TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 82/2024
138
DOI: 10.58490/ctump.2024i82.3201
KHẢO SÁT MÃ VẠCH ADN, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ TRẦU KHÔNG (Piper betle L.)
Nguyn Th Trang Đài, Lê Th Thanh Yến, Nguyn Hữu Nhân,
Thân Đặng Tuyết Minh, Nguyn Ngọc Nhã Tho*
Trường Đi hc Y Dưc Cn Thơ
*Email: nnnthao@ctump.edu.vn
Ngy nhận bi: 02/10/2024
Ngy phản biện: 16/12/2024
Ngy duyệt đăng: 25/12/2024
TÓM TẮT
Đặt vn đề: Lá tru không (Piper betle L.) l một dưc liệu phổ biến, đưc ứng dụng rộng
rãi trong y hc cổ truyền. Việc nghiên cứu các đặc đim định danh cũng như thnh phn hoá hc
của lá tru không to cơ sở khoa hc cho việc khai thác v ứng dụng an ton, hiệu quả trong lĩnh
vực y hc. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định các đặc đim thực vật hc, mã vch ADN v thnh phn
hóa hc của lá tru không. Đối tượng và phương php nghiên cứu: Mẫu lá tru không đưc thu
thập ti tỉnh Hậu Giang. Đánh giá đặc đim thực vật hc đưc thực hiện thông qua phân tch hình
thái v vi hc, trong khi mã vch ADN đưc xác định bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
Thnh phn hóa hc đưc xác định thông qua quá trình chiết xuất tun tự bằng ba dung môi có độ
phân cực tăng dn. Các hp chất chnh đưc nhận diện thông qua các thuc thử đặc hiệu. Kết qu:
Nghiên cứu đã xác định đưc đặc đim hình thái, cấu trúc vi hc, trong đó đặc trưng lsự hiện diện
của lỗ kh khổng vòng bo, ng tiết v tế bo tiết tinh du, Mã vch ADN đã khẳng định đúng loi
Piper betle. Phân tch hóa hc cho thấy sự hiện diện của tinh du, flavonoid, alkaloid, tanin
(polyphenol), saponin, và triterpenoid. Kết luận: Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin về đặc
đim thực vật hc v thnh phn hóa hc của lá tru không (Piper betle L.), có tiềm năng ứng dụng
trong việc lựa chn v sử dụng dưc liệu ny một cách phù hp v an toàn.
Từ khóa: Lá Tru không, Piper betle, mã vch ADN, thnh phn hóa hc.
ABSTRACT
INVESTIGATION ON THE BOTANY, DNA BARCODE, AND
ANALYSIS OF CHEMICAL CONSTITUENTS OF PIPER BETLE L.
Nguyen Thi Trang Dai, Le Thi Thanh Yen, Nguyen Huu Nhan,
Than Dang Tuyet Minh, Nguyen Ngoc Nha Thao*
Can Tho University of Medicine and Pharmacy
Background: Betel leaf (Piper betle L.) is a popular medicinal plant widely used in
traditional medicine. Researching its identification characteristics as well as chemical constituents
provides a scientific basis for the safe and effective utilization of this plant in the medical field.
Objectives: To determine the botanical characteristics, DNA barcode, and chemical constituents of
betel leaf (Piper betle). Materials and methods: Betel leaf samples were collected from Hau Giang
province. Botanical characteristics were evaluated through morphological and microscopic
analyses, while DNA barcodes were identified using agarose gel electrophoresis. Chemical
constituents were determined through sequential extraction using three solvents of increasing
polarity. Major compounds were identified using specific reagents. Results: The study identified the
morphological and microscopic characteristics of Piper betle, notably the presence of anomocytic
stomata, secretory ducts, and oil cells. DNA barcoding confirmed the species as Piper betle.
Chemical analysis revealed the presence of essential oils, flavonoids, alkaloids, tannins
TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 82/2024
139
(polyphenols), saponins, and triterpenoids. Conclusion: The findings provide valuable information
on the botanical characteristics and chemical constituents of betel leaf (Piper betle), highlighting
its potential for appropriate and safe utilization as a medicinal resource.
Keywords: Betel leaf, Piper betle, DNA barcodes, chemical composition.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lá tru không (Piper betle L.) l một dưc liệu quen thuộc trong y học cổ truyn,
đưc sử dụng phổ bin ti nhiu quốc gia châu , bao gồm Việt Nam. Lá tru không c mùi
thơm đặc trưng v cha nhiu thnh phn hot chất c khả năng kháng khuẩn, kháng viêm,
chống oxy ha v tác động lên nhiu quá trnh sinh lý trong cơ thể [1], [2], [3]. Theo y học
cổ truyn, lá tru không thường đưc dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng, viêm họng, v
chăm sc răng miệng [4-6]. Các nghiên cu trước đây đã chỉ ra rằng lá tru không cha các
hp chất phenolic, flavonoid v các thnh phn tinh du, l những chất c hot tnh sinh học
trong dưc liệu [7-9]. Tuy nhiên, mặc dù các nghiên cu sơ bộ v thnh phn ha học đã
đưc công bố, nhưng vẫn chưa c sự tổng hp đy đủ v mô tả thực vt học, mã vch ADN
v các hp chất c trong lá tru không trồng ti huyện Vị Thủy, tỉnh Hu Giang. Do đ, việc
tin hnh nghiên cu v thnh phn thực vt học v phân tch sơ bộ thnh phn ha học của
lá tru không đưc trồng ti tỉnh Hu Giang l cn thit để cung cấp thêm thông tin khoa
học lm cơ sở cho các ng dụng y học v công nghiệp [7].
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Dưc liệu: Lá tru không (Piper betle) đưc thu hái vo tháng 03/2024 ti huyện Vị
Thủy, tỉnh Hu Giang. Mẫu dưc liệu đã qua xử lý, nghiên cu v đưc lưu giữ ti Bộ môn
Dưc liệu, Khoa Dưc, Trường Đi học Y Dưc Cn Thơ. Mẫu đưc định danh trong quá
trnh nghiên cu. Mẫu sau khi xử lý đưc gửi đi giải trnh tự ti công ty TNHH DNA
SEQUENCING, thnh phố Cn Thơ
Dung môi v ha chất: Các ha chất sử dụng trong nghiên cu bao gồm methanol,
Javel 50%, chloral hydrat 50% pha trong nước, acid acetic, carmin, diethyl ether, ethanol
96%, v nước cất đt tiêu chuẩn phân tch.
Thit bị: Knh hiển vi Olympus CX31 cùng các thit bị cơ bản khác trong phòng th
nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát đặc điểm thực vt học:
Nghiên cu ny bao gồm khảo sát các đặc điểm hnh thái, cấu trúc vi phẫu v phân
tch bột dưc liệu.
- Đặc điểm hnh thái: Quan sát v mô tả các đặc điểm hnh thái trên mẫu cây tươi,
sau đ đối chiu với ti liệu phân loi thực vt để xác định chnh xác tên loi [10], [11].
- Khảo sát vi phẫu: Mẫu lá v thân đưc cắt lát mỏng ti các vị tr thch hp, sau đ
nhuộm mu bằng thuốc nhuộm kép. Quan sát, mô tả đặc điểm vi phẫu v chụp ảnh dưới
knh hiển vi Olympus CX31 với độ phng đi 10x v 40x.
- Kiểm tra bột dưc liệu: Lá v thân đưc sấy khô ở 50°C, nghin mịn v rây qua
lưới c đường knh 0,1 mm. Bột dưc liệu đưc lấy bằng kim mi mác, đặt lên phin knh
cha một giọt nước cất, đy lamen, quan sát dưới knh hiển vi Olympus CX31 v chụp ảnh
mô tả các cấu tử.
Nghiên cu mã vch ADN:
TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 82/2024
140
DNA từ mẫu lá đưc ly trch theo phương pháp CTAB (Doyle and Doyle, 1990)
[12]. DNA sau khi ly trch v tinh sch sẽ đưc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Mỗi mẫu đưc trộn với 1 µl dung dịch loading dye 6X, 1 µl DNA, v 4 µl nước PCR trên
giấy parafilm, sau đ từ từ np vo ging gel. Điện di đưc thực hiện ở điện áp 85V trong
30 phút. Sau đ, gel đưc nhuộm ethidium bromide (10 mg/L) trong 10 phút, rửa sch bằng
nước cất trong 5 phút v chụp ảnh dưới ánh sáng UV. Tip theo, thực hiện phản ng PCR,
điện di sản phẩm PCR v giải trnh tự.
Phân tch sơ bộ thnh phn ha học:
Lá tru không đưc sấy khô ở 50°C, nghin thnh bột thô, sau đ chit xuất ln lưt
bằng các dung môi với độ phân cực tăng dn (diethyl ether, ethanol 96%, nước). Các dịch
chit đưc định tnh nhm hp chất chnh (tinh du, chất béo, carotenoid, triterpenoid,
alkaloid, coumarin, anthranoid, flavonoid, tannin, saponin, chất khử, acid hữu cơ) theo
phương pháp cải tin của Ciulei [1]. Nhm hp chất chnh cng đưc kiểm tra định tnh
bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát đặc điểm thực vật học
Mẫu dược liu và đặc điểm hình thi
Mẫu dưc liệu: Lá tru không đưc thu hái l những lá trưởng thnh, nguyên vẹn, sau
đ sấy khô đn khi đt độ ẩm dưới 15%. Độ ẩm kiểm tra thực t của mẫu đt 10,16%. Mẫu lá
đưc nghin thnh bột v rây qua lưới c đường knh 0,3 mm.
Đặc điểm bột lá: Bột lá c mu vng nâu, mùi thơm đặc trưng, hơi hắc v vị cay. Quan
sát dưới knh hiển vi cho thấy rõ các thnh phn như lông che chở, mảnh t bo cha lỗ kh,
mảnh biểu b ct bo tit, mô mm giu, mch xoắn v mch vch (Hnh 1).
Hình 1. Đặc điểm các cấu tử bột lá
Đặc điểm hnh thái thực vt: Tru không (Piper betle) l cây dây leo, thân c hnh trụ,
nhẵn vc kha dọc, rễ mọc ra từ các đốt. Lá mọc so le, c hnh tim tròn với phn gốc đôi khi
hơi lệch, đu nhọn. Kch thước lá dao động từ 10–13 cm chiu di v 4,5–9 cm chiu rộng.
Cả hai mặt lá đu nhẵn; mặt trên c mu lục sẫm v bng, trong khi mặt dưới nht mu hơn
v c gân nổi rõ. Cuống lá kéo di cbẹ, lá c mùi thơm đặc trưng v vị cay. Hnh thái của lá
tru không đưc minh họa ở Hnh 2.
TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 82/2024
141
Hình 2. Đặc điểm hnh thái của lá Tru không
Đặc điểm vi phẫu
- Gân giữa: Lồi tròn ở cả hai mặt lá. Biểu b trên v biểu b dưới gồm một lớp t bo
hnh chữ nht sắp xp khá đồng đu. Lông che chở đơn bo xuất hiện nhiu ở biểu b dưới.
Mô mm: Gồm các t bo gn như tròn, cha các tbo tit tinh du phân bố rải rác. B libe-
gỗ c cấu trúc với b gỗ ở pha trên v b libe ở pha dưới. Trụ b đưc ha mô cng, to
thnh cụm trên đu b libe-gỗ với các t bo đa giác c vách dy, xp chặt chẽ.
- Phin lá: Mô mm giu c các t bo hnh chữ nht thuôn di, xp chặt v vuông
gc với biểu b trên. Các t bo tit tinh du nằm rải rác trong mô mm. Dưới biểu b trên v
mô giu c các mch xoắn.
Hình 3. Vi phẫu lá Tru không
3.2. Kt quả phân tch mã vạch ADN
Kt quả giải trnh tự gen v định danh loi đưc trnh by trong Bảng 1 v Bảng 2.
Bảng 1. Trnh tự cặp mồi RbcL sử dụng trong phản ng PCR
Tên
mồi
Trnh tự (5’-3’)
Tm
(0C)
Tác giả
RbcL.F
ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
60
Levin v cộng sự (2003) &
Fazekas v cộng sự (2008)
RbcL.R
GTAAAATCAAGTCCACCRCG
(Ghi chú: Tm, nhiệt độ gắn mi)
Trnh tự mẫu 240409
ATTACAAATTAACTTATTATACTCCTGAGTATGAAACCAAAGATACTGATATC
TTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCGCAACCCGGAGTTCCGCCCGAAGAAGCAGGGGCT
GCAGTAGCTGCCGAATCCTCTACTGGTACATGGACAACTGTATGGACCGACGGACTTA
CCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAGG
AAAATCAATATATTTGCTATGTAGCCTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTT
ACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGCTTCAAAGCCCTACGAGCCCT
ACGTCTGGAAGATCTACGAATTCCTCCTGCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCACCC
CATGGAATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGCCCTTTATTGGGAT
GTACTATTAAACCAAAGTTGGGGTTATCGGCTAAGAACTACGGTAGGGCGGTTTATGA
ATGTCTCC
TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 82/2024
142
Bảng 2. Mc độ tương đồng của mẫu khi BLAST trên NCBI
Mẫu
Tên loi
Mã số
% đồng nhất
Tác giả
Mẫu
240409
Piper
betle
MT498318.1
100
Bharathi,T.R. v Prakash,H.S., 2016
(Unpublished)
Nhn xét: Từ Bảng 2 cho thấy mẫu 240409 đã đưc xác định l Piper betle với độ
tương đồng 100% so với cơ sở dữ liệu NCBI.
3.3. Phân tch sơ bộ thnh phần hoá học
Mẫu lá tru không (20g) c độ ẩm kiểm tra thực t l 10,06% đã đưc chit xuất ln
lưt bằng ba loi dung môi c độ phân cực tăng dn: diethyl ether, ethanol 96%, v nước. Một
phn dịch chit từ ethanol 96% v nước đưc thủy phân bằng acid hydrochloric 10%. Các
nhm hp chất chnh đưc định tnh sơ bộ thông qua các phản ng ha học đặc trưng, kt quả
đưc trnh by trong Bảng 3.
Bảng 3. Bảng kt quả phân tch sơ bộ thnh phn ha học của lá Tru không
STT
Nhóm hp chất
Thuốc thử
Cách thực hiện
Phản ng dương tnh
Kt
quả
1
Acid hữu cơ
Na2CO3
Sủi bọt
-
2
Anthranoid
Phản ng Borntrager
Dung dịch kim c mu đỏ
+
3
Anthocyanosid
HCl/KOH
Đỏ/Xanh
-
4
Alkaloid
Thuốc thử chung của
alkaloid
Tủa vô định hnh mu trắng-vàng
nht
+
5
Các chất khử
Thuốc thử Fehling
Tủa đỏ gch
-
6
Carotenoid
H2SO4
Màu xanh dương đm hay mu
xanh dương lục ngã sang mu xanh
dương
-
7
Coumarin
Phát huỳnh quang/UV
365 nm
Sự phát quang mnh UV 365 nm
-
8
Chất béo
Nhỏ dung dịch lên giấy
Vt trong mờ
-
9
Flavonoid
Phản ng cyanidin
Màu hồng đn đỏ
+
10
Hp chất
polyuronic
Pha loãng với cồn 96%
Tủa bông trắng
+
11
Saponin
Phản ng to bọt
C bọt bn
+
12
Tanin
Dung dịch gelatin muối
(Tanin)
Tủa bông trắng
-
13
Polyphenol
Phản ng với dung dịch
FeCl3 (Polyphenol)
C mu xanh đen hay xanh rêu
+
14
Tinh du
Bốc hơi đn cắn
Có mùi thơm
+++
15
Triterpenoid
Phản ng Liebermann-
Burchard
Màu hồng đn đỏ tm
+
16
Glycosid tim
(Khung
steroid/aglycon)
Phản ng
Liebermann-Burchard
Mu chuyển dn thnh xanh dương
đm hoặc xanh dương lục pha xanh
dương
-
17
Glycosid tim
(dường v vòng
lacton 5 cnh)
Phản ng Legal
Xuất hiện mu đỏ
-
Phản ng Keller-Liliani
Vòng phân cách c mu đỏ nâu,
với sắc xanh lá khuch tán dn lên
phía trên.
-
Ghi chú: (-): âm tnh; (+, ++, +++, ++++): dương tnh với các mc độ tăng dn.