Đồ án tốt nghiệp: Xác định phương pháp tinh sạch NPV (Nuclera Polyhedrosis Virus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NPV

(NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai

Sinh viên thực hiện

: Trương Hùng Phong

MSSV: 1151110260 Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN

- - - - - - - - -- - - - - - - - -

Tôi tên: Trương Hùng Phong

Sinh ngày 17 tháng 09 năm 1993

Sinh viên lớp 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP

Hồ Chí Minh.

Tôi xin cam đoan : Đề tài "Xác định phương pháp tinh sạch NPV (Nuclera

Polyhedrosis Virus)" do Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai hướng dẫn là đề tài của riêng tôi. Các

số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố

trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Những thông tin tham khảo trong khóa

luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.

Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo

viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng.

Sinh viên thực hiện

Trương Hùng Phong

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

- - - - - - - - -- - - - - - - - -

Để hoàn thành đề tài này ngoại sự nổ lực, cố gắng của bản thân, em còn nhận

được sự hỗ trợ rất nhiều từ nhiều người, tôi chân thành gửi lời "CẢM ƠN" tới :

Con xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những

người thân trong gia đình đã nuôi con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi

điều kiện cho con được học tập cho đến ngày hôm nay.

Ngôi trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó

suốt bốn năm học qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh

nghiệm trong cuộc sống.

Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, các thầy cô trong bộ

môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã trang

bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để tôi thực hiện đề tài và làm tốt

công việc sau này.

Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai, đã tận tình hướng dẫn, cung cấp những tư liệu quý giá.

truyền đạt kinh nghiệm và động viên tinh thần để em có thể hoàn thành đồ án của

mình.

Thầy Huỳnh Văn Thành, thầy Nguyễn Trung Dũng phòng thí nghiệm khoa Môi

Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM đã

quan tâm, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.

Các bạn trong tập thể lớp 11DSH04 cùng tập thể các bạn cùng thực hiện trong

phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh Học trường Đại học Kỹ Thuật Công nghệ Tp.Hồ

Chí Minh, các bạn đã luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tinh thần giúp em vượt qua

những khó khăn trong quá trình thực hiện đồ án.

Em xin chân thành "CẢM ƠN" những sự giúp đỡ đó.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC

MỤC LỤC ........................................................................................................................iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. vi

DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH............................................................................................. viii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4

1.1. Giới thiệu chung về sâu khoang (Spodoptera litura) .......................................... 4

1.1.1. Phân bố .......................................................................................................... 4

1.1.2. Ký chủ ........................................................................................................... 4

1.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh học .................................................................... 4

1.1.4. Tập tính sống và cách gây hại ...................................................................... 8

1.1.5. Thiên địch và biện pháp phòng trừ ............................................................... 9

1.2. Khái quát về virus diệt côn trùng ...................................................................... 11

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu virus diệt côn trùng ..................................................... 11

1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng virus diệt côn trùng trong đấu tranh sinh học .... 11

1.2.3. Hình thái và cấu trúc chung của virus ........................................................ 12

1.2.4. Những nhóm virus chính gây bệnh côn trùng ............................................ 14

1.2.4.1. Nhóm Baculovirus (Baculoviridae) ........................................................ 14

1.2.4.2. Nhóm Cytoplasmic polyhedrosis virus - CPV (Reoviridae) .................. 16

1.2.4.3. Nhóm iridovirut (iridoviridae) ................................................................ 16

1.2.4.4. Nhóm Densevirut (Parvoviridae) ............................................................ 17

1.2.4.5. Nhóm các virut RNA (picornaviridae) ................................................... 17

1.2.4.6. Nhóm sigmavirut (Rhabdoviridae) ......................................................... 17

1.2.4.7. Nhóm ascoviridae .................................................................................... 17

iii

1.2.5. Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng ............................................. 17

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.5.1. Cấu trúc ................................................................................................... 18

1.2.5.2. Cơ chế gây bệnh của NPV ...................................................................... 19

1.2.5.3. Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus .............................................. 21

1.2.5.4. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu khoang .......................................... 21

1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của virus và cách hạn chế khi sử dụng chế phẩm virus ............................................................................................. 23

1.2.5.5. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch hại . ................................................................................................................ 24

1.3. Giới thiệu về phương pháp ly tâm ..................................................................... 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 28

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 28

2.2 Vật liệu ............................................................................................................... 28

2.2.1 Dụng cụ ....................................................................................................... 28

2.2.2 Hóa chất ...................................................................................................... 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 29

2.3.1 Thí nghiệm 1 :Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dịch gốc tới chất lượng của virus .................................................................................................................... 29

2.3.1.1 Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 29

2.3.1.2 Tiến hành ................................................................................................. 30

2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan ................................................................................................................. 35

2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 35

2.3.2.2 Tiến hành ................................................................................................. 36

2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định số vòng ly tâm lần thứ 2 để tinh sạch NPV ........ 39

2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 39

2.3.3.2 Tiến hành ................................................................................................. 39

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 41

3.1 . Ảnh hưởng của dịch gốc đến hiệu quả nhân NPV trong sâu khoang ............ 41

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3.2 Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan ......... 44

3.3 Xác định số vòng ly tâm lần 2 để tinh sạch virus NPV .................................... 52

3.4 Tối ưu hóa công thức ly tâm tinh sạch NPV ..................................................... 59

CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... 62

4.1. Kết luận .............................................................................................................. 62

4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 63

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NPV Virus đa diện nhân (Nuclear Polyhedrosis Virus)

SENPV Spodoptera exigua Nuclear Polyhedrosis Virus

BVTV Bảo vệ thực vật

DDT Thuốc trừ sâu (Dichloro diphenyl trichlorothane)

EPN Tuyến trùng ký sinh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes)

PPI Chất kiềm hãm sinh trưởng

CT Công thức

IPM Biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp (Integrated Pest

Management

CPVs Virus đa diện tế bào chất (Cytoplasmic polyhedrosis viruses).

IB Thể vùi (Inclusion Body)

OB Thể vùi (Occlusion Body)

PIB Thể vùi (Polyhedral inclusion body)

DNP Deoxyribo Nucleo Protein

PCA Plate Count Agar

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn nhân tạo ........................................................ 33

Bảng 3.1 Số sâu chết sau các ngày phơi nhiễm dịch NPV (con) .................................. 42

Bảng 3.2 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV .............................................................. 43

Bảng 3.3 Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong dịch virus ................................................ 43

Bảng 3.4 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi li tâm lần 1 ..................... 45

Bảng 3.5 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm ............................................ 47

Bảng 3.6 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV ............................................................. 50

Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus ở các công thức ly tâm .............................................................................................................. 51

Bảng 3.8 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi li tâm lần 2 ..................... 53

Bảng 3.9 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm ............................................ 54

Bảng 3.10 Hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức ở các ngày sau nhiễm ................ 56

Bảng 3.11 Hiệu lực diệt sâu, tổng số vi sinh vật hiếu khí và số PIB của các CT ở các chế độ ly tâm 2 lần........................................................................................................... 58

vii

Bảng 3.12 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus ....... 60

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình1.1: Vòng đời sâu khoang ....................................................................................... 5

Hình1.2: Trứng sâu khoang ............................................................................................. 6

Hình1.3: Ấu trùng sâu khoang ....................................................................................... 7

Hình1.4: Nhộng sâu khoang ............................................................................................ 7

Hình1.5: Bướm sâu khoang ............................................................................................. 8

Hình1.6: Một số hình dạng của virus ............................................................................ 13

Hình1.7: Cấu trúc của virus .......................................................................................... 14

Hình1.8: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al,2003) ................................................. 18

Hình1.9: Sâu khoang chết do nhiễm virus .................................................................. 22

Hình 2.1: Các bước tiến hành phương pháp đổ đĩa ....................................................... 32

Hình 2.2: A: Hộp nhựa 20x12x7 cm; B: Sau khi cho thức ăn nhân tạo; C: Sâu được nuôi trong thức ăn nhân tạo sau khi quét dịch virus ....................................................... 35

Hình 2.3: Buồng đếm hồng cầu ...................................................................................... 36

Hình 2.4: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu ......................................................................... 37

Hình 2.5: Quy tắc đếm bằng buồng đếm hồng cầu ........................................................ 38

Hình 2.6: Hình dáng virus trên buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) ........................... 39

Hình 3.1: Diễn biến số sâu chết qua các ngày phơi nhiễm ............................................ 42

Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV ................ 46

Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA ............................. 46

Hình 3.4: PIB virus trong buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X) ................................... 48

Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus ở các CT ly tâm ...................... 48

Hình 3.6: Hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm ................................................... 50

Hình 3.7: So sánh hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của các công thức ....................................................................................................................... .52

Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV ................ 53

viii

Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus NPV ........................................ 55

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.10: Sâu chết với các dấu hiệu đặc trưng của nhiễm virus ................................ 56

Hình 3.11: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm............................... 57

Hình 3.12: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm................................ 61

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Sâu khoang Spodoptera litura là đối tượng gây hại nghiêm trọng trên phạm vi

toàn thế giới cũng như ở Việt Nam. Trong những năm gần đây sâu khoang xuất hiện

khá phổ biến ở các ruộng rau màu tại địa bàn thành phố Hồ Chí Minh và các vùng lân

cận. Phạm vi ký chủ của sâu sâu khoang khá rộng với trên 290 loài cây bao gồm cả cây

thực phẩm, rau quả, cỏ dại và cây cảnh. Chúng tấn công trên lá, ăn hết phần thịt lá chỉ

còn lại gân lá. Để phòng trừ sâu khoang thì biện pháp hóa học là biện pháp được sử

dụng phổ biến hơn cả bởi tính tiện lợi, đơn giản, dễ sử dụng lại cho hiệu quả . Tuy

nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học không hợp lý trong một thời gian dài và không đúng

cách đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của sâu khoang, gây hậu quả nghiêm trọng tới

môi trường quan trọng hơn hết còn là vấn đề sức khỏe của con người. Lượng thuốc hóa

học còn tồn đọng trong nông sản sẽ gây ra những ảnh hưởng rất nghiêm trọng tới sức

khỏe.

Đứng trước thực trạng như hiện nay, thì việc nghiên cứu và tìm ra những tác nhân

sinh học phòng trừ sâu khoang an toàn cho con người là một điều hết sức cần thiết.

Trong số các tác nhân đã được nghiên cứu thì virus NPV được xem là có triển vọng vì

hiệu lực diệt sâu cao, mức độ lây lan trong quần thể rộng và kéo dài lại không độc hại

với con người và môi trường. Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về

virus NPV. Việc sản xuất NPV cho đến nay chủ yếu là lây nhiễm trên sâu ký chủ và

thu nhận virus thông qua cơ thể sâu chết. Do vậy, dịch NPV thường bị tạp nhiễm cao

bởi nhiều thành phần như da, thể mỡ và có cả các vi sinh vật khác. Các tác nhân này

ảnh hưởng xấu đến chất lượng dịch gốc dùng để nhiễm sâu, hiểu quả sản xuất chế

phẩm NPV cũng như việc bảo quản chế phẩm này. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu quy

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

trình ly tâm tinh sạch NPV phục vụ cho sản xuất chế phẩm này vẫn chưa được quan

tâm. Xuất phát từ thực tiễn trên sinh viên tiến hành nghiên cứu và thực hiện đề tài

“XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)”.

2. Tình hình nghiên cứu

Đối với loài sâu khoang Spodoptera litura thì virus NPV được coi là tác nhân hứa

hẹn nhất và cho kết quả tương đương với thuốc hóa học (Ravishanka and Venkatesha,

2010).

NPV đã được quan tâm nghiên cứu và sử dụng ở Việt Nam từ đầu những năm

1980. Khởi đầu là việc nghiên cứu và sử dụng NPV để trừ sâu xanh hại bông của Viện

nghiên cứu Bông và Viện bảo vệ Thực vật. Sau đó là SENPV trừ sâu xanh da láng

(Spodoptera exigua) trên bông, nho, hành tỏi cũng được phát triển khá mạnh và sử

dụng rất hiệu quả. Các kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng NPV có hiệu lực trừ sâu

tương đương hoặc cao hơn so với thuốc hóa học (Phạm Hữu Nhượng và CTV, 2005;

Hoàng Thị Việt và ctv,1999, 2000; Ngô Trung Sơn, 2001; Nguyễn Văn Tuất, 2004).

Chính vì vậy, virus NPV đã dành được nhiều mối quan tâm của các tác giả trong nước

cũng như ngoài nước.

Các nghiện cứu đều chỉ ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang.

Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Mohammad et al, 2002). Cụ thể Tran Thi

Kieu Trang et al (2002) cho biết, sâu 2 ngày tuổi mẫn cảm gấp 1.500.000 lần so với sâu

8 ngày tuổi.

Năm 2000, Monobrullah và Nagata nghiên cứu và cho biết, sản lượng NPV cao

nhất khi sử dụng sâu 9 ngày tuổi (trọng lượng 125 – 155mg) để nhiễm virus. Và sau 7

ngày nhiễm sản lượng virus đạt cao nhất. Sâu gần chết thích hợp hơn để thu nhận virus

so với sâu chết. Việc phối trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế

phẩm Neem, acid boric, rỉ đường… sẽ làm tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

bệnh do virus NPV. Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x

105 PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang

tăng hơn so với không trộn. Ngoài ra, nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng

cường hiệu lực gây chết của virus thì các chất phụ gia cũng được cho thêm

Bên cạnh các vần đề về việc tăng cường hiệu lực diệt sâu khoang của các virus

NPV, sản xuất virus NPV, quy trình sản xuất tạo chế phẩm… thì những vấn đề liên

quan đến bảo quản chế phẩm virus NPV cũng đang được quan tâm.

Các nghiên cứu đều cho rằng, hiệu lực của virus ảnh hưởng bởi thời gian và biện

pháp bảo quản. Rodrigo Lasa và cộng sự (2008) cho biết, hiệu lực trừ sâu xanh da láng

của virus SENPV bị giảm 16,67 lần sau 18 tháng bảo quản ở nhiệt độ 250C và hiệu lực

không thay đổi nếu bảo quản virus ở điều kiện 40C và -200C. Nhóm tác giả cũng cho

biết thêm, bổ sung các chất kháng khuẩn và chất chống oxy hóa có thể duy trì hiệu lực

của virus trong vòng 18 tháng ở điều kiện bảo quản trong tủ lạnh.

3. Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm ra công thức ly tâm phù hợp nhằm làm giảm lượng vi sinh vật hiếu khí có

trong dịch virus

- Xác định công thức ly tâm phù hợp để thu nhận virus (số PIB)

- Tối ưu hóa số vòng li tâm để tinh sạch virus NPV

4. Mục đích nghiên cứu

Mục đích của đề tài là tìm ra được công thức ly tâm virus để loại bỏ tối đa lượng

vi sinh vật hiếu khí bước đầu tinh sạch dịch NPV.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về sâu khoang (Spodoptera litura)

Tên khoa học: Spodoptera litura

Họ: Ngài đêm (Noctuidae)

Bộ: Cánh vẩy (Lepidoptera)

1.1.1. Phân bố

Sâu khoang phân bố khắp nơi trên thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt

đới như : Ấn Độ, Pakistans, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn

Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, các nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam sâu khoang hiện

diện khắp nơi.

1.1.2. Ký chủ

Sâu khoang là loài đa thực, chúng phá hoại trên 290 loài cây trồng thuộc 99 họ

thực vật khác nhau. Gây hại phổ biến nhất trên đậu nành, bắp, cải xanh, cải bắp, rau

muống và đậu phộng. Ngoài ra còn có trên ớt, cà chua, khoai lang, khổ qua và lúa non

(Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh, 2001). Sâu non tuổi nhỏ thường gây

hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh

chóng làm lá cây xơ xác. Sâu non còn có thể gặm ăn vỏ quả làm giảm phẩm chất.

1.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh học

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.1: Vòng đời sâu khoang

Vòng đời trung bình 35 - 40 ngày, trong đó thời gian sâu non sống và phá hoại

khoảng 20 - 25 ngày (Phạm Văn Biên et al., 2003).

* Giai đoạn trứng

Trứng có hình bán cầu, đường kính 0,4 - 0,5 mm. Bề mặt trứng có những đường

dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo

thành những ô nhỏ. Trứng mới đẻ có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu tro, lúc

sắp nở có màu tro đậm. Ổ trứng có phủ lông từ bụng bướm mẹ. Sau khi đẻ khoảng 2 -

3 ngày trứng sẽ nở.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.2: Trứng sâu khoang

* Giai đoạn ấu trùng

Sâu có 5 - 6 tuổi tùy điều kiện môi trường và phát triển trong thời gian từ 20 - 25

ngày. Sâu lớn đủ sức dài 35 - 53 mm, hình ống tròn. Sâu tuổi nhỏ có màu xanh lục,

càng lớn sâu chuyển dần thành màu nâu đậm (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen,

2004). Điểm đặc trưng nhất của ấu trùng sâu khoang là chấm đen ở đốt thân thứ nhất

rất to, rõ gần như giao nhau tạo thành khoang do đó sâu còn được gọi là sâu khoang.

Trên các đốt còn lại vẫn có chấm đen nhưng không lớn như ở đốt thứ nhất. Trên cơ thể

sâu có 4 sọc màu vàng cam (2 sọc nằm trên lưng và 2 sọc nằm 2 bên hông). Ở mỗi đốt,

lỗ khí khổng nằm ở bên hông và lớn dần theo tuổi của sâu. Sâu có phần bụng màu nhạt

hơn phần lưng (Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh, 2001). Sâu non lột xác

5-6 lần, sâu tuổi nhỏ ăn biểu bì của lá, sâu tuổi lớn ăn cả thịt lá chỉ chừa lại gân lá. Khi

mật độ sâu cao có thể làm cho lá rụng nhanh. Tuy nhiên sự gây hại thường không

nghiêm trọng lắm do khả năng tự đền bù của cây.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.3: Ấu trùng sâu khoang

* Giai đoạn nhộng

Nhộng dài 18 - 20 mm, màu nâu tươi hoặc nâu tối, hình ống tròn. Theo Phạm

Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Minh (2001), khi mới được hình thành nhộng sâu khoang

có màu xanh đọt chuối, rất mềm sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có

màu nâu, thân cứng dần và có màu nâu đỏ. Khi sắp vũ hóa nhộng có màu nâu đen, các

đốt cuối cùng của nhộng có thể cử động được. Thời gian nhộng là 7 ± 1 ngày.

Hình1.4: Nhộng sâu khoang

* Giai đoạn thành trùng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bướm có chiều dài thân 20 - 25 mm, sải cánh rộng 35 - 45 mm. Cánh trước màu

nâu vàng. Phần giữa từ cánh trước đến cánh sau có một vân ngang rộng, màu trắng.

Trong vân trắng này có 2 vân màu nâu. Cánh sau màu trắng óng ánh. Bướm có đời

sống trung bình từ 1 - 2 tuần tùy điều kiện thức ăn. Trung bình một bướm cái đẻ 300

trứng, nhưng điều kiện thích hợp bướm có thể đẻ từ 900 - 2000 trứng. Thời gian đẻ

trứng trung bình của bướm kéo dài từ 5 - 7 ngày, đôi khi đến 10 hoặc 12 ngày (Nguyễn

Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).

Hình1.5: Bướm sâu khoang

1.1.4. Tập tính sống và cách gây hại

Bướm thường vũ hóa vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối, ban

ngày bướm đậu ở mặt sau lá hoặc trong các bụi cỏ. Bướm bay rất nhanh, có khi xa đến

vài chục mét và cao đến 6 - 7 m. Sau khi vũ hóa vài giờ bướm có thể bắt cặp và một

ngày sau thì đẻ trứng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Bướm có xu tính

thích các chất có mùi chua ngọt và ánh sáng bước sóng ngắn.

Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn

phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn

nắp. Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Sâu khoang thường phát sinh phá hại nhiều trong điều kiện thời tiết ấm, ít nắng và

nhiệt độ không cao lắm, khoảng 20 - 25oC (Phạm Văn Biên et al., 2003). Theo Nguyễn

Đức Khiêm (2006), Sâu khoang là loài ưa điều kiện nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp nhất

cho sâu sinh trưởng phát dục là 29 - 30oC và độ ẩm không khí thích hợp là trên 90%.

Sâu vừa nở sống tập trung, nếu bị khua động nhẹ chúng có thể bò phân tán ra

chung quanh hoặc nhả tơ buông mình xuống đất. Ở giai đoạn này sâu chỉ gặm mặt dưới

lá, chừa biểu bì trên và gân. Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán và ăn gặm lá nhiều hơn.

Từ tuổi 4 sâu bắt đầu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sáng nên ban ngày sâu ẩn ở những

nơi tối hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm sâu leo lên cây. Ở tuổi lớn sâu có tập quán

ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân cây, cành và trái

non. Khi sắp làm nhộng sâu chui xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đó

hóa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004).

1.1.5. Thiên địch và biện pháp phòng trừ

* Thiên địch

- Các loài ăn mồi: Bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt, bọ cánh cứng.

- Ong kí sinh: Cotesia prodeniae, Telenomus remus.

- Vi khuẩn BT, virus NPV.

* Biện pháp phòng trừ

Biện pháp canh tác: Vệ sinh đồng ruộng, sau thu hoạch phải thu gôm các tàn

dư cây trồng đem đốt hoặc ủ làm phân. Đất trước khi trồng cần phải được cày,

phơi và xử lý thuốc trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2 - 3 ngày để diệt nhộng,

sâu non có trong đất. Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu

nếu sâu phát sinh nhiều thì ban đêm có thể soi đèn để bắt, ngắt bỏ ổ trứng hoặc

tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phát tán đi xa. Ngài sâu khoang có khuynh

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

hướng thích mùi chua ngọt và ánh sáng đèn, do đó có thể dùng bả chua ngọt để

thu hút bướm khi chúng phát triển rộ.

Biện pháp hóa học: Atabron được dùng làm nền phối hợp với các loại thuốc

còn lại hoặc với các loại thuốc Cúc tổng hợp sẽ cho hiệu quả phòng trị rất tốt. Sâu

khoang cũng rất dễ kháng thuốc, nên luân phiên nhiều loại thuốc để phun.

Biện pháp Phòng trừ Dịch hại tổng hợp (IPM):

- Vệ sinh đồng ruộng, tiêu diệt nhộng, phơi đất hay ngâm ruộng một thời gian.

- Dùng hoa hướng dương hay các loài cây có thể dẫn dụ sâu khoang trồng xung

quanh ruộng canh tác để dễ dàng tiêu diệt.

- Hàng ngày theo dõi dự báo sự phát triển của sâu qua bẫy pheromone, thường

xuyên ngắt bỏ ổ trứng và diệt ấu trùng trên những ruộng dẫn dụ.

Biện pháp sinh học:

Hiện nay có nhiều tác nhân đặc trưng được sử dụng để làm giảm mật độ sâu

khoang nhưng bảo tồn thiên địch, một số tác nhân như chất điều hòa sinh trưởng côn

trùng hoặc vi khuẩn Bt, các tác nhân này chỉ có hiệu quả trên ấu trùng rất nhỏ và cần áp

dụng nhiều trên một thế hệ. Do đó pheromone giới tính được kết hợp sử dụng không

chỉ làm giảm thành trùng mà còn để theo dõi sự xuất hiện của ấu trùng và dự đoán

được sự nở của ấu trùng (Shinoda, 2001).

Dùng sản phẩm sinh học có nguồn gốc nấm (Beauveria sp. và Nomureasp. ), vi

khuẩn (vi khuẩn Bt), virus (NPV), protozoa,… khi có những dấu hiệu cắn phá lá đầu

tiên và thông thường 10 ngày sau phải phun thuốc lại 1 lần. Tuy nhiên vẫn chưa được

áp dụng rộng rải do chi phí sản xuất cao, bảo quản còn khó khăn, và ảnh hưởng của

yếu tố môi trường và sinh vật và còn ngần ngại vì đưa ra một tác nhân lạ có thể gây rủi

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ro như tác động môi trường và chuyển gen vào các sinh vật bản địa (Munoz et al.,

1997).

1.2. Khái quát về virus diệt côn trùng

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu virus diệt côn trùng

Lịch sử cổ đại đã ghi nhận những phát hiện về bệnh do virus trên tằm dâu và ong

khi con người bắt đầu nuôi dưỡng hai loài côn trùng có ích này để phụ vụ đời sống.

Năm 384 - 322 trước công nguyên Aristolte đã miêu tả bệnh của ong, tuy nhiên

người Trung Quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2.700 năm trước Công

Nguyên (Tanada và Kaya, 1993).

Sau đó năm 1856 hai nhà khoa học trên thể giới là Cornilia và Maestri đã mô tả

thật kỹ lưỡng bệnh này trên tằm nghệ. Chính hai nhà khoa học này đã tìm thấy thể đa

diện trên cơ thể tằm.

Tuy nhiên, vào năm 1898 Bolle lại là người đầu tiên phát hiện ra sự hòa tan thể

đa diện (thể vùi) trong ruột tằm và giải phóng ra các hạt virus nhỏ (thể siêu vi).

Tiếp sau đó Akkva (1919), Komarek và Breindl (1924) đã tiến hành lọc chất dịch

từ tằm và sâu róm (Lymmantria monacha) bị bệnh và khẳng định bản chất virus của

các bệnh tạo nên thể đa diện ở côn trùng.

Người đầu tiên nhìn thấy virus gây bệnh côn trùng là Bergold trong những công

trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử.

1.2.2. Cơ sở khoa học sử dụng virus diệt côn trùng trong đấu tranh sinh học

Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các virus nhân lên ngay trong nhân hoặc

trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ chết. Những côn

trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài

vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

các thế hệ sau. Nguồn virus tồn đọng trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ

mới. Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên

cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp đấu tranh

sinh học phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lai.

Năm 1923, Tanaka và Kaya đã miêu tả hơn 20 nhóm (họ) virus gây bệnh cho côn

trùng. Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và Reoviridae. Đại diện

của họ Baculoviridae là virus đa diện nhân (NPV- Nuclear polyhedrosis viruses) và đại

diện của họ Reoviridae là virus đa diện tế bào chất (CPV - Cytoplasmic polyhedrosis

viruses).

Theo Hukuhara và Bonami (1991) thì CPVs ký sinh trong 4 bộ côn trùng hay gặp

nhất là bộ cánh vảy - Lepidoptera có 201 vật chủ, bộ hai cánh - Diptera - 39 vật chủ..

Mặc dù thuốc CPV có hiệu quả diệt sâu, nhưng người ta vẫn ít quan tâm để phát triển

nó hơn Baculovirut, vì lí do chủ yếu là CPVs chỉ tấn công tế bào biểu mô ruột của sâu

và có xu hướng gây ra nhiễm trùng mãn tính. Hơn nữa trong điều kiện tự nhiên, chúng

gây bệnh dịch với tỷ lệ thấp và ít ảnh hưởng tới quần thể vật chủ như Baculovirut. Tuy

nhiên chúng có thể nhân nuôi theo qui mô lớn trong công nghiệp.

Theo các tác giả Tanada và Kaya (1993), có hơn 600 loài sâu thuộc bộ

Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera, Diptera... là vật chủ của Baculovirut. Do đó có

rất nhiều nghiên cứu và sản xuất thuốc trừ sâu virus tập trung vào nhóm virus này. Hầu

hết Baculovirus thuộc tính chuyên hoá cao, chỉ ký sinh trong một loài sâu, thậm chí ký

sinh một số mô nhất định nào đó của sâu. Những tác động có hại của Baculovirus đối

với thiên địch và các ong kí sinh trưởng thành chưa được phát hiện trong tự nhiên

(Groner, 1990).

1.2.3. Hình thái và cấu trúc chung của virus

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Tất cả các virus đều có cấu tạo gồm hai thành phần cơ bản: lõi là acid nucleic (tức

genome) và vỏ là protein gọi là capsid bao bọc bên ngoài để bảo vệ acid nucleic.

Capsid bao gồm nhiều capsomer. Phức hợp bao gồm acid nucleic và vỏ capsid gọi là

nucleocapsid. Genome của virus có thể là AND hoặc ARN, sợi đơn hoặc sợi kép. Một

số loại virus có màng bao (envelop).

Virus có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau.

Hình thái của virus do vỏ capsid qui định. Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp

khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau.

Hình1.6: Một số hình dạng của virus (Presscott L. M. et al. , Microbiology. 6th ed. Intern.

Ed. 2005)

Khi có bộ gen trong vỏ capsid thì gọi là virion hoặc là hạt virus. Vậy virion là hạt

virus đầy đủ về hình thái, nó có thể là một nucleocapsid có vỏ bọc gọi là virus có vỏ,

hoặc là một nucleocapsid trần gọi là virus không vỏ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình1.7: Cấu trúc của virus

1.2.4. Những nhóm virus chính gây bệnh côn trùng

Phân loại virus hại côn trùng gắn liền với lịch sử phát minh và những cấu trúc đặc

trưng của chúng. Virus ký sinh trên vật chủ riêng biệt cho nên tên của virus được gắn

với tên của ký chủ. Ví dụ, virus đa diện nhân của sâu xanh đục quả có tên virus đa diện

nhân Helicoverpa armigera, viết tắt là HaNPV…

Virus côn trùng được phân thành 14 nhóm. Mỗi nhóm được miêu tả như một

“họ” mặc dù phân loại virus côn trùng vẫn đang phát triển, đặc biệt là các đặc điểm hóa

sinh, cho nên việc phân nhóm này không nên coi như là một quyết định cuối cùng.

1.2.4.1. Nhóm Baculovirus (Baculoviridae)

Nhóm Baculovirut này được nghiên cứu rất kỹ do khả năng diệt sâu của chúng.

Hơn nữa, gần đây những nghiên cứu về vai trò của vectơ biểu hiện đối với một số gen

có hoạt tính sinh học. Đặc điểm cơ bản của Baculovirus thuộc họ này là có mặt một sợi

đôi DNA trong hệ gen (genome) của chúng. Cho tới nay người ta đã xác định bệnh do

nhóm virus này gây ra ở côn trùng thuộc 6 bộ sau:

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Lepidoptera - Bộ cánh vẩy

- Diptera - Bộ hai cánh

- Coledoptera - Bộ cánh cứng

- Hymenoptera - Bộ cánh màng

- Orthoptera - Bộ cánh thẳng

- Neuroptera - Bộ cánh mạch

Theo Jayaraj (1985) có khoảng 300 mẫu virus phân lập ở bộ cánh vảy, cánh màng

và bộ hai cánh. Baculovirus bao gồm một vỏ lipoprotein bao quanh 1 protein lõi DNA

(Nucleocapsid). Các virion được bao bọc một tinh thể dạng lưới có bản chất protein

được gọi là thể vùi (Inclusion Body - IB). Hệ gen của Baculovirut bao gồm một sợ đôi

DNA vòng với trọng lượng phân tử từ 50 - 100 x 106.

Theo Kelly (1985), Baculovirus bao gồm một số loại sau:

- Virus đa diện nhân (Nuclear polyhedrosis virus - NPV) là virus gây bệnh cho

côn trùng có thể protein hình khối đa diện, trong chứa nhiều hạt virus (virion)

hình que.

- Virus hạt (Granulos virus - GV) là virus có thể protein dạng hạt hoặc dạng viên,

trong chỉ chứa 1 virion, rất hiếm khi có hai virion. Virion hình que, chúng xâm

nhiễm chủ yếu vào tế bào lớp hạ bì, mô mỡ và huyết tương. Nuclear polyhedrosis

virus (NPV) và Granulosis virus (GV) với virion có các thể vùi (PIB) dạng

protein tinh thể được gọi là polyhedral và granulin.

- Virus có các thể protein khác nhau và cũng chứa các virion.

- Virus không tạo thành thể vùi hoặc rất mỏng (virus không thể tạo thể protein).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Triệu chứng sâu bị nhiễm bệnh do NPV: Sâu bị bệnh do NPV trở nên ít hoạt

động, ngừng ăn. Cơ thể chúng có màu sắc trắng hơn hoặc vàng hơn ở vùng ruột. Cơ thể

căng phồng, trương phù, chứa nhiều nước. Sau khi chết thân sâu chuyển từ màu nâu

sang màu đen, da dễ bị nứt vỡ khi có tác động cơ học, dịch virus giải phóng ra ngoài có

mùi rất thối.

1.2.4.2. Nhóm Cytoplasmic polyhedrosis virus - CPV (Reoviridae)

Nhóm virus đa diện tế bào chất (CPV) gây bệnh cho hơn 200 loài côn trùng, chủ

yêu đối với bộ Lepidoptera và Diptera. Virus trong họ Reoviridae có đặc điểm hình

thái giống virus của NPV, nhưng chúng khác ở chổ chúng chứa sợi đôi RNA trong bộ

gen. CPV tạo thành các thể protein chứa các virion hình cầu có đường kính 50 - 65 nm

(hoặc 68 - 69 nm). Các virion có một số gai ở đỉnh với chiều dài 20 nm. Trong thể vùi

có thể bao gồm một hay nhiều virion. Mạng lưới protein của thể vùi phần lớn chỉ có

một polypeptide, trọng lượng phân tử là 25.000 - 31.000 kDa. Trong bộ gen của virus

CPV có sợi đôi RNA gồm 10 đoạn có trọng lượng phân tử 0,34 - 2,59 x 106. Người ta

cho rằng mỗi đoạn có một gen. Dựa trên cơ sở phân đoạn của bộ gen, có ít nhất 12 loại

(tip) của CPV được phân loại.

Triệu chứng sâu chết do CPV: biểu hiện kém ăn, còi cọc, đôi khi phần đầu quá to

so với cơ thể, ở giai đoạn cuối cùng của bệnh, màu sắc cơ thể sâu bị biến đổi, thường

trở nên trắng hoặc vàng. Những triệu chứng khác bao gồm sự phát triển kéo dài và

giảm ăn dẫn đến chết.

1.2.4.3. Nhóm iridovirut (iridoviridae)

Đặc điểm chủ yếu của nhóm này là phát ngủ sắc từ màu xanh, xanh lam, đến màu

tím trong các cá thể bị nhiễm. Các virion, bao gồm một lõi sợi đôi DNA, kích thước từ

130 - 180 nm và khi được sắp xếp trong dãy tinh thể thì biểu hiện phát màu ngũ sắc đặc

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

trưng của nhóm này. Có ít nhất 32 typ của nhóm iridoviridae được phát hiện dựa trên

kích thước và mối quan hệ huyết thanh.

1.2.4.4. Nhóm Densevirut (Parvoviridae)

Người ta mới phát hiện densevirut chỉ có ở trên loài côn trùng: Galleria

mellonella, Junoia coenia và Agraulis vanillae. Virion chứa sợi đơn DNA có trọng

lượng phân tử từ 1,6 - 2,2 x 106. Densovirut là những virus nhỏ nhất có đường kính

khoảng 18 - 26 nm. Dựa trên cơ sở hình thái các virion và triệu chứng nhiễm bệnh,

nhóm này chia thành typ 1 (nhiễm bệnh và chết nhanh) và typ 2 (chỉ nhiễm trong ruột

và chết tương đối chậm).

1.2.4.5. Nhóm các virut RNA (picornaviridae)

Nhóm virut có sợi đơn RNA này có hạt virut kích thước 20 - 30 nm. Phần lớn các

virut RNA được tách chiết từ nhiều loại côn trùng, chúng ký sinh trong tế bào chất và

biểu mô tế bào ruột không tạo thể vùi. Người ta nhận thấy sự giống nhau của virut này

với picornavirut, đặc biệt giống Enterovirut ký sinh ở động vật có xương sống.

1.2.4.6. Nhóm sigmavirut (Rhabdoviridae)

Virut sigma là một tác nhân gây nhiễm di truyền có mặt thường xuyên trong quần

thể sâu Drosophila melanogaster. Các hạt virut hình gậy với kích thước 75 x 200 nm

với các gai trên bề mặt có chiều dài 8nm. Triệu chứng duy nhất đối với virut này là sự

mẫn cảm của các ruồi dấm trưởng thành với CO2.

1.2.4.7. Nhóm ascoviridae

Virut thuộc nhóm này có bộ gen gồm một sợi đôi DNA không có thể vùi. Hạt

virion có kích thước 130 x 400 nm có cấu trúc phức tạp. Virut chỉ ký sinh trong côn

trùng thuộc bộ cánh vảy - Lepidoptera. Nhóm virut này gây bệnh kém.

1.2.5. Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NPV thuộc nhóm Baculovirus, họ Baculoviridae, nên nó mang những đặc điểm

cấu tạo đặc trưng của họ này.

NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau.

Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi.

1.2.5.1. Cấu trúc

Hình1.8: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al,2003)

Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que, kích thước từ 35 - 50 nm x 200 -

320 nm có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ capsid, nếu là

một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn - Single Nucleocapsid (NPV -

SNPV), nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắc là Deoxyribo

Nucleo Protein - DNP). Thể vùi đa diện là những khối kết tinh có nhiều cạnh, có dạng

gần giống như hình cầu.

Phân tử DNA gồm hai sợi có dạng vòng, dài khoảng 40 µm (Burgess, S., 1977)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một phân tử DNA, phân tử DNA có chiều dài gấp 2 -

3 lần chiều dài nucleocapsid (Skuratovskaya et al, 1977).

* Cấu tạo deoxyribo nucleo protein (DNP):

Theo kết quả nghiên cứu của Bud, H.M et al (1977) DNP được tạo thành do sự

kết hợp giữa DNA và protein, sự kết hợp này không đồng nhất. Đường kính DNP đo

được 32 nm. DNP ở trong capsid được sắp xếp chắc chắn, gọn gàng.

* Cấu tạo của nucleocapsid:

Nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm,

có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao gồm hai loại protein, đó là một lõi

DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al,

1978).

* Cấu tạo của thể virus:

Thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao có thể có

một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid. Lớp vỏ bao gồm có lipid,

trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C., 1982, 1985).

* Cấu tạo của khối đa diện (polyhedra):

Theo Crook, N.E. et al (1982) thì polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích

thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều

hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt

cáo. Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide. Protein polyhedron có trọng lượng

phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H.,

1963 Harrap, K.A., 1972). Polyhedra có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính, pH kiềm

9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M. et al ,1966).

1.2.5.2. Cơ chế gây bệnh của NPV

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Sau khi NPV vào cơ thể ký chủ côn trùng bằng đường tiêu hoá, sâu non ngừng

ăn. Cơ thể sâu biến đổi về màu sắc. Sau 1-2 ngày cơ thể sâu căng phồng, mọng nước.

Cơ thể có màu vàng hoặc trắng. Hạ bì dễ bị nứt, chuyển động chậm, chết nhanh. Ngoài

đồng ruộng sâu chết do virut thường quan sát thấy đầu chúc xuống dưới, dịch trắng

chảy ra ngoài

Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi thức ăn có chứa virus NPVs vào ruột sâu non,

cũng như Bacillus thuringiensis bằng con đường tiêu hóa virus đã thực hiện quá trình

hủy toàn bộ chức năng của sâu làm sâu chết. Cơ chế được mô tả như sau: khi vào ruột

các thể vùi PIB của virus sẽ giải phóng ra các virion, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa,

qua biểu bì mô ruột giữa, các virion xâm nhập vào dịch huyết tương, chúng tiếp xúc

với các tế bào và xâm nhập vào bên trong để thực hiện quá trình gây bệnh cho sâu hại,

quá trình này trải qua 3 giai đoạn:

- Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài từ 6 - 12 giờ, đây là giai đoạn xâm nhập của các thể

vùi polyhedral inclusion body xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng

thích ra, chúng tự đính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột

của sâu.

- Giai đoạn tăng trưởng (sinh sản): kéo dài 12 - 48 giờ, đây là giai đoạn tăng

nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu. Đối với sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32

giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần.

- Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn tạo thể vùi tức là các thể virion được bao bọc

trong thể protein, côn trùng trong giai đoạn này có màu sáng bóng, màu sắc nhạt

và đôi khi có màu hồng. Sự phân giải tế bào và sự phân giải của mô cơ thể bắt

đầu ngay sau khi virus tạo thể vùi.

Thời kỳ ủ bệnh của các côn trùng bị bệnh thường kéo dài từ 3-12 ngày. Sâu tuổi

nhỏ chết trong khoảng 3 - 5 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm virus. Nhưng sâu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tuổi lớn thời gian ủ bệnh từ 4 - 6 ngày, có khi dài hơn phụ thuộc vào tuổi của vật chủ,

lượng thức ăn lây nhiễm, nhiệt độ, độ ẩm và các điều kiện khác của môi trường. Hết

thời kỳ ủ bệnh, sâu đã bị nhiễm bệnh hoàn toàn, cơ thể yếu dần rồi chết.

Ngay sau khi sâu chết sâu trở nên mềm nhũn, da bị vỡ và giải phóng ra hàng tỷ

thể vùi bám trên các bộ phận của cây trồng, đó là nguồn virus lan truyền sang cá thể

khác.

1.2.5.3. Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus

Phần lớn các thể vùi của NPV được giải phóng từ cơ thể sâu bị bệnh đã rơi xuống

đất hoặc bám trên các bộ phận của thực vật tạo thành những nguồn virus lan truyền

bệnh.

Theo Chu Thị Thơm el al. (2006), việc lây truyền nguồn bệnh virus ở côn trùng

xảy ra theo 2 hướng:

Lây truyền ngang: nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một thế hệ trong

điều kiện bệnh phát thành dịch, nguồn virus có thể bám bên ngoài vỏ trứng của vật chủ.

Khi nở, ấu trùng gặm vỏ trứng chui ra và bị nhiễm nguồn bệnh.

Lây truyền dọc: là sự truyền bệnh qua trứng (qua phôi). Nhưng virus không tạo

thành thể vùi cũng có thể truyền bệnh qua trứng.

Ngoài ra, virus còn có thể nhiễm trực tiếp vào dịch máu qua các vết thương trên

cơ thể như vết chọc đẻ trứng của ong kí sinh, lỗ xâm nhiễm của một số ấu trùng kí sinh

vào bên trong cơ thể.

Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu đang được thực hiện để chứng minh rằng virus

có thể sống tiềm ẩn bên trong trứng của kí chủ để tạo ra khả năng lây bệnh hàng dọc.

1.2.5.4. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu khoang

Theo mô tả của Jayarasjs (1985):

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Trong thời gian 2-3 ngày đầu của thời kỳ ủ bệnh, sâu non bị nhiễm bệnh không

có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt và không có sự thay đổi về sức ăn.

- Các ngày sau, các đốt thân của sâu non căng phồng và mọng nước dần, sâu

chuyển động nhiều.

- Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ.

- Trước khi chết sâu thường trèo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây chúc đầu

xuống phía dưới.

- Dịch trắng chảy ra ngoài và sâu chết.

- Dịch trắng không có mùi hôi.

- Thời gian từ khi cơ thể mọng nước đến khi sâu chết không quá 1 ngày.

Hình1.9: Sâu khoang chết do nhiễm virus (http://udkhcnbinhduong.vn)

Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), từ việc khảo sát

những mẫu sâu thu được ở điều kiện ngoài đồng và trong phòng thí nghiệm ghi nhận

các triệu chứng như sau:

- Dạng 1: Sâu có màu trắng sang đôi khi vàng hồng, cơ thể căng phồng lên,

da dễ vỡ và dịch màu sữa không có mùi hôi.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Dạng 2: Sâu có màu đen, thân căng, da vỡ, dịch màu cà phê sữa, không hôi

hoặc có mùi hôi.

- Dạng 3: Sâu màu nâu đen hoặc đen, cơ thể căng phồng, da không vỡ chỉ

rách ở các ngắn trên thân, dịch màu nâu đen, không có hoặc có mùi hôi.

Nhộng sâu khoang bị nhiễm SpltNPV thường bị méo mó, chảy nước màu vàng,

rất mềm, dễ bị nhũn. Một số nhộng bị nhiễm có thể chết hoặc vũ hóa thì khả năng sinh

sản giảm và truyền virus sang trứng (Nguyễn Thị Diễm Trang, 2008).

1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực của virus và cách hạn chế khi sử dụng chế

phẩm virus

Tia cực tím của ánh sáng mặt trời là yếu tố quan trọng làm giảm hiệu lực của

NPV (Phạm Thị Thùy, 2004). Hầu hết những virus hiện diện trên lá sẽ bị bất hoạt trong

vòng vài ngày, nếu bị chiếu sáng trực tiếp liên tục thì có thể bị bất hoạt chỉ trong vòng

vài giờ (Evan, 1986). Người ta cũng phát hiện ra tia sáng có bước sóng ngắn 215-216

nm có khả năng khử hoạt tính PIB của NPV. Ignoffo, C.M. et al (1971) đã phát hiện :

Dưới tác dụng của ánh nắng mặt trời, thể vùi đa diện bị khử hoạt tính là do các

peroxide hoặc các gốc peroxide sản sinh từ các amino acid bị chiếu bức xạ bởi tia X.

Điều đó cho thấy sau khi phun càng nhiều ngày, hiệu lực của NPV trên cây càng giảm.

Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lực của NPV. Nhiệt

độ cao rất dễ làm giảm hoạt tính của virus. Kobayashi et al. (1981) đã tiến hành trên

chủng nhộng của con tằm (Bombyx mori) với NPV và quan sát chúng ở các nhiệt độ

khác nhau. Kết quả những con nhộng được chủng NPV khi được ủ ở 35oC thì sống lâu

hơn những con nhộng được ủ ở 25oC. Johnson et al. (1982) cũng thử nghiệm ảnh

hưởng của nhiệt độ cao lên loài Anticarsia gemmatalis, kết quả cho thấy ở nhiệt độ trên

32oC làm chậm tiến trình bệnh của ký chủ. Ở 40oC, tất cả các con sâu đều không phát

triển bệnh.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Knittel and Faibrother cũng đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên NPV của loài

Autographa californica đã chỉ ra rằng virus bị bất hoạt ngay lập tức ở pH = 2, và bị bất

hoạt trong vòng 1 giờ ở pH = 4. Virus bị suy yếu ở pH = 5 và sống sót ở pH = 6.

Ngoài ra, trong quần thể sâu hại tự nhiên côn trùng không chỉ bị một bệnh do một

loại virus gây ra mà còn bị nhiễm bệnh hỗn hợp của 2 loại virus. Thông thường đó là

hỗn hợp giữa NPV và CPV.

Tác động qua lại giữa các virus trong quá trình nhiễm bệnh biểu hiện theo ba

kiểu: Đồng tác động, tác động không phụ thuộc vào nhau và tác động gây nhiễu cho

nhau. Khi có hiện tượng đồng tác động các virus trong cùng một cơ thể vật chủ sẽ làm

tăng tỷ lệ chết của sâu và rút ngắn thời gian gây chết xuống 50%. Ngược lại hiện tượng

tác động nhiễu làm giảm hiệu lực gây bệnh của virus và làm giảm hiệu quả của chế

phẩm. Vì vậy chế phẩm NPV không được dùng trong quần thể sâu hại có bệnh CPV vì

giữa hai nhóm này thường có tác động nhiễu lên nhau.

1.2.5.5. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch

hại

Ưu Điểm:

- Hiệu lực diệt sâu của NPV tương đương như thuốc hóa học nhưng không độc

hại cho người và gia súc, thân thiện với môi trường.

- Không làm mất đi những nguồn tài nguyên sinh vật có ích như các loại ký sinh

thiên dịch và những vi sinh vật có lợi với con người.

- Chưa tạo nên tính kháng thuốc của sâu hại.

- Không ảnh hưởng đến chất lượng, phẩm chất nông sản, không ảnh hưởng đến

đất trồng, không khí trong môi trường.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Nếu sử dụng hợp lý, đúng phương pháp, đúng kỹ thuật trong điều kiện nhiệt độ

thích hợp sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao.

- Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp lứa

sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo.

- Hiệu lực diệt sâu của virus là không thay đổi theo thời gian.

Nhược Điểm:

- Chế phẩm virus rất khó bảo quản, chúng đòi hỏi điều kiện môi trường phải thích

hợp để giữ chúng ở trạng thái nghỉ, đồng thời sản phẩm rất dễ bị nhiễm vi khuẩn gây

thối.

- So với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của virus chậm hơn nhiều. Nông dân

muốn rằng sau khi phun thuốc thì sâu phải bị tiêu diệt ngay do đó chế phẩm virus chưa

được người dân ưa thích sử dụng.

- Phổ tác dụng của thuốc hẹp nên gặp khó khăn về vấn đề thương mại. Thường

trên cùng một mùa vụ có nhiều loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải

dùng mỗi loại thuốc cho một loài dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm

virus cũng khó khăn hơn thuốc hóa học vì virus phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng

không thể phát triển trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên.

- Do là tác nhân sinh học nên Baculovirus dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài

đồng không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm,…) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi

bằng thuốc hóa học

- NPV có công nghệ sản xuất phức tạp thủ công nên giá thành cao nên giá thành

cao ở Việt Nam.

1.3. Giới thiệu về phương pháp ly tâm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Ly tâm là quá trình sử dụng lực ly tâm để phân riêng các cấu tử có khối lượng

riêng khác nhau, thường là tách pha lỏng và pha rắn trong dịch huyền phù. Động lực

của quá trình này là lực ly tâm và yếu tố khác biệt để phân riêng là khối lượng riêng.

Sự khác biệt khối lượng riêng càng lớn thì quá trình phân riêng được thực hiện càng dễ

dàng.

Trong công nghệ vi sinh, phương pháp ly tâm thường được sử dụng để tinh sạch,

thu sinh khối sinh vật hay thu nhận sản phẩm lên men. Riêng đối với dịch gốc NPV

việc tinh sạch bằng phương pháp ly tâm có ý nghĩa rất quan trọng trong việc sản xuất

chế phẩm sau này. Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến việc sản xuất virus

kém hiệu quả là sử dụng nguồn dịch gốc kém chất lượng, không tinh khiết. Virus được

thu nhận từ cơ thể sâu ký chủ có thể chứa tới 90% chất gây ô nhiễm và chỉ chứa 10% là

virus. Vì vậy, dịch virus cần được ly tâm tinh sạch trước khi được đưa vào sản xuất hạn

chế sự nhiễm bẫn các mầm bệnh như nấm, vi sinh vật, GV…(Grzywacz et al, 2011).

Grzywacz cũng cho biết thêm, việc ly tâm tốt sẽ giúp loại bỏ vi khuẩn, protein,

chất béo cơ của cơ thể côn trùng và các chất ô nhiễm khác (chất thải của côn

trùng,da…). Chính các tác nhân này là nguyên nhân gây ra mùi hôi, và ảnh hưởng đến

hiệu quả diệt sâu của virus.

Phương pháp ly tâm tinh sạch virus sẽ phụ thuộc vào tính chất và độ tinh khiết

của dịch gốc. Trên thế giới đã có nhiều tác giả đưa ra nhiều phương pháp ly tâm khác

nhau. Ignoffo (1992) cho biết NPV cần trải qua hai lần ly tâm để tinh sạch, ly tâm lần

một với vận tốc 500 vòng/phút trong vòng 5 phút thu phần dịch nổi, loại bỏ cặn. Lần

hai tiến hành 12000 vòng/phút trong 5 phút thu phần cặn.

Jiang jie - Xian và Liu Juin - Jun (2002) cho rằng có thể loại bỏ xác sâu và các

thể tan trong dịch NPV bằng cách ly tâm hai lần, lần một 1000 vòng/phút trong vòng

10 phút và lần hai 7000 vòng/phút trong vòng 25 phút. Cũng với chế độ ly tâm này

Sanfeev et al (2005) thực hiện để thu nhận OB của Hyblaea puera NPV.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Cũng với hai lần ly tâm, Kao và Meher (2004) đã thu nhận PIB của virus trên

Helicovespa armigera NPV với tốc độ quay lần lượt 1000 vòng/phút trong vòng 1 phút

và 5000 vòng/phút trong vòng 15 phút.

Flávío et al (1997) cũng làm sạch virus bằng cách li tâm 2 lần , lần 1 ở 1500

vòng phút/ 2 phút và lần ở 7000 vòng/ phút trong 20 phút.

Khác với các tác giả ở trên, S. Arivudainambi et al (2000) thu nhận NPV của

S.litura bằng cách ly tâm 1 lần ở 6000 vòng/ phút trong 15 phút bỏ dịch nổi, thu cặn.

Kieu Trang et al (2002) cũng chỉ ly tâm 1 lần với vận tốc 6000 vòng/phút nhưng kéo

dài tới 1 giờ. Ly tâm trong vòng 5 phút với vận tốc 12000 vòng/phút là phương pháp

tinh sạch virus NPV của Sasumu Maeda et al (1990).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ ngày 25/5/2015 đến ngày 17/8/2015, tại

phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học của trường Đại Học Công

Nghệ TP HCM.

2.2 Vật liệu

2.2.1 Dụng cụ

- Hộp nuôi sâu

- Đĩa petri

- Panh, chổi lông bắt sâu

- Cân điện tử

- Máy xay sinh tố

- Các loại cốc thủy tinh

- Các loại pipep

- Đầu túyp

- Ống nghiệm

- Bút long ghi mẫu

- Bông gòn, khăn giấy

- Ống falcon, eppendorf

- Bao nhựa, giấy báo

- Đèn cồn

Thiết bị

- Kính hiển vi

- Buồng đếm hồng cầu

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Tủ lạnh

- Máy ly tâm

- Nồi hấp khử trùng

- Bếp từ

- Bể ủ

2.2.2 Hóa chất

- Acid ascorbic

- Acid sorbic

- Cồn 700, 960

- Methyl paraben

- Men mì

- Tinh bột tan

- Agar

- Môi trường tổng hợp PCA (Plate Count Agar)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dịch gốc tới chất lượng của

virus

2.3.1.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm gồm 3 CT được bố trí như sau:

CT1: Ly tâm một lần ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch, bỏ cặn

(Arivudainambi et al,2000)

CT2: Ly tâm hai lần, lần 1 500 vòng/phút trong 5 phút thu dịch bỏ cặn, lần 2 ly

tâm 5000 vòng/phút trong vòng 15 phút, thu cặn bỏ dịch (Theo khuyến cáo của ngành

nông nghiệp Ấn Độ).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CT đối chứng (Không ly tâm).

2.3.1.2 Tiến hành

Chuẩn bị dịch gốc virus NPV: NPV được phân lập bằng cách sử dụng sâu tuổi 4

để nhiễm virus bằng phương pháp nhiễm bề mặt trên thức ăn nhân tạo và để ở nhiệt độ

phòng cho đến khi sâu chết. Thu sâu chết và cho vào trong lọ (1 sâu/ml nước) và để ở

nhiệt độ phòng 1 ngày cho tới khi xác sâu rữa ra. Lọc qua 2 lớp vải mỏng để loại bỏ

xác sâu. Dịch gốc virus được bảo quản trong tủ lạnh.

Ly tâm: Dùng pipet lấy một lượng dịch gốc virus vừa đủ cho vào ống falcon. Sau

đó đem đi ly tâm với các vận tốc cần khảo sát. Dịch virus sau ly tâm sẽ tách lớp, tiến

hành loại bỏ phần cặn và định mức phần dịch nổi bằng nước cất sao cho đúng bằng

lượng dịch gốc ban đầu. Phần dịch nổi sau khi ly tâm ta tiến hành đánh giá các chỉ tiêu

*Tổng số vi sinh vật hiếu khí (cfu/ml) Tiến hành theo theo phương pháp đổ đĩa

dựa trên TCVN 5165-1990 có điều chỉnh một số thao tác cho phù hợp, cụ thể như sau:

Mổi công thức đổ 3 nồng độ, mỗi nồng độ 3 đĩa, lặp lại 3 lần.

Chuẩn bị:

- Môi trường nuôi cấy: Môi trường tổng hợp Plate Count Agar (PCA)

- Dịch pha loãng: Nước muối sinh lý 0.85%

Tiến hành: Dịch mẫu đem đi pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng

micropipette vô trùng hút 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã hấp

khử trùng lắc đều, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-1. Tiếp tục thực hiện tương tự để có

được các độ pha loãng cần thiết.

Sau khi pha loãng dịch mẫu, chọn 3 mẫu pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 25 -

250 tế bào vi sinh vật. Dùng micropipette hút 1ml dịch pha loãng vào đĩa petri vô

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

trùng. Tương ứng, với mỗi độ pha loãng ta cấy 3 đĩa. Sau khi cấy, ta đổ vào mỗi đĩa

10- 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 55 ± 50C. Trộn đều mẫu vào

môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ vài lần. Đặt

đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông. Đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ

25-250 để tính. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1ml dịch mẫu ban đầu được tính

theo công thức.

𝑁 A (CFU/ml) = n1Vf1 + … + niVfi

Trong đó: A: Số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

F: độ pha loãng tương ứng

55±50C

Mẫu đã pha loãng

1 ml

10-15 ml

Xoay đều

ủ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.1: Các bước tiến hành phương pháp đổ đĩa

* Kiểm tra hiệu lực diệt sâu của dịch virus áp dụng theo phương pháp lây nhiễm

bề mặt. trên thức ăn nhân tạo theo FAO (2011) và Lawrenceet al (2007).

Mỗi công thức nhiễm 20 sâu, lặp lại 3 lần.

Sâu non: Sâu non được lấy từ một ổ trứng của một ổ bướm và được nuôi bằng lá

thầu dầu cho đến tuổi cần thí nghiệm.

Thức ăn nhân tạo nuôi sâu: được pha chế theo công thức: M.A.Sorour et al (2011)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn nhân tạo

Thành phần Số lượng

Đậu trắng 200g

Tinh bột tan 30g

Men mì 30g

Ascorbic acid 3g

Methyl – paraben 1.9g

Sorbic acid 1g

Formalin 2cc

Nước cất 400ml

Agar 4g

Thức ăn sau khi được xay xong, đổ cẩn thận 100 ml thức ăn vào trong các hộp

nhựa kích thước 20x12x7cm, sao cho bề mặt thức ăn không bị rỗ để tránh sự phân bố

không đều của dịch nhiễm. Thức ăn được để nguội ở nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ

lạnh đến khi sử dụng mới lấy ra để tránh bị hư. Dùng micropipette cho vào mỗi hộp

thức ăn 1ml dịch NPV đã được pha loãng bằng nước cất để được 4 x 106 PIP/ml sau đó

dùng chổi lông để quét đều dịch virus lên bề mặt thức ăn. Đợi cho bề mặt thức ăn khô,

tiến hành chọn những cá thể sâu tuổi 3 để phơi nhiễm.

Phơi nhiễm sâu với thức ăn nhân tạo có virus trong vòng 2 ngày. Sau đó, chuyển

sâu sang thức ăn mới không nhiễm virus và theo dõi cho đến khi sâu chết hết.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Hiệu lực diệt sâu trong phòng được tính theo công thức công thức Abbott

(1925).

) x 100 Hiệu lực diệt sâu: H% = (1 − 𝑇 𝐶𝑜

Trong đó:

+ H: tỷ lệ sâu chết (%)

+ T: số sâu sống ở các nghiệm thức sau thí nghiệm

+ Co: số sâu sống ở nghiệm thức đối chứng sau thí nghiệm

* Chú ý: Trong thí nghiệm này, ta tiến hành thêm một công thức gọi là mẫu trắng.

công thức này không quét dịch virus lên thức ăn, mà chỉ quét nước cất vô trùng.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.2: A: Hộp nhựa 20x12x7 cm; B: Sau khi cho thức ăn nhân tạo; C: Sâu được nuôi

trong thức ăn nhân tạo sau khi quét dịch virus

2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể

hòa tan

2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo các công thức sau:

CT1: Ly tâm 500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

CT2: Ly tâm 1000 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

CT3: Ly tâm 1500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

CT4: Ly tâm 2500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

ĐC: Dịch gốc (không ly tâm).

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.2.2 Tiến hành

Thí nghiệm được tiến hành và theo dõi tương tự như thí nghiêm 1 có theo dõi thêm

chỉ tiêu mật độ virus.

* Mật độ virus (PIB/ml) tiến hành theo phương pháp xác định số lượng bào tử bằng

buồng đếm hồng cầu.(Nguyễn Đức Lượng, 2005).

Là phương pháp định lượng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào

vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm.

Hình 2.3: Buồng đếm hồng cầu

Nguyên tắc cấu tạo của buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia

thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này, có kẽ

một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông. Mỗi ô vuông lại được chia thành 16 ô vuông

nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích

một ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay 1/4000.000 ml. buồng đếm có lá kính dày để đậy.

Tiến hành:

Pha loãng mẫu (dịch virus) đã ly tâm theo dãy thập phân sao cho nồng độ dịch

huyền phù pha loãng có mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 bào tử. Số bào tử đếm

được trong 5 ô phải lớn hơn 200 mới đảm bảo tính chính xác của phương pháp.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

- Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu.

- Đậy lá kính lên lưới đếm

Hình 2.4: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu

- Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao

dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm, chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm

hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh.

- Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến

hành đếm trong 5 ô lớn chéo nhau (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa).

- Sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm. Chỉnh thật rõ sau đó chuyển sang

vật kính x 40 để đếm.

- Điều chỉnh cường độ ánh sáng sao cho để có thể nhìn rõ tế bào lẫn các đường

kẻ.

* Chú ý: Ta sẽ đếm tế bào trong mỗi ô lớn như sau, ta sẽ đếm theo hình zigzag,

đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều, mỗi ô nhỏ có 4

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

cạnh giới hạn, ta chỉ đếm những tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2

cạnh bên trái và ở trên (hình 2.3).

Hình 2.5: Quy tắc đếm bằng buồng đếm hồng cầu

Số PIB/ml dịch mẫu ban đầu được tính theo công thức:

𝐴.4000.1000.𝑛 N= 𝐵

Trong đó:

N: Số lượng bào tử trong 1 ml huyền phù.

A : Số lượng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con).

B : Số ô con trong 5 ô lớn (16 ô X 5 = 80 ô con).

1000 : Số chuyển mm3 thành ml ( 1000mm3 = 1 ml)

n : Số lần pha loãng dịch huyền phù.

4000 = 400*10 (1/400 mm2 : diện tích 1 ô nhỏ; 1/10 chiều cao từ mặt buồng đếm

tới lammelle)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 2.6: Hình dáng virus trên buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X)

2.3.3 Thí nghiệm 3:Xác định số vòng ly tâm lần thứ 2 để tinh sạch NPV

2.3.3.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với các CT sau:

CT5: Ly tâm lần 1: 500 vòng/5 phút loại cặn, thu dịch. Ly tâm lần 2: 5000

vòng/15 phút, thu cặn, bỏ dịch.

CT6: Ly tâm lần 1: 500 vòng/5 phút loại cặn, thu dịch. Ly tâm lần 2: 10000

vòng/15 phút, thu cặn, bỏ dịch.

CT7: Ly tâm lần 1: 500 vòng/5 phút loại cặn, thu dịch. Ly tâm lần 2: 12000

vòng/15 phút, thu cặn, bỏ dịch.

ĐC: Dịch gốc (không ly tâm).

2.3.3.2 Tiến hành

Tiến hành theo theo dõi 3 chỉ tiêu như ở thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2

Sau khi có kết quả của thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3 ta sẽ dự đoán và chọn ra một

công thức triển vọng để tiếp tục tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu

khí, số PIB và hiệu lực diệt sâu.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu đều được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics

Centurion XVI.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 . Ảnh hưởng của dịch gốc đến hiệu quả nhân NPV trong sâu khoang

Dịch gốc virus sẽ ảnh hưởng rất nhiều tới việc sản xuất NPV. Mục đích của

thí nghiệm này là tìm hiểu sự ảnh hưởng của dịch gốc lên hiệu lực diệt sâu của

virus. Đồng thời khảo sát và đánh giá việc tinh sạch bằng phương phương pháp ly

tâm có ý nghĩa như thế nào trong việc tinh sạch virus. Từ đó sẽ đưa ra phương pháp

tinh sạch thích hợp cho nguồn dịch gốc.

Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy, ở công thức nhiễm

dịch thô, sâu chết chậm và rãi rác hơn so với công thức nhiễm dịch đã ly tâm. Công

thức ly tâm 1 lần và 2 lần, sâu chết nhanh và tập trung vào ngày thứ 7 sau khi

nhiễm, thuận lợi cho việc thu nhận sâu chết trong việc sản xuất NPV. Trái lại, sâu

chết rãi rác, làm ảnh hưởng đến việc thu nhận sâu chết. Ngoài ra, số liệu ở bảng 3.2

cũng cho thấy so với không ly tâm, hiệu lực diệt sâu cả hai công thức ly tâm 1 lần

và ly tâm 2 lần đều rất cao. Chọn ngày thứ 8 sau khi phơi nhiễm làm điển hình, kết

quả xử lý số liệu ở bảng 3.2 cho thấy cả hai công thức ly tâm đều có hiệu lực ≥ 95%

trong khi dịch gốc không được ly tâm chỉ dừng lại ở con số 60%. Sự chênh lệch là

quá cao và hoàn toàn có ý nghĩa thống kê. Giải thích điều này, kết quả theo dõi thực

tế cho thấy, ở công thức không ly tâm, thức ăn có mùi hôi và bị biến màu nhanh

hơn các công thức còn lại nên sâu ăn ít hơn hẳn. Ở các công thức nhiễm bằng dịch

ly tâm, sâu ăn nhiều, lượng virus đưa vào nhiều nên sâu chết nhanh và nhiều hơn so

với công thức không ly tâm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.1 Số sâu chết sau các ngày phơi nhiễm dịch NPV (con)

CT Số sâu chết ở các ngày sau nhiễm

6 NSN 7 NSN 8 NSN 9 NSN 10 NSN

CT1 4 9,667 3 0 0

CT2 5,333 10 2,667 0 0

CT KLT 1,667 4,667 5,667 4,333 2

Không li tâm

Li tâm 1 lần

Li tâm 2 lần

Ngày 6

Ngày 7

Ngày 8

Ngày 9

Ngày 10

Ghi chú: NSN: ngày sau nhiễm

Hình 3.1: Diễn biến số sâu chết qua các ngày phơi nhiễm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.2 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV

Công thức Hiệu lực diệt sâu (%) ở các ngày sau nhiễm

7 NSN 8 NSN 9 NSN

CT1 (Ly tâm 1 lần 95 ± 5,0a 6 NSN 20 80 96,667

85 CT2 (Ly tâm 2 lần) 26,667 98,333 ± 2,887a 96,667

CT (KLT) 8,333 31,667 60 ± 10b 81,667

* Ghi chú: Số liệu trong các bảng được tính giá trị trung bình của các lần lặp

lại ± SD trong cùng một cột có cùng chữ theo sau thì khác biệt không ý nghĩa.

Những cột có chữ “ns (non sighnificant)” thì số liệu trong cột đó cũng không có sự

khác biệt, với độ tin cậy 95%

Bảng 3.3 Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong dịch virus

TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ CT

(x 109cfu/ml)

CT1 0,134 ± 0,056b

CT2 0,0956 ± 0,0340b

ĐC (KLT) 1,1 ± 0,0404a

Xét chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí, ta thấy tổng vi sinh vật trong dịch NPV

(bảng 3.3) không trải qua quá trình ly tâm là cao so với hai công thức ly tâm.

Trong khi, lượng vi sinh vật ở công thức 1 và công thức 2 lần lượt là 1,34 x108 và

9,56 x107, còn ở công thức đối chứng, lượng vi sinh vật đạt tới 1,1 x109, cao hơn

khoảng 10 lần. Và sự chênh lệch này là có ý nghĩa.

Như vậy, chỉ cần theo dõi và đánh giá thông qua 2 chỉ tiêu hiệu lực diệt sâu và

tổng vi sinh vật hiếu khí, ta cũng đủ thấy rằng: dịch gốc nếu trải qua quá trình ly

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

tâm tinh sạch thì hiệu lực diệt sâu sẽ cao hơn, sâu chết tập trung hơn đồng thời

lượng vi sinh vật hiếu khí sẽ giảm xuống. Từ đó, chất lượng virus sẽ được nâng lên

rõ rệt. Chính vì vậy, nhằm tìm ra chế độ ly tâm phù hợp nhất để loại bỏ những tác

nhân ảnh hưởng đến chất lượng virus đồng thời cải thiện chất lượng virus, sinh viên

tiếp tục tiến hành các thí nghiệm xác định công thức ly tâm phù hợp để loại bỏ xác

sâu và vi sinh vật hiều khí, nâng cao hoạt tính virus.

3.2 . Xác định số vòng ly tâm phù hợp để loại bỏ xác sâu và các thể hòa tan

Qua thí nghiệm ở trên ta nhận thấy rằng: sâu chết do nhiễm virus sẽ được thu

nhận, xử lý để sản xuất thành nguồn virus mới. Nguồn virus mới này càng “sạch” thì

hiệu lực diệt sâu càng cao. Khi nguồn virus không được xử lý “sạch” thì xác sâu chứa

các chất dinh dưỡng như protein, lipid,… sẽ trở thành môi trường lý tưởng cho sự phát

triển của các vi khuẩn. Điều này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng của nguồn virus.

Không những vậy khi nguồn virus càng ít “sạch” thì khi trộn với thức ăn nhân nuôi,

thức ăn càng dễ bị hư hỏng, dẫn đến làm giảm độ bền của virus, do đó giảm hiệu quả

diệt sâu, cũng như đem đến nguy cơ gây ô nhiễm vi sinh vật cho môi trường (Lasa R. et

al., 2008). Một trong những phương pháp trích ly hiệu quả virus NPV là phương pháp

ly tâm (Grzywacz et al, 2011). Lực ly tâm nhỏ với số vòng < 4000 vòng/ xác sâu với

khối lương lớn sẽ lắng xuống bên dưới, virus sẽ nằm trong phần dịch nổi bên trên. Vì

vậy ta dễ dàng loại bỏ được xác sâu. Thí nghiệm được tiến hành ở các tốc độ ly tâm

khác nhau 500, 1000, 1500, và 2500 vòng/ phút với mục đích tìm ra công thức ly tâm

phù hợp nhất để loại bỏ xác sâu nhưng lại không làm ảnh hưởng quá nhiều tới chất

lượng của virus.

Kết quả thí nghiệm cho thấy, so với đối chứng (không ly tâm), các công thức tăng

dần tốc độ ly tâm, tổng số vi sinh vật hiếu khí giảm rõ rệt. Nếu lấy số lượng VSV hiếu

khí trong mẫu đối chứng làm chuẩn 100 % (11,4 ± 31,6 x 109 cfu/ml) thì ở CT1 (500 v/

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

phút), tổng vi sinh vật hiếu khi vẫn không thay đổi nhiều bởi vì khi ly tâm ở tốc độ nhỏ,

dịch virus không phân lớp rõ nên không thể loại bỏ được xác sâu nhiều, vì vậy hai công

thức này sai khác không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 3.4). Khi tăng vận tốc ly

tâm lên 1000 v/phút thì tổng số vi sinh vật hiếu khí giảm từ 11,4 x 109 còn 4,23 x 109

cfu/ml giảm tới 7,17 x109 và sai khác đã có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tương tự như

vậy, tiếp tục tăng vận tốc ly tâm lên 1500 v/phút ở công thức 3 và 2500 v/phút ở công

thức 4, tổng vi sinh vật hiếu khí tiếp tục giảm mạnh chỉ còn 0,97 x 109 cfu/ml và 0,76 x

109 cfu/ml, và hai công thức này hoàn toàn có sai khác so với các công thức trước đó,

tuy nhiên sai khác giữa công thức 3 và công thức 4 lại không có ý nghĩa thống kê. Điều

này có thể giải thích như sau, tổng số vi sinh vật hiếu khí sẽ giảm đến một giá trị nhất

định nào đó thì sẽ không thay đổi nhiều nữa nếu như không có sự tăng đột phá vận tốc

ly tâm.Vì vậy, ta nếu muốn giảm một lượng đáng kể vi sinh vật hiếu khí ta nên tăng

mạnh vận tốc ly tâm.

Bảng 3.4 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi ly tâm lần 1

Công thức Tổng vi sinh vật hiếu Tổng VSV hiếu khí/ml

khí (x 109 CFU/ml) chuyển đổi sang Log (x+1)

Không ly tâm (Đ/C) 11,4 ± 3,16 10,05 ± 0,13 a

CT1:500 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 12,7 ±1,99 10,10 ± 0,07 a

CT2:1000 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 4,23 ± 3,03 9,56 ± 0,29 b

CT3: 1500 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 0,97 ± 0,17 8,98 ± 0,08 c

CT4:2500 v/5 phút, loại cặn, thu dịch 0,76 ± 0,22 8,87 ± 0,12 c

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SỐ VSV

1.60E+10

1.40E+10

1.20E+10

1.00E+10

8.00E+09

SỐ VSV

6.00E+09

4.00E+09

2.00E+09

0.00E+00

CT1

CT2

CT3

CT4

DC (KLT)

-2.00E+09

Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV

Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA

Mặc khác, khi ta tăng dần vận tốc ly tâm, ta cũng cần phải quan tâm đến chỉ tiêu

thể hiện chất lượng của virus, đó chính là số PIB có trong dịch. Vì rất có thể khi tăng

vận tốc ly tâm, tổng số vi sinh vật hiếu khí sẽ giảm đồng thời cũng sẽ ảnh hưởng tới số

PIB thu hồi.

Xét bảng 3.5 ta thấy, khi ly tâm với vận tốc lần lượt 500, 1000, 1500 v/phút thì

số PIB thu hồi có giảm nhưng con số là không đáng kể và không có sự sai khác so với

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

công thức đối chứng (không có ý nghĩa thống kê), Nhưng khi tăng vận tốc ly tâm lên

2500 v/phút, số PIB đã giảm còn 1,30 x109 trong khi công thức đối chứng là 1.99 x 109

và sai khác này đã có ý nghĩa thống kê (p<0,05), Nguyên nhân chính là do số vòng ly

tâm cao làm cho dịch virus phân lớp mạnh, lượng PIB lẫn trong lớp cặn bị thất thoát

nhiều. Như vậy, dựa vào những số liệu trên có thể nhận định, khi ly tâm với vận tốc

1500 v/phút (CT3) để thu hồi virus trong dịch nổi sẽ không làm giảm số PIB nhưng lại

giảm đáng kể tổng VSV hiếu khí.

Như vậy, so với các công thức còn lại CT3 là công thức ly tâm loại bỏ xác sâu phù

hợp.

Bảng 3.5 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ li tâm

Công thức Số PIB (x 109PIB/ml)

Số PIB/ml chuyển đổi sang Log (x+1)

Không li tâm (Đ/C) 1,99 ± 0, 68 9,27744 ± 0,172 a

1,77 ± 0,03 9,24711 ± 0,008 ab

CT1: 500vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

1,77 ±0,18 9,24526 ± 0,05 ab

CT2:1000 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

1,54 ±0,81 9,18618 ± 0,023 ab

CT3:1500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

1,30 ± 0,06 9,11357 ± 0,022 b

CT4:2500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.4: PIB virus trong buồng đếm hồng cầu (vật kính 40X)

SỐ PIB

3.00E+09

2.50E+09

2.00E+09

1.50E+09

SỐ PIB

1.00E+09

5.00E+08

0.00E+00

CT1

CT2

CT3

CT4

DC (KLT)

Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus ở các CT ly tâm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Để làm rõ thêm điều này, ta tiến hành đánh giá hiệu lực diệt sâu của các

công thức (sau khi điều chỉnh nồng độ virus như nhau giữa các công thức).

Thông qua kết quả bảng 3.6, 3.7 và hình 3.7, ta thấy lượng vi sinh vật hiếu khí

có trong dịch virus hoàn toàn có ảnh hưởng tới hiệu lực diệt sâu. Cụ thể như

sau, hiệu lực diệt sâu của các công thức tăng dần từ ngày thứ 6 tới ngày thứ 11

và tăng vọt từ ngày 8 chuyển sang ngày 9. Nếu ta chọn đại diện ngày cuối cùng

(ngày thứ 11) để so sánh thì dễ dàng thấy rằng ởcông thức đối chứng ( không ly

tâm) và công thức 1 ly tâm với vận tốc quá nhỏ (chỉ loại bỏ được một phần ít

xác sâu) thì lượng vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus nhiều hơn đáng kể so

với các công thức còn lại nên cho hiệu quả diệt sâu kém hơn (chỉ đạt ở mức

87,78% và 88,33%), nhưng khi tăng số vòng ly tâm lên 1000v/phút lượng vi

sinh vật giảm còn 4,23 x109cfu/ml đồng thời hiệu quả diệt sâu tăng 94,5%. Và

khi tăng vận tốc lên 1500v/phút (công thức 3) thì lượng vi sinh vật thấp nhất

(0,97 x109 cfu/ml),hiệu lực diệt sâu của công thức 3 cao nhất và đạt tới 97,22%.

Và so với công thức đối chứng, công thức 1 và cả công thức, thì sự sai khác về

hiệu lực diệt sâu của công thức 3 với các công thức này là có ý nghĩa. Mặc dù so

với công thức 2, sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng tổng

hợp dữ liệu từ những gì ta có được thì công thức 3 là thích hợp nhất khi ta tiến

hành ly tâm loại bỏ sác sâu, và loại bỏ một phần tổng vi sinh vật hiếu khí

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.6 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch NPV

Công thức Hiệu lực diệt sâu (%) ở các ngày sau nhiễm

4 NSN 6 NSN 7 NSN 8 NSN 9 NSN 10 NSN 11 NSN

CT1 0 15,757 28,787 43,183 70,077 78,89 88,333b

CT2 0 39,593 63,807 69,363 74,243 85 94,447ab

CT3 0 30,453 53,34 58,713 71,717 93,89 97,223a

CT4 0 24,393 34,34 48,74 68,687 82,777 88,333b

120

100

CT1

CT2

CT3

CT5

CT10 (KLT)

0 DC(KLT) 21,887 38,973 45,453 45,453 72,777 87,777b

Hình 3.6: Hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch virus ở các công thức ly tâm

Công thức Số PIB/ml chuyển sang Log đổi (x+1) Hiệu lực diệt sâu (%) sau 11 ngày phơi nhiễm.

Tổng vi sinh vật hiếu khí/ml chuyển đổi sang Log (x+1)

Không li tâm (Đ/C) 10,05 ± 0,13 a 9,27744a 87.78 ± 2.22 b

10,10 ± 0,07 a 9,24711 ab 88.33 ± 1.67 b

CT1: 500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

9,56 ± 0,29 b 9,24526 ab 94.44 ± 2.22 ab

CT2: 1000 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

8,98 ± 0,08 b 9,18618 ab 97,22 ± 1.47 a

CT3: 1500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

8,87 ± 0,12 b 9,11357 b 88.33 ± 4.41 b

CT4: 2500 vòng/5 phút, loại cặn, thu dịch

Như vậy, trong số các công thức khảo sát thì công thức ly tâm 1 lần: 1500

vòng/phút (trong vòng 5 phút) thu dịch nổi, cho kết quả tốt hơn hẳn so với đối

chứng vì không làm giảm số PIB nhưng lại loại bỏ vi sinh vật hiếu khí tốt hơn và

tăng hiệu lực diệt sâu của NPV.

10.2

9.8

9.6

9.4

SỐ VSV

9.2

SỐ PIB

HIỆU LỰC DIỆT SÂU

8.8

8.6

8.4

8.2

CT1

CT2

CT3

CT4

DC (KLT)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.7: So sánh hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của các

công thức

3.3 Xác định số vòng ly tâm lần 2 để tinh sạch virus NPV

Mục đích của thí nghiệm này là một lần nữa loại bỏ lượng vi sinh vật hiếu khí

xuống mức thấp nhất vì ở thí nghiệm ly tâm lần nhất lượng vi sinh vật hiếu khí còn lại

vẫn còn khá cao (xấp xỉ 90%), chất lượng dịch virus chưa được nâng lên đáng kể. Vì

vậy lần này, sẽ kết hợp 2 lần ly tâm, ly tâm lần 1 vẫn giữ nguyên vận tốc 500v/phút, ly

tâm lần 2 tăng dần vận tốc 5000v/phút, 10000v/phút và 12000v/phút. Như đã nói, việc

ly tâm lần 1 với số vòng ly tâm nhỏ nhằm loại bỏ các mảnh xác sâu lớn, thu dịch nổi

chứa virus. Ly tâm lần 2 với vận tốc ly tâm lớn (>4000v/phút) sẽ thu virus ở dạng cặn,

loại bỏ các hạt lipid hoặc nhũ tương nhỏ còn sót lại, một lần nữa làm sạch dịch virus.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.8 Tổng vi sinh vật hiếu khí trong dịch NPV sau khi ly tâm lần 2

Công thức Tổng vi sinh vật hiếu khí (x 109 CFU/ml)

Tổng vi sinh vật hiếu khí/ml chuyển đổi sang Log (x+1) 10,05 ± 0,13 a 11,4 ± 3,16 Không li tâm (Đ/C)

8,28 ±0,23 b 0,21 ± 0,10

CT5: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15phút, thu cặn.

0,39 ± 0,18 8,55 ± 0,24 b

CT6: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:10000 vòng/15 phút, thu cặn.

8,58 ±0,30 b 0,44 ± 0,24

CT7: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:12.000 vòng/15 phút, thu cặn.

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

1.60E+10

1.40E+10

1.20E+10

1.00E+10

8.00E+09

SỐ VSV

6.00E+09

4.00E+09

2.00E+09

0.00E+00

CT5

CT6

CT7

DC (KLT)

Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tổng số vi sinh vật hiếu khí của dịch virus NPV

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Từ kết quả trong bảng 3.8 và hình 3.8 ,ta dễ dàng nhận thấy việc ly tâm 2

lần như vậy cho kết quả rất khả quan, tổng vi sinh vật hiếu khí giảm rõ rệt so với

mẫu đối chứng không qua ly tâm. Cụ thể như sau: lượng vi sinh vật hiếu khí ở 3

công thức ly tâm 5000v/phút, 10000v/phút, và 12000v/phút giảm xuống còn 82

– 85%. Mặc dù sự sai khác giữa 3 các công thức này không có ý nghĩa thống kê

nhưng lương vi sinh vật hiếu khí thấp hơn nhiều so với các công thức ở thí

nghiệm ly tâm 1 lần. Điều này đã phần nào chứng tỏ được việc kết hợp 2 lần ly

tâm sẽ cho kết quả cao hơn so với 1 lần ly tâm .

Bảng 3.9 Số PIB của dịch virus NPV ở các chế độ ly tâm

Công thức

Số PIB (x 109PIB/ml) Số PIB/ml chuyển đổi sang Log (x+1)

Không li tâm (Đ/C) 1,99 ± 0, 68 9,27744 ± 0,172 ns

1,36 ± 0,03 9,13453 ± 0,01 ns

CT5: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn.

1,50 ± 0,13 9,17511 ± 0,036 ns

CT6: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:10000 vòng/15 phút, thu cặn.

1,66 ± 0,06 9,219 ± 0,018 ns

CT7: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:12.000 vòng/15 phút, thu cặn.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SỐ PIB

3.00E+09

2.50E+09

2.00E+09

1.50E+09

SỐ PIB

1.00E+09

5.00E+08

0.00E+00

CT5

CT6

CT7

DC (KLT)

Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện lượng PIB trong dịch virus NPV

Mặc khác kết quả từ bảng 3.9 cũng đã thể hiện, lương PIB thu hồi sau khi ly tâm

vẫn giữ ở mức cao (99% so với mẫu đối chứng) và sự sai khác giữa các công thức ly

tâm là không có ý nghĩa. Cụ thể lượng PIB thu hồi ở cong thức 5, 6 và 7 lần lượt là

1,36 x 109,1,5 x 109 và 1,66 x 109. Điều này cho thấy lượng PIB thu hồi tồn tại trong

phần cặn của dịch virus khi ly tâm và do vận tốc ly tâm lần 1 quyết định. Ở thí nghiệm

ly tâm lần hai ta loại bỏ phần dịch nổi, thu phần cặn nên lượng PIB sẽ gần như không

bị hao hụt.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.10: Sâu chết với các dấu hiệu đặc trưng của nhiễm virus

Bảng 3.10 Hiệu lực diệt sâu (%) của các công thức ở các ngày sau nhiễm

Hiệu lực diệt sâu (%) ở các ngày sau nhiễm Công thức 4 NSN 6 NSN 7 NSN 8 NSN 9 NSN 10 NSN 11 NSN

16,05 52,443 73,107 81,693 91,11 97,223ns CT5 0

40,15 62,88 71,467 71,467 82,223 91,11 CT6 0

27,677 65,66 67,3 67,3 88,89 94,443 CT7 0

0 DC (KLT) 21,887 38,973 45,453 45,453 72,777 87,777

100

CT5

CT6

CT7

DC (KLT)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.11: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm

Xét về hiệu lực diệt sâu của các công thức, kết quả cho thấy, tuy hiệu lực diệt sâu

giữa các công thức không có ý nghĩa thống kê nhưng ta vẫn nhận thấy hiệu lực diệt sâu

của công thức 5 cao nhất với 97,22%. Ở công thức 6 và 7 hiệu lực diệt sâu có phần

giảm hơn so với công thức 5. Điều này chứng minh rằng khi ta tăng vận tốc ly tâm lên

10000v/phút (CT6) và 12000v/phút (CT7) có thể lực ly tâm cao đã làm cho cấu trúc

của virus bị tổn thương,virus bị mất chức năng, ảnh hưởng đến hiệu lực diệt sâu của

virus. Vì vậy, ở thí nghiệm 2 này công thức ly tâm tối ưu để thu nhận virus là công

thức 5 ly tâm 2 lần, lần 1 với 500 v/phút thu dịch nổi và lần 2 vận tốc 5000 v/phút thu

cặn ly tâm.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Bảng 3.11 Hiệu lực diệt sâu, tổng số vi sinh vật hiếu khí và số PIB của các CT ở các chế độ ly tâm 2 lần

Công thức

Số PIB/ml chuyển đổi sang Log (x+1)

Hiệu lực diệt sâu (%) sau 11 ngày phơi nhiễm

Tổng vi sinh vật hiếu khí/ml chuyển đổi sang Log (x+1)

Không li tâm (Đ/C) 10,05 ± 0,13 a 9,28 ± 0,172 ns 87,78 ± 10,72 a

8,28 ± 0,23 b 9,13 ± 0,01 97.22 ± 4,81 a

CT5: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn.

8,26 ± 0,24 b 9,18 ± 0,036 91,11 ± 8,39 a

CT6: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:10000 vòng/15 phút, thu cặn.

8,46 ± 0,30 b 9,22 ± 0,018 94,44 ± 9,62a

CT7: Ly tâm 2 lần, lần 1: 500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:12.000 vòng/15 phút, thu cặn.

Tóm lại, lượng vi sinh vật hiếu khí tồn tại trong dịch virus sẽ làm ảnh hưởng tới

chất lượng của dịch virus (hiệu lực diệt sâu). Cụ thể là lượng vi sinh vật hiếu khí tỷ lệ

nghịch với chất lượng của virus. Cho nên, để duy trì hiệu lực diệt sâu của dịch virus ta

cần phải hạn chế lượng vi sinh vật xuống mức thấp nhất bằng cách ly tâm. Với các chế

độ ly tâm khảo sát,việc ly tâm sẽ không làm ảnh hưởng nhiều đến lượng PIB có trong

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

dịch virus nhưng lai có tác động đến lượng vi sinh vật hiếu khí. Cụ thể khi ta tăng vận

tốc ly tâm lên đến một con số thích hợp, hay ta kết hợp ly tâm 2 lần lượng vi sinh vật

hiếu khí sẽ bị giảm xuống, từ đó hiệu lực diệt sâu sẽ tăng lên.

Như vậy, ly tâm lần 2 với tốc độ li tâm từ 5000 vòng/phút đến 12.000 vòng/phút

thu cặn, giúp làm giảm rõ số vi sinh vật hiếu khí nhưng không làm giảm số PIB và hiệu

lực trừ sâu của virus. Mặc khác, trong khoảng tốc độ khảo sát, không có sự sai khác về

tổng vi sinh vật hiếu khí cũng như số PIB thu hồi và hiệu lực diệt sâu của virus giữa

các công thức ly tâm.

Chính vì vây, dựa trên kết quả của 2 lần ly tâm, sinh viên tiến hành thêm thí

nghiệm nữa với công thức ly tâm lần 1 là 1500 vòng/phút và lần 2 là 5000 vòng/phút.

Thí nghiệm này, sinh viên tạm gọi là tối ưu hóa công thức ly tâm tinh sạch NPV.

3.4 Tối ưu hóa công thức ly tâm tinh sạch NPV

Mục đích của thí nghiệm lần này không gì khác ngoài việc kiểm tra công thức kết

hợp hai lần ly tâm với vận tốc ly tâm lần 1 là 1500 vòng/phút và lần 2 là 5000

vòng/phút (dựa trên kết quả của thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3) với hy vọng công thức

ly tâm này sẽ là công thức ly tâm tối ưu nhất để tinh sạch NPV, vừa có thể làm giảm

lượng vi sinh vật xuống mức thấp nhất lại vừa không làm ảnh hưởng đến số PIB có

trong dịch đồng thời nâng cao hiệu lực diệt sâu của virus.

Kết quả thí nghiệm sau khi xử lý T Test thể hiện trong bảng 3.12 hoàn toàn đúng

với những dự doán ban đầu, lượng PIB sau khi ly tâm ở công thức thí nghiệm (1,13 x

109) không có sự sai khác so với công thức đối chứng (KLT) (1,87 x 109). Nghĩa là

lượng PIB vẫn được duy trì ở mức cao, không bị ảnh hưởng nhiều bởi vận tốc ly tâm.

Xét về tổng vi sinh vật hiếu khí, ở công thức thí nghiệm lượng vi sinh vật giảm rất

đáng kể, chỉ còn 6.47 x 107 đã giảm hơn 30 lần so với đối chứng (2,00 x 109) loại bỏ

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

hơn 96% tổng vi sinh vật hiếu khí so với không li tâm. Lượng vi sinh vật hiếu khí trong

mẫu thí nghiệm giảm đồng nghĩa với hiệu lực diệt sâu của sẽ tăng. Thật vậy, chỉ sau 4

ngày phơi nhiễm thì sâu đã có dấu hiệu nhiễm virus và chết và chỉ sau 9 ngày phơi

nhiễm lượng sâu chết do nhiễm phải virus đạt 95,5% (công thức thí nghiệm) trong khi

ở công thức đối chứng chỉ đạt 78,19%. Sự chênh lệch này khá cao và hoàn toàn có ý

nghĩa thống kê. Không chỉ riêng ngày thứ 9 mà ở tất cả các ngày còn lại lượng sâu chết

do nhiễm virus ở công thức thí nghiệm luôn cao hơn công thức đối chứng, điều này

hoàn toàn được thể hiện ở hình 3.12

Bảng 3.12 Hiệu lực diệt sâu, số PIB và tổng vi sinh vật hiếu khí của dịch

virus

Công thức

Số PIB/ml chuyển đổi sang Log (x+1)

Tổng vi sinh vật hiếu khí/ml chuyển đổi sang Log (x+1) Hiệu lực diệt sâu (%) sau 9 ngày phơi nhiễm

Không li tâm (Đ/C) 9.291 ± 0.173a 9.270 ± 0.04ns 78.193 ±4.258b

7.8 ± 0.105b 9.048 ± 0.069 95.5533 ±3.851a

CTKC: Ly tâm 2 lần, lần 1: 1500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn.

120

100

DC (KLT)

CT1

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 3.12: Diễn biến hiệu lực diệt sâu qua các ngày phơi nhiễm

Như vậy, khi kết hợp 2 lần ly tâm với vận tốc ly tâm thích hợp, sẽ cho ta kết quả

cao hơn so với khi ly tâm 1 lần. Cụ thể, như ở công thức thí nghiệm, ly tâm 2 lần, lần

1: 1500 vòng/5 phút, thu dịch, lần 2:5000 vòng/15 phút, thu cặn, sẽ loại bỏ được 1

lượng đáng kể vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus mà không làm thiệt hại đến

lượng PIB có trong đó, từ đó chất lượng của dịch virus sẽ nâng lên. Việc bảo quản dịch

virus phần nào được cải thiện.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

- Ly lâm dịch NPV gốc sử dụng nhiễm sâu khoang làm cho sâu chết nhanh và tập

4.1. Kết luận

trung hơn so với dịch không ly tâm.

- Ly tâm 1500 vòng/phút (trong vòng 5 phút) thu dịch nổi, cho kết quả tốt hơn hẳn

so với đối chứng vì không làm giảm số PIB nhưng lại loại bỏ vi sinh vật hiếu khí tốt

hơn và tăng hiệu lực diệt sâu của NPV.

- Không có sự sai khác về tổng vi sinh vật hiếu khí, số PIB cũng như hiệu lực diệt

sâu của NPV khi ly tâm lần 2 với tốc độ từ 5000 đến 12000 vòng/phút trong vòng

10 phút.

- Công thức ly tâm 2 lần, lần 1 với 500 vòng/phút trong vòng 5 phút thu dịch nổi và

lần 2 với tốc độ 5000 vòng/phút trong vòng 10 phút làm giảm > 96% tổng vi sinh

vật hiếu khi nhưng không làm giảm số PIB mà còn làm tăng hiệu lực diệt sâu của

NPV so với không ly tâm.

4.2. Kiến nghị

Nghiên cứu và tìm hiểu sự ảnh hưởng của vi sinh vật hiếu khí đến hoạt lực và thời

gian bảo quản virus

Tiến hành khảo sát thêm nhiều CT ly tâm khác nhau nhằm tìm ra công thức ly

tâm phù hợp để loại bỏ nhiều nhất có thể lượng vi sinh vật hiếu khí có trong dịch virus.

Mở rộng nghiên cứu, tìm ra phụ gia thích hợp có khả năng ức chế sự phát triển

của vi sinh vật đồng thời cải thiện mùi của dịch virus.

Dịch gốc virus nên định kỳ kiểm tra mức độ nhiễm vi sinh vật và hoạt hóa lại trên

cơ thể sâu ký chủ nhằm đảm bảo được chất lượng của virus

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A. TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[1] Baskaran R.K. M., 2001. In vivo screening of optical brighteners

as UV protectants and their efficacy in enhancing the virulence of Maduri

isolate of NPV of Amascata albistriga (Walker).Lepidoptera: Arctiidae. Journal

of Biological Control.2 (1):169-174.

[2] Burges, H. D., G. Croizier, J. Huber (1980), “A review of safery

tests on baculoviruses”, Entomophaga, 25: 329 - 339.

[3] Bergold, G. H., 1963a. Fine structure of some insect viruses.

Journal Insect Pathology, 5: 111 – 128.

[4] Bergold, G. H., 1963b. The molecular structure of some insect

virus inclusion bodies. Journal Ultrastructs. Res., 8: 360 – 378.

[5] Bud, H. M and M. D. Kelly (1980), “Nuclear polyhedrosis virus

DNA infectious”, Micro-biologycal, 3, 103 - 108.

[6] Bud, H.M, 1977. The DNA contained by nuclear polyherosis virus

isolated from four Spodoptera spp. (Lepidoptera, Noctuidae): genome size and

configuration assessed by electron microscopy, 135 – 143.

[7] Burges, H. D., G. Croizier, J. Huber (1980), “A review of safery

tests on baculoviruses”, Entomophaga, 25: 329 - 339.

[8] Crook, N. E. and Jarrett P. (1991), “Viral and bacterial pathogens

of insects”. Socirty for Applied Bacteriology 20: 91-96.

[9] Evans, H. F. (1986), “ The biology of Baculovirus” (eds Granados,

R. R. and Federici, B. A.), CRC Press, Boca Raton, Fl, vol. II, pp. 89 - 132.

Flavio et al (1997) Production of Nuclear Polyhedrosis Virus of [10]

Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera:Noctuidae): Effect of Vírus

Dosage, Host Density and Age

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[11] Grzywacz D., Rabindra R. J. Brown M., Jones K.A. 2011. The

Helicoverpa armigera NPV production manual.

http://www.fao.org/docs/eims/upload/agrotech/2011/hanpvmanual-pt1.pdf.

[12] Harrap, K. A., and B. E. Juniper. 1966. The internal structure of

an insect virus. Virology 29:175-178.

[13] Ignoffo, C. M., Rice, W. C. and Mcintoch, A. H. (1989):

Inactivation of non occluded and occluded baculovirus and baculovirus-DNA

exposed to simulated sunlight .Environmental Entomology.18(1)177-183

[14] Ignoffo, C.M (1992) Combination of environmental factor and

simulated sunlight affect-ing inclusion bodies of the Heliothis (Lepidotera:

Noctuidae) nucleopolyhedrosis virus. Environmental entomology 21,210-213.

[15] Jayaraj (1985), “Symptoms and pathologies of insect diseases

inMicrobial control and integrated pest management”, Tamil Nadu Agricultural

University, Coimbatorem, India, p 30 - 33.

[16] Johnson D. W., D. B. Boucias, C. S. Barfield, and G. E. Allen

(1982), “A temperature dependent developmental model for a

nucleopolyhedrosis virus of the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis

(Lepidoptera: Noctuidae)”, J. Invertebr. Pathol 40, pp. 292 - 298.

[17] Kao và Meher (2004) Optimization of Helicoverpa annigera NPV

inoivo mass production and regulation ofmalodor associated with the process.

[18] Kelly, D. C. (1985), “Insect iridescent viruses”, Current Topics in

Microbiology and Immunology, 116, 23 - 35.

[19] Kobayashi M., S. Inagaki and S. Kawase (1981), “Effect of high

temperature on the development of nuclear polyhedrovirus in the silkworm,

Bombyx”, J. Invertebr. Pathol 38, pp. 386 - 394.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[20] Lansing M. Prescott, john P. Harley, Đonal A. Klein, 2005

Microbiology. Mc Graw Hill

[21] Lawrence A. Lacey, Hary K. Kaya., 2007. Book: Field Manual of

Techniques in Invertebrate Pathology - Application and Evaluation of Pathogens

for Control of Insects and other Invertebrate Pests. Springer, Second edition.

[22] M.A.Sorour, O.Khamiss, A.S.Abd El-Wahab, M.A.K.El-Sheikh

and S.Abul-Ela( 2011). An Economically Modified Semi-Synthetic Diet for Mass

Rearing the Egyptian Cotton Leaf Worm Spodoptera littolaris, Academic

Journal of Entomology 4 ( 3), 118- 120

[23] Mohammad et al, 2002. BIOLOGICAL CONTROL Field

Efficacy of the Nucleopolyhedrovirus of Anticarsia gemmatalis Hübner

(Lepidoptera: Noctuidae): Effect of Formulations, Water pH, Volume and Time

of Application, and Type of Spray Nozzle

[24] Monobrullah Md. and Masao Nagata, 2000. Optimisation of

Spodoptera litura Fab. Nucleopolyhedrovirus Production in Homologous Host

Larvae. International Journal of Tropical Insect Science Science , Volume 20,

Issue 02, pp 157-165

[25] Ravishankar B. S. and Venkatesha M. G., 2010. Effectiveness of

SlNPV of Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera:Noctuidae) on different host

plants. Journal of Biopesticides 3 (1 Special Issue): 167 – 171

[26] Sasumu Maeda et all (1990), Characteristically distinct isolates of

nuclear polyhedrosis virus from Spodoptera litura (Fab) polyhedrosis virus

using UV irradiation protectants

[27] S. Arivudainambi et al (2000), enhancing the efficacy and

persistency of Spodoptera litura

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[28] Shinoda, T., 2001. Spodoptera litura Fabricius. In: Agriculture,

Forestry and Fisheries Research Council (Ed.), The Pest of Vegetables. Asociation

of Agriculture and Forestry Staistics, Tokyo, pp 112 - 125.

[29] Summers, M. D., R. Engler, L. A. Falcon and P. V. Vail (Eds)

(1975). Baculoviruses for Insect Pest Control: Safety Considerration. Amerrican

Society of Microbiology, Washington.

[30] Tanada, Y. and H. K. Kaya (1993), Insect pathology. Academic

press, IRC. Harcount brace Jovanovich, publishrs, San Diego/ New Yourk/

Boston/ London/ Sydney/ Tokyo/ Toronto

[31] Trang T.T.K., Chaudhari S. and Gautam R.D., 2003. “A note on

the spread of Spodoptera litura (Fab.) Nuclear polyhedrosis virrsu through

Cotesia (Apanteles) angaleti Muesbeck (Hymenoptera: Braconidae)”. Omonrice

11: 151-152 (2003)

[32] Trang, T. T. K. and Chaudhari, S., 2002. “Bioassay of nuclear

polyhedrovirus (npv) and in combination with insecticide on Spodoptera litura

(Fab)”. Omonrice, 10: 45-53.

B. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài và Nguyễn Văn Tó (2006), Tìm hiểu

về chế phẩm vi sinh vật dùng trong nông nghiệp, Tủ sách khuyến nông phục vụ

người lao động, Nhà xuất bản lao động, Hà Nội.

[2] Hoàng Thị Việt et al., (2000), “Một số kết quả nghiên cứu về

NPV (Nuclear polyhedrosis virus) và khả năng sử dụng trong phòng trừ sâu hại

cây trồng”, Tuyển tập công trình nghiên cứu Bảo Vệ Thực Vật 2000-2002,

Viện Bảo Vệ Thực vật, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, Trang 110-130

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[3] Ngô Trung Sơn (1999), Nghiên cứu sử dụng HaNPV trong phòng

trừ tổng hợp sâu xanh hại bông tại Ninh Thuận. Luận án tiến sỹ nông nghiệp,

Viện Khoa học và Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.

[4] Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004), Giáo trình Côn trùng

Nông nghiệp, phần B: Côn trùng gây hại cây trồng chính ở Đồng bằng sông

Cửu Long, Tủ sách Đại Học Cần Thơ.

[5] Nguyễn Văn Tuất, 2004. Nghiên cứu sản xuất sử dụng thuốc sinh

học đa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật Công nghệ sinh học.

Báo cáo tổng kết đề tài Khoa học công nghệ. Viện bảo vệ Thực vật.

[6] Phạm Hữu Nhượng và ctv 2005. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm

NPV trừ sâu xanh da láng. Tạp chí NNCNTP.

[7] Phạm Huỳnh Thanh Vân, Lê Thị Thuỳ Minh, 2001. Sâu Ăn Tạp

(Spodoptera litura) một số đặc điểm hình thái, sinh học và thành phần thiên

địch trên một số loại rau màu tại vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn

Tốt nghiệp Đại Học.

[8] Phạm Thị Thùy (2004), Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật,

Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.

[9] Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh (2003),

Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng (Quyển 1), Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp.

Hồ Chí Minh.

[10] Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007) Công nghệ sinh học, tập

5, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

C. TÀI LIỆU INTERNET

[1] http://thuvienphapluat.vn/archive/TCVN-5165-1990-san-pham-

thuc-pham-phuong-phap-xac-dinh-tong-so-vi-khuan-vb902237.aspx

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

[2] http://udkhcnbinhduong.vn

[3] http://luanvan.co/luan-van/de-tai-nghien-cuu-san-xuat-su-dung-

thuoc-sau-sinh-hoc-da-chuc-nang-cho-mot-so-loai-cay-trong-bang-ky-thuat-

cong-nghe-54104/

[4] http://d.violet.vn/uploads/previews/204/1403283/preview.swf

[5] http://www.vinachem.com.vn/Desktop.aspx/Xuat-ban-pham/So-

92011/Thuoc_BVTV_co_nguon_goc_sinh_hoc_ung_dung_cua_Hoa_hoc_xanh

_cho_nong_nghiep_ben_vung/

[6] http://www.fao.org/docs/eims/upload/agrotech/2011/hanpvmanual

-pt1.pdf

[7] http://www.moitruong.com.vn/Upload/48/Nam_2013/Thang_12/N

gay_7/GTSuDungThuocBVTV_SVquanlydat.com.pdf

http://www.bvtvhcm.gov.vn/document.php?id=51&cid=6 [8]

[9]

http://nnptntvinhphuc.gov.vn/index.php?action=details&&idmuc=SBHR21

[10] http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-tim-hieu-ve-cac-thiet-bi-ly-tam-

dung-trong-thuc-pham-25277/

PHỤ LỤC

A. HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN

Hình 1: Sâu khoang nuôi trên lá thầu dầu để chuẩn bị nhiễm

Hình 2: Thức ăn nhân tạo sau khi đổ ra hộp

Hình 3: Sâu được nuôi bằng thức ăn nhân tạo sau khi nhiễm virus

Hình 4: Sâu chết do nhiễm virus

Hình 4: Thao tác đỗ đĩa

B. BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU THÔ BẰNG PHẦN MỀM STATGRAPHICS CENTURION XV

* Thí nghiệm 1: Khảo Sát sự ảnh hưởng của dịch gốc virus tới hiệu lực diệt sâu

1. Hiệu lực diệt sâu sau 8 ngày phơi nhiễm

Summary Statistics for HLDIETSAUN8 CTHUC Average Count Standard deviation Coeff. of variation

3 3 3 5.0 2.88675 10.0 5.26316% 2.93568% 16.6667%

95.0 CT1 98.3333 CT2 60.0 KLT ANOVA Table for HLDIETSAUN8 by CTHUC Source Between groups 2705.56 Sum of Squares Mean Square F-Ratio 1352.78 30.44 P-Value 0.0007

Multiple Range Tests for HLDIETSAUN8 by CTHU Method: 95.0 percent LSD CTHUC Count Mean

Homogeneous Groups X X X KLT CT1 CT2 3 3 3 60.0 95.0 98.3333

2. Tổng vi sinh vật hiếu khí

CTHUC Count Average Standard deviation Coeff. of variation

3 3 3 1.34367E8 5.59527E7 9.56E7 3.39575E7 1.10333E9 4.04145E7 41.6418% 35.5204% 3.66295%

CT1 CT2 KLT ANOVA Table for TONGVSV by CTHUC Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 1.95593E18 9.77963E17 495.83 0.0000

Multiple Range Tests for TONGVSV by CTHUC CTHUC Count Mean Homogeneous Groups

X X X CT2 CT1 KLT 3 3 3 9.56E7 1.34367E8 1.10333E9

* Thí nghiệm ly tâm lần 1, loại bỏ xác sâu

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí

Count

Average

Standard deviation Coeff. of variation

3 3 3 3 3

10.0989 9.55708 8.98226 8.86708 10.0457

0.0714921 0.292368 0.0770068 0.122017 0.130937

0.707922% 3.05918% 0.857322% 1.37607% 1.30341%

Summary Statistics for VSV CONGTHUC

Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio

4 0.995875 38.73 P-Value 0.0000

CT1 CT2 CT3 CT4 DC ANOVA Table for VSV by CONGTHUC Source Between groups 3.9835 CONGTHUC

Count Mean

Homogeneous Groups

3 3 3 3 3

8.86708 X 8.98226 X 9.55708 10.0457 10.0989

X X X

CT4 CT3 CT2 DC CT1 2. Khảo sát số PIB

Count 3 3 3 3 3 15 Standard deviation Coeff. of variation 0.00794017 0.0502188 0.0227109 0.0220509 0.171709 0.0914237 0.0858666% 0.543184% 0.247229% 0.241957% 1.85082% 0.992235%

Summary Statistics for PIB Average CT 9.24711 CT1 9.24526 CT2 9.18618 CT3 9.11357 CT4 9.27744 DC 9.21391 Total ANOVA Table for PIB by CONGTHUC Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 0.0508742 0.0127185 1.92 0.1831

Multiple Range Tests for PIB by CONGTHUC Count CONGTHUC 3 CT4 Mean 9.11357 Homogeneous Groups X

CT3 CT2 CT1 DC 3 3 3 3 9.18618 9.24526 9.24711 9.27744 XX XX XX X

3.Hiệu lực diệt sâu sau 11 ngày phơi nhiễm

Summary Statistics for HIEULUCDIETSAU

Sum of Squares Mean Square F-Ratio 224.921

56.2302

2.73

P-Value 0.0897

Count 3 3 3 3 3 15 Average Standard deviation Coeff. of variation 88.3333 2.88675 94.4467 3.85093 97.2233 2.54551 88.3333 7.63763 87.7767 3.85093 91.2227 5.54547 3.26802% 4.07736% 2.61821% 8.64637% 4.38719% 6.07905%

CT CT1 CT2 CT3 CT4 DC Total ANOVA Table for HIEULUCDIETSAU by CONGTHUC Source Between groups Multiple Range Tests for HIEULUCDIETSAU by CONGTHUC CONGTHUC Count Mean Homogeneous Groups

3 3 3 3 3

87.7767 X DC 88.3333 X CT1 88.3333 X CT4 94.4467 XX CT2 X 97.2233 CT3 * Thí nghiệm ly tâm 2 lần, loại bỏ vi sinh vật, thu nhận virus

1.Khảo sát tổng số vi sinh vật hiếu khí

Summary Statistics for TONGVSVHIEUKHI Average CT Standard deviation Count Coeff. of variation

3 CT5 8.28252 0.232432 2.80629%

3 3 CT6 CT7 8.5525 8.58051 0.238566 0.300379 2.78943% 3.50071%

3 KLT 10.0457 0.130937 1.30341%

ANOVA Table for TONGVSVHIEUKHI by CT Source Between groups Sum of Squares Mean Square F-Ratio 1.91198 5.73593 35.03 P-Value 0.0001

Multiple Range Tests for TONGVSVHIEUKHI by CT CT

Homogeneous Groups

Count Mean

CT5

8.28252

CT6

8.5525

CT7

8.58051

KLT

10.0457

2.Khảo sát số PIB

Summary Statistics for TONGSOPIB CT Average Count Standard deviation Coeff. of variation

CT5 3 9.13453 0.00976775 0.106932%

CT6 3 9.17511 0.0355981 0.387986%

CT7 3 9.219 0.0176619 0.191582%

3 9.27744 0.171709 1.85082%

KLT ANOVA Table for TONGSOPIB by CT Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value

1.44 0.3004 0.0112551

Mean 9.13453 9.17511 9.219 9.27744 Count 3 3 3 3 Homogeneous Groups X X X X

Between groups 0.0337652 Multiple Range Tests for TONGSOPIB by CT Method: 95.0 percent LSD CT CT5 CT6 CT7 KLT 3. Hiệu lực diệt sâu sau 11 ngày phơi nhiễm

Summary Statistics for DIETSAU CT Average Count Standard deviation Coeff. of variation

3 3 3 3 97.2233 91.11 94.4433 87.7767 4.94668% 9.20892% 10.1907% 12.2081%

4.80933 CT5 8.39025 CT6 9.62443 CT7 10.7159 KLT ANOVA Table for DIETSAU by CT Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 150.756 50.2519 0.67 0.5951

Multiple Range Tests for DIETSAU by CT Method: 95.0 percent LSD Count Mean CT Homogeneous Groups

KLT 3 87.7767 X

CT6 CT7 3 3 91.11 94.4433 X X

* Thí nghiệm 3: Kiểm chứng CT dự đoán

CT5 3 97.2233 X

Summary Statistics for TPC CTHUC=KLT CTHUC=TN

Count 10 10

Average 2.0036E9 6.468E7

Standard deviation 8.53219E8 1.50498E7

Coeff. of variation 42.5843% 23.268%

Comparison of Means for TPC t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 7.18508 P-value = 0.00000109263 Reject the null hypothesis for alpha = 0.05. Summary Statistics for PIB Count Average Standard deviation CTHUC=KLT 10 1.87E9 1.71917E8 CTHUC=TN 10 1.13E9 1.75119E8

9.19344% 15.4973% Coeff. of variation

Comparison of Means for PIB t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = 9.53572 P-value = 1.84679E-8 Reject the null hypothesis for alpha = 0.05. Summary Statistics for %DIETSAU MAU=KLT MAU=TN

Count 3 3

Average 78.1933 95.5533

Standard deviation 4.25789 3.85093

Coeff. of variation 5.44534% 4.03013%

Comparison of Means for %DIETSAU t test to compare means Null hypothesis: mean1 = mean2 Alt. hypothesis: mean1 NE mean2 assuming equal variances: t = -5.23747 P-value = 0.00635114 Reject the null hypothesis for alpha = 0.05.

Đồ án tốt nghiệp: Xác định phương pháp tinh sạch NPV (Nuclera Polyhedrosis Virus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NPV

(NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS)

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai

Sinh viên thực hiện

: Trương Hùng Phong

MSSV: 1151110260 Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

- - - - - - - - -- - - - - - - - -

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

SỐ VSV

SỐ PIB

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

SỐ PIB

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CT1 CT2 CT3 CT4 DC ANOVA Table for VSV by CONGTHUC Source Between groups 3.9835 CONGTHUC

Multiple Range Tests for TONGVSVHIEUKHI by CT CT

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ môi trường: Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học theo mẻ (SBR) để xử lý nước thải sinh hoạt trong nhà cao tầng và khu dân cư quy mô tới 10000 người

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình của một số gen ở trẻ em mắc bệnh teo đường mật bẩm sinh

Đề thi kết thúc học phần học kì 2 môn Công nghệ sinh học dinh dưỡng năm 2023-2024 có đáp án

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Quản lý chất lượng sản phẩm năm 2023-2024

Tài liêu mới

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống sấy khí thổi dùng để sấy tinh bột gạo nếp, năng suất 2000 kg/h theo sản phẩm

Đồ án môn học: Nghiên cứu phát triển sản phẩm kem trứng muối đóng hộp mix hạt điều

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm công suất 15000M3 /NG/Đ

Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu về ứng dụng công nghệ số trong sản xuất in và tác động của nó đến chiến lược kinh doanh của công ty in

Đồ án môn học: Tính toán thiết kế thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống chùm để ngưng tụ hơi cồn nồng độ 96% khối lượng, lưu lượng 10000kg/ngày

Báo cáo đồ án: Thiết kế hệ thống chưng cất mâm chóp hệ etanol – nước năng suất nhập liệu 2000 L/h

Đồ án công nghệ: Thiết kế hệ thống chuyển hóa cacbon monoxit Water gas shift

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng hệ thống chia sẻ tài liệu theo kiến trúc hướng dịch vụ

Luận văn tốt nghiệp: Thiết kế nhà máy sản xuất màng ghép phức hợp ứng dụng cho bao bì thuốc trừ sâu năng suất 90 triệu m²/năm

Đồ án tốt nghiệp: Thành lập bản đồ lớp phủ thực vật tỉ lệ 1:50000 tại huyện Sóc Sơn, thành phố Hà Nội từ tư liệu ảnh viễn thám

Đồ án tốt nghiệp: Xây dựng chương trình quản lý chất lượng theo HACCP cho sản phẩm thịt ba rọi xông khói tại Cty TNHH MTV Việt Nam kỹ nghệ súc sản (VISSAN)

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng mô hình dự báo nguồn nhân lực thuyền viên xuất khẩu Việt Nam

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giải pháp điều khiển bám quỹ đạo tàu thủy có ràng buộc tín hiệu và bất định hàm ở đầu vào

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Đánh giá sự hiện diện một số kim loại nặng trong nghêu trắng Meretrix lyrate và môi trường sống của chúng

Tóm tắt luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tính toán hệ dây neo công trình biển nổi đặt tại vùng biển Việt Nam

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng