Đồ án tốt nghiệp: Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. VÀ LACTOBACILLUS SPP. ĐỐI VỚI MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Sinh viên thực hiện

: LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG

MSSV: 1515100007 Lớp: 15HSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016.

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự

hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm-

Môi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp

của người khác với bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp

hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình.

TP.HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

i

Lê Ngô Vũ Phượng.

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến

khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm

nay.

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em

đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hết

lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá

trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ

có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời.

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực

hiện, hoàn thành đồ án này.

Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan

tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành

thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức

khỏe.

TP. HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

ii

Lê Ngô Vũ Phượng

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

TRANG

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................... vi

DANH MỤC BẢNG .................................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................... ix

MỞ ĐẦU .................................................................................................... 2

CHƢƠNG I: TÔNG QUAN ................................................................... 4

1.1. Tổng quan về nấm: .................................................................................. 4

1.1.1. Giới thiệu chung .................................................................................... 4

1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra ............................................................................. 4

1.1.3. Tác hại của nấm .................................................................................... 5

1.1.3.1. Tác hại của nấm gây cho người và động vật ...................................... 5

1.1.3.2. Tác hại của nấm gây cho thực vật ...................................................... 6

1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm ........................................... 6

1.2. Tổng quan về hợp chất kháng nấm: ........................................................ 7

1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học ................................................................ 10

1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học ............................................. 10

1.2.3. Hợp chất kháng nấm trong sinh học ..................................................... 13

1.2.3.1. Hợp chất kháng nấm từ thực vật: .................................................... 13

1.2.3.2. Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: ................................................... 17

a. Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp. ............................. 17

b. Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp...................... 19

1.3. Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc: .................. 21

1.3.1. Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn) .................... 21

1.3.2. Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) ..................... 23

iii

1.3.3. Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp): ................................... 25

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 26

2.1. Địa điểm nghiên cứu: ................................................................................ 26

2.2. Thời gian nghiên cứu: ............................................................................... 26

2.3. Vật liệu nghiên cứu: .................................................................................. 26

2.3.1. Giống vi sinh vật: .................................................................................. 26

2.3.1. Hóa chất và môi trường sử dụng ........................................................... 26

2.3.1.1. Hóa chất: ............................................................................................. 26

2.3.1.2. Môi trường nuôi cấy: ........................................................................... 26

2.4. Thiết bị và dụng cụ: ................................................................................... 27

2.4.1. Thiết bị: .................................................................................................. 27

2.4.2. Dụng cụ: ................................................................................................. 28

2.5. Phương pháp luận: .................................................................................... 28

2.6. Phương pháp nghiên cứu: ......................................................................... 29

2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................... 29

2.6.2. Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: .................................................. 30

2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2

đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc:

.......................................................................................................................... 30

2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch

khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc:

.......................................................................................................................... 35

2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2

lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: .

.......................................................................................................................... 39

2.6.6. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số

chủng vi khuẩn ................................................................................................. 43

2.6.6.1. Nhuộm gram ........................................................................................ 43

2.6.6.2. Nhuộm bào tử ...................................................................................... 44

iv

2.6.6.3. Một số thử nghiệm sinh hóa: ............................................................... 44

Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................... 45

3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn

..................................................................................................................... 45

3.1.1. Nhuộm Gram: .................................................................................... 45

3.1.2. Nhuộm bào tử: ................................................................................... 46

3.1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa: ............................................................. 47

3.2. Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: ............................................... 48

3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn

của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc:

.......................................................................................................................... 50

3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch

khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm

mốc: .................................................................................................................. 66

3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2

lớp 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc

.......................................................................................................................... 81

3.6. So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách

chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) .................................................... 90

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 96

PHỤ LỤC

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

LAB Lactobacillus spp

NA Nutrient Agar

NB Nutrient Broth

MT Môi trường

PDA Potato dextrose agar

VK Vi khuẩn

vi

VSV Vi sinh vật

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống

.......................................................................................................................... 9

Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

(Corsetti và cộng sự, 1998) .............................................................................. 18

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp. ............................. 45

Bảng 3.2. Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp. ................. 47

Bảng 3.3. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn

Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn ...........

.......................................................................................................................... 53

Bảng 3.4. So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus

spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn ....

.......................................................................................................................... 54

Bảng 3.5. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn ..

.......................................................................................................................... 62

Bảng 3.6. So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi

khuẩn ............................................................................................................... 63

Bảng 3.7. Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn

Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán ...........

.......................................................................................................................... 68

Bảng 3.8. So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán

.......................................................................................................................... 69

Bảng 3.9. Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán ....

vii

.......................................................................................................................... 76

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch

tán ..................................................................................................................... 77

Bảng 3.11. Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi

khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ..............

.......................................................................................................................... 84

Bảng 3.12. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp ......................... 85

Bảng 3.13. Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi

khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp .......

.......................................................................................................................... 89

Bảng 3.14. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ............... 90

Bảng 3.15. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phương pháp

dựa theo xếp hạng LSD .................................................................................... 91

Bảng 3.16.. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng

viii

phương pháp dựa theo xếp hạng LSD .............................................................. 92

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Metalaxyl ....................................................... 10

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Manocozeb .................................................... 11

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole ............................................ 11

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Pyrones ......................................................... 14

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Viridines ........................................................ 15

Hình 1.6. Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn

LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) .......................................... 20

Hình 1.7. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương

pháp ria 2 đường vi khuẩn ................................................................................ 21

Hình 1.8. Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn

Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) .......................

.......................................................................................................................... 22

Hình 1.9. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương

pháp đặt thạch khuếch tán ................................................................................ 23

Hình 1.10. Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp. với các loại nấm

(trích từ Kumar và các cộng sự,2009). ............................................................. 24

Hình 1.11. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương

pháp đỗ dĩa ....................................................................................................... 25

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn

có lợi đối với nấm mốc .................................................................................... 29

Hình 2.2. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với

ix

nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường ................................................... 31

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3. Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi

khuẩn ................................................................................................................ 35

Hình 2.4. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với

nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán ........................................... 36

HÌnh 2.5. Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán .

.......................................................................................................................... 37

Hình 2.6. Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch

khuếch tán ........................................................................................................ 38

Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với

nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch ............................................... 40

Hình 3.1. HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp ............... 45

HÌnh 3.2. Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn ................................................... 46

Hình 3.3. Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn ................................................... 47

Hình 3.4. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA ..................... 48

Hình 3.5. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến ....... 49

Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử

phụ phế phẩm ................................................................................................... 55

Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử

phụ đất .............................................................................................................. 56

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập

tử nước thải ...................................................................................................... 57

Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân

x

lập tử nem ......................................................................................................... 63

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân

lập tử cơm mẻ ................................................................................................... 64

Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập

tử phụ phế phẩm ............................................................................................... 70

Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân

lập tử đất ........................................................................................................... 71

Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập

tử nước thải ...................................................................................................... 72

Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp

phân lập tử nem ................................................................................................ 78

Hình 3.25. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp

xi

phân lập tử cơm mẻ .......................................................................................... 79

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề:

Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đối

kháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấm

mốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc.

Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin,

tricothecenes, zearalenone…. Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gây

nhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thương

gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượng

cao sẽ gây chết người. Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tác

dụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật.

Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng

lại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác

như Trichoderma spp…và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Nhưng

việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn còn

khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm.

Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng

nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc

khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau. Từ đó,

em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng

và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm

của trường .Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phƣơng pháp

đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và

1

Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin”.

2. Tình hình nghiên cứu:

Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây

hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau.

 Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại

nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân

lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản”

(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm

thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp. Của vi khuẩn Lactobacillus

L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)….

 Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn

lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong-

75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và

Schnurer,2001) .

3. Mục đích nghiên cứu:

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả

nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của

phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường.

4. Mục tiêu nghiên cứu:

Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ

thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và

Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực

Phẩm- Môi Trường.

5. Nhiệm vụ nghiên cứu:

 Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp. và 10 chủng

Lactobacillus spp. đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. tiềm năng sinh

aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phương

pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method).

 Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.(Agar

2

Plug Diffusion Method).

 Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che phủ

.(Overlay Method).

 Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương pháp

thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm.

6. Phƣơng pháp nghiên cứu:

a. Phƣơng pháp luận:

Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được phân

lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã

được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng

thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt

giống cây trồng.

b. Phƣơng pháp xử lí số liệu:

 Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.

 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số liệu.

7. Kết quả đạt đƣợc từ đề tài:

 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp.

có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm.

 Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương

pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual

Culture Two Line Culture Method).

 Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua

phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug

Diffusion Method).

 Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua

phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method).

 Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí

3

nghiệm.

8. Kết cấu đồ án:

 Mở đầu

 Chương 1: Tổng quan tài liệu- Nội dung chương đề cập đến các nội dung liên

quan đến tài liệu nghiên cứu.

 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – Nội dung chương đề cập

đến các dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu trong đồ án.

 Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thu

được

 Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được

4

và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài.

Chƣơng I: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về nấm:

1.1.1. Giới thiệu chung về nấm:

 Nấm học (Mycology) được nhà khoa học người Ý là Pier Antonio

Micheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova

Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì

người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794-

1874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm

lớn (nấm quả thể). Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằng

mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinh

vật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấm

khác. Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy

các chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và trao

đổi chất

 Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế

bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị

dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là vô tính

nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose

và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường

phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi

(mycelium). Có 2 loại sợi:

 Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp

thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm.

 Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo

bào tử).

1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra:

 Theo Nguyễn Duy Tường (2009), độc tố của nấm mốc (mycotoxin) là

5

nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo

ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có

vú, gia cầm và con người.

 Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy

nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độ

nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo ra từ 5 chi

nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng

bao gồm:

 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và G1, G2),

Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic.

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin,

Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin….

 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon,

T-2 toxin.

 Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl

Ether Alternarion.

 Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà.

 Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là

độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra,

thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng). Phản ứng

gây độc chủ yếu của chúng là trong gan. Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ

tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu

dài sẽ gây ra bệnh ung thư.

 Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin

Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố Zearalenon và Tricothecenes

chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium

6

và Fumonisin tiết ra.

1.1.3. Tác hại của nấm mốc:

1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật:

 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm

sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong

nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria,

Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium,

Fusarium..., chỉ có vài loài nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có

một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomer, Ganoderma...

Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng,

các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do

ăn phải nấm độc, có thể làm rối loạn tiêu hóa, ảo giác, bào mòn ống tiêu

hóa, làm giảm khả năng đề kháng tiêu hóa các chât dinh dưỡng trong

thức ăn, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tử vong.

 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây

bệnh cho người thuộc các chi như: Aspergillus, Candida, Cryptococcus,

Histoplasma và Pneumocystic. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở

người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,... cho đến

những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm

Cryptococcus), hay Viêm phổi do nấm Pneumocystic carinii.

1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật:

 Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho

ngành nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe

oryzae) gây bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi

Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn

thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất

lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...

1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm:

 Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủng giống

7

nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus,

Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào

thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu

đỗ,…

 Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây

đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối

loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp

nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê

liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều

công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc

biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định

có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu

quả là đột biến hoặc quái thai.

1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng nấm:

Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm

quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với

con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực

phẩm và các vật liệu khác.

1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học:

 Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc

trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil,

8

….

Bảng 1.1: Một số hợp chất kháng nấm hóa học thƣờng gặp trong

thuốc bảo quản hạt giống. (Mathre và các cộng sự,2011).

 Các hoạt chất kháng nấm hóa học phổ biến như metalaxyl, mancozeb và

hexaconazole… chúng đều thông qua tế bào mô thực vật tiêu diệt các

nấm gây bệnh phát triển trong đó.

 Metalaxyl có tên hóa học là methyl N-(methoxyacetyl)-N-(2,6-xylyl)-DL-

alaninate là hoạt chất trừ nấm thuộc nhóm Alanine, đặc biệt hiêu quả với

nhóm nấm Oomycetes mà hai đại diện điển hình là Phytophthora và

Pythium gây nên các bệnh nghiêm trọng cho cây trồng. Hoạt chất

Metalaxyl có tác dụng nội hấp và lưu dẫn mạnh, thuốc được hấp thụ qua

lá, thân, rễ của cây trồng sau đó vẫn chuyển, lưu dẫn trong cây, ức chế sự

tổng hợp protein, can thiệp vào quá trình tổng hợp ARN ribosome của tế

bào nấm. Phòng trừ hiệu quả các loại nấm phát sinh từ đất và các loại nấm

phát tán bào tử trong không khí. (trích Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực

9

vật tỉnh Lâm Đồng,2015).

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Metalaxyl

 Manocozeb có tên hóa học là Manganese Ethylene bisdithiocarbamate

phức hợp với kẽm, là hoạt chất thuộc nhóm thuốc diệt nấm

Dithiocarbamate. Manocozeb là phức hợp của kẽm và muối mangan, dạng

bột màu vàng hung, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ khác,

bền trong môi trường khô nhưng thủy phân trong môi trường nóng, ẩm và

acid. Hoạt chất này không diệt nấm trực tiếp chỉ khi tiếp xúc với nước,

manocozeb mới bị hoạt hóa, giải phóng ethylene bisthiocyanate sunfua

(EBIS). Dưới tác động của tia cực tím, EBIS chuyển hóa thành ethylene

bisthiocyanate (EBI). EBIS và EBI tác động tới các enzyme có chứa nhóm

sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóa khác nhau

trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấm mốc.( trích

dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng, 2014).

10

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Manocozeb

 Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất có chứa

trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC. Là hoạt chất trừ nấm phổ

rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợp

Ergosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừng

phát triển do chúng không hình thành được tế bào mới. Chất này được mô

cây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốc

nhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh.

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole.

1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học:

 Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây

ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật.

Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm

có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tại

bệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vì

lượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm. Nếu liều

lượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài

từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư…)

 Đối với con người: cơ thể con người nhiễm độc các hợp chất hóa học

biểu hiện ở nhiều mức độ như là giảm sức khỏe, gây rối loạn hoạt động ở

hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa hô hấp, bài tiết, gây các tổn thương bệnh

11

lý ở các cơ quan từ mức độ nhẹ đến nặng thậm chí tàn phế và tử vong. Ví

dụ: hoạt chất Mancozeb gây bệnh da đối với người tiếp xúc, hoạt chất

Metalaxyl gây độc cấp tính thấp nhưng gây kích ứng ở mắt ở mức trung

bình và nhóm độc II về tác động kích thích mắt.

 Đối với môi trường xung quanh: các hợp chất hóa học sẽ diệt hết tất cả

các loài côn trùng, sâu bệnh và nấm gây bệnh có thể làm mất đi sự cân

bằng tự nhiên trong của hệ sinh thái gây ô nhiễm môi trường, đất, nước

và không khí. Các chất tồn dư, không phân hủy ở trong đất và nước có

thể làm cho động vật, cây trồng sống ở đó bị nhiễm các chất đó lâu dài,

con người khi ăn các sản phẩm trồng trọt và chăn nuôi bị nhiễm chất hóa

học hằng ngày một cách gián tiếp, lâu ngày sẽ rất có hại đến sức khỏe.

 Đối với các loại thực vật, chúng sẽ hình thành sự kháng thuốc và có khả

năng sẽ tạo ra các loại vi sinh vật hay nấm gây bệnh mới, mạnh hơn các

loài vi sinh vật và nấm gây bệnh cũ. Chẳng hạn như: hoạt chất Metalaxyl

khi sử dụng liên tục dễ hình thành tính kháng thuốc của vi sinh vật gây

hại; còn hoạt chất Manocozeb chỉ có tác dụng phong bệnh tiếp xúc, sau

khi phun thuốc lên thực vật thi chỉ ngăn ngừa sự hình thành mầm bệnh,

không xâm nhập được vào bên trong mô thực vật, do đó chúng không có

tác dụng khi nấm mốc hình thành và xâm nhiễm bên trong cây trồng.

1.2.3. Hợp chất kháng nấm sinh học:

1.2.3.1. Hợp chất kháng nấm từ thực vật:

 Các vi khuẩn có lợi thường tạo ra các chất có hoạt tính sinh học nhằmức

chế được các tác nhân gây bệnh, trong đó có 1 số chất như là chất có thể

chuyển hóa thành hợp chất thứ cấp hoặc chất có tính kháng sinh. Các

chất đó giúp cho vi khuẩn có thể ức chế hay tiêu diệt các loại vi sinh vật

cạnh tranh với chúng trong cùng điều kiện sống thích hợp. Thật vậy, ta

có thể tìm thấy một số hợp chất thứ cấp từ các vi khuẩn có lợi khác nhau

đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học trong quá trình

phát hiện bệnh trong cây trồng, chúng đã và đang được mọi người trên

12

toàn thế giới sử dụng để làm thuốc bảo vệ cây trồng hay phân bón sinh

học. Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp khôn những giúp cho thực vật chống

lại các tác nhân gây bệnh từ nấm mốc mà còn giúp chúng tăng trưởng và

phát triển tốt hơn. Điển hình là hợp chất thứ cấp được tiết ra từ nấm

Trichoderma, chúng chống lại được phytopathogens và một số chất khác

ảnh hương đến sự trao đổi chất của thực vật.

 Chất gây hại chủ yếu trong các bệnh của cây trồng chủ yếu là

phytopathogenic, các hợp chất thứ cấp trong sinh học có thể kháng lại

chúng mà không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến con người

và động vật, ít tốn kém, quan trọng hơn hết là không làm cho các chất

hây hại có khả năng kháng thuốc nhanh như các chất hóa học.

 Các hợp chất thứ cấp (SM) là sự chuyển hóa hóa học các hợp chất khác

nhau có trọng lượng phân tử tương đối thấp (<3kDa) và được sản xuất

dựa bởi các vi sinh vật và thực vật có liên quan đến các chi, loài hay

chủng. Các hợp chất thứ cấp này được chuyển hóa bằng con đường sinh

tổng hợp từ các chất chuyên biệt (như polypeptide hhay con đường bắt

nguồn từ Acetyl Co-enzyme A hoặc các amino aicd). Các hợp chất này

còn có một số tác nhân sinh học ảnh hưởng đến sự sống, các chức năng

của cơ thể hay cạnh tranh với các vi sinh vật khác.

 Đối với nấm, việc sản xuất các hợp chất thứ cấp thường tương quan đến

các giai đoạn như sự khác biệt về cấu trúc, hình thái và giai đoạn tăng

trường.

 SM còn biểu hiện một số chức năng sinh học và đóng vai trò quan trọng

trong việc điều chỉnh sự tương tác giữa các vi sinh vật. Ví dụ:

phytotoxins là hợp chất thứ cấp của nấm mốc tiết ra để gây hại cho cây

trồng, độc tố nấm là hợp chât thứ cấp được sản xuất ra để gây hại cho

cây trồng và có khả năng gây hại cho con người và động vật, kháng sinh

là các chất trong tự nhiên có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt đối thủ cạnh

tranh của vi sinh vật. Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp từ nấm có thể thay

13

đổi sự tăng trưởng và trao đổi chất cho cây nhằm mục đích kéo dài sự

hình thành bào tử và sơi nấm. Chính vì vậy, người ta tập trung nghiên

cứu các hợp chất thứ cấp từ nấm có lợi và vai trò của nó để chống lại các

vi sinh vật và nấm gây bệnh khác.

 Trong các nghiên cứu cho thấy,sự phân lập nấm Trichoderma tiết ra hợp

chất thứ cấp quan trọng có hoạt tính kháng nấm và gây độc chống lại

phytopathogenic. Trong nấm Trichoderma có chứa các chất kháng nấm

như là pyrones, viridins, butenolides và Hydroxy-lacton….

 Pyrones hay còn có tên gọi là 6-pentyl-2H-pyran-2-one (6PP): là

chất được chuyển hóa từ các loại nấm Trichoderma spp khác nhau(

T.viride, T.atroviride, T.harzianum, T.koningii). Hợp chất này đã thể

hiện được khả năng kháng lại một số nấm gây bệnh trong cả in vitro

và in vivo. Ngoài ra, còn có cytosporone S thuộc nhóm hợp chất

pyrones được phân lập từ Trichoderma có hoạt tính kháng sinh đối

với 1 số loài vi sinh vật và nấm gây bệnh.

14

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Pyrones.

 Viridins là hợp chất steroid được chuyển hóa từ sự phân lập các loài

nấm Trichoderma spp, hợp chất này ngăn chặn sự tăng trưởng từ các

loài nấm gây bệnh như: Aspergillus Niger, Fusarium caeruleum,

Penicillium expansum….

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Viridins.

 Butenolides và Hydroxy-Lactones cũng là các hợp chât thứ cấp được

phân lập từ các chủng Trichoderma spp khác nhau và thông qua các

nghiên cứu trong in vitro thấy được khả năng kháng nấm gây bệnh

của chúng, đặc biệt là chống lại được phytopathogenic.

1.2.3.2. Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn:

Một số loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện và môi trường

khác nhau, sinh ra các khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các

yếu tố môi trường bất lợi là thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức

chế sự phát triển của vi sinh vật. Trong thực tế, trong môi trường nuôi cấy

nấm gây bệnh sẽ có sự hiện diện của rất nhiều loài vi sinh vật khác tranh

dành chất dinh dưỡng, không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi

khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất

dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên

sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Theo Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức

15

Nhuận,1976, trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005).

a. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Bacillus spp.:

 Trước tiên, vi khuẩn Bacillus spp. tạo thành khối xung quanh các nấm gây

bệnh ngăn chặn và không cho chúng bám lên vật chủ để gây bệnh.

 Sau đó, Bacillus spp. sẽ tiết ra hỗn hợp gồm nhiều chất lipopeptid (hay

còn gọi là serenade) làm thủng vách tế bào và màng tế bào của các loại

nấm gây bệnh đó, vì vậy ngăn chặn sự phát triển của chúng. Serenda có

thể được bảo quản và được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu hóa học

tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm không

gây ngộ độc tới các loài động vật như cá hồi, ong mật, chim cút sâu đất….

 Serenda gồm có 3 nhóm lipopetid có tên là surfactin, agrastatin và iturin.

Ba nhóm chất này kết hợp lại với nhau sẽ làm tăng hoạt tính diệt các mầm

bệnh gây hại như nấm mốc và các bào tử gây bệnh của chúng.

 Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid.

Bản thân của chất này không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với

inturin thì sẽ trở thành hợp chất diệt nấm. Sufactin có khả năng làm

thủng vách tế bào của nấm gây bệnh và bảo tử của chúng hỗ trợ cho

agrastatin và iturin phát huy tác dụng.

 Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống

như sufactin và iturin.

 Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt

nấm mốc, bản chất của chúng là lipopeptide được chiết từ môi

trường nuôi cấy Bacillus spp. Iturin diệt nấm bằng cách tác dụng lên

màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành nhiều lỗ thủng làm mất đi

tính thẩm thấu và chọn lọc của màng

 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng của

Aspergillus spp. và Bacillus spp.:

 Trong nước:

Nguyễn Đình Đào (1993) đã kiểm tra đối kháng của Bacillus subtilis

16

AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết quả là

ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân,

1995).

Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã tiến hành sử dụng

Bacillus subtilis để ức chế sự sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của

Aspergillus flavusvà Aspergillus parasiticus trên đậu phộng (trích

Lâm Thanh Thúy, 1995).

 Ngoài nước:

Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của

một số chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.

Norio Kimura (1990) đã sử dụng Bacillus subtilis để ngăn chặn sự

phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus trên đậu phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis

NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm mốc và

tổng hợp aflatoxin. (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995).

b. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic:

 Khả năng ức chế của các vi khuẩn Lactic liên quan đến sự ức chế các vi

sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự

sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm

và các thành phần ức chế đã tìm thấy và được công nhận qua các nghiên

cứu.

 Các vi khuẩn Lactic có thể sản xuất ra các chất kháng sinh như acid lactic

và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin

kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. Các vi khuẩn Lactic đã được

biết đến trong nhiều năm và có vai trò quan trọng trong việc sản xuất các

sản phẩm lên men phục vụ vho đời sống con người. Lợi ích của chúng

mang lại là ảnh hưởng quan trọng đến đường tiêu hóa của con người

(Cogan và cộng sự,1995; Hafidh và cộng sự, 2010). Giống Lactobacillus

đã được báo cáo có hoạt tính kháng nấm đánh giá bằng thử nghiệm thạch

17

lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt chất kháng nấm của

L.coryniformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-

4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001).

 Hầu hết các nghiên cứu kháng nấm của vi khuẩn Lactic là do việc sản xuất

một loại protein kháng nấm hoặc hoạt chất proteinaceous và một số các vi

khuẩn Lactic L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ

và đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và

cộng sự, 2003). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học duy nhất là Nisin có

thể thêm được vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn Lactic (Gardiner và

cộng sự,2003; Corcoran và cộng sự,2004).

 Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic đã xác định

được một số hợp chất có tác dụng ức chế lại nấm mốc và các loại nấm

men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.1).; Lavermicocca và

cộng sự, 2000;.Niku-Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003;

Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005).

Bảng 1.2:Một số hợp chất đƣợc xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm

men (Corsetti và cộng sự, 1998)

Hợp chất đƣợc xác định Nguồn sản xuất giống

4-hydroxy-phenyllacticacid 3- Lactobacillusplantar 21B

phenyllacticacid

3 -hydroxydecanoicacid 3 - Lactobacillusplantarum MILAB14

hydroxydodecanoicacid 3 -

hydroxytetradecanoicacid 3-

hydroxy-5-cis –dodecenoicacid

cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillusplantarum VTTE-

mevalonolactone 78076

Caproic-, propionic-, buturic-, Lactibacillus sanfranciscensis CB1

18

acetic-, formic- and n-valeric acid.

 Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô

mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại

Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus

subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus

IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp..

Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này

(Roy và cộng sự, 1996).

 Vi khuẩn Lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính

acid và các tổ hợp khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất

kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid

hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl…..Ngoài sự ức

chế tăng trưởng thực tế của nấm, các vi khuẩn Lactic cũng có thể ức chế

sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997)

hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El-

Nezami và cộng sự, 2004).

1.3. Các phƣơng pháp sàng lọc các chủng VSV kháng nấm mốc:

 Từ cuối những năm 50 và đầu các thập niên 60, các nhà khoa học đã

nghiên cứu hoạt tính kháng nấm mốc của các vi khuẩn có lợi thông qua

nhiều phương pháp khác nhau để từ đó, các nhà khoa học có thể khẳng

định được sự kháng nấm của các vi khuẩn có lợi sẽ ức chế được sự tăng

trưởng và phát triển của các bào tử và sợi nấm của các chủng nấm gây hại,

đặc biệt là chủng nấm Aspergillus spp.

 Dựa trên tiêu chí đó, để lựa chọn ra được chủng vi khuẩn có lợi từ bộ sưu

tập của phòng thí nghiệm có khả năng kháng nấm mốc hiệu quả thích hợp

nhất, em đã thực hiện theo 3 phương pháp khác nhau: phương pháp đối

kháng trực tiếp, phương pháp đặt thạch khuếch tán và phương pháp đối

kháng che phủ. Từ đó, dựa trên sự đường kính của sợi nấm đánh giá được

mức độ đối kháng của vi khuẩn có lợi nào mạnh nhất và cũng như phương

19

pháp nào tối ưu nhất.

1.3.1. Phƣơng pháp đối kháng trực tiếp (phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuẩn):

Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sử

dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture

Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005):

Đầu tiên, ta cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đường kính 7mm) và đặt

vào tâm dĩa petri có môi trường thạch đã chuẩn bị, sau đó ủ 24h cho nấm

phát triển. Tiếp theo, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn chỉ thị vào dĩa và

đặt cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện

nhau qua tâm dĩa trên cùng một đường kính). Cuối cùng, ủ các dĩa thạch

trong 72h, nhiệt độ phòng. Hoạt động ức chế sẽ dựa trên đường kính của

sợi nấm.

Hình 1.6: Phƣơng pháp cấy ria 2 đƣờng vi khuẩn thể hiện sự đối kháng của vi

20

khuẩn LAB với nấm mốc (trích từ Brunner và cộng sự (2005).

Hình 1.7: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của các vi khuẩn có

21

lợi theo phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuân.

1.3.2. Phƣơng pháp đối kháng trực tiếp (đảt thạch khuếch tán):

 Phương pháp khuếch tán(Agar Plug Diffusion Method) này được phát triển

vào năm 1940, là phương pháp thông dụng được sử dụng nhiều trong các

phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng để thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh

thông thường. Hiện nay, nhiều tiêu chuẩn đã chấp nhận và phê duyệt được

công bố bởi CLSI cho vi khuẩn và nấm mốc thử nghiệm, mặc dù không phải

hầu hết các vi khuẩn đều thể hiện khả năng đối kháng trên phương pháp này

nhưng cũng đã thành công trên một số vi khuẩn và thể hiện rõ sự ức chế của

chống đối với nấm mốc.

 Phương pháp này được mô tả như sau: Đầu tiên, ta trang huyền phù của nấm với mật độ 105/ml nấm trên dĩa thạch PDA cho khô. Tiếp theo, sử dụng cây

khoanh thạch đục lỗ vi khuẩn chỉ thị đặt vào 3 điểm đã xác định trên dĩa petri

có chứa nấm. Cuối cùng, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.Hoạt động ức chế sẽ

dựa trên sụ phát triển của đường kính nấm.

Hình 1.8: Phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng

giữa vi khuẩn Bacillus spp với C.albicans (trích dẫn Mounyr Balouiri,

22

2011).

Hình 1.9: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn

23

có lợi theo phƣơng pháp khuếch tán.

1.3.3. Phƣơng pháp đối kháng che phủ: (phƣơng pháp đỗ dĩa)

Phương pháp che phủ (Overlay Method) này như mô tả của Kumar và các

cộng sự, 2009 .Sử dụng dịch tăng sinh của vi khuẩn chỉ thị được cấy trang

lên môi trường đặc thù của chúng, sau đó ủ 24h trong nhiệt độ phòng.

Tiếp theo, chúng được phủ lên bằng 10ml chiết xuất malt thạch mềm có chứa 105/ml nấm ủ hiếu khí trong vòng 72h. Sau 72h nuôi cấy, vùng ức

chế sẽ hiện ra.Hoạt động ức chế dựa trên độ bao phủ của nấm thể hiện trên

dĩa.

Hình 1.10: Phƣơng pháp đối kháng che phủ của vi khuẩn Bacillus

spp. với nấm mốc - Nấm Trichorphyton sp. (a) - Nấm Microsporum

24

fulvum (b). (trích dẫn Kumar và các cộng sự, 2009).

25

Hình 1.11: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm với các vi khuẩn có lợi theo phƣơng pháp đõ dĩa.

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm nghiên cứu:

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh

Học- Thực Phẩm- Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM.

2.2. Thời gian thực hiện:

Đề tài được thực hiện từ 20/3/2016 đến 30/7/2016

2.3. Vật liệu nghiên cứu:

2.3.1. Giống vi sinh vật:

 Các giống vi khuẩn Bacillus spp.:

 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1+, CS1b,VK4.

 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus

 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3.

 Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus spp.:

 Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN2-5(L3), LN2-7 (L4), LN3-5, LN3-7.

 Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1(C1), LC3(LC3-3).

 Các loại nấm thuộc nhóm Aspergillus spp.:

 Nhóm nấm phân lập từ đậu nành: ĐN3, ĐN2.

 Nhóm phân lập từ đậu phộng: CĐP1, CĐP2.

 Nhóm phân lập từ hạt cà phê: HCP2.

 Do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm-

Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM cung cấp.

 Nystatin từ nhà sản xuất F.T.Pharma 500000IU/viên, 1mg chứa 4855IU và 1IU

tương đương 0,0002059 mg chế phẩm tương đương chứa 0,9996445mg

26

Nystatin.

2.3.2. Hóa chất và môi trƣờng sử dụng:

2.3.2.1. Hóa chất:

 Các hóa chất dùng để pha môi trường NA, NB, PDA, MRS cải tiến và MRS-

broth.

 Các hóa chất dùng để làm huyền phù nấm.

 Các hóa chất để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal Violet), Iod

ethanol 95%, Aceton, thuốc nhuộm Fushin, xanh methylen.

2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy:

 Môi trường NA- NB

 Môi trường PDA

 Môi trường MRS-broth và MRS agar

2.4. Thiết bị và dụng cụ:

2.4.1. Thiết bị:

 Tủ cấy vi sinh (Brlad France)

 Tủ ủ (Memmert Germany)

 Tủ lạnh Toshiba

 Autoclave (Memmert- Đức)

 Cân phân tích (Orbital Germany)

 Bếp từ (Billy- England)

 Máy nước cất (Branstead USA)

 Máy lắc

 Kính hiển vi quang học

27

 Bể điều nhiệt

2.4.2. Dụng cụ:

 Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, ống

đong.

 Pipet thủy tinh 10ml, 20ml, pipetman 100-1000µl

 Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch,que đục lỗ thạch, dao phẫu thuật, đèn cồn.

 Bông thấm nước, bông không thấm nước, lame, lamell, giá đỡ ống nghiệm, rổ

nhựa.

2.5. Phƣơng pháp luận:

 Mục tiêu: Khảo sát các phương pháp đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Bacillus

spp.và Lactobacillus spp.đối kháng lại 1 số loại nấm mốc gây hại trên các loại

hạt nông sản.

 Nội dung:

 Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc Aspergillus spp.

 Khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của 1 số chủng vi khuẩn.

 Đánh giá khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp cấy 2 đường

vi khuẩn của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp. với nấm

mốc Aspergillus spp.

 Xác định khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp khuếch tán

của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp. với nấm mốc

Aspergillus spp.

 Khảo sát khả năng đối kháng thông qua phương pháp che phủ của 2 chủng

vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc Aspergillus spp.

 So sánh kết quả để lựa chọn ra phương pháp đối kháng mạnh nhất của 2

chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.

2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu:

28

2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu:

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng VK

29

có lợi với nấm mốc.

2.6.2. Khảo sát sự tăng trƣởng của nấm mốc:

 Mục đích: Khảo sát sự phát triển của nấm mốc và chứng tỏ rằng đây là các

giống nấm mốc Aspergillus spp. khỏe mạnh

 Tiến hành:

 Từ dĩa giống nấm của phòng thí nghiệm, ta đục một khoanh thạch nấm cấy

và đặt vào môi trường PDA đã hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút.

 Sau đó, ủ trong 72h trong nhiệt độ phòng và quan sát,

2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp ria 2

đƣờng vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với

nấm mốc Aspergillus spp. :

30

 Quy trình thí nghiệm:

Hình 2.2: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn

31

với nấm mốc theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.

 Thuyết minh quy trình:

Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn

theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn.

Tiến hành:

Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:

 Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp khử trùng ở 370C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường NB ở 370C trong 24h.

 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hoạt hóa giống trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h..

 Cấy truyền dịch tăng sinh:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., cấy ria vào môi trường NA đã hấp khử

trùng 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C.

 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., cấy ria vào môi trường MRS agar đã hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C

Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng:

 Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS cải tiến đều được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử

trùng, mỗi dĩa 15ml.

 Khi thạch đã đông, ta tiến hành cấy nấm mốc vào tâm các dĩa. Mỗi dĩa lặp

lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng.

 Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2

vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm dĩa trên cùng một

đường kính)cần thử đối kháng vào.Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm

dĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng.

32

 Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày.

 Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm:

Dtn

Dđc

1.5 cm

Hình 2.3: Mô tả cách đo đƣờng kính vòng ức chế của phƣơng pháp vạch 2

đƣờng vi khuẩn

Trong đó:

Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng

Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm

33

Số liệu được xử lí bằng phần mền SAS 9.1

2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt

thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với

nấm mốc Aspergillus spp. :

34

 Quy trình thí nghiệm:

Hình 2.4 : Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng kháng nấm của 20 chủng vi khuẩn

35

với nấm mốc theo phƣơng pháp đục thạch khuếch tán.

 Thuyết minh quy trình :

Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn

theo phương pháp khuếch tán.

Tiến hành:

Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:

 Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp khử trùng ở 370C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường NB ở 370C trong 24h.

 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hoạt hóa giống trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h..

 Cấy truyền dịch tăng sinh:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hút 0.1ml dịch tăng sinh và trang vi khuẩn vào môi trường NA đã hấp khử trùng 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C.

 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hút 0.1ml dịch tăng sinh và trang vi khuẩn vào môi trường MRS agar đã hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C.

Chuẩn bị huyền phù nấm:

 Cấy truyền giống nấm vào dĩa có chứa môi trường PDA đã hấp khử trùng ở

1210C trong 30 phút. Sau đó, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.

 Sau 72h, ta dùng muỗng đã hấp khử trùng cào hết phần bào tử nấm đã mọc

tròn dĩa và pha loãng với nước muối sinh lí có Tween 80 đã hấp khử trùng để nấm đạt đến mật độ 105/ml nấm.

36

Chuẩn bị môi trường để khảo sát sự đối kháng:

 Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS cải tiến đều được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử

trùng, mỗi dĩa 15ml.

 Khi thạch đã đông, ta tiến hành hút 0.1ml dịch huyền phù nấm đã pha loãng

và trang đều cho khô. Sau đó, đặt khoanh thạch vi khuẩn vào các điểm đã

được chấm trước trên dĩa.Mỗi dĩa được lặp lại 3 lần. Đối với dĩa đối chứng,

ta chỉ hút dịch huyền phù nấm và trang khô, không đặt thạch vi khuẩn. Cuối

cùng, ủ 72h ở nhiệt độ phòng.

(A) (B)

Hình 2.5:Cách đặt thạch vi khuẩn theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán-

Đĩa petri có chứa huyền phù nấm để đặt thạch chứa vi khuẩn lên (A) – Đĩa

petri chứa vi khuẩn (B)

 Quan sát và đọc kết quả đối kháng dựa trên sự phát triển của vòng ức chế

37

nấm của vi khuẩn.

D

d

 Ta tiến hành đo và tính toán kết quả dựa theo hình vẽ và công thức:

Hình 2.6: Cách đo đƣờng kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc theo

phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán

Trong đó:

Dtn1: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 1 chưa trừ

ra đường kính lỗ thạch (d).

Dtn2: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 2 chưa trừ

ra đường kính lỗ thạch (d).

Dtn3: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 3 chưa trừ

38

ra đường kính lỗ thạch (d).

2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phƣơng pháp đỗ dĩa

2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm

mốc Aspergillus spp.:

39

 Thuyết minh quy trình:

Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng che phủ của 20 chủng vi khuẩn

40

với các nấm mốc theo phƣơng pháp đỗ dĩa.

 Thuyết minh quy trình:

Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn

theo phương pháp đỗ dĩa.

Tiến hành:

Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:

 Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp. hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp khử trùng ở 370C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường NB ở 370C trong 24h.

 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp. hoạt hóa giống trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h..

 Pha loãng dịch tăng sinh:

 Hút 1ml dịch tăng sinh của các chủng vi khuẩn pha loãng với nước

muối sinh lí 85% cho đến 1 nồng độ nhất định.

Chuẩn bị huyền phù nấm:

 Cấy truyền giống nấm vào dĩa có chứa môi trường PDA đã hấp khử trùng ở

1210C trong 30 phút. Sau đó, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.

 Sau 72h, ta dùng muỗng đã hấp khử trùng cào hết phần bào tử nấm đã mọc

tròn dĩa và pha loãng với nước muối sinh lí có Tween 80 đã hấp khử trùng để nấm đạt đến mật độ 105/ml nấm.

Chuẩn bị môi trường để khảo sát sự đối kháng:

 Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS agar đều được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử

trùng, mỗi dĩa 15ml.

 Khi môi trường đã đông, hút 0.1ml dịch vi khuẩn đã pha loãng và trang đều

41

cho khô. Sau đó, ủ trong 24h ở nhiệt độ phòng.

 Cho dịch nấm đã pha loãng vào môi trường PDA đã hấp khử trùng đùng

theo tỉ lệ nồng độ. Sau đó, đổ 1 lớp PDA có chứa nấm lên dĩa môi trường

có chứa khuẩn lạc vi khuẩn đã ủ trong 24h và lắc đều. Mỗi dĩa được lặp lai

3 lần. Đối với dĩa đối chứng chỉ đổ lớp môi trường PDA có chứa dịch nấm

không trang vi khuẩn. Cuối cùng, đem ủ 72h ở nhiệt độ phòng.

 Quan sát và đọc kết quả dựa trên sự phát triển của nấm sau 3 ngày.

 Dựa theo hình ảnh quan sát, ta chia tỉ lệ ức chế nấm mốc của vi khuẩn theo

3 phân đoạn khác nhau:

 Không ức chế hay ức chế yếu từ 0 đến 30%

 Ức chế trung bình từ 35 đến 60%

42

 Ức chế mạnh từ 65-100%.

2.6.6. Một số phƣơng pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của một

số chủng vi khuẩn:

2.6.6.1. Nhuộm Gram:

Mục đích: Dựa vào cấu trúc vách tế bào giúp ta xác định nhóm của vi khuẩn là

vi khuẩn Gram dương (Gram – positive) hay vi khuẩn Gram âm (Gram –

negative). Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so

với soi vi khuẩn sống.

Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến. Vi khuẩn đem nhuộm gram

phải là vi khuẩn mới cấy truyền sau 24 giờ. Ngược lại vi khuẩn già cho kết quả

sai lệch.

Kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng.

2.6.6.2. Nhuộm bào tử:

Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu,

chứa nhiều lipid. Trước hết xử lý để tế bào chất dễ bắt màu bằng nhiệt và acid.

Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính

mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ

sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất bắt màu phân biệt. Theo sơ đồ

Bergey thì chủng Bacillus spp. sinh bào tử. Do đó việc xác định này nhằm loại bỏ

các vi khuẩn sinh bào tử như Lactobacillus spp.

Tiến hành: Dùng phương pháp Schaefera – Fulton.

Kết quả: Bào tử có màu xanh lục, tế bào có màu đỏ hồng.

2.6.6.3. Các thí nghiệm sinh hóa:

 Thử khả năng lên men đường:

43

Mục đích : Kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào.

Tiến hành : Môi trường NB với lượng đường glucose lần lượt thay thế bằng

các loại đường cần kiểm tra. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống

10ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để

hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong

15 phút ở 1210C. Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa vào các ống nghiệm, đặt ở 370C,

theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để

bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày.

Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị

Phenol Red sẽ chuyển sang màu vàng.

 Thửnghiệm Catalase:

Mục đích: Để phát hiện được enzyme catalase trong vi khuẩn. Phản ứng

catalase rất cần thiết để phân biệt vi khuẩn kị khí và hiếu khí bắt buộc, vi khuẩn

kị khí sẽ không có enzyme này như Lactobacillus spp.còn vi khuẩn hiếu khí bắt

buộc sẽ có enzyme này như Bacillus spp.

Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần cho lên phiến

kính sạch, nhỏ 1 giọt H2O2 lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính.

Kết quả: Nếu là vi khuẩn hiếu khí sẽ sủi bọt khi nhỏ H2O2 lên còn kị khí thì

không sủi bọt.

 Thử khả năng di động:

Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. Tiến hành: Sử dụng môi trường NA 0,5% agar. Hấp khử trùng 121oC/ 15 phút.

Để cho môi trường đông lại, dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần, cấy điểm vào giữa đĩa môi trường thạch bán rắn. Ủ ở 370C.

Đọc kết quả sau 24giờ.

44

Kết quả: Vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng di động.

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý- sinh hóa của một số chủng vi khuẩn:

Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. và Bacillus spp.được dùng trong thí nghiệm

đã được một số nghiên cứu trước định danh sơ bộ bằng khảo sát sinh lí và sinh hóa.

Tuy nhiên, vẫn còn ba vi khuẩn VK4, CS1a, CS1+ chưa được khảo sát sơ bộ bằng

khảo sát sinh lí và sinh hóa nên chúng ta khảo sát sinh lý và sinh hóa chúng lại để

khẳng định chúng có một số đặc điểm tiêu biểu của Bacillus spp. hay không. Vi

khuẩn Bacillus spp.cần phải đáp ứng các điều kiện: vi khuẩn gram dương, hình cầu

hoặc hình que, sinh bào tử, có khả năng di động… Các phản ứng sinh ly-sinh hóa

sau sẽ chứng minh vi khuẩn Bacillus spp.đạt được các yêu cầu đó. Hình thái khuẩn

lạc của các chủng Bacillus spp.thể hiện qua bảng 3.1:

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp.

Tên chủng Hình thái khuẩn lạc

CS1a Khuẩn lạc tròn, bờ răng cưa, nhẵn, ướt, màu trắng đục, có tâm

Khuẩn lạc tròn đều, ướt, nhẵn, có tâm, màu trắng đục CS1+

Khuản lạc tròn đều, nhẵn, không có tâm, màu trắng đục VK4

Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp. CS1a (a) – CS1+ (b)

45

– VK4 (c).

3.1.1. Nhuộm Gram:

 Vi khuẩn Bacillus spp. là vi khuẩn gram dương, hình que hoặc hình cầu nên ta

tiến hành nhuộm Gram với các tế bào tăng sinh ở 24h trong môi trường NB, vì

khi tế bào già sẽ bắt màu giống như vi khuẩn gram âm.

 Kết quả thu được vi khuẩn Bacillus spp.: VK4 là vi khuẩn gram dương

Hình 3.2: Nhuộm Gram vi khuẩn VK4

3.1.2. Nhuộm bào tử:

 Theo sơ đồ định danh của Bergey thì Bacillus spp.sinh bào tử nên nhuộm bào tử

giúp loại bỏ các vi khuẩn gram dương không sinh bảo tử như Lactobacillus spp.

và đây là cách nhận dạng của chúng. Kết quả sau khi nhuộm bào tử và được đối

chiếu với vi khuẩn Lactobacillus spp.gram dương.

 Kết quả cho thấy 3 chủng vi khuẩn Bacillus spp.CS1a,CS1+ và VK4 đều bắt

màu xanh lục sau khi nhuộm thuốc thử Malachite Green còn Lactobacillus spp.

46

L5 chỉ bắt màu đỏ hồng.

a

b

Hình 3.3: Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn- Nhuộm bào tử của vi khuẩn VK4

(a) - Nhuộm bào tử của vi khuẩn Lactobacillus sp L5. (b)

3.1.3. Các thử nghiệm sinh hóa:

Một số thử nghiệm sinh hóa được thể hiện qua bảng:

Bảng 3.2: Một số phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn Bacillus spp.

Phƣơng pháp Chủng

CS1a CS1+ VK4

Catalase + + +

Khả năng di động + + +

Glucose + + +

Khả năng lên men đường Saccarose + + +

+ - - Xylose

47

+ + + Lactose

Chú thích: “-“ là kết quả âm tính; “+” là kết quả dương tính.

 Qua các định danh sơ bộ theo phương pháp cổ điển, người thực hiện đề tài

khẳng định được các chủng Bacillus spp. VK4, CS1a, CS1+ đều là vi khuẩn

Bacillus và đều thuẩn khiết.

3.2. Khảo sát sự tăng trƣởng của các chủng nấm mốc Aspergillus spp.:

 Để xác định được các chủng nấm trong phòng thí nghiệm là các chủng nấm

khỏe mạnh và thuần khiết, ta cấy bằng cách đặt thạch nấm và đo đường kính

phát triển của chúng sau 3 ngày.

 Vì ở đây ta thực hiện sự đối kháng của nấm với 2 chủng vi khuẩn là Bacillus

spp và Lactobacillus spp. nên ta sẽ đặt thạch nấm lên 2 môi trường đặt trưng

của 2 vi khuẩn đó và đo đường kính phát triển của chúng sau 3 ngày.

 Đối với Bacillus spp.ta dùng môi trường PDA để khảo sát:

Hình 3.4: Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày quan sát trên môi trƣờng

PDA – Nấm CĐP1 (a) – Nấm CĐP2 (b) – Nấm ĐN2 (c) – Nấm ĐN3 (d) – Nấm

48

HCP2 (e).

 Đối với Lactobacillus spp. ta dùng MRS cải tiến (bỏ citrate amon) để khảo sát:

Hình 3.5: Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày quan sát trên môi trƣờng

MRS cải tiến – Nấm CĐP1 (a) – Nấm CĐP2 (b) – Nấm ĐN2 (c) – Nấm ĐN3 (d)

49

– Nấm HCP2 (e).

3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc Aspergillus spp.:

 Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp.nên ở mỗi ta sẽ

sắp xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm:

 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4.

 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus.

 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3.

 Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm:

 Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5.

 Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3.

 Thử nghiệm đối kháng nấm mốc ta sử dụng 5 chủng nấm mốc Aspergillus

spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Trong đó, ta sử dụng đối

chứng (+) là thuốc Nystatin vì Nystatin là hợp chất hóa học tác động lên

màng tế bào của nấm mốc của Steptomyces nourse. Nhằm mục đích để so

sánh sự đối kháng của chủng vi khuẩn thí nghiệm với hợp chất hóa học có

50

sự khác biệt hay không.

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp.:

Hình 3.6: Đối chứng CĐP2 (a)- Nystatin-CĐP2 (b)-Paenibacillus-CĐP2 (c) -

51

CS1b-CĐP2 (d)- NT 1.4-CĐP2(e).

Hình 3.7: Đối chứng ĐN3 (a) – Nystatin-ĐN3 (b) –Paenibacillus-ĐN3 (c) –

52

CS1b-ĐN3 (d) – NT 1.4-ĐN3 (e).

Bảng 3.3: Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các nhóm vi khuẩn Bacillus spp. với nấm mốc theo từng nhóm theo phƣơng pháp cây 2 đƣờng vi khuẩn.

32.80a±4.71 39.39b±1.78 43.80ab±2.66 38.95b±1.51 27.99b±4.66

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2

37.58c±4.81 35.28b±3.08

5.24d±4.26

34.73b±4.62

8.59c±3.73

ĐC(+)

VK4 NHÓM

2.54a±1.91

30.60c±2.57 37.85bc±4.39 60.61a±4.78 28.92b±4.44

VK CS1a PHÂN

16.71b±3.59 16.79d±4.71 32.00c±2.66

54.79a±4.12 10.27c±2.52

LẬP TỪ CS1+

PHỤ

40.76a±2.53 52.74a±1.78 51.39a±1.41

52.90a±4.86 47.39a±1.12

CS1b PHẾ

32.80b±4.71 39.39b±1.78 43.80a±2.66

38.95b±1.51 27.99b±4.66

PHẨM

ĐC(+)

44.58a±2.53 40.76a±4.75 44.16a±4.55

47.67b±3.80 27.99b±0.65

NHÓM D9

50.29a±3.80 38.44a±4.48

Paenibacillus 38.85ab±3.45 32.20c±1.78 44.00a±3.24

VK

PHÂN

LẬP TỪ

32.80a±4.71 39.39a±1.78 43.80b±2.66

38.95a±1.51 27.99b±4.66

ĐẤT

21.33b±3.86 29.26b±4.37 31.08a±3.73

46.65c±4.78 34.15b±4.27

ĐC(+)

Sb NT 1.3 NHÓM

29.93a±1.46 27.40b±4.15 45.54ab±3.73 40.40b±3.52 15.12c±4.20

VK Sb NT 2.3 PHÂN

31.21a±5.06 25.01b±4.48 35.39ab±2.77 41.86b±4.80 32.47b±4.13.

LẬP TỪ Sb NT 3.3

NƢỚC

36.30a±0.55 22.27b±2.14 37.23a±4.62 44.76ab±3.06 53.73a±2.58

53

Sb NT 1.4 THẢI

Bảng 3.4: So sánh tỉ lệ ức chế nấm mốc của 3 vi khuẩn Bacillus spp. mạnh nhất

trong từ nhóm với nhau theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.(dựa theo độ

tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1.

32.80c±4.71 39.39b±1.78 43.80bc±2.66 38.95b±1.51

27.99c±4.66

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2

ĐC(+)

CS1b

(NHÓM VK PHÂN

40.76ab±2.53 52.74a±1.78 51.39a±1.41 52.90a±4.86 47.39a±1.12

LẬP TỪ PHỤ PHẾ

PHẨM)

44.58a±2.53 40.76b±4.75 44.16b±4.55 47.67a±3.80

27.99c±0.65

D9

(NHÓM VK PHÂN

LẬP TỪ ĐẤT)

36.30bc±0.55 22.27c±2.14 37.23c±4.62 44.76a±3.06 53.73b±2.58

Sb NT 1.4

(NHÓM VK PHÂN

LẬP TỪ NƢỚC

54

THẢI)

Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus

55

spp.đƣợc phân lập từ phụ phế phẩm.

56

Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus spp. đƣợc phân lập từ đất.

57

Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus spp .đƣợc phân lập từ nƣớc thải.

 Sau khi xử lí số liệu bằng phần mền ANOVA (phân tích phương sai) với mức

độ tin cậy là 95% thì ta có:

 Phần trăm tỉ lệ ức chế của vi khuẩn CS1b là mạnh nhất với các chủng vi

khuẩn Bacillus spp. còn lại nằm trong khoảng 40.76-52.74% thể hiện trong

bảng 3.4 và hình 3.7

 Thông qua bảng 3.3, cho thấy được vi khuẩn thể hiện tỉ lệ ức chế yếu nhất là

vi khuẩn VK4, tỉ lệ ức chế chỉ nằm trong khoảng 5.24-37.58% trong bảng

3.3.

 Trong từng nhóm phân lập, các vi khuẩn Bacillus spp. thể hiện tỉ lệ đối kháng

thông qua biểu đồ:

 Ở biểu đồ 3.8, tỉ lệ đối kháng của vi khuẩn CS1b thể hiện qua sự bao phủ

hết các vi khuẩn khác trong nhóm vi khuẩn phân lập từ phụ phế phẩm.

 Trong nhóm phân lập từ đất, tỉ lệ đối kháng của vi khuẩn D9 thể hiện mạnh

và rõ ràng thông qua sự bao phủ của D9 trong biểu đồ 3.9.

 Nhóm vi khuẩn phân lập từ nước thải, Sb. NT 1.4 thể hiện sự đối kháng

thông qua biểu đồ 3.10 cho thấy tỉ lệ đối kháng khá mạnh đối với chủng

nấm HCP2.

 So với thí nghiệm của Nystatin với các chủng nấm mốc thì vi khuẩn CS1b có

khả năng kháng nấm mốc cao hơn rất nhiêu chiếm khoảng từ 40.00-50.00%

58

còn Nystatin chỉ khoảng 25.00-40.00%. (đồ thị hình 3.8).

 Đối với vi khuẩn Latobacillus spp.:

Hình 3.11: Đối chứng CĐP2 (a) – Nystatin-CĐP2 (b) – LN2-5-CĐP2 (c) –

59

LC1-1-CĐP2 (d)

Hình 3.12: Đối chứng ĐN3 (a) – Nystatin-ĐN3 (b) – LN2-5-ĐN3 (c) –

60

LC1-1-ĐN3 (d).

Bảng 3.5: Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các nhóm vi khuẩn Lactobacillus

spp. với nấm mốc theo từng nhóm theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.

63.49ab±1.37

9.12d±4.34

35.75c±4.18

43.15c±0.00

16.35e±1.09

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2

64.48ab±3.78 28.08ab±4.29 51.06ab±2.58 63.11a±1.21

47.01ab±3.14

ĐC(+)

L5

52.38c±3.14 20.03bc±4.26 43.36bc±4.20 59.78ab±4.45

39.94c±3.03

NHÓM L6 VK

60.12b±3.90

9.75d±1.24

22.46c±0.00

48.59c±1.05

25.63d±4.82

PHÂN LN3-5

LẬP TỪ

60.91b±1.37 15.38cd±4.87 38.41c±4.75

55.24b±0.00

21.23de±2.45

64.29ab±1.57 24.86b±3.87 52.05ab±4.87 59.48ab±3.68

43.40bc±1.89

NEM LN3-7

LN2-7

68.75a±1.26 35.95a±2.28

55.07a±4.10 60.49ab±3.42

52.83a±2.67

63.49ab±1.37

9.12b±4.34

35.75b±4.18 43.15b±0.00

16.35c±1.09

LN2-5

60.71b±2.73

3.03b±2.17

39.37b±2.41

36.49b±2.77

16.51c±4.03

ĐC(+)

LC7-7

63.29ab±1.24 26.65a±4.34

35.27b±4.32

61.29a±1.60

39.31a±3.57

NHÓM LC6-5 VK

PHÂN

64.29ab±0.00

9.47a±2.23

36.47a±4.18

62.10a±4.12

24.06a±4.19

LC1-1

LẬP TỪ

61.31a±2.73 31.84b±4.68

50.60b±4.20

65.32a±0.00

34.91b±4.55

CƠM LC3-3

61

MẺ

Bảng 3.6: So sánh tỉ lệ ức chế nấm mốc của 2 vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh

nhất trong từ nhóm với nhau theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.

(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)

63.49b±1.37

9.12b±4.34

35.75b±4.18

43.15b±0.00 16.35c±1.09

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2

ĐC(+)

LN2-5

(NHÓM VK PHÂN

68.75a±1.26

35.95a±2.28

55.07a±4.10

60.49a±3.42 52.83a±2.67

LẬP TỪ NEM)

64.29b±0.00

9.47a±2.23

36.47a±4.18

62.10a±4.12 24.06b±4.19

LC1-1

(NHÓM VK PHÂN

62

LẬP TỪ CƠM MẺ)

Hình 3.13: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn

63

Lactobacillus spp. đƣợc phân lập từ nem.

Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn

64

Lactobacillus spp. đƣợc phân lập từ cơm mẻ.

 Theo số liệu trên phàn mền ANOVA (phân tích phương sai) cho thấy tỉ lệ ngày

thứ 3 là cho tỉ lệ ức chế tốt nhất nhóm nấm mốc Aspergillus spp.thể hiện qua

các hình 3.11 và 3.12 với độ tin cậy 95%.

 Trong đó, vi khuẩn LN2-5 (L3) thuộc nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp.phân

lập từ nem là có khả năng kháng nấm mốc mạnh nhất và tỉ lệ ức chế nấm cũng

đồng đều hơn so với vi khuẩn Lactobacillus spp.khác trong 10 chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm thể hiện qua bảng 3.6.

 Tỉ lệ ức chế của LN2-5 (L3) với các nấm mốc dao động từ khoảng 36.0-67.0%,

đối với nấm ĐN3 68.75%, nấm ĐN2 là 35.95%, nấm CĐP1 là 60.49%, nấm

CĐP2 là 55.07%, nấm HCP2 là 52.83% được thể hiện rõ qua bảng thống kê số

liệu 3.5.

 Trong từng nhóm phân lập của các chủng Lactobacillus spp.:

 Nhóm phân lập từ nem, LN2-5 thể hiện sự đối kháng mạnh đối với các

chủng nấm mốc thông qua sự bao phủ được biểu hiện qua biểu đồ 3.13.

 Trong biểu đồ 3.14, vi khuẩn LC1-1 thể hiện tỉ lệ kháng nấm mốc khá cao

qua sự bao phủ của nó so với các chủng vi khuẩn khác.

 Thí nghiệm của Nystatin với các chủng nấm mốc thì vi khuẩn LN2-5 có khả

năng kháng nấm mốc cao hơn rất nhiêu chiếm khoảng từ 40.00-75.00% còn

Nystatin chỉ khoảng 25.00-40.00%. (đồ thị hình 3.13).

Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đối kháng nấm trực tiếp theo

cách cấy 2 đƣờng vi khuẩn:

 Ưu điểm: Đơn giản, dễ quan sát.

 Nhược điểm:

 Khi đặt thạch nấm vào dĩa môi trường phải nhanh nên không bào tử nấm sẽ

bay ảnh hưởng đến kết quả

65

 Sai số giữa các lần lặp lại trong cùng một nghiệm thức khá cao.

3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp

đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp.

với nấmmốc Aspergillus spp.:

 Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. nên ở mỗi ta sẽ sắp

xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm:

 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4.

 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus.

 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3.

 Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm:

 Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5.

 Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3.

 Thử nghiệm đối kháng nấm mốc với 2 chủng vi khuẩn ta sử dụng 5 chủng nấm

mốc Aspergillus spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp.:

66

Hình 3.15 : Đối chứng ĐN3 (a)- Sb NT 1.4- ĐN3 (b)- Sb NT 3.3- ĐN3 (c).

Hình 3.16 : Đối chứng ĐN2 (a)- Sb NT 1.4- ĐN2 (b)- D9- ĐN2 (c).

 So sánh vòng ức chế nấm mốc giữa các vi khuẩn Bacillus spp.mạnh nhất ở các

nhóm với nhau :

Hình 3.17: So sánh vòng ức chế giữa các nhóm VK mạnh nhất với nhau

67

Sb NT3.3-HCP2(a)-CS1b-HCP2(b)-D9-HCP2(c).

Bảng 3.7 : Thống kê số liệu vòng ức chế của vi khuẩn Bacillus spp. theo từng

nhóm đối với nấm mốc trong phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán.(dựa theo độ

tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)

10.44b±0.77 11.00b±1.73 10.00b±0.00 11.11a±1.08 10.00b±0.00

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

VK4 NHÓM

13.17ab±1.17 10.91b±0.86 11.50ab±0.60 10.67a±1.15 10.00b±0.00

VK CS1a PHÂN

LẬP

16.61a±3.95 16.67a±2.31 12.83a±1.32 12.94a±1.60 15.44a±2.59

CS1b

TỪ

9.56b±2.21

16.06a±3.33 13.06a±1.35 11.11a±1.92 11.67b±1.86

PHỤ CS1+ PHẾ

PHẨM

21.33a±2.89 17.83a±0.58 14.11a±1.11 19.11a±4.33 19.72a±2.42

NHÓM D9

VK

PHÂN

LẬP Paenibacillus 11.94b±2.31 16.33a±2.74 14.44a±1.17 16.11a±2.81 10.61b±0.54

TỪ

14.83b±2.33 14.78a±0.10 12.78a±0.59 12.33a±1.17 12.28a±0.54

ĐẤT

Sb NT 1.3 NHÓM

10.39b±0.42 10.39c±0.67 11.56ab±1.02 12.06a±0.67 10.00b±0.00

VK Sb NT 2.3 PHÂN

LẬP

21.83a±6.64 15.78a±1.35 13.17a±1.45 12.00a±0.93 13.22a±1.86

Sb NT 3.3

11.06b±1.08 12.72b±0.67 10.28b±0.48 10.83a±1.44 11.22ab±1.58

TỪ

Sb NT 1.4 NƢỚC

68

THẢI

Bảng 3.8 : So sánh vòng ức chế trung bình giữa các vi khuẩn Bacillus spp.

mạnh giƣa các nhóm với nhau đối với nấm mốc theo phƣơng pháp đặt thạch

khuếch tán.(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

CS1b

16.61a±3.95 16.67a±2.31

12.83a±1.32

12.94b±1.60

15.44ab±2.59

(NHÓM VK PHÂN

LẬP TỪ PHỤ PHẾ

PHẨM)

D9

21.33a±2.89 17.83a±0.58

14.11a±1.11

19.11a±4.33

19.72a±2.42

(NHÓM VK PHÂN

LẬP TỪ ĐẤT)

21.83a±6.64 15.78a±1.35

13.17a±1.45

12.00b±0.93

13.22b±1.86

Sb NT 3.3

(NHÓM VK PHÂN

LẬP TỪ NƢỚC

69

THẢI)

Hình 3.18: Biểu đồ thể hiện vòng ức chế trung bình nấm mốc của vi khuẩn

70

Bacillus spp. trong nhóm phân lập từ phụ phế phẩm.

Hình 3.19 : Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốccủa vi khuẩn Bacillus

71

spp. trong nhóm phân lập từ đất.

Hình 3.20 : Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của vi khuẩn Bacillus

72

spp.trong nhóm phân lập từ đất.

 Phân tích ANOVA (phân tích phương sai) cho thấy vòng ức chế nấm mốc

Aspergillus spp. của nhóm vi khuẩn Bacillus spp.thể hiện rõ nhất là vào ngày

thứ 3 với độ tin cậy 95%.(xem hình 3.17).

 Trong số 10 chủng Bacillus spp. do phòng thí nghiệm cung cấp thì D9 thể hiện

rõ nhất đường kính vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp.như hình 3.16 và

cũng có đường kính vòng ức chế trung bình tương đối đồng đều đối với tất cả

các loại nấm mốc như biểu đồ hình 3.19.

 Số đo đường kính vòng ức chế trung bình của D9 dao động từ khoảng 14,11-

21,33 (mm) như bảng 3.8 đây là số đo vòng ức chế cao nhất trong nhóm vi

khuẩn Bacillus spp.phân lập từ đất và cao so với các nhóm vi khuẩn Bacillus

spp.còn lại (nhóm vi phân lập từ phụ phế phẩm và nước thải).

 Trong từng nhóm phân lập Bacillus spp.:

 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1b có khả năng kháng nấm mốc cao

nhất vì thông qua biểu đô 3.18 cho thấy sự bao phủ của nó so với các vi

khuẩn còn lại rộng hơn.

 Thông qua biểu đồ 3.19, sự bao phủ của vi khuẩn D9 đối với các chủng nấm

mốc rộng hơn chủng vi khuẩn Paenibacillus trong nhóm phân lập từ đất.

 Biểu đồ 3.20 sự bao phủ vòng ức chế đối kháng của vi khuẩn Sb.NT 3.3 khá

rộng so với các chủng vi khuẩn còn lại.

 Số đo vòng ức chế trung bình (mm) của D9 đối với các nhóm nấm mốc

Aspergillus spp.như sau (bảng 3.8) : nấm ĐN3 là 21,33 mm, nấm ĐN2 là

17,83mm,nấm CĐP1 là 14.11mm, nấm CĐP2 là 19.11mm và nấm HCP2 là

73

19.72mm.

 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp.:

Hình 3.21: Đối chứng ĐN3 (a) - LC7-7- ĐN3 (b) - LC1-1- ĐN3 (c).

74

Hình 3.22: Đối chứng CĐP1 (a)- LC7-7- CĐP1 (b)- L5-CĐP1 (c).

 So sánh vòng ức chế nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp.mạnh nhất ở

các nhóm với nhau:

Hình 3.23: So sánh vòng ức chế nấm mốcgiữa các nhómvi khuẩn Lactobacillus

75

spp.với nhau LC7-7-HCP2(a)-LC1-1-HCP2(b)-L5-HCP2(c).

Bảng 3.9: Thống kê số liệu vòng ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp.theo từng nhóm trong phƣơng pháp đặt thạch khuếch

tán.(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

20.72a±6.01 14.06a±3.70 23.17a±3.33 17.28a±9.89 16.61a±4.32

L5

12.00b±0.76 10.78b±0.69 12.78b±1.07 11.39a±0.10 11.67b±1.44

NHÓM L6 VK

11.78b±0.63 12.11b±0.25 11.78b±0.42 11.89a±0.54 13.11ab±1.23

PHÂN LN3-5

LẬP

12.11b±0.25 11.39b±1.21 14.50b±1.69 12.94a±0.92 11.39b±1.23

TỪ LN3-7

14.17b±0.76 13.56ab±0.59 11.89b±0.77 14.50a±0.87 13.44ab±0.51

NEM

14.33b±4.19 10.94b±2.06 12.22b±1.84 12.72a±1.06 13.61ab±0.77

LN2-5

LN2-7

LC7-7 12.11ab±0.63 11.78b±0.98 11.61b±0.54 11.22b±0.25 11.67bc±1.44

10.17b±0.29 10.44b±0.77 10.00b±0.00 10.00b±0.00

10.11c±0.19

NHÓM LC6-5 VK

PHÂN LC1-1 11.44ab±0.35 18.39a±6.83 15.94a±3.38 17.22a±3.96 16.78a±3.42

LẬP

12.72a±1.99 11.06ab±0.25 12.83ab±0.44 11.61b±1.46 14.22ab±0.77

TỪ LC3-3 CƠM

76

MẺ

Bảng 3.10: So sánh số liệu vòng ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm trong phƣơng pháp đặt thạch

khuếch tán. (dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

20.72a±6.01

14.06a±3.70

23.17a±3.33

17.28a±9.89

16.61a±4.32

L5

(NHÓM VK PHÂN

LẬP TỪ NEM)

11.44b±0.35

18.39a±6.83

15.94a±3.38

17.22a±3.96

16.78a±3.42

LC1-1

(NHÓM VK PHÂN

77

LẬP TỪ CƠM MẺ)

78

Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. từ nem.

79

Hình 3.25: Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. từ cơm mẻ.

 Xử lí số liệu ANOVA (phân tích phương sai) với độ tin cậy 95% thì kết quả cho

thấy đường kính vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp.của nhóm vi khuẩn

Lactobacillus spp. thể hiện rõ nhất là vào ngày thứ 3.

 Trong số 10 chủng Lactobacillus spp.do phòng thí nghiệm cung cấp thì L5 thể

hiện rõ nhất đường kính vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp.như hình 3.22 và

cũng có vòng ức chế trung bình tương đối đồng đều ở tất cả các loại nấm mốc

thể hiện qua độ bao phủ nó đối với các vi khuản khác như biểu đồ hình 3.24.

 Số đo đường kính vòng ức chế trung bình của L5 dao động từ khoảng 14,06-

20.72 (mm) như bảng 3.10 đây là số đo vòng ức chế cao nhất trong nhóm vi

khuẩn phân lập từ nem và cao so với nhóm vi khuẩn lactic còn lại (nhóm vi

phân lập từ cơm mẻ ).

 Số đo vòng ức chế trung bình (mm) của L5 đối với các nhóm nấm mốc

Aspergillus spp. như sau (bảng 3.10) : nấm ĐN3 là 20.72 mm, nấm ĐN2 là

14,08mm, nấm CĐP1 là 23.17mm, nấm CĐP2 là 17,28mm và nấm HCP2 là

16,61mm

Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đối kháng trực tiếp theo cách

đặt thạch khuếch tán :

 Ưu điểm :

 Phương pháp này thấy rõ được vòng ức chế nấm mốc của vi khuẩn.

 Sai số trong các lần lặp lại của một nghiệm thức tương đối thấp, vì hệ số CV

(hệ số biến thiên) trong ANOVA chỉ dao động từ 3-10%.

 Nấm mốc sau khi tạo huyền phù không bị bay bào tử làm ảnh hưởng kết quả.

 Nhược điểm :

80

 Phức tạp ở bước tạo huyền phù các chủng nấm mốc Aspergillus spp.

3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phƣơng pháp đỗ

dĩa của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với các

chủng nấm mốc Aspergillus spp.:

 Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.nên ở mỗi ta sẽ sắp

xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau:

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm:

 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4.

 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus.

 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3.

 Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm:

 Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5.

 Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3.

 Thử nghiệm đối kháng nấm mốc với 2 chủng vi khuẩn ta sử dụng 5 chủng nấm

81

mốc Aspergillus spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

 Đối với vi khuẩn Bacillus spp.:

Hình 3.26 : Đối chứng HCP2(a) – D9-HCP2(b) – CS1b-HCP2(c) –

82

Sb. NT 3.3-HCP2(d).

Hình 3.27 : Đối chứng ĐN3(a) – D9- ĐN3 (b) – CS1b- ĐN3 (c) -

83

Sb. NT 3.3-ĐN3 (d).

Bảng 3.11: Thống kê số liệu trung bình ức chế nấm mốc của các chủng vi

khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm trong phƣơng pháp đối kháng che phủ

bằng cách đổ dĩa.

40-60.00%

0-30.00%

40-60.00%

0-30.00%

0-30.00%

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

VK4 NHÓM

40-60.00%

0-30.00%

40-60.00%

0-30.00%

40-60.00%

VK CS1a PHÂN

LẬP TỪ

40-60.00% 40-60.00% 40-60.00%

70-

70-

CS1b

PHỤ

100.00%

100.00%

PHẾ

40-60.00% 40-60.00%

0-30.00%

40-60.00%

40-60.00%

PHẨM CS1+

40-60.00%

70-

70-

40-60.00% 40-60.00%

NHÓM D9

100.00%

100.00%

VK

PHÂN

40-60.00%

40-60.00%

0-30.00%

40-60.00%

0-30.00%

0-30.00%

40-60.00%

0-30.00%

LẬP TỪ Paenibacillus 40-60.00% 40-60.00% ĐẤT

Sb NT 1.3 NHÓM

40-60.00% 40-60.00%

0-30.00%

40-60.00%

40-60.00%

VK Sb NT 2.3 PHÂN

LẬP TỪ

40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00%

0-30.00%

Sb NT 3.3

40-60.00% 40-60.00%

40-60.00%

40-60.00%

40-60.00%

NƢỚC

84

Sb NT 1.4 THẢI

Bảng 3.12 : Sắp xếp trung bình ức chế giữa các vi khuẩn Bacillus spp. giữa

các nhóm với nhau đối với nấm mốc theo phƣơng pháp đối kháng che phủ

theo đỗ dĩa.

NHÓM VI KHUẨN

VK4, CS1a, Sb.NT 3.3, Sb NT 1.3 KHÔNG HOẶC ĐỐI KHÁNG YẾU

Sb NT 1.4, CS1+, Paenibacillus ĐỐI KHÁNG TRUNG BÌNH

CS1b, D9, Sb NT 3.3 ĐỐI KHÁNG MẠNH

 Sau khi sắp xếp lại bằng bảng ta thấy được trung bình ức chế thể hiện rõ nhất là

ở ngày quan sát kết quả thứ 3, khi đó nấm ở các dĩa đối chứng đã phát triển

mạnh nhất đồng thời thể hiện rõ được sự đối kháng của các chủng vi khuẩn

Bacillus spp.

 Trong đó, vi khuẩn CS1b, D9, Sb N.T 3.3 là các vi khuẩn có sự đối kháng thể

hiện rõ nhất và cho thấy được khuẩn lạc rời rạc rõ ràng nhất (hình 3.26 và 3.27).

Ngoài ra, CS1b còn thể hiện được sự đối kháng đồng đều ở các chủng nấm mốc

85

Aspergillus spp. khác nhau.( bảng 3.12).

 Đối với Lactobacillus spp. :

86

Hình 3.31 : Đối chứng CĐP2 (a) – LC1-CĐP2 (b) – L5-CĐP2 (c) – LN2-5- CĐP2 (d).

87

Hình 3.32 : Đối chứng ĐN3 (a) – LC1-ĐN3 (b) – L5-ĐN3 (c) - LN2-5- ĐN3 (d).

Bảng 3.13: Thống kê số liệu trung bình ức chế nấm mốc của các chủng vi

khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm trong phƣơng pháp đối kháng che

phủ bằng cách đổ dĩa.

0-30.00%

40-60.00%

40-60.00% 40-60.00%

0-30.00%

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

L5

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

NHÓM L6 VK

40-60.00% 40-60.00%

0-30.00%

40-60.00%

40-60.00%

PHÂN LN3-5

LẬP TỪ

0-30.00%

40-60.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

NEM LN3-7

70-

70-

70-

40-

70-100.00%

LN2-5

100.00%

100.00%

100.00%

60.00%

0-30.00%

40-60.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

LN2-7

LC7-7

0-30.00%

40-60.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

NHÓM LC6-5 VK

PHÂN

0-30.00% 40-60.00% 40-60.00%

40-

40-60.00%

LC1-1

LẬP TỪ

60.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00%

0-30.00% 40-60.00%

88

CƠM LC3-3 MẺ

Bảng 3.14: Sắp xếp trung bình ức chế giữa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. trong các nhóm phân lập khác nhau theo phƣơng pháp đối kháng che phủ

NHÓM VI KHUẨN

L6, LN3-7, LC7-7, LC6-5, LN2-7 KHÔNG HOẶC ĐỐI KHÁNG YẾU

L5, LN3-5, LC1-1, LC3-3 ĐỐI KHÁNG TRUNG BÌNH

LN2-5 ĐỐI KHÁNG MẠNH

 Sau khi sắp xêp theo nhóm đối kháng, ta thấy được trung bình ức chế thể hiện

rõ nhất là ở ngày quan sát kết quả thứ 3, khi đó nấm ở các dĩa đối chứng đã phát

triển mạnh nhất đồng thời thể hiện rõ được sự đối kháng của các chủng vi

khuẩn Lactobacillus spp..

 Trong đó, vi khuẩn LN2-5 (L3) là vi khuẩn có sự đối kháng thể hiện rõ nhất và

cho thấy được khuẩn lạc rời rạc rõ ràng nhất (hình 3.31 và 3.32). Ngoài ra, vi

khuẩn LN2-5 còn thể hiện sự đối kháng mạnh ở chỗ nó đã tăng trưởng lên lớp

thạch PDA có chứa nấm, ức chế nấm mốc để chúng không mọc được.

Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đối kháng che phủ theo cách đặt

đổ dĩa :

 Ưu điểm :

 Có thể nuôi cấy vi sinh vật đặc trưng trên 2 lớp môi trường khác nhau. Vi

khuẩn Bacillus spp. trên môi trường NA và vi khuẩn Lactobacillus spp. trên

môi trường MRS và sau đó thêm một lớp PDA phía trên.

89

 Nhược điểm :

 Phức tạp ở bước tạo huyền phù các chủng nấm mốc Aspergillus spp.

 Không thấy rõ được vòng ức chế nấm mốc của vi khuẩn.

 Khó theo dõi được độ đông của môi trường.

3.6. So sánh các phƣơng pháp đối kháng lại các chủng nấm mốc của 20

chủng vi khuẩn thí nghiệm thông qua cách chấm điểm LSD (sai số khác

biệt nhỏ nhất) :

 Dựa theo xử lí số liệu của ANOVA (phần mềm phân tích phương sai) , ta có thể

chấm điểm của các chủng vi khuẩn thí nghiệm theo từng phương pháp đối

kháng khác nhau để từ đó tìm ra sự tương đồng của các phương pháp với nhau.

 Ở đây, ta có 20 chủng vi khuẩn thí nghiệm của 2 nhóm vi khuẩn có lợi là

Bacillus spp. và Lactobacillus spp , mỗi chủng có 10 vi khuẩn. Ta có thể chia

theo thang điểm 10 tương đương với các thứ hạng (a,b,c… ) trong xử lí SAS

9.1.

90

 Đối với Bacillus spp. ta có bảng sau :

Bảng 3.15 : Thống kê điểm của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phƣơng pháp dựa theo xếp hạng LSD.

VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

PHƢƠNG

PHÁP ĐỐI

KHÁNG

TRỰC TIẾP

(CẤY 2

ĐƢỜNG VI

KHUẨN)

PHƢƠNG

PHÁP ĐỐI

KHÁNG

TRỰC TIẾP

(ĐẶT THẠCH

KHUẾCH

TÁN)

PHƢƠNG

PHÁP ĐỐI

KHÁNG CHE

PHỦ (ĐỖ

DĨA)

91

Nystatin VK4 CS1a CS1b CS1+ D9 Paenibacillus Sb NT 1.4 Sb NT 1.3 Sb NT 2.3 Sb NT 3.3 VK4 CS1a CS1b CS1+ D9 Paenibacillus Sb NT 1.4 Sb NT 1.3 Sb NT 2.3 Sb NT 3.3 VK4 CS1a CS1b CS1+ D9 Paenibacillus Sb NT 1.4 Sb NT 1.3 Sb NT 2.3 Sb NT 3.3 8.0 9.0 6.0 10.0 7.0 10.0 10.0 8.0 7.0 7.0 7.0 7.0 8.0 9.0 8.0 10.0 8.0 7.0 8.0 7.0 10.0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 9.0 4.0 8.0 10.0 7.0 9.0 9.0 8.0 5.0 6.0 7.0 8.0 8.0 9.0 8.0 10.0 9.0 8.0 8.0 8.0 8.0 1 1 3 2 2 2 2 2 2 2 8.0 6.0 8.0 10.0 7.0 8.0 9.0 10.0 9.0 7.0 9.0 5.0 5.0 9.0 6.0 10.0 6.0 6.0 7.0 5.0 8.0 1 2 3 2 2 2 2 1 2 2 TỔNG ĐIỂM 36.0 30.0 38.0 49.0 35.0 43.0 41.0 37.0 32.0 30.0 34.0 34.0 36.0 44.0 40.0 50.0 43.0 36.0 40.0 35.0 44.0 7.0 8.0 12.0 9.0 12.0 10.0 10.0 7.0 9.0 10.0 XẾP HẠNG 6 10 4 1 7 2 3 5 9 10 8 7 5 2 4 1 3 5 4 6 2 5 4 1 3 1 2 2 5 3 2 3.0 4.0 10.0 9.0 10.0 7.0 7.0 6.0 6.0 5.0 6.0 8.0 8.0 9.0 9.0 10.0 10.0 8.0 9.0 8.0 9.0 2 2 2 1 3 2 2 1 1 2 8.0 7.0 6.0 10.0 4.0 9.0 6.0 5.0 5.0 5.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 10.0 7.0 8.0 7.0 9.0 1 1 2 2 3 2 2 1 2 2

 Đối với Lactobacillus sp ta có bảng sau :

Bảng 3.15 : Thống kê điểm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng phƣơng pháp dựa theo xếp hạng LSD.

VI ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2

PHƢƠNG

PHÁP ĐỐI

KHÁNG

TRỰC TIẾP

(CẤY 2

ĐƢỜNG VI

KHUẨN)

PHƢƠNG

PHÁP ĐỐI

KHÁNG

TRỰC TIẾP

(ĐẶT THẠCH

KHUẾCH

TÁN) KHUẨN ĐN3 9.0 Nystatin 9.0 L5 8.0 L6 9.0 LC7-7 9.0 LC6-5 9.0 LN3-5 9.0 LN3-7 9.0 LN2-7 10.0 LN2-5 9.0 LC1-1 9.0 LC3-3 10.0 L5 9.0 L6 9.0 LC7-7 8.0 LC6-5 9.0 LN3-5 9.0 LN3-7 9.0 LN2-7 9.0 LN2-5 9.0 LC1-1 9.0 LC3-3 7.0 10.0 9.0 8.0 8.0 8.0 8.0 10.0 10.0 10.0 8.0 10.0 7.0 8.0 7.0 8.0 9.0 8.0 7.0 9.0 8.0 4.0 9.0 7.0 5.0 9.0 5.0 6.0 8.0 10.0 10.0 5.0 10.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 10.0 10.0 10.0 6.0 10.0 9.0 5.0 10.0 7.0 8.0 9.0 9.0 10.0 10.0 10.0 8.0 8.0 7.0 8.0 8.0 9.0 9.0 10.0 9.0 5.0 9.0 8.0 5.0 8.0 6.0 6.0 9.0 10.0 7.0 6.0 10.0 10.0 9.0 9.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 TỔNG ĐIỂM 31.0 47.0 41.0 32.0 44.0 35.0 37.0 45.0 49.0 46.0 38.0 50.0 43.0 43.0 40.0 44.0 45.0 45.0 45.0 48.0 46.0 XẾP HẠNG 9 2 5 10 4 8 7 4 1 3 6 1 6 6 7 5 4 4 4 2 3

PHƢƠNG

PHÁP ĐỐI

KHÁNG CHE

PHỦ (ĐỖ

DĨA)

92

L5 L6 LC7-7 LC6-5 LN3-5 LN3-7 LN2-7 LN2-5 LC1-1 LC3-3 2 1 1 1 2 1 1 3 2 1 2 1 1 1 2 1 1 2 2 1 2 1 1 2 2 2 2 3 2 1 2 1 1 1 2 1 1 3 2 1 2 1 1 1 2 1 1 3 2 2 10.0 5.0 5.0 6.0 10.0 6.0 6.0 14.0 10.0 6.0 2 4 4 3 2 3 3 1 2 3

 Sau khi xếp hạng theo các phương pháp, ta dùng cách chấm điểm dựa theo sai

số khác biệt nhỏ nhất (LSD) trong xử lí số liệu thống kê có độ tin cậy là 95% thì

có được thứ hạng của các chủng vi khuẩn :

 Theo các phương pháp đối kháng trực tiếp cấy 2 đường vi khuẩn thì các

vi khuẩn Bacillus spp. có CS1b xếp hạng 1, D9 xếp hạng 2, Paenibacillus

xếp hạng 3. Các vi khuẩn Lactobacillus spp. có LN2-5 xếp hạng 1, L5

xếp hạng 2 và LC1-1 xếp hạng 3.

 Trong phương pháp đối kháng trực tiếp đặt thạch khuếch tán thì các vi

khuẩn Bacillus spp. có D9 xếp hạng 1, CS1b và Sb NT 3.3 xếp hạng 2 và

Paenibacillus xếp hạng 3. Các vi khuẩn Lactobacillus spp. có L5 xếp

hạng 1, LC1-1 hạng 2 và LC 3-3 xếp hạng 3.

 Trong phương pháp đối kháng che phủ thì các vi khuẩn Bacillus spp. D9

xếp hạng 1, Sb.NT 3.3 xếp hạng 2 và Paenibacillus, Sb NT 1.4 và Sb.NT

2.3 xếp hạng 3.Các vi khuẩn Lactobacillus spp. có LN2-5 xếp hạng 1,

LN3-5, L5 và LC1-1 xếp hạng 2

 Từ đó, ta thấy được điểm tương đồng giữa các phương pháp cấy 2 đường vi

khuẩn và đặt thạch khuếch tán có sự xếp hạng giữa các vi khuẩn đối kháng nấm

mốc. Nhưng trong phương pháp đặt thạch khuếch tán, nó thể hiện đường kính

vòng ức chế rõ ràng hơn và có độ sai số không quá khác biệt nên phương pháp

đặt thạch khuếch tán là khả quan nhất và thích hợp trong điều kiện phòng thí

93

nghiệm của trường.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận :

 Hoạt hóa lại các chủng vi khuẩn và các chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí

nghiệm. Trong đó, có 3 chủng vi khuẩn CS1a, CS1+, VK4 chưa được định danh

sơ bộ trước đó. Và đã được định danh sơ bộ lại bằng sinh lý và sinh hóa để

khẳng định lại là chủng Bacillus spp.

 Trong phƣơng pháp đối kháng trực tiếp bằng cách cấy 2 đƣờng vi khuẩn :

Vi khuẩn Bacillus spp. CS1b thể hiện khả năng đối kháng với tất cả các

chủng nấm mốc Aspergillus spp. cho tỉ lệ ức chế khá cao từ khoảng 40.00-

53.00% tương ứng với tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc Aspergillus spp. của

LN2-5 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. là khoảng 36.00-68.00%.

 Trong phƣơng pháp đối kháng trực tiếp bằng cách đặt thạch khuếch tán:

Vi khuẩn Bacillus spp. D9 thể hiện rõ đường kính vòng ức chế đối kháng

với các chủng nấm mốc Aspergillus spp. khoảng 14.00-21.00(mm)và cho

kết quả rất đồng đều ở các lần lặp lại. Tương tự, đối với các chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp. L5 đối kháng với các chủng nấm mốc Aspergillus spp.

khoảng 15.00-20.00(mm) cũng đạt kết quả vòng ức chế cao và đồng đều.

 Trong phƣơng pháp đối kháng che phủ bằng cách đỗ dĩa, không thể định

lượng chính xác khả năng ức chế, nhưng kết quả không mâu thuẫn với hai

phương pháp trên.

 Theo bảng chấm điểm trên, ta thấy có được nhiều điểm tương đồng của giữa 2

phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách cấy 2 đường vi khuẩn (cho thấy tỉ lệ

ức chế) và đặt thạch khuếch tán (cho thấy được đường kính vòng ức chế). Còn

phương pháp đối kháng che phủ không thể hiện được điểm tương đồng và

không định lượng rõ ràng sự ức chế như 2 phương pháp trên. Vì vậy, 2 phương

pháp đối kháng trực tiếp là cấy 2 đường vi khuẩn và đặt thạch khuếch tán cho

nên được áp dụng trong việc đối kháng nấm mốc trong phòng thí nghiệm của

94

trường.

 Chủng vi khuẩn CS1b, D9 và LN2-5, LC1-1 cho thấy được khả năng kháng

nấm cao có thể ứng dụng thực tế trong việc bảo quản các hạt nông sản như :

 Sử dụng CS1b để bảo quản hạt đậu phộng, D9 để bảo quản hạt hạt cà

phê…

 Sử dụng LN2-5 và LC1-1 để bảo quản hạt đậu phộng.

2. Đề nghị :

 Kiểm chứng các lại rõ hơn các phương pháp đối kháng được nêu trên bằng cách

tăng số lượng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. nhiều hơn và phân

lập thêm các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao.

 Bổ sung phương pháp khảo sát khả năng ức chế in vivo va so sánh sự tương

95

quan với các thí nghiệm in vitro .

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt:

1.Phan Thị Ngọc Ái (2014) “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm

của vi khuẩn Lactic”. Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM.

2.Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm- Dùng trong công nghệ

sinh học. NXB Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội, trang 184-188.

3.Văn Hương (2015) “ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng

bảo quả nông sản”. Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM.

4.Nguyễn Thị Thúy Hằng “ Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân và

kích thích tăng trưởng cây trồng”. Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM.

5.Nguyễn Đức Lượng (2002). Công nghệ vi sinh vật tập 2 Vi sinh vật học công

nghiệp. NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM, trang 33 – 34.

6.Phan Huỳnh Mai Nhi (2015) “Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có

khả năng phân hủy protein trong nước thải chế biến thủy sản”. Trường Đại Học

Công Nghệ TP.HCM.

7.Phan Nguyễn Hương Thảo (2015) “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm

thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5”.

Trường Đâị Học Công Nghệ TP.HCM.

Tài liệu Tiếng Anh:

8.Mounyr Balouiri, Moulay Sadiki, Saad Koraichi Ibnsouda .2011. Methods for

in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical

96

Analysis: 71-79.

9..Nora Laref, Bettache Guessas. 2013. Antifungal activity of newly isolates of

lactic acid bacteria. Department of Biology, Faculty of Sciences, Laboratory of

Applied microbiology, University of ES- Senia of Oran, Box 16, Es- Senia 31100,

Oran, Algeria: 80-88.

10.Ajay Kumar, Pragati Saini, J N Shrivastava. 2009. Prodution of peptide

antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis.Indian Jouranal of

Experimental Biology: 57-62.

11. K.K .Sharma, U.S. Singh, Pankaj Sharma, Ashish Kummar and Lalan

Sharma. 2008. Seed treatments for sustainable agriculture- A review: 521-539.

12.Rositsa Tropcheva, Dilyana Nikolova, Yana Evstatieva, Svetla Danova.

2014. Antifunal activity and indentification of Lactobacilli, inolated from

traditional dairy product “katak”.Anaerobe: 78-84.

13.Francesco Vinale, Krishnapillai Sivasithamparam, Emilio L. Ghisalberti,

Sheridan L.Woo. 2014. Trichoderma secondary Metabolites Active on Plant and

Fungal Pathogens.The Open Mycology Journal (Suppl-1,M5): 127-139.

13.http://luanvan.co/luan-van/chuyen-de-ngo-doc-thuc-pham-o-nguoi-do-

Tài liệu Internet:

doc-to-nam-moc-54187/

14.https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-

textbook/fungi-24/characteristics-of-fungi-149/fungi-cell-structure-and-function-

590-11809/

15.http://luanvan.co/luan-van/phan-lap-vi-khuan-bacillus-subtilis-tu-dat-

97

khao-sat-kha-nang-uc-che-san-sinh-aflatoxin-cua-cac-chung-phan-lap-duoc-2475/

16.http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-nghien-cuu-kha-nang-sinh-hoat-chat-

doi-khang-vi-sinh-vat-gay-benh-cho-cay-trong-cua-cac-chung-nam-soi-phan-lap-

42864/

17.http://www.zbook.vn/ebook/nghien-cuu-kha-nang-sinh-hoat-chat-doi-

khang-vi-sinh-vat-gay-benh-cho-cay-trong-cua-cac-chung-nam-soi-phan-lap-tu-

rung-42467/

18.http://tailieu.tv/tai-lieu/chuong-ii-ung-dung-vi-sinh-vat-trong-bao-quan-

thuc-pham-24205/

19.http://nguyeninvestment.com/luan-van/luan-van-khao-sat-tinh-khang-

nam-gay-benh-cay-va-nam-sinh-doc-to-afelatoxin-cua-san-pham-chiet-xuat-tu-

xoan-chiu-han-20334/

20.http://jos.hueuni.edu.vn/index.php/TCKHDHH/article/view/1552

21.http://bvtvld.gov.vn/quan-ly-thuoc-bao-ve-thuc-vat/1063-dac-diem-cua-

hoat-chat-metalaxyl-trong-phong-tru-benh-hai-cay-trong.html

22.http://bvtvphutho.vn/Home/hieubietthuocbvtv/2009/142/Dac-diem-cua-

nhom-thuoc-tru-benh.aspx

23.http://www.bvtvld.gov.vn/quan-ly-thuoc-bao-ve-thuc-vat/1013-dac-diem-

98

cua-hoat-chat-mancozeb-trong-phong-tru-dich-hai-cay-trong.html

PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƢỜNG

 Thành phần môi trường PDA: (Potato Dextrose Agar):

 Khoai tấy 200g

 D-Glucose 20g

 Agar 1%

 Nước cất 1000ml

 Thành phần môi trường NA:

 Pepton 5g

 Cao thịt 3g

 NaCl 5g

 Agar 20g

 Nước cất 1000ml

 Thành phần môi trường NB:

 Pepton 5g

 Cao thịt 3g

 NaCl 5g

 Nước cất 1000ml

 Thành phần môi trường MRS agar:

 Tween 80 1ml

 Cao thịt 10g

 Pepton 5g

 Yest Extract 5g

 D-glucose 10g

 Diamonium Citrate 2g

 MgSO4.7H2O 0.2g

 MgSO4.4H2O 0.2g

 K2PO4 2g

1

 Nước cất 1000ml

 Agar 2%

 Thành phần môi trường MRS Broth:

1ml  Tween 80

10g  Cao thịt

5g  Pepton

5g  Yest Extract

10g  D-glucose

 Diamonium Citrate 2g

0.2g  MgSO4.7H2O

0.2g  MgSO4.4H2O

2g  K2PO4

 Nước cất 1000ml

 Thành phần môi trường MRS Cải tiến:

1ml  Tween 80

10g  Cao thịt

5g  Pepton

5g  Yest Extract

10g  D-glucose

0.2g  MgSO4.7H2O

0.2g  MgSO4.4H2O

2g  K2PO4

 Nước cất 1000ml

 Agar 2%

 Thành phần nước muối sinh lí 85%:

 NaCl 8.5g

 Tween 80 1ml

2

 Nước cất 1000ml

PHỤ LỤC A

Đặc điểm sinh lý- sinh hóa của vi sinh vật

CÁC CHỦNG LACTOBACILLUS SP:

Trích từ đồ án “ Phân lập vi khuẩn Lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm”- Lưu Đại Kim Phượng (2016).

Quan sát khuẩn lạc Quan sát nhuộm Gram Thử nghiệm di động Thử nghiệm lên men đƣờng Kí hiệu chủng phân lập

LN2-5

LN2-7

3

LN3-5

LC1-1

LC3-3

LC7-7

4

LC6-5

LN3-7

Thử nghiệm lên men đƣờng Quan sát nhuộm Gram Kí hiệu chủng phân lập Thử nghiệm di động

L5

5

L6 (Trích từ đồ án” Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5”)

CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.:

Kí hiệu chủng phân lập Quan sát nhuộm Gram Quan sát nhuộm bào tử Thử nghiệm Catalase Thử nghiệm di động

+ +

D9(Trích từ đồ án: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân và khhh thích tăng trưởng cây trồng”- Nguyễn Thị Thúy Hằng) Paenibacillus (Trích từ đồ án:” Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm”-Phạm Ngọc Yến Trinh) -2015

+ +

6

Sb. NT 1.3(Trích từ đồ án: “Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nước thải chế biến thủy sản”- Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015

+ +

Sb. NT 1.4(Trích Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015

+ +

Sb. NT 2.3(Trích Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015

+ +

Sb. NT 3.3(Trích Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015

+ +

7

CS1b (Trích từ đề tài: “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản)- Eureka Văn Hương)

CS1+

+ +

CS1a

+ +

VK4

8

+ +

PHỤ LỤC B

Hình ảnh các phƣơng pháp đối kháng nấm mốc Aspergillus sp. của các chủng

vi khuẩn

PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (CẤY RIA 2 ĐƢỜNG VI

KHUẨN):

Từ trái sang phải: Đối chứng CĐP1 (a)-Nystatin- CĐP1 (b)-Paenibacillus-

CĐP1(c). Đối chứng CĐP2(a)- Nystatin-CĐP2 (b)-CS1b-CĐP2(c).

9

Từ trái sang phải:Đối chứng ĐN3(a)- Nystatin- ĐN3(b)-CS1b-ĐN3(c). Đối chứng ĐN2 (a)- Nystatin- ĐN2(b)-Sb NT 1.4-ĐN2(cHình: Đối chứng HCP2(a)-Nystatin- HCP2(b)-CS1b-HCP2(c).

Hình từ trái sang phải: Đối chứng CĐP1(a)- Nystatin-CĐP1(b) -LN2-5-

CĐP1(c).Đối chứng CĐP2(a)- Nystatin-CĐP2(b) –LC1-1-CĐP2(c).

10

Từ trái sang phải: Đối chứng ĐN3(a)-Nystatin-ĐN3(b)- LN2-5-ĐN3 (c). Đối chứng ĐN2 (a)- Nystatin ĐN2 (b) –LC1-1-ĐN2(c).Đối chứng HCP2 (a)- Nystatin- HCP2(b) -LN2-5-HCP2(c).

PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (ĐẶT THẠCH KHUẾCH TÁN):

Từ trái sang phải: Đối chứng ĐN3 (a)- Sb NT 1.4- ĐN3 (b)- Sb NT 3.3- ĐN3 (c). Đối chứng ĐN2 (a)- Sb NT 1.4- ĐN2 (b)- D9- ĐN2 (c).

Từ trái sang phải: Đối chứng CĐP1 (a)- Sb NT 1.4- CĐP1 (b)- D9- CĐP1 (c). Đối

chứng CĐP2 (a)- Sb NT 1.4- CĐP2 (b)- CS1b- CĐP2 (c).

Từ trai sang phải: Đối chứng ĐN3 (a)- LC7-7- ĐN3 (b)- L5- ĐN3 (c)- Đối chứng

11

CĐP1 (a)- LC7-7- CĐP1 (b)- L5-CĐP1 (c).

Từ trái sang phải: Đối chứng CĐP2 (a)- LC7-7- CĐP2 (b)- L5- CĐP2 (c)- Đối

chứng HCP2 (a)- LC7-7-HCP2 (b)- L5-HCP2 (c).

PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG CHE PHỦ (ĐỖ DĨA):

12

Từ trái sang: Đối chứng CĐP1 (a)- CS1b-CĐP1(b)-D9-CĐP1 (c)-Sb NT3.3-CS1b (d)- Đối chứng ĐN2 (a)-CS1b-ĐN2 (b)- D9-ĐN2 (c)-Sb.NT3.3-ĐN2 (d).

13

Từ trái sang phải: Đối chứng ĐN2(a)-C1-ĐN2(b)-L5-ĐN2(c)-LN2-5-ĐN2(d)- Đối chứng CĐP1(a)- C1-CĐP1(b)-L5-CĐP1(c)-LN2-5-CĐP1(d).

PHỤ LỤC C

Xử lí số liệu thông qua phần mềm SAS 9.1

PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (CẤY 2 ĐƢỜNG VI KHUẨN):

KẾT QUẢ 3 NGÀY

DN3:

TI LE UC CHE NAM DN3 21:09 Thursday, July 23, 2016 10

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

DN3 11 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 DCNYSTAT

Number of Observations Read 33

Number of Observations Used 33

TI LE UC CHE NAM DN3 21:09 Thursday, July 23, 2016 11

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TILEKHANG

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 10 4725.825764 472.582576 27.65 <.0001

Error 22 376.009333 17.091333

Corrected Total 32 5101.835097

R-Square Coeff Var Root MSE TILEKHANG Mean

0.926299 10.54146 4.134167 30.52970

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

DN3 10 4725.825764 472.582576 27.65 <.0001

TI LE UC CHE NAM DN3 21:09 Thursday, July 23, 2016 12

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for TILEKHANG

14

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 22

Error Mean Square 17.09133

Critical Value of t 2.07387

Least Significant Difference 7.0004

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N DN3

A 44.583 3 5 (D9)

A

B A 40.760 3 4 (CS1b)

B A

B A 40.757 3 8 (Paenibacillus)

B A

B A C 38.910 3 1 (VK4)

B C

B D C 36.300 3 7 (NT 1.4)

D C

D C 32.797 3 DCNYSTAT

D

D 31.207 3 6 (NT 3.3)

D

D 29.933 3 9 (NT 2.3)

E 21.330 3 10 (NT 1.3)

E

E 16.710 3 3 (CS1+)

F 2.540 3 2 (CS1a

15

DN2:

TI LE UC CHE NAM DN2 21:09 Thursday, July 23, 2016 13

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

DN2 11 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 DCNYSTAT

Number of Observations Read 33

Number of Observations Used 33

TI LE UC CHE NAM DN2 21:09 Thursday, July 23, 2016 14

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TILEKHANG

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 10 2954.889655 295.488965 29.16 <.0001

Error 22 222.952200 10.134191

Corrected Total 32 3177.841855

R-Square Coeff Var Root MSE TILEKHANG Mean

0.929842 9.802007 3.183424 32.47727

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

DN2 10 2954.889655 295.488965 29.16 <.0001

TI LE UC CHE NAM DN2 21:09 Thursday, July 23, 2016 15

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for TILEKHANG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 22

16

Error Mean Square 10.13419

Critical Value of t 2.07387

Least Significant Difference 5.3905

Means with the same letter are not significantly different

t Grouping Mean N DN2

A 52.743 3 4 (CS1b)

B 43.500 3 5 (D9)

B

C B 39.387 3 DCNYSTAT

C

C D 35.280 3 1 (VK4)

D

E D 32.197 3 8 (Paenibacillus)

E D

E D 30.657 3 2 (CS1a)

E

E F 29.283 3 10 (NT1.3)

E F

E F 27.403 3 9 (NT 2.3)

F

F 25.007 3 7 (NT 1.4)

F

F 25.007 3 6 (NT 3.3)

G 16.787 3 3 (NT CS1+)

17

HCP2:

TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 24

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

HCP2 11 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 DCNYSTAT

Number of Observations Read 33

Number of Observations Used 33

TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 25

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TILEKHANG

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 10 6163.394539 616.339454 46.28 <.0001

Error 22 292.956067 13.316185

Corrected Total 32 6456.350606

R-Square Coeff Var Root MSE TILEKHANG Mean

0.954625 10.30976 3.649135 29.64424

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

HCP2 10 6163.394539 616.339454 46.28 <.0001

TI LE UC CHE NAM HCP2 21:09 Thursday, July 23, 2016 26

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for TILEKHANG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 22

18

Error Mean Square 13.31618

Critical Value of t 2.07387

Least Significant Difference 6.1791

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N HCP2

A 53.737 3 7 (NT 1.4)

A

A 47.763 3 4 (CS1b)

B 38.437 3 8 (Paenibacillus)

B

C B 34.147 3 10 (NT 1.3)

C B

C B 33.133 3 6 (NT 3.3)

C

C 28.923 3 2 (CS1a)

C

C 27.990 3 DCNYSTAT

C

C 27.987 3 5 (D9)

D 15.117 3 9 (NT 2.3)

D

E D 10.267 3 3 (NT CS1+)

E

E 8.587 3 1 (VK4)

19

CDP1:

TI LE UC CHE NAM CDP1 00:38 Friday, July 24, 2016 3

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CDP1 11 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 DCNYSTAT

Number of Observations Read 33

Number of Observations Used 33

TI LE UC CHE NAM CDP1 00:38 Friday, July 24, 2016 4

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: TILEKHANG

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 10 1702.384685 170.238468 10.01 <.0001

Error 22 374.084267 17.003830

Corrected Total 32 2076.468952

R-Square Coeff Var Root MSE TILEKHANG Mean

0.819846 8.854967 4.123570 46.56788

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CDP1 10 1702.384685 170.238468 10.01 <.0001

TI LE UC CHE NAM CDP1 00:38 Friday, July 24, 2016 5

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for TILEKHANG

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 22

20

Error Mean Square 17.00383

Critical Value of t 2.07387

Least Significant Difference 6.9825

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CDP1

A 60.607 3 2 (CS1a)

A

B A 54.070 3 3 (CS1+)

B

B C 52.903 3 4 (CS1b)

B C

B C D 49.287 3 8 (Paenibacillus)

B C D

B E C D 47.670 3 5 (D9)

E C D

F E C D 46.657 3 10 (NT 1.3)

F E D

F E G D 45.827 3 7 (NT 1.4)

F E G

F E G H 41.080 3 6 (NT 3.3)

F G H

F G H 40.403 3 9 (NT 2.3)

G H

G H 38.950 3 DCNYSTAT

H

H 34.793 3 1 (VK4)

21

- Chạy tương tự như vậy với Lactobacillus sp.và các chủng nấm khác.

- Chạy tương tự và chỉa theo tửng nhóm phân lập của từng chủng.

PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (ĐẶT THẠCH KHUẾCH

TÁN):

 Phương pháp này chạy tương tự như phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn.

 Chạy chia theo nhóm phân lập như sau:

Tỉ lệ kháng của nhóm VK Lactic phân lập từ nem:

DN3:

VONG UC CHE NAM DN3 21:52 Thursday, July 29, 2016 21

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

DN3 6 1 2 3 4 5 6

Number of Observations Read 18

Number of Observations Used 18

VONG UC CHE NAM DN3 21:52 Thursday, July 29, 2016 22

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VONGUCCHE

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 5 178.8207833 35.7641567 5.24 0.0088

Error 12 81.8926667 6.8243889

Corrected Total 17 260.7134500

R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean

0.685890 10.69751 2.612353 13.97167

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

22

DN3 5 178.8207833 35.7641567 5.24 0.0088

VONG UC CHE NAM DN3 21:52 Thursday, July 29, 2016 23

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for VONGUCCHE

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 12

Error Mean Square 6.824389

Critical Value of t 2.17881

Least Significant Difference 4.6474

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N DN3

A 20.723 3 1(L5)

B 14.500 3 3(LN2-5)

B

B 12.723 3 4(LN2-7)

B

B 12.110 3 6(LN3-7)

B

B 11.997 3 2(L6)

B

B 11.777 3 5(LN3-5)

23

DN2:

VONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 25

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

DN2 6 1 2 3 4 5 6

Number of Observations Read 18

Number of Observations Used 18

ONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 26

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VONGUCCHE

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 5 122.1141611 24.4228322 2.59 0.0824

Error 12 113.3172000 9.4431000

Corrected Total 17 235.4313611

R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean

0.518683 10.00231 3.072963 12.80278

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

DN2 5 122.1141611 24.4228322 2.59 0.0824

VONG UC CHE NAM DN2 21:52 Thursday, July 29, 2016 27

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for VONGUCCHE

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 12

Error Mean Square 9.4431

24

Critical Value of t 2.17881

Least Significant Difference 5.4668

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N DN2

A 18.223 3 1(L5)

A

B A 13.557 3 3(LN2-5)

B

B 12.110 3 5(LN3-5)

B

B 11.390 3 6(LN3-7)

B

B 10.777 3 2(L6)

B

B 10.760 3 4(LN2-7)

25

CDP1:

VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 33

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CDP1 6 1 2 3 4 5 6

Number of Observations Read 18

Number of Observations Used 18

VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 34

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VONGUCCHE

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 5 292.3496444 58.4699289 18.24 <.0001

Error 12 38.4626667 3.2052222

Corrected Total 17 330.8123111

R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean

0.883733 10.44329 1.790313 14.38778

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CDP1 5 292.3496444 58.4699289 18.24 <.0001

VONG UC CHE NAM CDP1 21:52 Thursday, July 29, 2016 36

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for VONGUCCHE

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.01

Error Degrees of Freedom 12

Error Mean Square 3.205222

Critical Value of t 3.05454

Least Significant Difference 4.465

26

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CDP1

A 23.167 3 1(L5)

B 14.500 3 6(LN3-7)

B

B 12.777 3 2(L6)

B

B 12.220 3 4(L2-7)

B

B 11.887 3 3(LN2-5)

B

B 11.777 3 5(LN3-5)

27

CDP2:

VONG UC CHE NAM CDP2 21:52 Thursday, July 29, 2016 37

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

CDP2 6 1 2 3 4 5 6

Number of Observations Read 18

Number of Observations Used 18

VONG UC CHE NAM CDP2 21:52 Thursday, July 29, 2016 38

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VONGUCCHE

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 5 66.6432444 13.3286489 0.78 0.5830

Error 12 205.1190000 17.0932500

Corrected Total 17 271.7622444

R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean

0.245226 10.88958 4.134398 13.38444

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

CDP2 5 66.64324444 13.32864889 0.78 0.5830

VONG UC CHE NAM CDP2 21:52 Thursday, July 29, 2016 39

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for VONGUCCHE

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 12

Error Mean Square 17.09325

Critical Value of t 2.17881

Least Significant Difference 7.355

28

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N CDP2

A 17.277 3 1(L5)

A

A 13.943 3 3(LN2-5)

A

A 13.090 3 6(LN3-7)

A

A 12.720 3 4(LN2-7)

A

A 11.890 3 5(LN3-5)

A

A 11.387 3 2(L6)

29

HCP2:

VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 1

The ANOVA Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

HCP2 6 1 2 3 4 5 6

Number of Observations Read 18

Number of Observations Used 18

VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 2

The ANOVA Procedure

Dependent Variable: VONGUCCHE

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F

Model 5 40.53496111 8.10699222 2.21 0.1213

Error 12 44.08193333 3.67349444

Corrected Total 17 84.61689444

R-Square Coeff Var Root MSE VONGUCCHE Mean

0.479041 10.49861 1.916636 13.21944

Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F

HCP2 5 40.53496111 8.10699222 2.21 0.1213

VONG UC CHE NAM HCP2 22:53 Thursday, July 29, 2016 3

The ANOVA Procedure

t Tests (LSD) for VONGUCCHE

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.

Alpha 0.05

Error Degrees of Freedom 12

Error Mean Square 3.673494

Critical Value of t 2.17881

Least Significant Difference 3.409

30

Means with the same letter are not significantly different.

t Grouping Mean N HCP2

A 15.947 3 1(L5)

A

B A 13.613 3 4(LN2-7)

B A

B A 13.590 3 3(LN2-5)

B A

B A 13.113 3 5(LN3-5)

B

B 11.667 3 2(L6)

B

B 11.387 3 6(LN3-7)

 Chạy tương tự với nhóm cơm mẻ cảu chủng Lactobacillus spp. và các nhóm

31

Bacillus spp với các nấm khác.