Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021
Nghiên cứu
B - Khoa Học Dược
35
KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ VI KHUẨN S. MUTANS, LACTOBACILLUS SPP.
GÂY SÂU RĂNG TỪ CAO CHIẾT LÁ BÀNG (TERMINALIA CATAPPA L.)
Võ Thị Trinh1, Nguyễn Thị Ngọc Anh1
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn S. mutans, Lactobacillus spp. đóng vai
trò quan trọng trong quá trình gây bệnh sâu răng ở người. Nhiều loại cây cỏ có khả năng chữa sâu răng.
Tuy nhiên chưa có tài liệu nghiên cứu về tác động của cao chiết lá cây Bàng lên 2 đối tượng vi khuẩn này.
Mục tiêu: Tách chiết cao thô từ lá cây Bàng Terminalia catappa. Thử hoạt tính ức chế của cao chiết lá
cây Bàng Terminalia catappa lên hai đối tượng vi khuẩn S. mutans, Lactobacillus spp.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Thu thập lá Bàng tươi và chiết cao bằng các dung môi ethanol
70%, ethanol 96% và nước. Thử hoạt tính ức chế của các cao chiết này trên các chủng vi khuẩn S. mutans ATCC
35668; S. mutans và Lactobacillus spp. phân lập từ 95 mẫu phết của bệnh nhân bị sâu răng được thu nhận từ đợt
khám răng miễn phí tại Trường Song ngữ Quốc tế Học Viện Anh Quốc UK Academy và được định danh bằng
bộ kít Microgen Strep đối với S. mutans, dựa vào kiểm tra các đặc tính sinh hóa đối với Lactobacillus spp. Thử
nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh trên các chủng vi khuẩn S. mutans bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch,
trên các chủng, Lactobacillus spp. bằng phương pháp tìm nồng độ ức chế tối thiểu.
Kết quả: Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 17 chủng S. mutans, 30 chủng Lactobacillus spp. Tình
trạng kháng kháng sinh của các chủng S. mutans có biểu hiện tăng, trong đó các chủng kháng cao nhất với
ceftriaxone (64,71%), erythromycin (52,94%), cefotaxime (35,29%); tình trạng kháng kháng sinh của các
chủng Lactobacillus spp. thấp hơn, trong đó các chủng kháng cao nhất với penicillin (20%), vancomycin
(16,67%) và nhạy hoàn toàn với clindamycin, linezolid. Cao chiết lá Bàng từ các dung môi nước, ethanol
70%, 96% không có hoạt tính ức chế S. mutans ở nồng độ 200 mg/ml, có hoạt tính ức chế, Lactobacillus spp.
Trong đó hoạt tính ức chế, Lactobacillus spp. của cao chiết lá Bàng ở nồng độ 200 mg/ml từ nước đạt 25/30
chủng, từ ethanol 70% đạt 29/30 chủng, từ ethanol 96% đạt 28/30 chủng phân lập; một số trường hợp hoạt
tính ức chế của cao chiết lá Bàng cao hơn so với chlorhexidine gluconate 0,12%.
Kết luận: Từ kết quả thu được đã cho thấy cao chiết lá Bàng từ ethanol 70%, 96% và nước có tiềm
năng ức chế , Lactobacillus spp. là tác nhân gây sâu răng thứ cấp. Tuy nhiên, hoạt tính ức chế của các cao
chiết lá Bàng không có trên vi khuẩn S. mutans ở nồng độ 200 mg/ml.
Từ khóa: S. mutans, Lactobacillus spp., Terminalia catappa, bệnh sâu răng
ABSTRACT
INVESTIGATE THE INHIBITION OF S. MUTANS, LACTOBACILLUS SPP. CAUSING TOOTH DECAY
FROM TERMINALIA CATAPPA L.
Vo Thi Trinh, Nguyen Thi Ngoc Anh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 6 - 2021: 35 - 45
Background: Previous studies have shown that the bacteria S. mutans, Lactobacillus spp. play an important role
in the process of causing dental caries in humans. Many plants have the ability to cure tooth decay. However, there has
not been a detailed study on the effects of extracts from the leaves of Terminalia catappa on these two bacteria.
Objectives: The leaves of Terminalia catappa were extracted in different solvent. To test the antimicrobial
activity of Terminalia catappa leaf extract on S. mutans and Lactobacillus spp.
1Khoa Xét Nghiệm Y Học, Trường Đại học Quốc Tế Hồng Bàng
Tác giả liên lạc: ThS. Võ Thị Trinh ĐT: 0917603559 Email: trinhvt@hiu.vn
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021
B - Khoa Học Dược
36
Materials and methods: Collect Terminalia catappa fresh leaves and extract with ethanol 70%, ethanol
96% and water. Test the antimicrobial activity of Terminalia catappa leaf extract on S. mutans ATCC 35668, S.
mutans and Lactobacillus spp. strains. S. mutans and Lactobacillus spp. strains isolated from 95 swabs of patients
with caries were obtained from a free dental examination organized at the British Academy International
Bilingual School UK Academy. The identification use the Microgen Strep kit for S. mutans strains; base on the
basis of colonies morphologies and biochemical tests for Lactobacillus spp. strains. Antibiotic susceptibility testing
of S. mutans strains was performed by agar disc diffusion method, Lactobacillus spp. strains by MIC method.
Results: The results isolated 17 strains of S. mutans, 30 strains of Lactobacillus spp. The antibiotic
resistance status of S. mutans strains showed an increase, in which the strains were most resistant to ceftriaxone
(64.71%), erythromycin (52.94%), cefotaxime (35.29%); the antibiotic resistance status of Lactobacillus spp.
strains was lower, of which the strains were most resistant to penicillin (20%), vancomycin (16.67%) and
completely sensitive to clindamycin, linezolid. The extracts with ethanol 70%, 96% and water of Terminalia
catappa leaf did not have activity against S. mutans at the concentration of 200 mg/ml, only activity against
Lactobacillus spp. The Lactobacillus spp. inhibitory activity of the aqueous extract at the concentration of 200
mg/ml was 25/30 strains, 29/30 strains of 70% ethanol extract, 28/30 strains of 96% ethanol extract; in some
case, the diameter of the zone of inhibition of the leaf extract was higher than chlorhexidine gluconate 0.12%.
Conclusion: The obtained results, it was shown that the extracts with ethanol 70%, 96% and water of
Terminalia catappa leaf have the potential to inhibit Lactobacillus spp. However, the extracts did not have
inhibitory activity on S. mutans at the concentration of 200 mg/ml.
Keywords: S. mutans, Lactobacillus spp., Terminalia catappa, dental caries
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâu răng là một trong những vấn đề sức
khỏe phổ biến trên thế giới, gây hậu quả ở nhiều
mức độ về sức khoẻ răng miệng và sức khoẻ
chung. Theo nghiên cứu của The Global Burden
of Disease Study năm 2017 ước tính có 2,3 tỷ
người trên thế giới bị sâu răng mạn tính, và hơn
530 triệu trẻ em bị sâu răng sữa(1). Hệ vi khuẩn
răng miệng là nguyên nhân chính dẫn đến các
bệnh về răng miệng. Các nghiên cứu trước đây đã
chỉ ra rằng vi khuẩn S. mutans, Lactobacillus spp.
đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây sâu
răng ở người(2). Do vậy nhóm nghiên cứu đã tiến
hành phân lập hai chủng vi khuẩn S. mutans,
Lactobacillus spp. từ 95 mẫu phết của bệnh nhân
bị sâu răng để tiến hành nghiên cứu khảo sát.
Chữa bệnh sâu răng có rất nhiều bài thuốc
về cây cỏ đã được truyền miệng và sử dụng
trong dân gian, trong đó có việc sử dụng chiết
xuất từ lá cây Bàng.
Cây Bàng Terminalia catappa được biết đến là
loại trái cây giàu dinh dưỡng và cũng có lợi ích
về mặt y học. Nhiều nghiên cứu về dược lý trước
đây đã xác nhận loài cây này thể hiện khả năng
kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống
đái tháo đường, chống oxy hóa và ung thư(3).
Terminalia catappa cũng đã được công nhận về
mặt y học có chứa các hoạt chất như alkaloid,
flavonoid, saponin, anthroquinone, terpenoid,
steroid, glycoside, phenol(3,4). Trong đó, hoạt chất
chiết xuất từ nước của lá Bàng ở các giai đoạn
phát triển có sự khác nhau: tanin chiếm tỷ lệ cao
ở lá non, saponin chiếm tỷ lệ cao ở lá trưởng
thành, hoạt chất trong lá đỏ già thấp(5). Một số
nghiên cứu cũng đã cho thấy chiết xuất lá Bàng
từ nước, ethanol và methanol đều có hoạt tính
ức chế một số loài vi khuẩn(3) . Khả năng ức chế
vi khuẩn của chiết xuất lá Bàng non cao hơn lá
Bàng trưởng thành và lá đỏ già(5).
Theo Đỗ Tất Lợi thì người dân ở một số vùng
miền đã sử dụng một số bộ phận cây Bàng để
chữa bệnh. Chẳng hạn, tại Ấn Độ, Indonesia,
Philipin người ta dùng vỏ Bàng sắc uống chữa lỵ,
tiêu chảy và rửa các vết loét, vết thương; lá được
dùng sắc uống chữa cảm sốt, lá tươi giã nát hoặc
xào nóng để đắp và chườm vào nơi đau nhức; hạt
sắc uống chữa ỉa ra máu(6). Tại Suriname, chè
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021
Nghiên cứu
B - Khoa Học Dược
37
được làm từ lá Bàng được dùng để chữa các bệnh
như lỵ và tiêu chảy(7). Ngoài ra, trong dân gian,
theo kinh nghiệm của những người dân Việt
Nam: lá Bàng khô được sử dụng để tạo màu,
ngăn ngừa một số vi khuẩn và các loại nấm trên
cá, lá Bàng non được sử dụng để chữa bệnh sâu
răng. Tuy nhiên, nước ta vẫn chưa có công trình
nghiên cứu chính thức nào về việc sử dụng lá
Bàng tươi hay khô để phòng và trị các bệnh về
răng miệng. Do đó đề tài phân lập chủng vi
khuẩn S. mutans, Lactobacillus spp. gây bệnh sâu
răng và khảo sát chiết xuất từ lá cây Bàng nhằm
ức chế chúng là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng
chiết xuất từ lá cây Bàng trong phòng và điều trị
bệnh sâu răng do S. mutans, Lactobacillus spp.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu lá Bàng tươi trưởng thành (Terminalia
catappa L.) có kích thước dài 11 - 30 cm, rộng 8 -
12,5 cm, màu xanh đậm, mặt trên láng, mặt dưới
nhiều lông mịn được thu ở các quận Tân Phú,
Gò Vấp, Bình Tân trong TP. Hồ Chí Minh.
Chủng chuẩn S. mutans ATCC 35668 mua
của hãng Microbiologics, Mỹ.
Các mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập vi
khuẩn S. mutans, Lactobacillus spp. được thu
nhận từ đợt khám răng miễn phí tổ chức tại
Trường Song ngữ Quốc tế Học Viện Anh Quốc
UK Academy do Hội Bảo trợ Người khuyết tật
và Trẻ mồ côi TP. Hồ Chí Minh, Hội Răng Hàm
Mặt Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và Khối
ngành Sức Khỏe - Trường Đại học Quốc tế Hồng
Bàng tổ chức khám và chữa bệnh cho bệnh nhân.
Thời gian thu mẫu từ 7 giờ 30 phút đến 11 giờ
ngày 15/11/2020.
Phương pháp nghiên cứu
Thu mẫu bệnh phẩm
Sử dụng tăm bông vô khuẩn quệt các mảng
bám và nước bọt trên các tổ chức răng bị sâu. Sau
đó tăm bông được bảo quản trong ống nghiệm có
chứa 1 ml nước muối sinh lý vô trùng. Vận
chuyển về phòng thí nghiệm Vi sinh - Khoa Xét
nghiệm Y học - Trường Đại học Quốc tế Hồng
Bàng để tiến hành trộn mẫu và cấy phân lập(8).
Định danh vi khuẩn S. mutans
Phân lập trên đĩa môi trường BA có bổ sung
75 g/ml gentamicin. Đĩa cấy được ủ ở 37oC, khí
trường 5% CO2, thời gian ủ 48 giờ. Sau ủ, chọn
các khuẩn lạc đặc trưng: màu trắng xám, hình
tròn hoặc không đều, đường kính 0,5 - 1,0 mm,
tan huyết α, khuẩn lạc khô có xu hướng bám vào
bề mặt thạch và hơi rỗ trên bề mặt thạch; nhuộm
Gram: Gram (+); thử nghiệm catalase âm tính,
Taxo P âm tính; định danh bằng bộ kít Microgen
Strep và bảo quản chủng -35oC/ glycerol 20%(8).
Định danh nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp.
Phân lập trên đĩa môi trường thạch MRS có
bổ sung 1% CaCO3. Đĩa cấy được ủ ở 37 oC, khí
trường 5% CO2, thời gian ủ 48 giờ. Sau ủ chọn các
khuẩn lạc đặc trưng: làm tan CaCO3(vòng halo),
tròn, bóng, rìa nguyên, kích thước từ 1 - 3 mm,
màu trắng đục hoặc hơi đục; nhuộm Gram:
Gram dương (+); thử nghiệm catalase âm tính,
oxidase âm tính, không hình thành bào tử,
không sinh khí H2S, không sinh indole, Methyl-
red âm tính, Voges-Proskauer âm tính, không sử
dụng citrate, lên men đường glucose, lactose và
bảo quản chủng -35oC/glycerol 20%(9).
Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh của các
chủng S. mutans
Theo hướng dẫn của CLSI M100, 2020(10),
các khoanh giấy kháng sinh được sử dụng
gồm: cefepime 30 g (Nam Khoa), cefotaxime
30 g (Nam Khoa), ceftriaxone 30 g (Nam
Khoa), chloramphenicol 30 g (Nam Khoa),
clindamycin 2 g (Nam Khoa), erythromycin
15 g (Nam Khoa) và theo hướng dẫn của
EUCAST breakpoint v10(11), các khoanh giấy
kháng sinh được sử dụng gồm: ampicillin 10
g (Nam Khoa), penicillin 10 U (Bionalysis),
vancomycin 30 g (Nam Khoa), tedizolid 2 g
(Liofilchem). Thử nghiệm tính nhạy cảm
kháng sinh của S. mutans được thực hiện trên
môi trường MHA có bổ sung 5% máu cừu.
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021
B - Khoa Học Dược
38
Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh của
các chủng Lactobacillus spp.
Theo hướng dẫn của CLSI M45, 2015, các
kháng sinh được sử dụng gồm: penicillin
(HiMedia), ampicillin (Liofilchem), erythromycin
(HiMedia), vancomycin (Liofilchem), clindamycin
(HiMedia), linezoid (HiMedia). Thử nghiệm tính
nhạy cảm kháng sinh của Lactobacillus spp. được
thực hiện trên môi trường CAMHB có bổ sung
5% máu ngựa(12).
Phương pháp thu thập các mẫu lá cây Bàng
Mẫu lá cây Bàng được thu ở các quận trong
TP. Hồ Chí Minh. Xử lý sơ bộ: rửa sạch, phơi
khô, cắt nhỏ 1 - 2 mm dành cho chiết cồn 96%,
70% và 2 - 4 cm dành cho chiết nước. Mẫu bột
lá Bàng được xác định độ ẩm, hàm lượng tro,
hàm lượng kim loại theo tiêu chí của Dược
điển Việt Nam V(6,13).
Phương pháp tách chiết cao thô
Mẫu bột lá Bàng được tách chiết bằng nước,
ethanol 70% và 96% bằng phương pháp ngâm
dầm ở nhiệt độ thường và thu nhận cao chiết
bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi
của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp(14).
Định tính các hợp chất tự nhiên trong cao
Dựa vào các phản ứng tạo màu theo mô tả
của Saxena và cộng sự, 2012(15) được trình bày
trong Bảng 1.
Bảng 1. Thử nghiệm định tính hợp chất tự nhiên
trong cao chiết
Thử
nghiệm
Kết quả
Alkaloid
Kết tủa màu nâu đỏ
Flavonoid
Hợp chất màu xanh
lá đậm
Saponin
Hình thành bọt
Terpenoid
Lớp màu vàng dưới
đáy
Phenol
Kết tủa màu xanh lá
đậm
Tanin
Kết tủa màu xanh lá,
tím hoặc đen
Phương pháp thử hoạt tính ức chế S. mutans,
Lactobacillus spp. của cao chiết lá Bàng
Sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa
thạch(12,16), dịch chiết lá Bàng được cô thành cao
đến khối lượng không đổi, pha loãng cao chiết
theo dãy nồng độ 200; 100; 50; 25 mg/ml. Cao
chiết bằng nước được pha loãng trong nước
cất vô trùng, cao chiết bằng ethanol 70% và
96% được hòa tan bằng DMSO 1%. Hút 50 µl
cao với các mức nồng độ lần lượt nhỏ vào các
lỗ đã đục trên đĩa MHA có bổ sung 5% máu
cừu đã có chứa vi khuẩn S. mutans, trên đĩa
MRS đã có chứa vi khuẩn Lactobacillus spp.
được pha loãng ở nồng độ 0,5 McFarland (mỗi
lỗ có d = 6 mm), ủ 37oC, 5% CO2 trong 18 - 24h,
quan sát và đo đường kính vòng ức chế vi
khuẩn của cao chiết lá Bàng. Chlorhexidine
gluconate 0,12% dùng làm đối chứng dương
và nước cất vô trùng làm đối chứng âm đối với
cao chiết bằng nước, DMSO 1% làm đối chứng
âm đối với cao chiết bằng ethanol 70% và 96%.
Đường kính vòng ức chế vi khuẩn được đo bằng
thước đo đơn vị mm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Tất
cả các dữ liệu được phân tích thống kê dựa vào
công cụ Data Analysis trong Excel 2013. Dữ liệu
thể hiện giá trị trung bình và độ lệch chuẩn. Mức
ý nghĩa 5% (p < 0,05) được sử dụng như xác suất
chấp nhận tối thiểu cho sự khác biệt giữa các giá
trị trung bình.
Y Đức
Nghiên cứu này được thông qua bởi Hội
đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Đại
học Quốc tế Hồng Bàng, số 62a/QĐ-HIU, ký
ngày 19/02/2020.
KẾT QUẢ
Kiểm tra độ ẩm, độ tro toàn phần và kim loại
nặng trong mẫu nguyên liệu lá Bàng
Độ ẩm của mẫu nguyên liệu bột lá Bàng là
11,22 0,75%. Độ ẩm này nằm trong ngưỡng
10 - 12% đối với các mẫu dược liệu từ lá, là độ
ẩm an toàn để tránh hiện tượng ẩm mốc và các
hoạt chất trong dược liệu từ lá bị biến đổi
trong quá trình bảo quản(17).
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 6 * 2021
Nghiên cứu
B - Khoa Học Dược
39
Độ tro trung bình trong lá Bàng khô là 9,45
0,51%. Xác định độ tro toàn phần là xác định
các hàm lượng chất vô cơ không bay hơi có
trong dược liệu, trong đó có kim loại hoặc
muối của một số kim loại. Tuy nhiên, hàm
lượng các kim loại nặng gây ảnh hưởng đến
sức khỏe con người đã được kiểm tra phân tích
trong Bảng 2 không vượt quá mức quy định
theo hướng dẫn WHO về đánh giá chất lượng
thuốc từ dược liệu(18).
Bảng 2. Hàm lượng kim loại nặng trong mẫu
nguyên liệu lá Bàng
Tên chỉ tiêu
Kết quả
Asen (As)
ppm
7,40 x 10-2
Thủy ngân Hg)
ppm
< 4,50 x 10-2
Cadimi (Cd)
ppm
< 9,00 x 10-2
Đồng (Cu)
ppm
12,6
Chì (Pb)
ppm
0,56
Hiệu quả tách chiết cao
Khối lượng mẫu lá Bàng của 3 lần chiết
xuất là 250 g bột lá/lần cho mỗi loại dung môi.
Hàm lượng cao chiết thu hồi được trình bày
qua Bảng 3. Cao lá Bàng thu được đặc, màu nâu,
vị chát, mùi thơm đặc trưng của dược liệu.
Bảng 3. Hiệu suất chiết cao lá Bàng
Dung môi
Khối lượng cao (g)
Hiệu suất chiết (%)
Nước
59,38 0,96
23,75 0,38
Ethanol 70%
22,79 0,92
9,12 0,37
Ethanol 96%
22,38 0,45
8,95 0,18
Định tính các hợp chất tự nhiên trong cao
Kết quả định tính các hợp chất tự nhiên có
trong cao chiết từ dung môi ethanol và nước
được trình bày qua Bảng 4.
Bảng 4. Kết quả định tính các hợp chất tự nhiên
trong cao chiết lá Bàng
Thử nghiệm
Cao nước
Cao ethanol
70%
Cao ethanol
96%
Alkaloid
+
+
+
Flavonoid
+
+
+
Saponin
+
-
-
Terpenoid
+
+
+
Phenol
+
+
+
Tanin
+
+
+
“+”: phát hiện, “-”: không phát hiện
Kết quả phân lập, định danh S. mutans và
Lactobacillus spp.
Kết quả phân lập từ 95 mẫu phết sâu răng
của các bệnh nhân có độ tuổi từ 6 – 63 tuổi được
17 chủng S. mutans. Khuẩn lạc S. mutans trên
thạch máu sau 2 ngày nuôi ủ có màu trắng xám,
hình tròn hoặc không đều, đường kính 0,5 - 1,0
mm, tan huyết α, khuẩn lạc cứng có xu hướng
bám vào bề mặt thạch và hơi rỗ trên bề mặt
thạch (Hình 1).
Tương tự, từ 95 mẫu phết sâu răng trên của
các bệnh nhân cũng đã phân lập được 30 chủng
Lactobacillus spp. Khuẩn lạc Lactobacillus spp. trên
môi trường MRS sau 2 ngày nuôi ủ có màu trắng
đục hoặc hơi đục, khuẩn lạc tròn, bóng, rìa
nguyên, kích thước từ 1 - 3 mm (Hình 2).
Hình 1. Khuẩn lạc S. mutans trên môi trường BA
sau 2 ngày nuôi ủ ở 37oC, khí trường 5% CO2
Hình 2. Khuẩn lạc Lactobacillus spp. trên môi trường
MRS sau 2 ngày nuôi ủ ở 37oC, khí trường 5% CO2
Kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh
của những chủng S. mutans
Hình 3 cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh
của vi khuẩn S. mutans. Trong đó kháng sinh
có tỷ lệ kháng cao nhất là ceftriaxone
(64,71%), tiếp theo là erythromycin (52,94%),
cefotaxime (35,29%).