BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
XÁC ĐỊNH CỘNG ĐỒNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG
PHÁP PCR VÀ DGGE TỪ RƠM TRƯỚC VÀ SAU KHI
XỬ LÝ TRỒNG NẤM RƠM
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
CN. NGÔ ĐỨC DUY
Sinh viên thực hiện : HOÀNG NGỌC PHƯƠNG THẢO
MSSV: 0851110222 Lớp: 08DSH4
TP. Hồ Chí Minh, 2012
Đồ án tốt nghiệp
1
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Nghiên cứu về cộng đồng vi sinh vật trong các môi trường sống nhằm tìm
hiểu thêm đa dạng sinh học là một trong những mong muốn của các nhà khoa học
trên thế giới. Trước đây, để phân tích cộng đồng vi sinh vật trong các môi trường tự
nhiên, các nhà khoa học phải nuôi cấy và phân lập qua nhiều công đoạn khác nhau,
tốn thời gian và công sức nhưng lại không đem đến kết quả mong muốn.
Trong số tất cả các vi sinh vật trong tự nhiên, khoảng 99% không được phát
hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy. Vì vậy, sinh học phân tử, phương pháp nhận biết độc
lập, khuếch đại và giải trình tự gen 16S rDNA, thường được sử dụng để có một dữ
liệu đầy đủ hơn về một cộng đồng sống trong một môi trường cụ thể, sinh học phân
tử ra đời đã khắc phục những khó khăn vẫn còn hạn chế của công nghệ sinh học,
nhằm góp phần xác định cộng đồng của vi sinh vật trong môi trường nhanh chóng
mà không phải qua nhiều giai đoạn nuôi cấy và phân lập, qua đó giúp các nhà khoa
học hiểu biết nhiều hơn về đa dạng sinh học, từ đó đưa vào các ứng dụng nhằm
phục vụ cho thực tiễn.
Áp dụng sinh học phân tử để nghiên cứu cộng đồng vi sinh có trong rơm rạ
ở giai đoạn trước và sau khi xử lý trong trồng nấm là rất cần thiết. Định danh hệ vi
sinh vật có trong mẫu rơm bằng việc ly trích và thu nhận DNA trực tiếp, so sánh sự
thay đổi hệ vi sinh trong mẫu rơm ở các giai đoạn tiền xử lý trước khi đưa vào
trồng nấm, từ đó có thể bổ sung hệ vi sinh phù hợp vào giai đoạn rơm tiền xử lý
nhằm rút ngắn thời gian ủ rơm trước khi đưa vào trồng nấm, đem lại hiệu quả kinh
tế cao hơn cho người dân. Đây cũng là bước khởi đầu quan trọng cho chúng ta có
thêm kiến thức về sự đa dạng sinh học trong nguồn cơ chất này, góp phần ứng dụng
cho các nghiên cứu tiếp theo.
Đồ án tốt nghiệp
2
2. Tình hình nghiên cứu
Ly trích DNA của vi sinh vật trực tiếp từ rơm rạ để tìm hiểu cộng đồng vi
sinh vật đã được thực hiện tại một số phòng thí nghiệm về nông nghiệp các nước.
Tuy có những quy trình ly trích DNA khác nhau nhưng đều chung mục đích là thu
nhận DNA của nhóm vi khuẩn phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ở Việt Nam, mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn nhưng vẫn chưa
được ứng dụng nhiều so với vai trò mà nó có thể mang lại. Rơm rạ nói riêng và từ
biomass nói chung không được sử dụng một cách hiệu quả. Phần lớn chúng được
đốt và bỏ trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà
nông, làm cơ chất trồng nấm, làm thức ăn cho gia súc…gây lãng phí một nguồn
năng lượng tiềm năng. Việc ly trích và thu nhận trức tiếp DNA của nhóm vi khuẩn
từ rơm vẫn chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều, chủ yếu là phân lập và ly
trích từ những chủng thuần vi sinh cho những mục đích nghiên cứu khác nhau.
3. Mục đích nghiên cứu
- Ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước và sau khi xử lý
trong trồng nấm.
- Xác định nhóm vi khuẩn trong rơm trước và sau khi xử lý trong trồng nấm
bằng phương pháp PCR và DGGE, giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 của
đoạn 16S rDNA.
- Thành lập cây phân loài của nhóm vi khuẩn có trong rơm trước và sau xử lý.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh trực tiếp từ rơm xử lý trong trồng
nấm.
- Tiến hành tinh sạch và kiểm tra độ tinh sạch DNA của nhóm vi khuẩn.
- Sử dụng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn. Điện di
và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose.
- Xác định nhóm vi khuẩn trong rơm bằng phương pháp DGGE vùng V3 thuôc
đoạn gene 16S rDNA.
- Giải mã trình tự đoạn gene vùng V3 của đoạn 16S rDNA.
Đồ án tốt nghiệp
3
- Hình thành cây phân loài của hệ vi khuẩn có trong rơm trước và sau khi xử lý.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Hình thức thu mẫu: Thu mẫu rơm trước và sau khi xử lý trong trồng nấm.
- Ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh bằng phương pháp SDS.
- Tinh sạch DNA bằng bộ kit: GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit.
- Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR khuếch đại đoạn gene 16S
rDNA dựa vào cặp mồi 27F 5’ – GA GTT TGA TCM TGG CTC AG – 3’ và
1492R 5’ – TAC GGG TAC CTT GTT CG ACT T – 3’, sau đó tinh sạch sản
phẩm PCR trước khi phân tích DGGE.
- Phương pháp DGGE được sử dụng để xác định hệ vi khuẩn trong mẫu:
+ PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn được thực hiện với
cặp mồi chuyên biệt cho nhóm vi khuẩn là 517R 5’ – ATT AC GCG GCT
GCT CC – 3’ và 357F – GC 5’ – CGC CCG CGC GCG GGC GGG GGG
GGG GCA CGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’.
+ Thực hiện phương pháp DGGE trên gel polyacrylamide.
+ PCR vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA sau khi DGGE với cặp mồi 357F 5’
– CCT ACG GGA GGC AGC AG – 3’ và 517R 5’ – ATT ACC GCG GCT
GCT GG – 3’. Tinh sạch và thu nhận DNA từ gel polyacrylamide bằng bộ
Kit QIAEX II trước khi bước vào giải trình tự loài.
+ Giải trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA của vi khuẩn.
+ Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình BLAST trên ngân
hàng dữ liệu gene của NCBI.
6. Kết quả nghiên cứu
- Ly trích và thu nhận DNA vi khuẩn trực tiếp từ rơm trước và sau xử lý trong
trồng nấm rơm.
- Xác định nhóm vi khuẩn cần nghiên cứu dựa vào sự khuếch đại đoạn gene
16S rDNA bằng phản ứng PCR.
- Xác định nhóm vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp DGGE của vùng V3
thuộc đoạn gene 16S rDNA.
Đồ án tốt nghiệp
4
- Giải mã được trình tự đoạn gene vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA của vi khuẩn.
- Hình thành cây phân loài của cộng đồng vi khuẩn có trong rơm trước và sau
xử lý
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
- Chương 1: Tổng quan
- Chương 2: Vật liệu và phương pháp
- Chương 3: Kết quả và thảo luận
- Chương 4: Kết luận và kiến nghị