Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS N6.1 ĐỐI KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Võ Minh Sơn

Th.S Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: MAI NGỌC TUYỀN

MSSV: 107111217

Lớp: 07DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2011

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Nuôi trồng thủy sản là một trong những thế mạnh của Việt Nam. Tính đến thời

điểm này, kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đạt hơn 3 tỷ USD với trên

843.000 tấn thủy sản các loại. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn dự báo, giá trị

xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đến hết quý IV năm 2010 nhiều khả năng sẽ đạt mức

4,74 tỷ USD, trong đó riêng kim ngạch xuất khẩu cá tra sẽ chiếm ưu thế đạt khoảng

1,38 tỷ USD. Sản lượng cá tra ngày càng gia tăng thì luôn đi kèm theo sự phát sinh của

dịch bệnh. Một trong những bệnh quan trọng trên cá tra nuôi là bệnh gan thận mủ, đã

có một số công trình nghiên cứu về bệnh này. Và nguyên nhân gây bệnh được xác định

chủ yếu do vi khuẩn E. ictaluri (Crumlish và ctv, 2002). Khi bệnh xảy ra, nông dân

thường lạm dụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn để phòng bệnh và điều trị cho cá

việc này đã tạo ra những chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc (Schwarz và ctv., 2001;

Akinbowale và ctv., 2006). Để thay thế dần dần phương pháp phòng bệnh truyền

thống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học như sử dụng vaccine,

các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh

học), đặc biệt là phương pháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) ngày

càng được ưa chuộng. Việc sử dụng vi sinh vật thay thế kháng sinh để chữa bệnh đã trở

thành bước tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản.

Với ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành “Khảo sát

một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh

gan thận mủ trên cá tra”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Phòng

Sinh học thực nghiệm – Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II.

1.2. Tình hình nghiên cứu

Trong năm 2010, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã tiến hành phân

lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

gây bệnh gan thận mủ trên cá tra. Nguồn vi sinh vật phân lập từ hệ tiêu hóa, nước, bùn

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

ao nuôi cá tra và nguồn vi sinh từ ngân hàng vi sinh. Đã tiến hành 5 đợt thu mẫu với

tổng số mẫu là 284 mẫu (hệ tiêu hóa, nước và bùn), số khuẩn lạc đã sàng lọc qua AHLs

là 592, vi khuẩn lactic là 120 khuẩn lạc, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus là 165 khuẩn lạc

Một số nghiên cứu khác về các vi khuẩn probiotic có đặc tính đối kháng với vi

khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Sàng lọc những vi khuẩn có đặc tính đối

kháng vi khuẩn gây bệnh vẫn là cách tiếp cận được sử dụng chủ yếu trong việc phân

lập vi khuẩn probiotic. Trong quá trình sàng lọc này, đa số các nhà nghiên cứu áp dụng

phương pháp xác định hoạt tính ức chế in vitro (Spangaard và ctv., 2001; Chythanya và

ctv., 2002; Hjelm và ctv., 2004). Hiện nay, có bốn phương pháp thường được sử dụng

để sàng lọc các chủng vi khuẩn tiết ra các hợp chất ức chế in vitro: phương pháp lớp

kép (Dopazo và ctv., 1988), phương pháp đục lỗ trên mặt thạch, phương pháp cấy ria

vuông góc, và phương pháp đĩa giấy khuếch tán. Tất cả các phương pháp trên đều dựa

trên một nguyên tắc là khi một chủng vi khuẩn sản xuất ra một hợp chất ngoại bào có

tính chất ức chế một chủng vi khuẩn khác, hoạt tính này sẽ được thể hiện thông qua

việc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn khác trong môi trường agar.

1.3. Mục đích nghiên cứu

Làm cơ sở để tạo ra những sản phẩm probiotic phù hợp có đặc tính đối kháng

với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E. ictaluri

1.4. Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

 Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối

kháng với E.ictaluri của Bacillus N6.1

 Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật

 Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone

 Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E. ictaluri

bằng phương pháp nuôi chung (co-culture)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

CHƯƠNG II: TỒNG QUAN

2.1. Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

Trong các năm gần đây, nghề nuôi thủy sản trong nước đã phát triển nhanh và

có nhiều nổi bật. Hiện nay ở Đồng bằng sông Cửu Long, mặc dù diện tích nuôi cá tra

không lớn (năm 2009 là 5540 ha) nhưng sản lượng hàng năm cho trên 1.000.000 tấn.

Năm 2010, tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra ở vùng ĐBSCL có nhiều biến

động. Đến hết tháng 11/2010, tổng sản lượng sản xuất cá tra toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ

con cá giống, diện tích thả nuôi 5.420 ha, đạt 90,3% kế hoạch năm; nhờ nâng cao năng

suất (trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ) nên sản lượng cá thu hoạch 1.141.000 tấn, đạt

95,1%/năm. Sản lượng cá xuất khẩu đạt 600.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,3

tỉ USD, giảm 2,8% về lượng, 7,8% về kim ngạch xuất khẩu so cùng kỳ năm 2009. Dự

kiến cả năm xuất khẩu đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,4 tỉ USD.

Đi sâu vào hình thức và mô hình nuôi, nghề nuôi cá tra có sự chuyển đổi từ mô

hình nước chảy trong lồng bè, đăng quần trên sông vùng thượng nguồn sông Tiền và

sông Hậu sang mô hình nuôi ao dọc cồn bãi ven sông và càng dịch chuyển về phía hạ

lưu với chất lượng cá tốt hơn. Tuy nhiên, tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra đang thể

hiện sự thiếu bền vững, trong đó có nhiều nguyên nhân chủ yếu là:

 Việc phát triển cá tra quá nhanh trong những năm vừa qua, đôi khi vượt quá quy

hoạch của ngành, vượt ngoài sự quản lý của nhà nước dẫn đến các sự cạnh tranh không

lành mạnh nhất là việc tiêu thụ sản phẩm trên thị trường quốc tế.

 Sự không ổn định về mặt cung cầu do thiếu cơ chế liên kết phối hợp giữa các

chuổi trong hệ thống đã dẫn đến các hệ lụy về biến động giá cả trên thị trường, chất

lượng sản phẩm, ô nhiễm môi trường, sự phá sản của người nuôi .

 Với số lượng lên đến trên 3 tỉ con giống hàng năm nhưng việc quản lý đàn cá bố

mẹ của các trại sản xuất trong thời gian dài vừa qua chưa thật sự được quan tâm về mặt

quản lý và hổ trợ về mặt kỹ thuật. Hệ quả dẫn đến chất lượng con giống cá tra đang có

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

biểu hiện giảm sút, tốc độ tăng trưởng chậm hơn, dể nhiễm bệnh trong quá trình ương

nuôi, tỉ lệ hao hụt cao khi nuôi.

 Bệnh cá tra nuôi là một trong những nguyên nhân gây hao hụt cho người nuôi.

Trong đó các loại bệnh gan thận mủ, bệnh trắng gan, trắng mang là những bệnh gây

thiệt hại to lớn cho người nuôi có thể thiệt hại đến 20 – 30% sản lượng ao nuôi. Ngoài

ra các bệnh nội và ngoại ký sinh cũng là tác nhân gây tổn thất cho ao nuôi.

 Vấn đề ảnh hưởng đến môi trường nuôi cũng như chất lượng môi trường nước

cấp cho ao nuôi cũng là một thách thức đối với sự ổn định và bền vững trong nghề nuôi

cá tra. Việc giải quyết chất thải và nước thải từ ao nuôi cá tra là thách thức lớn, đỏi hỏi

phải có những giải pháp công nghệ và kỹ thuật để đảm bảo sự bền vững về môi trường.

 Vần đề thị trường tiêu thụ cá tra, tương tự với sản phẩm tôm nuôi, chất lượng

sản phẩm chế biến đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm và đáp ứng yêu cầu truy

xuất nguồn gốc của nhà nhập khẩu cũng được đặt ra đối với việc sản xuất, chế biến,

bảo quản và xuất khẩu sản phẩm cá tra.(Oanh Lê - Nguồn viện nghiên cứu nuôi trồng

thủy sản II)

Hình 2.1: Thu hoạch cá tra ở ĐBSCL

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Edwardsiella spp. và bệnh gan thận mủ trên cá tra

2.2.1. Vi khuẩn Edwardsiella spp.

2.2.1.1. Phân loại

Phân loại khoa học, Edwardsiella thuộc:

Ngành: Proteobacteria.

Lớp: Gammaproteobacteria

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Edwardsiella thường gặp hai loài gây bệnh là: E.tarda và E.ictaluri. E.tarda là

tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da trơn. E. ictaluri gây

bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng gan, thận, tụy của cá không vảy, gây

bệnh nhiễm trùng đường ruột trên cá da trơn ở Mỹ, là tác nhân gây bệnh gan thận mủ

trên cá tra ở Việt Nam. Edwardsiella thường gây bệnh ở động vật máu lạnh: rắn, cá

sấu, cá… và một số động vật thủy sản khác. Ở Việt Nam đã phân lập được E.tarda từ

cá trê giống; E.ictaluri từ cá tra, cá basa…. Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá

hương (cỡ từ 4-6cm) đến 5-6 tháng tuổi, ít xuất hiện hơn ở cá có kích cỡ trên 15cm, tỷ

lệ tử vong của cá từ 60-70%, có trường hợp tới 100%. Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào

mùa xuân, mùa thu và trong ao nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè.

A B

Hình 2.2: Vi khuẩn E.ictaluri (hình A) và cá tra bị bệnh do nhiễm

Edwardsiella (hình B)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

2.2.1.2. Đặc điểm sinh hóa

Theo Hawke và ctv. (1981) Edwardsiella ictaluri, là loài thuộc

Enterobacteriacea, Gram âm, hình que, ngắn, kích thước 0.75x1.5-2.5μm. Di động yếu

ở 25-300C, không di động khi nhiệt độ cao hơn, catalase dương tính, cytochrome

oxidase âm tính và lên men glucose (Shott, 1989). Không sinh ra H2S và Indole âm

tính. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI (36-48 giờ

tại 28-300C).

Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá tra (ở tất

cả các giai đoạn phát triển). Tỷ lệ hao hụt lớn trên cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về

kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g ( Thanh Dung và ctv., 2004). Theo

Ferguson và ctv (2001), bệnh này được ghi nhận xuất hiện ở ĐBSCL vào cuối năm

1998 và có tên là BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius).

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã được phân lập trên cá tra nuôi bè ở Việt Nam,

với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan (Thanh Dung và ctv., 2005)

2.2.2. Bệnh gan thận mủ trên cá tra

2.2.2.1. Lịch sử phát hiện

Bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tác nhân

gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường Đại học Stirling phối

hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp. (Ferguson và ctv., 2001). Đến năm

2002 nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv., 2002). E. ictaluri được báo cáo

đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus (Hawke, 1979). E. ictaluri gây bệnh

nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội chứng này được gọi tắt là ESC

(Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ lệ chết cao ở cá nheo Mỹ (Austin

và Austin, 1999).

Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ. Bệnh xảy

ra ở tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

(USDA/APHIS, 2003). Bệnh xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thường xuyên khi nhiệt

độ nước nằm trong khoảng 20 – 29oC (Tucker và ctv., 2004). Cá bị bệnh ESC thường

giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùng miệng và phần bụng.

Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng có thể xuất hiện trên bề mặt da. Cá nhiễm bệnh thường

lồi mắt và bụng trương to.

Hình 2.3: Các bệnh thường xuyên xuất hiện trên cá tra qua các giai đoạn nuôi (Lý Thị

Thanh Loan và ctv., 2007).

2.2.2.2. Dấu hiệu bệnh lý

Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da (phía mặt lưng), đường kính khoảng 3-

5mm. Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng bên trong cơ và làm

cho da bị mất sắc tố. Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị rách, gẫy.

Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí có

mùi hôi. Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh. Bệnh xuất hiện khi

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

chất lượng nước trong môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày. Nhiệt độ thích hợp để

phát triển khoảng 300C.

2.2.2.3. Một số nghiên cứu về biện pháp phòng bệnh gan thận mủ

Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phòng

bệnh do E. ictaluri gây ra trên cá da trơn. Shoemaker và ctv. (1999) nghiên cứu ảnh

hưởng của ba loại vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5, Immuno2

X+5, Serial 1A) và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33). Cá nheo Mỹ

(Ictalurus punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày tuổi

khác nhau (từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi). Kết quả cho thấy hiệu lực của vaccine đã

thể hiện được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi và 10 ngày

tuổi. Tỉ lệ sống của cá 7 ngày tuổi được gây miễn dịch dao động trong khoảng 58,4 –

77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 – 78,9%. Ba năm sau

đó, nhóm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in vivo đối với việc sử dụng các

loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạn trứng của cá nheo Mỹ,

bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút. Kết quả cho thấy phương pháp gây

miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7% (Shoemaker và ctv.,

2002).

Trong những năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm đến việc phát

triển các chế phẩm vi sinh (probiotic) và một số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào

thức ăn để phòng bệnh E. ictaluri ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus).

Shelby và ctv. (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus

sp. và Enterococcus sp. (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn của cá nheo Mỹ

(Ictalurus punctatus) giống và cho ăn trong vòng 5-8 tuần. Sau đó tiến hành đo các chỉ

tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thông số miễn dịch như protein

huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement. Các số liệu về vi sinh cho thấy

hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ sung trong thời

gian bảo quản khoảng 4 tuần. Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sự khác biệt nào về

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính kháng bệnh của cá sau thời gian cho ăn

thức ăn có bổ sung probiotic.

Aboagye và ctv. (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh

Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm với

Edwardsiella ictaluri. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung

Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi gây

nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so

với nghiệm thức đối chứng (80%).

Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hai lọai

peptide tổng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh

trên cá, trong đó có E. ictaluri (Kjuul và ctv., 1999). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

của cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µm. Các dẫn xuất của cecropin B đã được biết đến

có họat tính kháng khuẩn đối với nhiều loài vi khuẩn gây bệnh, và có khả năng tăng

cường tính đề kháng của cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E. ictaluri (Kelly và ctv.,

1993).

Prebiotic là những hợp chất bổ sung vào thức ăn, có tác dụng kích thích sinh

trưởng và hoạt tính của hệ vi khuẩn có lợi hiện diện trong hệ tiêu hóa của vật chủ

(Delzenne & Roberfroid, 1994). Prebiotic thường được sử dụng kết hợp với probiotic

(gọi là synbiotic). Các hợp chất đường mạch ngắn đang được sử dụng phổ biến như là

prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, trong số đó bao gồm: Inulin, fructose-

oligosaccharide, transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005), isomalto-

oligosaccharide (Li và ctv., 2009). Hiệu quả về dinh dưỡng và sức khỏe của một số

oligosaccharide đã được chứng minh trên cá (Glencross và ctv., 2003; Li & Gatlin,

2005; Pryor và ctv., 2003). Isomalto-oligosaccharide ở nồng độ 0,2% sử dụng kết hợp

với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 cfu/g thức ăn) bổ sung vào thức ăn cho tôm thẻ

chân trắng (Penaeus vannamei) đã giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, tăng

cường phản ứng miễn dịch và khả năng đề kháng đối với virus đốm trắng, thông qua

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

hiệu ứng tương hỗ của hai loại chế phẩm này (Li và ctv., 2009).

Mannan-oligosaccharide (MOS), một loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, đã

được chứng minh là có hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối kháng đối

với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker và

ctv., 2007).

2.3. Tổng quan về probiotic trong nuôi trồng thủy sản

2.3.1. Định nghĩa probiotic

Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy lạp “probios” có nghĩa là “cho sự

sống”. Qua thời gian cùng với sự phát triển của khoa học và sự hiểu biết của nhân loại

thuật ngữ này được định nghĩa nhiều lần.

Vào năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là những nhân tố thúc đẩy

sự phát triển được sản xuất bởi vi sinh vật. Vào năm 1974, Parker đã định nghĩa

probiotic dựa trên mối quan hệ giữa vi sinh với vật chủ “probiotic là những sinh vật và

những cơ chất có lợi cho động vật có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột”. Đến

năm 1989, Fuller đã mở rộng định nghĩa về probiotic: “probiotic là sinh vật sống được

cung cấp dưới dạng thức ăn cho động vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường

ruột”. Havenaar và Huis Int Veld (1992) định nghĩa “probiotic là một chủng hay một

hỗn hợp vi sinh vật sống, cung cấp cho người hoặc động vật, có lợi cho vật chủ bằng

cách cải thiện đặc tính hệ vi sinh vật bản địa”. Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic

là những sinh vật sống cung cấp dưới dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật

chủ”.

FAO/WHO (2002), Reid và cộng sự (2003) lại định nghĩa “probiotic là những vi

sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật

chủ”

Vào năm 2003, Jean Fioramonti và cộng sự đã định nghĩa probiotic một cách

ngắn gọn nhưng đầy xúc tích: “probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật ảnh

hưởng có lợi lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Trước đây, probiotic thường được ứng dụng cho con người và động vật trên cạn,

vì vậy thuật ngữ probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn gram dương chủ yếu

là Lactobacillus và dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng nhiều

gồm cả vi khuẩn gram âm, gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo đơn bào, phạm

vi sử dụng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic ngày nay được

ứng dụng trên cả đối tượng động vật thủy sản.

Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi

trường nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ. Những

vi sinh vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu thụ thức

ăn, động vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn từ môi trường nước, kết quả của

mối tương tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng thủy sản.

Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới hạn

trong đường ruột của vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và cả môi

trường nước xung quanh vật chủ. Do vậy, Verschuere và cộng sự (2000) đã đề xuất

một định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic trong nuôi

trồng thủy sản “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được thêm vào có lợi cho vật chủ

bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật xung

quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường chống

chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ”.

2.3.2. Đặc điểm chung của probiotic

 Có khả năng sống sót trong môi trường acid dạ dày, tồn tại tạm thời hoặc

hình thành khuẩn lạc trong ruột non.

 Không gây hại cho vật chủ.

 Probiotic phải tới đúng vị trí cần tác động trong cơ thể vật chủ.

 Biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng với các sinh vật gây

bệnh, sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử

dụng được).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

 Không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh

2.3.3. Các cơ chế tác động của probiotic

Gia tăng khả năng bám hoặc đối kháng trực tiếp, những ảnh hưởng có hại của

tác nhân gây bệnh là những yếu tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc

trong suốt quá trình nhiễm bệnh. Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi

khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau. Đa

số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều

nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic. Nhìn chung, probiotic có các cơ

chế tác động sau:

2.3.3.1. Sản sinh ra các hợp chất ức chế

Kháng khuẩn là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên. Vì vậy, sự tương tác

giữa các vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đảm bảo trạng thái cân bằng giữa vi sinh

vật hữu ích và những vi sinh vật gây bệnh.

Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học có

khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng

hay các chất hóa học (Fredrickson và Stephanopoulos, 1981). Những hợp chất này bao

gồm: bacteriocin, siderphore, lysozyme, protease, hydrogen peroxide và các acid hữu

cơ. Vi khuẩn sinh acid lactic tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế các vi khuẩn khác.

Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của

một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào môi trường ương nuôi ấu trùng.

Gaixa (1889) đã có báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của vi khuẩn trong nước biển

có khả năng ức chế Vibrio sp. Sau đó, Rosenfeld và Zobell (1947) mô tả một nghiên

cứu sản sinh chất ức chế vi sinh vật biển và kể từ đó nhiều nghiên cứu tiếp theo, theo

hướng sử dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát sinh học. Nogami và Maeda

(1992), Nogami và ctv (1997) đã chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi

khuẩn Vibrio anguillarum, do đó làm gia tăng khả năng sống sót của ấu trùng cua xanh

Portunus trituberculatus, đồng thời cũng làm giảm số lượng Vibrio trong nước ương ấu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

trùng. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng này ngăn chặn sự phát triển của vi

khuẩn V. angillarum trên cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus và Limanda

limanda. Sử dụng V. alginolyticus như một probiotic đã được đề cập để tăng cường khả

năng sống sót và phát triển của ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei ở các

trại nuôi ở Ecuador. Gần đây một chủng vi khuẩn nước mặn, Pseudomonas I2 được

phân lập từ cửa sông, có khả năng sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh trên tôm.

Hợp chất kháng khuẩn này được chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan

trong chloroform, và kháng được sự thủy giải của các ezyme (Chythanya và cộng sự,

2002).

2.3.3.2. Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có

Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đóng một

vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong môi trường

nuôi thủy sản.

Minh chứng điển hình cho tác động này là những vi khuẩn có khả năng sinh

siderophore. Tất cả vi khuẩn đều cần sắt để tăng trưởng, siderophore là chất có trọng

lượng phân tử thấp, có khả năng gắn với ion sắt. Siderophore có thể hòa tan sắt kết tủa

thành dạng dễ sử dụng, do đó nó là một công cụ thu lượm sắt hiệu quả.

Các chủng vi khuẩn vô hại có thể sản xuất siderophore được sử dụng như

probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính gây bệnh có liên quan đến

việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy phân tử sắt trong môi trường thiếu sắt

ở giai đoạn cần thiết (Verchuere và ctv., 2000). Chủng Vibrio E có thể cải thiện khả

năng đề kháng đối với vi khuẩn gây bệnh Vibrio P, Vibrio splendidus ở ấu trùng cá

bơn. Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng, Vibrio E có thể phát triển trong môi trường đã

bị tách hết sắt trong khi Vibrio P thì không. Hơn nữa, cá bơn bột được cho ăn rotifer

được làm giàu chất siderophore deferoxamine của Vibrio E đã đạt được tỉ lệ sống cao

hơn sau khi gây nhiễm với Vibrio P, so với lô đối chứng (Gatesoupe, 1997). Từ những

kết quả có liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

luận rằng hiệu quả probiotic của Vibrio E có thể một phần là do sự đấu tranh giành lấy

phân tử sắt với tác nhân gây bệnh.

2.3.3.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại

Khả năng hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic trong biểu

mô ruột và trong lớp nhầy đường ruột vật chủ là cơ chế bảo vệ vật chủ chống lại tác

nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh các thụ quan bám dính, dinh dưỡng và không gian,

oxy và sự sản sinh các cơ chất kháng khuẩn. Một số cơ chế liên quan đến sự bám dính

của vi sinh vật lên tế bào biểu mô ruột bao gồm: Liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, vị

trí gắn dựa trên các cấu trúc chuyên biệt. Những đặc tính này là một thế mạnh cạnh

tranh quan trọng giúp duy trì vi khuẩn trong đường ruột động vật.

Các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành khuẩn lạc của vi sinh vật có thể phụ

thuộc vào:

 Mối quan hệ với vật chủ như: nhiệt độ cơ thể, enzyme, đặc tính do kháng di

truyền. Ví dụ, vi khuẩn có thể theo nguồn nước và thực phẩm đến miệng và đóng góp

vào quá trình dinh dưỡng, ở đó một số chủng được giữ lại trở thành quần cư của vi

khuẩn đường ruột. Những chủng còn lại bị tiêu diệt thông qua quá trình tiêu hoá và bị

loại thải thông qua quá trình bài tiết. Ngoài ra, sự sinh trưởng của vi khuẩn trong

đường ruột còn có thể bị ức chế do hợp chất kháng khuẩn tiết ra từ vật chủ.

 Các yếu tố có mối quan hệ với vi sinh vật như: ảnh hưởng của các hợp chất

kháng khuẩn, protease, bacteriocin, hydrogen peroxide, sự hình thành NH3, diacetyl, và

sự biến đổi pH do sản sinh các acid hữu cơ.

 Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh chủng Lactobacillus plantarum có khả

năng bám dính và hình thành màng nhầy bên trong đường ruột, chủng này sử dụng vị

trí gắn chuyên biệt là manose để cạnh tranh vị trí gắn với các chủng gram âm gây bệnh

trên lớp nhầy đường ruột của cá.

Ngoài ra, sự hình thành khuẩn lạc và khả năng bám dính của probiotic đóng vai

trò quan trọng trong điều hòa và kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào chủ.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

2.3.3.4. Đóng góp về mặt dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vi sinh vật ảnh hưởng có lợi cho quá trình tiêu

hóa của động vật thủy sản: khử độc các hợp chất độc hại trong thức ăn, phân hủy các

hợp chất khó tiêu như chitin, cellulose…trong thức ăn nhờ các enzyme thủy giải

(cellulase, amylase…). Ngoài ra probiotic còn cung cấp vitamin (biotin và vitamin

B12), carotenoid, protein, acid béo chuỗi ngắn và chuỗi acid béo không bão hòa

(PUFAs-polyunsaturated fatty acids) như eicosapentaenoic acid (EPA) và

docosahexaenoic acid (DHA) cần thiết cho sự sinh trưởng của cá.

Ở mức độ in vivo, có nhiều báo cáo cho rằng khi cho cá ăn probiotic ở nồng độ

từ 103-1012 cfu/g trong thời gian từ 30-90 ngày có thể gia tăng tỷ lệ sống sót, tăng

trọng, giảm hệ số chuyển đổi thức ăn.

Ở cá, có báo cáo cho rằng Bacteroides và Clostridium đã đóng góp về mặt dinh

dưỡng cho vật chủ đặc biệt là cung cấp acid béo và vitamin. Một số vi sinh vật như

Agrobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevibacterium sp., Microbacterium sp., và

Staphylococcus sp có thể đóng góp vào quá trình tiêu hóa ở cá hồi chấm hồng Bắc cực

(Salvelinus alpinus L.). Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B. subtilis, B.

polymixa, B. laterosporus và B. circulans) thúc đẩy tăng trưởng của ấu trùng cá tầm

Acipenser nudiventris: tăng chiều dài và khối lượng, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn,

tăng hệ số tăng trưởng đặc hiệu (Specific Growth Rate). Ngoài ra một số vi khuẩn còn

tham gia vào quá trình tiêu hóa của những loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng cách sản

sinh các enzyme ngoại bào như protease, lipase, đồng thời cung cấp các nhân tố dinh

dưỡng cần thiết. Những nghiên cứu tương tự cho thấy hệ vi sinh vật khu trú ở tôm

Penaeus chinensis bổ sung nguồn enzyme tiêu hóa và các hợp chất đồng hóa tương tự

như ở động vật.

2.3.3.5. Cải thiện chất lượng nước

Chất lượng nước đã được cải thiện nhờ bổ sung các chủng probiotic đặc biệt là

các chủng Bacillus sp. Các chủng Gram dương chuyển đổi các hợp chất hữu cơ thành

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

CO2 tốt hơn các chủng gram âm. Có báo cáo cho rằng việc sử dụng các chủng Bacillus

sp. cải thiện chất lượng nước, tăng khả năng sống và tăng tốc độ phát triển của Penaeus

monodon và làm giảm tác nhân gây bệnh Vibrio.

Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được

chất hữu cơ trong nước ao nuôi thủy sản, giảm hàm lượng BOD và giảm độc tố do

amoni, nitrite và hydro sulfua, khống chế được vi khuẩn gây bệnh, tăng năng suất tôm

cá.

2.3.3.6. Tăng cường đáp ứng miễn dịch

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu có thể được kích thích bởi probiotic, quá

trình hình thành khuẩn lạc và sự bám dính của probiotic trong ruột cá là điều kiện cần

thiết để tăng cường đáp ứng miễn dịch thông qua liên kết giữa các kiểu phân tử liên

quan đến vi khuẩn- BAMPs (bacteria associated molecular patterns) có tính bảo tồn

cao và các thụ thể chyên biệt trên bề mặt của tế bào biểu mô ruột.

Một số nghiên cứu đã chứng minh Clostridium butyricum giúp gia tăng khả

năng kháng Vibrio của cá hồi và gia tăng hoạt tính thực bào của bạch cầu. Rengpipat

và ctv (2000) cho rằng sử dụng Bacillus sp. (chủng S11) đã bảo vệ tôm sú Penaeus

monodon khỏi tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ thống miễn dịch dịch thể ở

tôm. Balca´zar (2003) chứng minh sử dụng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus sp và Vibrio sp

ảnh hưởng tốt tới sự phát triển và khả năng sống sót của ấu trùng tôm thẻ chân trắng

đồng thời bảo vệ chống lại Vibrio harveyi và virus gây hội chứng đốm trắng. Sự bảo vệ

này xuất phát từ sự kích thích hệ thống miễn dịch bằng việc gia tăng thực bào và hoạt

động kháng khuẩn. Ngoài ra, nhiều tác giả chứng minh sử dụng vi khuẩn lactic

Lactobacillus rhamnosus (chủng ATCC 53103) ở hàm lượng 105 cfu/g, Lactococcus

lactis, Leuconostoc mesenteroides, L. sakei kích thích miễn dịch ở cá hồi

Oncorhynchus mykiss bằng cách thúc đẩy hoạt tính thực bào, sản sinh superoxide,

lyzozyme, tăng cường hoạt tính bổ trợ (ACH50).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

2.3.3.7. Tác động kháng virus

Một số vi khuẩn được sử dụng như probiotic có tác dụng kháng virus, mặc dù

cơ chế này vẫn chưa được hiểu chính xác. Việc kiểm tra trong phòng thí nghiệm chỉ ra

có sự bất hoạt virus nhờ các hợp chất hóa học và hợp chất sinh học như là dịch chiết từ

tảo biển và dịch chiết ngoại bào từ vi khuẩn.

Kamei và ctv (1988) báo cáo cho rằng các chủng Pseudomonas sp, Vibrios sp,

Aeromonas sp và nhóm Coryneform phân lập từ các trại ấp trứng cá hồi có hoạt tính

kháng virus IHHNV (infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus).

Direkbusarakom và ctv (1998) phân lập được hai chủng Vibrio sp. là NICA

1030 và NICA 1031 có hoạt tính kháng IHHNV và Oncorhynchus masou virus (OMV)

với tỷ lệ giảm hai virus trên lần lượt từ 62% và 99%.

2.3.4. Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản

Khi đưa probiotic vào môi trường nước ao, các vi sinh vật sẽ sinh sôi và phát

triển rất nhanh trong môi trường nước. Sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi sẽ có các

tác dụng sau đây trong các ao hồ nuôi thủy sản:

 Phân hủy các chất hữu cơ trong nước, hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự

gia tăng của lớp bùn đáy.

 Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát

sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước.

 Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất

dinh dưỡng hòa tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí

thay nước.

 Nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (kích thích hệ miễn dịch không đặc

hiệu ở tôm, cá).

 Ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh

vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại). Trong

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự

phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được sự phát triển của mầm bệnh.

Ngoài ra, một số probiotic còn được sử dụng bằng cách trộn vào thức ăn để

nâng cao khả năng hấp thu của tôm cá, làm giảm hệ số thức ăn và phòng chống các

bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cho tôm cá.

Vì vậy, sử dụng probiotic sẽ có ý nghĩa nhiều mặt trong việc nâng cao hiệu quả

kinh tế cho các mô hình nuôi thủy sản như:

 Làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn (giảm hệ số thức ăn).

 Tôm cá mau lớn, rút ngắn thời gian nuôi.

 Tăng tỷ lệ sống và tăng năng suất do tôm cá nuôi ít bị hao hụt.

 Giảm chi phí thay nước.

 Giảm chi phí sử dụng kháng sinh và hóa chất trong điều trị bệnh

2.3.5. Giới thiệu về quorum sensing và khả năng bẻ gãy hệ thống quorum sensing

ở vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản

2.3.5.1. Định nghĩa quorum sensing

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau bằng cách sử dụng các phân tử tín hiệu hóa

học. Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu

này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt

giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị gen

đối với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này được gọi là quorum sensing. Nhiều

kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm độc lực, sự sản

xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học ….

Trong thế giới vi sinh vật tồn tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ

phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một loài và

giữa các loài. Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân

tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL). Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17

amino acid

Quá trình giao tiếp thông qua hệ thống tín hiệu protein I /protein R được xem

như là cơ chế chuẩn được các vi khuẩn Gram âm sử dụng để thông tin liên lạc với

nhau. Hệ thống quorum sensing kiểu này được sử dụng để kiểm soát việc biểu hiện gen

ở trên 25 loài vi khuẩn Gram âm. Trong mọi trường hợp, AHL là một loại phân tử tín

hiệu mà việc tổng hợp phụ thuộc vào protein I. Một protein khác (protein R) chịu trách

nhiệm việc nhận biết phân tử tín hiệu AHL và sau đó là quá trình hoạt hóa việc phiên

mã của một số gen đích. Phân tử tín hiệu AHL đã được chứng minh là có liên quan đến

quá trình quorum sensing ở nhiều tác nhân gây bệnh ở người và thực vật như

Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh và ctv., 2000), Erwinia carotovora,

Agrobacterium tumefaciens (Whitehead và ctv., 2001), cũng như ở Vibrio harveyi

(Manefield và ctv., 2000) và những loài vi khuẩn gây bệnh khác trong nuôi trồng thủy

sản (Bruhn và ctv., 2005).

2.3.5.2. Hệ thống quorum sensing của vi khuẩn Edwardsiella spp.

Hệ thống quorum sensing gần đây cũng được phát hiện ở nhóm vi khuẩn gây

bệnh quan trọng trên cá (Edwardsiella spp.). Han và ctv. (2010) xác định có bốn loại

phân tử tín hiệu AHL (BHL, HHL, 3-oxo-HHL và một phân tử AHL chưa xác định

được) liên quan đến độc lực của Edwardsiella tarda, tác nhân gây bệnh trên các loài cá

nước ngọt và nước mặn như lươn, cá nheo Mỹ, cá đối, cá tráp, cá rô phi, ca bơn. Gần

đây, nhóm nghiên cứu trên lại xác định bốn loại phân tử tín hiệu AHL nói trên cũng tồn

tại ở Edwardsiella ictaluri, vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá

nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) và bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

2.3.5.3. Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

Hình 2.4: Một số phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn

Có hai chiến lược chủ yếu trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn, hoặc giết

chết vi khuẩn gây bệnh, hoặc làm suy giảm độc lực của nó để sau đó mầm bệnh không

thể thích nghi với môi trường bên trong vật chủ hoặc dễ dàng bị đào thải bởi hệ miễn

dịch tự nhiên của vật chủ. Việc phát hiện ra hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn, có

chức năng gắn liền với việc sản xuất ra các hợp chất trao đổi chất thứ cấp và những yếu

tố liên quan đến độc lực, là tiền đề cho cách tiếp cận thứ hai.

Việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh đã được đề nghị như

là cách tiếp cận mới trong việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn. Một số phương pháp bẻ

gãy hệ thống quorum sensing đã được nghiên cứu, bao gồm (Hình 2.4) :

(1) Ức chế quá trình sinh tổng hợp phân tử tín hiệu quorum sensing

(2) Ứng dụng các hợp chất đối kháng quorum sensing

(3) Ức chế bằng hóa học đối với phân tử tín hiệu quorum sensing

(4) Phân hủy sinh học bằng các enzyme của vi khuẩn.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Một số báo cáo liên quan đến việc bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở các vi

khuẩn gây bệnh trong nước, cùng với những kết quả đạt được đối với vi khuẩn gây

bệnh ở người và thực vật, đã chỉ ra rằng phương pháp tiếp cận mới này có nhiều tiềm

năng trong việc kiểm soát bệnh trong nuôi trồng thủy sản

2.3.5.4. Quá trình phân hủy sinh học bằng enzyme đối với phân tử tín hiệu quorum

sensing

Khả năng phân hủy phân tử AHL phân bố rộng rãi trong giới vi khuẩn. Những

enzyme có thể phân hủy phân tử AHL đã được phát hiện ở nhiều lòai vi khuẩn thuộc

nhóm β-Proteobacteria (Zhang và ctv., 2002), α- Proteobacteria (Uroz và ctv., 2003) và

γ- Proteobacteria cũng như ở một số lòai thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (Dong và

ctv., 2002). Những loài vi khuẩn thuộc các nhóm này có khả năng khóa hệ thống

quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc. Quá

trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL-

acylase và AHL-lactonase (Hình 2.5).

Hình 2.5: Quá trình bẻ gãy phân tử AHL bằng enzyme.

Enzyme AHL-acylase có khả năng bẻ gãy mạch cacbon, phân hủy AHL thành

acid béo và homoserine lactone (Dong và ctv., 2001; Lee và ctv., 2002; Wang và ctv.,

2004), tuy nhiên không làm thay đổi nhiều đến cấu trúc của phân tử AHL. Trong khi

đó enzyme AHL-lactonase, điều khiển bởi gen aiiA, có khả năng phân hủy phân tử

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

AHL bằng cách xúc tác phản ứng mở vòng lactone. Điều này dẫn đến sự thay đổi về

cấu trúc hình thể tương đối của phân tử AHL, gây trở ngại cho việc gắn kết của phân tử

AHL với protein điều tiết việc phiên mã protein R, vì vậy một số kiểu hình (trong đó

có yếu tố độc lực ở vi khuẩn gây bệnh) không thể được biểu hiện. Gen aiiA đầu tiên

được tìm thấy ở chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus sp. 240B1 (Dong và ctv., 2000).

Các dạng tương đồng của gen aiiA sau đó được tìm thấy ở nhiều lòai Bacillus khác,

bao gồm Bacillus thuringiensis, B. cereus, B. anthracis, B. mycoides và B. subtilis

(Dong và ctv., 2002; Lee và ctv., 2002; Uroz và ctv., 2003; Wang và ctv., 2004; Dong

& Zhang, 2005; Pan và ctv., 2008). Các gen này có độ tương đồng cao (89 – 96%) so

với gen aiiA của chủng 240B1. Gần đây, Yin và ctv. (2010) đã phân lập được gen aiiA

từ ADN của Bacillus amyloliquefaciens, một lòai gần gũi với B. subtilis. Gen này có độ

tương đồng 87 – 99,3% so với các dạng tương đồng ở các lòai Bacillus khác, trong khi

trình tự acid amin của AHL-lactonase có độ tương đồng 89,6 – 99,6%.

Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng gen aiiA tái tổ hợp như

là một biện pháp kiểm soát sinh học đối với các bệnh trên cây trồng có liên quan đến

việc tiết ra phân tử tín hiệu AHL. Báo cáo đầu tiên được ghi nhận trong nghiên cứu của

Dong và ctv. (2000). Trong nghiên cứu này, gen aiiA được gắn vào plasmid của chủng

Erwinia carotovora SCG1, vi khuẩn gây bệnh thối rễ ở bắp cải Trung Quốc. Kết quả

cho thấy sự biểu hiện của enzyme AHL lactonase làm giảm mạnh tín hiệu AHL ở

Erwinia carotovora SCG1, từ đó làm giảm độc lực của chủng vi khuẩn này. Một

nghiên cứu khác năm 2004 của cùng nhóm tác giả khẳng định, B. thuringiensis chỉ bẻ

gãy phân tử tín hiệu AHL tiết ra bởi Erwinia carotovora mà không làm ảnh hưởng đến

sự tăng trưởng bình thường khi hai lòai được nuôi chung với nhau. Khi gen aiiA bị đột

biến, B. thuringiensis bị mất khả năng kiểm sóat tác nhân gây bệnh (Dong và ctv.,

2004; Zhou và ctv., 2006). Bên cạnh đó, Dong và ctv. (2001) tiến hành tái tổ hợp gen

aiiA vào trong bộ gen của cây thuốc lá và cây khoai tây. Hoạt tính của enzyme AHL-

lactonase được phát hiện trong cả hai loại cây được tái tổ hợp. Điều này giúp cho

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

chúng tăng sức đề kháng đối với bệnh thối rễ do E. carotovora. Tiếp tục phương pháp

tiếp cận của Dong và ctv., Ban và ctv. (2009) tổng hợp được gen aiiA và sau đó gắn nó

vào trong bộ gen của cây thảo dược Amorphallus konjac, điều này cũng giúp cho loài

cây này tăng sức đề kháng bệnh thối rễ do E. carotovora.

2.4. Khái quát về Bacillus

2.4.1. Đặc điểm chung của chi Bacillus

Theo Bergey/s Manual of Systematic Bacteriology, Bacillus được phân loại như

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus

Chi Bacillus bao gồm 51 loài đã được xác định chính xác và nhiều loài khác

chưa được phân loại rõ ràng. Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong đất,

không khí, nước, trên cơ thể thực vật, bụi cỏ khô và rơm rạ, hầu hết là các vi khuẩn

hình que, Gram dương, hiếu khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẽ hay dính

nhau thành chuỗi ngắn. Nội bào tử được miêu tả đầu tiên bởi Cohn khi nghiên cứu về

B. subtilis và sau đó là Koch trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B.

anthracis vào năm 1976.

Tuy nhiên, cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B.

thermoamylovorans (Combet- Blanc và ctv.,1995), B. halodenitrificans (Denariaz và

ctv.,1989), một số khác có Gram âm hay Cram dương yếu như B. thermosphaericus (

Andersson và ctv., 1995), B. horti (Yumoto ctv., 1998), B. oleronius (Kuhnigk ctv.,

1995), B. azotoformans (Pichinoty ctv., 1983). Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

trình tự RNA/ DNA, dạng vi khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm

Bacillus như B. infernus (Boone và ctv., 1995).

Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi theo chu trình sống của nó, chỉ các

tế bào trẻ mới chắc chắn Gram dương. Wiegel (1981) đã cho thấy rằng dưới kính hiển

vi, cấu trúc của vách tế bào, không hoàn toàn giống nhau như phản ứng nhuộm Gram.

Tức là, vách tế bào của một sinh vật nhuộm ra Gram âm, có thể có cấu trúc Gram

dương thật sự. Một vách tế bào có cấu trúc Gram âm sẽ luôn luôn nhuộm ra Gram âm.

Tuy nhiên, một vách tế bào có cấu trúc Gram dương, có thể nhuộm ra Gram âm hoặc

dương dưới một số điều kiện nhất định.

Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước từ 0,5 –

1,2x 2,5- 10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài. Đối với Bacillus có nội bào tử

thì bào tử hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục. Tùy theo loài, bào tử có

thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không phồng . Dưới

- trong bình kỵ khí hoặc môi trường CO2), B.

một số điều kiện đặc biệt (có HCO3

anthracis, B. subtilis, B. licheniformis và B. megaterium tạo ra một vỏ polypeptide (

poly- γ- D- glutamic acid) nhìn thấy được khi nhuộm tế bào với polychrome methylene

blue. Trừ B. anthracis và B. mycoides, hầu hết các loài Bacillus đều di động, mặc dù có

sự khác biệt rất lớn về khả năng di động trong mỗi loài. Đa số các loài có catalase

dương tính.

2.4.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng

2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy

Phần lớn các chi Bacillus phát riển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương

mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khoáng,

…, mặc dù trong một số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh

pH hoặc nồng độ muối (pH từ 2-11, và nồng độ muối từ dưới 2-25%). Trong phòng thí

nghiệm, dưới điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Trong môi trường nuôi cấy lỏng chúng tạo váng trên bề mặt. Trên môi trường

thạch tạo khuẩn lạc to, tròn hay hình dạng bất thường, có màu xám ngả vàng nhạt, bề

mặt khóm sần sùi, hơi nhăn hoặc tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch.

Hình dạng khuẩn lạc thay đổi tùy theo độ tuổi, và các đĩa nuôi cấy riêng lẻ có

thể tạo ra các dạng khuẩn lạc khác nhau. B. larvae và B. popilliae trong môi trường

nuôi cấy cần có thêm thiamine. Chúng thường phát triển trên môi trường J chứa

trypton, glucose, dịch chiết nấm men. B. pasteuri cần bổ sung 0.5-1% urea vào tất cả

môi trường nuôi cấy. B. stearothermophilus phát triển trên môi trường dinh dưỡng có

bổ sung calci và sắt.

 Môi trường tối thiểu

B. subtilis và nhiều thành viên khác trong chi phát triển được trong môi trường

muối đơn giản chứa các ion ammonium như nguồn nitrogen và glucose như nguồn

cacbon. Môi trường muối tối thiểu thường được sử dụng là Spizizen’s minimal

medium (SMM).

 Môi trường tạo bào tử

Hầu hết các loài Bacillus cần một môi trường đặc biệt để có thể tạo bào tử. Sự

tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng bị cạn

kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn cacbon, nitrogen hoặc phospho. Có thể sử dụng môi

trường nhân tạo để cảm ứng tạo bào tử như Difico sporulation agar (DSM), 2x SG

agar, CDSM medium.

2.4.2.2. Nhiệt độ phát triển

Phần lớn các chủng Bacillus ưu nhiệt trung tính, và tạo khuẩn lạc đặc trưng sau

24 giờ nuôi cấy ở 370C. Các loài ưu nhiệt như B. stearothermophilus phát triển từ 55

đến 700C, thường là khoảng 600C. Các loài này ưu nhiệt bắt buộc và không thể phát

triển ở 370C. Loài ưu nhiệt trung bình như B. coagulans phát triển tốt tại 45- 500C.

Loài gây bệnh cho côn trùng như B. larvae và B. popilliae phát triển ở nhiệt độ từ 25-

300C. Tương tự như vậy đối với B. thuringiensis và B. cereus.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

2.4.3. Hệ enzyme của vi khuẩn Bacillus

Bacillus rất đa dạng về hình thái, do đó các enzyme của chúng cũng vô cùng

phong phú. Ở các loài Bacillus khác nhau đã tìm thấy các enzyme thuộc các nhóm

cacbonhydrate (gồm amylase, cellulase, chitinase, protease, penicillinase, lipase,

thiaminase, enzyme phân giải vi khuẩn…)

Trong nhóm enzyme amylase thường gặp nhất là α – amylase. Chúng thủy phân

liên kết α – 1,4 glucosidase của tinh bột tạo thành các polysaccharite. Có 2 loại α –

amylase chính được tạo từ Bacillus là: Enzyme dịch hóa tinh bột ( liquefying enzyme)

và enzyme đường hóa ( saccharifying enzyme). Hai loại enzyme này có thể phân biệt

với nhau dựa trên sự tác động của chúng đối với tinh bột. Trước kia người ta cho rằng

α – amylase và cyclodextrin glucosytransferase của B. maceransualaf là những enzyme

duy nhất phân giải tinh bột của chi Bacillus , nhưng gần đây người ta đã tìm thấy

những enzyme khác cũng thủy phân tinh bột như β- amylase và các enzyme cắt mạch

nhánh

Phần lớn trong số 34 loài Bacillus có tên trong Bergey/s Manual of Systematic

Bacteriology đều có khả năng sinh tổng hợp protease. Trong đó những lòai quan trọng

nhất là: B. subtilis, B. polymyxa, B. megaterium, B. thermoproteolyticus thường được

chia làm 4 nhóm dựa vào cơ chế tác động của chúng: protease chứa serine, protease

chứa kim loại, protease chứa lưu huỳnh, protease acid. Các protease ngọai bào của

Bacillus thường thuộc nhóm protease kim loại và serine

2.4.4. Ứng dụng của Bacillus

Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có khả

năng sinh các loại enzyme như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextran,

glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase,

serine protease, urease, …. Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển

hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid,…Dưới điều

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid

như surfactin vừa có tình kháng khuẩn và kháng khối u.

Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được ứng dụng làm thuốc trừ

sâu vi sinh, Bacillus thuringiensis làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng

quăng. Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzyme ngoại bào và khả năng

đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus

influenzae, Candida albicans, E. coli, S. aureus, Salmonella, Shigella, Vibrio spp.,

…nên Bacillus sp. được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản

Bacillus ứng dụng trong thủy sản như: làm tăng khả năng sống, thúc đẩy sinh

trưởng (Gomez-Gil và ctv., 2000), kích thích tiêu hóa (Ziaei-Nejad và ctv., 2006), tăng

cường đáp ứng miễn dịch (Gatesoupe, 1999) và cải thiện chất lượng nước (Kennedy và

ctv., 1998; Moriarty và ctv., 1998). Các chủng B. subtilis sản xuất enzyme ngoại bào

như protease và một số enzyme khác đã đóng góp vào hoạt tính enzyme tự nhiên của

chủng chủ (Ziaei Nejad và ctv., 2006), đóng góp nguồn vi lượng và đa lượng bổ sung

thức ăn (Verschuere và ctv., 2000). Hơn nữa, B. subtilis sản sinh các hợp chất kháng

khuẩn, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống góp phần ức chế vi khuẩn gây bệnh

(Vaseeharan và ctv., 2003). B.licheniformis được chứng minh có hoạt tính kháng virut

(Arena và ctv., 2006), trong khi đó B. pumilus sản xuất enzyme ngoại bào bao gồm

amylase, cellulase, là những enzyme quan trọng trong hoạt động tiêu hóa của cá bột

(Ghosh và ctv., 2002).

Hơn nữa Bacillus có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, giúp giảm chu kì thay

nước và cải thiện môi trường, do có khả năng khử nitrate, phân hủy chất hữu cơ thải ra

từ thức ăn thừa nhờ có các enzyme ngoại bào như protease, amylase, lipase….Ngoài ra,

một số chủng Bacillus còn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng Vibrio sp, Aeromonas sp,

… giúp phòng và ức chế bệnh trong nuôi trồng thủy sản.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1. Thời gian

Từ 1/4/2011 đến 30/6/2011

3.1.2. Địa điểm nghiên cứu

Phòng Sinh học Thực Nghiệm - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

3.2. Vật liệu nghiên cứu

3.2.1. Đối tượng nghiên cứu

 Chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 được phân lập từ nước ao nuôi cá tra được nhận

từ Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.

 Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri Gly 09M) trên cá tra

nhận từ Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch

Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

 Chủng CV026, thể đột biến từ chủng vi khuẩn Chromobacterium violaceum

(McClean và ctv., 1997), được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị để phát hiện nồng độ dư

lượng AHL còn lại trong môi trường chủng này có khả năng tạo sắc tố màu tím violacein

khi có sự hiện diện của các phân tử AHL mạch ngắn (từ 4-8 cacbon) trong môi trường.

Chủng CV026 được nuôi cấy trong môi trường BHI, có bổ sung 20mg/l kanamycin.

3.2.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm, hóa chất và môi trường

3.2.2.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

 Tủ cấy vô trùng Microflow

 Tủ ấm lắc Orbital incubator SI 50

 Tủ ấm Memmert

 Tủ sấy Memmert

 Máy ly tâm

 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

 Cân điện tử 4 số lẻ AY220

 Máy đo pH để bàn Thermo Orion

 Tủ mát Sanyo

 Tủ lạnh sâu (– 80oC)

 Nồi hấp vô trùng Hirayama

 Máy cất nước Hamilton

 Máy đo giá trị OD

 Máy vortex

 Các loại đầu típ và micropipet

 Eppendorf

 Erlen các loại

 Ống nghiệm

 Đĩa petri

Một số thiết bị và dụng cụ khác như que cấy, que trang, đèn cồn, nhíp, dụng cụ

đục lỗ, bông thấm, bông không thấm…..

3.2.2.2. Hóa chất và môi trường

 Dung dịch đệm Phosphate Buffer Saline (PBS).

 Nước muối sinh lý 0.85%.

 Thuốc thử cho các phản ứng khả năng sinh enzyme ngoại bào: Lugol, TCA 25%

(tricloric acetic acid 25%)…

 CMC 1%, glycerol 40%, CaCl2,...

 Môi trường dinh dưỡng thông thường: Nutrient Agar (NA),Brain Heart Infusion

Agar (BHIA), Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Blood Agar (BA)

 Môi trường tạo bào tử Bacillus: Difco Sporulation Medium (DSM)

 Môi trường thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào: enzyme cellulase,

amylase, protease và lipase.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

3.3. Bố trí thí nghiệm

3.3.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

Đối với các chủng vi sinh vật dùng làm probiotic trong thủy sản, khả năng sinh

các enzyme ngoại bào là một tiêu chí chọn lọc quan trọng giúp hổ trợ tiêu hóa cho vật

chủ và cải thiện môi trường sống của động vật nước ngọt bằng cách phân hủy nhanh

chóng thức ăn dư thừa. Các enzyme thử nghiệm là amylase, protease, cellulase, lipase

(Ertuğrul và ctv, 2007; Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010; Trần Linh

Thước, 2010).

3.3.1.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase của Bacillus N6.1

Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào có tác dụng phân hủy

tinh bột thành các đường đơn. Phản ứng này nhận biết được khi ta nhỏ dung dịch lugol

vào trong môi trường thạch nuôi cấy, nếu trong môi trường có tinh bột thì môi trường

chuyển sang màu xanh đậm, ngược lại thì lugol sẽ không làm chuyển màu môi trường.

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC trong 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng

(NA) bổ sung 0.5% tinh bột tan

 Ủ ở 30oC trong 24 giờ

 Nhỏ lugol, đọc kết quả:

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Xuất hiện màu xanh đậm xung quanh khóm khuẩn lạc

3.3.1.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase của Bacillus N6.1

Một số sinh vật có khả năng tiết ra các enzyme lipase phân giải dầu thực vật và

một số hợp béo khác. Trong thử nghiệm lipase môi trường có chứa CaCl2 và Tween80.

Nếu vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme lipase sẽ phân giải Tween 80 tạo các acid béo

tự do, các acid béo này sẽ tủa khi có mặt Ca2+, tạo nên vùng mờ đục dưới và xung

quanh khuẩn lạc.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHI ủ ở 30oC, 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng

(NA) có bổ sung CaCl2 (100ppm) và Tween 80 (10ml/l)

 Ủ 30oC, trong 24 giờ

 Đọc kết quả.

 Dương tính: Tủa mờ đục xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Không có tủa mờ đục xung quanh khóm khuẩn lạc

3.3.1.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của Bacillus N6.1

Thử nghiệm 2 enzyme trong nhóm protease là gelatinase và caseinase.

 Đối với những sinh vật có nhóm enzyme gelatinase thì nó sẽ phân hủy được

gelatine tạo vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc.

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC trong 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng

(NA) có bổ sung 1% gelatine.

 Ủ 30oC, trong 24 giờ

 Nhỏ TCA 25% ( Trichloric Acetic Acid 25%) , xem kết quả

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Không xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc.

 Môi trường có casein sẽ có màu trắng đục, vi khuẩn tiết enzyme caseinase sẽ tạo

vùng phân giải xung quanh khuẩn lạc.

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC, trong 24 giờ.

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường Skim milk Agar (1%

skim milk)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

 Ủ 30oC, 24 giờ, đọc kết quả.

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khuẩn lạc

 Âm tính: Xung quanh khuẩn lạc có màu trắng đục

3.3.1.4. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của Bacillus N6.1

Chủng kiểm tra được nuôi trên môi trường có bổ sung CMC 1% (Carbonyl

methyl cellulose), những vi khuẩn có enzyme cellulase sẽ phân giải CMC và sau khi

nhuộm với lugol sẽ tạo được các vòng trong xung quanh khuẩn lạc.

Cách tiến hành:

 Hoạt hóa chủng Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ ở 30oC, trong 24 giờ

 Dùng que cấy vô trùng cấy chủng vi khuẩn lên môi trường thạch dinh dưỡng

(NA) có bổ sung CMC 1%

 Ủ 30oC, trong 24 giờ.

 Nhỏ lugol, đọc kết quả.

 Dương tính: Xuất hiện vòng trong xung quanh khóm khuẩn lạc

 Âm tính: Xuất hiện màu xanh đậm xung quanh khóm khuẩn lạc

3.3.2. Dựng đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD và mật độ vi khuẩn Bacillus

N6.1; E.ictaluri

Chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 và E.ictaluri (- 80oC) sau khi hoạt hoá trên môi

trường BHIA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng nuôi trong erlen chứa 50ml môi trường

BHIB ủ ở 30oC, lắc 120 vòng /phút trong 24 giờ

Đo giá trị OD ở bước sóng 600nm của canh khuẩn được tăng sinh trong môi

trường BHIB sau 24 giờ ở các nồng độ pha loãng tăng dần 20, 2-1, 2-2, 2-3…

Tại mẫu pha loãng có giá trị OD600nm gần bằng 0, tiến hành pha loãng và trải đĩa

ở 3 nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, mỗi nồng độ trải 3 đĩa. Ủ ở 30oC sau 24 giờ tiến hành đếm

khuẩn lạc.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Đếm số khuẩn lạc ở mỗi đĩa (Chọn đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-

300 khuẩn lạc).Tính số khuẩn lạc trung bình, từ đó suy ra mật độ vi khuẩn (cfu/ml) ở

các nồng độ khác nhau => dựng đường chuẩn

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối

kháng với E. ictaluri của Bacillus N6.1

Mục đích: Xác định khoảng chịu pH, nhiệt độ, NaCl của chủng vi khuẩn

Bacillus N6.1 trong môi trường nuôi trồng thủy sản

Chủng Bacillus N6.1 (-80oC) sau khi hoạt hoá trên môi trường BHIA, chọn một

khuẩn lạc đặc trưng tăng sinh trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BHIB ủ ở

30oC, lắc 120 vòng /phút. Sau 24 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn

xác định mật độ, điều chỉnh về 2x106 (cfu/ml). Sau đó nuôi trên ống nghiệm chứa 10ml

môi trường BHIB ở các điều kiện pH (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), nhiệt độ (25oC, 30oC, 35oC,

40oC), nồng độ muối (0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%) ở 30oC, lắc 120 vòng/phút.

Sau 24 giờ tiến hành đo OD600nm ở tất cả các điều kiện trên. Đồng thời sử dụng phương

pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) để đánh giá khả năng đối kháng của

Bacillus N6.1 bằng cách vi khuẩn gây bệnh E. ictaluri (-80oC) sau khi hoạt hoá trên

môi trường BA, chọn một khuẩn lạc đặc trưng tăng sinh trong ống nghiệm chứa 10 ml

môi trường BHIB ủ ở 30oC, lắc 120 vòng/phút. Sau 24 giờ, đo OD600nm, dựa vào

phương trình đường chuẩn xác định mật độ, điều chỉnh về 2x108 (cfu/ml). Trải 50µl

canh khuẩn gây bệnh lên môi trường thạch BHI, để khô trong 15 phút. Sau đó khoan 3

giếng (đường kính 8mm) trên mỗi đĩa. Hút 50µl canh khuẩn Bacillus N6.1 nhỏ vào

giếng trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, ủ ở nhiệt độ 300C và đo

kích thước vòng kháng khuẩn sau 24 giờ.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Bacillus N6.1(-80oC)

E. ictaluri (-80oC) Hoạt hoá vi khuẩn bằng cách cấy ria lên BHIA

Ủ 30oC, 24 giờ

Hoạt hóa vi khuẩn bằng cách cấy ria lên BA Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên 10ml BHIB

Ủ 30oC, 24 giờ Ủ 30oC, 48 giờ

Đo OD600nm, xác định mật độ điều chỉnh về 2x106 cfu/ml Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên 10 ml BHIB

Ủ 30oC, 24 giờ

Đo OD 600, điều chỉnh về 2x108 cfu/ml Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 0C( 25,30,35,40) Khảo sát ảnh hưởng của pH ( 4,5,6,7,8,9,10) Khảo sát ảnh hưởng của muối % (0.5,1,2,3,4,5,6) 4,5,6,7,8,9,10)

Hút 50 µl trải trên BHIA, để khô 15 phút và đục lỗ 8 mm (3 lỗ/đĩa)

(Hút 50 µl nhỏ vào giếng) Ly tâm 10000 vòng, 10 phút (2 lần rửa dịch)

Ủ 30oC, 24 giờ Đo đường kính vòng kháng khuẩn Đo OD600nm, tính mật độ vi khuẩn

Hình 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối

kháng với E. ictaluri của Bacillus N6.1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

3.3.4. Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật

Khi vi khuẩn tạo thành bào tử, chúng sẽ có khả năng chịu đựng và tồn tại trong

một thời gian dài ở các điều kiện khắc nghiệt và bất lợi. Do đó khả năng sống sót của

chúng ở các điều kiện pH thấp hoặc muối mật sẽ cao hơn so với vi khuẩn ở dạng tế bào

sinh dưỡng.Vì vậy các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường DSM trước khi khảo

sát

3.3.4.1. Khả năng chịu acid dạ dày

Mục đích: Khảo sát khả năng chịu đựng acid trong cơ thể vật chủ khi vi khuẩn

đi qua dạ dày

Vi khuẩn Bacillus N6.1 (-80oC) được cấy ria trên môi trường thạch BHI, ủ 30oC

trong 24 giờ, chọn một khuẩn lạc tăng sinh trên 50 ml môi trường DSM ủ 30oC, lắc

120 vòng/phút. Sau 48 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định

mật độ, điều chỉnh về 2x107 (cfu/ml). Chuyển dịch vi khuẩn vào 10ml BHIB có pH 2,

3 và 4, ủ ở nhiệt độ 30oC, lắc 120 vòng/phút. Thu mẫu dịch khuẩn vào các thời điểm 0,

1, 2, 3, 6, 24 giờ, ly tâm 10000 vòng trong 10 phút (2 lần rửa dịch) thu sinh khối và pha

loãng theo hệ số thập phân trong dung dịch NaCl (0,85%). Trải 50µl dịch khuẩn trên

môi trường thạch BHI, ủ 30oC, 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa ở các độ pha

loãng. Tính toán phần trăm vi khuẩn còn sống (Mourad and Nour-Eddine, 2006;

Verdenelli et al., 2009). (Jacobsen et al., 1999)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Bacillus N6.1 (-80oC)

Cấy ria trên môi trường thạch BHI (ủ 24 giờ, 30oC)

Tăng sinh trên DSM (50ml) ủ 30oC, 120 vòng/phút, 48 giờ

Xác định mật độ (Đo OD600nm) Điều chỉnh về 2x107 (cfu/ml) nuôi trong 10 ml môi trường BHIB có pH 2,3 và 4 (sử dụng HCl 0,5M)

Thu mẫu dịch khuẩn vào thời điểm 0, 1, 2, 3, 6, 24 giờ

Ly tâm 10000 vòng, 10 phút, rửa dịch (2 lần)

Pha loãng theo hệ số thập phân, trải trên môi trường thạch BHI, ủ 24-48 giờ, đếm khuẩn lạc, tính tỉ lệ % sóng sót

Hình 3.2: Khả năng chịu acid dạ dày

3.3.4.2. Khả năng chịu muối mật

Bacillus N6.1 (-80oC) được cấy ria trên môi trường thạch BHI, ủ 30oC trong 24

giờ, chọn một khuẩn lạc tăng sinh trên 50 ml môi trường DSM ủ 30oC, lắc 120

vòng/phút. Sau 48 giờ, đo OD600nm, dựa vào phương trình đường chuẩn xác định mật

độ, điều chỉnh về 2x107 (cfu/ml). Chuyển dịch vi khuẩn vào 10ml BHIB có hàm lượng

muối mật 0,3%; 0,5%; 1% và 2% (Bile salt, India), ủ ở nhiệt độ 30oC, lắc 120

vòng/phút. Thu mẫu dịch khuẩn vào các thời điểm 0, 1, 2, 3, 6, 24 giờ, ly tâm 10000

vòng trong 10 phút (2 lần rửa dịch) thu sinh khối và pha loãng theo hệ số thập phân

trong dung dịch NaCl (0,85%). Trải 50µl dịch khuẩn trên môi trường thạch BHI, ủ 24-

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

48 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa ở các độ pha loãng.Tính toán phần trăm vi

khuẩn còn sống (Verdenelli et al., 2009).

Bacillus N6.1 (-80oC)

Cấy ria trên môi trường thạch BHI (ủ 24 giờ, 30oC)

Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên DSM ( 50ml) ủ 30oC, 120 vòng/phút, 48 giờ

Xác định mật độ (Đo OD600nm).Điều chỉnh về 2x107 (cfu/ml) nuôi trong 10 ml môi trường BHIB có muối mật 0,3%; 0,5%; 1%; 2%

Thu mẫu dịch khuẩn vào thời điểm 0, 1, 2, 3, 6, 24 giờ

Ly tâm 10000 vòng, 10 phút, rửa dịch (2 lần)

Pha loãng theo hệ số thập phân, trải trên môi trường thạch BHI, ủ 24-48 giờ, đếm khuẩn lạc, tính tỉ lệ % sóng sót

Hình 3.3: Khả năng chịu muối mật

3.3.5. Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone

3.3.5.1. Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ HHL và đường kính vòng

tròn sắc tố violacein

 Giống vi khuẩn Chromobacterium violaceum (CV026) lưu giữ ở (-80oC) được

cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường BHIA. Sau đó ủ ở 30oC trong 24 giờ để tạo

giống cấp 1.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

 Từ giống cấp 1, chọn một khuẩn lạc cấy chuyền sang erlen chứa 10ml môi

trường BHI có bổ sung kanamycin với nồng độ 20 ppm. Sau đó ủ trong tủ ấm lắc ở

30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp 2.

 Tiến hành pha loãng dung dịch C6-HHL (N-hexanoyl homoserine lactone) từ

nồng độ 2500 mg/l thành các nồng độ 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 ppm trong môi trường

BHI.

 Sử dụng 1 đĩa petri chứa BHIA. Nhỏ 50µl canh khuẩn CV026 (tương ứng với

nồng độ 109 cfu/ml) lên mỗi đĩa. Dùng que cấy tam giác trải đều dịch khuẩn trên đĩa và

để khô.

 Dung dịch C6-HHL ở các nồng độ khác nhau, sử dụng 3 x 10µl dung dịch C6-

HHL nhỏ vào 3 vị trí trên đĩa BHIA đã trang sẵn dịch khuẩn CV026. Để trong box cấy

vô trùng cho đến khi khô, sau đó dán parafilm và ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 30oC.

 Sau khi ủ trong 24 giờ, trên đĩa xuất hiện 3 vòng tròn sắc tố violacein tương ứng

tại 3 vị trí đã nhỏ dung dịch HHL (Hình 3.4). Tiến hành đo đường kính của các vòng

tròn này, và xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa ln [HHL] và đường kính

đường tròn sắc tố violacein (mm)

Hình 3.4: Các vòng tròn sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện

của phân tử AHL.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

3.3.5.2. Khả năng phân hủy phân tử HHL của Bacillus N6.1

Chuẩn bị vi khuẩn chỉ thị cho HHL: Chromobacterium violaceum (CV026)

đuợc hoạt hóa trong môi trường BHI có chứa kanamycin với nồng độ 20 ppm

Chuẩn bị vi khuẩn:

 Vi khuẩn phân lập được bảo quản ở – 80oC, được cấy chuyền sang đĩa BHIA và

ủ ở 30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp 1.

 Chọn một khuẩn lạc trên đĩa BHIA, cấy chuyền sang các Erlen chứa 20ml dung

dịch BHI, ủ trong 24 giờ để tạo giống cấp 2.

 Từ các giống cấp 2 này, tiến hành pha loãng và đo mật độ quang ở bước sóng

600nm

 Từ mật độ vi khuẩn xác định được, tính toán thể tích cần thiết cấy vào các Erlen

chứa 20ml dung dịch BHI để đạt mật độ 2x107 cfu/ml.

 Bổ sung vào mỗi erlen 5ppm dung dịch HHL. Sử dụng một erlen đối chứng, chỉ

chứa HHL mà không bổ sung vi khuẩn. Tất cả erlen được đặt trong tủ ấm lắc ở tốc độ

120 vòng/phút trong 24 giờ.

 Sau đó lấy 3 x (10µl) dịch nổi nhỏ lên bề mặt đĩa BHIA đã tráng sẵn 50µl dịch

vi khuẩn CV026 đã chuẩn bị trước đó. Sau đó ủ ở 30oC trong 12 giờ

 Sau thời gian ủ, đo đường kính các vòng tròn violacein và dựa vào đường chuẩn

đã thiết lập để tính toán nồng độ HHL còn lại trong môi trường.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Bacillus N6.1(-80oC)

Cấy ria trên môi trường BHIA (ủ 24-48h, 30oC)

Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trong 10ml môi trường BHI (ủ 24h, 30oC, 120 vòng/phút)

Nuôi vi khuẩn trên (2x107 cfu/ml) trong môi trường BHI + 5ppm HHL/L CV026 (-80oC) cấy ria trên môi trường BHIA

Ủ 24h, 30oC, 120 v/p

Đối chứng BHI + 5ppm HHL/L Lô thí nghiệm Ủ ở 30oC, 120 v/p Chọn 1 khuẩn lạc tăng sinh trên môi trường BHI + kanamycin 20ppm

Ủ 24h, 30oC, 120 v/p

Thu 10µl dịch trên (sau 0, 6, 12, 18, 24 giờ) nhỏ vào đĩa đã trải CV026 Trải 50µl dịch CV026 trên môi trường BHIA (1x109 tb/ml), để khô 15 phút

Ủ ở 30oC, 24h Đo kích thước đường kính violacein (sắc tố màu tím)

Hình 3.5: Khảo sát khả năng phân hủy phân tử tín hiệu HHL

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

3.3.6. Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E.

ictaluri bằng phương pháp nuôi chung

 Hoạt hóa chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 trên môi trường BHIA ủ 300C, 24 giờ

 Chọn một khuẩn lạc tăng sinh trên môi trường BHIB ủ 300C, 120 vòng/phút, 24

giờ

 Sau 24 giờ. Đo OD600nm điều chỉnh về 2x107cfu/ml tiến hành 2 thí nghiệm nuôi

chung với E.ictaluri (2x106 cfu/ml) và nuôi riêng ủ 300C, 120 vòng/phút, 24 giờ

 Tiến hành lọc qua màng lọc 0.2 µm và không lọc ở 2 điều kiện trên. Hút 50µl

nhỏ vào giếng đã tráng E.ictaluri trên BHIA

 Ủ 300C, 24 giờ. Đo đường kính vòng kháng khuẩn.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Phương pháp pha loãng

 Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy.

 Cho các dụng cụ vào bên trong tủ cấy.

 Rửa tay bằng cồn.

 Lắc đều mẫu cần pha loãng bằng máy vortex

 Mở nút ống nghiệm hoặc nút bông của erlen, hơ nhanh miệng trên ngọn đèn

cồn.

 Dùng micropipet hút 100 l

 Mở nút eppendorf chứa 900µl nước muối sinh lý, cho 100 l mẫu vào. Ta sẽ

được mẫu pha loãng 10-1

 Từ ống pha loãng 10-1, tiếp tục hút 100µl cho vào ống chứa 900µl nước muối

sinh lý ta sẽ được độ pha loãng 10-2.Tương tự như vậy để pha loãng 10-4, 10-5...

3.4.2. Phương pháp tráng đĩa

 Lấy eppendorf đã pha loãng ở nồng độ cần tiến hành tráng đĩa.

 Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

 Cho các dụng cụ trên vào tủ cấy

 Rửa tay bằng cồn.

 Lắc kỹ ống eppendorf bằng máy vortex trong 1 phút.

 Mở nút ống eppendorf chứa mẫu, hơ nhanh miệng trên ngọn đèn cồn.

 Dùng micropipet hút 50 l dung dịch mẫu.

 Tay trái hé mở nắp đĩa thạch, tay phải cầm micropipet cho vào 50  mẫu.

 Dùng que gạt nhúng vào cồn, hơ trên ngọn đèn cồn, làm nguội trong không khí

15 giây, tiếp tục làm nguội que gạt trên phần thạch không có dung dịch vi khuẩn, khi

que cấy đã nguội thì gạt giọt dịch trải đều khắp mặt thạch: tay trái hé mở nắp hộp, ngón

út trái xoay nhẹ cho đĩa chuyển động tròn, tay phải liên tục gạt cho tới khi mặt thạch

khô ráo.

 Thay đầu tip và tiếp tục với các ống còn lại

Chú ý: Để các tế bào vi sinh vật tách rời nhau và phân bố đều trên mặt thạch,

sau khi nhỏ dịch pha loãng cần tiến hành gạt ngay. Nếu để lâu giọt dịch sẽ bị khô, các

tế bào gắn chặt vào mặt thạch, việc gạt dàn đều chúng sẽ rất khó khăn, dẫn đến kết quả

sai lệch.

 Các đĩa thạch đã được tráng sẽ được dán parafilm và cho vào tủ ấm ở 30oC

trong vòng 24-48 giờ.

3.4.3. Phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method)

3.4.3.1. Chuẩn bị vi khuẩn khảo sát

 Các chủng vi khuẩn phân lập (– 80oC) được cấy ria trên môi trường BHIA và ủ

ở 30oC trong 48 giờ để tạo giống cấp 1.

 Chọn một khuẩn lạc trên đĩa BHIA (đối với mỗi chủng), cấy chuyền sang ống

nghiệm 5ml dung dịch BHI, ủ trong 24 giờ để tạo giống cấp 2.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

 Từ các giống cấp 2 này, tiến hành pha loãng 10 lần và đo mật độ quang ở bước

sóng 600nm sao cho OD nằm trong khoảng 0,1-1. Điều chỉnh về mật độ vi khuẩn là

2×106 cfu/ml, tăng sinh trong môi trường BHIB, ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 30oC.

3.4.3.2. Chuẩn bị vi khuẩn gây bệnh

 Tương tự với vi khuẩn gây bệnh (– 80oC) được cấy ria trên đĩa thạch máu

(Blood agar + máu cừu), ủ ở 28oC, 48 giờ. Chọn 1 khuẩn lạc cấy trong 10 ml BHI, ủ

trong 18-24 giờ. Đo độ hấp thu ở bước sóng 600nm, điều chỉnh về mật độ vi khuẩn

2×108 cfu/ml.

 Dùng 50 µl dịch vi khuẩn gây bệnh trên tráng lên môi trường BHIA và đợi khô

trong 15 phút. Sau đó dùng ống sắt hình trụ (có đường kính 8mm) khoan 3 lỗ trên đĩa

thạch. Các khối thạch sau khi đục được lấy ra và bỏ.

 Dùng 50µl dịch vi khuẩn cần khảo sát sau khi đã ủ 24 giờ, nhỏ vào mỗi lỗ trên

đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn gây bệnh, sau đó dán parafilm

 Ủ trong tủ ấm nhiệt độ 28-32oC trong 24 giờ. Tiếp theo đo vòng kháng khuẩn

(mm). Nếu chủng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn có đường kính ≥17 mm được cho là

đối kháng mạnh.

3.4.4. Phương pháp định lượng vi sinh vật

3.4.4.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp này cho phép xác định số tế bào sống

 Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu

 Chuẫn bị các chuỗi pha loãng

 Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu

 Đếm số khuẩn lạc hình thành. Đếm tất cả các khuẩn lạc đơn lẽ mọc trên môi

trường

 Tùy chọn những đĩa có số khuẩn lạc từ 15-300

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

 Tính toán (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn

lạc vi sinh vật trong dung dịch ban đầu)

3.4.4.2. Phương pháp đo độ đục

Giống vi khuẩn cần đo, tiến hành pha loãng 10 lần và đo mật độ quang ở bước

sóng 600nm sao cho OD nằm trong khoảng 0,1-1. Dựa vào phương trình đường chuẩn

tính ra mật độ vi khuẩn trong dung dịch ban đầu.

3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 13.0 (SPSS Inc., 1989-2004).

Multiple comparation (Tukey’s) test được sử dụng để kiểm tra sự khác biệt có ý nghĩa

giữa các nghiệm thức. Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p < 0,05.

Các đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2007.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

Đối với các chủng vi sinh dùng làm probiotic trong thủy sản, khả năng sinh các

enzyme ngoại bào là một trong những tiêu chí chọn lọc quan trọng giúp hỗ trợ tiêu hóa

cho vật chủ và cải thiện môi trường sống của động vật nước ngọt bằng cách phân hủy

nhanh chóng thức ăn dư thừa. Kết quả thí nghiệm này nhằm xác định khả năng sinh các

enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus N6.1.

N6.1

4.1.1. Khả năng sinh enzyme amylase của Bacillus N6.1.

Hình 4.1: Khả năng sinh enzyme amylase

Dựa vào hình 4.1, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có

khả năng phân hủy tinh bột, điều này chứng tỏ chúng có khả năng tiết ra enzyme

amylase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động

vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu tinh

bột, giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

N6.1

4.1.2. Khả năng sinh enzyme lipase của Bacillus N6.1.

Hình 4.2: Khả năng sinh enzyme lipase

Dựa vào hình 4.2, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 không

có khả năng phân hủy dầu thực vật và một số hợp chất béo khác, điều này chứng tỏ

rằng chúng không có khả năng tiết ra enzyme lipase. Do đó, khi cung cấp chủng vi

khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động vật thủy sản thì cần lưu ý đến hàm lượng

lipid có trong thức ăn.

N6.1

4.1.3. Khả năng sinh enzyme protease của Bacillus N6.1.

Hình 4.3: Khả năng sinh enzyme gelatinase

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Dựa vào hình 4.3, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có

khả năng phân hủy gelatine, điều này chứng tỏ rằng chúng có khả năng tiết ra enzyme

gelatinase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động

vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu

N6.1

gelatine, giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn

Hình 4.4: Khả năng sinh enzyme caseinase

Dựa vào hình 4.4, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có

khả năng phân hủy casein, điều này chứng tỏ rằng chúng có khả năng tiết ra enzyme

caseinase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động

vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu casein,

giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn

Kết quả ở hình 4.3 và 4.4 chứng tỏ chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng

phân hủy các loại thức ăn giàu protein

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

4.1.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của Bacillus N6.1.

Hình 4.5: Khả năng sinh enzyme cellulase

Dựa vào hình 4.5, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có

khả năng phân hủy cellulose, điều này chứng tỏ rằng chúng có khả năng tiết ra enzyme

cellulase. Do đó, khi cung cấp chủng vi khuẩn này dưới dạng probiotic cho các động

vật thủy sản thì giúp cho tôm, cá có thể dễ dàng phân hủy các loại thức ăn giàu

cellulose, giúp cho các quá trình tiêu hóa thức ăn dễ dàng hơn

Kết quả sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn Bacillus N6.1. được tóm tắt

ở Bảng 4.1.

Bảng 4.1: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Bacillus N6.1

Kết quả Enzyme

+ Amylase

- Lipase

+ Gelatinase

+ Caseinase

+ Cellulase

(+): Kết quả dương tính

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

(-): Kết quả âm tính

Trong số 5 loại enzyme ngoại bào khảo sát thì Bacillus N6.1 có khả năng sản

xuất ra 4 loại enzyme. Qua bảng 4.1 cho thấy chủng Bacillus N6.1 có khả năng phân

hủy tinh bột nhờ tiết ra enzyme amylase, phân hủy gelatin, casein nhờ tiết ra enzyme

gelatinase và caseinase. Ngoài ra Bacillus N6.1 còn thể hiện hoạt tính phân giải

cellulose nhờ tiết enzyme cellulase, hoạt tính này càng tăng lên đáng kể khi môi trường

nuôi có bổ sung thêm CMC. Tuy nhiên qua quá trình khảo sát chủng này cho kết quả

âm tính trên môi trường thử nghiệm lipase hay chúng không sinh enzyme lipase vì vậy

chủng này không có khả năng phân giải dầu thực vật và các hợp chất béo khác.

Trong một số nghiên cứu trước đây đa số các chủng Bacillus spp. có khả năng

sinh enzyme ngoại bào. Theo khảo sát của Nguyễn Đức Quỳnh Như và ctv (2009), từ

32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi thử nghiệm khả

năng sinh enzyme protease, amylase, lipase trên môi trường TSB, kết quả cũng chọn

được 14 chủng có khả năng sinh tất cả các enzyme trên.

Kết quả này chứng tỏ Bacillus N6.1 là chủng vi khuẩn có tính ưu việt và có khả

năng ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp nói chung, nuôi trồng thủy sản nói riêng.

Việc cung cấp các chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào là điều hết sức

cần thiết, giúp cho quá trình tiêu hóa thức ăn của vật nuôi tốt hơn, tăng cường hiệu quả

tiêu thụ thức ăn. Tuy nhiên, khi sử dụng chủng này, cần lưu ý là hạn chế sử dụng các

loại thức ăn giàu lipid vì chủng này không có khả năng tiết ra enzyme lipase để phân

giải lipid.

4.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD600nm và mật độ vi

khuẩn Bacillus N6.1; E. ictaluri

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Xây dựng đường chuẩn nhằm xác định mật độ vi khuẩn trong dịch nuôi ở các

khảo sát của đề tài. Kết quả đường chuẩn của Bacillus N6.1, E.ictaluri được biểu diễn

ở biểu đồ hình 4.6 và 4.7

Hình 4.6: Đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD600nm và mật độ vi khuẩn Bacillus

N6.1.

Dựa vào hình 4.6, ta có phương trình đường chuẩn Bacillus N6.1 là:

y = 145606246,07x – 3420567,95

Trong đó: x: là giá trị OD600nm

y: là mật độ vi khuẩn Bacillus N6.1 (cfu/ml) .

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Hình 4.7: Đường chuẩn tương quan giữa giá trị OD600nm và mật độ vi khuẩn E.ictaluri.

Dựa vào hình 4.7, ta có phương trình đường chuẩn E.ictaluri là:

y = 752784796,45x – 5927396,13

Trong đó: x: là giá trị OD600nm

y: là mật độ vi khuẩn E.ictaluri (cfu/ml)

4.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, NaCl lên tăng trưởng và khả năng đối

kháng với E.ictaluri của Bacillus N6.1

4.3.1. Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri

Giá trị pH ảnh hưởng khá lớn đến sự tăng trưởng và khả năng đối kháng của vi

sinh vật có lợi đối với các vi sinh vật gây hại và gây bệnh. Do đó việc xác định được

giá trị pH tối ưu đóng vai trò cần thiết.

Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300C, 120 vòng/phút. Tại các nồng độ pH khác nhau, đem

đo OD600nm và ghi nhận kết quả. Đồng thời với việc đo OD600nm, tiến hành thu dịch vi

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

khuẩn và khảo sát khả năng đối kháng với E.ictaluri. Kết quả được trình bày trong hình

4.8

Hình 4.8: Ảnh hưởng của pH lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri của

Bacillus N6.1.

Các nghiệm thức với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê (P < 0,05)

Dựa vào hình 4.8, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có

khả năng chịu tất cả các giá trị pH khảo sát. Tuy nhiên, pH thích hợp cho vi khuẩn

Bacillus N6.1 phát triển từ pH 5 đến pH 8 và chúng phát triển mạnh nhất ở pH 8. Ở pH

8, Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất và mật độ vi khuẩn cao một cách khác biệt có ý

nghĩa so với các giá trị pH còn lại (P < 0,05). Trong khi đó tại pH 4, 9, 10 mật độ vi

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

khuẩn thấp nhất, chứng tỏ các giá trị pH này không thích hợp cho sự phát triển của

chủng vi khuẩn Bacillus N6.1.

Đồng thời dựa vào hình 4.8, chúng tôi nhận thấy rằng các điều kiện pH không

chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến khả năng đối

kháng với các vi khuẩn gây bệnh. Tại pH 8, Bacillus N6.1 đạt mật độ cao nhất

(OD600nm = 0.915±0.054) cũng tương ứng với đường kính vòng kháng khuẩn là cao

nhất (25.83±0.44) và có sự khác biệt ý nghĩa so với các giá trị pH còn lại (P < 0,05). Ở

các pH 5, 6, 7 khả năng đối kháng cũng mạnh nhưng thấp hơn pH 8 , đường kính vòng

kháng khuẩn khoảng từ 20-24 mm. Tại pH 4, 9, 10 mật độ vi khuẩn thấp nhất đồng

thời khả năng đối kháng với E.ictaluri cũng yếu nhất.

Kết quả này chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 tăng trưởng tốt và có khả năng đối

kháng mạnh khi nuôi ở điều kiện pH trung tính và phát triển mạnh nhất ở điều kiện pH

hơi kiềm, không thích hợp với điều kiện quá kiềm hoặc quá acid. Mật độ vi khuẩn có

ảnh hưởng đến khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh, mật độ vi khuẩn càng cao

thì khả năng đối kháng càng mạnh. So với một số thử nghiệm định tính, các chủng

Bacillus spp. từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi

thử nghiệm đều phát triển được ở pH từ 5 - 10, một số phát triển ở pH từ 5 - 9 (Nguyễn

Đức Quỳnh Như và ctv, 2009). Vì vậy, khi chủng Bacillus N6.1 được ứng dụng làm vi

sinh vật probiotic thì nên nuôi ở pH từ 7-8 để đạt hiệu quả cao nhất.

4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng và khả năng đối kháng E.ictaluri

Nhiệt độ ảnh hưởng khá lớn đến sự tăng trưởng và khả năng đối kháng của vi

sinh vật có lợi đối với các vi sinh vật gây hại và gây bệnh. Do đó việc xác định được

giá trị nhiệt độ tối ưu đóng vai trò cần thiết.

Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300C, 120 vòng/phút. Tại các nhiệt độ khác nhau, đem đo

OD600nm và ghi nhận kết quả. Đồng thời với việc đo OD600nm, tiến hành thu dịch vi

khuẩn và khảo sát khả năng đối kháng với E.ictaluri. Kết quả được trình bày trong hình

4.9.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Hình 4.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng và khả năng đối kháng

E.ictaluri của Bacillus N6.1.

Các nghiệm thức với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê (P < 0,05)

Dựa vào hình 4.9, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có

khả năng chịu được tất cả các nhiệt độ khảo sát. Tuy nhiên, ở 30oC và 35oC Bacillus

N6.1 phát triển mạnh nhất và cho mật độ cao nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so với các

giá trị nhiệt độ còn lại (P < 0,05) . Trong khi đó tại 25oC và 40oC mật độ vi khuẩn thấp,

chứng tỏ các giá trị nhiệt độ này không thích hợp cho sự phát triển của chủng vi khuẩn

Bacillus N6.1.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Đồng thời dựa vào hình 4.9, chúng tôi nhận thấy rằng các điều kiện nhiệt độ

không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn mà còn ảnh hưởng đến khả năng

đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh. Tại 250C, 300C và 350C, khả năng đối kháng của

Bacillus N6.1 với E.ictaluri là mạnh nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so với các giá trị

nhiệt độ còn lại (P < 0,05). Ở nhiệt độ 40oC mật độ vi khuẩn thấp, khả năng đối kháng

với E.ictaluri yếu

Kết quả này chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 tăng trưởng tốt và có khả năng đối

kháng mạnh khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ từ 30-35oC. Mật độ vi khuẩn có ảnh hưởng

đến khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh, mật độ vi khuẩn càng cao thì khả

năng đối kháng càng mạnh. So với một số thử nghiệm định tính, các chủng Bacillus

spp. từ 32 chủng qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi thử nghiệm

đều phát triển được ở nhiệt độ 20-40oC (Nguyễn Đức Quỳnh Như và ctv, 2009). Vì

vậy, khi chủng Bacillus N6.1 được ứng dụng làm vi sinh vật probiotic thì nên nuôi ở

nhiệt độ từ 30-35oC để đạt hiệu quả cao nhất.

4.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tăng trưởng và khả năng đối kháng

E.ictaluri

Nồng độ muối ảnh hưởng khá lớn đến sự tăng trưởng và khả năng đối kháng của

vi sinh vật có lợi đối với các vi sinh vật gây hại và gây bệnh. Do đó việc xác định được

nồng độ muối thích hợp đóng vai trò cần thiết.

Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300C, 120 vòng/phút. Tại các nồng độ muối khác nhau,

đem đo OD600nm và ghi nhận kết quả. Đồng thời với việc đo OD600nm, tiến hành thu dịch

vi khuẩn và khảo sát khả năng đối kháng với E.ictaluri. Kết quả được trình bày trong

hình 4.10.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Hình 4.10: Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tăng trưởng và khả năng đối kháng

E.ictaluri của Bacillus N6.1.

Các nghiệm thức với các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê (P < 0,05)

Dựa vào hình 4.10, chúng tôi nhận thấy rằng chủng vi khuẩn Bacillus N6.1 có

khả năng chịu được tất cả các nồng độ muối khảo sát. Tuy nhiên, ở nồng độ muối 4%

Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất, cho mật độ cao nhất và có sự khác biệt ý nghĩa so

với các nồng độ muối còn lại (P < 0,05). Tại nồng độ muối 3%, chủng này cũng phát

triển mạnh nhưng mật độ thấp hơn so với nồng độ muối 4%. Ở nồng độ muối 1, 2, 5%

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

chủng này cũng phát triển nhưng mật độ không cao. Trong khi đó tại nồng độ muối

0,5% và 6% mật độ vi khuẩn thấp.

Đồng thời dựa vào hình 4.10, chúng tôi nhận thấy rằng tại nồng độ muối 3, 4,

5%, Bacillus N6.1 khả năng đối kháng của Bacillus N6.1 với E.ictaluri là mạnh nhất và

có sự khác biệt ý nghĩa so với các nồng độ muối còn lại (P < 0,05). Ở các nồng độ

muối 0.5, 1, 2, 6% khả năng đối kháng với E.ictaluri yếu

Kết quả này chứng tỏ chủng Bacillus N6.1 phát triển mạnh nhất khi nồng độ

muối trong môi trường từ 3 - 4%. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn không tương đồng với

khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh, khả năng đối kháng ở nồng độ muối 3% cao

nhất. Điều này có thể là do ở nồng độ 3%, Bacillus N6.1 thích nghi và có khả năng tiết

ra một số hợp chất ức chế mạnh sự phát triển của E.ictaluri so với các nồng độ muối

còn lại. Một số thử nghiệm định tính trước đây, các chủng Bacillus spp. từ 32 chủng

qua sàng lọc từ mẫu đất và nước tại Cần Giờ được đem đi thử nghiệm có 4 chủng chịu

được 8% muối, 3 chủng chịu được 10% muối (Nguyễn Đức Quỳnh Như và ctv, 2009).

Vì vậy, khi chủng Bacillus N6.1 được ứng dụng làm vi sinh vật probiotic thì nên nuôi

nồng độ muối 3- 4% để đạt hiệu quả cao nhất.

4.4. Khảo sát khả năng chịu pH thấp và muối mật

Việc thử nghiệm khả năng chịu được pH thấp và muối mật đóng vai trò khá

quan trọng trong quá trình chọn lọc vi khuẩn probiotic. Vì các chủng này chủ yếu cung

cấp cho cơ thể vật chủ qua đường tiêu hóa, nếu chúng không chịu được pH thấp và

muối mật của dạ dày thì khả năng sống sót của chúng rất thấp. Khi đó sẽ không có hiệu

quả trong việc phòng bệnh cũng như hổ trợ tiêu hóa.

4.4.1. Khả năng chịu đựng acid dạ dày

pH thấp là một trong những tiêu chí lựa chọn chính cho chủng probiotic

(Quwehand và ctv. 1999, Çakır 2003). Vì để vào được ruột non thì vi sinh vật phải đi

qua các điều kiện pH thấp của dạ dày (Chou và Weimer,1999,Çakır 2003).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Hình 4.11: Khả năng chịu pH thấp của Bacillus N6.1

Dựa vào hình 4.11, chúng tôi nhận thấy rằng ở pH 2, ban đầu vi khuẩn Bacillus

N6.1 có mật độ trung bình là 2x107 cfu/ml tương ứng với tỉ lệ sống là 100%, nhưng sau

1 giờ tiếp xúc với với điều kiện pH thấp thì tỉ lệ sống giảm xuống 97.9%. Nhưng tỉ lệ

sống lại tăng lên sau 2 giờ tiếp xúc và >100% sau 24 giờ. Ở pH 3, 4 cũng tương tự như

vậy sau 1 giờ tiếp xúc với với điều kiện pH thấp thì tỉ lệ sống giảm xuống 97.9%,

99.7%, sau 2 giờ lại tỉ lệ sống lại tăng lên. Nguyên nhân có thể là do chủng này được

tăng sinh trong môi trường DSM đã tạo thành bào tử, mà bào tử lại có khả năng sống

trong các điều kiện bất lợi của môi trường hơn so với dạng tế bào sinh dưỡng. Do đó,

ban đầu ở pha thích nghi mật độ vi khuẩn giảm xuống , nhưng sau đó vi khuẩn bắt đầu

thích nghi được chúng phát triển nên mật độ tăng lên. Tuy nhiên ở 3 điều kiện pH thấp

sau 24 giờ thì tỉ lệ sống của Bacillus N6.1 cao nhất ở pH 4, pH 3. Kết quả này chứng tỏ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

vi khuẩn Bacillus N6.1 là chủng có thể làm probiotic bổ sung vào thức ăn cho các loài

thủy sản, đặc biệt là tôm cá vì chủng này có tỉ lệ sống trong điều kiện pH thấp rất cao.

Kết quả này tương đồng với nghiên cứu sự tồn tại của vi khuẩn probiotic trong

các điều kiện acid, có khả năng chịu acid dạ dày (pH thử nghiệm bằng 3(Audet và ctv

1988; Jankowski và ctv 1997, Krasaekoopt và ctv 2003; Doleyres và Lacroix 2004).

Theo Prasad, và cộng sự, 1998. Khi kiểm tra tất cả các chủng, thì các chủng tồn tại

được trong pH 3. Các chủng này được tiếp tục thử nghiệm với pH 2 thì khả năng chịu

đựng kém đi.

4.4.2. Khả năng chịu đựng muối mật

Hình 4.12: Khả năng chịu muối mật (Bile salt, India) của Bacillus N6.1.

Dựa vào hình 4.12, chúng tôi nhận thấy rằng ở nồng độ muối mật 0.3%, ban đầu

mật độ vi khuẩn là 2x107 cfu/ml tương ứng với tỉ lệ sống là 100%, sau 1 giờ tiếp xúc tỉ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

lệ sống tăng lên và tiếp tục tăng cao sau 2 giờ tiếp xúc. Nhưng tỉ lệ sống lại bắt đầu

giảm sau 3 giờ, và giảm mạnh sau 24 giờ. Ở nồng độ muối mật 0.5, 1, 2% cũng tương

tự như vậy. Nguyên nhân có thể là do chủng này đã tạo thành bào tử khi được tăng sinh

trong môi trường DSM, mà bào tử lại có khả năng sống trong các điều kiện bất lợi của

môi trường hơn so với dạng tế bào sinh dưỡng. Do đó, chủng vi khuẩn này thích nghi

được và chúng phát triển làm mật độ tăng lên, nhưng khả năng sống trong điều kiện

muối mật kém, sau 6 giờ chúng ngừng tăng trưởng bắt đầu đi vào pha tàn lụi nên mật

độ giảm xuống, dẫn đến tỉ lệ sống giảm sau 24 giờ. Tuy nhiên ở 4 nồng độ muối mật

sau 24 giờ thì tỉ lệ sống của Bacillus N6.1 cao nhất ở 0.3% và 0.5% và thấp nhất là ở

nồng độ 2%. Kết quả này chứng tỏ vi khuẩn Bacillus N6.1 là chủng có thể làm

probiotic bổ sung vào thức ăn cho các loài thủy sản, đặc biệt là tôm cá vì chủng này có

tỉ lệ sống cao trong các điều kiện muối mật sau 3 giờ

Theo kết quả nghiên cứu của Prasad và ctv, 1998., các chủng Bacillus spp. có

thể phát triển trong 0,3% muối mật sau 4 giờ

Một số nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn probiotic có thể phát triển trong

MRS có bổ sung 0,5% muối mật (Noriega và ctv, 2006). Nghiên cứu sử dụng nồng độ

muối mật từ 1% - 3% đã chỉ ra rằng bào tử của vi khuẩn có thể tồn tại tốt hơn so với

các tế bào sinh dưỡng (Chandramouli và ctv, 2004.; Kailasapathy 2005).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

4.5. Khả năng phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone

4.5.1. Dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử tín hiệu quorum

sensing (N-hexanoyl homoserine lactone, HHL) và đường kính vòng sắc tố violacein

Hình 4.13: Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử HHL và đường kính vòng

tròn sắc tố violacein

Dựa vào đường chuẩn mối tương quan giữa nồng độ C6-HHL và đường kính

vòng sắc tố, ta thiết lập phương trình y = 11,20x + 17,53 để quy đổi từ đường kính

vòng tròn violacein sang nồng độ C6-HHL (N-Hexanoyl homoserine lactone).

Trong đó: x: ln[HHL]

y: đường kính vòng tròn violacein (mm)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

4.5.2. Khả năng phân hủy phân tử HHL của Bacillus N6.1

HHL được sử dụng như một hợp chất thử nghiệm bởi vì nó được tạo ra do tác

nhân gây bệnh như Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Edwardsiella

tarda và Vibrio salmonicida (Swift và ctv.,1997; Morohoshi và ctv, 2004;. Bruhn và

ctv, 2005). Quá trình bẻ gãy các phân tử tín hiệu AHL được xúc tác bởi hai lọai

enzyme: AHL-acylase và AHL-lactonase.

Hình 4.14: Khả năng phân hủy phân tử tín hiệu C6- HHL của Bacillus N6.1

Dựa vào hình 4.14, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ HHL trong mẫu giảm dần

theo thời gian khảo sát và có sự khác biệt ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,05), điều này

chứng tỏ vi khuẩn Bacillus N6.1 có khả năng phân hủy HHL mặc dù sự phân hủy HHL

xảy ra không hoàn toàn sau 24 giờ. Nồng độ HHL bắt đầu giảm sau 6 giờ và giảm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

nhiều nhất sau 24 giờ, pH đo được sau 24 giờ là 8.08, pH này là phù hợp không làm

ảnh hưởng đến nồng độ C6-HHL trong môi trường..

Theo nghiên cứu của Defoirdt và ctv (2010), Đoàn Thanh Loan và ctv (2010),

các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được nuôi cấy trong môi trường có chứa HHL.

Vi khuẩn nuôi ở 108 cfu/ml trong đệm LB20 bổ sung 5 mg HHL/L để xác định khả năng

phân hủy HHL. Tất cả các vi khuẩn phân lập như: Bacillus anthracis, Bacillus cereus,

Bacillus subtilis và Bacillus thuringiensis có khả năng phân hủy HHL trong vòng 6-9

giờ. Nồng độ HHL giảm sau 6 giờ, từ 5mg/l còn lại 0,7 - 0,9 mg/l gần như hoàn toàn.

Và Bacillus cereus và Bacillus thuringiensis có khả năng phân hủy lactonase enzyme

AiiA (Đồng và cộng sự, 2002;.. Lee và cộng sự, 2002) phân lập từ tôm thẻ chân trắng.

4.6. Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 lên sự phát triển của E.

ictaluri bằng phương pháp nuôi chung (co-culture)

Để biết được bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 đối với E.ictaluri chúng tôi

tiến hành khảo sát như ở phần 3.3.6 và ghi nhận kết quả. Kết quả được trình bày trong

bảng 4.2

Bảng 4.2: Khảo sát bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 đối với E. ictaluri bằng

phương pháp nuôi chung

Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Phương pháp nuôi Dịch sau lọc Canh khuẩn

Bacillus N6.1 0 23.7 ± 2.1

Bacillus N6.1 + E. ictaluri (nuôi chung) 14.5 ± 1.32 22.3 ± 5.9

Dựa vào bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng đối kháng của Bacillus

N6.1 chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Ở 2 điều kiện nuôi khác

nhau dịch sau khi lọc xảy ra đối kháng khi Bacillus N6.1 được nuôi chung với vi khuẩn

gây bệnh E.ictaluri. Mặt khác, khả năng đối kháng của dịch vi khuẩn khi có tế bào sinh

dưỡng ở 2 điều kiện nuôi cũng khác nhau. Ở điều kiện nuôi riêng Bacillus N6.1 khả

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

năng đối kháng của chủng vi khuẩn này với E.ictaluri mạnh hơn, đường kính vòng

kháng khuẩn to hơn ở điều kiện nuôi chung

Nhìn chung, chủng vi khuẩn này khi ở điều kiện bình thường thì chúng không

tiết ra hợp chất đối kháng, nhưng khi gặp điều kiện bất lợi, có sự hiện diện của vi

khuẩn gây bệnh thì chúng lại tiết ra hợp chất ức chế vi khuẩn gây bệnh. Điều này lí giải

tại sao dịch sau khi lọc 0.2 µm ở điều kiện nuôi riêng lại không có khả năng đối kháng.

Tuy nhiên, canh khuẩn ở 2 điều kiện nuôi có khả năng đối kháng không tương đồng do

ở điều kiện nuôi chung, Bacillus N6.1 vừa tiết ra chất đối kháng chống lại E.ictaluri

vừa bị cạnh tranh dinh dưỡng nên không phát triển, mật độ giảm dẫn đến đường kính

vòng kháng khuẩn nhỏ hơn ở điều kiện nuôi riêng

Kết quả này chứng tỏ bản chất đối kháng của Bacillus N6.1 là tiết chất đối

kháng khi có sự hiện diện của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.

Tóm lại, chủng Bacillus N6.1 có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào, chủng

này tăng trưởng và đối kháng mạnh ở nồng độ muối 3-5%, pH từ 7-8 và nhiệt độ từ 30-

35oC. Có khả năng chịu muối mật và acid dạ dày, đồng thời có khả năng phân hủy tính

hiệu HHL, tiết chất đối kháng khi có sự hiện diện của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.

Vì vậy, chủng này là chủng tiềm năng có thể sử dụng làm chế phẩm probiotic phục vụ

cho nuôi trồng thủy sản.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

Theo kết quả của một số khảo sát cho thấy vi khuẩn Bacillus N6.1có một số đặc

tính sau:

 Có khả năng sinh các enzyme ngoại bào như: amylase, cellulase, caseinase,

gelatinase, nhưng không có khả năng sinh enzyme lipase

 Tăng trưởng và đối kháng mạnh ở nhiệt độ từ 30-35oC, tốt nhất ở 30oC. Ở nồng

độ muối từ 3-4%, pH từ 7-8, tốt nhất ở pH 8

 Có khả năng chịu đựng acid dạ dày và nồng độ muối mật từ 0.3-2%

 Có khả năng phân hủy tín hiệu HHL sau 6 giờ, và nồng độ HHL còn lại trong

môi trường giảm mạnh sau 24 giờ nhưng không phân hủy hoàn toàn

 Có khả năng sản xuất các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri trong môi trường khi tiến hành nuôi chung nhưng không có khả năng

hình thành các hợp chất này trong điều kiện không có sự hiện diện của vi khuẩn

gây bệnh.

5.2. Đề nghị

Để có thể đưa chủng này vào ứng dụng thực tế, cần tiến hành thêm một số khảo

sát sau:

 Định danh bằng sinh học phân tử để xác định chính xác tên loài

 Khả năng tương thích với các chủng khác

 Khả năng bảo hộ cá tra ở điều kiện in vivo

 Một số thông số kỹ thuật lên men nếu chủng này được chọn làm probiotic

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

Hạnh, V.T., L.T.B. Phượng, L.T. Hưng, T.T.H. Vân và T.T. Phong (2004). Nghiên cứu

sản xuất chế phẩm VEM dùng trong nuôi trồng thủy sản, Tuyển tập Hội thảo

toàn quốc về NC&ƯD KHCN trong nuôi trồng thủy sản.

Lý Thị Thanh Loan, Đỗ Quang Tiền Vương, Nguyễn Thanh Trúc, Thới Ngọc Bảo,

Đặng Ngọc Thùy, Lưu Đức Điền (2007). Quan trắc, cảnh báo môi trường và

phòng ngừa dịch bệnh một số vùng nuôi thủy sản ở các tỉnh phía nam – năm

2005, Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007.

Nguyễn Văn Minh (2010). Phân lập và sàn lọc một số vi khuẩn làm probiotic trong

nuôi trồng thủy sản từ trùng quế(Peryonyx escavatus),luận văn thạc sĩ, Đại học

khoa học Tự nhiên, Tp HCM.

Nguyễn Đức Quỳnh Như, Trần Thị Thanh Thảo, Huỳnh Bái Nhi, Trần Cát Đông,

(2009). Phân lập và sàng lọc một số chủng Bacillus làm probiotic trong nuôi

thủy sản, Bộ KH và CN, Tuyển tập hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc khu

vực phía nam, tr 444-449.

Đặng Thị Hoàng Oanh .Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây

bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ

Nguyễn Thanh Phương (2007). Báo cáo tổng kết đề tài “Quan trắc môi trường và xác

định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (Tra – Pangasianodon hypophthalmus

và Basa – Pangasius bocourti) và Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)

ở tỉnh An Giang”. Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, 81 trang.

Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004).Bệnh học

thủy sản, NXB Nông nghiệp Tp HCM.

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Vũ Hồng Như Yến (2007). Hổn hợp vi khuẩn phân hủy N-

ACYL Hormoserine Lactone giúp nâng cao tỉ lệ sống của ấu trùng cá Turbot

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

(Scophthalmus maximus L.).Tuyển tập nghề nuôi cá sông Cửu Long, NXB

Nông Nghiệp 2007.

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2008). Chuyên đề 3: Các phương pháp xác định cơ chế tác

động của vi khuẩn Probiotic. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II.

Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010).Khảo sát các điều kiện nuôi cấy và

phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis, Tuyển

tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7, Đại học Đà

Nẵng.

Tài liệu tiếng anh

Aboagye, D.L., Daniels, W.H., Terhune, J.S., Arias, C.R. (2008). The effect of the

probiotic Lymnozyme on survival of channel catfish challenged with

Edwardsiella ictaluri. Aquaculture America 2008 – Meeting abstract.

Austin, B. & Austin, D.A. (1999). Enterobacteriacea representatives. In: Bacterial Fish

Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish (ed. By B. Austin & D.A.

Austin), 3rd edn, pp. 81-84. Springer Praxis Publishing, Chichester.

Brown, M.R., S.M. Barrett, J.K. Volkman, S.P. Nearhos, J.A. Nell, and G.L. Allan

(1996) Biochemical composition of new yeasts and bacteria evaluated as food

for bivalve aquaculture. Aquaculture 143:341-360.

Crumlish, M., Dung, T.T., Turnbull, J.F., Ngoc, N.T.N., Ferguson, H.W. (2002).

Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish,

Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam.

Journal of Fish Diseases 25, 733-736

Ferguson, H.W., Turnbull, J.F., Shinn, A., Thompson, K., Dung, T.T., Crumlish, M.

(2001). Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from

the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 24, 509-513

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

Glencross, B.D., Boujard, T., Kaushik, S.J. (2003). Influence of oligosaccharides on

the digestibility of lupin meals when fed to rainbow trout, Oncorhynchus

mykiss. Aquaculture 219, 703-713.

Hawke, J.P. (1979). A bacterium associated with disease of pond cultured channel

catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the Fisheries Research Board of Canada

36, 1508-1512.

Hai, N.V., R. Fotedar, and N. Buller. 2007. Selection of probiotics by various

inhibition test methods for use in the culture of western king prawns, Penaeus

latisulcatus (Kishinouye). Aquaculture 272:231-239.

Li, J., Tan, B., Mai, K. (2009). Dietary probiotic Bacillus OJ and

isomaltooligosaccharides influence the intestine microbial populations, immune

responses and resistance to white spot syndrome virus in shrimp (Litopenaeus

vannamei). Aquaculture 291, 35-40.

McClean, K.H., M.K. Winson, L. Fish, A. Taylor, S.R. Chhabra, M. Camara, M.

Daykin, J.H. Lamb, S. Swift, B.W. Bycroft, G.S.A.B. Stewart, and P. Williams.

1997. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of

violacein production and inhibition for the detection of Nacylhomoserine

lactones. Microbiology 143:3703-3711.

Mourad, K., and K. Nour-Eddine. 2006. In vitro preselection criteria for probiotic

Lactobacillus plantarum strains of fermented olives origin. International Journal

of Probiotics and Prebiotics 1:27-32.

Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., Evans, J.J. (2002). In vovo methods for utilizing the

modified live Edwardsiella ictaluri vaccine against enteric septicemia in

channel catfish. Aquaculture 203, 221-227.

Nguyen Thi Ngoc Tinh, Vu Hong Nhu Yen, Kristof Dierckens, Patrick Sorgeloos,

Peter Bossier (2008) . An acyl homoserine lactone-degrading microbial

community improves the survival of first-feeding turbot larvae (Scophthalmus

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: Th.S Võ Minh Sơn Th.S Phạm Minh Nhựt

maximus L.). Laboratory of Aquaculture & Artemia Reference Center, Ghent

University, Rozier 44, 9000 Gent, Belgium

Tom Defoirdt, Loan Doan Thanh, Bart Van Delsen, Peter De Schryver, Patrick

Sorgeloos ,Nico Boon , Peter Bossier (2010) . N-acylhomoserine lactone-

degrading Bacillus strains isolated from aquaculture animals. Laboratory of

Aquaculture and Artemia Reference Center, Ghent University, Rozier 44, 9000

Gent, Belgium

Robertson, P.A.W., C. O'Dowd, C. Burrells, P. Williams, and B. Austin (2000) Use of

Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and

rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). Aquaculture 185:235-243.

W. K.Ding and N.P. Shah (2007). Acid, Bile, and Heat Tolerance of Free And

Microencapsulated Probiotic Bacteria.

Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh “mủ ở gan thận” trên cá tra nuôi tại Bến Tre,

www.ntu.edu.vn/khoa/nuoitrong/privateres/khoa/nuoitrong/file/sv/2008

http://www.nongnghiep.vinhlong.gov.vn/Default.aspx?tabid=64&categoryid=47&item

id=2888

http://www.tongcucthuysan.gov.vn/Portal/NewsDetail.aspx?newsid=8548&lang=vi-

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn Bacillus N6.1 đối kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN BACILLUS N6.1 ĐỐI KHÁNG EDWARDSIELLA ICTALURI GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Võ Minh Sơn

Th.S Phạm Minh Nhựt

Sinh viên thực hiện

: MAI NGỌC TUYỀN

MSSV: 107111217

Lớp: 07DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2011

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU

CHƯƠNG II: TỒNG QUAN

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ môi trường: Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học theo mẻ (SBR) để xử lý nước thải sinh hoạt trong nhà cao tầng và khu dân cư quy mô tới 10000 người

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình của một số gen ở trẻ em mắc bệnh teo đường mật bẩm sinh

Đề thi kết thúc học phần học kì 2 môn Công nghệ sinh học dinh dưỡng năm 2023-2024 có đáp án

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Quản lý chất lượng sản phẩm năm 2023-2024

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm

Đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ lớp phủ thực vật tỉ lệ 1:50000 tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội từ tư liệu ảnh viễn thám

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng mô hình dự báo nguồn nhân lực thuyền viên xuất khẩu Việt Nam

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp điều khiển bám quỹ đạo tàu thủy có ràng buộc tín hiệu và bất định hàm ở đầu vào

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tính toán hệ dây neo công trình biển nổi đặt tại vùng biển Việt Nam

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok