Khóa luận tốt nghiệp đại học: Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp Physalis angulata

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ MAI

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH

PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƯỚC

CÂY TẦM BÓP PHYSALIS ANGULATA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

HÀ NỘI – 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ MAI

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH

PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN NƯỚC

CÂY TẦM BÓP PHYSALIS ANGULATA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. NGUYỄN VĂN BẰNG

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG đã định hướng và hướng dẫn em

tận tình trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp.

Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo và các anh, chị cán bộ Viện Hóa

Sinh biển đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện cho em được sử dụng các thiết bị

tiên tiến của viện để nghiên cứu và hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp của

mình.

Em xin chân thành cảm ơn TS. Hoàng Lê Tuấn Anh - Viện Hóa Sinh biển -

Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận tình, hướng dẫn

và giúp em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học - Trường

ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập

tại trường. Xin cảm ơn gia đình và tất cả các bạn bè đã động viên, khích lệ giúp

đỡ trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng

nhận được ý kiến đóng góp chỉ bảo của các quý thầy, cô.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 03 năm 2017

nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy em kính mong

Sinh viên

NGUYỄN THỊ MAI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận:

“Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp

Physalis Angulata”

Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung

thực và không trùng với kết quả của tác giả khác.

Sinh viên

Nguyễn Thị Mai

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR

Kí hiệu Chú giải

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

1H-NMR

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-

Dimensional NMR

CC Sắc ký cột Column Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron

Electron Impact Mass Spectroscopy

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me

Nhóm metyl

MS

Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Hình 1.1: Cây Tầm bóp ............................................................................... 3

Hình 1.2: Hoa và quả cây Tầm bóp ............................................................. 3

Hình 1.3: Quả Tầm bóp xanh ...................................................................... 3

Hình 1.4: Quả Tầm bóp khi chín.................................................................. 3

Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập cây Tầm bóp ....................................................... 30

Hình 4.1.1 Cấu trúc của hợp chất Icariside E5 (VPA1A) ................................. 32

Hình 4.1.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 ....................................................... 33

Hình 4.1.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 ....................................................... 34

Hình 4.1.4 Phổ HMBC của hợp chất 1 ........................................................... 35

Hình 4.1.5 Phổ HSQC của hợp chất 1............................................................ 36

Hình 4.2.1 Cấu trúc của hợp chất Methyl salicylate 2-0-triglycoside (VPA7) ... 38

Hình 4.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 2 .............................................................. 39

Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 ............................................................. 40

Hình 4.2.4: Phổ HMBC hợp chất 2 ................................................................. 41

Hình 4.1.6: Một số tư ơng tác HMBC của hợp chất 1 ...................................... 36

Hình 4.2.6 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất 2 ............................... 43

Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo ...........................37

Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo ...........................44

Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................ 3

1.1. Tổng quan về cây Tầm bóp .................................................................. 3

1.1.1. Giới thiệu về cây Tầm bóp .......................................................... 3

1.1.2. Phân bố, sinh thái....................................................................... 4

1.1.3. Công dụng.................................................................................. 5

1.1.4 Thành phần hóa học .................................................................... 5

b) Các hợp chất flavonoid ............................................................. 11

c) Các hợp chất khác .................................................................... 12

1.1.5. Hoạt tính sinh học .................................................................... 13

1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật ................................................. 15

a) Các hợp chất steroid ................................................................... 5

1.2.1. Chọn dung môi chiết ................................................................. 15

1.2.2. Quá trình chiết ......................................................................... 16

1.3. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ ............. 17

1.3.1. Đặc điểm chung........................................................................ 17

1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký .................................................. 18

1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc ký ............................................ 18

1.3.3.1. Sắc ký cột (C.C)............................................................... 21

1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng .............................................................. 22

1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ23

1.4.1. Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................. 23

1.4.2. Phổ khối lượng (MS)................................................................. 24

1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) ........................................... 24

1.4.3.1. Phổ 1H-NMR ................................................................... 24

1.4.3.2. Phổ 13C-NMR .................................................................. 24

1.4.3.4. Phổ 2D-NMR .................................................................. 25

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 26

2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 26

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất .................................................. 26

1.4.3.3. Phổ DEPT ....................................................................... 25

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ............................................................. 26

2.2.2. Sắc ký cột (CC)......................................................................... 26

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất .................. 26

2.4. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................ 26

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết .................................................... 27

2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất . 27

2.5. Hoá chất ........................................................................................... 27

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ............................................... 28

3.1. Thu và xử lí mẫu................................................................................ 28

3.2. Tính chất vật lí của các hợp chất phân lập được ................................. 31

3.2.1. Hợp chất 1: Icariside E5 ........................................................... 31

3.2.1. Hợp chất 2 :Methyl salicylate 2-0-triglycoside ........................... 31

CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ......................................................... 32

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 .......................................... 32

KẾT LUẬN................................................................................................... 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 47

4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 .......................................... 38

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nhiệt đới với địa hình là ba phần tư là đồi núi, lại

giáp biển đông nên có nguồn sinh thái đa dạng và phong phú. Thế giới sinh vật

phát triển đa dạng về thành phần loài, phong phú về số lượng loài. Số loài thực

vật bậc cao ở nước ta có khoảng 12000 loài, trong đó đã biết gần 4000 loài là cây

thuốc mọc tự nhiên được nhân dân dùng làm thảo dược.

Các loại thảo dược dùng làm thuốc đều có sẵn trong tự nhiên, nhất là khi

Việt Nam lại là quốc gia nhiệt đới nên các loại thảo dược này rất phong phú.Hiện

nay có nhiều phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại ,đạt kết quả cao,con

người đã nghiên cức các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các chất tách ra từ

các dịch chiết.Do vậy mà đã tìm ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có hiệu

quả trong việc chữa trị các căn bệnh nan y.

Vì vậy, việc nghiên cứu các thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên

Cây Tầm bóp (Physalis angulata) hiện đang thu hút các nhà nghiên cứu vì trong cây chứa hàm lượng lớn các chất hóa học có hoạt tính ngăn ngừa ức chế

nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao .

đới như vùng Nam Mỹ, Ấn Độ , Trung quốc .Ở Việt Nam, cây Tầm bóp mọc

hoang dại trên khắp mọi vùng miền đất nước tại những cánh đồng, bờ ruộng và

ven đường.

Theo dân gian, lá cây Tầm bóp dùng để trị cảm sốt, ho nhiều đờm, yết

hầu sưng đau. Lá cây Tầm bóp tốt cho dạ dày, do đó ngoài việc dùng lá cây làm

mầm tế bào ung thư [18]. Cây thường phân bố ở những vùng nhiệt đới, liên nhiệt

1

thuốc chữa bệnh người ta còn dùng thứ cây này như một vị rau ăn hàng ngày.

Một số hợp chất trong cây Tầm bóp có hoạt tính chống sốt rét [16] ,điều hòa hệ

miễn dịch [13], hoạt tính kháng khuẩn [23] ,hoạt tính ‘in vitro” chống lại các siêu

vi khuẩn bại liệt sởi [19] ,ban hồng được nghiên cứu trong những năm 2000-

2004 và hoạt tính chống ung thư [18]

Vì vậy, tôi chọn cây Tầm bóp làm đối tượng nghiên cứu, với mục đích

nhằm góp phần tìm hiểu thêm về những thành phần hóa học của cây trong phân

đoạn nước. Từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển ngành y dược trong

công cuộc chữa bệnh cứu người và làm tăng thêm kho tàng tri thức về cây thuốc

cổ truyền Việt Nam với đề tài khóa luận là: “Bước đầu nghiên cứu thành phần

hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp Physalis angulata”

Nhiệm vụ của đề tài:

1. Thu mẫu lá cây Tầm bóp, xử lí mẫu và tạo dịch chiết.

2. Nghiên cứu phân lập các hợp chất hóa học trong phân đoạn nước từ cây

Tầm bóp.

2

3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây Tầm bóp

Tên khoa học: Physalis angulata

1.1.1. Giới thiệu về cây Tầm bóp

Tên tiếng việt: Cây Tầm bóp (Cây thù lù, cây đèn lồng,...)

Chi: Thù lù (Physalis)

Họ : Cà (Salanaceae)

Bộ: Cà (Solanales)

Hình 1.1: Cây Tầm bóp Hình 1.2: Hoa và quả cây Tầm bóp

Hình 1.3: Quả Tầm bóp xanh Hình 1.4: Quả Tầm bóp khi chín

3

Lớp (Nhóm): Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)

1.1.2. Phân bố, sinh thái

- Chi Thù Lù (Physalis) bao gồm nhiều loài thực vật có nguồn gốc ở vùng nhiệt

đới và cận nhiệt đới với khoảng 75- 90 loài. Hầu hết các loài trong chi này

có nguồn gốc từ Mexico ở Nam Mỹ. Kể từ khi, người Tây Ban Nha và Bồ

Đào Nha chiếm Nam Mỹ làm thuộc địa, các loài cây thù Lù được phát tán

khắp châu lục chúng thích nghi trở thành cây mọc hoang trên khắp thế giới.

- Cây Tầm bóp (Physalis angulata) có nguồn gốc từ vùng đất nhiệt đới châu

Mỹ sau này trở thành cây liên vùng nhiệt đới.Tầm bóp mọc hoang trên các

bờ ruộng, bãi cỏ, đất hoang hay ven đường làng quê, ở khắp phía Nam châu

Âu, Ấn Độ, Baluchistan, Afghanistan, nhiệt đới châu Phi, Singapore và các

đảo ở Thái Bình Dương. Ngoài ra còn thấy ở ven rừng từ vùng thấp đến

vùng có độ cao 1500m so với mặt nước biển.

- Tầm bóp là cây thân thảo.

+ Thân: thân cao 50- 100cm, phân nhiều cành. Đường kính thân tròn từ 1-

2cm.

+ Lá: lá mọc so le, hình bầu dục, dài 30- 35mm, rộng 20- 40mm, cuống lá

+ Hoa: hoa mọc đơn độc ở nách lá, có cuống mảnh dài khoảng 1cm. Đài

hình chuông, chia ra từ phía giữa thành 5 thùy, tràng hoa màu vàng tươi

hay màu trắng nhạt. Quả mọng, tròn, nhẵn, lúc non màu xanh, khi chín

màu đỏ hoặc vàng, có đài lớn cùng với quả dài 3- 4cm, rộng 2cm bao trùm

lên ở ngoài như cái túi. Ruột quả có nhiều không gian rỗng, khi bóp vỡ

phát ra tiếng “bộp” .

dài từ 15- 30mm.

4

+ Hạt: quả chứa nhiều hạt nhỏ hình thận.

1.1.3. Công dụng

- Toàn cây có vị đắng, tính mát, không độc, thường dùng trị cảm sốt, ho nhiều

đờm, yết hầu sưng đau. Dùng ngoài da trị nhọt vú, đau bìu đái, đinh độc.Quả

Tầm bóp chữa đờm nhiệt sinh ho, chữa chứng đái đường.Ở Ấn Độ, dịch lá được

dùng trị bệnh táo bón và đau dạ dày, cây dùng làm thuốc lợi tiểu.Rễ được dùng

như loại thuốc giun giải nhiệt và điều trị bệnh tiểu đường.

1.1.4 Thành phần hóa học

- Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của cây Tầm bóp. Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy cây Tầm bóp

này chứa các chất thuộc nhóm alkaloid, steroid thực vật, Flavonoid và một số đó

chưa được tìm thấy trong khoa học.

- Năm 1970, Matsuura T và cộng sự đã xác định được cấu trúc hóa học của

a) Các hợp chất steroid

5

physalin A và physalin B [17]

- Năm 1978, L.Ramachandra Row thông báo đã tách được năm hợp chất

3

physalin E , F , G, H , I. Và cấu trúc hóa học của physalin F và physalin J được

6

xác định. [12]

- Năm 1990 , Jin- kai Juang và cộng sự của ông đã tìm ra một withanolide mới là

withangulin A , được phân lập từ cây Tầm bóp [11]

- Đến năm 1991, Kazushi Singu và cộng sự cũng tìm thấy physagulin C, được

- Năm 1991, Shingu và cộng sự của ông thông báo đã tìm được hợp chất mới là

phân lập từ thân và lá cây Tầm bóp [25]

physagulin C. Năm 1992 ông và cộng sự tìm được thêm physagulin A ,B , D từ

7

lá tươi và thân cây Tầm bóp [20]

- Ngoài ra trong cây còn chứa :withphysalin A,B,C; Withangulatin A,B;

8

Withphysalin A Withaphysalin B

Withaphysalin C Withangulatin A Withangulatin B

- Người ta còn tìm thấy các hợp chất Withaphysalis P,Q,R,S có trong cây Tầm

9

bóp nhỏ.

- Từ lá, rễ, thân cây được báo cáo là có chứa stigmasterol, sitosteol,

Β-sitosterol Stimasterol

10

physangulidine.

WithnolideA Withanone

- Trong khi đó ở hoa và quả thì chứa withanone, withanolide A

- Vào năm 2014, tại Viện Hóa học, Đại học Tự trị Quốc gia Mexico,Emma

Maldonado và cộng sự đã phát hiện được một withanolide mới – physangulide

B , được phân lập từ đài hoa Tầm bóp. Cấu trúc của hợp chất này phân tích trên

b) Các hợp chất flavonoid

dữ liệu quang phổ, chỉ ra sự hiện diện của nhóm 20,24-epoxy [12]

11

- Năm 1976, Lopez và cộng sự thông báo đã phân lập được ayanin một o-

ayanin

- Năm 2001, Ismail N và cộng sự đã tìm ra hợp chất myricetin 3-O-

methylated flavonol từ cây Tầm bóp [25]

neohesperidoside, được phân lập từ dịch chiết MeOH, cho thấy hoạt tính

gây độc tế bào sắc in vitro chống lại chuột dòng tế bào bệnh bạch cầu P-

c) Các hợp chất khác

- Năm 1992, Basey K cùng cộng sự thông báo tìm được một alkaloid mới là

388 [10]

Phygrine

phygrine [7]

12

Ngoài ra có nhiều chất hóa học đã được tìm thấy trong cây như axit chlorogenic, cholin, ixocarpanolit, myriceti ,vamonolit...

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hóa học cũng như hoạt tính sinh học của

các loài thuộc chi Thù Lù (Physalis), cũng như loài Physalis angulata còn khá ít.

Nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế, mới chỉ mang tính chất thăm dò, chưa đưa ra

phương hướng ứng dụng thực tế.

1.1.5. Hoạt tính sinh học

- Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất hóa

học được phân lập từ cây Tầm bóp đặc biệt nghiên cứu hoạt tính của các dòng

physalis, withanolide.

- Cây Tầm bóp đã được nghiên cứu lâm sàng gần đây (vẫn đang được tiến

hành), dựa trên những nghiên cứu ban đầu cho thấy nó là một chất kích thích

miễn dịch hiệu quả, rất độc đối với nhiều loại ung thư và tế bào ung thư bạch

cầu và nó có tính chất chống vi trùng. Các steroid mới tìm thấy trong cây Tầm

bóp đã nhận được nhiều sự chú ý, và nhiều tác động chống ung thư và chống lại

bạch cầu được cho là do các steroid.

- Các chất chiết xuất khác nhau của cây Tầm bóp, cũng như các steroid

thực vật chiết xuất được gọi là physalin , đã cho thấy hoạt tính in-vitro và in -

vivo mạnh mẽ với nhiều loại tế bào ung thư người và động vật, bao gồm phổi,

thư. Nghiên cứu về ung thư này bắt đầu vào đầu những năm 1980 với các nhà

nghiên cứu ở Thái Lan và Hoa Kỳ và đã được kiểm chứng bằng các nghiên cứu

được thực hiện tại Đại học Đài Loan năm 1992 - Physalin F và Physalin D( trích

từ nguyên cây Tầm bóp bằng etanol) có hoạt tính diệt tế bào trên 8 dòng tế bào

ung thư trong đó có 5 dòng loại ung thư ở người và 3 dòng ung thư ở động vật.

ruột kết, mũi họng, gan, cổ tử cung, u ác tính và glioma (Não) tế bào ung

13

(Nguồn: Anticancer Research Số 12_1992).

- Sau đó, vào năm 2001, các nhà nghiên cứu tại Đại học Houston đã phân

lập được một hóa chất mới - myricetin 3-o-neohesperidosid trong Tầm bóp [10],

cho thấy độc tính đáng kể đối với tế bào ung thư vòm họng, ung thư phổi (ung

thư biểu mô tuyến) cũng như bệnh bạch cầu ở chuột. Các nhà nghiên cứu ở Nga

và Trung quốc đã chứng minh một cách độc lập các hiệu quả điều hòa hệ miễn

dịch chống lại sự phát sinh của bệnh ung thu, đồng thời tăng cường khả năng

miễn dịch khác , nó có thể gây ra các phản ứng chống lại bệnh bạch cầu ở những

con chuột.

- Meira và cộng sự cũng báo cáo rằng physalis B và F được phân lập từ

cây Tầm bóp gây ức chế mạnh sự tăng sinh của cấu trúc nhỏ và khả năng lây

nhiễm của Trypanosoma cruzi [19]. Silva và cộng sự báo cáo các chất chiết xuất

nước của Physalis angulata có thể thúc đẩy sự khác biệt của các tế bào tủy

xương, đặc biệt là Macrophages [22].

- Nghiên cứu tại Viện khảo cứu các hợp chất thiên nhiên thuộc ĐH Y Khoa

Kaohsing (Taiwan) về hoạt tính chống ung thư gan của cây Tầm bóp ghi nhận:

Các dịch chiết toàn cây bằng nước và bằng etanol được đánh giá về hoạt tính

chống ung thư gan trên các dòng tế bào Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 ghi nhận

hoạt tính chống ung thư do hiện tượng tế bào tự hủy phối hợp với những rối

Sciences số 74,2-2004).

- Physangulidine được cô lập từ Physalis angulate có thể làm xáo trộn

chu kì tế bào và gây chết tế bào trong DU145 do apoptosis, ung thư tuyến tiền

liệt ở người [24]

14

loạn chức năng của các mitochondria nơi màng tế bào bị ung thư.(Nguồn Life

- Matheus S.v à cộng sự của ông đã nghiên cứu về hoạt tính chống sốt rét của

physalin B, D, F, G được tách từ cây Tầm bóp cho thấy sự ức chế sự sinh trưởng

của kí sinh trùng [16]

Một số nghiên cứu khác chứng minh được hoạt tính invitro của dịch chiết

cây Tầm bóp trên 1 số vi khuẩn chống lại các siêu vi khuẩn bại liệt, sởi, bạch

cầu.

1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Tuỳ thuộc vào chất có trong mẫu thực vật khác nhau (chất phân cực, chất

không phân cực, chất có độ phân cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ

dung môi khác nhau.

1.2.1. Chọn dung môi chiết

Các chất chuyển hóa thứ cấp liên tục, trong quá trình chiết nên mỗi phân

đoạn sẽ có độ phân cực khác nhau. Do đó dung môi dùng trong mỗi phân đoạn

chiết phải được lựa chọn cẩn thận.

Điều kiện của dung môi: Phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ

cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất

Các tạp chất ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả trong quá trình chiết,

do đó các dung môi được sử dụng phải sạch.

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các

hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm

tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được

nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.

15

lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của

chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà

tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung

bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng

thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá

trình chiết sơ bộ.

Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay

vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.

1.2.2. Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm.

- Chiết sắc với dung môi nước.

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.

Trong đó, chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng

rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và

thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để

điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp

chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ

rồi chất chiết được lấy ra. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài

cách khác nhau.

thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn.

16

Ví dụ:

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra

mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự

xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung

môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao.

Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất

mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

1.3. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Sắc ký là một trong những phương pháp quan trọng,phổ biến hữu hiêu nhất hiện

nay. Sắc ký được áp dụng rất rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như định tính,

định lượng, điều chế các chất tinh khiết, xác định các hằng số hóa lí, nghiên cứu các

quá trình động học và xúc tác.

Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu

hiệu nhất hiện nay, được sử dụng trong việc phân lập các hợp chất hữu nói chung và

các hợp chất thiên nhiên nói riêng.

Sắc ký là phương pháp tách liên tục các chất từ hỗn hợp các chất do sự

phân bố không đồng đều của chúng, giữa pha cố định và pha di động khi cho pha

di động di chuyển qua pha cố định.

Khi tiếp xúc với pha cố định, các phần tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa tính

chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) tương ứng với pha động và pha tĩnh.

17

1.3.1. Đặc điểm chung

1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký

Định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của

lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí

là áp suất riêng phần), xét trong điều kiện nhiệt độ không đổi.

Trong đó

b: Hằng số.

C: Nồng độ của chất bị hấp phụ.

n: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đại cân bằng

n∞: Lượng chất cực đại có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó

1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong các phương pháp sắc ký: pha động là các chất ở trạng thái khí hay

lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.

• Theo bản chất của hai pha sử dụng:

+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được

xử lý, nó có thể nạp vào trong một cột.

+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt

một chất mang.

- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí.

18

- Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng.

+ Pha động là chất lỏng: Ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký

lớp mỏng, sắc ký cột.

+ Pha động là chất khí: Ví dụ trong kĩ thuật sắc ký khí. Trong

trường hợp này chất khí được gọi là khi mang hay khí vectơ.

• Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình phân tách chất.

- Sắc ký phân chia (partition chromatography).

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí).

+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất

lỏng này được nổi hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.

- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography).

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí,

+ Pha tĩnh là chất rắn: Đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính

trơ,được nối trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử

dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.

- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa

học ở dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.

- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration chromatography

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên

học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của các hạt mang các nhóm chức hóa

19

bề mặt có nhiều lỗ rỗng.

- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)

+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi

trong việc tinh sạch protein.

+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong

cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực

với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.

- Sắc ký lỏng cao áp: Kĩ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của

kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản

thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí

tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được

làm từ vật liệu mịn hơn nên để có được một tốc độ chảy thích hợp, phải có một

áp lực tác động lên cột. Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography

configuration).

- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng.

Trong sắc ký giấy:

+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos.

+ Pha động: chất lỏng.

+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là

loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực.

+ Pha động: Luôn luôn là chất lỏng.

- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)

+ Là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng

Trong sắc ký lớp mỏng:

20

đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên

bề mặt của pha tĩnh.

• Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn:

Sắc ký lỏng và sắc ký khí.

• Theo cách tiến hành sắc ký, người ta chia sắc ký thành các nhóm nhỏ: Sắc ký

cột và sắc ký lớp mỏng.

1.3.3.1. Sắc ký cột (C.C)

Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phổ biến, đơn giản nhất. Chất hấp phụ là

pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha

đảo YMC, ODS, Dianion. Chúng được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh

hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ phản ánh

số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất càng

nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên,

hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) có thể xảy ra nếu chất hấp phụ

có kích thước hạt càng nhỏ, tốc độ chảy càng giảm. Khi đó, người ta phải sử

dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).

khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc

vào hỗn hợp chất cụ thể.

Trong sắc ký, Rf được gọi là tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách

so với quãng đường đi của dung môi, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau.

Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.

21

Trong sắc ký cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều dài cột (L) thể hiện

Tùy theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ chất so với chất hấp phụ khác nhau:

Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào

hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong

khoảng 1/20 - 1/30.

Trong sắc ký cột tùy vào lượng chất và dạng chất sẽ có các phương pháp

khác nhau để có thể đưa chất lên cột. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ

biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách

tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột

với lượng tối thiểu.

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

+ Cách 1: Nhồi cột khô.

Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que

mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phi sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng

dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.

+ Cách 2: Nhồi cột ướt.

Chất hấp phụ được hòa tan vào trong dung môi chạy cột trước với lượng

dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.

1.3.3.2. Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica

gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh, thường được sử dụng để kiểm tra và định

hướng cho sắc ký cột. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp.

Bằng việc sử sụng SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn) ,có

22

thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký người ta có thể cạo

riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích

hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng

đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung

dịch H2SO4.

1.4. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương

pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử

dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các

phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu

trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung

khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp sắc ký so sánh,….

1.4.1. Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các

liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại hoặc tia

khuyếch tán Raman. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng

khác nhau. Vì vậy có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất

dựa vào phổ hồng ngoại, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm -OH tự do trong

cm-1, của nhóm ete C-O-C trong vùng 1020 - 1100 cm-1,… Đặc biệt vùng dưới

700 cm-1 được gọi là vùng vân tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu

cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp.

Hiện nay, đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ

hồng ngoại được đo sau khi hoàn chỉnh các phép đo khác bởi vì thông tin chung

23

các nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm C=C trong vùng 1630 – 1650

thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều mà lượng chất cần để thực hiện phép đo

này lại cần đến 2 - 3 mg chất và khó thu hồi lại.

1.4.2. Phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của

phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Người ta có thể xác định

được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất vì

phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối

lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:

1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu

nhất hiện nay. Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp

chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ

NMR một chiều và hai chiều.

1.4.3.1. Phổ 1H-NMR

Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác

định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử

cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Người ta có thể xác định được cấu trúc

tương tác spin- spin.

hóa học của hợp chất dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và

1.4.3.2. Phổ 13C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng

hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ

13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm.

24

1.4.3.3. Phổ DEPT

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ

DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm

về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 900

chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH.

1.4.3.4. Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các

hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu

thường được sử dụng như sau:

 Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương

tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR.

Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.

 Phổ HMBC: Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử.

Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ

25

phân tử được xác định về cấu trúc.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Toàn bộ mẫu cây Tầm bóp (Physalis angulata) được thu tại tỉnh Thái Bình

vào tháng 8 năm 2015 và được giám định bởi TS. Trần Thị Phương Anh, Bảo

Tàng Thiên Nhiên Việt Nam. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại viện Hóa Sinh biển,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254

(Merck-Đức). Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng

254 và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản

mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu.

2.2.2. Sắc ký cột (CC)

Được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo.

Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel

pha đảo OSD hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd).

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được đo trên máy Bruker AM500

FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

2.4. Dụng cụ và thiết bị

26

2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử

dụng bao gồm: bình chiết 30 lít, phễu chiết 2 lít, máy cô quay chân không, đèn tử

ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm, tủ sấy chân không, máy sấy, micropipet,

bình sắc ký loại phân tích và điều chế, cột sắc ký pha thường và pha ngược.

2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất

Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.

2.5. Hoá chất

+ Silica gel pha thường 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck.

+ Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC RP18 (150 m, FuJisilisa Chemical

Ltd).

+ Bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck

1,05715).

+ Bản mỏng tráng sẵn silica gel pha đảo RP18 F254s (Merck).

+ Bản mỏng điều chế silica gel pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).

+ Các loại dung môi hữu cơ như metanol, etanol, etyl axetate, clorofom,n-

27

hexan, axetone.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. Thu và xử lí mẫu

4,5 kg mẫu khô cây Tầm bóp, được cắt nhỏ, phơi khô, xay thành bột mịn

rồi được ngâm chiết với metanol vớ sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần

60 phút ở 40-50 oC, 3-5 lần). Lớp dung môi metanol được lọc qua giấy lọc rồi

tiến hành cất loại dung môi metanol bằng thiết bị cất quay chân không áp suất

giảm thu được 200 g cặn chiết metanol.

200 g cặn chiết metanol mẫu Tầm bóp thu được ở trên được phân bố đều

vào 2 phễu chiết có chứa 1L nước cất. Sau đó, bổ sung vào mỗi phễu chiết 1L

diclometan, lắc đều rồi để phân lớp qua đêm (3 lần). Lớp diclometan (dưới) được

lọc qua giấy lọc rồi cất loại diclometan bằng thiết bị cất quay chân không áp suất

giảm thu được 80,0 g cặn diclometan. Lớp nước (trên) được loại bỏ dung môi

còn sót lại và nước thu được 30,0 g cặn nước.

Cặn nước được đưa qua cột Diaion HP-20, rửa bằng nước cất để loại muối

vô cơ rồi tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi có độ phân cực giảm dần

MeOH/H2O (tăng dần nồng độ metanol trong nước, 25% - 50% - 75% -100%

Phân đoạn W2 (3,8g) tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký sử dụng silica

gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH/H2O (3/1/0,1,v/v/v thể

tích 4,0lit) thu được 2 phân đoạn là W2A và W2B.

Phân đoạn W2A được tinh chế trên cột sắc ký pha đảo C-18 với hệ dung

môi rửa giải MeOH/H2O(2/1,v/v thể tích 1,5lit), rồi tiếp tục đưa qua cột

28

metanol) thu được 4 phân đoạn W1 – W4.

Shephadex LH20 với hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O (3/1,v/v thể tích 1,2lit)

thu được hợp chất WPA1A (12mg) – Hợp chất 1

Phân đoạn W2B được tinh chế trên cột sắc ký pha đảo C-18 với hệ dung

môi rửa giải axeton/nước (1/1, v/v thể tích 2,3lit) thu được 2 phân đoạn W2B1

và W2B2. Tiếp tục tinh chế phân đoạn W2B2 trên cột sắc ký sử dụng silica gel

pha thường với hệ dung môi rửa giải ethyl axetat/metanol/nước (15/1/0,05 về thể

29

tích 1,5lit) thu được hợp chất VPA7 (9mg) – Hợp chất 2

Chiết với methanol

M: Methanol D: Điclometan

( 3 lần x 3l)

EtOAc: Ethylaxetat W: Nước

Physalin angulata (4,5 kg)

A: Axeton

Bổ sung nước và chiết phân lớp với

CH2Cl2 (3 lần)

Cặn Methanol (200g)

Cặn nước (30g) Điclometan (80g)

M:W (25,50,75,100% M)

Diaion HP20

W1 W2 (3,8g) W3 W4

Silicagel pha thường D:M:W (3/1/0,1)

Silica gel pha đảo C-18

Silica gel pha đảo C-18

A:W (1/1)

M:W (2/1) và

Cột Shephadex LH20

W2B2

W2B1

W2A W2B

M:W (3/1) VPA1A (12mg)

Silica gel pha thường

(Hợp chất 1)

EtOAc/M/W (15/1/0,05)

WPA7 (9mg)

(Hợp chất 2)

30

Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập cây Tầm bóp

Như vậy, có 2 hợp chất được phân lập từ phần cặn chiết nước của cây Tầm bóp.

3.2. Tính chất vật lí của các hợp chất phân lập được 3.2.1. Hợp chất 1: Icariside E5

Chất bột trắng vô định hình, có công thức phân tử là C26H34O11 ( M = 522,21).

1H-NMR (500MHz, CD3OD); 13C-NMR (125Hz, CD3OD) (Bảng 4.1)

3.2.1. Hợp chất 2 :Methyl salicylate 2-0-triglycoside

Chất bột vô định hình,có công thức phân tử là C25H36O17 ( M=608,55).

1H-NMR (500MHz, CD3OD); 13C-NMR (125Hz, CD3OD) (Bảng 4.2)

31

CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1

Hình 4.1.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất Icariside E5 (VPA1A)

Hợp chất 1 nhận được là chất bột vô định hình,trên phổ 1H-NMR của hợp chất

này cho thấy hai proton nối đôi (cấu hình trans) tại δH 6,58 (1H, d, J = 16,0 Hz)

và 6,33 (1H, dt, J = 5,5.16Hz); ba proton ở vòng thơm thế 3 vị trí 1,3,4 tại δH 6,6

(1H,d , J= 1,5Hz).6,57 (1H, br s) và 6,50 (1H, dd, J = 1,5 và 8,0 Hz); hai proton

(3H, s) và 3,71 (3H, s). Bên cạnh đó còn quan sát thấy tín hiệu của một proton

anomeric tại δH 4,7 (1H, d, J = 7,0 Hz) gợi ý sự có mặt của 1 đơn vị đường .

32

singlet tại δH 6,95 (1H, br s) và 6,94 (1H, br s); hai proton methoxy tại δH 3,85

Hình 4.1.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1

Trên phổ 13C-NMR và quang phổ 2D- HSQC cho thấy tín hiệu 26 cacbon, bao

D-glucose tại δC 105,4. 76,0. 77,9. 71,3. 78,1, and 62,5; hai cacbon methoxy tại

δC 56,4 và 56,3; và 12 cacbon của 2 vòng thơm trong đó 7 cacbon không liên kết

với hydro và 5 cacbon metin (CH).

33

gồm hai cacbon olefin có liên kết đôi δC 131,5 và 129,7; 6 cacbon của đường β-

Tương tác từ H-2 (δH 6,57) và H-5 (δH 6,60) đến C-1 (δC 133,2)/ C-3 (δC 148,4)/

C-4 (δC 145,4); từ H-6 (δH 5,50) đến C-4 (δC 145,4)/ C-7 (δC 39,2); và từ proton

methoxy (δH 3,71) đến C-3 (δC 148,4) khẳng định vị trí của cacbon methoxy tại

C-3. Các tương tác giữa H-9 (δH 4,25) đến C-7 (δC 131,5) / C-8 (δC 129,7); H-7

(δH 6,58) đến C-2 (δC 109,1) / C-6 (δC 119,2); H-2 (δH 6,95) / H-6 (δH 6,94) /

H-1 (δH 4,70, Glc) đến C-4 (δC 145,0); và proton giữa methoxy (δH 3,85) đến

34

Hình 4.1.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1

C-3 (δC 153,5) khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-7, vị trí đường glucose tại

C-4, và nhóm methoxy tại C-3, tương ứng.

35

Hình 4.1.4 Phổ HMBC của hợp chất 1

Hình 4.1.5 Phổ HSQC của hợp chất 1

Kết quả so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 1 thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị

trí tương ứng của chất Icariside E5 [15]. Từ đó chất này được xác định là

Icariside E5 (VPA1A) có CTPT: C26H34O11 với số khối tương ứng M = 522,21.

36

Hình 4.1.6: Một số tương tác HMBC của hợp chất 1

Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo

a,c (mult., J in Hz)

δH

a,b δC 133.2 115.7 148.4 145.4 113.8 122.6

No. 1 2 3 4 5 6 7

a δC 133.2 116.0 148.3 145.3 114.1 122.8 39.1

HMBC 1, 3, 4 1, 3, 4, 6 5 1, 6, 8, 9, 5' 39.2

42.8

8 9 43.0 66.5 66.8

4′-O-Glucosyl

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''

106.0 75.7 77.5 71.0 77.8 62.3

4.70 (d, 7.0) 3.48 (t, 9.0) 3.43 (t, 8.0) 3.39 (t, 8.5) 3.13 (m) 3.68 (m),3.79 (d, 12.0)

1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 3-OMe 3'-OMe 135.4 108.7 153.4 145.0 139.0 118.7 131.5 129.6 63.5 56.0 55.9 135.4 109.1 153.5 145.0 139.0 119.2 131.5 129.7 63.7 56.3 56.4 - 6.57 (br s) - - 6.60 (d, 1.5) 6.50 (dd, 1.5, 8.0) 2.74 (dd, 9.5, 14.0) 2.99 (dd, 6.0, 14.0) 3.98 (m) 3.70 (m) 3.80 (d, 11.0) - 6.95 (br s) - - - 6.94 (br s) 6.58 (d, 13.5) 6.33 (dt, 5.5, 16.0) 4.25 (dd, 1.0, 6.0) 3.71 (s) 3.85 (s)

105.4 76.0 77.9 71.3 78.1 62.5

a đo trong CD3OD; b125 MHz; c500 MHz;

37

3', 4', 6', 7' 2', 4', 7', 8 1' 7', 8' 3 3' 4'

Hình 4.2.1 Cấu trúc của hợp chất Methyl salicylate 2-0-triglycoside

4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2

(VPA7)

Hợp chất 2 nhận được là chất bột trắng vô định hình.

thế 1,2 tại δH 7,79 (1H,d, J = 7,5Hz); 7,46 (1H, t, J =7,5 Hz); 7,33 (1H, d, J =

8,5Hz); 7,09 (1H, t, J = 7,5); và một tín hiệu proton methoxy tại δH 3,89 (3H, s).

Bên cạnh đó, ba proton anomeric được quan sát thấy ở δH 5,34 (1H, d, J=7,0

Hz); 4,86 (1H, chồng lấp) và 4,31 (1H, d, J = 7,0 Hz) cho thấy sự có mặt của

trisaccharide.

38

Trên phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của bốn proton của một vòng benzen

Hình 4.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 2

cacbon cacbonyl tại δC 167,9; sáu cacbon thơm tại δC 157,6(C) ; 135,2 (CH);

132,4 (CH); 122,6 (CH); 121,2 (C); 116,5 (CH); một cacbon methoxy tại δC

52,6. Tín hiệu cacbon anomeric tại δC 105,3 và cacbon oxymethylene tại δC 66,8

cho biết sự hiện diện của một xylopyranose. Ngoài ra, hai tín hiệu cacbon

anomeric đã được quan sát ở δC 99,6 và 104,3 cùng với 1 cacbon oximethine tại

Trên phổ 13C-NMR và HSQC cho tổng số 25 tín hiệu cacbon, trong đó có 1

39

δC 82,9; và hai cacbon oxymethylene tại δC 69,9 và 61,4 cho biết sự hiện diện của

2-O-β- D- glucopyranosyl –(1→2) –[O- β-D-xylopyranosyl-(1→6)]-O- β-D-

glucopyranoside.

Phân tích các tương tác đã nhận được trên phổ 2 chiều HSQC và HMBC cho

phép gán chính xác các giá trị phổ NMR. Các tín hiệu proton được gán với các

tín hiệu cacbon tương ứng dựa vào kết quả phân tích phổ HSQC (Bảng 4.2)

.Trên phổ HMBC, tương tác giữa proton anomeric H-1′ (δH 5,34. Glc1) và C-1

(δC 157,5); H-1′′(δH 4,86 Glc2) và C-2′′ (δC 82,9); H-1ʹ (δH 4,31, Xyl) and C-6

Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2

40

(δC 69,6) đã chứng minh cho 2-O-β-D-glucopyranosyl-(12)-[O-β-D-

xylopyranosyl-(16)]-O-β-D-glucopyrano-side và vị trí cacbon methoxy tại C-7

đã được xác nhận nhờ tương quan giữa proton methoxy (δH 3,89) và C-7 (δC

167,9).

Hình 4.2.4: Phổ HMBC hợp chất 2

41

Kết quả so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 2 thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí

tương ứng của hợp chất Methyl salicylate 2-O-triglycoside [14]. Từ đó, hợp chất

Hình 4.2.5: Phổ HSQC hợp chất 2

2 được xác định là Methyl salicylate 2-O-triglycoside có CTPT: C25H36O17 (M

=608,55)

42

43

Hình 4.2.6 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất 2

Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo

a,c (mult., J in Hz)

δH

d δC 121.0 157.4 116.4 134.1 121.5 131.6 166.3 52.0

No. 1 2 3 4 5 6 7 7-OMe - - 7.33 (d, 8.5) 7.46 (t, 7.5) 7.09 (t, 7.5) 7.79 (d, 7.5) - 3.89 (s)

100.0 82.7 77.8 71.1 77.5 1' 2' 3' 4' 5'

a,b δC 121.2 157.5 116.5 135.2 122.6 132.4 167.9 52.6 3-O-Glucosyl 99.6 82.9 77.4 70.86 77.6

6' 69.5 69.6 5.34 (d, 7.0) 3.85 (m) 3.72 (t, 8.5) 3.48 (m) 3.99 (t, 8.5) 3.78 (dd, 1.5, 11.5) 4.11 (d, 11.5)

61.4

105.7 76.8 78.1 71.2 78.3 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 2′′-O-Glucosyl 104.3 76.0 77.1 70.6 77.3

105.9 75.0 78.1 70.8

1''' 2''' 3''' 4'''

6′′-O-Xylosyl 105.3 75.0 77.4 71.1

5'''

67.1

66.8

4.31 (d, 7.0) 3.20 (m) 3.39 (m) 3.51 (m) 3.10 (t, 11.5) 3.83 (dd, 5.0, 11.5)

a đo trong MeOD; b125 MHz; c500 MHz; d) pyridine

44

62.3 6'' 4.86 overlapped 3.23 (m) 3.16 (m) 3.40 (m) 3.14 (m) 3.17 (m) 3.50 (m)

KẾT LUẬN

Trong quá trình hoàn thành khóa luận với đề tài:

“Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn nước cây Tầm bóp ( Physalis

angulata)”

Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, em đã phân lập được 2 hợp chất sau:

1. Hợp chất 1: Icariside E5

2. Hợp chất 2: Methyl salicylate 2-O-triglycoside

Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 và 2 được xác định bằng phương pháp phổ cộng

Hợp chất 1: Icariside E5, C26H34O11 , M= 522,21

45

hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC)

46

Hợp chất 2: Methyl salicylate 2-0-triglycoside, C25H36O17 M= 608,55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Bộ môn Dược liệu, Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội,

2004.

[2].Nguyễn Tiến Bân, 2003. Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Nxb Nông

nghiệp, Hà Nội, tập 2.

[3]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng

Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai,

Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn,Cây thuốc và

động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà

Nội, tập I, trang 875-876 (2004).

[4]. Võ Văn Chi, 1999. Từ điển cây thuố c Viê ̣t Nam, NXB Y ho ̣c, Hà Nô ̣i,471.

[5]. Trần Văn Sung, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Hoàng Anh, Các hợp chất thiên

nhiên từ một số cây cỏ Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo tài nguyên thiên

nhiên và Môi trường Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, 2011.

[6]. A. H. Janua ´rio, E. Rodrigues Filho, R. C. L. R. Pietro, S. Kashima, D. N.

angulata L. (Solanaceae)”, 16, 445-448

[7]. Basey K, B.A.Mc Gaw , J.G.Wooley , 1992 “Physalis alkekengi var.

francheti and

their Phygrine, an alkaloid

from Physalis species.

differentiation inducing activity”Phytochemistry, Phytochemistry, 31, 4173-

Sato and S. C. Franc (2002), “Antimycobacterial Physalins from Physalis

47

4176.

[8]. Cheng-Peng Sun, Chong-Yue Qiu, Ting Yuan, Xiu-Fang Nie, Hong-Xin

Sun, Qian Zhang, Hui-Xiang Li, Li-Qin Ding, Feng Zhao, Li-Xia Chen, and

Feng Qiu (2016), “Antiproliferative and Anti-inflammatory Withanolides

from Physalis angulate” , 79(6), 1586-1597

[9]. Emma Maldonado, Norma E. Hurtado , Ana L. Pérez-Castorena , Mahinda

Martínez (2015), “Cytotoxic 20,24-epoxywithanolides from Physalis

angulate" ,108, 72-74

[10]. Ismail N, Alam M (2001), “A novel cytotoxic flavonoid glycoside from

Physalis angulate” at Fitoterapia, 72 (6), 676-679

[11]. Jin-Kai Juang et. Al, (1989) “ A new compound, withangulatin A

promotestype II DNA topoisomera”, 159(3), 1128-1134

[12]. L.R. Row, N.S. Sarma, K.S. Reddy, T. Matsuura, R. Nakashima (1978),

“The structure of Physalins F and J from Physalis angulata and

P. lancifolia”Phytochemistry, 17, 1647-1650.

[13]. Lorena A. Pinto, Cássio S. Meira, Cristiane F. Villarreal, Marcos A.

Vannier-Santos, Claudia V.C. de Souza, Ivone M. Ribeiro, Therezinha C.B.

(2016), “Physalin F, a seco-steroid from Physalis angulata. L, has

immunosuppressive activity in peripheral blood mononuclear cells from

patients with HTLV1-associated myelopathy” , 79, 129-134

[14]. Masateru Ono, Yuki Shiono, Takayuki Tanaka, Chikako Masuoka, Shin

Yasuda, Tsuyoshi

Ikeda, Masafumi Okawa, Junei Kinjo, Hitoshi

Tomassini, Bernardo Galvao-Castro, Milena B.P. Soares, Maria F.R. Grassi

48

Yoshimitsu, Toshihiro Nohara (2010), “Three new aromatic glycosides

from the ripe fruit of cherry tomato”. J. Nat. Med, 64, 500–505

[15]. Maria Iorizzi, Virginia Lanzotti, Simona De Marino, Franco Zollo,

Magdalena Blanco Molina, Antonio Macho and Eduardo Munoz (2001),

“New Glycosides from Capsicum annuum L. Var.acuminatum. Isolation,

Structure Determination, and Biological Activity” J. Agric. Food Chem, 49

, 2022−2029

[16] . Matheus S. Sa, Maria N. de Menezes, Antoniana U. Krettli, Ivone M.

Ribeiro, Therezinha C. B. Tomassini, Ricardo Ribeiro dos Santos, Walter F

de Azevedo and Milena B. P. Soares (2011), “Antimalarial Activity of

Physalins B, D, F, and G”, 74, 2269-2272

[17]. Matsuura T, Kawai M, Nakashima R, Butsugan Y (1970), “Structures of

physalin A and physalin B, 13,14-Seco-16,24-cyclo-steroids from Physalis alkekengi var. Francheti. J Chem Soc 1970, 5 , 664 – 70

[18]. Milena da Silva Lima, Afranio Ferreira Evangelista, Gisele Graca Leite dos

Santos, ̧ Ivone Maria Ribeiro, Therezinha Coelho Barbosa Tomassini,

Milena Botelho Pereira Soares, and Cristiane Flora Villarreal (2014),

[19]. Meira. C.S, et al.(2015) “In vitro and in vivo antiparasitic activity of

Physalis angulata L. concentrated ethanolic extract against

Trypanosoma cruzi” 22(11) , 969-974

[20]. Kazushi Shingu, Shoji Yahara, Toshihiro Nohara, Hikaru okabe (1992),

“Antinociceptive Properties of Physalins from Physalis angulate”, 77(11), 2397-2403

49

“Three New Withanolides, Physagulins A, B and D from Physalis angulata

L”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40 (8), 2088-2091

[21]. Soares M, Bellintani M, Ribeiro I, Tomassini T,Ribeiro R (2003) ,

“Inhibition of macrophage activation and lipopolysaccaride-induced death

bye seco-steroids purified from Physalis angulata L” Eur J Pharmacol,

459,107 - 112

[24]. Ting Ma, Wen-Na Zhang, Lei Yang, Chao Zhang, Ru Lin, Si-Ming Shan,

Meng-Di Zhu, Jian-Guang Luo and Ling-Yi Kong (2016) “Cytotoxic

withanolides from Physalis angulata var.villosa and the apoptosis-inducing

effect via ROS generation and the activation of MAPK in human

osteosarcoma cells”, 6, 53089-53100

[25]. T.K.Lim (2013), Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants,Springer

Science and Business Media Dordrecht

[26]. Zizhen Liu, Rui Jiang, Meng Xie, Guanling Xu, Weirui Liu, Xiaohong

Wang, Hongying Lin, Jianqiu Lu, and Gaimei , She from Chem. Pharm.

50

Bull. (2014) , 62(11), 1083–1091

51