inflata, S. lavandulifolia và S. laxa được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán

trên đĩa thạch và xác định các giá trị ức chế tối thiểu (MIC) đối với S. aureus ,

Streptococcus sanguis, E. coli, P. aeroginosa, K. pneumoniae, A. niger và C. albicans

(Saeedi và cộng sự, 2008). Các chiết xuất cá tác dụng hiệu quả hơn với vi khuẩn Gram

dương và không có hoạt tính kháng nấm. Hoạt tính có thể liên quan đến sự có mặt

của flavonoids như là thành phần chính. Nhiều nghiên cứu đã xác định flavonoid có

khả năng chống nấm, kháng vi trùng và kháng khuẩn (Cushnie and Lamb, 2005).

1.5. Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys

Nhân giống bằng nuôi cấy mô và tế bào là biện pháp nhân giống hiện đại và

ngày càng phổ biến, cho phép nhân nhanh nhiều loại cây trồng với quy mô lớn. Một

số loài thuộc chi Stachys đã được nghiên cứu và xác định các điều kiện môi trường

nhân giống in vitro thích hợp, có thể kể đến một số loài như Stachys thracica, Stachys

pubescens, …

Khử trùng 100 hạt giống Stachys thracica bằng cồn 70 %, sau đó rửa với cồn

96%. Hạt sau khi khử trùng được chia đều cấy vào môi tường ½ MS và môi trường

lỏng chứa 0,07% agar. Sau 14 ngày, 10 % trong số 50 hạt cấy vào môi trường lỏng

chứa 0,07% agar nảy mầm, trong khi ở môi trường ½ MS không cáo dấu hiệu nảy

mầm. Cây con được cấy truyền sang môi trường MS cơ bản bổ sung 3 % sucrose và

0,7 % agar và được trồng trong điều kiện môi trường được kiểm soát (ánh sáng và

nhiệt độ). Các cây tái sinh có chỉ số tăng trưởng cao, hệ thống rễ phát triển và số

lượng lá nhiều (Desislava Mantovska và cộng sự, 2016).

Đồ án tố t nghiê ̣p

Môi trường tạo mô sẹo tốt nhất của Stachys pubescens là môi trường MS bồ

sung 100 mg/l myo inositol, 2 mg/l glycine, 0,5 mg/l nicotinic, 0,5 mg/l pyridoxine,

0,1 mg/l thymine, 30 g/l sucrose, 15 % nước dừa, 0,8 % agar, 1 mg/l IAA, 1 mg/l 2,4-

D và 0,2 mg/l kinetin. Độ pH của môi trường được điều chỉnh về 5,8. Môi trường đã

cấy mẫu được để ở nhiệt độ 250C trong bóng tối (Masoume Sabokbari và cộng sự,

2013).

Đồ án tố t nghiê ̣p

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Dự kiến thực hiện đề tài từ tháng 1/2017 đến tháng 7/2017.

- Địa điểm: Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh

học Thành phố Hồ Chí Minh, số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây,

quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh.

2.2. Vật liệu và phương pháp

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu được sử dụng trong đề tài là cây sùng thảo in vitro được

cung cấp từ phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.

HCM.

2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.2.2.1. Trang thiết bị - dụng cụ

- Tủ cấy vô trùng

- Tủ lạnh

- Máy đo pH

- Bếp từ

- Cân điện tử

- Dao cấy, kẹp cấy.

- Ống đong 100 ml, ống đong 100 ml, pipet 10 ml.

- Chai thủy tinh 500 ml.

- Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm.

- Máy đo pH, cân điện tử.

- Máy nước cất 2 lần.

- Tủ sấy.

- Nồi hấp tiệt trùng.

2.2.2.2. Hóa chất

- Cồn 96o, 70o

Đồ án tố t nghiê ̣p

- Môi trường MS cơ bản

- Saccharose

- Agar

- Các chất kích thích sinh trưởng: NAA, BA, IBA

2.2.3. Môi trường nghiên cứu

Môi trườ ng nuôi cấy sử du ̣ng là môi trườ ng khoáng cơ bản củ a Murashige và

Skoog (1962) gồ m: khoáng đa lươ ̣ng, khoáng vi lươ ̣ng, vitamin.

Môi trườ ng đươ ̣c bổ sung thêm 30 g/l đườ ng sucrose, 8,5 g/l agar. Sau khi bổ

sung đầy đủ các chất cần thiết thì cần điều chỉnh pH = 5,7 – 5,8.

Môi trườ ng nuôi cấy đươ ̣c đong vào chai thuỷ tinh vớ i thể tích mỗi chai là 60 ml rồ i tiến hành hấp khử trù ng ở điều kiê ̣n áp suất 1atm, nhiê ̣t đô ̣ 121oC trong 20 phú t.

2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy

Để đảm bảo điều kiê ̣n vô trù ng, các thí nghiê ̣m đươ ̣c thực hiê ̣n trong mô ̣t phò ng

nuôi cấy riêng biê ̣t vớ i các điều kiê ̣n sau:

- Cường độ chiếu sáng ánh sáng 2000 ± 500 lux.

- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.

- Nhiệt độ: 25oC ± 2.

- Độ ẩm: 50%.

Thời gian chiếu sáng và độ ẩm môi trường cũng có thể thay đổi tùy thuộc vào

mục đích và điều kiện thí nghiệm.

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, số liệu thu thập được

xử lý bằng phần mềm SARS 9.4 và Microsoft Excel 2016.

2.3. Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân

chồi từ đoạn thân cây sùng thảo.

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây

sùng thảo.

Đồ án tố t nghiê ̣p

- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây

sùng thảo giai đoạn vườn ươm.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Pha môi trường nuôi cấy

2.4.1.1. Chuẩn bị dung dịch mẹ

Hiện nay, môi trường MS được xem là môi trường thích hợp với nhiều loại

cây do giàu và cân bằng chất dinh dưỡng. Để thuận tiện cho việc pha các môi trường

nuôi cấy người ta không cần cân nhiều loại hóa chất thay vào đó là việc chuẩn bị

trước các dung dịch mẹ (dung dịch Stock), sau đó pha loãng ra để sử dụng.

Thường pha các dung dịch mẹ: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, Fe –

EDTA, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng. Dung dịch mẹ được pha với độ đậm đặc

từ X10 – X200 (10 lần đến 200 lần). Khi sử dụng chỉ cần pha với nước cất 2 lần theo

tỉ lệ thích hợp. Bảo quản dung dịch Stock trong tủ lạnh và thời gian sử dụng khoảng

nửa tháng.

2.4.1.2. Quy trình pha môi trường

- Chuẩn bị dụng cụ và các hóa chất cần thiết.

- Tiến hành cân, đong và hòa tan các chất cần thiết tương ứng với thể tích cần

pha.

- Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

- Thêm nước cất vào môi trường đến khi đạt thể tích cần thiết, khuấy đều

hỗn hợp.

- Chuẩn pH 5,8 ± 0,05 bằng NaOH 1 N và HCl 1 N, bổ sung agar và than

hoạt tính (nếu cần).

- Tiến hành chiết môi trường vào chai (thể tích tùy vào mục đích), bịt miệng

chai hoặc đóng nắp (không đóng nắp quá chặt hay cột chặt miệng chai vì dễ gây nổ

và tràn môi trường do áp suất thay đổi trong khi hấp).

- Ghi rõ ngày tháng và tên (ký hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn.

Đồ án tố t nghiê ̣p

- Hấp khử trùng môi trường ở 121oC trong 20 phút, áp suất 1 atm. Sau khi hấp

xong lấy môi trường ra và chuyển môi trường đã hấp khử trùng vào phòng bảo quản

môi trường. Giữ 2 ngày ở 25oC để kiểm tra.

2.4.2. Các thao tác trong phòng cấy

- Rửa tay kỹ bằng xà phòng, mặc áo blouse, đeo găng tay, khẩu trang trước khi

vào phòng cấy.

- Dùng khăn lau tủ cấy bằng cồn 70o.

- Bật đèn UV để khử trùng tủ cấy trong 30 phút, xịt cồn bộ dụng cụ cần cấy và

cho vào tủ trước.

- Sau khi bật UV xong bật quạt khoảng 15 phút và lau tủ cấy lại bằng cồn 70o.

- Môi trường và chai mẫu phải lau cồn trước khi đưa vào tủ cấy.

- Khi cấy cần tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ và mẫu cấy. Hạn chế đi lại

trong suốt quá trình cấy.

- Hơ miệng chai cấy thật kỹ trước và sau khi cấy.

- Dụng cụ sau mỗi lần cấy phải được đốt lại bằng cồn 90o.

- Hạn chế nói chuyện trong quá trình làm thí nghiệm.

- Sau khi cấy ghi lại ngày tháng, tên giống,... để thuận tiện cho việc theo dõi.

- Sau khi chấm dứt cấy, cần phải tắt đèn cồn, tắt tủ cấy, làm vệ sinh sạch sẽ.

Ngoài ra cần chú ý trong quá trình làm việc, cồn 96o rất dễ cháy do đó phải

tuyệt đối thật cẩn thận.

2.4.3. Bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu gồm 3 thí nghiệm

2.4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng nhân chồi

từ đoạn thân của cây sùng thảo.

Mục đích: Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho qúa

trình nhân chồi cây sùng thảo.

Mẫu cấy: Đoạn thân cây sùng thảo in vitro.

Tiến hành: Chọn những cây sùng thảo in vitro khỏe mạnh, không bị dị dạng

và sinh trưởng bình thường làm vật liệu cấy chuyền vào môi trường nhân chồi. Tiến

Đồ án tố t nghiê ̣p

hành cắt thân cây thành từng đoạn ngắn rồi cấy trực tiếp vào môi trường MS bổ sung

30 g/l đường sucrose, 8,5 g agar/l, 0,1 mg/l NAA và bổ sung BA với các nồng độ đã

bố trí trong bảng 2.1.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố gồm 4 nghiệm thức.

Mỗi nghiệm thức lặp lại 12 mẫu cấy.

Bảng 2.1. Khảo sát hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi

Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l)

0,0 A0 (ĐC)

1,0 A1

2,0 A2

3,0 A3

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ tạo chồi (%).

- Khối lượng cụm chồi (g)

- Số chồi/mẫu.

- Chiều cao chồi hoặc cụm chồi (cm).

Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần.

2.4.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng

thảo

Mục đích: Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây

sùng thảo in vitro.

Mẫu cấy: Các chồi in vitro được tạo ra từ thí nghiệm 1.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Các bước tiến hành: Tách các chồi thu được từ thí nghiệm 1 ra thành từng chồi

riêng biệt và đều nhau. Chọn những chồi khỏe mạnh, sinh trưởng bình thường và

không bị dị dạng cấy trực tiếp vào bình thủy tinh chứa sẵn môi trường MS bổ sung

30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và bổ sung IBA với các nồng

độ như bảng 2.2.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố gồm 5 nghiệm thức, mỗi

nghiệm thức lặp lại 15 mẫu cấy.

Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA ảnh hưởng đến quá trình tạo

rễ

Nghiệm thức Nồng độ IBA (mg/l)

B0 (ĐC) 0

B1 0,5

B2 1,0

B3 1,5

B4 2,0

Chỉ tiêu theo dõi:

- Số rễ/mẫu.

- Chiều dài của rễ (cm).

- Số lá của cây.

- Chiều cao cây (cm).

Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần.

Đồ án tố t nghiê ̣p

2.4.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của gía thể đến sự sinh trưởng của cây

sùng thảo giai đoạn vườn ươm

Mẫu: Cây con in vitro đã tạo rễ hoàn chỉnh ở thí nghiệm 2.

Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên cần tiến

hành huấn luyện cây con quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài. Thời gian

huấn luyện kéo dài 7 ngày và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh

khả năng thích nghi của cây. Sau thời gian huấn luyện, tiến hành ra cây con in vitro

cây sùng thảo bằng kẹp, rửa sạch phần thạch còn bám vào cây vì chúng thường là

môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Lựa chọn

những cây con khỏe mạnh, sinh trưởng bình thường đem trồng trên các loại giá thể

đã bố trí như trong bảng 2.3.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức và 3 lần lặp

lại. Mỗi lần lặp lại trồng 30 cây con.

Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng

thảo giai đoạn vườn ươm

Nghiệm thức Giá thể

C1 Tro trấu

C2 Mụn xơ dừa

Tro trấu : Mụn xơ dừa C3 (tỷ lệ 1:1)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ sống (%).

- Tỷ lệ chết (%).

- Chiều cao cây (cm).

- Số lá/cây.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần và số liệu được theo dõi 7 ngày/lần.

Đồ án tố t nghiê ̣p

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn

thân cây sùng thảo

Trong nuôi cấy mô thực vật thì quá trình nhân chồi có vai trò quan trọng trong

nhân giống in vitro. Nếu tìm ra môi trường nhân chồi thích hợp có thể tạo ra số lượng

chồi lớn làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống tiếp theo. Nhờ đó mà nhân giống

vô tính in vitro có thể đáp ứng nhu cầu về lượng lớn giống cây trồng. Để tăng hệ số

nhân chồi, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng có

tác dụng kích thích tạo chồi.

Auxin và cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng của thực vật thường

có mặt ở tất cả các loại cây trồng, auxin có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ còn

cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Theo Sakakibara (2006), cytokinin có

vai trò quan trọng và rất đặc trưng trong sự chia tế bào và kích thích sự hình thành

chồi.

Từ lâu đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng sự cân bằng tỷ lệ giữa auxin

và cytokinin có ý nghĩa quyết định dạng phân hóa cơ quan của tế bào thực vật trong

quá trình phát sinh hình thái của cây trong nuôi cấy mô in vitro. Nếu tỷ lệ auxin cao

hơn cytokinin sẽ kích thích ra rễ, còn tỷ lệ cytokine cao hơn auxin sẽ kích thích sự

xuất hiện và phát triển của chồi.

BA là một cytokinin có tác dụng tạo chồi mạnh, kích thích sự phân chia tế bào,

kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và hạn chế sự già hóa của tế bào.

Ngoài ra nó còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, tăng cường sự hoạt động của

một số enzyme được sử dụng rộng rãi trong các môi trường nhân chồi. Trong nhân

giống in vitro, BA có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc kích thích mạnh mẽ sự

hình thành chồi non, quyết định hệ số nhân chồi và chất lượng chồi hình thành. Việc

kết hợp auxin (NAA) với cytokinin (BA) sẽ giúp tăng trưởng chồi non và khởi phát

sự tạo mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Mục tiêu của thí nghiệm này là tìm ra nồng

Đồ án tố t nghiê ̣p

độ BA thích hợp kết hợp với NAA để nhân nhanh chồi với số lượng lớn và đảm bảo

sự tương đồng về mặt di truyền.

Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu chọn lọc những cây sùng thảo in vitro

sinh trưởng bình thường, không bị dị dạng và tiến hành cắt phần thân của những cây

sùng thảo in vitro thành những đoạn ngắn có kích thước 0,5 – 1 cm, cấy vào môi

trường MS bổ sung 30 g/l đường sucose; 8,5 g/l agar; bổ sung NAA cố định ở nồng

độ 0,1 ml/l và BA ở các nồng độ 0, 1, 2, 3 ml/l vào môi trường nuôi cấy.

Quan sát sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy đã có sự nảy chồi nhưng không có

sự khác biệt về mặt số lượng và hình thái. Đến tuần thứ 4, mẫu cấy phát triển vượt

trội, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về số lượng chồi hình thành và hình thái

của chồi.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ

đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy.

Nghiệm Nồng độ Tỷ lệ tạo Số Khối lượng Chiều cao

thức BA (mg/l) chồi (%) chồi/mẫu cụm chồi (g) chồi (cm)

A0 0 94,5a 1,45d 0,21d 3,47a

A1 1 97,47a 10,69b 2,31b 2,11b

A2 2 100a 14,59a 3,16a 1,47c

A3 3 60,2b 4,8c 1,63c 1,09c

CV 3,59 8,21 8,74 8,46

Ghi chú: Các ký tự khác nhau theo sau các số liệu trên cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,01.

LSD 8,68 1,77 0,59 0,47

Đồ án tố t nghiê ̣p

100

%

Tỷ lệ mẫu tạo chồi

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau 4

tuần nuôi cấy

A1 A0 Khối lượng chồi (g)

A2 Chiều cao chồi (cm)

A3 Số chồi

(A0; A1; A2; A3 tương ứng với nồng độ BA là 0; 1; 2; 3 mg/l)

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn

thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy

(A0; A1; A2; A3 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 1; 2; 3 mg/l)

Đồ án tố t nghiê ̣p

Số liệu thống kê bảng 3.1 và biểu đồ 3.1, biểu đồ 3.2 cho thấy môi trường nuôi

cấy khi bổ sung BA thì có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức. Tỷ lệ tạo chồi

và số chồi hình thành tăng dần khi tăng nồng độ BA từ 0 đến 2. Đặc biệt là khi bổ

sung BA với nồng độ 2 mg/l, mẫu cấy hình thành cụm chồi có kích thước lớn với số

lượng chồi nhiều nhất.

Ở nghiệm thức A0, trong môi trường không bổ sung BA, sau 4 tuần nuôi cấy

mẫu chỉ hình thành chồi đơn với khối lượng trung bình 0,21g, số chồi trung bình là

1,45 chồi/mẫu/ Chồi mọc nhiều lá, lá có kích thước lớn màu xanh thẫm, chồi phát

triển khỏe mạnh.

Ở nghiệm thức A1, trong môi trường nuôi cấy bổ sung BA với nồng độ 1 mg/l,

sau 4 tuần nuôi cấy, mẫu tạo thành cụm chồi có khối lượng trung bình 2,31 g, số chồi

hình thành trung bình 10,96 chồi/mẫu. Các chồi có nhiều lá, lá có màu xanh nhạt,

chồi phát triển tốt.

Ở nghiệm thức A2, khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 2

mg/l cho tỷ lệ tạo chồi đạt 100%. Sau 4 tuần nuôi cấy, hình thành cụm chồi có kích

thước lớn, khối lượng cụm chồi trung bình là 3,16 g với số chồi tạo thành nhiều, trung

bình 14,59 chồi/mẫu, các chồi có kích thước đồng đều, thân mập và phát triển khỏe

mạnh.

Ở nghiệm thức A3, khi tăng nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên 3

mg/l cho tỷ lệ mẫu tạo chồi thấp (60,2%). Điều đó cho thấy khi bổ sung BA ở nồng

độ cao (3 mg/l) đã ức chế sự hình thành và phát triển nhân chồi của mẫu cấy. Sau 4

tuần nuôi cấy, mẫu chỉ hình thành cụm chồi nhỏ với khối lượng trung bình 1,63 g, số

chồi hình thành ít (4,8 chồi/mẫu). Các chồi bé, có chiều cao thấp, lá có màu xanh

nhạt, một số lá bị biến dạng. Chồi phát triển chậm.

Wei Li và cộng sự (2002) đã nghiên cứu nhân chồi cây sùng thảo trên môi

trường MS bồ sung BA với các nồng độ 0; 0,1; 0,5 và 1 mg/l và phát hiện môi trường

MS có bổ sung 1 mg/l BA kích thích hình thành và tạo cụm chồi với số chồi trung

bình 6,6 chồi/mẫu.

Đồ án tố t nghiê ̣p

A1

A0

A3

A2

Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn

thân cây sùng thảo

(A0; A1; A2; A3 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 1; 2; 3 mg/l)

BA là loại cytokinin có hiệu quả trong việc tạo chồi, nhưng nồng độ sử dụng

tùy vào từng bộ phận nuôi cấy và các loại cây khác nhau. Mỗi loại cây cần một nồng

độ BA tối ưu để tạo chồi. Nếu sử dụng nồng độ BA cao thì sẽ tạo ra những chồi không

bình thường, hay có hiện tượng thủy tinh thể. Còn nếu sự dụng BA ở nồng độ thấp

thì hiệu quả nhân chồi không cao. Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin

cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất

lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc có những nốt nhỏ ở cuối gốc.

Theo kết quả nghiên cứu của M. P. Legkobit và N. V. Khadeeva (2003) về ảnh

hưởng của các phytohormon đến sự biến đổi và đặc tính hình thái của các loài Stachys

khác nhau trong quá trình nhân giống in vitro đã chứng minh rằng bổ sung hàm lượng

Đồ án tố t nghiê ̣p

cytokinin thấp sẽ gây ra ít biến đổi di truyền hơn so với tái sinh từng bước hoặc bổ

sung hàm lượng BA cao.

Tóm lại: BA kết hợp với NAA có ảnh hưởng tốt đến sự hình thành và nhân

chồi in vitro cây sùng thảo. Nồng độ BA phù hợp nhất bổ sung vào môi trường nhân

chồi từ đoạn thân cây sùng thảo in vitro là 2 mg/l.

3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo in vitro

Rễ là một bộ phận quan trọng của cây. Rễ có tác dụng hút nước, muối khoáng

và chất dinh dưỡng cung cấp cho cây sinh trưởng và phát triển. Các chồi hình thành

trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng số lượng rễ ít và chất lượng rễ

không tốt. Sau khi nhân đủ số lượng chồi cần thiết điều quan trọng là cần phải chuyển

chồi sang môi trường ra rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh.

Quá trình hình thành rễ là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh, có đủ thân, lá và

rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao được sức

sống khi ra môi trường bình thường do khi di chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn

ươm, cây con chịu sự tác động của nhiều yếu tố như: độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ,….

Trong quá trình tạo rễ, các chất kích thích tạo chồi sẽ được thay thế bằng các chất

kích thích tạo rễ thuộc nhóm auxin.

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng của thực vật thường gặp trong thiên

nhiên, có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ. Auxin đóng vai trò quan trọng trong

trong quá trình hình thành rễ của nhiều loại cây cũng như trong nhân giống in vitro.

IBA là chất kích thích sinh trưởng thực vật tổng hợp đầu tiên thuộc nhóm heteroauxin,

có nhiều ứng dụng trọng nông nghiệp, lâm nghiệp. IBA có tác dụng kích thích hình

thành rễ với nhiều loại cây và được sử dụng rộng rãi nhân giống vô tính.

Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu tiến hành lựa chọn và tách các chồi

nhân được từ thí nghiệm nhân chồi thành các chồi riêng biệt và có kích thước đồng

đều cấy vào môi trường MS có bổ sung 30 g đường sucrose; 8,5 g agar/l; 1 mg/l than

hoạt tính và bổ sung IBA ở các nồng độ 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Mục tiêu của thí nghiệm này nhằm xác định được nồng độ IBA thích hợp cho

quá trình tạo rễ của cây sùng thảo in vitro.

Theo dõi ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro

sau 4 tuần nuôi cấy, các kết quả thu được trình bày ở bảng 3.2 và biểu đồ 3.3.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng

thảo sau 4 tuần nuôi cấy.

Nghiệm Nồng độ Chiều dài Chiều cao Số rễ/chồi Số lá thức IBA (mg/l) rễ (cm) cây (cm)

B0 0 5,59d 4,68d 10,06d 4,19d

B1 0,5 9,84bc 10,24bc 13,3c 5,1bc

B2 1 11,44ab 12,28b 15,65b 5,57ab

B3 1,5 13,63a 15,63a 18,06a 6,18a

B4 2 8,23cd 9,4c 9,36d 4,6cd

CV 11,13 8,48 5,77 6,11

Chú ý: Các ký tự khác nhau theo sau các số liệu trên cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý

nghĩa thống kê với p<0,01.

LSD 2,80 2,29 1,99 0,81

Đồ án tố t nghiê ̣p

Số rễ

Chiều dài rễ (cm)

Số lá

Chiều cao cây

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4

tuần nuôi cấy

(B0; B1; B2; B3; B4 tương ứng với nồng độ IBA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l)

Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3 cho thấy khi bổ sung IBA vào

môi trường nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng lớn đến quá trình ra rễ,

sự hình thành số lá, chiều cao cây và chiều dài của rễ của chồi in vitro cây sùng thảo.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Ở nghiệm thức B0 (nghiệm thức đối chứng), trong môi trường không bổ sung

IBA, các chồi in vitro vẫn có khả năng ra rễ, tuy nhiên số rễ hình thành còn rất ít với

số rễ trung bình là 5,59 rễ/chồi và có chiều dải trung bình là 4,68 cm. Rễ có màu

trắng, kích thước không đồng đều, rễ ngắn và mảnh.

Ở nghiệm thức B1, trong môi trường bổ sung 0,5 mg/l IBA, sau 4 tuần nuôi

cấy chồi ra rễ với số rễ hình thành trung bình là 9,84 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình

đạt 9,5 cm. Rễ có màu trắng và mảnh.

Ở nghiệm thức B2, khi bổ sung vào môi trường 1 mg/l IBA, sau 4 tuần nuôi

cấy số rễ hình thành trung bình là 11,44 rễ/ chồi, rễ có chiều dài trung bình 12,28 cm.

Rễ có màu trắng, mọc nhiều, có kích thước đồng đều.

Ở nghiệm thức B3, trong môi trường bổ sung 1,5 mg/l IBA, sau 4 tuần nuôi

cấy, IBA kích thích sự ra rễ từ chồi với số rễ hình thành trung bình 13,63 rễ/chồi, rễ

có chiều dài trung bình 15,63 cm. Rễ mọc nhiều, có màu trắng, có kích thước đồng

đều và khỏe mạnh.

Ở nghiệm thức B4, khi tăng nồng độ IBA bổ sung vào môi trường lên 2 mg/l,

quá trình ra rễ của chồi bắt đầu bị ức chế, số rễ hình thành giảm trung bình 8,23

rễ/chồi, rễ mảnh và phát triển không đồng đều với chiều dài trung bình là 10,71 cm.

Về sự phát triển chiều cao và số lá của cây con ở từng nghiệm thức cũng có sự

khác biệt rõ rệt trong đó ở nồng độ 1,5 mg/l, cây có sự phát triển vượt trội về chiều

cao với chiều cao trung bình 6,18 cm và số lá trung bình 18,6 lá/cây. Ngoài vai trò

kích thích sự tao rễ auxin còn có tác dụng kích thích phân chia và kéo dài tế bào, giúp

tăng trưởng chiều dài thân, lóng và tạo ưu thế ngọn. Tuy nhiên khi bổ sung nồng nồng

độ auxin quá cao sẽ gây ức chế sinh trưởng và sự hình thành rễ, làm rễ có khuynh

hướng ngắn lại.

Tóm lại trong thí nghiệm này, nghiệm thức B3 (môi trường nuôi cấy có bổ

sung 1,5 mg/l IBA) là môi trường cho kết quả tạo rễ tốt nhất.

Đồ án tố t nghiê ̣p

B0

B1

B2

Hình 3.2. Ảnh hưởng

của IBA đến quá trình

ra rễ của cây sùng thảo

sau 4 tuần nuôi cấy.

(B0; B1; B2; B3; B4

tương ứng với nồng độ

IBA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2

mg/l)

B4

B3

Đồ án tố t nghiê ̣p

3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn

ươm

Giai đoạn chuyển cây in vitro từ phòng thí nghiệm (điều kiện nhân tạo) ra vườn

ươm (điều kiện tự nhiên thường gặp rất nhiều khó khăn như: Tỷ lệ cây sống rất thấp,

cây sinh trưởng kém và sâu bệnh tấn công…. Nguyên nhân do trong giai đoạn nuôi

cấy mô, cây con được cung cấp đều đủ chất dinh dưỡng đảm bào cho quá trình sinh

trưởng và phát triển bình thường. Vì vậy, khi đưa cây in vitro ra vườn ươm, cây rất

mẫn cảm với môi trường và sẽ bị sốc mạnh khi được chuyển qua giai đoạn nuôi trồng

ngoài vườn ươm. Trước khi ra ngoài vườn ươm, cần phải tạo cho cây sinh trưởng và

thích nghi với điều kiện tự nhiên.

Giá thể không chỉ là nơi cây tiếp xúc đầu tiên để cây quen dần với môi trường

tự nhiên mà còn là nơi giúp cây bám rễ, đừng vững, dự trữ nước và chất dinh dưỡng

để cung cấp dần cho cây sau này. Khi đưa cây ra vườn ươm, giá thể trồng là một trong

những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sống, thời gian ra lá và sinh trưởng của

cây. Vì vậy, giá thể trồng phù hợp có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của quy

trình nhân giống in vitro.

Thí nghiệm sử dụng các cây sùng thảo in vitro đã tạo rễ hoàn chỉnh ở thí

nghiệm 2, lựa chọn những cây con in vitro có kích thước tương đồng (chiều cao 5 –

6 cm, có 15 – 18 lá) đem trồng trên 3 loại giá thể khác nhau. Sau 4 tuần theo dõi kết

quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.3, biểu đồ 3.3 và biểu đồ 3.4.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai

đoạn ngoài vườn ươm

Tỷ lệ Nghiệm Số cây Tỷ lệ Chiều cao Giá thể Số lá chết thức trồng sống (%) cây (cm) (%)

C1 Tro trấu 10,74c 90,67a 5,5c 14,86c 90

C2 Mụn xơ dừa 94,01a 6,30c 7,80a 23,55a 90

Mụn xơ dừa + C3 59,26b 40,74b 6,72b 19,59b 90 Tro trấu (1:1)

CV 8,78 10,49 4,93 5,12

Chú ý: Các ký tự khác nhau theo sau các số liệu trên cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý

nghĩa thống kê với p<0,01.

LSD 14,54 14,58 0,99 2,99

%

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Tỷ lệ sống

Tỷ lệ chết

Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây sùng thảo giai đoạn

vườn ươm

Đồ án tố t nghiê ̣p

Chiều cao cây

Số lá

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai

đoạn vườn ươm

Kết quả bảng 3.3 và biểu đồ 3.4, biểu đồ 3.5 cho thấy các loại giá thể khác

nhau sử dụng để ươm cây có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng

của cây in vitro trong giai đoạn vườn ươm.

Trong 3 loại giá thể nghiên cứu thì giá thể mụn xơ dừa cho tỷ lệ sống và sinh

trưởng của cây sùng thảo vượt trội hơn hẳn so với các giá thể khác. Trên giá thể này,

tỷ lệ cây sống đạt cao nhất 94,01 %, sau khi trồng một tuần cây bắt đầu bén rễ và

thích ứng với điều kiện sống bên ngoài. Sau 4 tuần trồng, cây phát triển nhanh chóng,

cây có sức sống tốt. Khi phối trộn giá thể mụn xơ dừa và tro trấu với nhau theo tỷ lệ

1: 1 chỉ cho tỷ lệ cây sống ở mức trung bình 59,26 %, cây bắt đầu có dấu hiệu chết

dần sau một tuần ươm cây. Sau 4 tuần trồng, những cây còn sống có sức sống yếu,

cây còi cọc và chậm phát triển. Sử dụng giá thể trấu hun để ươm cây giống sùng thảo

Đồ án tố t nghiê ̣p

in vitro tỏ ra không phù hợp. Tỷ lệ sống thấp 10,74 %, sau khi trồng 2 - 3 ngày, cây

bắt đầu chết dần, những cây còn sống có sức sống kém và chậm phát triển.

Theo dõi về chỉ tiêu sinh trưởng của cây sùng thảo in vitro trên các loại giá thể

cũng có sự khác biệt.

Trồng cây con in vitro trên giá thể mụn xơ dừa, chỉ tiêu sinh trưởng của cây

đạt giá trị cao nhất với chiều cao trung bình 7,80 cm và số lá trung bình 23,55 lá/ cây.

Thân cây khỏe mạnh và cao ráo, lá màu xanh đậm và có kích thước lớn, cây phát triển

tốt. Trên giá thể tro trấu, sự tăng trưởng của cây sùng thảo in vitro rất kém với chiều

cao cây trung bình 5,5 cm, số lá trung bình 14,86 lá/ cây. Thân cây còi cọc, chậm lớn,

lá có màu vàng xanh. Khi phối hợp giá thể tro trấu và mụn xơ dừa với nhau theo tỷ

lệ 1: 1, các chỉ tiêu sinh trưởng của cây in vitro đạt mức trung bình với chiều cao cây

6,72 cm và số lá là 19,59 lá/ cây.

Kết quả thu được có sự khác biệt ở các loại giá thể trồng là do tính chất khác

nhau của từng loại giá thể. Giá thể mụn xơ dừa có tính chất tơi xốp nên kích thích cây

con phát triển, tránh được hiện tượng gây nghẹt rễ con. Mụn xơ dừa cũng có tính giữ

ẩm tốt nên hạn chế được việc mất nước, nhất là lúc trưa năng, tránh cho cây con bị

chết vì mất nước. Hơn nữa mụn xơ dừa khá sạch nên hạn chế được các mầm bệnh tấn

công cây con. Ngoài ra trong giá thể xơ dừa còn chứa các chất hữu cơ tự nhiên tốt

cho cây trồng, giúp cây tăng trưởng nhanh.

Giá thể tro trấu mặc dù thoáng khí nhưng khi tưới nước, nước thường thoát đi

rất nhanh vì giá thể không có khả năng giữ ẩm tốt, dễ khiến cây bị mất nước mà chết.

Tro trấu còn kém chất dinh dưỡng và có tính hấp thụ nhiệt vì có hàm lượng carbon

cao, không tốt cho rễ cây vào những ngày nắng nóng. Mặt khác, trong giai đoạn đầu

ở vườn ươm, cây giống in vitro không có nhu cầu cần nhiều chất dinh dưỡng mà yếu

tố quyết định là độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng để cây có thể thích nghi và ra rễ mới.

Đồ án tố t nghiê ̣p

C1

C3

C2

Hình 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai

đoạn vườn ươm

(C1; C2; C3 tương ứng với các loại giá thể: tro trấu, mụn xơ dừa, tro trấu + mụn xơ

dừa tỷ lệ 1:1)

Tóm lại, trong 3 loại giá thể thí nghiệm, giá thể phù hợp nhất để ươm cây sùng

thảo in vitro là giá thể mụn xơ dừa. Giá thể tro trấu tỏ ra không phù hợp vì tỷ lệ cây

chết cao, cây có sức sống yếu và chậm phát triển.

Đồ án tố t nghiê ̣p

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Từ kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo,

đưa ra một số kết luận sau:

- Khi khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ

đoạn thân cây sùng thảo, môi trường MS bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar,

0,1 mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l BA là thích hợp nhất để nhân chồi. Tỷ lệ mẫu tạo

chồi và số chồi/mẫu cao nhất lần lượt là 100 % và 14,59 chồi/mẫu.

- Khi khảo sát ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây sùng thảo, môi

trường MS bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar, 1 mg/l than hoạt tính và 1,5

mg/l IBA là thích hợp nhất để tạo rễ. Số rễ hình thành cao nhất là 13,63 rễ/chồi.

- Khi khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo in

vitro ngoài vườn ươm, mụn xơ dừa là giá thể phù hợp nhất để ươm cây. Tỷ lệ cây

sống đạt cao nhất 94,01 %. Cây có sức sống tốt, phát triển nhanh và đồng đều.

4.2. Kiến nghị

Do thời gian thực hiện đồ án có hạn nên chưa thể thực hiện thêm nhiều nghiên

cứu sâu hơn, vì vậy chúng tôi có những kiến nghị sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác để

tăng số lượng chồi và số rễ hình thành.

- Khảo sát các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng,… ảnh hưởng đến khả

năng tạo chồi, nhân chồi và tạo rễ.

- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như thời vụ, phân bón,… đến sự sinh

trưởng và phát triển của cây sùng thảo ngoài vườn ươm.

Đồ án tố t nghiê ̣p

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu Tiếng Việt

[1]. Dương Công Kiên, (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học Quốc Gia

TP. Hồ Chí Minh.

[2]. Dương Tấn Nhựt (2007), Công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông Nghiệp.

[3]. Dương Tấn Nhựt (2009), Công nghệ sinh học thực vật (Tập 2), NXB Nông

Nghiệp.

[4]. Dương Tấn Nhựt (2011), Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu cơ bản và

ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.

[5]. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1993), Chất điều hòa sinh trưởng đối

với cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

[6]. Lê Văn Hoàng (2008), Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, NXB Đà

Nẵng.

[7]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2011), Công nghệ tế bào, NXB Đại

học Quốc gia TP. HCM.

[8]. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng

dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

[9]. Nguyễn Quang Thạch (2001), Công nghệ sinh học trong trồng trọt – Giáo trình

sau Đại học.

[10]. Trần Văn Minh (1997), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

2. Tài liệu Tiếng Anh

[1]. Anulov, O.V., Shcherbukhin, V.D., and Kononkov, P.F., Characterization of

the Mono- and Oligosaccharide Compositions for Tubers of Stachys sieboldii

Miq., Tezisy dokladov II Mezhdunarodnogo Simpoziuma “Novye i

netraditsionnye rasteniya i perspektivy ikh ispol’zovaniya” (Proc. II Int. Symp.

“New and Unusual Plants and Prospects of Their Use”), Pushchino, 1997, vol.

2, pp. 16–17.

Đồ án tố t nghiê ̣p

[2]. Bhojwani S. S., and M. K. Razdan. (1996), Plant Tissue Culture: Theory and

Practice, Elsevier science B.V, Amsterdam, The Neitherlands, pp. 766.

[3]. Cakir, A., Duru, M.E., Harmandar, M., Izumi, S, Hirata, T., 1997. The volatile

constituents of Stachys recta L. and Stachys balansae L. from Turkey. Flavour

Frag. J. 12, 215–218.

[4]. Conforti, F., Menichini, F., Formisano, C., Rigano, D., Senatore, F., Arnold,

N.A., Piozzi, F., 2009. Comparative chemical composition, free radical-

scavenging and cytotoxic properties of essential oils of six Stachys species from

different regions of the Mediterranean Area. Food Chem. 116, 898–905.

[5]. Derkach, A.I., 1998. Biologically active substances of some species of the genus

Stachys L. of the flora of the Ukraine. Rastitel’nye Resursy 34, 57–61.

[6]. Fazio, C., Passannanti, S., Paternostro, M.P., Piozzi, F., 1992. Neo-clerodane

diterpenoids from Stachys rosea. Phytochemistry 31, 3147–3149.

[7]. Flamini, G., Cioni, P.L., Morelli, I., Celik, S., Gokturk, R.S., Unal, O., 2005.

Essential oil of Stachys aleurites from Turkey. Biochem. Syst. Ecol. 33, 61–66.

[8]. Goren, A.C., Akçicek, E., Dirmenci, T., Kilic, T., Moziog˘lu, E., Yilmaz, H.,

2012. Fatty acid composition and chemotaxonomic evaluation of species of

Stachys. Nat. Prod. Res. 26, 84–90.

[9]. Goren, A.C., Piozzi, F., Akçicek, E., Kilic, T., Carikc, S., Moziog˘lu, E., Setzer,

W.N., 2011. Essential oil composition of twenty-two Stachys species (mountain

tea) and their biological activities. Phytochem. Lett. 4, 448–453.

[10]. Hayashi K, Nagamatsu T, Ito M, Hattori T, Suzuki Y. 1994. Acteoside, a

component of Stachys sieboldii Miq, may be a promising antinephritic agent

(2): Effect of acteoside on leukocyte accumulation in the glomeruli of nephritic

rats. Jpn J Pharmacol 66: 47–52.

[11]. Hazarika B. N. (2003), Acclimatization of tissue culture plants, Devision of

Horticulture, ICAR Research complex, uniam 793 103, India, pp 1704 - 1712.

[12]. Horst R.K. (1990), Handbook of plant cell culture, Vol5, New York, pp. 215 -

217.

Đồ án tố t nghiê ̣p

Yuxing Wang, WenjingZhang (2014), Optimization extraction, preliminary

characterization and antioxidantactivity in vitro of polysaccharides from

Stachys sieboldii Miq. Tubers. Carbohydrate Polymers 125 (2015) 45–52.

[13]. Kai Feng, Wei Chen, Liwei Sun, Jianzeng Liu, YangxinZhao, Luxi Ki,

[14]. Kartsev, V.G., Stepanichenko, N.N., and Auelbekov, S.A., Chemical

Composition and Pharmacological Properties of Plants of the Genus Stachys,

Khim. Prirod. Soed., 1994, vol. 30, no. 6, pp. 699–709.

[15]. Khadeeva, N.V., Degtyarenko, L.V., Gordon, N.Yu., and Yakovleva, E.Yu.,

Introduction of Stachys sieboldii Miq. in an in Vitro Culture, Fiziol. Rast.

(Moscow), 1995, vol. 42, no. 6, pp. 923–928.

[16]. Keller F (1992) Transport of stachyose and sucrose by vacuole of Japanese

artichoke (Stachys sieboldii). Plant Physiol 98: 442 – 445.

[17]. .Kostyuchenko, O.I., Chemical Composition and Pharmacological Properties

of Stachys L. Species, Rast. Resursy, 1983, vol. 19, no. 3, pp. 407–413.

[18]. Lee, H.J., Kim, K.W., 2012. Anti-inflammatory effects of arbutin in

lipopolysaccharide - stimulated BV2 microglial cells. Inflamm. Res. 61, 817–

825.

[19]. Legault, J., Pichette, A., 2007. Potentiating effect of beta-caryophyllene on

anticancer activity of alpha-humulene, isocaryophyllene and paclitaxel. J.

Pharm. Pharmacol. 59, 1643–1647.

[20]. Mamaril J. C., A. M. Lopez. (1997), Comparative effect of coconut water

growth hormone extracts on the growth of reflasked Vanda, Phalaenopsis

(grandiflora) and Dendrobium protocorms, Philippine journal of coconut

studies, 23.

[21]. Mantell S. H., J. A. Mathews, and R. A. McKee. (1985), Principles of Plant

Biotechnology, Blackwell Scientific Publications, Oxford.

[22]. M. P. Legkobit and N. V. Khadeeva (2004), M. P. Legkobit and N. V.

Khadeeva. (2004), Variation and Morphogenetic Characteristics of Different

Đồ án tố t nghiê ̣p

Stachys Species during Microclonal Propagation, Russian Journal of Genetics, Vol. 40, No. 7, pp 916 – 924.

[23]. Murashige T. and F. Skoog. (1962), A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco cultures, Physiol. Plant, 15, pp. 473-497.

[24]. Murashige T. (1974), Plant propagation through tissue culture, Annu. Rev.

Plant Phys, 25, pp. 135-166.

[25]. Nishimura, H. Sasaki, H. Inagaki, N., et al., Nine Phenethyl Alcohol Glycosides

from Stachys sieboldii, Phytochemistry, 1991, vol. 30, no. 3, pp. 965–969.

[26]. Salmaki, Y., Zarre, S., Ryding, O., Lindqvist, C., Bräuchler, C., Heubl, G., et

al. (2013). Molecular phylogeny of tribe Stachydeae (Lamiaceae subfamily

Lamioideae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 69, 535–551.

[27]. Skoog F., and C.O. Miller. (1957), Chemical regulation of growth and organ

formation plant tissue cultured in vitro, Symp. Soc. London, 114, pp. 317-339.

[28]. Takeda Y, Fujita T, Satoh T, Kakegawa H. 1985. On the glycosidic constituents

of Stachys sieboldi Miq. and their effects on hyaluronidase activity. Yakugaku

Zasshi 105: 955–959.

[29]. Tundis, R., Peruzzi, L., & Menichini, F. (2014). Phytochemical and biological

studiesof Stachys species in relation to chemotaxonomy: A review.

Phytochemistry, 102, 7–39.

[30]. Vince-Pure D. (1994), Photomorphogenesis and plant development. In:

Lumsden PJ, Nicholas JR and Davies WJ [eds.], Physiology, growth and

development of plants in culture, 19-30, Kluwer Academic Publishers,

Dordrecht.

[31]. White P. R. (1943), Nutrient deficiency studies and improved inorganic

nutrients for cultivation of excised tomato roots, Growth, 7, pp. 53 - 65.

[32]. Yamahara J, Kitani T, Kobayashi H, Kawahara Y. 1990. Studies on Stachys

sieboldii Miq. II. Anti-anoxia action and the active constituents. Yakugaku

Zasshi 110: 932–935

Đồ án tố t nghiê ̣p

[33]. Yin, J., Yang, G., Wang, S., Chen, Y., 2006. Purification and determination of

stachyose in Chinese artichoke (Stachys Sieboldii Miq.) by high-performance

liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Talanta 70,

208–212.

[34]. Yildiz M. (2012), The Prerequisite of the Success in Plant Tissue Culture: High

Frequency Shoot Regeneration In Recent Advances in Plant in vitro Culture, in

the book "Recent Advances in Plant in vitro Culture", edited by Annarita Leva

and Laura M. R. Rinaldi, ISBN 978-953-51-0787-3.

[35]. Ueno Y, T. Ikami, R. Yamauchi, and K. Kato: Purification and some properties

of a-galactosidase from tubers of Stachys affinis. Agric. BioI. Chern. 44, 2623-

2629 (1980).

Đồ án tố t nghiê ̣p

PHỤ LỤC

Phu ̣ lu ̣c A: Thành phần môi trường MS

Bả ng 1. Thà nh phần khoá ng cơ bả n (Murashige và Skoog, 1962)

mM mg/l Khoá ng đa lươ ̣ng

1.650 20,6 NH4NO3

1.900 18,8 KNO3

440 3,0 CaCl2.2H2O

370 1,5 MgSO4.7H2O

170 1,25 KH2PO4

mg/l µM Khoá ng vi lươ ̣ng

KI 0,83 5,0

6,2 100 H3BO3

22.3 100 MnSO4.4H2O

8,6 30 ZnSO4.7H2O

0,25 1,0 Na2MoO4.2H2O

0,025 0,1 CuSO4.5H2O

0,025 0,1 CoCl2.6H2O

37,3 100 Na2.EDTA

27,8 100 FeSO4.7H2O

Bả ng 2. Thà nh phần vitamin của Morel

Vitamin mg/l µM

Pyridoxine HCl (B6) 1,0 2,5

Biotin (H) 0,01 0,5

Myo-Inositol 100 555

Nicotinic acid (PP) 1,0 4

Thiamine HCl) 1,0 0,3

Pantotheate 1,0 3,2

Đồ án tố t nghiê ̣p

Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis)

HgCl2 0,1 % + môi trường MS

MS + 2 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA

MS + 1,5 mg/l IBA + 1 mg/l than hoạt tính

100 % giá thể mụn xơ dừa

Đồ án tố t nghiê ̣p

Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4

1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi

từ đoạn thân cây sùng thảo

a. Tỷ lệ tạo chồi

TY LE TAO CHOI

THE ANOVA Procedure

2. Class Level Information

Class Levels Values

NTHUC 4 A0 A1 A2 A3

Number of Observations Read 12

Number of Observations Used 12

TY LE TAO CHOI

THE ANOVA Procedure

Dependent Variable: TYLETAOCHOI

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 3146.102500 1048.700833 104.60 <.0001

Error 8 80.205867 10.025733

Corrected Total 11

3226.308367

R-Square Coeff Var Root MSE TYLETAOCHOI Mean

0.975140 3.596415 88.04167

3.166344

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NTHUC 3 1048.700833 104.60 <.0001 3146.1025 00

Đồ án tố t nghiê ̣p

TY LE TAO CHOI The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TYLETAOCHOI

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 8

Error Mean Square 10.02573

Critical Value of t 3.35539

Least Significant Difference 8.6747

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean NTHUC N

100.000 3 A A2

97.467 3 A A1

94.500 3 A A0

60.200 3 B A3

b. Số chồi

SO CHOI

THE ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NTHUC A0 A1 A2 A3

4 Number of Observations Read 12

Number of Observations Used 12

Đồ án tố t nghiê ̣p

SO CHOI

THE ANOVA Procedure

Dependent Variable: SOCHOI

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 311.2038667 103.7346222 247.41 <.0001

Error 8 3.3542000 0.4192750

Corrected Total 11

314.5580667 Coeff Var R-Square Root MSE SOCHOI Mean

0.989337 8.213714 0.647514 7.883333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NTHUC 3 311.2038667 103.7346222 247.41 <.0001

SO CHOI

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for SO CHOI

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 8

Error Mean Square 0.419275

Critical Value of t 3.35539

Least Significant Difference 1.774

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping NTHUC N Mean

A 3 14.5933 A2

B 3 10.6867 A1

C 3 4.8000 A3

D 3 1.4533 A0

Đồ án tố t nghiê ̣p

c. Khối lượng chồi

SO CHOI

THE ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NTHUC A0 A1 A2 A3 4

Number of Observations Read 12

Number of Observations Used 12

KHOI LUONG CHOI

THE ANOVA Procedure

Dependent Variable: KHOILUONGCHOI

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 29.96206667 9.98735556 215.48 <.000 1

Error 0.37080000 0.04635000 8

Corrected Total 30.33286667 11

R-Square Coeff Var Root MSE KHOILUONGCHOI Mean

0.987776 8.739804 0.215291 2.463333

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NTHUC 3 29.96206667 9.98735556 215.48 <.0001

KHOI LUONG CHOI

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for KHOILUONGCHOI

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 8

Error Mean Square 0.04635

Critical Value of t 3.35539

Least Significant Difference 0.5898

Đồ án tố t nghiê ̣p

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NTHUC

A 3.1633 3 NT2

B 2.3067 3 NT1

C 1.6333 3 NT3

D 0.2100 3 DC

d. Chiều cao chồi

CHIEU CAO CHOI

THE ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NTHUC A0 A1 A2 A3 4

Number of Observations Read 12

Number of Observations Used 12

CHIEU CAO CHOI

THE ANOVA Procedure

Dependent Variable: CHIEUCAOCHOI

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 3 9.79136667 3.26378889 109.62 <.0001

Error 8 0.23820000 0.02977500

Corrected Total 11

10.02956667

R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUCAOCHOI Mean

0.976250 8.465462 0.172554 2.038333

Đồ án tố t nghiê ̣p

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NTHUC 3 9.79136667 3.26378889 109.62 <.0001

CHIEU CAO CHOI

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for CHIEUCAOCHOI

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 8

Error Mean Square 0.029775

Critical Value of t 3.35539

Least Significant Difference 0.4727

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean NTHUC N

A 3 3.4700 A0

B 2.1133 3 A1

C 1.4767 3 A2

C 1.0933 3 A3

2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ cây sùng thảo

a. Số rễ

SO RE

THE ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NTHUC 5 B0 B1 B2 B3 B4

Đồ án tố t nghiê ̣p

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

SO RE

THE ANOVA Procedure

Dependent Variable: SORE

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 112.4428267 28.1107067 23.89 <.0001

Error 10 11.7681333 1.1768133

Corrected Total 14

R-Square Coeff Var 124.2109600 Root MSE SORE Mean

0.905257 11.13083 9.746000

1.084810

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NTHUC 4 112.4428267 28.1107067 23.89 <.0001

SO RE

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for SORE

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 1.176813

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 2.8072

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean NTHUC N

A 3 13.6267 B3

B A 3 11.4400 B2

B C 3 9.8400 B1

Đồ án tố t nghiê ̣p

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NTHUC

D C 8.2300 3 B4

D 5.5933 3 B0

b. Chiều dài rễ

CHIEU DAI RE

THE ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

NTHUC B0 B1 B2 B3 B4 5

Number of Observations Read 15

Number of Observations Used 15

CHIEU DAI RE

THE ANOVA Procedure

Dependent Variable: CHIEU DAI RE

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 4 193.2528267 48.3132067 54.21 <.0001

Error 10 8.9124667 0.8912467

Corrected Total 14 202.1652933

R-Square Root MSE SOLA Mean Coeff Var

0.955915 0.944059 10.56067

8.939385

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

NTHUC 4 48.3132067 54.21 <.0001 193.252826 7

Đồ án tố t nghiê ̣p

CHIEU DAI RE

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for CHIEUDAIRE

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 10

Error Mean Square 0.891247

Critical Value of t 3.16927

Least Significant Difference 2.4429

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N NTHUC

15.6333 3 B3 A

B2 B 12.2800 3

C B4 B 10.7100 3

C B1 9.5000 3

c. Số lá

B0 D 4.6800 3

SO LA

Class Level Information

Class

Levels

Values

NTHUC

DC NT1 NT2 NT3 NT4

Number of Observations Read

Number of Observations Used

The ANOVA Procedure

Đồ án tố t nghiê ̣p

SO LA

The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

162.7277733

40.6819433

69.09

<.0001

Error

5.8880000

0.5888000

Corrected Total 14

168.6157733

R-Square

Coeff Var

Root MSE

SOLA Mean

0.965080

5.774342

0.767333

13.28867

Source

DF Anova SS Mean Square F Value

Pr > F

NTHUC

4 162.7277733 40.6819433

69.09

<.0001

Dependent Variable: SOLA

SO LA

The ANOVA Procedure

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.5888

Critical Value of t

3.16927

Least Significant Difference

1.9856

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean

NTHUC

NT3

18.0667

NT2

15.6500

NT1

13.3033

10.0633

NT4

9.3600

t Tests (LSD) for SOLA

Đồ án tố t nghiê ̣p

d. Chiều cao cây

CHIEU CAO CAY

Class Level Information

Class Levels

Values

NTHUC

DC NT1 NT2 NT3 NT4

Number of Observations Read

Number of Observations Used

The ANOVA Procedure

CHIEU CAO CAY

The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

7.39166667

1.84791667

18.82

0.0001

Error

0.98186667

0.09818667

Corrected Total 14

8.37353333

R-Square

Coeff Var Root MSE CHIEUCAOCAY Mean

0.882742

6.112110

5.126667

0.313348

Source

DF Anova SS Mean Square F Value

Pr > F

NTHUC

4 7.39166667 1.84791667

18.82

0.0001

Dependent Variable: CHIEUCAOCAY

CHIEU CAO CAY

The ANOVA Procedure

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.098187

Critical Value of t

3.16927

Least Significant Difference

0.8108

t Tests (LSD) for CHIEUCAOCAY

Đồ án tố t nghiê ̣p

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean N NTHUC

6.1767

3 NT3

5.5733

3 NT2

5.0967

3 NT1

4.6000

3 NT4

4.1867

3 DC

3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai

đoạn vườn ươm

a. Tỷ lệ sống

TY LE SONG

Class Level Information

Class

Levels

Values

NTHUC

NT1 NT2 NT3

Number of Observations Read

Number of Observations Used

The ANOVA Procedure

TY LE SONG

The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value

Pr > F

Model

10509.02782

5254.51391

227.63

<.0001

Error

138.49907

23.08318

Corrected Total 8

10647.52689

Dependent Variable: TYLESONG

Đồ án tố t nghiê ̣p

R-Square

Coeff Var Root MSE

TYLECAYSONG Mean

0.986992

8.785140

54.68889

4.804496

Source DF Anova SS Mean Square F Value

Pr > F

NTHUC

2 10509.02782

5254.51391

227.63

<.0001

TY LE SONG

The ANOVA Procedure

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

23.08318

Critical Value of t

3.70743

Least Significant Difference

14.544

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean

NTHUC

94.067

NT2

59.260

NT3

10.740

NT1

t Tests (LSD) for TYLESONG

b. Tỷ lệ chết

TY LE CHET

Class Level Information

Class Levels

Values

NTHUC

NT1 NT2 NT3

Number of Observations Read

Number of Observations Used

The ANOVA Procedure

Đồ án tố t nghiê ̣p

Source

DF Sum of Squares Mean Square

F Value

Pr > F

Model

10797.31216

5398.65608

232.72

<.0001

Error

139.18953

23.19826

Corrected Total 8

10936.50169

TY LE CHET

The ANOVA Procedure

R-Square Coeff Var Root MSE TYLECAYCHET Mean

0.987273 10.49312

4.816457

45.90111

Source DF Anova SS Mean Square F Value

Pr > F

NTHUC 2 10797.31216 5398.65608

232.72

<.0001

Dependent Variable: TYLECHET

TY LE CHET

The ANOVA Procedure

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

23.19826

Critical Value of t

3.70743

Least Significant Difference

14.58

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean

NTHUC

90.667

NT1

40.740

NT3

6.297

NT2

t Tests (LSD) for TYLECHET

c. Số lá

Đồ án tố t nghiê ̣p

SO LA

Class Level Information

Class Levels

Values

NTHUC

C1 C2 C3

Number of Observations Read

Number of Observations Used

The ANOVA Procedure

SO LA

The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F

Model

113.5809556

56.7904778

57.86

0.0001

Error

5.8890000

0.9815000

Corrected Total 8

119.4699556

R-Square

Coeff Var Root MSE

SOLA Mean

0.950707

0.990707

19.33222

5.124640 Mean Square F Value

Pr > F

Source

Anova SS

NTHUC

113.5809556

56.7904778

57.86

0.0001

Dependent Variable: SOLA

SO LA

The ANOVA Procedure

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.9815

Critical Value of t

3.70743

Least Significant Difference

2.999

t Tests (LSD) for SOLA

Đồ án tố t nghiê ̣p

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

Mean

N NTHUC

23.5467

3 C2

19.5933

3 C3

14.8567

3 C1

d. Chiều cao cây

CHIEU CAO CAY

Class Level Information

Class

Levels

Values

NTHUC

C1 C2 C3

Number of Observations Read

Number of Observations Used

The ANOVA Procedure

CHIEU CAO CAY

The ANOVA Procedure

Source

DF Sum of Squares Mean Square F Value

Pr > F

Model

7.94302222

3.97151111

36.56

0.0004

Error

0.65180000

0.10863333

Corrected Total 8

8.59482222

R-Square

Coeff Var Root MSE

SOLA Mean

0.924164

4.938174 0.329596

6.674444

Source

Anova SS

Mean Square F Value

Pr > F

NTHUC

7.94302222

3.97151111

36.56

0.0004

Dependent Variable: CHIEUCAOCAY

Đồ án tố t nghiê ̣p

CHIEU CAO CAY

The ANOVA Procedure

Alpha

0.01

Error Degrees of Freedom

Error Mean Square

0.108633

Critical Value of t

3.70743

Least Significant Difference

0.9977

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping

NTHUC

Mean

7.8033

6.7167

5.5033

t Tests (LSD) for CHIEUCAOCAY

Đồ án tố t nghiê ̣p

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinnis)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ

MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Hoàng Quân

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Thanh Hằng

MSSV: 1311100026

Lớp: 13DSH01

TP. Hồ Chí Minh, năm 2017

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

BA

Benzyl Adenine

CNSH

Công Nghệ Sinh Học

ĐC

Đối chứng

IAA

3-Indole acetic acid

IBA

3-Indole butyric acid

MS

Murashige – Skoog

NAA

Napthalene Acetic Acid

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

%

A1

A0

A3

A2

B0

B1

B2

B4

B3

%

C1

C3

C2

Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis)

Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ môi trường: Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học theo mẻ (SBR) để xử lý nước thải sinh hoạt trong nhà cao tầng và khu dân cư quy mô tới 10000 người

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình của một số gen ở trẻ em mắc bệnh teo đường mật bẩm sinh

Đề thi kết thúc học phần học kì 2 môn Công nghệ sinh học dinh dưỡng năm 2023-2024 có đáp án

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Quản lý chất lượng sản phẩm năm 2023-2024

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm