Đồ án tốt nghiệp: Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải chế biến thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU KHẢ NĂNG TĂNG SINH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT LỰC CỦA VI KHUẨN AOB VÀ NOB CÓ NGUỒN GỐC TỪ NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: VI SINH MÔI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện

: Trương Cao Dương

MSSV: 0851110028 Lớp: 08DSH5

TP. Hồ Chí Minh, 2012

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn khoa

học của TS. Nguyễn Hoài Hương, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí

Minh.

Những kết quả có được trong đồ án này là hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp

của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này

là hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về đồ án tốt nghiệp của mình.

TP.HCM, ngày 21 tháng 7 năm 2012

Sinh viên thực hiện

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành nhất đến ba mẹ và gia đình đã tạo

mọi điều kiện tốt nhất cho em được cắp sách đến trường, theo đuổi con đường học vấn mà

em đã chọn suốt 16 năm qua.

Lời thứ hai, cho em gửi lời tri ân chân thành nhất đến các thầy các cô những người đã tận

tình dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức hay và bổ ích nhất trong suốt những năm

em ngồi trên ghế nhà trường và giảng đường đại học, cho em một hành trang tri thức vững

chắc vào đời để thực hiện những ước mơ, những hoài bão mà em đang ấp ủ.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy các cô cùng ban giám hiệu nhà trường đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi nhất từ điều kiện học tập, trang thiết bị máy móc hiện đại để em có thể làm

việc và thực hiện đề tài tốt nghiệp của em đạt kết quả tốt nhất. Và đặc biệt là em xin chân

thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương: cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo hết mình, giúp đỡ

tận tình em trong suốt thời gian dài làm đồ án để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp của

mình với kết quả tốt nhất.

Lời cuối cùng, cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn của em, những người luôn

động viên, luôn sát cánh bên em và giúp đỡ em hết mình để em có thể hoàn thành đồ án tốt

nghiệp với kết quả tốt nhất. Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 21 tháng 7 năm 2012

Sinh viên thực hiện

ii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AOB: Ammonia-Oxidizing Bacteria

cBOD: carbonaceous BOD

CBTS: Chế biến thủy sản

DO: Dissolved Oxygen

ĐC: Đối chứng

MLVSS: Mixed liquor volatile suspended solids

NOB: Nitrite-Oxidizing Bacteria

RAS: Return Activated Sludge

TN: Thí nghiệm

TS4: Thủy sản 4

W1: Winogradsky 1

W2: Winogradsky 2

iii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các giống của vi khuẩn nitrate hóa. ................................................................. 17

Bảng 1.2. Sinh lý học cơ bản và những đặc trưng về cấu trúc của Nitrosomonas và

Nitrobacter. ..................................................................................................................... 18

Bảng 1.3. Sự tăng về kích thước quần thể của Nitrosomonas và Nitrobacter sau 72 giờ. .. 13

Bảng 1.4. Nồng độ DO và quá trình nitrate hóa đạt được. ................................................ 23

Bảng 1.5. pH và quá trình nitrate hóa. .............................................................................. 24

Bảng 1.6. Nhiệt độ và quá trình nitrate hóa. ..................................................................... 25

+ - NO2

Bảng 1.7. Những dạng của sự ức chế và độc chất. ........................................................... 27 - với thuốc thử tương ứng trong phản ứng - & NO3 Bảng 2.1. Cường độ màu của NH4

định tính. ......................................................................................................................... 38

Bảng 2.2. Thể tích mẫu còn lại của 10 bình AOB nuôi cấy sau khi đã lấy mẫu định lượng.41

Bảng 2.3. Kết quả OD của 6 chủng vi khuẩn sau 48 giờ nuôi lắc và thể tích huyền phù tế

bào cần hút cho thí nghiệm khảo sát. ............................................................................... 42

Bảng 2.4. Kết quả OD của 3 chủng vi khuẩn khảo sát sau 48 giờ tăng sinh và thể tích

huyền phù tế bào cần hút cho thí nghiệm. ........................................................................ 44

Bảng 3.1. Thử nghiệm định tính mẫu tăng sinh AOB trong môi trường W1 từ nước thải

TS4. ................................................................................................................................ 48

- qua “Thử nghiệm định tính” 10 bình mẫu nuôi

Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của 4 chủng vi khuẩn phân lập được trên W1. ................... 49

+ - NO2

- & NO3

Bảng 3.3. Hàm lượng NH4

- trong 10 bình mẫu AOB và hiệu quả chuyển

cấy AOB. ........................................................................................................................ 51

+ - NO2

- & NO3

Bảng 3.4. Hàm lượng NH4

hóa cơ chất. ..................................................................................................................... 53

Bảng 3.5. Kết quả định tính 10 bình mẫu AOB tiếp tục được tăng sinh trong vòng 13 ngày

(sau khi đã được thay môi trường AOB mới). .................................................................. 56

Bảng 3.6. Tổng kết các chủng vi khuẩn nitrate hóa phân lập được trên môi trường W2. ... 58

Bảng 3.7. Hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa sau 6 ngày tăng sinh. ...................... 61

iv SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1. Hiện tượng cá chết hàng loạt trên sông do nhiễm độc. ...................................... 08 + ...................................................... 09 Hình 1.2. pH và sự chuyển đổi của NH3 và ion NH4

Hình 1.3. Hiện tượng tảo nở hoa. ..................................................................................... 10

Hình 1.4. Hội chứng da xanh ở trẻ em. ............................................................................ 10

Hình 1.5. Chu trình nitơ trong nước thải. ......................................................................... 11

Hình 1.6. Quy trình phân lập tuyển chọn, cải biến các VSV nguồn gốc tự nhiên để sản xuất

Hình 2.1. Phương trình đường chuẩn NH4

Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn NO2

Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn NO3

- & NO3

+ - NO2

chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm. .................................................................................... 28 +……………………………… ....................... 42 -…………………………………………… ..…42 ................................................................................................................... 43 - trong 11 bình tăng sinh AOB. ...... 54 Hình 3.1. Nồng độ các dạng nitơ NH4

Hình 3.2. Hiệu quả xử lý N – Amoni và hiệu quả nitrate hóa của các quần thể vi sinh vật

trong 10 bình tăng sinh AOB. .......................................................................................... 54

Hình 3.3. Các mẫu vi khuẩn phân lập trên thạch W2: a) Mẫu 1, b) Mẫu 2, c) Mẫu 3, d)

Mẫu 5, e) Mẫu 7, f) Mẫu MV1. ....................................................................................... 59

Hình 3.4. Biến thiên N – nitrite trong môi trường W2 khi cấy vi khuẩn phân lập từ nước

thải CBTS. ...................................................................................................................... 60

Hình 3.5. Nồng độ N – nitrate (mg/L) sinh ra trong môi trường W2 khi cấy các chủng phân

- của 3 mẫu trong suốt thời gian

lập. ................................................................................................................................. 60

Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng chuyển hóa N – NO2

khảo sát. .......................................................................................................................... 62

Hình 3.7. Biến đổi nồng độ N – nitrate tạo thành theo thời gian khảo sát các mẫu phân

lập... ................................................................................................................................ 62

Hình 3.8. Biến đổi hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa theo thời gian của các mẫu

phân lập. .......................................................................................................................... 63

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có

nguồn gốc từ nước thải CBTS. ........................................................................................ 46

v SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ iii

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... iv

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ ................................ v

LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. vi

1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................... 1

2. Tình hình nghiên cứu ............................................................................................... 2

2.1

Trên thế giới ....................................................................................................................... 2

2.2

Tại Việt Nam ....................................................................................................................... 2

3. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................ 2

4. Nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................................................... 2

5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4

1.1 Giới thiệu về những hợp chất có bản chất nitơ (Nitrogenous Compounds) .............. 5

1.1.1 Amino acids .......................................................................................................................... 5

1.1.2 Proteins .................................................................................................................................. 6

1.1.3 Urea ........................................................................................................................................ 6

1.2 Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống và

nước thải ..................................................................................................................... 7

1.2.1 Sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO) ............................................................................................. 7

1.2.2 Độc tính (Toxicity) ............................................................................................................... 7

1.2.3 Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication) ....................................................................... 9

1.2.4 Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia) ................... 10

1.3 Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle) ......................... 11

1.4 Giới thiệu về quá trình nitrate hóa trong môi trường (Introduction to

Nitrification)............................................................................................................... 14

1.5 Những vi khuẩn oxi hóa nitơ hay vi khuẩn nitrate hóa (Nitrifying Bacteria) ......... 15

1.6 Những sinh vật chỉ thị hay những chất chỉ thị cho quá trình Nitrate hóa

(Indicators of Nitrification) ......................................................................................... 21

vi SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

1.7 Những yếu tố hay điều kiện môi trường ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa và

quá trình nitrate hóa .................................................................................................... 22

1.7.1 Sự tích lũy NO2 ................................................................................................................... 22

1.7.2 Oxi hòa tan (DO) ............................................................................................................... 22

1.7.3 Tính kiềm và pH ................................................................................................................. 23

1.7.4 Nhiệt độ (Temperature) .................................................................................................... 24

1.7.5 Sự ức chế và độc tính (Inhibition and Toxicity) ........................................................... 25

1.8 Tăng cường sinh học (Bioaugmentaion) [10] ........................................................ 26

1.8.1 Định nghĩa ........................................................................................................................... 26

1.8.2 Phương pháp tăng cường sinh học ................................................................................. 27

1.9 Các nghiên cứu liên quan đến quá trình phân lập, nuôi cấy các chủng vi khuẩn

Nitrate hóa .................................................................................................................. 27

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 30

2.1 Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 31

2.2 Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ & thiết bị .............................................................. 31

2.2.1 Vật liệu ................................................................................................................................. 31

2.2.2 Hóa chất .............................................................................................................................. 31

2.2.2.1 Thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy ..................................................... 31

2.2.2.2 Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm .................................................... 33

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị............................................................................................................. 33

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu .................................................................. 34

2.3.1 Nội dung nghiên cứu chính .............................................................................................. 34

2.3.2 Phương pháp thu nhận và vận chuyển mẫu nước thải ............................................... 34

2.3.3 Phương pháp phân lập...................................................................................................... 34

2.3.4 Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy ............................................................... 35

2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập .................................. 37

2.3.6

Khảo sát khả năng mọc trên môi trường agar hữu cơ đối với 4 chủng nghi

ngờ là

vi khuẩn nitrite hóa đã phân lập được trên môi trường W1 ......................................... 40

2.3.8 Thử nghiệm tăng sinh khối 10 bình nuôi cấy AOB: .................................................... 41

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

vii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

2.3.9 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa đã phân lập

được trên môi trường W2 lỏng .................................................................................................. 41

2.3.10 “Khảo sát khả năng chuyển hóa” của 3 chủng vi khuẩn nitrate hóa chọn lọc

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................ 47

3.1 Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrite hóa của AOB từ nước

thải nhà máy chế biến thủy sản (CBTS) ...................................................................... 48

3.1.1 Tăng sinh phân lập AOB lần I ......................................................................................... 48

3.1.1.1 Kết quả thử nghiệm định tính .......................................................................... 48

3.1.1.2 Kết quả phân lập ............................................................................................. 49

3.1.1.3 Kết quả khảo sát khả năng mọc của 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa trên môi

trường agar hữu cơ .................................................................................................... 50

3.1.2 Tăng sinh phân lập AOB lần II ....................................................................................... 50

3.1.3 Tăng sinh phân lập AOB lần III ...................................................................................... 51

3.1.3.1 Kết quả thử nghiệm định tính .......................................................................... 51

- có trong 10 bình nuôi

3.1.3.2 Kết quả định lượng hàm lượng NH4

+ - NO2

- & NO3

cấy AOB vừa mới phân lập được ở trên ...................................................................... 52

3.1.3.3 Kết quả định tính lại 10 bình AOB sau khi thêm môi trường mới vào và tăng

sinh tiếp tục trong 13 ngày ......................................................................................... 55

3.2 Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrate hóa của các chủng NOB

có nguồn gốc từ nhà máy chế biến thủy sản (CBTS) ................................................... 57

3.2.1 Tăng sinh phân lập NOB lần I ........................................................................................ 57

3.2.1.1 Kết quả định tính ............................................................................................ 57

3.2.1.2 Kết quả phân lập ............................................................................................. 57

3.2.1.3 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 mẫu vi khuẩn phân lập được trên môi

trường lỏng W2 .......................................................................................................... 59

3.2.1.4 Khảo sát khả năng chuyển hóa của các quần thể NOB trong thí nghiệm tăng

sinh trên môi trường lỏng NOB (1g NaNO2/l) ............................................................. 61

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 65

4.1 Kết luận ................................................................................................................ 66

4.2 Kiến nghị .............................................................................................................. 66

trên môi trường giàu vi lượng NOB (1g NaNO2/l) .................................................................44

viii SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 68

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH............................................................................................... 70

PHỤ LỤC BẢNG ....................................................................................................... 92

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

ix SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

LỜI MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài:

- Việt Nam được mệnh danh là “Rừng vàng - Biển bạc” với sự phong phú và đa dạng

về tài nguyên thiên nhiên. Nước ta có chiều dài bờ biển dài hàng ngàn km từ Bắc vào Nam,

chính vì vậy mà chúng ta sở hữu được một nguồn tài nguyên biển vô cùng vô tận, đặc biệt

nhất là nguồn lợi thủy hải sản vô cùng phong phú. Chính vì thế đã thúc đẩy sự phát triển

mạnh mẽ của ngành công nghiệp đánh bắt và chế biến thủy hải sản ở các tỉnh ven biển và ở

các thành phố lớn của nước ta.

- Ngành công nghiệp chế biến thủy sản ở nước ta đã phát triển không ngừng trong

những năm gần đây và đang là ngành mũi nhọn trong việc thúc đẩy phát triển nền kinh tế

của nước nhà, mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế cho đất nước, tạo ra nhiều công ăn việc làm

cho người dân … Tuy nhiên, bên cạnh những mặt tích cực ấy, thì còn rất nhiều công ty,

nhà máy xí nghiệp chế biến thủy hải sản ở nước ta chưa có đầu tư và vận hành hệ thống xử

lý nước thải; nước thải chế biến thủy sản được thải với lượng lớn ra ngoài môi trường, gây

ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, đặc biệt là môi trường nước.

- Nước thải chế biến thủy sản (nước thải giết mổ và rửa thủy sản) chứa hàm lượng

hữu cơ rất cao, đặc biệt là các chất hữu cơ có chứa nitơ, khi chúng được thải ra ngoài môi

trường sẽ gây ô nhiễm cho chủ yếu là các nguồn nước mặt như ao, hồ, sông, suối… và ảnh

hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người. Chính vì vậy để khắc phục tình trạng ô nhiễm này

đã có nhiều biện pháp xử lý khác nhau nhằm hạn chế và giảm bớt hàm lượng chất thải hữu

cơ có chứa nitơ trong hệ thống xử lý nước thải trước khi nước được thải ra ngoài. Và

phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là xử lý bằng phương pháp sinh học để xử lý

nước thải chế biến thủy sản (phù hợp với tính chất của nước thải chế biến thủy sản là giàu

chất hữu cơ) với việc bổ sung vi sinh vật được phân lập nuôi cấy từ bên ngoài vào hệ thống

xử lý nước thải nhằm tăng cường hiệu quả xử lý trước khi nước được thải ra ngoài. Dựa

vào điểm này, chúng tôi đã đi đến quyết định chọn đề tài “Tìm hiểu khả năng tăng sinh

phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải

CBTS” với mục đích là tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập các chủng vi khuẩn nitrate

hóa có khả năng xử lý nitơ từ nguồn nước thải chế biến thủy sản để có thể ứng dụng tạo ra

các chế phẩm sinh học để bổ sung vào hệ thống xử lý nước thải giúp tăng hiệu quả xử lý

nước thải cũng như loại bỏ hoàn toàn các chất thải có bản chất nitơ ra khỏi nước thải trước

khi được thải ra ngoài môi trường.

1 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

2. Tình hình nghiên cứu:

2.1 Trên thế giới:

- Sự phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã được

thực hiện thành công đầu tiên bởi Winogradsky (1890). Sự thành công này của ông đã

được biết đến vài năm trước khi quá trình nitrate hóa được tìm ra là do những sinh vật sống

thực hiện (Schloesing & Muntz, 1877) và sự cố gắng của Frankland cùng các cộng sự

(1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những phương pháp vi khuẩn học thường dùng

đã gặp thất bại.

- Năm 1950, bằng phương pháp cải tiến từ phương pháp của Winogradsky, Jane

Meiklejohn đã thành công trong việc phân lập chủng Nitrosomonas europaea từ sự nuôi

cấy thuần khiết. Và cũng trong nghiên cứu này, bà cũng đã tìm ra được môi trường thích

hợp (có bổ sung thành phần vi lượng cần thiết) để duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn

nitrate hóa (qua nhiều lần cấy chuyển môi trường để tăng sinh mà không bị mất hoạt tính

như ban đầu bà đã vấp phải khi mới bắt đầu nghiên cứu). [11]

- Năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và

nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện ra và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi

hóa NH3 khác.

- Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh sạch

được Nitrosomonas và Nitrosocystis spp. bằng việc sử dụng môi trường agar tinh chế và

một phương pháp thu nhận những tập đoàn với những pipet mao quản thủy tinh được hoạt

động bởi máy vi thao tác đơn trước đây đã được mô tả bởi Soriano (1935). [20]

2.2 Tại Việt Nam:

- Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007) đã phân lập được 4

chủng vi khuẩn nitrate hóa ứng dụng vào xử lý nước hồ bị ô nhiễm. [1]

Hoàng Phương Hòa, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc -

(2008) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa từ nước lợ nuôi tôm và ứng dụng xử

lý nitơ trong ao nước nuôi tôm. [2]

3. Mục đích nghiên cứu:

- Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và

NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu:

- Tìm hiểu khả năng tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn AOB và NOB có nguồn

gốc từ nước thải CBTS.

2 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Đánh giá hoạt lực của các chủng vi khuẩn AOB và NOB phân lập được trên môi

trường nuôi cấy tương ứng của chúng.

5. Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp thu nhận và bảo quản mẫu nước thải. -

Phương pháp phân lập vi khuẩn nitrate hóa. -

Phương pháp thử nghiệm định tính. -

Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập. -

- trong môi trường nuôi cấy.

+ - NO2

- và NO3

- Phương pháp định lượng NH4

3 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

1.1 Giới thiệu về những hợp chất có bản chất nitơ (Nitrogenous Compounds):

- Sự đa dạng hóa của những hợp chất có thể rất khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc

xả thải bao gồm cả những chất thải có bản chất nitơ. Ví dụ về những hợp chất có bản chất

nitơ đã được tìm thấy trong nước thải công nghiệp bao gồm: analine (CH3CHNH2COOH),

chất ức chế sự ăn mòn, chất thải của các sản phẩm từ sữa và chất thải từ lò mổ…

- Analine: được sử dụng trong sản xuất thuốc nhuộm, những hóa chất chụp ảnh và

những chất dùng làm thuốc. Nitrite: được dùng làm chất ức chế ăn mòn trong hệ thống

nước công nghiệp. Những chất thải từ sữa: bao gồm những protein có chứa nitơ, kể cả

casein và nhiều protein hiện diện trong thịt và máu từ chất thải lò mổ hay nhà máy chế biến

thủy sản.

+. Nitơ trong

- Nước thải trong nhà bao gồm những hợp chất nitơ hữu cơ và NH4

nước thải trong nhà bắt nguồn từ sự chuyển hóa protein trong cơ thể con người. Trong

nước thải trong nhà mới được thải ra, khoảng chừng 60% nitơ là ở trạng thái hữu cơ, như +. Những hợp là những chất thải có chứa protein và 40% nitơ là dưới dạng vô cơ, như NH4

chất hữu cơ như: amino acid, protein, urea có nguồn gốc từ những hợp chất nitơ hữu cơ từ + là hợp chất có nguồn gốc vô cơ từ nước thải trong nước thải trong nhà, trong khi đó NH4

nhà.

-

- Nếu không thải ra bằng những ngành nghề sản xuất kinh doanh riêng biệt, thì NO3 - không được tìm thấy trong hệ thống cống rãnh thành phố. Những điều kiện bên -; tức là quá trình

và NO2

+ hay NO2

trong hệ thống cống rãnh không thuận lợi cho sự oxi hóa NH4

nitrate hóa không xảy ra.

1.1.1 Amino acids:

- Amino acid: là những hợp chất nitơ hữu cơ, chúng chứa nhóm carboxylic acid (-

COOH) và nhóm amino (-NH2). Nhóm amino trong tất cả các amino acid luôn luôn được

liên kết với carbon kế cận nhóm carboxylic acid. Amino acid là những hợp chất khung của

cấu trúc protein, chúng tạo thành các phân tử protein. Trong thời gian suy giảm của amino

acid, nhóm amino được phóng thích.

- Sự khử nhóm NH2 ra khỏi một hợp chất hữu cơ là phản ứng sinh hóa chịu trách

nhiệm về sự giảm đi của nhóm amino. Sự khử nhóm NH2 khỏi một hợp chất hữu cơ của

amino acid có thể xảy ra trong hệ thống cống rãnh và hệ thống xử lý nước thải (cụ thể là

trong bể aerotank). Sự khử nhóm NH2 có thể xảy ra trong sự hiện diện hay không có oxi

hòa tan. Những amino acid có cấu trúc đơn giản có thể được phân hủy trong hệ thống cống

rãnh. Còn những amino acid có cấu trúc phức tạp hơn có thể được phân hủy trong hệ thống

xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính).

5 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

-

Khi mà nhóm amino (-NH2) được phóng thích vào nước thải, nó được biến đổi +. Sự biến đổi này xảy ra trong nước thải do có sự hiện diện của

nhanh chóng thành NH4 ion H+:

+ 2H+ (cid:198) NH4

NH2

1.1.2 Proteins:

- Protein: là những hợp chất nitơ hữu cơ (chứa tới 15 – 17% nitơ) và là thành phần

quan trọng của tế bào sinh vật; chúng chứa những amino acid. Protein là những chất keo và

có cấu trúc rất phức tạp. Vì chúng là những chất keo tự nhiên và có cấu trúc phức tạp nên

sự phân hủy protein là rất chậm và sự khử NH2 thường xảy ra trong hệ thống xử lý nước

thải (bể bùn hoạt tính) chứa đựng nồng độ chất rắn cao và sự thông khí kéo dài.

- Protein phải được hút bám trên bề mặt của vi khuẩn và được hòa tan thành những

hợp chất đơn giản, chúng có thể đi vào những tế bào vi khuẩn để mà được phân hủy. Khi

+.

protein phân hủy, thì những amino acid được giải phóng. Sự khử nhóm amino (-NH2) của

các amino acid đưa đến sự tạo ra NH4

- Những protein hình thành nên nhiều tế bào chất bên trong tế bào vi khuẩn và cung

cấp như là phần hợp thành cấu trúc bên trong vách tế bào vi khuẩn. Những enzyme của vi

khuẩn vẫn có protein trong thành phần cấu tạo. Khi mà vi khuẩn chết đi trong một hệ thống

xử lý nước thải, những chất hợp thành tế bào này được giải phóng và đáp ứng như là nguồn

thức ăn cho sự sống của những vi khuẩn khác. Khi mà những chất hợp thành tế bào bị phân + được tạo ra trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). hủy, NH4

1.1.3 Urea:

- Urê: có trong thành phần nước tiểu của người và động vật, chiếm khoảng 2.2%

nước tiểu và chứa tới 46.6% nitơ. Urê là một hợp chất nitơ hữu cơ đơn giản nhất, nó chứa 2 +. Thủy phân là sự nhóm amino. Trong hệ thống cống rãnh urê bị thủy phân tạo thành NH4

phân cắt hay một phân tử với sự cộng thêm nước thông qua hoạt động của vi khuẩn. Vi

+

khuẩn dùng enzyme urease để phân cắt urê:

H2NCONH2 2H2O (cid:198) 2NH4 CO2

- Trong hệ thống cống rãnh nhiều hợp chất nitơ hữu cơ nhanh chóng được thủy phân

độ NH4

và khử nhóm NH2. Do sự thủy phân và sự khử nhóm NH2 trong hệ thống cống rãnh, nồng + đầu vào mà hệ thống xử lý nước thải nhận được từ nước thải trong nhà thường là + được phóng thích thêm ra trong hệ thống xử lý nước thải (bể 15 – 30mg/l. Những ion NH4

bùn hoạt tính) từ những amino acid có cấu trúc phức tạp, protein và những chất thải có bản

chất nitơ khác nữa.

6 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

1.2 Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống

và nước thải:

- Sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ và những chất thải có chứa nitơ

trong nước thải cuối cùng của một hệ thống nước thải nhà máy hay xí nghiệp được thải ra,

có thể tác động bất lợi và gây ô nhiễm đến chất lượng của nguồn nước tiếp nhận (các

- và NO3

+, NO2

nguồn nước mặt như: sông, suối, ao, hồ…). Nguồn gốc của những chất thải có bản chất -. Những tác nitơ gây ô nhiễm nguồn nước nhận chính là những ion NH4

động gây ô nhiễm quan trọng có liên quan tới sự hiện diện của những chất thải có bản chất

nitơ ấy bao gồm: sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO), độc tính (Toxicity), sự thiếu oxi trong nước

(Eutrophications) và sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia).

- Để giảm bớt những ảnh hưởng bất lợi của những chất thải có bản chất nitơ cho

nguồn nước tiếp nhận, một hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo

yêu cầu xử lý và giảm lượng chất thải có bản chất nitơ xuống dưới hoặc bằng mức cho

phép của tiêu chuẩn xả thải trong nước thải đầu ra của hệ thống xử lý nước thải ấy. Hệ

thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo quá trình oxi hóa nitơ

(nitrify) và quá trình khử nitơ (denitrify) những chất thải có bản chất nitơ xảy ra hoàn tất

trong cả quá trình hoạt động của hệ thống. Yêu cầu của quá trình nitrate hóa (nitrification)

thường được đưa ra như giới hạn thải ra NH3 và yêu cầu của quá trình phản nitrate

(denitrification) thường được đưa ra như giới hạn Tổng nitơ hay Tổng nitơ Kjeldahl

(TKN).

1.2.1 Sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO):

- Việc thải ra những chất thải có bản chất nitơ vào nguồn nước nhận là kết quả của

sự cạn kiệt nguồn oxi hòa tan trong nguồn nước nhận ấy. Sự cạn kiệt xảy ra thông qua sự

- bên

- và NO2

- được oxi hóa thành NO3

- tiêu thụ oxi hòa tan bởi hoạt động của vi khuẩn. + được oxi hóa thành NO2 Đầu tiên, NH4

+ và NO2

chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn và gia tăng thêm NH4

- và NO3

+, NO2

trong nguồn nước tiếp nhận. Quá trình oxi hóa mỗi ion xảy ra bằng oxi hòa tan được di -. Tiếp theo, - đáp ứng như là nguồn nitơ dinh dưỡng cho sự tăng trưởng của những NH4

thực vật sống ở nước, chủ yếu là những loài tảo. Khi những thực vật ấy chết đi, oxi hòa tan

sẽ được di chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn để phân hủy những thực vật đã

chết ấy.

+

-

-

+ O2 + O2 NH4 NO2 NO3

1.2.2 Độc tính (Toxicity):

7 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Hình 1.1: Hiện tượng cá chết hàng loạt trên sông do nhiễm độc.[23]

+ - NO2

- & NO3

-) có thể là độc chất cho sự sống - là vô cùng độc.

- Ba ion có bản chất nitơ trên (NH4

+ và NO2

- là độc nhất trong 3 loại ion có bản chất nitơ.

của những loài thủy sinh vật, đặc biệt nhất là cá. Những ion NH4

Và NO2

- Mặc dù NH4

+ là nguồn dinh dưỡng nitơ ưa thích nhất cho phần lớn sinh vật sống, + được biến đổi thành NH3 với sự tăng lên của pH. Nó là NH3 khi ở pH cao và độc cho

NH4

sự sống của thủy sinh vật.

8 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

+ .[16]

Hình 1.2: pH và sự chuyển đổi của NH3 và ion NH4

1.2.3 Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication):

2-) là nguồn gốc chính yếu của sự thiếu oxi trong nước thì

- Trong khi phosphate (PO4

những chất thải có bản chất nitơ cũng góp phần quan trọng cho vấn đề ô nhiễm nước này.

- Sự thiếu oxi trong nước nói đến sự thải ra những chất dinh dưỡng của thực vật (chủ

yếu là: phốt pho và nitơ) vào nước sạch (như: hồ và ao). Sự hiện diện những chất dinh

dưỡng này kích thích sự tăng trưởng nhanh chóng hay sự ra hoa của thực vật thủy sinh, bao

gồm cả tảo. Khi những thực vật thủy sinh này già và chết đi, xác của chúng sẽ làm cho

nguồn nước thiếu oxi do quá trình hoạt động phân hủy hiếu khí của những vi sinh vật diễn

ra. Sự thiếu oxi trong nước dẫn đến sự lão hóa nhanh chóng của nguồn nước ngọt khi

chúng mất khá nhiều oxi cho sự phân hủy này. Và sự tích lũy xác những thực vật thủy sinh

ngày càng nhiều dẫn đến khả năng phân hủy của nguồn nước bị giảm đi đến mức chúng

9 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

không thể phân hủy được nữa, không tự làm sạch được nữa thì dẫn đến nguồn nước ấy bị ô

nhiễm.

Hình 1.3: Hiện tượng tảo nở hoa.[23]

1.2.4 Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia):

Hình1.4: Hội chứng da

xanh ở trẻ em.[23]

- Từ “Methemoglobinemia” hay “Hội chứng da xanh ở trẻ em” nói đến một căn

NO3

thì những ion này dễ dàng được biến đổi thành NO2

bệnh của những đứa trẻ còn nhỏ (dưới 6 tháng tuổi) ăn uống phải nước ngầm đã nhiễm bẩn - -. Khi một đứa bé ăn uống những thứ được làm ra từ nước ngầm đã bị nhiễm bẩn NO3 - trong đường tiêu hóa của đứa bé. Ion - này xâm nhập vào hệ tuần hoàn của đứa trẻ và nhanh chóng liên kết với Fe trong NO2

nhân của Hemoglobin hay những Tế bào hồng cầu.

- trong nhân ngăn cản Hemoglobin thu được oxi khi nó đi qua

- Sự hiện diện của NO2

phổi của đứa trẻ. Sự thiếu oxi trong cơ thể của đứa trẻ dẫn đến da của đứa trẻ trở nên xanh

10 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

xao, vì thế mới có thuật ngữ “Blue baby syndrome”. Nếu thiếu oxi trong não của đứa trẻ,

chứng liệt hay chết có thể xuất hiện.

- Methemoglobinemia thường thường liên đới với những vùng nông thôn, nơi mà

nước dùng để uống được thu từ nước ngầm. Methemoglobinemia không có dấu hiệu để

cảnh báo và mặc dù nó có thể xuất hiện với những người trưởng thành; nó có thể độc hơn

nhiều với những đứa trẻ sơ sinh bởi vì pH trong cơ thể chúng thấp hơn và trọng lượng cơ - ở nồng độ thể chúng thấp hơn khi so sánh với những người trưởng thành. Và khi ion NO3

cao cũng có thể làm tăng nguy cơ gây ung thư dạ dày ở mọi lứa tuổi.

1.3 Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle):

Hình 1.5: Chu trình nitơ trong nước thải.[16]

- Có nhiều hợp chất có bản chất nitơ tồn tại trong môi trường sống và trong hệ thống

xử lý nước thải. Phần lớn nitơ tìm thấy trong môi trường sống tồn tại dưới dạng nitơ phân

tử (N2) trong bầu khí quyển chúng ta (chúng chiếm tới 76% trong bầu khí quyển so với các

khí khác).

- Mặc dù sự cấu thành không nhiều của nitơ trong sinh khối so với carbon hay oxi

nhưng nitơ là một yếu tố thiết yếu của tất cả sự sống sinh vật. Nó được kết hợp chặt chẽ

11 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

trong nguyên liệu tế bào và được dùng cho sự tăng trưởng, tạo ra enzyme và thông tin về di

truyền học. Tuy nhiên, nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ nối với nhau bằng 3

dây nối N N, nó rất khó để hầu hết sinh vật có thể bẻ gãy. May thay, nitơ phân tử được

+.

tạo ra sẵn có cho sự sống sinh vật khi mà liên kết 3 bị bẻ gãy bởi một nhóm vi khuẩn duy

+ là những vi khuẩn cố định nitơ.

nhất và được cố định lại hay biến đổi thành NH4

- Những vi khuẩn biến đổi nitơ phân tử thành NH4

Những vi khuẩn này có thể sống tự do trong đất xung quanh rễ của thực vật hay có thể tăng

+, được hoàn thành bởi

trưởng cộng sinh trong rễ của những cây họ đậu.

- Sự cố định nitơ tức là sự chuyển đổi nitơ phân tử thành NH4

enzyme nitrogenase chỉ được tìm thấy trong những vi khuẩn cố định nitơ. Trước khi sự sử

dụng phân bón nitơ lan rộng, thực vật tăng trưởng nốt sần hay những cây họ đậu cung cấp

nitơ cho đất. Ví dụ những cây họ đậu bao gồm: Cỏ linh lăng, Cỏ ba lá và những cây Đậu

nành.

- Một vài loài tảo cũng có thể sử dụng nitơ phân tử để sản xuất ra amino acid và

protein. Tảo lấy nitơ phân tử từ không khí và đồng hóa chúng thành những phân tử hữu cơ.

Cuối cùng, những phân tử hữu cơ này với nitơ liên kết thành cấu trúc của chúng và được

tiêu thụ trong suốt chiều dài của chuỗi thức ăn; như là tảo được tiêu thụ bởi những dạng

sống cao hơn.

- Sự di chuyển của nitơ và sự thay đổi chính nó trong các trạng thái oxi hóa từ không

khí sang sinh vật sống đến hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) và sự trở lại

+, NH3, NO2

- và NO3

của nó vào không khí là chu trình nitơ trong nước thải. Chu trình này liên kết với những

- là những dạng vô cơ của nitơ.

urea, NH4

- và NO3

hợp chất có bản chất nitơ then chốt liên tiếp như: nitơ phân tử (N2), amino acid, protein, -. Trong đó, amino acid và protein là những dạng hữu cơ của +, NH3, NO2 nitơ; còn nitơ phân tử (N2), NH4

- trong hệ thống cống rãnh là hiếm thấy. Những điều

- và NO3

- Sự sản sinh ra NO2

kiện trong hệ thống cống rãnh là không phù hợp cho sự tạo ra hay quá trình nitrate hóa của

những ion này. Những điều kiện bất lợi trong hệ thống cống rãnh ngăn cản quá trình nitrate

- và NO3

hóa bao gồm: sự thiếu oxi thích hợp, quần thể vi khuẩn nitrate hóa nhỏ và thời gian nước - có thể được tìm thấy trong hệ được giữ lại ngắn. Tuy nhiên, lượng rất lớn NO2

thống cống rãnh nếu chúng được thải ra từ nguồn nước thải công nghiệp có những ion này,

như là nước thải nhà máy thép.

- Những amino acid và protein trong mô thực vật, trong rễ, trong hạt và từ thịt vật

nuôi được thải trực tiếp vào hệ thống cống rãnh (rác vứt bỏ đi, nước thải chế biến thực

phẩm) và gián tiếp vào hệ thống cống rãnh (chất thải có bản chất là phân). Nhiều vi khuẩn

12 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

khử nhóm NH2 được hoàn thành với enzyme deaminase và đưa đến kết quả là tạo ra NH4

trong hệ thống cống rãnh khử nhóm amino (-NH2) ra khỏi các amino acid và protein. Sự +. + còn được biết đến như là quá trình amôn hóa. Sự khử nhóm NH2 của Sự tạo thành NH4

amino acid phenylalanine được cho thấy:

+

Phenylpyruvic acid. Phenylalanine –Proteus(cid:198) NH4

- Urea: là một hợp chất nitơ hữu cơ, chúng được tìm thấy trong nước tiểu, phân bón

và những chất thải từ chăn nuôi. Khi mà được thủy phân bởi enzyme urease của vi khuẩn, + được giải phóng. Enzyme urease được tìm thấy trong nhiều sinh vật dị dưỡng hóa NH4

năng hữu cơ liên kết với phân bao gồm: Citrobacter. Sự thủy phân urea thành NH3 và CO2

+.

bởi hoạt động của vi khuẩn là rất nhanh chóng. Ở pH của hệ thống cống rãnh NH3 nhanh

chóng được biến đổi thành NH4

NH2COHN2 H2O –Citrobacter(cid:198) 2NH3 CO2

- Những amino acid và những protein không được phân hủy trong hệ thống cống

+.

rãnh có thể được phân hủy trong hệ thống xử lý nước thải (bể aerotank). Sự phân hủy

những amino acid và protein trong bể aerotank cũng đưa đến kết quả sản sinh ra NH4

+ trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) có vài

- Những ion NH4

nhiệm vụ. Chúng có thể được dùng như nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị

dưỡng hóa năng hữu cơ và vi khuẩn nitrate hóa. Chúng có thể được giải phóng ra ngoài

không khí như NH3 ở pH cao và dưới những điều kiện hoạt động thích hợp, Nitrosomonas + không được sử dụng như nguồn -. Nếu những ion NH4 có thể oxi hóa chúng thành NO2

dinh dưỡng, hóa thành khí hay oxi hóa, chúng được chảy vào trong hệ thống nhánh của bể

aerotank.

- Dưới nhiệt độ lạnh hay điều kiện phương pháp hệ thống có giới hạn, ion NO2

- có - cũng có một -

thể tích lũy lại trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). NO2

vài nhiệm vụ trong hệ thống bùn hoạt tính. Chúng có thể bị oxi hóa hóa học thành NO3

dạng sợi. NO2

- không có sẵn trong bể aerotank, NO3

+ và NO2

nếu Cl2 được dùng để kiểm soát sự tăng trưởng không mong muốn của những sinh vật - còn có thể được oxi hóa sinh học bởi Nitrobacter dưới những điều kiện - được dùng hoạt động thuận lợi. Nếu NH4

ion NO2

như là nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Nếu những - không bị oxi hóa hay được dùng như nguồn dinh dưỡng nitơ, chúng được chảy - có thể được khử thành các khí vào hệ thống nhánh của bể aerotank. Trong bể lắng 2, NO2

N2O và N2.

13 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- NO3

+ trong bể aerotank, NO3

- trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) có một vài nhiệm vụ. - có thể được dùng như nguồn dinh - không được dùng như một nguồn dinh dưỡng nitơ thì chúng được

Trong sự vắng mặt của NH4

- có thể được khử nitrate.

dưỡng nitơ. Nếu NO3

chảy vào hệ thống nhánh của bể aerotank. Trong bể lắng 2, NO3

- là quan trọng chủ yếu trong chu trình nitơ nước thải. Chúng là sản

+ không có sẵn. NO3

- Những ion NO3

dưỡng nitơ khi mà NH4

phẩm của quá trình nitrate hóa, cơ chất của quá trình phản nitrate hóa và là nguồn dinh - được sử dụng như nguồn dinh dưỡng nitơ - rất thông qua một hệ thống sinh học được biết như sự đồng hóa nitrate. Những ion NO3

dồi dào, nguồn nitơ vô cơ trong nguồn nước.

- Sự phản nitrate có thể xảy ra trong lớp bùn của bể lắng 2 (trong Hệ thống xử lý

- và NO3

nước thải) khi mà điều kiện kỵ khí xảy ra trong lớp bùn. Ở đây vi khuẩn kỵ khí tùy nghi sử - để phân hủy cBOD hòa tan (carbonaceous BOD). Sự phân hủy này dụng NO2

được liên kết với sự giải phóng phân tử nitơ.

+ có thể được loại bỏ bởi hoạt động trộn hay sự hóa khí vào không

- Những ion NH4

khí như NH3. Tuy nhiên lượng NH3 mất đi qua sự hóa khí là rất nhỏ, tức là ít hơn 10%.

- Khi mà những chất thải nitơ hữu cơ không còn có sẵn nữa để giải phóng ra NH4

+ giảm. Sự giảm NH4

lượng NH4

- và NO3

và bị oxi hóa thành NO2

- xảy ra. Một vài ion NO3

+, + xảy ra vì chúng được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ -. Nếu quá trình nitrate hóa bắt đầu một cách đúng đắn, - có thể được loại bỏ đi như là + bị cạn kiệt. Nếu quá trình phản nitrate xảy ra thì

không có sự tích lũy của NO2

- sẽ bị giảm rất lớn, có lẽ được loại trừ.

nguồn dinh dưỡng nitơ khi mà NH4

lượng NO3

1.4 Giới thiệu về quá trình nitrate hóa trong môi trường (Introduction to

Nitrification):

+ thành NO2

- và sau -, oxi được cộng thêm vào những ion

- Quá trình nitrate hóa sinh học là sự biến đổi hay oxi hóa NH4

-. Trong thời gian oxi hóa NH4

+ và NO2

đó thành NO3

này bởi một nhóm sinh vật duy nhất, những vi khuẩn nitrate hóa. Quá trình nitrate hóa xảy

ra trong tự nhiên và trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). Quá trình

nitrate hóa trong đất là đặc biệt quan trọng trong tự nhiên, bởi vì nitơ được hấp thu bởi -. Quá trình nitrate hóa trong nước có liên thực vật như là nguồn dinh dưỡng dưới dạng NO3

quan đến xử lý nước thải, nhất là đảm bảo yêu cầu xả thải theo đúng quy chuẩn cho phép.

+ và NH3 là những dạng của hợp chất nitơ, chúng được oxi hóa trong suốt quá + và NH3 trong bể aerotank của hệ thống xử lý nước

- NH4

trình nitrate hóa. Số lượng của NH4

thải được quyết định bởi pH và nhiệt độ trong hệ thống.

14 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- được hoàn thành thông qua sự thêm vào oxi hòa tan bên

+ và NO2

- Sự oxi hóa NH4

trong những tế bào vi khuẩn. Bởi vì quá trình nitrate hóa hay sự thêm vào oxi của những

phản ứng hóa sinh xảy ra bên trong những tế bào sinh học, quá trình nitrate hóa xảy ra

thông qua những phản ứng hóa sinh.

+ được tạo ra trong nước thải từ sự thủy phân urea và sự phân hủy

- Những ion NH4

những hợp chất nitơ hữu cơ. Sự thủy phân và sự phân hủy những hợp chất nitơ hữu cơ đưa

đến kết quả là sự giải phóng ra những nhóm amino (-NH2) và sự tạo thành NH4

+. -, nhưng những sinh vật

+ và NO2

- Mặc dù có nhiều sinh vật có khả năng oxi hóa NH4

ban đầu chịu trách nhiệu chính trước nhất cho quá trình nitrate hóa trong hệ thống xử lý

nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) đó là 2 giống vi khuẩn nitrate hóa, Nitrosomonas và

Nitrobacter. Những giống này sở hữu những enzyme và cấu trúc tế bào đặc biệt cho phép

chúng hoàn thành quá trình nitrate hóa quan trọng này.

- Tốc độ của quá trình nitrate hóa đạt được bởi những vi khuẩn nitrate hóa thường là

1.000 – 10.000 lần lớn hơn tốc độ của quá trình nitrate hóa bằng những sinh vật khác. Bên

cạnh những vi khuẩn nitrate hóa, có 2 Protozoa chúng hiện diện với số lượng rất lớn trong

lúc quá trình nitrate hóa diễn ra nhanh nhất. Những Protozoa này là: Epistylis và

Vorticella.

- Mặc dù hệ thống bùn hoạt tính được dùng cho quá trình nitrate hóa, nhưng hệ thống

này không phải là lý tưởng cho quá trình nitrate hóa. Vì kích thước quần thể lớn và sự tăng

trưởng nhanh chóng của các sinh vật khác trong bể aerotank so sánh với kích thước quần

thể nhỏ và sự tăng trưởng chậm của những vi khuẩn nitrate hóa, kích thước quần thể của

những vi khuẩn nitrate hóa được làm giảm đi từ từ, tạo ra khó khăn để đạt được và duy trì

quá trình nitrate hóa mong muốn. Khoảng chừng 90% đến 97% vi khuẩn trong hệ thống

bùn hoạt tính là những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ, còn khoảng chừng 3% đến 10%

là vi khuẩn nitrate hóa.

1.5 Những vi khuẩn oxi hóa nitơ hay vi khuẩn nitrate hóa (Nitrifying Bacteria):

- Vi khuẩn nitrate hóa sống rất đa dạng trong môi trường sống của chúng ta bao gồm:

nước ngọt, nước có thể uống được, nước thải, nước biển, nước lợ và trong đất.

- Mặc dù một vài giống vi khuẩn nitrate hóa có khả năng sử dụng một vài hợp chất

hữu cơ để thu carbon, giống chủ yếu của những vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống xử lý

nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính), Nitrosomonas và Nitrobacter, sử dụng CO2 hay

carbon vô cơ như là nguồn carbon cho sự tổng hợp nguyên liệu tế bào. Mỗi phân tử CO2

- có thể được oxi hóa.

đồng hóa thành nguyên liệu tế bào bởi những vi khuẩn nitrate hóa, khoảng chừng 30 phân

+ hay 100 phân tử của NO2

tử của NH4

15 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

+ và NO2

- rất lớn cần để đồng hóa CO2, vi khuẩn nitrate hóa có tốc độ

- Vì lượng NH4

sinh sản rất chậm. Thậm chí dưới những điều kiện tốt nhất thì tốc độ sinh sản của vi khuẩn

nitrate hóa là rất nhỏ.

-

+ và NO2

- là sản phẩm của sự oxi hóa NH4

-. Ion NO2

cơ, cụ thể là NH4

cung cấp như là cơ chất cho Nitrobacter. Nếu NO2

Vi khuẩn nitrate hóa thu được năng lượng bởi quá trình oxi hóa những cơ chất vô + bởi Nitrosomonas - không được thải ra khỏi hệ thống bùn - có thể được sản sinh ra trong bể aerotank để mà Nitrobacter dùng làm hoạt tính thì NO2

cơ chất năng lượng.

-

-:

Có 2 phản ứng sinh năng lượng xảy ra trong suốt quá trình nitrate hóa. Nhiều năng +, hơn là phản ứng thứ 2, lượng được lấy từ dạng phản ứng đầu tiên, tức là, sự oxi hóa NH4

+

-

tức là sự oxi hóa NO2

-

2H+ Năng lượng. NH4 1.5O2 –Nitrosomonas(cid:198) NO2 H2O

-

Năng lượng. NO2 0.5O2 –Nitrobacter(cid:198) NO3

-

đều sử dụng oxi phân tử tự do. Từ đó sự tích lũy NO2

+ sang NO3

Phản ứng sinh năng lượng xảy ra trong những tế bào vi khuẩn và cả 2 phản ứng này - không xuất hiện. Toàn bộ phản ứng -. Toàn bộ phản ứng nitrate hóa nitrate hóa được điều khiển bằng sự oxi hóa NH4

+

-

là một sự kết hợp của 2 phản ứng sinh năng lượng trên:

2H+ NH4 2O2 –Vi khuẩn Nitrate hóa(cid:198) NO3 H2O.

- Mặc dù NH4

+ được dùng như một nguồn năng lượng bởi những vi khuẩn nitrate + có trong tế bào vi khuẩn đều được nitrate hóa. Một vài ion + được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ và được đồng hóa thành nguyên liệu tế bào

hóa, không phải tất cả NH4

NH4

mới (C5H7O2N). Sự tăng trưởng của những tế bào mới trong hệ thống bùn hoạt tính được

tạo thành do sự tăng lên của những chất rắn lơ lửng huyền phù trộn lẫn trong nước

-

+

(MLVSS) (Mixed liquor volatile suspended solids).

4CO2 HCO3 NH4 4H2O (cid:198) C5H7O2N 5O2 3H2O.

-

+ hay NO2

Có vài giống vi khuẩn nitrate hóa. Các giống có thể được tập hợp lại thành nhóm -: với nhau dựa theo chúng oxi hóa NH4

Bảng 1.1: Các giống của vi khuẩn nitrate hóa.[16]

16 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Cơ chất năng lượng Sản phẩm oxi hóa Các giống vi khuẩn

(Energy Substrate) (Oxidized Product) nitrate hóa (Genera of

-

Nitrifying Bacteria)

+

Nitrosococcus NO2 NH4 Nitrosocystis

Nitrosolobus

Nitrosomonas

-

Nitrosospira

-

Nitrobacter NO3 NO2 Nitrococcus

Nitrospira

- Những vi khuẩn nitrate hóa không có khả năng gây bệnh, chúng không có trong

đường ruột của con người. Vì vậy những vi khuẩn nitrate hóa không đi vào hệ thống cống

rãnh và hệ thống xử lý nước thải với lượng lớn thông qua nước thải gia đình. Vi khuẩn

nitrate hóa xuất xứ từ đất và nước.

- Những vi khuẩn nitrate hóa Nitrosomonas và Nitrobacter có ở mức độ lớn, nếu

không hoàn toàn, là nguyên nhân của quá trình nitrate hóa trong đất. Bởi vì những vi khuẩn

nitrate hóa bị tiêu diệt bởi ánh sáng tử ngoại, chúng không được tìm thấy lượng lớn trên bề

mặt của đất. Tuy nhiên, chúng được tìm thấy với số lượng lớn trực tiếp bên dưới bề mặt

của đất nơi ánh sáng cực tím không thể lọt vào được.

-

+ và NO2

Trong hệ thống xử lý nước thải, 2 loài vi khuẩn nitrate hóa chịu trách nhiệm chính - là Nitrosomonas europeae và Nitrobacter agilis. Những cho sự oxi hóa NH4

giống vi khuẩn nitrate hóa khác cũng quan trọng không kém trong hệ thống xử lý nước thải

(Hệ thống bùn hoạt tính).

- Nitrosomonas và Nitrobacter là những vi khuẩn gram âm và hiếu khí bắt buộc,

chúng yêu cầu oxi phân tử tự do hay oxi hòa tan nhằm để oxi hóa cơ chất. Mặc dù những

vi khuẩn nitrate hóa có thể sinh trưởng phát triển và sinh sản trong sự hiện diện của phần

lớn những hợp chất hữu cơ, một vài dạng hợp chất hữu cơ có thể ức chế hoạt động của

chúng, tức là, ức chế quá trình nitrate hóa. Những hợp chất ức chế đó bao gồm: Cồn và

Acid. Một vài hợp chất hữu cơ có chứa nhóm amino (-NH2), như là Methylamine

(CH2NH2), cũng ức chế hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa.

- Với vài ngoại lệ, những vi khuẩn nitrate hóa là những sinh vật tự dưỡng bắt buộc

(nghiêm ngặt). Bởi vì chúng là những vi sinh vật tự dưỡng bắt buộc, vài dạng hợp chất hữu

17 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

cơ đơn giản còn lại trong bể aerotank có thể ức chế vi khuẩn nitrate hóa, tức là, ức chế quá

trình nitrate hóa. Vì vậy một quần thể sinh vật tự dưỡng hóa năng hữu cơ lớn và đa dạng

hiện diện trong bể aerotank để mà oxi hóa những hợp chất hữu cơ có dạng đơn giản ấy.

Bảng 1.2: Sinh lý học cơ bản và những đặc trưng về cấu trúc của Nitrosomonas và

Nitrobacter.[16]

Nitrosomonas Nitrobacter Điểm đặc trưng

Vô cơ (CO2) Vô cơ (CO2) Nguồn carbon

Cầu khuẩn (Coccus) Hình que (Bacillus) Hình dạng tế bào

0.5 – 1.5 0.5 1.0 Kích thước tế bào

(µm)

Đất và nước Đất và nước Môi trường sống

Có Có hoặc Không Di động

Hiếu khí bắt buộc Hiếu khí bắt buộc Nhu cầu oxi

5.8 – 8.5 6.5 – 8.5 Khoảng pH tăng

trưởng

Sinh sản nhân đôi Nảy chồi Cách thức sinh sản

8 – 36 giờ 12 – 60 giờ Thời gian thế hệ

5 – 30oC 5 – 40oC Khoảng nhiệt độ tăng

trưởng

Hiệu suất sinh bùn 0.04 - 0.13 pound sinh + được oxi 0.02 – 0.07 pound sinh - được oxi khối/g NH4 khối/g NO2 (Sludge yield) hóa hóa

Hiện diện Hiện diện Màng tế bào

- Vi khuẩn nitrate hóa có thể tăng trưởng và sinh sản bằng những tế bào riêng biệt

hay khối tập hợp nhỏ dính chặt vào nhau trong chất nhờn. Trong hệ thống bùn hoạt tính,

những vi khuẩn nitrate hóa được tìm thấy hút bám trên bề mặt của những hạt keo và lơ

lửng trong bể.

18 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Những vi khuẩn nitrate hóa sinh sản vô tính. Nitrosomonas: sinh sản bằng sự tự

phân đôi hay sự phân cắt hoàn toàn thành hai phần; trong khi đó, Nitrobacter: sinh sản

bằng cách nảy chồi.

-

+ và NO2

Vì những vi khuẩn nitrate hóa thu được một lượng rất nhỏ năng lượng từ sự oxi hóa -, sự sinh sản hay thời gian thế hệ là chậm và quần thể nhỏ. Kích thước quần NH4

thể vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính là rất nhỏ khi mà so sánh với kích

thước quần thể của các sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ.

- Sự khác nhau trong kích thước quần thể giữa vi khuẩn nitrate hóa và những vi

khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ là do 2 lý do. Thứ nhất, trong hầu hết hệ thống bùn hoạt

tính thành phố và công nghiệp, nồng độ của chất thải có bản chất carbon vượt qúa giới hạn

nồng độ của những chất thải có bản chất nitơ. Vì vậy nhiều cơ chất có giá trị để tăng

trưởng nhiều vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Thứ hai, những vi khuẩn dị dưỡng hóa

năng hữu cơ thu được nhiều năng lượng từ sự sinh sản hơn những vi khuẩn nitrate hóa khi

chúng oxi hóa những cơ chất tương ứng của chúng. Vì vậy những vi khuẩn dị dưỡng hóa

năng hữu cơ có thể sinh sản nhanh hơn nhiều những vi khuẩn nitrate hóa có thể sinh sản.

- So sánh thời gian thế hệ của những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ với vi

khuẩn nitrate hóa thì vi khuẩn nitrate hóa dài hơn nhiều. Thời gian thế hệ của hầu hết

những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ trong hệ thống bùn hoạt tính là 15 đến 30 phút.

Dưới những điều kiện thuận lợi, thời gian thế hệ của những vi khuẩn nitrate hóa trong hệ

thống bùn hoạt tính là 48 đến 72 giờ.

- Trong quần thể vi khuẩn nitrate hóa cũng có một kích thước quần thể khác biệt giữa

Bởi vì Nitrosomonas thu được nhiều năng lượng từ sự oxi hóa NH4

Nitrosomonas và Nitrobacter. Kích thước quần thể Nitrosomonas là lớn hơn Nitrobacter. + hơn Nitrobacter thu -, Nitrosomonas có thời gian thế hệ ngắn hơn và có thể tăng nhanh được từ sự oxi hóa NO2

chóng về số lượng khi so sánh với Nitrobacter. Một kích thước quần thể lớn của

-.

Nitrosomonas hơn Nitrobacter trong hệ thống bùn hoạt tính đáp ứng cho khả năng oxi hóa

+ nhiều hơn khả năng oxi hóa NO2

NH4

- Sự khác nhau trong thời gian thế hệ giữa Nitrosomonas và Nitrobacter ảnh hưởng

trực tiếp đến quá trình nitrate hóa. Sự khác nhau ấy là nguyên nhân gây nên sự tích lũy - trong suốt thời gian những điều kiện hoạt động không thuận lợi trong hệ thống bao NO2

gồm: nhiệt độ lạnh, quá trình rửa trôi cơ học, mức oxi hòa tan thấp, độc chất…

-

+ và NO2

Mặc dù kích thước quần thể cơ bản của vi khuẩn nitrate hóa phụ thuộc vào lượng -), sự tăng trưởng và sinh sản của quần thể bị ảnh hưởng mạnh cơ chất sẵn có (NH4

19 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

bởi vài yếu tố hoạt động bao gồm: oxi hòa tan, tính kiềm và pH, nhiệt độ, chất ức chế, chất

độc và phương thức hoạt động của cả hệ thống xử lý nước thải.

Bảng 1.3: Sự tăng về kích thước quần thể của Nitrosomonas và Nitrobacter sau 72

giờ.[16]

Nitrosomonas Nitrobacter Thời gian

Sự phân Vi khuẩn Sự phân Vi khuẩn (giờ)

bào bào

0 1 0 1 0

1 2 0 1 8

2 4 1 2 16

3 8 2 4 24

4 16 2 4 32

5 32 3 8 40

6 64 4 16 48

7 128 4 16 56

8 256 5 32 64

9 512 6 64 72

- Ví dụ, tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa bị ảnh hưởng trực tiếp bởi nhiệt

độ. Với sự tăng lên của nhiệt độ, sự tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa tăng nhanh và quá

trình dễ dàng kết thúc. Vì vậy khi nhiệt độ giảm, tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn nitrate

- có thể xảy ra vì Nitrobacter oxi hóa NO2

+.

hóa giảm và quá trình nitrate hóa được hoàn tất với nhiều khó khăn. Vì vậy trong thời gian - chậm hơn nhiều nhiệt độ thấp, sự tích lũy NO2

so với Nitrosomonas oxi hóa NH4

- ở bên trong bể aerotank.

- Sự hiện diện vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính có thể được nhận

- hay NO3

biết bởi sự tạo ra NO2

- Việc phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa rất khó thực hiện trên môi trường

thạch do thời gian thế hệ kéo dài và chúng không có khả năng cạnh với vi khuẩn dị dưỡng.

Chính vì vậy, để phân lập được các chủng vi khuẩn nitrate hóa phải dùng silica gel thay

cho thạch [5].

20 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

1.6 Những sinh vật chỉ thị hay những chất chỉ thị cho quá trình Nitrate hóa

(Indicators of Nitrification):

-

- và Hệ thống bùn hoạt tính (của một hệ thống xử lý nước thải) oxi hóa nitơ nếu NO2 - được sinh ra trong bể aerotank. Dù có nhiều cơ chế khác nhau của sự mất đi và sinh + trong bể aerotank

+ trong bể aerotank; do đó, một mình sự giảm nồng độ của NH4

NO3

ra NH4

-. Tuy nhiên, nếu sự kiểm tra NO2

- hay NO3

- hay NO3

không biểu lộ quá trình nitrate hóa. Quá trình nitrate hóa được chứng minh bằng sự sản - trong hệ thống không sinh ra NO2

được thực hiện, thì quá trình nitrate hóa có thể được nghi ngờ bởi sự hiện diện của sinh vật

chỉ thị sinh học, chất chỉ thị hóa học và những sinh vật báo hiệu tự nhiên khác.

- Những sinh vật chỉ thị sinh học của quá trình nitrate hóa bao gồm: sự tăng trưởng

của Tảo và Bèo tấm trong bể lắng 2, sự tăng lên có ý nghĩa của nhu cầu oxi pha trộn trong

- hay quá trình nitrate hóa trong bể aerotank.

nước và sự giảm đi có ý nghĩa của mức oxi hòa tan trong hệ thống. Tảo và Bèo tấm thu -. Vì vậy sự hiện diện của chúng trong bể lắng 2 là một được chất dinh dưỡng nitơ từ NO3

sự chỉ thị của sự sản sinh ra NO3

- Bèo tấm: là những thực vật có hoa bé nhỏ nhất và đơn giản nhất. Bèo tấm sinh sôi

nảy nở nhanh chóng và nổi trên mặt nước. Có 3 giống Bèo tấm chúng được tìm thấy trong

hệ thống bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thải. Những giống này là: Lemna,

Spirodella, và Wolffia.

-

+ và NO2

Khi mà quá trình nitrate hóa xảy ra trong bể aerotank, lượng lớn oxi hòa tan được -. Vì vậy, khi quá tiêu thụ bởi những vi khuẩn nitrate hóa do chúng oxi hóa NH4

trình nitrate hóa xảy ra, sự đòi hỏi có ý nghĩa của sinh khối về oxi hòa tan xuất hiện và

mức độ oxi hòa tan trong bể aerotank giảm đi.

- Những chất chỉ thị hóa học của quá trình nitrate hóa bao gồm sự tăng lên nhu cầu

- tích lũy và NO2

và NO2

Cl2 để khử trùng trong phụ lưu bể lắng 2. Nếu quá trình nitrate hóa không hoàn tất xảy ra - phản ứng nhanh chóng với Cl2, đưa đến kết quả là sự tiêu diệt - trong bể aerotank đưa coliform kém đi trong phụ lưu của bể lắng 2. Sự sản sinh ra NO2

đến kết quả là sự phá hủy tính kiềm. Sự phản nitrate hóa trong bể lắng 2 (do kết quả nitrate

hóa trong bể aerotank) trả lại tính kiềm cho nước thải. Sự trả lại tính kiềm đưa đến sự tăng

tính kiềm hay pH.

- Nếu vài sinh vật chỉ thị sinh học, hóa học hay tự nhiên của quá trình nitrate hóa xảy

ra trong hệ thống bùn hoạt tính chúng không được yêu cầu nitrate hóa, khi đó sự nitrate

- sẽ được thực hiện.

hóa sẽ bị nghi ngờ. Để xác định dạng nitrate hóa đang xảy ra, sự kiểm tra nước trong hệ

+, NO2

- và NO3

thống về nồng độ NH4

21 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

1.7 Những yếu tố hay điều kiện môi trường ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa

1.7.1 Sự tích lũy NO2

- Sự tích lũy NO2

- thành NO3

và quá trình nitrate hóa: -: - một phần ức chế đến hoạt động của enzyme bên trong vi khuẩn -. Những yếu nitrate hóa. Sự ức chế này ngăn cản sự oxi hóa nhanh chóng NO2

tố hoạt động chịu trách nhiệm chính cho sự ức chế này bao gồm: nhiệt độ lạnh, sự thiếu hụt + cao ở phụ lưu, những chất thải ức chế và những chất dinh dưỡng then chốt, nồng độ NH4

độc, sự thay đổi pH, thời gian lưu nước ngắn trong bể aerotank và mức oxi hòa tan thấp

nhất thời.

- trong hệ thống bùn hoạt tính có thể là sự cố thay đổi theo mùa vì - thường xảy ra tại thời điểm cuối

- Sự tích lũy NO2

sự thay đổi nhiệt độ và nồng độ MLVSS. Sự tích lũy NO2

mùa đông hay ngay từ đầu mùa xuân trong hệ thống bùn hoạt tính.

1.7.2 Oxi hòa tan (DO):

- Có nhiều nhu cầu hoạt động được biết ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa hay quá

trình nitrate hóa, nồng độ oxi hòa tan là một trong những nhu cầu quan trọng ấy. Tuy nhiên

nồng độ DO tối ưu nhất để hoàn thành quá trình nitrate hóa là rất thấp, từ 2 – 3 mg/l và

không may, nhiều hệ thống bùn hoạt tính được thông khí vượt qúa để hoàn thành quá trình

nitrate hóa.

- Sự thông khí vượt quá thực tiễn không mang lại lợi nhuận và có thể góp phần làm

lượng DO được duy trì trong bể aerotank sẽ được điều chỉnh để phù hợp với nồng độ NH4

- và NO3

chia cắt những hạt keo hay làm tăng những bọt khí. Để quá trình nitrate hóa có hiệu quả, + -. Ngoài ra, để nồng độ DO trong bể aerotank, trong phụ lưu nước pha trộn, NO2

xáo trộn đủ phải được duy trì để ngăn cản sự phân tầng của DO. Và DO phải thâm nhập

vào lõi của những hạt keo.

- Bởi vì vi khuẩn nitrate hóa là hiếu khí bắt buộc, chúng chỉ có thể oxi hóa nitơ khi

có sự hiện diện của oxi hòa tan. Ở nồng độ DO 0.5 mg/l quá trình nitrate hóa không xảy

ra. Những yếu tố chủ yếu cho giới hạn này về lượng của quá trình nitrate hóa là sự thiếu

oxi cho sự khuếch tán qua các hạt keo và sự cạnh tranh về oxi bởi những sinh vật khác.

- Sự tăng nồng độ oxi cho phép tốt hơn sự thâm nhập DO vào hạt keo và khuyến

khích thêm quá trình nitrate hóa. Trong khoảng DO từ 0.5 – 1.9mg/l, quá trình nitrate hóa

tăng tốc, nhưng nó không có hiệu quả lắm. Quá trình nitrate hóa có ý nghĩa được hoàn tất ở

nồng độ DO từ 2.0 – 2.9mg/l, trong khi đó quá trình nitrate hóa đạt cao nhất xuất hiện gần

với nồng độ DO 3.0mg/l.

22 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bảng1.4: Nồng độ DO và quá trình nitrate hóa đạt được.[16]

Quá trình nitrate hóa đạt được Nồng độ DO (mgO2/l)

Ít, một số lượng không xác định, quá 0.5mg/l trình nitrate hóa xuất hiện.

Quá trình nitrate hóa xảy ra nhưng 0.5 – 1.9mg/l yếu kém.

Quá trình nitrate hóa có ý nghĩa xảy 2.0 – 2.9mg/l ra.

Quá trình nitrate hóa đạt tối đa. 3.0mg/l

-

+ và NO2

Bởi vì vi khuẩn nitrate hóa phải giảm bớt CO2 cho tăng trưởng tế bào, sinh sản và -. Chúng cạnh tranh kém với những vi thu được ít năng lượng từ sự oxi hóa NH4

khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ về DO trong bể aerotank. Vì vậy mức DO trong bể

aerotank sẽ được giám sát một cách cẩn thận và không cho phép xuống dưới 1.5mg/l. Dưới

giá trị này sự giảm bớt hoạt động nitrate hóa xuất hiện.

- Những vi khuẩn nitrate hóa có thể vẫn còn sống trong sự vắng mặt của DO chỉ

trong một khoản thời gian rất ngắn. Sự vắng mặt của DO ít hơn 4 giờ không ảnh hưởng bất

lợi đến hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa cho đến khi DO được khôi phục. Sự vắng mặt

DO nhiều hơn 4 giờ ảnh hưởng bất lợi đến hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa cho đến khi

DO được khôi phục lại. Sự vắng mặt DO trong 24 giờ hay nhiều hơn có thể phá hủy quần

thể vi khuẩn nitrate.

1.7.3 Tính kiềm và pH:

- Nồng độ ion H+ hay pH của môi trường sống của sinh vật có ảnh hưởng tác động

rất lớn đến bên trong sinh vật. Quá trình nitrate hóa bắt đầu rất chậm ở pH thấp và nó có

thể xảy ra trong hầu hết môi trường; quá trình nitrate hóa xảy ra ở pH dưới 5.0 không phải

do vi khuẩn nitrate hóa thực hiện mà do những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ thực

hiện, bao gồm cả nấm. Ở giá trị pH trung tính thì vi khuẩn nitrate hóa có ưu thế hơn. Và ở

giá trị pH kiềm thì quá trình nitrate hóa chủ yếu là do vi khuẩn nitrate hóa thực hiện.

Bảng 1.5: pH và quá trình nitrate hóa.[16]

23 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

pH Tác động đến quá trình nitrate hóa

Sự hiện diện của vi khuẩn nitrate hóa; nitrate hóa của 4.0 – 4.9 những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ xảy ra.

Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc 5.0 – 6.7 độ nitrate hóa chậm chạp.

Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc 6.7 – 7.2 độ nitrate hóa tăng lên.

Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc 7.2 – 8.0 độ nitrate hóa được xem là hằng số.

Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa. 7.5 – 8.5

- pH thấp trong nước thải có một ảnh hưởng đầu tiên đến vi khuẩn nitrate hóa bởi sự

ức chế hoạt động của enzyme và ảnh hưởng thứ 2 là đến tính kiềm. Quá trình nitrate hóa

trong hệ thống bùn hoạt tính bắt đầu tăng tốc khi pH 6.7. Khoảng pH tối ưu cho quá

trình nitrate hóa là 7.2 đến 8.0. Ở khoảng pH từ 7.2 đến 8.0 thì tốc độ của quá trình nitrate

hóa được thừa nhận là không thay đổi. Và nhiều hệ thống bùn hoạt tính oxi hóa nitơ ở pH

gần trung tính. Ở pH cao hơn sẽ tác động bất lợi đến các sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu

cơ làm nhiệm vụ phân hủy cBOD. May thay những vi khuẩn nitrate hóa thích nghi với môi

trường chậm hơn khi ở pH thấp hơn tối ưu. Tuy nhiên, sự thích nghi với môi trường này có

thể yêu cầu sự tăng dần dần hay giảm dần dần của pH.

1.7.4 Nhiệt độ (Temperature):

- Trong tất cả các yếu tố hoạt động ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa, nhiệt độ có

sự ảnh hưởng ý nghĩa trên hết trong sự tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa và do đó, ảnh

hưởng đến tốc độ của quá trình nitrate hóa. Tốc độ của quá trình nitrate hóa giảm theo sự

giảm của nhiệt độ và ngược lại, tăng theo sự tăng của nhiệt độ và nhất là trong khoảng từ 8 đến 30oC. Nitrosomonas tăng gần 10% tốc độ tăng trưởng khi nhiệt độ tăng 1oC. Dưới 10oC tốc độ quá trình nitrate hóa hạ xuống đột ngột. Trên 10oC thì tốc độ quá trình nitrate

hóa hầu như tương ứng về nhiệt độ. Nitrosomonas được phân lập từ hệ thống bùn hoạt tính có tốc độ tăng trưởng tối ưu ở 30oC. Vì vậy, những mục đích của hoạt động, nhiệt độ tối ưu cho quá trình nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính được tính toán phổ biến là ở 30oC. Không có sự tăng trưởng của Nitrosomonas hay Nitrobacter xảy ra dưới 4oC.

Bảng 1.6: Nhiệt độ và quá trình Nitrate hóa.[16]

24 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Nhiệt độ (toC) Sự ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa

Quá trình nitrate hóa dừng lại. 45oC

Khoảng nhiệt độ tối ưu. 28 – 32oC

16oC Tốc độ quá trình nitrate hóa khoảng chừng 50% so với khi ở 30oC.

10oC Sự giảm bớt có ý nghĩa về tốc độ, khoảng chừng 20% về tốc độ so với khi ở 30oC.

Quá trình nitrate dừng lại. 5oC

- tích lũy lại trong thời gian nhiệt độ lạnh vào mùa đông.

- Tác động ức chế của nhiệt độ lạnh là rất lớn đến Nitrobacter hơn Nitrosomonas. Vì

vậy mà không kỳ lạ khi NO2

1.7.5 Sự ức chế và độc tính (Inhibition and Toxicity):

- Có vài dạng sự ức chế và độc tính có thể xảy ra trong thời gian quá trình nitrate

hóa. Sự ức chế là sự mất đi tạm thời của hoạt động enzyme. Độc tính là sự mất đi lâu dài

của hoạt động enzyme hay hư hại không thể thay đổi được của cấu trúc tế bào.

- Tất cả vi khuẩn nitrate hóa có thể khắc phục sự ức chế bằng sự sửa chữa những hệ

+ và NO2

thống enzyme đã bị hỏng. Vì vi khuẩn nitrate hóa chỉ thu được một lượng rất nhỏ năng -, và không may, năng lượng đủ thường không có sẵn cho lượng từ sự oxi hóa NH4

duy trì sự thích nghi với khí hậu. Vì vậy, với sự tăng lên dù là rất ít của những chất gây ức

chế cũng có thể gây ra những sự thay đổi đáng chú ý trong sự tăng trưởng của vi khuẩn

nitrate hóa.

- Với lượng năng lượng rất ít có sẵn để thích nghi với khí hậu, vi khuẩn nitrate hóa

dễ bị tổn thương với nồng độ rất thấp của những chất thải vô cơ và những chất thải hữu cơ.

Những chất thải có độc tính cao với vi khuẩn nitrate hóa bao gồm: cyanide, những hợp

chất halogenated, những kim loại nặng, hydantoin, mercaptans, phenols và thiourea.

-

acid tự do. NH3 tự do được sinh ra từ NH4

Vi khuẩn nitrate hóa còn bị ức chế bởi nồng độ rất thấp của NH3 tự do và nitrous + dưới pH cao trong bể aerotank. Còn acid - dưới pH thấp trong bể aerotank. Sự ức chế hay độc tính nitrous tự do được sinh ra từ NO2

từ NH3 tự do và acid nitrous tự do được biết đến như là sự ức chế bởi cơ chất ban đầu gây

ra.

+ dễ dàng chuyển đổi thành NH3 tự do:

+

- Với sự tăng lên của pH, những ion NH4

OH- NH4 NH3 H2O

25 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- NH3 tự đo ức chế Nitrosomonas và Nitrobacter. NH3 tự do có thể ức chế

Nitrosomonas ở nồng độ bằng với 10mg/l. NH3 tự do có thể ức chế Nitrobacter ở những

- dễ dàng chuyển đổi nhiều hơn thành acid nitrous tự do:

nồng độ bằng với 0.1mg/l.

-

- Với sự giảm pH, ion NO2

NO2 H+ ↔ NHO2

Acid nitrous tự do ức chế Nitrosomonas và Nitrobacter ở nồng độ rất thấp. Cả 2 -

giống vi khuẩn có thể bị ức chế bởi acid nitrous tự do ở nồng độ bằng với 1.0mg/l.

+ được biến đổi thành NO2

-

500mg/l NH4

+, hay khi NH4 -. Vì vậy sự quá dư thừa NH4

Sự ức chế cơ chất trong hệ thống bùn hoạt tính thường xảy ra ở nồng độ từ 400 đến - được biến - ở tốc độ cao hơn NO2 + chảy ra hay sự khử nhóm NH2 của những hợp đổi thành NO3

chất nitơ hữu cơ có thể ức chế quá trình nitrate hóa.

- Ngoài những vi khuẩn có khả năng quang hợp ra, sự bức xạ cực tím gây tổn hại đến

hầu hết các loại vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn nitrate hóa. Hầu hết những bước sóng gây

hại là 265nm. Có thể do bức xạ tia cực tím là nguyên nhân gây ra sự ngưng hoạt động của

hệ thống enzyme, đặc biệt là những tế bào còn non hay những tế bào đang tăng trưởng

nhanh chóng.

Bảng 1.7: Những dạng của sự ức chế và độc chất.[16]

Dạng của sự ức chế hay độc chất Sự mô tả và ví dụ

Khử trùng bằng clo của RAS và Cl2 tự do còn dư lại nhánh.

Những kim loại nặng và cyanide. Vô cơ

Những chất thải công nghiệp, e.g., Hữu cơ phenol.

5.0 pH

NH3 tự do và NHO2 tự do. Cơ chất

Sự bức xạ cực tím. Ánh sáng mặt trời

5oC Nhiệt độ

1.8 Tăng cường sinh học (Bioaugmentaion) [10]:

1.8.1 Định nghĩa:

26 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Tăng cường sinh học là việc sử dụng những vi sinh vật được nuôi cấy đặc biệt từ

môi trường bên ngoài để bổ sung vào trong các hệ thống xử lý nước thải nhằm tăng hiệu

quả xử lý nước thải.

1.8.2 Phương pháp tăng cường sinh học:

Hình 1.6: Quy trình phân lập tuyển chọn, cải biến các VSV nguồn gốc tự

nhiên để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm. (Gray NF, 2004)[10]

- Những vi sinh vật được dùng thường là những loài có sẵn trong tự nhiên, được

phân lập từ những nơi đặc biệt, nơi mà sự chọn lọc tự nhiên cho phép chúng thích nghi với

những điều kiện khác thường.

- Những vi sinh vật này được tăng sinh trong phòng thí nghiệm và được nuôi cấy

trong một môi trường với sự giàu chất gây ô nhiễm mà chúng được yêu cầu phân hủy. Từ

đó những giống tốt nhất có thể được phân lập và tăng sinh cho mục đích sử dụng thương

mại.

1.9 Các nghiên cứu liên quan đến quá trình phân lập, nuôi cấy các chủng vi khuẩn

Nitrate hóa:

- Sự phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã được

thực hiện thành công đầu tiên bởi Winogradsky (1890). Sự thành công này của ông đã

được biết đến vài năm trước khi quá trình nitrate hóa được tìm ra là do những sinh vật sống

thực hiện (Schloesing & Muntz, 1877) và sự cố gắng của Frankland cùng các cộng sự

27 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

(1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những phương pháp vi khuẩn học thường dùng

đã gặp thất bại.

- Bằng sự hiểu biết sâu sắc của mình, Winogradsky đã khám phá ra phương thức tự

dưỡng trong sự sống của những vi khuẩn oxi hóa lưu huỳnh và sắt; và đi đến kết luận rằng

những vi khuẩn nitrate hóa cũng có thể là tự dưỡng, và vì vậy ông đã thành công trong việc

phân lập chúng bằng việc sử dụng những môi trường phân lập nuôi cấy không phải từ chất

-).

liệu hữu cơ. Trong năm 1892, Winogardsky đã mô tả được 2 chủng, Nitrosomonas và

Nitrosococcus (chúng oxi hóa NH3); và một chủng, Nitrobacter (chúng oxi hóa NO2

- Và sau đó, những phương pháp nghiên cứu phân lập của ông đã được sử dụng rộng

rãi thành công bởi những nghiên cứu tiếp theo sau của các nhà khoa học cùng các cộng sự

của họ như: Boullanger & Massol (1903), Bonazzi (1919), Gibbs (1919), Nelson (1931)

và Kingma Boltjes (1934, 1935).

- Năm 1950, bằng phương pháp cải tiến từ phương pháp của Winogradsky, Jane

Meiklejohn đã thành công trong việc phân lập chủng Nitrosomonas europaea từ sự nuôi

cấy thuần khiết. Và cũng trong nghiên cứu này, bà cũng đã tìm ra được môi trường thích

hợp (có bổ sung thành phần vi lượng cần thiết) để duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn

nitrate hóa (qua nhiều lần cấy chuyển môi trường để tăng sinh mà không bị mất hoạt tính

như ban đầu bà đã vấp phải khi mới bắt đầu nghiên cứu) [11].

-

Và cũng trong năm 1953, Jane Meiklejohn đã nghiên cứu và tìm ra lượng sắt tối - của các ưu cho vào môi trường nuôi cấy để tăng khả năng chuyển hóa từ NH3 thành NO2

chủng Nitrosomonas spp. [12].

- Năm 1958, bằng nghiên cứu thực nghiệm của mình, R.F.Lewis và D.Pramer đã

khám phá ra rằng: sự phân lập Nitrosomonas tốt hơn khi có sự kết hợp với những vi khuẩn

dị dưỡng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy [18].

- Năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và

nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện ra và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi

hóa NH3 khác.

- Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh sạch

được Nitrosomonas và Nitrosocystis spp. bằng việc sử dụng môi trường agar tinh chế và

một phương pháp thu nhận những tập đoàn với những pipet mao quản thủy tinh được hoạt

động bởi máy vi thao tác đơn trước đây đã được mô tả bởi Soriano (1935) [20].

- Năm 1998, Martin Hessels e và S rensen đã tìm ra được một kỹ thuật vi khuẩn

lạc để ước lượng khả năng phát triển của vi khuẩn nitrite hóa: Nitrosomonas europaea và

Nitrosospira sp. dựa trên sự phân ra trên những màng lọc [15].

28 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Năm 2003, Patrick Chain, Jane Lamerdin, Frank Larimer và nhiều cộng sự

khác nữa đã thành công trong việc tìm ra và hoàn tất chuỗi gene của vi khuẩn nitrite hóa

và chủng Nitrosomonas europaea [17].

- Mới đây, 3 nhà khoa học: Kh.Elbanna, R.M.El-Shahawy và K.M.Atalla (2011) đã

tìm ra được một phương pháp mới đơn giản là sử dụng những chất chỉ thị hóa học thay thế

những phương pháp hóa học cổ điển để điều tra những vi khuẩn nitrate hóa trong những

môi trường khác nhau với hiệu quả rất cao [13].

- Và ngày nay với sự tiến bộ vượt bậc về mặt khoa học kỹ thuật, người ta đã áp dụng

kỹ thuật PCR để xác định đoạn gene amoA (mã hóa cho trung tâm hoạt động của enzyme

chìa khóa trong quá trình nitrite hóa là ammonia monooxygenase-AOB) và phương pháp

phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH (Fluorescence in situ hybridization).

Và đã có nhiều ứng dụng các chủng vi khuẩn nitrate hóa vào thực tiễn cuộc sống và đặc

biệt nhất là ứng dụng các chủng vi khuẩn này vào hệ thống xử lý nước thải để xử lý các

chất thải có bản chất nitơ với hiệu quả rất cao.

- Trên thị trường Việt Nam hiện nay có rất nhiều chế phẩm sinh học được giới thiệu

để xử lý nước thải, trong đó có nước thải giàu nitơ như: TP- 05- Super (Công Ty Cổ phần

Công nghệ Sinh học Thú Y, Biên Giang, Thành phố Hà Đông, Hà Nội), Tidy Pro, Bio 100

Treatment (Công ty TNHH Giải Pháp chăn Nuôi Xanh, 18/6A ấp Mới 1, xã Tân Xuân,

huyện Hóc Môn, Tp Hồ Chí Minh), C.Zyme, M.Zyme (Công ty TNHH Long Hiệp, Lô B1,

KCN Suối Dầu, Cam Lâm, Khánh Hoà)..., theo đăng ký có ghi sự có mặt của các vi khuẩn

nitrate hóa [24]. Tuy nhiên, hoạt lực của các chế phẩm này không rõ ràng, đó là lý do tại

sao chúng tôi quyết định tìm hiểu khả năng tăng sinh, phân lập vi khuẩn nitrate hóa để xử

lý nước thải giàu nitơ.

29 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

30 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

2.1 Thời gian và địa điểm:

Đề tài được thực hiện từ: 21/4 đến 21/7 năm 2012. -

Địa điểm lấy mẫu nước thải: “Công ty CP Thủy sản số 4”, 320 Hưng Phú, P.9, -

Q.8, TP.HCM.

Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh -

Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh.

2.2 Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ & thiết bị:

2.2.1 Vật liệu:

- Mẫu nước thải được lấy từ: “Công ty CP Thủy sản số 4”, 320 Hưng Phú, P.9, Q.8,

TP.HCM.

2.2.2 Hóa chất:

2.2.2.1 Thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy:

- Môi trường Winogradsky phân lập Nitrosomonas spp. (W1):[3]

(NH4)2SO4 : 2g/l

K2HPO4.3H2O : 1.308g/l

MgSO4.7H2O : 0.5g/l

FeSO4.7H2O : 0.4g/l

NaCl : 2g/l

CaCO3 : 5g/l

Nước cất 1l

- Môi trường phân lập Nitrobacter spp. (W2):[3]

NaNO2 : 1.0g/l

MgSO4.7H2O : 0.5g/l

FeSO4.7H2O :0.03g/l

NaCl : 0.3g/l

Na2CO3 : 1.0g/l

K2HPO4.3H2O : 1.308g/l

Nước cất 1l

Chỉnh pH về 7.3

- Môi trường tăng trưởng muối khoáng AOB (giàu vi lượng):[6]

(NH4)2SO4 : 2g/l

NaCl : 0.585g/l

KH2PO4 : 0.054g/l

KCl : 0.075g/l

31 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

CaCl2.2H2O : 0.147g/l

MgSO4.7H2O : 0.049g/l

CaCO3 : 5g/l

Dung dịch khoáng vi lượng 1ml/l

- Dung dịch khoáng vi lượng bổ sung vào môi trường AOB:[6]

Na2EDTA : 4292mg/l

FeCl2.4H2O : 1988mg/l

MnCl2.2H2O : 81mg/l

NiCl2.6H2O : 24mg/l

CoCl2.6H2O : 24mg/l

CuCl2.2H2O : 17mg/l

ZnCl2 : 68mg/l

Na2MoO4.2H2O : 24mg/l

Na2WO4.2H2O : 33mg/l

H3BO3 : 62mg/l

- Môi trường muối khoáng NOB (giàu vi lượng):[9]

Gồm có 900ml nước cất 100ml dung dịch gốc 1ml dung dịch vi lượng 2g NaNO2.

Dung dịch gốc:

CaCO3 : 0.07g/l

NaCl : 5g/l

MgSO4.7H2O : 0.5g/l

KH2PO4 : 1.5g/l

Dung dịch vi lượng:

HCl (0.01M) : 1000ml

MnSO4.H2O : 33.8mg

H2BO3 : 49.4mg

ZnSO4.7H2O : 43.1mg

(NH4)6Mo7O24 : 37.1mg

FeSO4.7H2O : 973mg

CuSO4.5H2O : 25mg

- Môi trường hữu cơ kiểm tra sự nhiễm vi khuẩn dị dưỡng hay nấm:[6]

Cao nấm men : 0.5g/l

Peptone : 0.5g/l

Cao thịt : 0.5g/l

32 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Nước cất 1l

pH 7.3

2.2.2.2 Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm:

-

- Thuốc thử dùng định tính: Griess A & Griess B, Nessler, Diphenylamine.[3] Thuốc nhuộm gram: Tím Gentian Violet, dung dịch Lugol, cồn 96o, Fuchsin, dầu

soi kính. [8]

- Thuốc nhuộm tiên mao: dung dịch A, dung dịch B. [22]

- .[4, 7]

+, NO2

- và NO3

- Các hóa chất dùng định lượng NH4

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị:

- Dụng cụ:

Đèn cồn.

Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 1000ml.

Bình tam giác: 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml.

Pipet các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 25ml.

Bóp cao su.

Đũa thủy tinh.

Ống nghiệm.

Giá đỡ ống nghiệm.

Đĩa petri: đĩa thủy tinh và đĩa nhựa.

Dây cấy vòng.

Dây cấy thẳng.

Lam kính.

Micropipet: 100µl, 1000µl.

Cuvet thạch anh.

Bông không thấm. Cồn khử trùng 70o

Giấy lọc.

- Thiệt bị máy móc:

Máy lắc.

Tủ cấy vô trùng.

Máy nước cất.

Máy đo pH.

Tủ hút.

Bếp từ, bếp đun.

33 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Nồi hấp Autoclave.

Kính hiển vi quang học.

Máy đo quang phổ.

Tủ lạnh.

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Nội dung nghiên cứu chính:

Tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn AOB và NOB từ nguồn nước thải chế biến -

thủy sản.

- Các chủng AOB sau khi được tăng sinh thì tiến hành định tính và định lượng kiểm

tra khả năng chuyển hóa cơ chất của các quần thể vi sinh vật trong môi trường và thay môi

trường mới để tiếp tục tăng sinh.

- Các chủng NOB đã phân lập được tiến hành định danh sơ bộ các chủng ấy về mặt

hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm tiên mao và kiểm tra khả năng di động.

- Từ các chủng NOB đã phân lập được tiến hành các thử nghiệm khảo sát khả năng

chuyển hóa cơ chất của chúng trên môi trường lỏng W2.

- Chọn ra các chủng NOB có khả năng chuyển hóa cơ chất mạnh nhất để tiếp tục

khảo sát trên môi trường có nhiều thành phần khoáng vi lượng NOB.

2.3.2 Phương pháp thu nhận và vận chuyển mẫu nước thải:

- Vì thời gian thực hiện đề tài rất ngắn và điều kiện lấy mẫu rất hạn chế nên sinh viên

chỉ thực hiện phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa trên mẫu nước thải chế biến thủy sản

được lấy từ “Công ty CP Thủy sản số 4” mà thôi.

- Mẫu nước thải được lấy từ bể tập trung nước thải của “Công ty CP Thủy sản số 4”

và được cho vào can nhựa 2L (đã được rửa sạch), không được lấy quá đầy (còn chừa lại

khoảng chừng 5 – 10cm khoảng không khí phía trên) và được vận chuyển ngay về phòng

thí nghiệm sau khoảng 1 giờ vận chuyển bằng xe máy. Và tiến hành phân lập mẫu ngay

trong vòng 24 giờ.

2.3.3 Phương pháp phân lập:[3]

- Nguyên tắc:

Phân lập là quá trình tách riêng một vi sinh vật từ mẫu hoặc quần thể ban đầu để thu nhận

giống ở dạng thuần khiết. Giống vi sinh vật thuần khiết chỉ gồm các tế bào được sinh ra từ

một tế bào ban đầu.

Cách thực hiện: -

(cid:190) Phân lập lần thứ I trên cả 2 môi trường W1 và W2: Mẫu nước thải chế biến thủy

sản được khuấy thật đều và cho vào cốc 250ml (cid:198) tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: hút

34 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

1ml mẫu nước thải cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (đã vô trùng) thì ta được nồng độ pha loãng là 10-1 và từ độ pha loãng 10-1 ấy ta lại hút ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý khác thì ta được nồng độ pha loãng 10-2; và cứ tiếp tục như vậy ta được nồng độ pha loãng 10-3 và 10-4 (cid:198) ta chọn 2 nồng độ pha loãng 10-2 và 10-4

để phân lập mẫu: dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu cho vào 4 bình tam giác 100 đã chứa

sẵn 30ml môi trường W1 và 4 bình tam giác 100 đã chứa sẵn 30ml môi trường W2 tương ứng (cid:198) ta có: 4 bình mẫu 10-2, 4 bình mẫu 10-4 và 2 bình ĐC tương ứng với 2 môi trường

phân lập W1 & W2 (cid:198) đem 10 bình mẫu lắc trên máy lắc: 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng

(28 2oC), trong vòng 2 – 3 tuần.

(cid:190) Phân lập lần thứ II trên môi trường W1 : Mẫu nước thải chế biến thủy sản được

khuấy thật đều và cho vào cốc 250ml (cid:198) tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: hút 1ml mẫu

nước thải cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (đã vô trùng) thì ta được nồng độ pha loãng là 10-1 và từ độ pha loãng 10-1 ấy ta lại hút ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý khác thì ta được nồng độ pha loãng 10-2; và cứ tiếp tục như vậy ta được nồng độ pha loãng 10-3 và 10-4 (cid:198) ta chọn 2 nồng độ pha loãng 10-2 và 10-4 để phân

lập mẫu: dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu cho vào 4 bình tam giác 100 đã chứa sẵn 30ml môi trường W1 tương ứng (cid:198) ta có: 2 bình mẫu 10-2, 2 bình mẫu 10-4 và 1 bình ĐC (cid:198)

dùng bao nilon đen bịt kín toàn bộ bình tam giác (chừa phần miệng bình lại) tạo điều kiện

tối suốt quá trình ủ mẫu (cid:198) cuối cùng đem 5 bình mẫu lắc trên máy lắc: 210 vòng/phút, ở

nhiệt độ phòng (28 2oC), trong vòng 2 – 3 tuần.

(cid:190) Phân lập lần thứ III trên môi trường AOB: Mẫu nước thải chế biến thủy sản được

khuấy thật đều và cho vào cốc 250ml (cid:198) tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: hút 1ml mẫu

nước thải cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý (đã vô trùng) thì ta được nồng độ pha loãng là 10-1 và từ độ pha loãng 10-1 ấy ta lại hút ra 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý khác thì ta được nồng độ pha loãng 10-2; và cứ tiếp tục như vậy ta được nồng độ pha loãng 10-3 và 10-4 (cid:198) ta chọn 4 nồng độ pha loãng 10-0, 10-1, 10-2 và 10-3

để phân lập mẫu: dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu cho vào 10 bình tam giác 100 đã chứa sẵn 30ml môi trường AOB (vô trùng) tương ứng (cid:198) ta có: 4 bình mẫu 10-0, 2 bình mẫu 10- 1, 2 bình mẫu 10-2, 2 bình mẫu 10-3 và 1 bình ĐC (cid:198) dùng bao nilon đen bịt kín toàn bộ

bình tam giác lại (chừa phần miệng bình ra) tạo điều kiện tối suốt quá trình ủ mẫu (cid:198) cuối 2oC), cùng đem 11 bình mẫu lắc trên máy lắc: 210 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28

trong vòng 2 – 3 tuần.

2.3.4 Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy:[3]

35 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Nguyên tắc:

Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy nhằm mục đích kiểm tra nhanh chóng trong

canh trường nuôi cấy của chúng ta có hay không có vi sinh vật mà ta cần phân lập bằng

cách sử dụng các loại thuốc thử tương ứng khác nhau đối với từng mục đích phân lập của

chúng ta.

- Cách thực hiện:

Sau 2 đến 3 tuần ủ và lắc mẫu trên máy lắc: ta thấy môi trường trong các bình mẫu thí

nghiệm chuyển sang đục (có sinh khối vi sinh vật phát triển) hơn so với môi trường trong

bình ĐC (không cấy mẫu nước thải vào) thì ta tiến hành lấy mẫu để thực hiện các phản ứng

+): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường

định tính và kiểm tra các thành phần trong canh trường nuôi cấy của chúng ta như sau:

• Phản ứng định tính amoni (NH4

trong bình nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC

dương) (cid:198) sau đó nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên giọt canh trường nuôi cấy (cid:198) ta thấy:

giọt canh trường xuất hiện màu vàng có kết tủa nâu thì là phản ứng dương tính (+), còn nếu

-): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường

giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Nessler.

• Phản ứng định tính nitrite (NO2

trong bình nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC

dương) (cid:198) sau đó nhỏ lần lượt từng giọt thuốc thử Griess A và Griess B lên giọt canh

trường nuôi cấy (cid:198) ta thấy: giọt canh trường nuôi cấy xuất hiện màu hồng là phản ứng

dương tính (+), còn giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với

-): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường

thuốc thử Griess A và Griess B.

• Phản ứng định tính nitrate (NO3

trong bình mẫu nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC

dương) (cid:198) sau đó nhỏ 1 giọt thuốc thử Diphenylamine lên giọt canh trường nuôi cấy (cid:198) ta

thấy: giọt canh trường nuôi cấy xuất hiện màu xanh dương là phản ứng dương tính (+), còn

giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử

Diphenylamine.

- với thuốc thử tương ứng trong phản

Bảng 2.1: Cường độ màu của NH4

+ - NO2

- & NO3

ứng định tính.

36 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Phản ứng định tính +) của amoni (NH4

với thuốc thử

Nessler Không màu - Màu vàng nhạt

+

không có Màu vàng + Màu nâu - rất + - ít NH4 sậm -NH4 nhiều NH4

+

trung bình NH4

+ + + + + + - Ký hiệu:

Phản ứng định tính -) của nitrite (NO2

với thuốc thử

-

-

Griess A & Griess Không màu - Màu hồng nhạt Màu hồng Màu hồng rất B sậm - rất nhiều không có - ít NO2

-

đậm vừa - - trung NO2 NO2 NO2

bình

+ + + + + - + Ký hiệu:

Phản ứng định tính -) của nitrate (NO3

với thuốc thử

Diphenylamine Không màu - Màu xanh Màu xanh Màu xanh

-

-

không có dương nhạt - ít

dương đậm - dương thẫm - - NO3 NO3 vừa - NO3 rất nhiều NO3

trung bình

- + + + + + + Ký hiệu:

2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập:

- Việc xác định các đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được, bước

đầu giúp chúng ta định danh sơ bộ các chủng ấy và thuận lợi hơn cho các nghiên cứu tiếp

theo. Đặc điểm hình thái vi khuẩn được xác định qua các phương pháp phổ biến sau đây:

(cid:153) Phương pháp xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc: phương pháp này giúp

chúng ta có thể quan sát được hình thái khuẩn lạc (tròn hay méo, nhăn hay không nhăn,

37 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

bóng hay không bóng, lồi hay lõm, màu sắc…) của các chủng vi khuẩn phân lập được bằng

mắt thường khi vi khuẩn được cấy lên môi trường thạch. Phương pháp này được thực hiện

từng bước theo tài liệu của Benson (2001) [8].

(cid:153) Phương pháp nhuộm gram: phương pháp này giúp chúng ta quan sát được hình

thái tế bào vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi quang học như: hình cầu, hình que

hay hình xoắn, có liên kết với nhau không hay riêng lẻ, gram âm (-) hay gram dương (+)…

Phương pháp này được thực hiện từng bước như trong tài liệu của Benson (2001) [8].

(cid:153) Phương pháp nhuộm tiên mao: phương pháp này giúp chúng ta quan sát được vi

khuẩn có tiên mao hay không và các kiểu tiên mao của chúng như thế nào… Từ đó biết

được chúng di động theo kiểu nào. Phương pháp này được thực hiện từng bước theo tài

liệu của GS.TS Nguyễn Lân Dũng [22].

(cid:153) Phương pháp kiểm tra khả năng di động: phương pháp này giúp chúng ta khẳng

định chính xác hơn vi khuẩn phân lập được có khả năng di động hay không thông qua việc

cấy vi khuẩn vào thạch mềm trong ống nghiệm. Phương pháp này được thực hiện theo tài

liệu của GS.TS Nguyễn Lân Dũng [22].

2.3.6 Khảo sát khả năng mọc trên môi trường agar hữu cơ đối với 4 chủng nghi ngờ là

vi khuẩn nitrite hóa đã phân lập được trên môi trường W1:

- Sau khi định tính 4 bình nuôi cấy W1 thì canh trường nuôi cấy trong 4 bình mẫu

đều có hoạt tính. Chính vì vậy mà ta tiến hành lấy sinh khối trong 4 bình nuôi cấy cấy

chuyển sang môi trường thạch (với 2% agar) để mà phân lập. Trên môi trường thạch đã

chọn và thuần khiết được 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa.

- Từ 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa ấy tiến hành cấy chuyển lại môi trường lỏng W1 để

tăng sinh và kiểm tra lại hoạt tính của chúng. Qua quá trình tiến hành thử nghiệm định tính

lại canh trường nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn thì cả 4 chủng đều không có hoạt tính như ban

đầu.

- Chính vì vậy, để khẳng định lại một lần nữa 4 chủng vi khuẩn ấy có phải là 4 chủng

vi khuẩn nitrite hóa hay không, chúng tôi tiến hành cấy chuyển 4 chủng vi khuẩn ấy sang

môi trường agar hữu cơ xem chúng có mọc được trên môi trường ấy không.

- Cách tiến hành như sau: môi trường hữu cơ đã được bổ sung 2% agar trong đĩa

petri (đã được chuẩn bị sẵn trước đó) (cid:198) ta dùng dây cấy vòng lấy sinh khối 4 chủng từ môi

trường thạch W1 cấy ria sang môi trường thạch hữu cơ trên (cid:198) ủ đĩa ở nhiệt độ phòng 28

2oC (cid:198) sau 48 giờ thì quan sát mẫu.

- trong 10 bình mẫu AOB

2.3.7 Thí nghiệm định lượng 3 chỉ tiêu NH4

+ - NO2

- và NO3

đã phân lập được:[4, 7]

38 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Sau khi định tính 10 bình AOB đã phân lập được ở trên và cả 10 bình đều có hoạt

tính hết cả (cid:198) tức là có các chủng vi khuẩn nitrate hóa (vừa có vi khuẩn nitrite hóa và vừa

có vi khuẩn nitrate hóa) trong canh trường nuôi cấy (cid:198) để kiểm tra khả năng chuyển hóa

- và NO3

+ - NO2

của các quần thể vi sinh vật trong 10 bình mẫu ấy (cid:198) chúng tôi tiến hành lấy mẫu và định - có trong canh trường nuôi cấy như sau (mỗi bình lượng 3 chỉ tiêu NH4

mẫu lặp lại 3 lần):

(cid:190)

+ còn lại trong bình nuôi cấy: dùng pipet vô trùng hút 3ml mẫu

Định lượng NH4

cho vào cốc thủy tinh và thêm 147ml nước cất vào để pha loãng mẫu, từ mẫu đã được pha

loãng 50 lần ấy ta khuấy đều và hút ra 3 bình mỗi bình 50ml mẫu đã được pha loãng và

tiến hành thêm lần lượt các hóa chất vào như sau: thêm 0.5ml ZnSO4 và 0.25ml NaOH 6N

vào 50ml mẫu (cid:198) khuấy đều rồi lọc mẫu qua giấy lọc để loại tủa (cid:198) mẫu sau khi được lọc

thêm: 1ml Na2S2O3 N/70, 1 giọt EDTA và 2ml Nessler (cid:198) đợi 5 phút (cid:198) đem mẫu đo

+ còn lại trong bình nuôi cấy.

quang ở OD 430nm (cid:198) từ giá trị OD đo được ta thế vào phương trình đường chuẩn NH3

0.18

lập trước đó (xem hình 2.1) và tính được lượng NH4

y = 0.169x - 0.000 R² = 0.998

0.16

0.14

0.12

0.1

0.08

OD 430nm Linear (OD 430nm)

0.06

0.04

0.02

0

0

0.5

1

1.5

‐0.02

OD 430nm

+ (mg/L)

N - NH4

+.

Hình 2.1: Phương trình đường chuẩn NH4

(cid:190)

- sinh ra trong bình nuôi cấy: dùng micropipette vô trùng hút

Định lượng NO2

10µl mẫu cho vào Erlen (cid:198) thêm 25ml mước cất vào Erlen chứa mẫu (cid:198) thêm: 0.5ml dd

EDTA và 0.5ml dd Acidsulfanilic vào Erlen (cid:198) đợi trong 10 phút (cid:198) thêm tiếp: 0.5ml dd

Naphthylamine và 0.5ml dd đệm Acetate vào Erlen (cid:198) đợi trong 20 phút (cid:198) lắc mẫu thật

- sinh ra

đều và đem đo quang OD 520nm (cid:198) từ giá trị OD đo được ta thế vào phương trình

đường chuẩn nitrite đã lập trước đó (xem hình 2.2) thì ta tính được lượng NO2

trong 10 bình nuôi cấy AOB.

39 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

0.7

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

y = 2.528x + 0.008 R² = 0.999

0.6

0.5

0.4

0.3

OD 520 nm

m n 0 2 5 D O

Linear (OD 520 nm)

0.2

0.1

0

0

0.2

0.3

- (mg/ml)

0.1 N-NO2

Hình 2.2: Phương trình đường chuẩn NH3.

(cid:190)

- sinh ra trong bình nuôi cấy: từ 1 bình mẫu nuôi cấy (cid:198) dùng

Định lượng NO3

pipet vô trùng hút ra 3ml mẫu cho vào cốc, sau đó thêm 27ml mước cất vào để pha loãng

mẫu (cid:198) từ mẫu đã pha loãng ấy hút ra 10ml mẫu cho vào cốc thủy tinh (cid:198) thêm 1ml dd

Urea-acetic vào cốc mẫu (cid:198) đem cô cạn mẫu trên bếp điện (cid:198) mẫu thật nguội thì thêm 1ml

PDA vào cốc mẫu (cid:198) lắc cốc cho mẫu tan đều vào acid (cid:198) 10 phút sau: thêm 25ml nước

cất vào cốc và lắc đều (cid:198) dùng dd NaOH 10% để trung hòa acid dư trong cốc mẫu (cho

đến khi pH trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được) (cid:198) chuyển

dung dịch màu vàng vào bình định mức 100 và dùng nước cất định mức đến vạch (cid:198) đem

- sinh ra trong môi trường

đo quang OD 410nm (cid:198) từ giá trị OD đo được ta thế vào phương trình đường chuẩn

nitrate đã lập trước đó (xem hình 2.3) và tính được lượng NO3

1.6

nuôi cấy AOB.

1.4

1.2

1

0.8

0.6

y = 0.236x + 0.046 R² = 0.993

m n 0 1 4 D O

0.4

0.2

0

0

2

4

6

- (µg/ml)

N - NO3

40 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

-.

Hình 2.3: Phương trình đường chuẩn NO3

2.3.8 Thử nghiệm tăng sinh khối 10 bình nuôi cấy AOB:

- có trong 10 bình nuôi

+ - NO2

- và NO3

- Sau khi lấy mẫu định lượng 3 chỉ tiêu NH4

cấy AOB thì lượng môi trường (Vml) còn lại rất ít trong 10 bình nuôi cấy:

Bảng 2.2: Thể tích mẫu còn lại của 10 bình AOB nuôi cấy sau khi đã lấy mẫu định

lượng.

STT Bình mẫu nuôi cấy AOB Thể tích môi trường còn lại trong bình (ml)

Bình 10o (1) 6.8 1

Bình 10o (2) 7.5 2

Bình 10o (3) 12 3

Bình 10o (4) 10.2 4

Bình 10-1 (1) 5 5

Bình 10-1 (2) 5.8 6

Bình 10-2 (1) 6.8 7

Bình 10-2 (2) 2.35 8

Bình 10-3 (1) 7 9

Bình 10-3 (2) 4.75 10

- Vì vậy cần phải thêm môi trường AOB mới vào 10 bình mẫu ấy nhằm cung cấp

dinh dưỡng, giúp vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.

- Cách tiến hành: dùng pipet vô trùng hút 35ml môi trường AOB mới (vô trùng) cho

vào mỗi bình nuôi cấy (cid:198) bọc kín 10 bình mẫu lại bằng bao nilon đen (chừa phần miệng

Erlen lại) (cid:198) đem lắc tiếp tục 10 bình mẫu trên máy lắc: 210 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng

(28 2oC).

2.3.9 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa đã phân lập

được trên môi trường W2 lỏng:

- Vì không thể dùng “Phương pháp định tính” để khẳng định được 6 chủng vi

khuẩn phân lập được trên môi trường W2 là các chủng vi khuẩn nitrate hóa được (vì hóa

chất bị tạp nhiễm nitrate trong đó) nên muốn xác định chính xác các chủng ấy có phải là

các chủng vi khuẩn nitrate hóa thực sự hay không? Chúng tôi tiến hành cấy chuyển 6

41 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- hay không?

chủng vi khuẩn ấy sang môi trường lỏng W2 để xem chúng có chuyển hóa được cơ chất từ

- sang NO3

NO2

Cách tiến hành: -

(cid:190) Giai đoạn tăng sinh: ban đầu 6 chủng vi khuẩn được tăng sinh trong bình tam giác

chứa 30ml môi trường W2 (vô trùng) (cid:198) sau 48 giờ ủ và lắc mẫu trên máy lắc (cid:198) ta tiến

hành đo OD 600nm để xác định mật độ tế bào 6 chủng sau 48 giờ ủ và lắc mẫu (cid:198) từ giá

trị OD đó ta tính được mật độ tế bào và thể tích dung dịch huyền phù tế bào cho vào các

bình mẫu để khảo sát khả năng chuyển hóa của chúng tại các mốc thời gian: 0 ngày – 2

ngày – 4 ngày – 6 ngày.

Bảng 2.3: Kết quả OD của 6 chủng vi khuẩn sau 48 giờ nuôi lắc và thể tích huyền phù

tế bào cần hút cho thí nghiệm khảo sát.

Các chủng W2 khảo OD sau 48 giờ lắc Thể tích huyền phù tế bào

cần hút cho thí nghiệm (ml) sát mẫu

0.075 0.3922 Chủng 1

0.052 0.5656 Chủng 2

0.024 1.2255 Chủng 3

0.053 0.5549 Chủng 5

0.037 0.7949 Chủng 7

0.021 1.4006 Chủng MV1

(cid:190) Giai đoạn cấy và ủ mẫu: dùng pipet vô trùng hút lượng mẫu huyền phù tế bào

(Vml) phù hợp như đã tính ở trên cho vào các bình tam giác chứa 40ml môi trường W2 để

khảo sát: mỗi chủng cấy 4 bình, vậy ta có tất cả 24 bình mẫu (cid:198) sau đó đem tất cả 24 bình

mẫu ủ và lắc trên máy lắc (210 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng.

(cid:190) Giai đoạn khảo sát (định lượng các thành phần trong môi trường nuôi cấy): cứ

- và NO3

đúng mốc thời gian khảo sát thì có 6 bình mẫu (tương ứng với 6 chủng khảo sát) được lấy - có trong môi trường khảo sát. ra để tiến hành phân tích định lượng 2 chỉ tiêu: NO2

Mỗi bình mẫu (tương ứng với 1 chủng vi khuẩn khảo sát) đều được định lượng 2 chỉ tiêu

sau (và mỗi chỉ tiêu lập lại 2 lần):

-: Hút 25ml nước cất cho vào Erlen (cid:198) sau đó dùng micropipette

• Định lượng NO2

hút 10µl mẫu (canh trường nuôi cấy khảo sát) cho vào Erlen trên (cid:198) thêm hóa chất vào

42 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Erlen chứa mẫu: 0.5ml dd EDTA và 0.5ml dd Acidsulfanilic (cid:198) đợi 10 phút (cid:198) tiếp tục

thêm: 0.5ml dd Naphthylamine và 0.5ml dd đệm Acetate vào (cid:198) đợi 20 phút (cid:198) lắc đều

- trong canh trường khảo sát.

mẫu và đo quang OD 520nm (cid:198) thế giá trị OD vào phương trình đường chuẩn đã lập

trước đó (cid:198) tính được hàm lượng NO2

-: dùng pipet hút 10ml mẫu cho vào cốc thủy tinh (cid:198) thêm 1ml dd

• Định lượng NO3

Urea-acetic vào cốc (cid:198) cô cạn mẫu trên bếp điện (cid:198) mẫu thật nguội thì thêm 1ml PDA vào

cốc (cid:198) lắc cho mẫu tan đều vào acid (cid:198) đợi 10 phút sau (cid:198) thêm 25ml nước cất vào trong

cốc và lắc cho đều cốc (cid:198) dùng dd NaOH 10% để trung hòa acid dư trong cốc (cho đến khi

pH trong cốc là trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được) (cid:198)

chuyển dung dịch màu vàng vào bình định mức 100 và dùng nước cất định mức đến vạch

- có trong mẫu khảo sát.

(cid:198) đem mẫu đo quang OD 410nm (cid:198) từ giá trị OD đó ta thế vào phương trình đường

chuẩn nitrate đã lập trước đó thì ta có thể tính được lượng NO3

2.3.10 “Khảo sát khả năng chuyển hóa” của 3 chủng vi khuẩn nitrate hóa chọn lọc trên

môi trường giàu vi lượng NOB (1g NaNO2/l):

- Sau khi đã chọn được 3 chủng trong 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa (phân lập được

trên môi trường W2) có khả năng chuyển hóa cơ chất mạnh nhất trong môi trường lỏng

W2 ở trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng chuyển hóa của 3 chủng mà chúng tôi đã

chọn được ở trên trong môi trường lỏng giàu vi lượng NOB để xem khả năng chuyển hóa

cơ chất của 3 chủng ấy.

Cách tiến hành: -

(cid:153) Giai đoạn tăng sinh: Ban đầu 3 chủng vi khuẩn nitrate hóa (Chủng 2, Chủng 3 và

Chủng MV1) được tăng sinh trong bình tam giác chứa 30ml môi trường lỏng NOB (1g

600nm để xác định NaNO2/l) (cid:198) sau 48 giờ lắc mẫu trên máy lắc (cid:198) ta tiến hành đo OD

mật độ tế bào của 3 chủng sau 48 giờ ủ và lắc mẫu (cid:198) từ giá trị OD đó ta tính được nồng độ

tế bào và tính được thể tích huyền phù tế bào (để đảm bảo được mật độ tế bào giữa 3 chủng

khi cho vào các bình mẫu khảo sát là như nhau) cho vào các bình mẫu để khảo sát khả

năng chuyển hóa của 3 chủng vi khuẩn ấy tại các mốc thời gian là: 0 ngày – 2 ngày – 4

ngày – 6 ngày – 8 ngày – 10 ngày và 12 ngày.

Công thức tính thể tích mẫu cần cho thử nghiệm: •

C1 V1 C2 V2

OD 1.02 109 C2

Trong đó: •

106 : là mật độ tế bào cần cho vào bình khảo sát (cfu/ml) C1

43 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

30ml: là thể tích môi trường NOB có trong bình Erlen để tăng sinh vi khuẩn trong 48 V1

giờ.

C2: là mật độ tế bào vi khuẩn có trong bình tăng sinh sau 48 giờ (cfu/ml)

V2: là thể tích dịch huyền phù vi khuẩn cần hút (ml)

Bảng 2.4: Kết quả OD của 3 chủng khảo sát sau 48 giờ tăng sinh và thể tích huyền phù

tế bào cần hút cho thí nghiệm.

3 chủng khảo sát OD sau 48 giờ lắc Vmẫu cần hút cho thí

mẫu nghiệm (ml)

0.063 0.4668 Chủng 2

0.024 1.2255 Chủng 3

0.019 1.5479 Chủng MV1

(cid:153) Giai đoạn cấy và ủ mẫu: dùng pipet vô trùng hút lượng mẫu huyền phù tế bào

(Vml) phù hợp như đã tính ở trên cho vào các bình tam giác chứa 40ml môi trường NOB để

khảo sát: mỗi chủng cấy 7 bình, vậy ta có tất cả 21 bình mẫu (cid:198) sau đó đem tất cả 21 bình

mẫu ủ và lắc trên máy lắc (210 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng.

(cid:153) Giai đoạn khảo sát (định lượng các thành phần trong môi trường nuôi cấy): cứ

- và NO3

đúng mốc thời gian khảo sát thì có 3 bình mẫu (tương ứng với 3 chủng khảo sát) được lấy - có trong môi trường khảo sát. ra để tiến hành phân tích định lượng 2 chỉ tiêu: NO2

Mỗi bình mẫu (tương ứng với 1 chủng vi khuẩn khảo sát) đều được định lượng 2 chỉ tiêu

sau (và mỗi chỉ tiêu lập lại 3 lần):

-: Hút 25ml nước cất cho vào Erlen (cid:198) sau đó dùng micropipette

• Định lượng NO2

hút 10µl mẫu (canh trường nuôi cấy khảo sát) cho vào Erlen trên (cid:198) thêm hóa chất vào

Erlen chứa mẫu: 0.5ml dd EDTA và 0.5ml dd Acidsulfanilic (cid:198) đợi 10 phút (cid:198) tiếp tục

thêm: 0.5ml dd Naphthylamine và 0.5ml dd đệm Acetate vào (cid:198) đợi 20 phút (cid:198) lắc đều

- trong canh trường khảo sát.

mẫu và đo quang OD 520nm (cid:198) thế giá trị OD vào phương trình đường chuẩn đã lập

trước đó (cid:198) tính được hàm lượng NO2

-: dùng pipet hút 10ml mẫu cho vào cốc thủy tinh (cid:198) thêm 1ml dd

• Định lượng NO3

Urea-acetic vào cốc (cid:198) cô cạn mẫu trên bếp điện (cid:198) mẫu thật nguội thì thêm 1ml PDA vào

cốc (cid:198) lắc cho mẫu tan đều vào acid (cid:198) đợi 10 phút sau (cid:198) thêm 25ml nước cất vào trong

cốc và lắc cho đều cốc (cid:198) dùng dd NaOH 10% để trung hòa acid dư trong cốc (cho đến khi

pH trong cốc là trung tính và dung dịch trong cốc chuyển sang màu vàng là được) (cid:198)

44 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

chuyển dung dịch màu vàng vào bình định mức 100 và dùng nước cất định mức đến vạch

- có trong mẫu khảo sát.

(cid:198) đem mẫu đo quang OD 410nm (cid:198) từ giá trị OD đó ta thế vào phương trình đường

chuẩn nitrate đã lập trước đó thì ta có thể tính được lượng NO3

45 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Trên MT W2

Nhuộm tiên mao

Nhuộm gram

Trên MT NOB

Khảo sát khả năng chuyển hóa

Tăng sinh

Quan sát KL

6 chủng VK thuần khiết

Khảo sát khả năng di động

Cấy sang MT agar

+

Thêm MT AOB mới vào

Định lượng: NH4 -

- & NO3

- NO2

Phân lập VK nitrate hóa trên W2

Thử nghiệm định tính

3.Phân lập VK nitrite hóa trên AOB

Nước thải TS4

Có hoạt tính

Thử nghiệm định tính

Thử nghiệm định tính

1. Phân lập VK nitrite hóa trên W1

2.Phân lập VK nitrite hóa trên W1

Có hoạt tính

Nhuộm gram

Định tính: không có hoạt tính

Cấy chuyển sang MT agar

4 chủng VK thuần khiết

Quan sát KL

Bỏ

Cấy chuyển sang MT agar hữu cơ

Cấy chuyển lại MT lỏng W1

Định tính: không có hoạt tính

Không phải VK nitrite hóa

4 chủng đều mọc tốt

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS.

46 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

CHƯƠNG 3:

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

47 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Để đáp ứng nhu cầu tăng cường sinh học trong xử lý nước thải giàu Nitơ, nước thải

nhà máy chế biến thủy sản được sử dụng để phân lập các vi khuẩn của quá trình nitrate hóa

(nitrification) bao gồm vi khuẩn nitrite hóa hay vi khuẩn oxy hóa amôn (Ammonium

Oxidizing Bacteria - AOB) và vi khuẩn nitrate hóa hay vi khuẩn oxy hóa nitrite (Nitrite

Oxidizing Bacteria - NOB). Thông thường hai dạng vi khuẩn này được tăng sinh và phân

lập trên môi trường Winogradsky 1 (W1) và Winogradsky 2 (W2) như Giáo trình thực tập

đây là các vi khuẩn dinh dưỡng hóa năng vô cơ, hiếu khí bắt buộc, sử dụng NH4

- chỉ đạt 165 mg/L.

Vi sinh vật học của Egorov hướng dẫn. Đây là các môi trường chỉ chứa các chất vô cơ vì - + hay NO2 + trong môi trường W1 khá cao, đạt đến 583 mg/L, là nguồn năng lượng. Nồng độ N-NH4

trong khi đó nguồn năng lượng trong môi trường W2 là NO2

3.1 Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrite hóa của AOB từ nước

thải nhà máy chế biến thủy sản (CBTS):

3.1.1 Tăng sinh phân lập AOB lần I:

- 4, tăng sinh trong môi trường W1 trên máy lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 Nước thải “Công ty CP thủy sản số 4” được pha loãng theo các nồng độ 10-2 và 10- 2oC).

3.1.1.1 Kết quả thử nghiệm định tính:

- Sau 2 – 3 tuần lắc mẫu, môi trường tăng sinh trở nên đục, đục do sinh khối vi sinh

vật phát triển hơn nhiều so với bình đối chứng (ĐC) chỉ có môi trường không được cấy

tác dụng với với thuốc thử Griess, màu xanh dương của NO3

mẫu nước thải. Để đánh giá sơ bộ, các bình tăng sinh được đem thử định tính sự có mặt - của AOB và thậm chí NOB. Các phép thử định tính dựa trên màu hồng đặc trưng của NO2 - với Diphenylamine trong + khi gặp thuốc thử Nessler. Mức độ đậm nhạt H2SO4 đậm đặc và màu vàng nâu của NH4

của màu tương ứng với nồng độ các chất muốn kiểm tra và được phân thành 4 mức: âm

tính (-), dương tính yếu (+), dương tính trung bình (++) và dương tính mạnh (+++) (xem

phần phương pháp và phụ lục A).

Bảng 3.1: Thử nghiệm định tính mẫu tăng sinh AOB trong môi trường W1 từ nước thải

TS4.

48 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

STT Tên bình

+

-

Độ đục Định tính NH4 Định tính NO2

Đối chứng - + + + - ĐC

Bình 10-2 (1) + + + + + + 1

Bình 10-2 (2) + + + + + + 2

Bình 10-4 (1) + + + + + + 3

+ và sự xuất hiện NO2

- ở tất cả các bình - xuất hiện càng cao (+++) và

Bình 10-4 (2) + + + + + + 4

(cid:190) Kết quả định tính cho thấy có sự giảm NH4 tăng sinh, khi hệ số pha loãng thấp (10-2) thì nồng độ NO2

ngược lại, điều này chứng minh rằng trong nước thải của “Công ty CP thủy sản số 4” có

chứa AOB.

3.1.1.2 Kết quả phân lập:

- Sau khi tiến hành tăng sinh vi khuẩn AOB, chúng tôi tiến hành phân lập chủng

thuần khiết bằng phương pháp cấy ria truyền thống trên môi trường W1 agar tương ứng để

phân lập vi khuẩn. Khác với lý thuyết là các vi khuẩn AOB tăng trưởng rất chậm, có thời

gian thế hệ 8-36 giờ, các chủng phân lập mọc khá nhanh chóng có hình thái được trình bày

trong bảng 3.2 (xem thêm phụ lục B).

Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái của 4 chủng vi khuẩn phân lập được trên W1.

Tên chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào Gram

Màu vàng đậm – hơi Cầu khuẩn – nhỏ - Chủng 1 bóng – lồi

Màu vàng đậm – Cầu khuẩn – nhỏ li ti - Chủng 2 nhăn – không bóng –

lồi

Cầu khuẩn – nhỏ - Màu cam nhạt đục Chủng 3 sữa – tròn – bóng –

lồi

Màu trắng đục – Cầu khuẩn – nhỏ - Chủng 4 bóng – lồi

- Sau khi đã lựa chọn ra được “4 chủng vi khuẩn thuần khiết” trên môi trường

thạch thì chúng tôi tiến hành cấy chuyển 4 chủng vi khuẩn này từ môi trường agar sang

môi trường W1 lỏng để tăng sinh lại và kiểm tra hoạt tính của 4 chủng vi khuẩn trên đã

49 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

2oC). Khi môi phân lập được trên máy lắc với 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28

trường nuôi cấy lỏng chuyển từ trong sang đục (do sinh khối vi sinh vật phát triển trong

môi trường nuôi cấy) sau 24 giờ hoạt tính nitrite hóa được kiểm tra bằng “Thử nghiệm định

tính”. Kết quả cho thấy: 4 chủng vi khuẩn phân lập đều không có hoạt tính (xem thêm phần

phụ lục C).

3.1.1.3 Kết quả khảo sát khả năng mọc của 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa trên môi trường

agar hữu cơ:

- Vì kết quả định tính lại canh trường nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa phân lập

được ở trên đều không có hoạt tính, nên chúng tôi nghi ngờ 4 chủng đó không phải là vi

khuẩn nitrite hóa mà là các chủng vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Chính vì vậy mà

chúng tôi tiến hành cấy chuyển 4 chủng vi khuẩn nghi ngờ ấy sang môi trường hữu cơ agar

để khảo sát khả năng mọc của chúng. (xem phần phụ lục D)

-

Tất cả 4 chủng W1 phân lập được đều mọc tốt trên môi trường agar có thành phần 2oC), chúng là những vi dinh dưỡng hữu cơ sau 48 giờ ủ mẫu ở nhiệt độ phòng (28

khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ chứ không phải là các chủng vi khuẩn nitrite hóa nên các

chủng vi khuẩn này bị loại bỏ.

(cid:190) Như vậy đúng như kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả việc phân lập các AOB gặp

khó khăn vì chúng tăng trưởng rất chậm nên khó phân lập chủng thuần khiết, chúng thường

bị các vi khuẩn dinh dưỡng hóa năng hữu cơ lấn át. Việc phân lập đòi hỏi agar tinh khiết

hoặc thạch silica gel là điều khó đạt được trong điều kiện chúng tôi. Từ đó chúng tôi thay

đổi cách tiếp cận vấn đề. Theo lý thuyết để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm,

người ta phân lập các chủng vi sinh từ các nguồn ô nhiễm, làm thuần, nghiên cứu hoạt tính,

cải biến hoạt tính rồi sản xuất chế phẩm. Tuy nhiên trong trường hợp AOB là vi khuẩn

thuần túy dinh dưỡng hóa năng vô cơ việc phân lập và làm thuần gặp nhiều khó khăn. Hơn

nữa, ứng dụng chúng trong xử lý nước thải dựa chủ yếu vào họat tính quần thể hơn là hoạt

tính cá thể, nên chúng tôi thay đổi mục tiêu “phân lập” thành mục tiêu “tăng sinh” vi khuẩn

AOB nhằm tăng sinh khối vi khuẩn này đủ cho những thí nghiệm xử lý nước thải về sau

(không phải nhiệm vụ của ĐATN này).

3.1.2 Tăng sinh phân lập AOB lần II:

- Lập lại bước tăng sinh trong thí nghiệm trên, song song việc tuân thủ các yêu cầu

ngặt nghèo của AOB là yêu cầu oxy hòa tan phải nằm trong khoảng 2.0 – 3.0 mgO2/L, pH

phải kiểm soát trong khoảng 7.2 – 8.0 , không để ánh sáng chiếu vào, không tiếp xúc cao

su (nút bình tam giác dùng để thí nghiệm làm bằng nút bông không thấm, không dùng nút

50 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

cao su) [6]. Khảo sát oxy hòa tan bằng phương pháp mangan [7], ở vận tốc lắc 150 vòng/

phút, oxy hòa tan là 1.9 mg/L, khi lắc 210 vòng/ phút DO là 3.75 mg/L. Để bảo đảm oxy

hòa tan chế độ lắc 210 vòng/phút được chọn. Kết quả thử nghiệm định tính:

(cid:190) Sau hơn 2 tuần lắc mẫu trên máy lắc 210 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 2oC)

thử nghiệm định tính cho thấy kết quả âm tính ở toàn bộ mẫu tăng sinh (xem phụ lục E).

(cid:190) Xem lại các kết quả phân lập từ trước đến giờ và các tổng quan gần đây (Koops HP

et al., 2006 và Martens-Habbena et al, 2011) [14] về tăng sinh phân lập AOB cho thấy rằng

để có thể phân lập AOB và giữ được hoạt tính nitrite hóa cần bổ sung khoáng vi lượng

thích hợp. Nhận thức được điều này tăng sinh lần 3 được tiến hành.

3.1.3 Tăng sinh phân lập AOB lần III:

- Mẫu nước thải được mang về từ “Công ty CP Thủy sản số 4” và được tiến hành

tăng sinh ngay trên môi trường AOB sau khi mang mẫu nước thải về phòng thí nghiệm, không pha loãng, pha loãng theo dãy thập phân đến 10-3 và tăng sinh trong môi trường tăng

sinh AOB Verhagen, F. J. M., và Laanbroek, H. J. (1991) [21] đề nghị với nồng độ N- + giữ nguyên như trong môi trường W1 là 583 mg/L. Mẫu đối chứng là môi trường NH4

không cấy giống từ nước thải. Bảo đảm các điều kiện như trong thí nghiệm trên như lắc

mẫu 210 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 2oC), pH 7.8, bao nilon đen kín quanh bình

tránh ánh sáng.

3.1.3.1 Kết quả thử nghiệm định tính:

- Sau 18 ngày tăng sinh, thử nghiệm định tính mẫu tăng sinh trên môi trường AOB

cho kết quả được trình bày trong bảng 3.3 như sau:

- qua “Thử nghiệm định tính” 10 bình mẫu

Bảng 3.3: Hàm lượng NH4

+ - NO2

- & NO3

nuôi cấy AOB.

51 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình mẫu Hệ số Độ đục Định tính các dạng ion chứa nitơ trong môi

trường nuôi cấy AOB pha

loãng

-(sinh ra)

NH4

+ (còn dư) NO2

-(sinh ra) NO3

- + + + - - Bình ĐC

0 + + + + + + + + Bình 10o (1)

0 + + + + + + + Bình 10o (2)

0 + + + + + + + + Bình 10o (3)

0 + + + + + + Bình 10o (4)

10 + + + + + + + + + Bình 10-1 (1)

10 + + + + + + + Bình 10-1 (2)

100 + + + + - - Bình 10-2 (1)

100 + + + + + + + + Bình 10-2 (2)

1000 + + + + - - Bình 10-3 (1)

1000 + + + + - - Bình 10-3 (2)

(cid:190) Tất cả 10 bình mẫu tăng sinh trên môi trường AOB đã có hoạt tính nitrite hóa thể

hiện qua độ đục môi trường tăng, lượng nitrite tăng so với nước thải ban đầu (âm tính

nitrite, âm tính nitrate). Độ pha loãng càng nhỏ thì hoạt tính thể hiện càng mạnh qua sự

nhạt màu với thuốc thử Nessler, sự tăng sậm màu với thuốc thử Griess. Pha loãng 1000 lần

nước thải rồi mới cấy vào bình tăng sinh làm mật độ quần thể vi sinh vật AOB quá thấp

dẫn đến không phát hiện được hoạt động bằng phép thử định tính.

(cid:190) Vì thời gian lắc mẫu dài (hơn 2 tuần) nên vi sinh vật NOB (nitrate hóa) có trong

nước thải đã chuyển hóa một phần nitrite thành nitrate bắt màu xanh dương với thuốc thử

Diphenylamine (Bảng 3.3 và Phụ lục F).

(cid:190)

Một số ngoại lệ là bình 10o(4), 10-1(1), 10-2(1) có hệ số pha loãng 0, 10 và 100 lần - - và NO3 nhưng cũng không thể hiện hoạt động hoặc yếu qua phép thử định tính (rất ít NO2

xuất hiện sau thời gian nuôi cấy), điều này chứng tỏ khi môi trường tăng sinh như nhau,

- có trong 10 bình nuôi cấy AOB

nguồn vi sinh vật như nhau nhưng các yếu tố kiểm soát khi tăng sinh không bảo đảm (do

+ - NO2

ngẫu nhiên) có thể dẫn đến thất bại trong tăng sinh AOB. - & NO3 3.1.3.2 Kết quả định lượng hàm lượng NH4

vừa mới phân lập được ở trên:

52 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Để biết được chính xác khả năng chuyển hóa cơ chất của các quần thể vi khuẩn

- & NO3

+ - NO2

nitrate hóa trong 10 bình mẫu phân lập AOB, chúng tôi tiến hành lấy mẫu và định lượng - có trong mỗi bình mẫu và cho kết quả như trình hàm lượng 3 chỉ tiêu NH4

bày trong bảng 3.4:

- trong 10 bình mẫu và hiệu quả chuyển hóa

Bảng 3.4: Hàm lượng NH4

+ - NO2

- & NO3

cơ chất.

Bình mẫu Nồng độ (mg/l) Hiệu quả xử Hiệu quả

N - Amoni N - Nitrite N - Nitrate

lý N – Amoni (%)a nitrate hóa (%)b

554.1 0 0 0 0 Bình ĐC

7.9 136.8 3.7 99 25.3 Bình 10o(1)

8.3 164.8 12.0 99 31.9 Bình 10o(2)

8.5 186.9 12.0 98.5 35.9 Bình 10o(3)

288.4 9.2 0 47.9 1.7 Bình 10o(4)

217.3 31.6 0 60.8 5.7 Bình 10-1(1)

6.9 162.8 23.1 98.8 33.6 Bình 10-1(2)

0 295.9 0 46.6 0 Bình 10-2(1)

4.7 175.0 20 99.2 35.2 Bình 10-2(2)

254.0 0 0 54.2 0 Bình 10-3(1)

+ (%)

aHiệu quả xử lý NH4

279.8 0 0 49.5 0 Bình 10-3(2)

bHiệu quả nitrate hóa (%)

(N-amoniĐC N-amoniTN)/N-amoniĐC*100

(N-nitriteTN N-nitrateTN)/N-amoniĐC*100

53 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Nồng độ các dạng nitơ trong các bình tăng sinh VSV từ nước thải CBTS

600

500

400

300

L / g m

N-ammonium

N-nitrite

200

N-nitrate

100

0

ì

C Đ h n B

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

) 1 (   o 0 1 h n B

) 2 (   o 0 1 h n B

) 3 (   o 0 1 h n B

) 4 (   o 0 1 h n B

) 1 ( 1 ‐ 0 1 h n B

) 2 (   3 ‐ 0 1 h n B

) 1 (   3 ‐ 0 1 h n B

) 2 (   2 ‐ 0 1 h n B

) 1 (   2 ‐ 0 1 h n B

) 2 (   1 ‐ 0 1 h n B

- trong 11 bình tăng sinh AOB.

Hình 3.1: Nồng độ các dạng nitơ NH4

+ - NO2

- & NO3

Hiệu quả nitrate hóa của quần thể VSV từ nước thải CBTS

100

80

60

40

Hiệu quả xử lý N- ammonium

20

Hiệu quả nitrate hóa

0

ì

C Đ h n B

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

ì

) 1 (   o 0 1 h n B

) 2 (   o 0 1 h n B

) 3 (   o 0 1 h n B

) 4 (   o 0 1 h n B

) 1 ( 1 ‐ 0 1 h n B

) 2 (   3 ‐ 0 1 h n B

) 1 (   3 ‐ 0 1 h n B

) 2 (   2 ‐ 0 1 h n B

) 1 (   2 ‐ 0 1 h n B

) 2 (   1 ‐ 0 1 h n B

%

Hình 3.2: Hiệu quả xử lý N – Amoni và hiệu quả nitrate hóa của các quần thể vi

sinh vật trong 10 bình tăng sinh AOB.

(cid:190) Kết quả định lượng không mâu thuẫn với kết quả định tính; từ đó, cho phép chúng

tôi tính toán và kết luận được hiệu quả chuyển hóa cơ chất của các quần thể vi sinh vật

trong 10 bình mẫu tăng sinh AOB. Bảng 3.4 và đồ thị trong hình 3.1, 3.2 cho thấy trong

54 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

các bình 10o(1), 10o(2), 10o(3), 10-1(2) và 10-2(2), tương ứng tăng sinh với nước thải không

pha loãng, pha loãng 10 và 100 lần (tỉ lệ cấy như nhau vào môi trường bằng 1/30), trong

điều kiện phù hợp, nồng độ N – Amoni hầu như đã giảm gần hết sau 18 ngày nuôi cấy, từ

583 mg/L xuống còn khoảng 10mg/L. Đồng thời trong những mẫu này có sự nitrite hóa

xảy ra rõ ràng, với nồng độ nitrite tăng từ 0 lên đến cao nhất là 186.9 mg/L, một phần nhỏ

chuyển hóa thành nitrate, nồng độ không vượt 23 mg/L.

(cid:190) Đối với các bình 10-2(1), 10-3(1) và 10-3(2) tương ứng với nồng độ pha loãng nước

thải là 100 lần và 1000 lần rồi mới tăng sinh cùng điều kiện như các mẫu trên, nồng độ N-

+ chỉ đạt xấp xỉ 50%.

amoni còn dư không dưới 254 mg/L, nitrite và nitrate chưa được tạo thành. Hiệu quả xử lý

NH4

+ được sử dụng để tạo

(cid:190) Từ kết quả thí nghiệm dẫn đến kết luận khoảng 50% N-NH4

thành sinh khối vi sinh vật. Những nghiên cứu về động học tăng trưởng là cần thiết để có + trong môi trường kết luận chặt chẽ về vấn đề này. Dù chuyển hóa thành dạng gì thì NH4

đã được chuyển hóa thành cơ chất cho những quá trình xử lý khác.

(cid:190)

được thay môi trường và tăng sinh tiếp. Khi lượng NH4

Các bình tăng sinh 10o, 10-1(1), 10-1(2), 10-3(1), 10-3(2), 10-2(1) và 10-2(2) tiếp tục + trong môi trường giảm 80%, sinh + ban đầu chu khối sẽ được chuyển sang môi trường mới để bảo đảm được nồng độ N-NH4

kỳ là 583 mg/L.

3.1.3.3 Kết quả định tính lại 10 bình AOB sau khi thêm môi trường mới vào và tăng sinh

tiếp tục trong 13 ngày:

- Mười bình mẫu AOB sau khi đã thêm môi trường AOB mới vào và được theo dõi

tăng sinh (ở các điều kiện nuôi cấy như trên) trong vòng 13 ngày thì tiếp tục định tính lại

để xem hàm lượng cơ chất trong các bình có tăng hay giảm như thế nào và cho kết quả

định tính như được trình bày trong bảng 3.5 (xem thêm phụ lục G):

Bảng 3.5: Thử nghiệm định tính kiểm tra hoạt động của các bình tăng sinh AOB

khi được tiếp môi trường mới trong 13 ngày.

55 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Tên bình Hệ số pha Độ đục Định tính các dạng ion chứa nitơ trong

loãng môi trường nuôi cấy AOB

- sinh ra

NH4

+ còn dư NO2

- sinh ra NO3

+ + + - Bình ĐC - -

Bình 10o(1) 0 + + + + + + +

Bình 10o(2) 0 + - + + + + +

Bình 10o(3) 0 + - + + + + + +

Bình 10o(4) 0 + + + + + + +

Bình 10-1(1) 10 + + + + + + + +

Bình 10-1(2) 10 + + + + + + +

Bình 10-2(1) 100 + + + + - -

Bình 10-2(2) 100 + + + + + +

Bình 10-3(1) 1000 + + + + - -

Bình 10-3(2) 1000 + + + - -

(cid:190) Khi thay môi trường mới (chuyển toàn bộ sinh khối sang), cũng giống như lần tăng

sinh đầu tiên, các quần thể vi khuẩn nitrate hóa vẫn tiếp tục hoạt động với mức độ khác + triệt để, các bình với hệ số nhau: lần này cả 4 bình 10o (không pha loãng) đều loại bỏ NH4 + tồn dư ít (+), 1 bình với hệ số pha loãng 100 cho thấy hiệu quả pha loãng 10 cho thấy NH4

chuyển hóa. Còn lại 1 bình với hệ số pha loãng 100 và 2 bình với hệ số pha loãng 1000

chuyển hóa xảy ra yếu nên bị loại bỏ, trong khi các bình khác được thay môi trường mới để

tiếp tục tăng sinh.

(cid:190) Sau hai chu kỳ tăng sinh AOB trên môi trường AOB bổ sung khoáng vi lượng,

chúng tôi nhận thấy hoạt tính của vi khuẩn AOB không thay đổi, so với chu kỳ trước chu + được loại bỏ ra khỏi những kỳ này ngắn hơn (18 ngày so với 13 ngày) để toàn bộ NH4

bình có nồng độ vi sinh vật cao nhất (không pha loãng nguồn ban đầu, tỉ lệ cấy 1/30).

(cid:190) Vi khuẩn AOB là vi khuẩn dinh dưỡng hóa năng vô cơ hiếu khí bắt buộc, không thể

lầm lẫn chúng với các vi sinh vật gây bệnh. Như vậy với phương pháp tăng sinh thay vì

phân lập quần thể AOB sẽ tăng để đáp ứng nhu cầu xử lý nước thải. Việc xác định hoạt lực

của quần thể có thể dựa trên động học chuyển hóa của quần thể.

56 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

3.2 Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrate hóa của các chủng

NOB có nguồn gốc từ nhà máy chế biến thủy sản (CBTS):

3.2.1 Tăng sinh phân lập NOB lần I:

- Đồng thời với tăng sinh phân lập AOB vi khuẩn nitrate hóa NOB cũng được tăng

sinh phân lập. Lần đầu tiên NOB được phân lập trên môi trường W2 như mô tả trong giáo

trình của Egorov. Nước thải được pha loãng 100 lần và 10000 lần cấy vào môi trường tăng

sinh W2 và lắc trên máy lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 2oC).

3.2.1.1 Kết quả định tính:

- Thử nghiệm định tính được tiến hành sau hai tuần tăng sinh. Tuy nhiên, qua thử

nghiệm định tính chúng tôi phát hiện hóa chất NaNO2 (nguồn năng lượng trong môi trường

W2 là ion nitrite) bị nhiễm một lượng nitrate nhất định, do đó phép thử định tính không

đem lại kết quả tin cậy (xem thêm phần phụ lục H). Thay vào đó phân tích định lượng

nitrite, nitrate được tiến hành để đánh giá được khả năng chuyển hóa cơ chất của các quần

thể vi sinh vật trong nước thải. Trước hết chúng tôi thử phân lập ra các chủng vi khuẩn

thuần khiết từ 4 bình nuôi cấy trên đã sau đó mới kiểm tra và khảo sát khả năng chuyển

hóa của những chủng vi khuẩn phân lập được ấy.

3.2.1.2 Kết quả phân lập:

-

Từ 4 bình mẫu nuôi cấy: 2 bình 10-2 và 2 bình 10-4 sau khi “nghi ngờ” dịch nuôi - giảm đi với thuốc thử cấy dương tính (+) với thuốc thử Diphenylamine và hàm lượng NO2

Griess A & Griess B thì chúng tôi tiến hành lấy sinh khối trong bình nuôi cấy và cấy ria

trên môi trường thạch W2 agar để phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa có trong bình

nuôi cấy. Sau quá trình chọn lựa (dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường

thạch) chúng tôi đã chọn và thuần khiết được 6 chủng vi khuẩn nghi ngờ là các chủng vi

khuẩn nitrate hóa có các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và hình thái về tế bào như sau:

(Bảng 3.6 và Hình 3.3; xem thêm phụ lục I, J)

Bảng 3.6: Tổng kết các chủng vi khuẩn nitrate hóa phân lập được trên môi trường W2.

57 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Tên chủng Hình thái Gram Hình thái tế Khả năng di động

khuẩn lạc bào

Màu trắng đục - Hình cầu + Mẫu 1 sữa – bóng –

lồi

Màu vàng cam - Hình bầu dục + Mẫu 2 – không bóng –

nhăn – lồi

- Hình que lớn + Màu trắng đục Mẫu 3 – bóng – lồi –

ướt

Màu vàng cam - Hình cầu nhỏ + Mẫu 5 – bóng – lồi –

ướt

- Hình que nhỏ + Màu trắng đục Mẫu 7 – bóng – lồi-

rất ướt

- Hình que nhỏ + Màu vàng – Mẫu MV1 tròn - lồi –

bóng – ướt

58 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

b) c) a)

e) f) d)

Hình 3.3: Các mẫu vi khuẩn phân lập trên thạch W2. a) Mẫu 1, b) Mẫu 2, c) Mẫu 3, d)

Mẫu 5, e) Mẫu 7, f) Mẫu MV1.

3.2.1.3 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 mẫu vi khuẩn phân lập được trên môi trường

lỏng W2:

-

- với kết qủa trình bày trên hình 3.4 và 3.5:

Sáu mẫu vi khuẩn nitrate hóa đã phân lập được ở trên được tăng sinh trong môi - và trường lỏng W2 và khảo sát khả năng nitrate hóa sau 2, 4, 6 ngày qua định lượng NO2

NO3

- Hình 3.4 cho thấy hàm lượng N-nitrite trong môi trường W2 thực phân tích được

lúc đầu là 180 mg/L giảm nhanh sau 2 ngày nuôi cấy còn xấp xỉ 60 -80 mg/L đối với các

chủng 1, 2, 3, 5, 7 và 100 mg/L đối với chủng MV1, sau đó nồng độ N-nitrite không giảm

tiếp mà gần như không thay đổi.

59 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Chủng 1

Biến thiên N-nitrite trong môi trường W2 khi cấy vi khuẩn phân lập từ nước thải CBTS

L / g m

Chủng 2

Chủng 3

Chủng 5

Chủng 7

, e t i r t i n - N

Chủng MV1

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

0 ngày

2 ngày

4 ngày

6 ngày

Hình 3.4: Biến thiên N-nitrite trong môi trường W2 khi cấy vi khuẩn phân lập từ

nước thải CBTS.

16.0

14.0

Chủng 1

12.0

10.0

Chủng 2

8.0

Chủng 3

6.0

Chủng 5

Nồng độ N-nitrate sinh ra trong môi trường W2, mg/L

L / g m   , e t a r t i n ‐ N

4.0

Chủng 7

2.0

Chủng MV1

0.0

0 ngày

2 ngày

4 ngày

6 ngày

Hình 3.5: Nồng độ N-nitrate (mg/L) sinh ra trong môi trường W2 khi cấy các chủng

phân lập.

- Trong môi trường W2 tạp nhiễm trung bình khoảng 14.5 mg/L N-nitrate, dẫn đến

phản ứng dương tính với thuốc thử Diphenylamine ngay từ thời điểm 0. Sau khi trừ đi

nồng độ N-nitrate ban đầu, nồng độ N-nitrate sinh ra được biểu diễn trên hình 3.5.

- Dựa vào các nồng độ chuyển hóa N-nitrite và N-nitrate tạo thành, hiệu quả chuyển

hóa sau 6 ngày được trình bày trên bảng 3.7.

(cid:190) Như vậy, từ nước thải CBTS có thể phân lập được 6 mẫu, trong đó hiệu quả chuyển

hóa nitrite sau 6 ngày chỉ đạt cao nhất 60%, hiệu quả nitrate hóa rất thấp. Vi khuẩn NOB

60 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

theo các nghiên cứu trước đó có 3 dạng, dạng tự dưỡng (autotrophic), dạng dị dưỡng

(heterotrophic) và dạng hỗn hợp (mixotrophic) (Spieck E và Lipski A, 2011), tuy nhiên

thời gian thế hệ còn dài hơn AOB, có thể kéo dài đến 60 giờ. Vì vậy, việc thu được vi

khuẩn này trên bề mặt thạch là có thể nhưng không tránh khỏi tạp nhiễm. Mặc dù có kết

quả quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào như trình bày phần trên nhưng kết luận đó là các

chủng NOB là quá vội vã. Trên thực tế không thể nhìn thấy các vi khuẩn lạc riêng rẽ của

AOB và NOB bằng mắt thường. Các NOB như Nitrospira chỉ có thể tách khỏi vi khuẩn tạp

nhiễm bằng phương pháp ly tâm phân đoạn theo Percoll (Percoll gradient centrifugation)

kèm theo pha loãng nhiều lần (Speck E và Bock E., 2005) [19].

Bảng 3.7: Hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa sau 6 ngày tăng sinh.

Hiệu quả

Hiệu quả

nitrate hóa

chuyển hóa

Chủng

(%)

nitrite (%)

0

ĐC

0

57.1

3.5

Mẫu 1

55.1

8.4

Mẫu 2

56.1

6.7

Mẫu 3

56.4

4.9

Mẫu 5

56.9

2.6

Mẫu 7

59.0

5.2

Mẫu MV1

3.2.1.4 Khảo sát khả năng chuyển hóa của các quần thể NOB trong thí nghiệm tăng sinh

trên môi trường lỏng NOB (1g NaNO2/l):

- Vì những lý do trình bày ở trên các quần thể vi khuẩn trên tiếp tục được đưa vào

tăng sinh trên môi trường chứa nitrite là nguồn năng lượng. Để bảo đảm không mất họat

tính môi trường NOB biến đổi từ môi trường Bock, 1983 được sử dụng (Spieck E và

Lipski A, 2011), sau đây được gọi là môi trường NOB.

(cid:190) Chỉ các quần thể trong Mẫu 2, 3 và MV1 cho hiệu quả nitrate hóa cao hơn các mẫu

còn lại được đưa vào môi trường NOB tiếp tục tăng sinh. Hình 3.6 cho thấy tốc độ chuyển

hóa của N-nitrite theo thời gian trong 12 ngày tăng sinh.

61 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

250

200

Biến đổi N-nitrite theo thời gian, mg/L

L / g m

150

Chủng 2

Chủng 3

100

MV1

50

, e t i r t i n - N

0

0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày12 ngày

Hình 3.6: Biểu đồ thể hiện khả năng chuyển hóa N – Nitrite của 3 mẫu trong suốt thời

gian khảo sát.

- So sánh với thí nghiệm tăng sinh trên môi trường W2, lần này tốc độ chuyển hóa

chậm hơn, N-nitrite giảm đến 8 ngày sau đó ít biến đổi và biên độ giảm từ gần 200 mg/L

xuống xấp xỉ 100 mg/L, đạt hiệu quả biến đổi cao nhất xấp xỉ 50% (Hình 3.6).

- Trong khi đó nồng độ nitrate tạo thành rất thấp (Hình 3.7), chỉ đạt đến cao nhất 10

mg/L sau 12 ngày, thấp hơn so với tăng sinh trên môi trường W2 (đạt 14.5 mg/L sau 6

ngày). Hiệu quả nitrate hóa chỉ khoảng 5% (Hình 3.8) sau 12 ngày. Có thể giải thích sự

khác biệt lần này so với lần tăng sinh thứ nhất là đổi từ môi trường W2 sang môi trường

NOB hoặc do không kiểm soát được nồng độ cấy giống do tạp nhiễm.

12

10

8

Biến đổi N-nitrate theo thời gian, mg/L

L / g m

Chủng 2

6

Chủng 3

4

, e t a r t i n - N

MV1

2

0

0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

10  ngày

12  ngày

Hình 3.7: Biến đổi nồng độ N – Nitrate tạo thành theo thời gian khảo sát các mẫu phân

lập

62 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

60

Hiệu quả chuyển hóa  nitrite, % Chủng 2

50

40

Hiệu quả chuyển hóa  nitrite, % Chủng 3

Hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa, %

%

30

Hiệu quả chuyển hóa  nitrite, % MV1

20

Hiệu quả nitrate  hóa, % Chủng 2

10

Hiệu quả nitrate  hóa, % Chủng 3

0

Hiệu quả nitrate  hóa, % MV1

0  ngày

2  ngày

4  ngày

6  ngày

8  ngày

10  ngày

12  ngày

Hình 3.8: Biến đổi hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa theo thời gian của

các mẫu phân lập.

(cid:190) Như vậy tương tự như trường hợp AOB, phần lớn hợp chất nitơ dưới dạng nitrite

khi chuyển hóa thành nitrate được giữ lại bên trong tế bào để đồng hóa.

(cid:190) Vấn đề ở đây là khác với hiệu quả xử lý AOB gần như 100% thì hiệu quả xử lý của

NOB trong thí nghiệm chỉ đạt được ≈ 50%. Điều này tương tự như trường hợp xảy ra với

AOB khi sử dụng hệ số pha loãng cao (1000). Từ đó đưa ra đề nghị không nên cố gắng

phân lập các AOB và NOB để tạo chế phẩm tăng cường sinh học trong xử lý nước thải

giàu nitơ mà chỉ nên tăng sinh chúng loại bỏ từ từ các vi sinh vật tạp nhiễm nhằm tăng mật

độ các vi khuẩn cần thiết. Trong công việc này tuân thủ điều kiện tăng trưởng và phát triển

là điều kiện tiên quyết như: nguồn năng lượng, carbon, khoáng vi lượng, oxy hòa tan, pH,

tránh ánh sáng trực tiếp… Theo nghiên cứu tổng quan thì NOB có thời gian thế hệ dài hơn

AOB nhiều, có thể kéo dài đến 60 giờ, vì vậy muốn tăng hiệu quả chuyển hóa nitrite phải

tăng sinh khối NOB nhiều lần so với AOB. Đó là mục tiêu của những nghiên cứu tiếp theo.

Ngoài ra phải tìm được tỉ lệ thích hợp giữa cơ chất và sinh khối để tăng hiệu quả chuyển

hóa.

(cid:190) Trong các thí nghiệm trên đây chưa thấy phương pháp nào được thực hiện để đo

sinh khối vi khuẩn. Phương pháp đếm khuẩn lạc truyền thống không áp dụng được do dễ

tạp nhiễm, phương pháp MPN đòi hỏi thời gian nuôi cấy 1 tháng, phương pháp PCR

định lượng, DGGE và FISH (fluorescence in situ hybridization) vượt quá khả năng phòng

thí nghiệm. Phương pháp microcolony sử dụng (HesselsÖe M, 1999) đòi hỏi kính hiển vi

63 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

huỳnh quang. Dựa trên kết quả thí nghiệm này chúng tôi đề nghị những nghiên cứu tiếp

theo dựa trên vận tốc chuyển hóa và độ tăng chất khô sinh khối.

64 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

CHƯƠNG 4:

KẾT LUẬN VÀ KIẾN

NGHỊ

65 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

4.1 Kết luận:

-

được tăng sinh trên môi trường W1 lỏng (583 mg N-NH4

+ thành NO2

Từ nước thải chế biến thủy sản lấy từ “Công ty CP Thủy sản số 4” vi khuẩn AOB +/L) thể hiện khả năng chuyển - nhưng hoạt tính này biến mất khi chúng được chuyển sang môi hóa NH4

trường thạch.

-

+ trong bình nuôi cấy cạn kiệt.

Thay môi trường W1 bằng môi trường AOB có các nguyên tố vi lượng với cùng + giúp thành công trong tăng sinh AOB mà không mất hoạt tính khi cấy nồng độ NH4

truyền sang môi trường mới để cung cấp NH4

+ giảm từ 583 mg/L xuống 10 mg/L khi

- Sau 18 ngày tăng sinh, nồng độ N-NH4

cấy vào môi trường theo tỉ lệ 1/30, với nước thải không pha loãng, pha loãng 10 hoặc 100

+

99%; trong khi đó khi pha loãng nước thải nguồn lần, đạt hiệu quả chuyển hóa N-NH4

1000 lần thì hiệu quả chuyển hóa chỉ còn 50%. Hiệu quả nitrate hóa, chủ yếu là nitrite hóa

đạt cao nhất 35% cho trường hợp nước thải không pha loãng, pha loãng 10 hoặc 100 lần và - trong môi trường là 186.9 mg/L 0% khi pha loãng 1000 lần, dẫn đến sự tích tụ N-NO2

trong trường hợp chuyển hóa tốt nhất.

- Tiếp tục tăng sinh trong cùng điều kiện như thí nghiệm trên sau 13 ngày hiệu quả

chuyển hóa tương tự như lần tăng sinh trước nhưng thời gian ngắn đi, cho thấy bằng kỹ

thuật tăng sinh có thể cung cấp quần thể AOB cho mục tiêu xử lý nước thải mà không cần

phân lập.

-

Cũng từ nước thải chế biến thủy sản lấy từ “Công ty CP Thủy sản số 4” vi khuẩn -). Những cố gắng phân NOB được tăng sinh trên môi trường W2 lỏng (≈184 mg/L N-NO2

lập chúng trên môi trường thạch thu được 6 mẫu vi khuẩn gram âm, có khả năng di động, - gần 60% trong môi trường W2 lỏng sau 6 ngày mẫu thể hiện khả năng chuyển hóa NO2

tăng sinh, hiệu quả này chỉ còn 50% sau 12 ngày tăng sinh trong môi trường NOB của

Bock, 1983. Với hiệu quả chuyển hóa nitrite này, lượng N-nitrate sinh ra rất nhỏ chỉ chiếm

10% so với lượng nitơ ban đầu.

4.2 Kiến nghị:

+ là 583 +, N-

- Tiếp tục tăng sinh nuôi cấy quần thể AOB trên môi trường AOB với N-NH4

+ bao gồm các chỉ tiêu sinh khối, N-NH4

-.

mg/L. Khảo sát động học chuyển hóa N-NH4

- và N-NO3

NO2

- Khảo sát ảnh hưởng của thông số nước thải thực tế đến quần thể AOB như nồng độ

NaCl, nồng độ chlorine khử trùng.

66 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

+ và sinh khối trong điều kiện thực tế để đưa vào

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

- Xác định mối tương quan N-NH4

xử lý nước thải.

Với các vi khuẩn NOB đã phân lập tiếp tục tăng sinh theo dõi hoạt động trong môi -

trường lỏng; làm rõ ảnh hưởng của môi trường tăng sinh W2 và Bock.

Tiến hành tiếp theo tương tự như với AOB để có thể ứng dụng trong xử lý nước -

thải.

- Để kết hợp AOB và NOB cần khảo sát tỉ lệ AOB/NOB thích hợp tránh ứ đọng

nitrite.

67 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. Tài liệu Tiếng Việt:

[1] Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007). Phân lập và tuyển chọn các

chủng vi khuẩn nitrat hóa để ứng dụng trong xử lý nước hồ ô nhiễm. Tạp chí Khoa Học Và

Công Nghệ. Tập 45, số 3, 2007. Tr.95 – 100.

[2] Hoàng Phương Hòa, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc (2008).

Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn nitrat hóa phân lập từ nước lợ nuôi tôm tại

Quãng Bình và Hà Tĩnh. Khoa Học Công Nghệ. Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn –

Số 2 – Tháng 2/2008.

[3] Egorov. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học quốc gia Moscow.

[4] Nguyễn Văn Phước (2005). Thí nghiệm Hóa Kỹ Thuật Môi Trường – Phần I: Phân tích

chất lượng nước, NXB ĐHQG TP.Hồ Chí Minh.

[5] TS. Trần Cẩm Vân (2001). Giáo trình Vi sinh vật học môi trường, NXB ĐHQG Hà

Nội.

B. Tài liệu Tiếng Anh:

[6] Annette Bollmann, Elizabeth French, and Hendrikus J.Laanbroek (2011). Isolation,

Cultivation, and Characterization of Ammonia-Oxidizing Bacteria and Archaea Adapted to

low Ammonium Concentrations. Methods in Enzymology, Volume 486.

[7] AWWA/APHA/WEF (1999). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th Edition – Method 4500-N.

[8] Benson (2001). Microbiological Applications Lab Manual. Eighth Edition. The

McGraw−Hill Companies.

[9] Eva Spieck and Andre Lipski (2011). Cultivation, Growth Physiology, and

Chemotaxonomy of Nitrite-Oxidizing Bacteria. Methods in Enzymology, Volume 486. [10] Gray NF. (2004). BIOLOGY OF WASTEWATER TREATMENT (2nd Edition).

Imperial College Press, London. 1439p.

[11] Jane Meiklejohn (1950). The Isolation of Nitrosomonas europaea in Pure Culture.

Journal of General Microbiology, Vol.4, No.2

[12] Jane Meiklejohn (1953). Iron and the Nitrifying Bacteria. J.gen.Microbiol. 8, 58 – 65. [13] Kh.Elbanna1,2, R.M.El-Shahawy1, K.M.Atalla1 (2011). A new simple method for the

enumeration of nitrifying bacteria in different environments. PLANT SOIL ENVIRON.,

58, 2012 (1): 49 – 53.

68 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

[14] Koops HP, Purkhold U, Pommerening-röser A, Timmermann G. Wagner M (2006).

The Lithoautotrophic Ammonia-Oxidizing Bacteria in The Prokaryotes. T. 5, Third Edition

Springer.

[15] Martin Hesselsøe and Jan Sørensen (1998). Microcolony formation as a viability

index for ammonia-oxidizing bacteria: Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp.. FEMS

Microbiology Ecology 28 (1999) 383 – 391.

[16] Michael H.Gerardi (2002). Nitrification and Denitrification in the Activated Sludge

Process. Wastewater Microbiology Series, Environmental Protection Magazine Series.

[17] Patrick Chain, Jane Lamerdin, Frank Larimer, Warren Regala, Victoria Lao, Miriam

Land, Loren Hauser, Alan Hooper, Martin Klotz, Jeanette Norton, Luis Sayavedra-Soto,

Dave Arciero, Norman Hommes, Mark Whittaker and Daniel Arp (2003). Complete

Genome Sequence of the Ammonia-Oxidizing Bacterium and Obligate

Chemolithoautotroph Nitrosomonas europaea. Journal of Bacteriology, May 2003, p. 2759

– 2773.

[18] R.F.Lewis and D.Pramer (1958). Isolation of Nitrosomonas in Pure Culture. Paper of

the Journal Series, New Jersey Agricultural Experiment Station, Rutgers, The State

University, Department of Agricultural Microbiology, New Brunswick, N.J.

[19] Speck E. and Bock E.(2005). The Lithoautotrophic Nitrite-Oxidizing Bacteria. Bergey

manual of systematic bacteriology, Springer 2005. [20] S.Soriano and N.Walker (1968). Isolation of Ammonia-oxidizing Autotrophic

Bacteria. Soriano, S. & Walker, N. (1968). J. appl. Bact. 31, 493 – 497.

[21] Verhagen.F.J.M., and Laanbroek.H.J.(1991). Competition for ammonium between

nitrifying and heterotrophic bacteria in dual energy limited chemostats. Appl. Environ.

Microbiol.57, 3255 – 3263.

C. Tài liệu Internet:

[22]http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiem-

dinhtenvk03.htm

[23]http://www.agroviet.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=14063

[24] http://vanban.chinhphu.vn/. THÔNG TƯ Số: 12/2010/TT-BNNPTNT ngày

11.03.2010 Ban hành “Danh mục bổ sung sản phẩm xử lý, cải tạo môi trường nuôi trồng

thuỷ sản được phép lưu hành tại Việt Nam”.

69 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH

A. Hình “Thử nghiệm định tính” 4 bình mẫu W1 nuôi cấy “Phân lập lần I” từ nước

thải TS4:

ĐC (+) Mẫu TN ĐC (-) Mẫu TN ĐC (+) ĐC (-)

Bình 10-2: canh trường nuôi cấy dương

+ giảm đi trong môi trường nuôi cấy

NH4

tính với thuốc thử Griess A & Griess B

ĐC (-) Mẫu TN ĐC (+) ĐC (+) Mẫu TN ĐC (-)

+ giảm đi trong môi trường nuôi cấy

NH4

Bình 10-4: canh trường nuôi cấy dương

tính với thuốc thử Griess A & Griess B

B. Hình “Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào” của 4 chủng vi khuẩn phân lập

được trên môi trường W1 (qua lần phân lập đầu tiên):

70 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Cầu khuẩn – nhỏ - gram (-). Chủng 1: Màu Vàng đậm – hơi bóng – lồi.

Cầu khuẩn – tròn nhỏ li ti – gram (-). Chủng 2: Màu vàng đậm – nhăn – không

bóng – lồi.

Cầu khuẩn – tròn nhỏ - gram (-). Chủng 3: Màu cam nhạt đục sữa – tròn –

bóng – lồi.

71 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Hình cầu – rất nhỏ - gram (-). Chủng 4: Màu trắng đục – bóng – lồi.

C. Hình “Thử nghiệm định tính” của 4 chủng vi khuẩn W1 thuần khiết sau khi cấy

trở lại môi trường lỏng W1:

Chủng 1: Canh trường âm tính (-) với Chủng 2: Canh trường âm tính (-) với

thuốc thử Griess A & Griess B. thuốc thử Griess A & Griess B.

72 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Chủng 3: Dịch nuôi cấy âm tính (-) với

Chủng 4: Dịch nuôi cấy âm tính (-) với thuốc thử Griess A & Griess B.

thuốc thử Griess A & Griess B.

Hình khuẩn lạc 2 chủng vi khuẩn W1 mọc trên “Môi trường kiểm nghiệm agar D.

hữu cơ”:

Chủng 3. Khuẩn lạc mọc tốt trên môi Chủng 4. Khuẩn lạc mọc tốt trên môi

trường agar hữu cơ sau 2 ngày ủ mẫu. trường agar hữu cơ sau 2 ngày ủ mẫu.

E. Hình “Thử nghiệm định tính” 4 bình nuôi cấy W1 phân lập lần thứ II từ nước thải

TS4:

73 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

(cid:198)Dịch nuôi cấy âm tính (-) với thuốc thử Bình 1 (10-2)

Griess A & Griess B.

(cid:198)Canh trường nuôi cấy âm tính (-) với thuốc Bình 2 (10-2)

thử Griess A & Griess B.

74 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

(cid:198)Canh trường nuôi cấy âm tính (-) với thuốc Bình 1 (10-4) thử Griess A & Griess B.

(cid:198)Dịch nuôi cấy âm tính (-) với thuốc thử Bình 2 (10-4)

Griess A & Griess B.

F. Hình “Thử nghiệm định tính” 10 bình mẫu nuôi cấy trên môi trường AOB từ nước

thải TS4:

75 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình mẫu ĐC: (mẫu không cấy nước thải). Cũng lắc trên máy lắc 210 vòng/phút, 2oC) như 10 bao kín tạo điều kiện tối bằng bao nilon đen, ủ ở nhiệt độ phòng (28

bình mẫu bên dưới (có cấy nước thải vào).

Bình 1 (10-o): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 6,5 (cid:198) 7; màu môi trường: trắng đục; hàm

lượng CaCO3: còn nhiều trong bình nuôi cấy.

76 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 2 (10-o): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 6,0 (cid:198) 6,5; màu môi trường: trắng đục;

hàm lượng CaCO3: còn ít trong bình nuôi cấy.

Bình 3 (10-o): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 6,0 (cid:198) 6,5; màu môi trường: trắng rất đục;

hàm lượng CaCO3: còn nhiều.

77 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 4 (10-o): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 6,5 (cid:198) 7,0; màu môi trường: màu hồng tím

(trong suốt); hàm lượng CaCO3: không còn nhiều trong bình nuôi cấy.

Bình 5 (10-1): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 5,5 (cid:198) 6,0; màu môi trường: màu trắng

đục; hàm lượng CaCO3: không còn trong môi trường nuôi cấy.

78 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 6 (10-1): Sau 18 giờ ủ mẫu: pH 6,0 (cid:198) 6,5; màu môi trường: màu trắng

trong; hàm lượng CaCO3: còn ít…

Bình 7 (10-2): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 6,5 (cid:198) 7,0; màu môi trường: trắng trong

suốt; hàm lượng CaCO3: không còn.

79 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 8 (10-2): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 6,0 (cid:198) 6,5; màu môi trường: màu trắng

đục; hàm lượng CaCO3: còn hơi nhiều.

Bình 9 (10-3): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 7,0; màu môi trường: trắng hơi đục; hàm

lượng CaCO3: còn nhiều lắm.

80 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 10 (10-3): Sau 18 ngày ủ mẫu: pH 7,0; màu môi trường: màu tắng đục; hàm

lượng CaCO3: còn rất nhiều.

G. Hình định tính lại 10 bình mẫu AOB sau 13 ngày lắc tăng sinh tiếp tục sau khi đã

thêm môi trường AOB mới vào:

Bình 10o(1)

81 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 10o(2)

Bình 10o(3)

Bình 10o(4)

82 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 10-1(1)

Bình 10-1(2)

Bình 10-2(1)

83 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Bình 10-2(2)

Bình 10-3(1)

Bình 10-3(2)

H. Hình “Thử nghiệm định tính” 4 bình mẫu nuôi cấy W2 phân lập lần I từ nước thải

TS4:

84 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

W2 – 10-2

W2 – 10-2

-

-

NO3

NO3

-

NO2

-

NO2

Bình 2 (10-2) Bình 1 (10-2)

W2 – 10-4

W2 – 10-4

-

NO3

-

NO3

-

NO2

-

NO2

Bình 4 (10-4) Bình 3 (10-4)

I. Hình ảnh “Hình thái khuẩn lạc – Hình thái tế bào – Nhuộm gram” của 6 chủng

vi khuẩn nitrate hóa phân lập được trên môi trường W2:

85 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

1. Chủng MV1:

Tế bào màu đỏ - Gram (-) – Tế bào nhuộm tiên mao Hình thái khuẩn lạc: Màu vàng Hình que nhỏ. (Không thấy được tiên mao). - tròn - lồi– bóng – ướt.

2. Chủng 2:

Tế bào màu đỏ - Gram (-) – Tế bào nhuộm tiên mao

Hình thái khuẩn lạc: Màu vàng Hình bầu dục. (Không thấy được tiên mao).

cam – không bóng – nhăn – lồi.

3. Chủng 5:

86 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Tế bào màu đỏ - Gram (-) – Tế bào nhuộm tiên mao Hình thái khuẩn lạc: Màu vàng

Hình cầu nhỏ. (Không thấy được tiên mao). cam – bóng – lồi – ướt.

4. Chủng 1:

Hình thái khuẩn lạc: Màu trắng Tế bào màu đỏ - Gram (-) – Tế bào nhuộm tiên mao

đục sữa – bóng – lồi. Hình tròn hay hình que. (Không thấy được tiên mao).

5. Chủng 3:

Hình thái khuẩn lạc: Màu trắng Tế bào màu đỏ - Gram (-) – Tế bào nhuộm tiên mao

đục – bóng – lồi – ướt. Hình que lớn. (Không thấy được tiên mao).

87 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

6. Chủng 7:

Hình thái khuẩn lạc: Màu trắng Tế bào màu đỏ - Gram (-) – Tế bào nhuộm tiên mao

đục – bóng – lồi – rất ướt. Hình que nhỏ. (Không thấy được tiên mao).

J. Hình “Thử nghiệm kiểm tra khả năng di động” của 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa

phân lập được trên môi trường W2:

Mẫu ĐC (Mẫu không cấy vi khuẩn W2 vào). Mẫu ĐC: sau 9 ngày ủ mẫu ở nhiệt độ

phòng (28 2oC).

1. Chủng 1:

88 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

(cid:198)Mẫu sau 9 ngày ủ ở nhiệt Chủng 1 Mẫu sau khi cấy vi khuẩn

độ phòng (28 vào (vừa mới cấy xong và 2oC).

đem đi ủ ở nhiệt độ phòng (cid:198)Tạo một lớp đục dày 0.4cm

28 2oC). trên bề mặt ống nghiệm.

2. Chủng 2:

Chủng 2 Mẫu sau khi được cấy vi (cid:198)Mẫu sau 9 ngày ủ ở nhiệt

2oC). khuẩn vào (chưa ủ ngày nào độ phòng (28

cả). (cid:198)Tạo một lớp đục dày 0.4cm

trên bề mặt ống nghiệm.

3. Chủng 3:

89 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

(cid:198)Mẫu sau 9 ngày ủ ở nhiệt Mẫu sau khi cấy vi khuẩn Chủng 3

độ phòng (28 2oC). vào.

(cid:198)Tạo một lớp đục dày 1.1cm

trên bề mặt ống nghiệm.

4. Chủng 5:

Mẫu sau khi được cấy vi (cid:198)Mẫu sau 9 ngày ủ ở nhiệt Chủng 5

khuẩn vào. độ phòng (28 2oC).

(cid:198)Tạo một lớp đục dày 0.7cm

trên bề mặt ống nghiệm.

(cid:198)Làm đục toàn bộ môi

trường và sinh ra bong bóng

khí rất to trong ống nghiệm.

5. Chủng 7:

90 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

(cid:198)Mẫu sau 9 ngày ủ ở nhiệt Mẫu sau khi được cấy vi Chủng 7

độ phòng (28 2oC). khuẩn vào.

(cid:198)Tạo một lớp đục dày 0.8cm

trên bề mặt ống nghiệm.

6. Chủng MV1:

Mẫu sau khi được cấy vi (cid:198)Mẫu sau 9 ngày ủ ở nhiệt

Chủng MV1 khuẩn vào. độ phòng (28 2oC).

(cid:198)Tạo một lớp đục dày 0.5cm

trên bề mặt ống nghiệm.

91 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

PHỤ LỤC BẢNG

- trong thí nghiệm “Khảo sát khả

- & N – NO3

K. Kết quả đo quang OD của N – NO2

năng chuyển hóa” của 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa phân lập được trên môi trường W2:

Tên Thời gian nuôi lắc (210 vòng/phút)

chủng T0 (0 ngày) T2 (2 ngày) T4 (4 ngày) T6 (6 ngày)

520nm Mật độ quang ODNO2-

Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2

1.014 0.9815 0.306 0.2995 0.315 0.310 0.393 0.394 Chủng 1

0.969 0.8315 0.292 0.42 0.393 0.241 0.399 0.424 Chủng 2

0.864 0.7505 0.378 0.3565 0.415 0.253 0.404 0.402 Chủng 3

0.853 0.94 0.305 0.439 0.385 0.416 0.391 0.410 Chủng 5

0.968 0.815 0.358 0.3305 0.319 0.371 0.387 0.405 Chủng 7

0.960 0.935 0.538 0.5057 0.332 0.370 0.394 0.360 Chủng

MV1

410nm Mật độ quang ODNO3-

0.555 0.482 0.394 0.420 0.528 0.601 0.460 0.615 Chủng 1

0.321 0.360 0.444 0.295 0.507 0.449 0.710 0.771 Chủng 2

0.442 0.319 0.381 0.343 0.491 0.448 0.585 0.757 Chủng 3

0.431 0.368 0.431 0.437 0.561 0.500 0.419 0.770 Chủng 5

0.419 0.265 0.497 0.374 0.457 0.593 0.423 0.576 Chủng 7

0.355 0.344 0.483 0.345 0.494 0.559 0.586 0.630 Chủng

- trong thí nghiệm “Khảo sát khả năng

MV1

- & NO3

L. Kết quả đo quang OD của NO2

chuyển hóa” của 3 chủng nitrate hóa đã được chọn lọc trên môi trường NOB:

Chủng 2 Chủng 3 Chủng MV1 Thời

gian 520nm Mật độ quang ODNO2-

L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3

92 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

0.216 0.191 0.223 0.192 0.196 0.202 0.201 0.232 0.195 0 ngày

0.18 0.141 0.182 0.177 0.179 0.164 0.173 0.184 0.207 2 ngày

0.13 0.13 0.141 0.138 0.142 0.151 0.141 0.15 0.151 4 ngày

0.133 0.126 0.123 0.126 0.126 0.116 0.146 0.137 0.146 6 ngày

0.112 0.108 0.111 0.099 0.121 0.124 0.123 0.126 0.14 8 ngày

0.115 0.098 0.103 0.112 0.111 0.113 0.109 0.124 0.104 10

ngày

0.095 0.098 0.103 0.094 0.107 0.123 0.086 0.116 0.123 12

ngày

410nm Mật độ quang ODNO3-

0.142 0.167 0.124 0.164 0.201 0.19 0.176 0.101 0.124 0 ngày

0.127 0.164 0.169 0.191 0.193 0.192 0.19 0.192 0.194 2 ngày

0.165 0.159 0.13 0.204 0.2 0.166 0.202 0.204 0.209 4 ngày

0.182 0.149 0.181 0.215 0.21 0.253 0.269 0.276 0.273 6 ngày

0.216 0.154 0.115 0.204 0.255 0.27 0.278 0.342 0.268 8 ngày

0.348 0.385 0.346 0.363 0.286 0.298 0.296 0.253 0.309 10

ngày

0.431 0.396 0.37 0.295 0.34 0.315 0.401 0.353 0.3 12

ngày

- trong “Thí nghiệm định lượng” 3

+ - NO2

- & NO3

M. Kết quả đo quang OD của NH4

chỉ tiêu trong 10 bình nuôi cấy AOB:

Tên bình mẫu Số lần lập lại

Lần 1 Lần 2 Lần 3

- (OD

520 nm) Kết quả đo quang NO2

0 0 0

0.179 0.142 0.119

0.146 0.156 0.223 Bình ĐC Bình 10o (1) Bình 10o (2)

93 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

0.186 0.180 0.226

0.020 0.018 0.015

0.038 0.043 0.040

0.176 0.144 0.199

0.002 0.002 0.003

0.185 0.189 0.182

0 0 0

0 0 0 Bình 10o (3) Bình 10o (4) Bình 10-1(1) Bình 10-1 (2) Bình 10-2 (1) Bình 10-2 (2) Bình 10-3 (1) Bình 10-3 (2)

+ (OD

430 nm) Kết quả đo quang NH4

1.844 1.92 1.876

0.023 0.028 0.028

0.024 0.025 0.034

0.030 0.026 0.029

0.983 0.951 1.001

0.740 0.706 0.765

0.021 0.022 0.026

0.975 1.030 1.006

0.014 0.017 0.015

0.856 0.871 0.858

0.993 0.915 0.939 Bình ĐC Bình 10o (1) Bình 10o (2) Bình 10o (3) Bình 10o (4) Bình 10-1(1) Bình 10-1 (2) Bình 10-2 (1) Bình 10-2 (2) Bình 10-3 (1) Bình 10-3 (2)

- (OD

410 nm) Kết quả đo quang NO3

0 0 0

0.058 0.055 0.052

0.072 0.066 0.086

0.067 0.072 0.085

0.009 0.008 0.013

0.009 0.010 0.009

0.098 0.110 0.095

0.001 0.001 0.000

0.078 0.108 0.095

0 0 0

0 0 0 Bình ĐC Bình 10o (1) Bình 10o (2) Bình 10o (3) Bình 10o (4) Bình 10-1(1) Bình 10-1 (2) Bình 10-2 (1) Bình 10-2 (2) Bình 10-3 (1) Bình 10-3 (2)

94 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – 2012 GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

N. Nồng độ N – Nitrite và N – Nitrate trong các bình nuôi cấy 3 chủng nitrate hóa trên

môi trường NOB qua các mốc thời gian khảo sát.

Thời gian N – Nitrite (mg/l) N – Nitrate (mg/l)

khảo sát Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu MV1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu MV1

199.4 186.2 198.7 0 0 0 0 ngày

157.5 163.1 177.6 0.4 0.3 2.5 2 ngày

123.9 133.8 137.4 0.3 0.2 3.0 4 ngày

117.6 113.0 133.1 1.1 1.7 5.9 6 ngày

100.8 105.1 119.9 0.7 2.4 6.9 8 ngày

95.9 102.5 102.8 9.1 5.5 6.4 10 ngày

89.3 98.5 98.8 10.7 5.6 9.2 12 ngày

Hiệu quả chuyển hóa nitrite và hiệu quả nitrate hóa của 3 chủng vi khuẩn khảo sát O.

trên môi trường NOB qua các mốc thời gian của thí nghiệm.

Thời gian Hiệu quả chuyển hóa nitrite (%) Hiệu quả nitrate hóa (%)

khảo sát Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu MV1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu MV1

0 0 0 0 0 0 0 ngày

20.99868 12.39377 10.61712 0.190526 0.158681 1.238985 2 ngày

37.86376 28.15156 30.85601 0.148187 0.113344 1.515102 4 ngày

41.00529 39.30595 33.01261 0.557464 0.92942 2.952325 6 ngày

49.43783 43.55524 39.64831 0.366938 1.314789 3.447919 8 ngày

51.91799 44.97167 48.27472 4.558502 2.962053 3.235522 10 ngày

55.22487 47.09632 50.26543 5.391169 2.984721 4.623185 12 ngày

95 SVTH: TRƯƠNG CAO DƯƠNG Lớp: 08DSH5 MSSV: 0851110028