Khóa luận tốt nghiệp ngành Y đa khoa: Xây dựng quy trình phân tích một số đa hình gen N-acetyltransferase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở người bệnh lao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC

KIỀU HỒNG NHUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE 2

LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID

Ở NGƯỜI BỆNH LAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH Y ĐA KHOA

Hà Nội – Năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC

KIỀU HỒNG NHUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

MỘT SỐ ĐA HÌNH GEN N-ACETYLTRANSFARASE 2

LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ ISONIAZID

Ở NGƯỜI BỆNH LAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH Y ĐA KHOA

Khóa : QH 2013.Y Người hướng dẫn : PSG.TS. Đinh Đoàn Long

ThS. Phạm Thị Hồng Nhung

Hà Nội – Năm 2019

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành quá trình nghiên cứu khóa luận này, lời đầu tiên tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Đoàn Long, ThS. Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người thầy đã

hướng dẫn trực tiếp, chỉ dạy nhiệt tình, tỉ mỉ và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức cũng

như kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới TS. Vũ Thị Thơm – Giảng viên Khoa Y

Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội - cố vấn khoa học, người thầy đã luôn tận tâm giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, luôn sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc để tôi

có thể hoàn thành khóa luận này. Đồng thời, tôi xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thu Hà,

thành viên cùng nhóm nghiên cứu đã luôn tích cực giúp đỡ, chỉ dạy tôi rất nhiều trong

quá trình thực hiện các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.

Tôi xin cảm ơn Bộ Khoa học và công nghệ và Chương trình Newton Fund Việt

Nam đã tài trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu KHCN cấp nhà nước (Mã số HNQT/SPĐP/01.16) do PGS.TS Lê Thị Luyến chủ trì, mà đây là một nhánh đề tài

trong nghiên cứu đó.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Phổi

Hà Nội và Bệnh viện 74 Trung Ương đã cung cấp các mẫu phẩm phục vụ cho nghiên

cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô, các bạn thực tập tại Phòng thí

nghiệm – Bộ môn Y Dược học cơ sở đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện

nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong

Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong

quá trình học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và yêu thương tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, khích lệ tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá

trình thực hiện khóa luận này.

Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2019

Tác giả

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Kiều Hồng Nhung

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFB Vi khuẩn kháng axit (Acid Fast Bacillus)

CYP2E1 Cytochrom P450 2E1

ddNTP Dideoxynucleotide

DHPLC

Sắc kí lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography)

DILI Tổn thương gan do thuốc (Drug-induced liver injury)

DNA Axit Deoxyribonucleic (Deoxyribo Nucleic Acid)

EDTA Chất chống đông Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

INH Isoniazid

NAT1 Gen N-Acetyltransferase 1

NAT2 Gen N- Acetyltransferase 2

NAT2 Enzym N- Acetyltransferase 2

OD Mật độ quang học (Optical Density)

PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase chain Reaction)

PGx Dược di truyền học (Pharmacogenetics/-nomics)

RFLP Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment

Length Polymorphism)

SNP Đa hình di truyền đơn nucleotit (Singles nucletotide

polymorphisms)

STD Liều điều trị tiêu chuẩn (Standard Treatment Dose)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1. 1. Ảnh hưởng của kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa một số thuốc ...............4

Bảng 1. 2. Một số SNP phổ biến ở gen NAT2 .....................................................................7

Bảng 2. 1. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt ..................................................... 23

Bảng 3. 1. Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2............................. 27

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Bảng 3. 2. Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2 ............................... 30 Bảng 3. 3. Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam......... 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1. 1. Một số phản ứng chuyển hóa được xúc tác bởi NAT2 ....................................4

Hình 1. 2. Cấu trúc và vị trí gen NAT2 trên nhiễm sắc thể số 8 .........................................5

Hình 1. 3. Ảnh hưởng ở mức độ phân tử của các SNP NAT2 ............................................8

Hình 1. 4. Tỉ lệ mắc bệnh lao tại một số khu vực trên thế giới năm 2017 .......................9

Hình 1. 5. Chuyển hóa isoniazid ở gan............................................................................... 12 Hình 1. 6. Số lượng người gặp tác dụng phụ của isoniazid từ 1997-2018 .................... 13

Hình 2. 1. Các bước tiến hành nghiên cứu ......................................................................... 20

Hình 2. 2. Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit ............................................................ 21

Hình 2. 3. Trình tự đoạn gen NAT2 được nhân dòng để xác định kiểu alen.................. 22

Hình 2. 4. Kết quả dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7. ............................... 23

Hình 3. 1. Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2%. ......................................... 26

Hình 3. 2. Kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5%.. ... 27

Hình 3. 3. Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối ưu. .. 28

Hình 3. 4. Phân tích kiểu gen NAT2 dựa vào PCR - RFLP ............................................. 28

Hình 3. 5. Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9. ................ 30

Hình 4. 1. Các tần số phân bố của alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 tại một số vùng và khu vực trên thế giới. ................................................................................... 34

Hình 4. 2. Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới ......... 35

Hình 4. 3. Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa ................................... 36

Hình 4. 4. Tỷ lệ tổn thường gan do INH gây ra (INH-DILI) theo thời gian trong số 172

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

người bệnh. ......................................................................................................... 37

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3

1.1. Tổng quan về enzym N-Acetyltransferase 2 (NAT2) .................................................. 3

1.2. Tổng quan về gen N-Acetyltransferase 2....................................................................... 5

1.2.1. Vị trí, cấu trúc và vai trò của gen NAT2 ............................................................... 5

1.2.2. Đa hình gen N-Acetyltransferase 2 ....................................................................... 6

1.3. Đặc điểm chung về bệnh lao và vai trò của isoniazid trong điều trị lao .................... 9

1.3.1. Đặc điểm chung về bệnh lao .................................................................................. 9

1.3.2. Điều trị và dự phòng lao ....................................................................................... 10

1.3.3. Isoniazid trong điều trị lao.................................................................................... 11

1.3.3.1. Dược lý, chuyển hóa của isoniazid ............................................................ 11

1.3.3.2. Độc tính của INH với cơ thể ...................................................................... 12

1.3.4. Gen liên quan đến chuyển hóa isoniazid ở người.............................................. 14

1.4. Các nghiên cứu về đa hình di truyền NAT2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid

ở người bệnh lao. .................................................................................................................... 15

1.5. Các phương pháp phân tích đa hình NAT2 .................................................................. 16

CHƯƠNG 2. ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 19

2.1. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................................... 19

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 19

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................................. 19

2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................................... 19

2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 20

2.2.1. Thu mẫu sinh phẩm................................................................................................ 21

2.2.2. Tách chiết DNA tổng số ....................................................................................... 21

2.2.3. Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR................................................................ 22

2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR...................................................................................... 23

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

2.2.5. Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP ........................................................ 23

2.2.6. Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự ................................ 24

2.2.7. Xác định tần số của các SNP và dự đoán kiểu hình acetyl hóa ....................... 24

2.3. Đạo đức nghiên cứu........................................................................................................ 25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................ 26

3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................................ 26

3.2. Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR........................................................................ 26

3.2.1. Tối ưu quy trình PCR ............................................................................................ 26

3.3.2. Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu ................................................ 27

3.3. Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP ................................................................. 28

3.4. Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự. ................................................................ 29

3.5. Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2. .............................. 30

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN................................................................................................... 32

4.1 Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2 ............................................. 32

4.1.1. Phương pháp PCR-RFLP ..................................................................................... 32

4.1.2. Phương pháp giải trình tự ..................................................................................... 32

4.2. Về đa hình di truyền NAT2 ............................................................................................ 33

4.2.1. Tần số alen và tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa............................................................ 33

4.2.2. Về mối liên quan giữa NAT2 và một số bệnh khác ........................................... 39

KẾT LUẬN ............................................................................................................................ 40

KIẾN NGHỊ........................................................................................................................... 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis là một trong các bệnh nhiễm

trùng mạn tính phổ biến nhất ở người. Bệnh gây nên các triệu chứng chủ yếu trên đường hô hấp, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và cuộc sống của người bệnh. Theo

công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam hiện đứng thứ 16/30 nước có

gánh nặng bệnh lao cao nhất thế giới với số lượng người mới mắc năm 2017 là

124.000 người trong đó 12.840 người tử vong do lao [40].

Sau khi chẩn đoán mắc bệnh lao, người bệnh thường điều trị theo phác đồ của

Chương trình Chống lao Quốc gia [1]. Theo đó các thuốc chống lao hàng 1 gồm có 5

thuốc: Isoniazid (INH), Rifampicin, Ethambutol, Pyrazinamid, Streptomycin [1].

Trong đó, Isoniazid là thuốc then chốt trong điều trị và dự phòng lao do hiệu lực kìm và diệt vi khuẩn lao cao. Đối với các người bệnh lao mới mắc và không đa kháng

thuốc, hầu hết đều đáp ứng điều trị tốt với phác đồ hàng 1, tuy nhiên một tỷ lệ nào đó

gặp phải các tác dụng không mong muốn, một phần khác thất bại trong điều trị. Nhiều

trường hợp điều trị thất bại và gặp các tác dụng phụ đã được một số nghiên cứu trên

thế giới trước đây chỉ ra liên quan đến đột biến gen N- Acetyltransferase 2 (NAT2) gây

ra kiểu hình acetyl hóa chậm. Tùy vào vị trí đột biến mà làm biến đổi hoạt tính, cấu

trúc và độ bền enzym làm ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa isoniazid và các thuốc

chuyển hóa bởi NAT2 như hydralazin, procainamid, aminoglutethimid, sufasalazin, nitrazepam, dapson [24]. Kiểu gen NAT2 quy định kiểu hình acetyl hóa với 3 kiểu

hình acetyl hóa là acetyl hóa nhanh, acetyl hóa trung bình và acetyl hóa chậm [44].

Một số nghiên cứu đã chứng minh, người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm có nguy

cơ tổn thương gan, gặp các tác dụng phụ và tỉ lệ thất bại khi điều trị với các thuốc

chuyển hóa bởi NAT2 cao hơn 2 kiểu hình còn lại [23, 46]. NAT2 ngoài liên quan đến chuyển hóa một số thuốc nêu trên, nó còn đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa

một số hợp chất gây ung thư. Một số nghiên cứu chỉ ra sự liên quan giữa kiểu hình

acetyl hóa và nguy cơ ung thư vú, ung thư bàng quang, ung thư đại trực tràng [10, 35].

Trong các đột biến liên quan đến kiểu hình acetyl hóa, 6 alen NAT2*5

(c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11 (c.481C>T),

NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) được ghi nhận phổ biến và được nghiên

cứu nhiều nhất ở một số quần thể trên thế giới [36, 37]. Việc xác định đột biến trên

gen NAT2 nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa biến đổi di truyền và đáp ứng thuốc có

thể giúp các bác sĩ lâm sàng cân nhắc điều chỉnh liều điều trị INH, hạn chế tác dụng

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

phụ của thuốc, qua đó nâng cao hiệu quả điều trị cho người bệnh. Đây chính là xu

hướng tối ưu hóa điều trị theo cá thể, tích hợp xét nghiệm di truyền trong phác đồ điều

trị đang được phát triển và mở rộng ứng dụng nhanh chóng trên thế giới. Tuy vậy, ở

Việt Nam, việc nghiên cứu cũng như ứng dụng quy trình phân tích kiểu gen NAT2 vào

thực hành lâm sàng hầu như mới chỉ bắt đầu. Từ nhu cầu lâm sàng và tính cấp thiết của việc tích hợp xét nghiệm gen NAT2 trong liệu trình chẩn đoán, điều trị người bệnh mắc lao, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phân tích

một số đa hình gen N-acetyltransferase 2 liên quan đến đáp ứng điều trị isoniazid ở

người bệnh lao” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

- Xây dựng được quy trình phân tích một số đa hình di truyền gen NAT2 ở

người bệnh mắc lao tại Việt Nam. - Áp dụng được quy trình đã tối ưu để bước đầu đánh giá mức độ đa hình di

truyền gen NAT2 trên 100 mẫu người bệnh lao ở Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu:

- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen mã hóa enzym NAT2.

- Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự.

- Khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen liên quan đến 6 đa hình SNP gồm

NAT2*5 (c.341T>C), NAT2*6 (c.590G>A), NAT2*7 (c.857G>A), NAT2*11

(c.481C>T), NAT2*12 (c.803G>A), NAT2*13 (c.282C>T) ở nhóm người bệnh

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

tham gia nghiên cứu.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về enzym N-Acetyltransferase 2 (NAT2)

Như chúng ta đã biết, hiệu lực của nhiều loại thuốc và các chất ngoại lai từ môi

trường tới cơ thể ngoài việc phụ thuộc vào các cơ chế truyền tin (cơ chế dược lực

học), còn phụ thuộc vào sự chuyển hóa và thải trừ thuốc của cơ thể (các cơ chế dược

động học). Trong các con đường chuyển hóa và thải trừ thuốc, sự acetyl hoá các thuốc

bởi enzym N-Acetyltransferase (NAT, EC 2.3.1.5) [24, 62] là một cơ chế chuyển hoá quan trọng giúp cơ thể tránh khỏi các phản ứng quá khích với thuốc và các chất độc

hại từ môi trường. Nhiều loại thuốc và hóa chất trong cơ thể có thể được NAT chuyển

thành các chất không độc và loại khỏi cơ thể, trong đó có cả các chất có khả năng gây

ung thư và gây độc cho cơ thể [14]. NAT là enzym xúc tác phản ứng acetyl hóa, qua

đó có xu hướng chuyển một chất gây độc cho cơ thể thành chất không hoặc ít độc.

NAT xúc tác phản ứng gồm N-Acetyl hóa, O-Acetyl hóa và N,O-Acetyl hóa, trong đó

N-acetyl hóa (Hình 1.1) được chỉ ra là con đường hiệu quả nhất thực hiện biến đổi

sinh học các hợp chất amin thơm, hydralazin và một số chất gây ung thư [14]. NAT ở

người bao gồm 2 loại là N-Acetyltransferase 1 (NAT1) và N-Acetyltransferase 2

(NAT2). Enzym NAT1 có vai trò trong sự chuyển hóa các hợp chất folat, trong khi đó

NAT2 đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa một số hợp chất amin thơm và dị vòng như isoniazid (một loại thuốc chống lao), hydralazin và endralazin (thuốc điều

trị tăng huyết áp), procainamid (thuốc điều trị loạn nhịp tim), aminoglutethimid ( một

chất ức chế tổng hợp hormon của tuyến thượng thận), nitrazepam (thuốc an thần) và

dapson (thuốc điều trị bệnh phong) (Bảng 1.1) [24].

NAT2 được phân bố chủ yếu ở gan, một phần ở ruột non và đại tràng trong khi

NAT1 có ở hầu hết các mô trong cơ thể [14]. Các gen mã hóa cả hai protein đều có

khung đọc mở dài 870 bp trên nhánh ngắn (vùng 22) của nhiễm sắc thể số 8 (vùng

8p22) [54]. Các biến thể di truyền trên gen NAT1 và NAT2 quyết định kiểu hình acetyl hóa của mỗi cá thể ảnh hưởng đến đáp ứng với nhiều thuốc và các chất có nguy

cơ gây ung thư. Tùy vào trình tự các nucleotid trên NAT2 của mỗi cá thể mà phân

chia ra ba nhóm kiểu hình là acetyl hóa là nhanh, trung bình và chậm [15]. Mối liên

quan giữa kiểu hình acetyl hóa (được quyết định bởi NAT2) và nguy cơ mắc các bệnh

khác nhau đã được báo cáo từ nhiều năm nay. Năm 1960, lần đầu tiên các đa hình của

NAT2 được nghiên cứu liên quan đến chuyển hóa isoniazid, sau đó các nghiên cứu

tiếp theo chứng minh sự liên quan đến các thuốc khác được đưa ra nhiều hơn, và ngày

càng chứng minh được tầm quan trọng của NAT đối với cơ chế giải độc của cơ thể

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[12].

Hình 1. 1. Một số phản ứng chuyển hóa được xúc tác bởi NAT2 [14]

Bảng 1. 1. Ảnh hưởng của kiểu hình acetyl hóa tới chuyển hóa một số thuốc [24]

Tên thuốc Ảnh hưởng Kiểu hình acetyl hóa

Dapson Chậm Gây độc hệ thần kinh

Sulphamethoxazol Chậm Tăng mẫn cảm

Hydralazin

Chậm Nhanh Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống Giảm hiệu quả điều trị

Isoniazid Chậm Ảnh hưởng đến phenytoin và rifampicin

Ctrimoxazol Chậm Tăng các phản ứng không mong muốn

Sulphasalazin Chậm Gây độc với gan, gây buồn nôn, nôn

Procainamid Chậm Liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống

Phenelzin Nhanh Giảm đáp ứng điều trị

p- Phenylenediamin Chậm Gây viêm da tiếp xúc

Sự tiếp xúc với các chất độc hại từ thực phẩm hoặc từ môi trường làm việc

(như khói thuốc lá, các hóa chất có chứa benzen..) sẽ làm con người dễ mắc một số

bệnh, đặc biệt là ung thư. Và kiểu hình acetyl hóa có thể làm tăng hoặc giảm nguy cơ

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

mắc ung thư đối với các cá thể có phơi nhiễm. Nguy cơ khác nhau giữa kiểu hình

acetyl hóa nhanh và chậm đã được nghiên cứu và chứng minh với một số bệnh như:

ung thư bàng quang, ung thư đại tràng, ung thư vú, bệnh lupus ban đỏ hệ thống [14],

bệnh Parkinson và Alzheimer [11]. Đối với chuyển hóa thuốc, tính đa hình di truyền

của NAT2 được phát hiện lần đầu tiên ở những người bệnh lao điều trị bằng isoniazid [47]. Các nghiên cứu sau đó đều chứng minh mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa

và chuyển hóa isoniazid, từ đó đưa ra các phác đồ điều trị phù hợp cho mỗi kiểu hình

nhằm hạn chế tối đa ảnh hưởng không tốt của isoniazid lên cơ thể.

1.2. Tổng quan về gen N-Acetyltransferase 2

1.2.1. Vị trí, cấu trúc và vai trò của gen NAT2

Gen NAT2 trên vai ngắn nhiễm sắc thể số 8 (vùng 8p22) mã hóa enzym

arylamine N-Acetyltransferase 2. Gen NAT2 gồm hai exon, exon 1 (không mã hóa protein) dài 100 bp nằm ở vị trí 8 kb ngược dòng của vị trí bắt đầu dịch mã, exon 2

(mã hóa protein) là một khung đọc mở dài 870 bp như mô tả ở Hình 1.2 [54].

Hình 1. 2. Cấu trúc và vị trí gen NAT2 trên nhiễm sắc thể số 8[16]

Việc xác định các đa hình NAT2 rất quan trọng trong việc thiết lập các khái

niệm cơ bản trong dược lý học của các thuốc chuyển hóa bởi NAT2, trong đó

isoniazid là thuốc đầu tiên và điển hình. Enzym NAT2 có vai trò là trung tâm trong

chuyển hóa thuốc này, vì vậy sự biến đổi bất thường trên gen NAT2 gây ra nhiều ảnh

hưởng khác nhau của cá thể với khả năng đáp ứng thuốc, tác dụng không mong muỗn

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

của thuốc và với sự gia tăng tỷ lệ một số bệnh khi đã tiếp xúc với yếu tố phơi nhiễm.

1.2.2. Đa hình gen N-Acetyltransferase 2

Dự án giải trình tự hệ gen người hoàn thành vào năm 2004 và các nghiên cứu

sau này đã chứng minh rằng DNA hệ gen của phần lớn (hơn 7,5 tỷ người) chúng ta

đang sống khác biệt nhau chủ yếu là đa hình thay thế đơn nucleotit (Singles nucletotide polymorphisms – SNP), một loại ʺđột biến điểmʺ có thể hoặc không dẫn

đến sự thay thế axit amin. SNP có ý nghĩa rất quan trọng vì nó là loại biến dị di truyền

phổ biến và ổn định. Sự biến đổi các SNP chung trong cả hệ gen được coi có ảnh

hưởng lớn đến phản ứng của mỗi người đối với bệnh tật, với các nhân tố môi trường

(như vi khuẩn, vi rút, các độc tố và hóa chất), các thuốc và các liệu pháp điều trị khác

nhau. Sự tiến bộ trong các nghiên cứu di truyền học và dược lý học đã chứng tỏ bản

chất di truyền của sự khác biệt giữa các cá thể trong đáp ứng các yếu tố bất lợi của

môi trường (như các chất độc) và đáp ứng thuốc. SNP giải thích sự biến đổi trong hoạt

động của enzym với chuyển hóa thuốc làm tăng hoặc giảm độ thanh thải thuốc, qua đó

tác động đến đáp ứng điều trị [38]. Mặc dù tác động của từng SNP đến sự hình thành

bệnh là tương đối yếu nhưng sự kết hợp của chúng có thể làm thay đổi đáng kể nguy cơ gây bệnh. Cùng với đó là sự liên quan đến khả năng đáp ứng, khả năng hấp thụ và

chuyển hóa của nhiều thuốc. Do có cấu trúc đơn giản, chỉ thay đổi một nucleotit nên

các kĩ thuật sinh học phân tử có thể xác định nhanh kiểu gen và dự đoán hiệu quả của

kiểu gen lên đáp ứng thuốc của mỗi cá thể. Các nhà di truyền y học hy vọng trong

tương lai có thể hoàn thiện bản đồ các SNP có liên quan đến các bệnh lý, tiến đến việc

giải mã chức năng của các gen ở mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ mắc bệnh, từ

đó có lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh và điều trị của từng cá thể.

Đa hình NAT2 cho thấy một quan điểm mới về lĩnh vực dược lý học, đây là một

trong những đa hình về chuyển hóa thuốc đầu tiên được ghi nhận tương đối hệ thống

trong nhiều quần thể người [12]. Ngay từ năm 1953, các nghiên cứu bắt đầu chứng

minh được mối liên quan giữa đa hình NAT2 với hiệu quả lâm sàng, cụ thể là sự gia tăng tần số và mức độ tác dụng phụ của thuốc chống lao isoniazid trên một số người

bệnh [42]. Năm 1960, kết quả về mối liên quan trên được công bố bởi Evan và cộng

sự [12], đến năm 1965 danh pháp quốc tế về gen NAT đã được công bố lần đầu tiên và

được áp dụng trên toàn thế giới vào các nghiên cứu sau đó [30]. Các nghiên cứu tiếp

theo về NAT2 đều chỉ ra rằng có 3 kiểu hình acetyl hóa là acetyl hóa nhanh (3 alen

nhanh), acetyl hóa trung bình (2 alen nhanh, 1 alen chậm) và acetyl hóa chậm (nhiều

hơn 1 alen chậm) [15]. Hiện nay, các nhà di truyền học đã xác định được alen kiểu dại

hay còn gọi là kiểu alen không có đột biến, alen kiểu dại được qui ước là NAT2*4. Các

đột biến dưới dạng SNP có thể xuất hiện duy nhất trong đoạn gen hoặc xuất hiện đồng

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

thời với các đột biến khác được gọi là các halotype hay biến thể di truyền. Hiện nay,

trên thế giới đã tìm thấy tổng cộng 108 halotype, trong đó một số halotype được tìm ra

đã được chứng minh ảnh hưởng của nó đối với kiểu hình acetyl hóa [5]. Một ví dụ

điển hình về halotype được tìm thấy là alen NAT2*5, một trong các alen gây ra kiểu

hình acetyl hóa chậm. Alen này được xác định khi có sự thay thế axit amin isoleucin thành threonin ở vị trí c.341T>C , halotypee NAT2*5A được xác định khi có 2 vị trí

cùng xảy ra sự thay thế axit amin là c.341T>C và c.481C>T [5]. Bên cạnh alen kiểu

dại NAT2*4 là các halotype khác NAT2*12A-C, *13A, *18 liên quan đến kiểu hình

acetyl hóa nhanh và các halotype NAT2*5A-J, *6A-E, *7, *12D, *14A-G, *17 và *19

có liên quan đến kiểu hình acetyl hóa chậm (Phụ lục 1).

Bảng 1. 2. Một số SNP phổ biến ở gen NAT2 [31, 38, 56]

Vị trí Alen Mã tra cứu Axit amin thay thế

Kiểu hình acetyl hóa Chậm rs1801280 341T>C Ile114Thr NAT2*5 Ảnh hưởng chức năng Giảm hoạt tính NAT2

Chậm rs1799930 590G>A Arg197Gln NAT2*6

Chậm rs1799931 857G>A Gly286Glu NAT2*7 Giảm độ bền NAT2 Giảm hoạt tính NAT2

Nhanh rs1799929 481C>T Leu161Leu NAT2*11 Không gây biến đổi

Nhanh rs1208 803A>G Arg268Lys NAT2*12 Không gây biến đổi

Nhanh rs1041983 282C>T Tyr94Tyr NAT2*13 Không gây biến đổi

Trong các đa hình gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm, 3 alen NAT2*5, *6, *7

được nghiên cứu nhiều nhất, bởi tỷ lệ đột biến trong 3 vị trí này được tìm thấy nhiều

hơn hẳn các vị trí khác, đồng thời ảnh hưởng của 3 SNP trên cũng rõ ràng hơn [19].

Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng 6 alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 được dùng

phổ biến hơn (Bảng 1.2) [5, 41], đặc biệt trong các nghiên cứu có sử dụng phương

pháp giải trình tự. Đối với kiểu hình dựa trên 3 SNP, các nhóm cá thể có kiểu hình

acetyl hóa nhanh có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại ở cả 3 vị trí SNP (T341C, G590A, G857A). Các cá thể có kiểu hình acetyl hóa trung bình có kiểu gen dị hợp tử về alen

đột biến ở một trong 3 vị trí NAT2*5, *6 hoặc *7. Những người acetyl hóa chậm là

những người có trên một alen đột biến trong 3 SNP trên. Tuy nhiên, các nghiên cứu tại

các vị trí địa lý khác nhau trên thế giới cho kết quả tỷ lệ các kiểu hình acetyl hóa có sự

khác biệt ở mỗi quốc gia và vùng địa lý. Đối với kiểu hình 6 SNP, xác định kiểu hình

acetyl hóa được cho là chính xác hơn. Từ năm 2009 ứng dụng trên web là

NAT2PRED (của tác giả Igor B. Kuznetsov) cho phép xác định kiểu hình acetyl hóa

thông qua kiểu gen ở 6 vị trí NAT2 *5, *6, *7, *11, *12, *13. Trên bài báo công bố về

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

web NAT2PRED có chỉ ra tỷ lệ khác biệt giữa kiểu hình dựa trên 3 SNP và 6 SNP, sự 7

khác biệt này là không lớn, nhưng việc xác định kiểu hình dựa trên 6 SNP được ưu

tiên hơn [31, 65].

Một số vị trí đột biến thay thế gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm được biểu thi ở

Hình 1.3. Alen đột biến NAT2*5 (c.341T>C) làm thay thế isoleucin ở vị trí 114 thành threonin gây giảm hoạt tính enzym, tuy nhiên đột biến này không thể xác định bằng

RFLP. Vì vậy, hầu hết các nghiên cứu đều phân tích alen c.481C>T (là một đột biến

câm liên kết với c.341) như là một biến thể đại diện của NAT2*5, vì khi xảy ra đột

biến ở vị trí c.481 thì cũng xảy ra đột biến ở NAT2*5 và ngược lại [38, 58].

Hình 1. 3. Ảnh hưởng ở mức độ phân tử của các SNP NAT2 [56]. Hình 3D của

NAT2 và các SNP phổ biến xác định kiểu hình acetyl hóa gồm NAT2*5 (Ile114Thr,vị

trí số 2), NAT2*6 (Arg197Gln, vị trí số 7), NAT2*7 (Gly286Glu,vị trí số 10) và

NAT2*12 (Arg268lys, vị trí số 8)

Đột biến ở alen NAT2*6 (c.590G>A) dẫn đến làm giảm độ bền của NAT2 do sự

thay thế axit amin Arginin bằng Glycin. Đột biến alen NAT2*7 (c.857G>A) làm biến

đổi cấu hình lập thể tại trung tâm xúc tác của enzym qua đó làm giảm hoạt tính của

enzym. Các SNP tại 3 vị trí trên dẫn đến thay đổi hoạt độ, độ ổn định, ái lực của

enzym NAT2 với cơ chất, hậu quả là gây ra các biến đổi về nồng độ của các hợp chất

không tốt trong cơ thể và gây ra các biểu hiện trên lâm sàng [50]. Các halotype NAT2*11A, NAT2*12A và NAT2*13A gây ra kiểu hình acetyl hóa nhanh được cho là

không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym NAT2, tuy nhiên sự xuất hiện của các alen

nhanh nàycó thể liên quan đến sự tăng giảm một số chất chuyển hóa của thuốc khác.

Các nghiên cứu trước đây về đặc điểm chức năng của các đa hình NAT2 cho thấy các

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

cơ chế phân tử khác nhau của kiểu hình acetyl hóa chậm, cuối cùng đều gây giảm biểu

hiện protein mRNA và protein NAT2. Đặc biệt là khi có sự hiện diện của NAT2*5B,

NAT2*6D và NAT2*14G [8, 57] .

1.3. Đặc điểm chung về bệnh lao và vai trò của i soniazid trong điều trị lao

1.3.1 Đặc điểm chung về bệnh lao

Bệnh lao ở người do vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn kháng cồn kháng axit

(Acid fast bacilli, AFB) gây ra, trong đó chủ yếu là do vi khuẩn lao người

(Mycobacterium tuberculosis hominis). Đây là một trong những nguyên nhân hàng

đầu gây tử vong trên toàn thế giới [2]. Thêm vào đó, sự xuất hiện của đại dịch

HIV/AIDS (Human Immuno-deficiency Virus/ Acquired Immuno Deficiency

Syndrom, Vi rút gây Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người đã làm cho

bệnh lao bùng phát trở lại và đáng sợ hơn, đặc biệt là trong những năm cuối của thế kỉ

XX tỷ lệ người mắc và chết do lao đã gia tăng mạnh mẽ. Năm 1993, WHO đã tuyên

bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu về bệnh lao và mối hiểm họa kháng thuốc trong tương

lai. Trong công bố của WHO về dịch tễ lao, năm 2017 có 10 triệu người mắc bệnh lao

với hơn 1,3 triệu người tử vong do lao, trong đó một số khu vực và vùng lãnh thổ có tỷ lệ mắc khá cao, đặc biệt là khu vực Châu Phi như bản đồ phân bố ở Hình 1.4.

Trong số các ca tử vong năm 2017, có khoảng 1,3 triệu người âm tính với HIV và

300.000 người dương tính với HIV [40]. Năm 2017 Việt Nam có 124.000 người mắc

mới với 12.840 ca tử vong do lao. Hiện tại, Việt Nam hiện đang xếp thứ 16/30 nước

có gánh nặng bệnh lao cao trên thế giới và thứ 13/30 nước có gánh nặng bệnh lao đa

Việt Nam

Số ca mắc

kháng thuốc [40].

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 1. 4. Tỉ lệ mắc bệnh lao tại một số khu vực trên thế giới năm 2017 [64]

Bệnh lao diễn biến qua 2 giai đoạn là nhiễm lao và lao bệnh. Vi khuẩn lao có

thể gây bệnh ở tất cả các bộ phận trên cơ thể người, trong đó phổ biến nhất là lao phổi.

Giai đoạn nhiễm lao xảy ra khi vi khuẩn xâm nhập lần đầu tiên vào cơ thể chưa bao

giờ tiếp xúc với lao. Vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường hô hấp vào tận phế nang gây tổn thương viêm phế nang, sau khoảng 3 tuần đến 3 tháng dưới tác

động của vi khuẩn lao, cơ thể có sự chuyển biến về mặt sinh học, hình thành dị ứng và

miễn dịch với vi khuẩn lao. Người bị lây ở tình trạng nhiễm lao, lúc này trong cơ thể

người bị nhiễm đã có kháng thể kháng lao và phản ứng Tuberculin có thể dương tính.

Đa số người bị bệnh chỉ ở tình trạng nhiễm lao (khoảng 80% - 90%) không chuyển

sang giai đoạn lao bệnh. Khoảng 10% -20% người nhiễm lao sẽ chuyển sang giai đoạn

bệnh lao khi sức đề kháng của cơ thể giảm, số lượng và độc tính của vi khuẩn tăng.

Đặc biệt ở những người thuộc nhóm suy giảm miễn dịch như HIV/AIDS hoặc có các

bệnh mạn tính, các bệnh toàn thân khác [3].

Vi khuẩn lao ở cơ quan bộ phận nào thì sẽ gây nên các triệu chứng thuộc về

mỗi cơ quan bộ phận đó. Do triệu chứng ở giai đoạn sớm thường khó phát hiện, vì vậy bệnh chỉ được phát hiện khi đã có các biểu hiện rõ ràng. Các triệu chứng hay gặp nhất

là triệu chứng toàn thân và triệu chứng thuộc đường hô hấp như: da xanh xao, người

mệt mỏi, ăn kém, gầy sút cân, ho kéo dài, sốt nhẹ về chiều (37o5 đến 38oC) kèm ra mồ

hôi về ban đêm... Tuy nhiên, do các triệu chứng thường mơ hồ, khó xác định và dễ

nhầm với các triệu chứng thuộc các bệnh khác, vì vậy bệnh lao được chẩn đoán xác

định khi tìm thấy vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (đờm, dịch dạ dày, dịch phế quản).

Các kĩ thuật xác định vi khuẩn lao gồm 2 nhóm chính là kĩ thuật cổ điển và hiện đại.

Các kĩ thuật cổ điển gồm: kĩ thuật nhuộm soi trực tiếp Ziehl - Neelsen (còn gọi là kĩ

thuật nhuộm AFB), phương pháp nuôi cấy, phương pháp tiêm truyền súc vật. Nhóm

các kĩ thuật hiện đại gồm: phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain Reaction -

PCR), phương pháp khuếch đại trực tiếp (Amplified direct test), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzym Linked Immunosorbent Assay – ELISA), Xpert/MTB và nhiều kĩ

thuật khác [2, 3].

1.3.2 Điều trị và dự phòng lao

Điều trị lao: Mỗi nước trên thế giới đều có một phác đồ điều trị lao riêng,

nhưng đều có đặc điểm chung là đều dựa vào chiến lược chống lao do WHO khuyến

cáo là chiến lược DOTS (Directly Observed Treatment Short Course) điều trị hóa trị

liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp. Dựa trên DOTS, Chương trình Chống lao Quốc

gia Việt Nam đã đưa ra phác đồ điều trị cho các loại bệnh lao. Trong đó lao mới mắc

sử dụng phác đồ I gồm các thuốc chống lao hàng 1 là isoniazid, rifampicin,

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

streptomycin, pyrazinamid, ethambutol. Phác đồ cụ thể là sử dụng 4 loại thuốc

streptomycin, isoniazid, rifampicin, pyrazinamid đối với người lớn và rifampicin,

isoniazid, pyrazinamid với trẻ em hàng ngày trong 2 tháng đầu, 6 tháng tiếp theo dùng

2 loại thuốc isoniazid, ethambutol cho người lớn và rifampicin, isoniazid cho trẻ em

hàng ngày. Người bệnh điều trị thuốc lao cần được theo dõi đánh giá đáp ứng lâm sàng và các tác dụng phụ của thuốc để điều chỉnh kịp thời. Các người bệnh lao AFB

dương tính sẽ được xét nghiệm đờm vào tháng thứ 2, thứ 5 và thứ 7. Điều trị được coi

là thất bại nếu từ tháng thứ 5 xét nghiệm AFB vẫn dương tính [1].

Dự phòng lao: Vaccin BCG được sử dụng dự phòng trong trường hợp chưa

nhiễm lao, các người bệnh nhiễm lao sẽ được dự phòng bằng uống INH trong vòng 6

tháng đến 1 năm để làm giảm tỷ lệ chuyển sang giai đoạn bệnh lao. 1.3.3 Isoniazid trong điều trị lao

1.3.3.1. Dược lý, chuyển hóa của isoniazid

Isoniazid (còn gọi là isonicotinylhydrazid, viết tắt là INH), là một thuốc chính

trong điều trị bệnh lao. Hóa chất này được tổng hợp ở Praha năm 1912 nhưng đến năm

1952 mới biết được tác dụng của INH với vi khuẩn lao. INH kìm hãm sự sinh trưởng

và diệt vi khuẩn lao ở cả trong và ngoài tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là thông

qua sự ức chế hình thành axit mycolic có ở thành trực khuẩn lao [3]. Sau khi uống,

INH hấp thu qua ruột vào máu: 40% ở dạng tự do, một phần kết hợp với axit amin trong máu thành hydrazol; INH ở dạng tự do và hydrazol có tác dụng với vi khuẩn lao,

phần dư thừa còn lại được chuyển hóa ở gan tạo thành các hợp chất không có tác dụng

với vi khuẩn lao. Tại gan, 50% - 90% INH được acetyl hóa bởi enzym NAT2 như

Hình 1.5 tạo thành acetyl isoniazid, sản phẩm tiếp tục bị thủy phân tạo thành acetyl

hydrazin.

Một con đường khác là INH có thể bị thủy phân trực tiếp tạo ra hydrazin [28].

Sau đó NAT2 xúc tác quá trình acetyl hóa của hydrazin tạo acetyl hydrazin và diacetyl

hydrazin. Acetyl hydrazin và hydrazin có thể bị oxi hóa bởi Cytochrom P450 2E1 tạo

thành các hợp chất trung gian gây độc cho cơ thể [53]. Hydrazin là một chất độc với

các tế bào gan do có khả năng gây hoại tử tế bào. Vì vậy, trong trường hợp hoạt tính

NAT2 thấp, hydrazin sẽ tăng nồng độ trong máu đồng thời chuyển hóa chủ yếu theo con đường bởi CYP2E1, tạo ra các sản phẩm trung gian gây độc với gan. Các chất

chuyển hóa của INH được thải trừ ra khỏi cơ thể chủ yếu qua hệ tiết niệu (chiếm 80%)

[28]. Đặc tính dược động học của thuốc bị ảnh hưởng bởi các yếu tố cụ thể của từng

người bệnh như tình trạng di truyền, tuổi, cân nặng, bệnh đi kèm và các thuốc dùng

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

đồng thời với INH.

Hình 1. 5. Chuyển hóa isoniazid ở gan[61] (CYP2E1: Cytochrom P450 2E1;

NAT2: N-Acetyltransferase 2; GST: Glutathion S-transferase)

Nồng độ ức chế tối thiểu trong huyết thanh của INH với vi khuẩn lao là 0,04 µg/mL. Nồng độ của INH trong huyết thanh của mỗi người khác nhau phụ thuộc

vào kiểu hình acetyl hóa của cá thể. Khi uống INH liều 5 mg/kg sau 1-2 giờ sẽ đạt

nồng độ tối đa trong huyết tương trung bình là 3-5 µg/mL [3].

Liều chuẩn theo phác đồ của Bộ y tế là với INH là 5 mg (4-6 mg)/kg/ngày cho

cả trẻ em và người lớn, liều hàng ngày tối đa là 300 mg, nên uống một lần lúc đói.

Liều cách quãng 3 lần/tuần là 10 mg/kg thể trọng (8-12 mg), liều cách quãng 2

lần/tuần là 15 mg/kg thể trọng (13-17 mg) [1].

1.3.3.2. Độc tính của INH với cơ thể

Tương tác thuốc: Isoniazid ức chế chuyển hóa một số thuốc. Khi dùng kết hợp

isoniazid với các thuốc này có thể làm tăng nồng độ trong huyết thanh và làm tăng độc

tính của thuốc phối hợp, nhất là các thuốc chữa động kinh. Các thuốc khi phối hợp với

isoniazid phải điều chỉnh liều gồm có alfentanil, các chất chống đông máu dẫn chất

coumarin, dẫn chất indandion, các benzodiazepin, carbamazepin, theophylin,

phenytoin, enfluran, disulfiram và cycloserin [21]. Khi dùng đồng thời rifampicin,

acetaminophen, rượu với isoniazid có thể làm tăng độc tính với gan, đặc biệt ở người có tiền sử suy gan. Isoniazid làm giảm nồng độ ketoconazole (thuốc điều trị nấm)

trong huyết thanh, vì vậy làm giảm tác dụng điều trị nấm của thuốc này. Các corticoid

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

làm tăng thải trừ isoniazid, vì vậy làm giảm nồng độ và tác dụng của isoniazid, đặc 12

biệt ở những người bệnh chuyển hóa isoniazid nhanh. Các thuốc kháng axit, đặc biệt

muối nhôm làm giảm hấp thu isoniazid.

Tác dụng phụ: Các tác dụng phụ của INH phổ biến nhất là tác dụng trên hệ thần

kinh và gan. Các chất chuyển hóa của INH gồm acetyl hydrazin và hydrazin có thể bị oxy hóa bởi enzym CYP2E1 tạo thành các chất trung gian gây độc cho cơ thể, đặc biệt

là gây tổn thương gan. Theo Cục quản lý chất lượng thực phẩm và dược phẩm Hoa Kì

(US Food and Drug Administration, FDA) thống kê, giai đoạn 1997 – 2018 tỷ lệ gặp

tác dụng phụ của INH theo thời gian dùng thuốc được thể hiện trên biểu đồ Hình 1.6.

Theo đó, các tác dụng phụ có tỷ lệ tặng dần từ năm 1997 đến năm 2018, có sự gia tăng

rõ vào các năm 2011, 2017 và 2018. Năm 2018 theo báo cáo của 30 tác giả gửi về, có

1049 trường hợp gặp các tác dụng phụ điển hình khi dùng INH [67].

Hình 1. 6. Số lượng người gặp tác dụng phụ của isoniazid từ 1997-2018 [67].

Trên hệ thần kinh, bệnh lý thần kinh ngoại biên là tác dụng phụ phổ biến

nhất, do INH làm tăng quá trình đào thải vitamin B6 qua đường tiết niệu. Triệu

chứng khởi phát thường là dị cảm bàn tay và chân. Tỷ lệ gặp các triệu chứng này

cao hơn ở những người có kiểu hình acetyl hóa chậm. Các tác dụng trên hệ thần

kinh ít gặp hơn là co giật, viêm dây thần kinh thị giác, rối loạn tâm thần [21].

Tại gan, INH có thể gây viêm gan với các triệu chứng chán ăn, buồn nôn,

nôn, mệt mỏi. Người bệnh sử dụng INH có thể có nồng độ transaminase huyết thanh (AST, ALT), bilirubin máu, bilirubin nước tiểu tăng trong đợt điều trị vào

bất kì thời điểm nào, nhưng thường tăng trong 1 đến 3 tháng đầu và sau đó trở lại

bình thường. Tuy nhiên vẫn có 20% người bệnh men gan tăng cao gấp 3-5 lần và 1-

2% người bệnh bị nhiễm độc gan nặng do thuốc kháng lao [28]. Viêm gan do INH

hay diễn ra ở người tuổi cao, nữ giới (đặc biệt đang trong thai kỳ), trọng lượng cơ

thể thấp hoặc suy dinh dưỡng, nghiện rượu, chức năng gan bất thường hoặc ghép

gan, nhiễm viêm gan B và C mãn tính, AIDS và một số bệnh suy giảm miễn dịch

[28]. Các tác dụng phụ khác có thể gặp gồm: buồn nôn, nôn, đau thượng vị, viêm

tụy; thiếu máu, giảm hoặc mất bạch cầu hạt; thiếu hụt pyridoxine, tăng đường

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

huyết, toan chuyển hóa; lupus ban đỏ hệ thống, thấp khớp; sốt, viêm da…

1.3.4 Gen liên quan đến chuyển hóa isoniazid ở người

Tổn thương gan do thuốc (drug-induced liver injury, DILI) chống lao gây ra

là một tác dụng phụ phổ biến và nghiêm trọng của thuốc chống lao, tuy nhiên đa

phần tác dụng gây tổn thương gan là do INH gây ra. Sự khác biệt về độc tính của INH gây ra là do sự biến đồi về di truyền ở một số gen như N- acetyltransferase 2

(NAT2), Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1), glutathione S – transferase M1

(GSTM1), glutathione S – transferase T1 (GSTT1) [22], HLA DQA1/DQB1 [52].

Đột biến gen NAT2 gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm làm ảnh hưởng đến

nồng độ và hoạt độ xúc tác của enzym như đã trình bày trong phần 1.2. Trong

trường hợp NAT2 thấp, con đường chuyển hóa của INH có thể chuyển sang

CYP2E1 gây tăng các sản phẩm trung gian gây độc cho gan, đồng thời làm tăng

nồng độ hydrazin làm gia tăng mức độ và tần số các tác dụng không mong muốn

[43, 59]. NAT2 đóng vai trò gián tiếp trong việc gây ra các tác dụng độc khác khi

INH phối hợp với rifampicin và một số thuốc chống lao khác. Khi phối hợp INH và

rifampicin, rifampicin sẽ làm giảm hoạt độ NAT2 và hoạt động như một chất gây cảm ứng mạnh với CYP2E1 gây ra tăng các chất độc. Một nghiên cứu khác cũng

chỉ ra INH và các chất chuyển hóa độc của có gây ra tăng độc tính của pyrazinamid

với tế bào gan [50].

CYP2E1 là gen mã hóa cho enzym CYP2E1 có tác dụng chuyển hóa thuốc ở

gan. CYP2E1 xúc tác quá trình oxy hóa acetyl hydrazin và Hydrazin tạo ra các chất

trung gian gây độc cho cơ thể. Hoạt tính của CYP2E1 cũng được quyết định bởi đa

hình tại một số vị trí trong gen, hoạt tính cao hơn của enzym này có thể làm tăng sự

tổng hợp của các chất độc cho gan. Các nghiên cứu cho thấy người bệnh mang kiểu

gen CYP2E1 kiểu dại (CYP2E1 *1A/*1A) có nguy cơ nhiễm độc gan cao hơn so

với CYP2E1 dạng đột biến. Nhiều nghiên cứu chứng minh DILI của người bệnh có

CYP2E1 kiểu dại tăng lên khi người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm [59].

Các enzym thuộc họ Glutathione S-Transferase (GST) có khả năng giải độc

cho cơ thể, chúng chuyển các chất trung gian gây độc hoặc các sản phẩm oxy hóa

thành chất ít hoặc không gây độc và giúp cơ thể đào thải ra ngoài. GST tham gia

quá trình chuyển hóa của thuốc điều trị lao thông qua các phản ứng liên hợp các

chất chuyển hóa trung gian gây độc ở dạng tiềm ẩn [28]. Sự thiếu hụt GST trong cơ

thể người mà cụ thể là GSTM1 (Glutathione S - Transferase M1) và GSTT1

(Glutathione S - Transferase T1) đã được báo cáo là có liên quan đến độc tính gan.

Sự thiếu hụt hoạt tính GST do sự đồng hợp tử tại locus GSTM1 và GSTT1 có thể

ảnh hưởng đến tính nhạy cảm với độc tính gan do INH gây ra. Nguy cơ nhiễm độc

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

gan do INH ở người bệnh Ấn Độ có GSTM1 đồng hợp tử đột biến đã tăng so với 14

nhóm còn lại [20]. Một nghiên cứu ở Đài Loan cho thấy nhóm người bệnh có kiểu

gen GSTM1 đồng hợp tử đột biến có nguy cơ nhiễm độc gan do INH gây ra gấp

đôi, điều này không xảy ra ở những người mang GSTT1 đồng hợp tử kiểu dại [20].

Việc xác định kiểu gen GSTM1 đồng hợp tử kiểu dại có thể giúp phòng ngừa và quản lý tốt hơn khả năng gây độc gan do isoniazid.

1.4 Các nghiên cứu về đa hình di truyền NAT2 liên quan đến đáp ứng điều trị

isoniazid ở người bệnh lao.

INH được sử dụng để điều trị lao từ năm 1952, đến năm 1954 các nhà khoa học

đã chứng minh kiểu hình acetyl hóa chậm liên quan đến sự gia tăng các tác dụng phụ

về thần kinh (cụ thể là bệnh lý thần kinh ngoại biên) ở người bệnh lao điều trị INH.

Sau đó sự liên quan của INH với các đa hình NAT2 được báo cáo lần đầu tiên bởi

Evans và cộng sự. Vào năm 1960, các tác giả đã xác định hai nhóm kiểu hình riêng

biệt: acetyl hóa nhanh và acetyl hóa chậm [12]. Đây là một trong các nghiên cứu sớm

nhất về dược động học của quá trình chuyển hóa thuốc. Tuy nhiên, lúc này các nhà di

truyền học mới chỉ chứng minh sự nhiễm độc gan do INH gây ra, còn sự liên quan của đa hình di truyền NAT2 đối với đáp ứng INH chưa rõ ràng. Mặc dù acetyl hoá chậm

được chứng minh là có nguy cơ tăng tác dụng phụ INH (cụ thể là độc với hệ thần

kinh), nhưng không cần thiết phải tiến hành các xét nghiệm di truyền để dự đoán tác

dụng phụ này bởi vấn đề này có thể được ngăn chặn bằng cách sử dụng thêm

pyridoxine, một phương pháp khá rẻ và an toàn [17].

Năm 1985, Weber WW và Hein DW đưa ra các báo cáo đầy đủ và rõ ràng hơn

về dược động học quá trình acetyl hóa của isoniazid [55]. Năm 1991, gen NAT2 được

nhân bản thành công đã cho phép xác định 2 alen đầu tiên có liên quan đến kiểu hình

acetyl hóa chậm (đến năm 1995 theo danh pháp quốc tế về NAT2, 2 alen đó gọi là

NAT2*5 và NAT2*6) [17]. Đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu xác định tỷ lệ kiểu

hình acetyl hóa trong các quần thể người khác nhau cũng như mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa với các tác dụng phụ của INH.

Tại Việt Nam, nghiên cứu trên 100 người bệnh thu thập ngẫu nhiên từ một số

bệnh viện tại Hà Nội sử dụng phương pháp PCR-RFLP cho kết quả tỷ lệ 3 alen

NAT2*5, *6, *7 lần lượt là 2%, 12,5% và 25% [34]. Một nghiên cứu khác của cùng

tác giả sử dụng phương pháp realtime PCR cho kết quả tần số các alen đột biến

NAT2*5A, *6A, *7A lần lượt là 8%, 29% và 29% [33].

Năm 2005, Kinzig - Schipper đã công bố kết quả nghiên cứu về sự biến đổi

dược động học của INH ở những người tình nguyện khỏe mạnh sau khi dùng liều

chuẩn và mối quan hệ của nó với các biến thể di truyền của NAT2, các đặc điểm nhân

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

khẩu học. Kết quả cho thấy rằng, nồng độ INH huyết tương tăng lên ở các cá thể có

kiểu hình acetyl hóa chậm do gây giảm hoạt tính NAT2 [36]. Trong một nghiên cứu

của Parkin và cộng sự, nồng độ trong huyết tương đã được đo trong khoảng thời gian

ngắn sau khi uống INH ở người bệnh lao. Acetyl hóa chậm có nồng độ isoniazid trong

huyết thanh cao hơn acetyl hóa nhanh 4-6 lần trong khoảng thời gian từ 2 đến 6 giờ sau khi uống, các tác giả đề xuất phác đồ liều isoniazid riêng cho mỗi kiểu hình [36,

51]. Như vậy, các nghiên cứu đều chỉ ra rằng việc xác định các đa hình di truyền

NAT2 có thể giúp các bác sĩ lâm sàng ngăn ngừa tình trạng nhiễm độc gan nặng

hơn thông qua thay đổi liều điều trị đối với mỗi cá thể riêng biệt, từ đó tăng hiệu

quả điều trị, giảm các tác dụng không mong muốn.

Ngoài các nghiên cứu về vai trò NAT2 với INH, các nghiên cứu về mối liên

quan giữa kiểu hình acetyl hóa và các bệnh ung thư, bệnh Alzeimer, Parkinson, Lupus

ban đỏ hệ thống cũng đã được đưa ra. Bởi enzym NAT2 đóng vai trò quan trọng trong

chuyển hóa các hợp chất amin thơm, dị vòng, các chất gây ung thư do có khả năng

hoạt hóa sinh học, giải độc nhiều thuốc và các hóa chất độc hại. Các nghiên cứu trong

hơn 50 năm trở lại đây đã chứng minh được tầm quan trọng của việc xác định kiểu hình acetyl hóa ở các cá thể mắc lao hoặc một số cá thể phơi nhiễm với các tác nhân

ung thư. Việt Nam hiện đang đứng thứ 16/30 nước có gánh nặng bệnh lao cao nhất thế

giới, chính vì vậy việc xác định kiểu hình acetyl hóa có thể giúp các nhà lâm sàng

định hướng trong xác định liều isoniazid cho mỗi cá thể khi điều trị lao. 1.5 Các phương pháp phân tích đa hình NAT2

Hiện nay, có nhiều phương pháp phân tích SNP được sử dụng, một số phương

pháp điển hình được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn gồm:

1.5.1. Phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length

Polymorphism, RFLP).

Phương pháp này được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn sử dụng vì những ưu

điểm của nó như kết quả chính xác, giá thành rẻ, kết quả nhanh. PCR-RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về

kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzym cắt giới hạn khi có

sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. Nguyên tắc của

kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzym cắt hạn chế (Restriction enzym) đối

với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các

enzym cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một

mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt [64]. Sự khác

biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. Cùng với sự

phát triển kỹ thuật PCR, hiện nay kỹ thuật PCR-RFLP ngày càng trở nên đơn giản,

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

thuận tiện hơn. Một cặp mồi oligonucleotid có thể dùng khuếch đại một vùng DNA

cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các enzym cắt giới

hạn, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc nitrat [64].

1.5.2. Phương pháp giải trình tự

Phần lớn các phương pháp nói trên được sử dụng để sàng lọc bước đầu đột biến

điểm/SNP. Để khẳng định chính xác đột biến hay biến đổi người ta phải tiến hành giải

trình tự. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự hiện nay đều dựa trên

phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được gọi là phương pháp

dideoxyribonuleotide (viết tắt là ddNTP). Tuy nhiên phương pháp cổ điển của Sanger

chỉ giải trình tự được các đoạn gen có kích thước nhỏ khoảng 300 bp, đồng thời yêu

cầu các thao tác kỹ thuật nhiều và chính xác. Phương pháp giải trình tự hiện nay phát

triển từ phương pháp cổ điển của Sanger giúp giải trình tự nhanh và chính xác các đoạn gen lớn. Phương pháp này sử dụng các ddNTP được gắn chất phát quang,

ddNTP sẽ liên kết vào mạch DNA đang kéo dài và làm ngừng phản ứng sao chép. Cấu

trúc phần phát quang được thiết kế để phát ra ánh sáng có bước sóng khác nhau cho

mỗi ddNTP. Một máy cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính xử lý, mã hóa và tự

động chuyển thành trình tự DNA. Phương pháp này có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, đặc

biệt với các đoạn DNA từ 30 bp đến 1000 bp. Một hạn chế nhỏ của phương pháp này

là không đọc được các trình tự quá ngắn (dưới 30 bp), sai số tăng khi giải trình tự các

đoạn DNA trên 1000bp. Đối với các đoạn quá ngắn cần xác định lại độ chính xác bằng

các phương pháp thủ công khác [5].

1.5.3. Phương pháp phản ứng nối chuỗi (Ligase Chain Reaction, viết tắt là LCR)

Kỹ thuật cho phép phát hiện sự thay thế một đôi base với tính đăc hiệu và độ tin cậy cao nhờ quá trình khuếch đại (với xúc tác của enzym ligase) để kết nối 2 đầu

tận của 2 cặp mồi liền kề nhau. Enzym ligase nối hai chuỗi oligonucleotid khi chúng

liên kết bổ sung hoàn toàn (100%), vì vậy sự thay thế một đôi base sẽ cản trở hình

thành liên kết nối. Phương pháp LCR thường được sử dụng trong lĩnh vực pháp y [6].

1.5.4. Phương pháp Realtime PCR

Kĩ thuật sử dụng đoạn đầu dò oligonucleotid có khả năng lai với một vị trí nội

phân tử của gen đích. Đầu dò này được gắn với chất phát màu huỳnh quang, số lượng

sản phẩm đặc hiệu sẽ tỷ lệ thuận với mức độ tín hiệu huỳnh quang. Các đột biến điểm

của DNA khuôn sẽ làm giảm sự bền vững của liên kết giữa đầu dò và đoạn DNA đích.

Vì vậy khi có đột biến, tín hiệu huỳnh quang sẽ bị giảm đi nhanh chóng so với DNA

đích nguyên vẹn. Kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kì

nhiệt của phản ứng, vì vậy người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

(như PCR). Do khả năng phân tích kết quả sau mỗi chu kì phản ứng, Realtime – PCR

có ưu điểm là cho kết quả nhanh và nhậy và tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, phương

pháp này đòi hỏi chi phí cho hóa chất cao, yêu cầu khắt khe về hệ thống máy Realtime

– PCR cũng như trình độ của người làm thí nghiệm [6].

1.5.5. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp biến tính (Denaturing high performance liquid chromatography - DHPLC).

Đây là phương pháp phân tích DNA dị sợi kép. Thay vì sử dụng gel và phân

tách DNA bằng điện di, DNA được phân tách bằng sắc ký DHPLC. Các mạch DNA

được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ, chúng liên kết với nhau và hình

thành DNA dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị sợi kép

này có thời gian di chuyển khác so với sợi kép bình thường. DHPLC là một kĩ thuật

mạnh, đơn giản và mẫu được đưa vào tự động [48]. Với những tiến bộ gần đây trong

việc phát triển phần mềm dự đoán đường cong biến tính, phương pháp này có độ nhạy

cao và khả năng tái sử dụng tốt.

1.5.6. Kỹ thuật phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn (single strand DNA

conformational polymorphism, viết tắt là SSCP)

Sự thay thế một cặp base trong bộ gen có thể dẫn đến thay đổi về cấu trúc và

làm biến đổi khả năng di chuyển. SSCP giúp phát hiện cấu trúc đa hình của các đoạn

nucleotid thông qua sự thay đổi khả năng di chuyển của DNA chuỗi đơn. Phương

pháp gồm 2 bước là khuếch đại đoạn DNA đích bằng PCR, sau đó sản phẩm PCR

được biến tính và phân đoạn nhờ điện di trên gel polyacrylamid ở điều kiện không

biến tính. Các đoạn DNA đích (có đột biến điểm) sẽ có cấu trúc khác với sợi DNA đối

chứng và được phân biệt nhờ gel polyacrylamid ở trạng thái không biến tính. Phương

pháp này đòi hỏi các điều kiện khắt khe về nhiệt độ, nồng độ gel, nồng độ mồi và

thường có kết quả tốt với phân đoạn DNA có kích thước 150 đôi base (không nên tiến

hành với với các phân đoạn có kích thước lớn hơn 200 đôi base) [6].

Trong các phương pháp kể trên, phương pháp được sử dụng phổ biến để phân tích đa hình gen NAT2 là Realtime PCR, PCR-RFLP, DHPLC và giải trình tự. Tại

Việt Nam, mới chỉ có phương pháp phân tích đa hình NAT2 dựa trên Realtime PCR và

PCR-RFLP của tác giả Đinh Đoàn Long và cộng sự nhằm xác định các SNP có vai trò

dược lý quan trọng trên người bệnh không mắc lao [33, 34], chưa có báo cáo nào về

đa hình di truyền NAT2 trên người bệnh lao sử dụng phương pháp giải trình tự. Trong

khi đó, tại Việt Nam tỷ lệ mắc lao vẫn còn khá cao, số người gặp các tác dụng phụ do

isoniazid vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Vì vậy, nhóm nghiên cứu thực hiện

nghiên cứu này nhằm xây dựng một quy trình chuẩn để phân tích kiểu gen, từ đó xác

định kiểu hình của mỗi cá thể. Kết quả của nghiên cứu sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu

khác để từ đó ứng dụng vào trong thực tế lâm sàng nhằm nâng cao hiệu quả điều trị

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

bệnh lao tại nước ta.

CHƯƠNG 2. ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

100 người bệnh từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện 74 Trung Ương và

Bệnh viện Phổi Hà Nội tham gia nghiên cứu thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: Người bệnh

lao phổi có AFB dương tính (mới hoặc lao phổi tái trị); điều trị bằng các thuốc chống

lao hàng 1 theo phác đồ của Chương trình Chống lao Quốc gia Việt Nam năm 2017;

người bệnh tự nguyện tham gia nghiên cứu.

Tiêu chuẩn loại trừ gồm có: Phụ nữ có thai và cho con bú; người bệnh nuôi cấy

không mọc khuẩn lạc để xác định các thông số dược động học.

Thời gian: từ tháng 6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2018.

Địa điểm xét nghiệm và phân tích: Phòng thí nghiệm Bộ môn Y Dược học cơ

sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất dùng cho tách DNA tổng số: E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng

Omega-Biotek).

Hóa chất dùng cho điện di: Ethylene Diamine Tetra Acetic Axit (EDTA),

Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix), TAE 1X, 5X DNA loading dye (hãng

ThermoScientific), Oˈ GeneRuler 50bp DNA Ladder (hãng ThermoScientific),

Oˈ GeneRuler 1kb DNA Ladder (hãng ThermoScientific), Lambda DNA/HindIII

Marker (hãng ThermoScientific), Tris base (hãng Bio basic), axit acetic (hãng Merck). Hóa chất dùng cho PCR: Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng Phusa-biochem

(Việt Nam) với trình tự mồi đã được sử dụng ở một số nghiên cứu khác 5'-GGA ACA

AAT TGG ACT TGG-3' và 5'-TCT AGC ATG AAT CAC TCT GC-3' [18, 34], nước

khử ion (hãng Omega Biotek), Kapa2GT M Robust HotStart ReadyMix (2X) (hãng

Kapabiosystems).

Hóa chất dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR: E.Z.N.A.® CyclePure Kit (hãng

Omega-biotek).

Hóa chất dùng cho PCR-RFLP: nước khử ion (hãng Omega Biotek), enzym cắt

FastDigest KpnI, FastDigest BamHI, FastDigest TaqI (hãng ThermoScientific).

2.1.3. Thiết bị

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It - Mỹ), hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd - Mỹ), máy PCR (Prime Thermal Cycler - Anh), tủ an toàn sinh học (ESCO - Đức), 19

máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen -Châu Âu), máy lắc VELP (Scientifica -

Châu Âu), máy quang phổ NP80 (Nanophotometer - Đức), máy làm đá vảy (Fiocchetti

- Anh), tủ ấm (Panasonic - Nhật bản), tủ lạnh sâu -30oC (Panasonic - Nhật Bản), tủ mát

4oC (FRIMED - Anh). 2.2. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 6 bước chính được thể hiện trong Hình 2.1 gồm (1)Thu thập

mẫu sinh phẩm, (2) tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số, (3) nhân dòng

đoạn gen NAT2 bằng PCR, (4) tinh sạch sản phẩm PCR, (5) xác định kiểu gen

bằng phương pháp PCR-RFLP hoặc giải trình tự, (6) phân tích kết quả.

Thu thập100 mẫu máu BN lao

Tách chiết DNA tổng số

PCR nhân dòng đoạn gen NAT2

Tinh sạch sản phẩm PCR

Xác định kiểu gen thông qua RFLP và giải trình tự tự

Phân tích kết quả

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 2. 1. Các bước tiến hành nghiên cứu

2.2.1. Thu mẫu sinh phẩm

Mỗi người bệnh cung cấp 2mL mẫu máu toàn phần lưu trong ống có chứa

EDTA, bảo quản ở - 20 oC cho đến khi sử dụng.

Kí hiệu mẫu: Thông tin về mẫu máu của người bệnh được lưu trong sổ thí nghiệm với các thông tin: tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và

khi sử dụng để tách DNA.

2.2.2. Tách chiết DNA tổng số

Tách DNA tổng số sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình

khuyến cáo của hãng.

Nguyên lý của phương pháp tách chiết này là dựa vào sự hấp thụ chọn lọc của

axit nucleic vào màng silica – gel thông qua 4 bước chính như mô tả ở Hình 2.2 là ly

giải, gắn DNA vào màng silica, rửa sạch tạp chất; giải phóng và thu DNA. Cụ thể: (1)

Quá trình ly giải thực chất chính là phá vỡ tế bào để giải phóng DNA. Trong dung

dịch chất ly giải có một số chất ly giải và có nồng độ cao các muối hoạt động bề mặt

có khả năng làm mất ổn định liên kết hydro, lực Van der Walls và tương tác kị nước để tạo điều kiện để chuyển DNA lên màng silica. (2) Quá trình gắn DNA vào màng

silica gel nhờ sự có mặt của các muối hoạt động bề mặt và cồn (thường là ethanol

hoặc isopropanol. (3) Quá trình rửa: Giúp loại bỏ tạp chất khác trên màng silica gel

thông qua các dung dịch có chứa muối hoạt động bề mặt cao, sau đó là ethanol để loại

bỏ muối. Sau bước này trên màng silica gel chỉ còn gắn DNA sẽ được làm khô cột

bằng ly tâm để chắc chắn đã loại bỏ ethanol. (4) Quá trình giải phóng và thu DNA:

Bằng cách sử dụng dung dịch muối phù hợp, thường là Tris 10 mM ở pH 8 hoặc 9,

DNA sẽ hòa tan vào muối. Cuối cùng sau khi chắc chắn DNA đã hòa tan, các cột sẽ

được li tâm để thu DNA [27].

(1) Ly giải

(2) Gắn DNA vào màng

(3) Rửa sạch tạp chất

(4) Giải phóng và thu DNA

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 2. 2. Nguyên lý tách DNA tổng số bằng kit [33]

DNA tổng số thu được được điện di trên gel agarose 1,2%, đệm TAE 1X. Trộn

4 µL DNA với 1 µL 5X DNA loading Dye đã nhuộm Ethidium bromide (50 µg/mL)

trước khi tra mẫu. Điện di được thực hiện trong hiệu điện thế 84 volt trong 40 phút, sử

dụng thang chuẩn DNA λ/HindIII ladder, các băng DNA được hiện hình dưới ánh sáng UV. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tách chiết được định lượng bằng cách đo

mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280). DNA được

cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.

Nguyên lý của phương pháp đo mật độ quang là do axit nucleic có phổ hấp thụ

cực đại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purin và base pyrimidin. Vì vậy,

để tính nồng độ DNA cần xác định giá trị mật độ quang ở OD260. Một đơn vị OD260

tương ứng nồng độ 50 ng/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi. Đo dung dịch ở bước

sóng OD280 (mức hấp thụ cực đại của protein) và sử dụng tỉ lệ OD260/OD280 để đánh

giá độ tinh sạch của DNA. Các mẫu được đo ở bước sóng 260 và 280 nm, tiến hành đo

ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu. 2.2.3. Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR

Dựa vào dữ liệu trên NCBI gen NAT2 kiểu dại dài 1093 bp được khuếch đại

thông qua PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình tự lý thuyết như sau (Hình 2.3) [62]:

1 GGAACAAATT GGACTTGGAA ACATTAACTG ACATTCTTGA GCACCAGATC CGGGCTGTTC CCTTTGAGAA CCTTAACATG

81 CATTGTGGGC AAGCCATGGA GTTGGGCTTA GAGGCTATTT TTGATCACAT TGTAAGAAGA AACCGGGGTG GGTGGTGTCT

161 CCAGGTCAAT CAACTTCTGT ACTGGGCTCT GACCACAATC GGTTTTCAGA CCACAATGTT AGGAGGGTAT TTTTACATCC

241 CTCCAGTTAA CAAATACAGC ACTGGCATGG TTCACCTTCT CCTGCAGGTG ACCATTGACG GCAGGAATTA CATTG TCGAT

321 GCTGGGTCTG GAAGCTCCTC CCAGATGTGG CAGCCTCTAG AATTAATTTC TGGGAAGGAT CAGCCTCAGG TGCCTTGCAT

401 TTTCTGCTTG ACAGAAGAGA GAGGAATCTG GTACCTGGAC CAAATCAGGA GAGAGCAGTA TATTACAAAC AAAGAATTTC

481 TTAATTCTCA TCTCCTGCCA AAGAAGAAAC ACCAAAAAAT ATACTTATTT ACGCTTGAAC CTCGAACAAT TGAAGATTTT

561 GAGTCTATGA ATACATACCT GCAGACGTCT CCAACATCTT CATTTATAAC CACATCATTT TGTTCCTTGC AGACCCCAGA

641 AGGGGTTTAC TGTTTGGTGG GCTTCATCCT CACCTATAGA AAATTCAATT ATAAAGACAA TACAGATCTG GTCGAGTTTA

721 AAACTCTCAC TGAGGAAGAG GTTGAAGAAG TGCTGAGAAA TATATTTAAG ATTTCCTTGG GGAGAAATCT CGTGCCCAAA

801 CCTGGTGATG GATCCCTTAC TATTTAGAAT AAGGAACAAA ATAAACCCTT GTGTATGTAT CACCCAACTC ACTAATTATC

881 AACTTATGTG CTATCAGATA TCCTCTCTAC CCTCACGTTA TTTTGAAGAA AATCCTAAAC ATCAAATACT TTCATCCATA

961 AAAATGTCAG CATTTATTAA AAAACAATAA CTTTTTAAAG AAACATAAGG ACACATTTTC AAATTAATAA AAATAAAGGC

1041 ATTTTAAGGA TGGCCTGTGA TTATCTTGGG AAGCAGAGTG ATTCATGCTA GA

Hình 2. 3. Trình tự đoạn gen NAT2 được nhân dòng để xác đinh kiểu alen

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và nồng độ DNA. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng trên gel agarose 1,5%, sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler DNA Ladder để xác định kích thước sản phẩm. Tất cả các phản ứng đều sử dụng đối chứng âm để đảm bảo mẫu không bị ngoại nhiễm.

2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng E.Z.N.A.® CyclePure Kit theo quy trình

khuyến cáo của hãng. Nguyên lý của phương pháp là loại bỏ mồi, muối và các tạp

chất khác từ mẫu DNA thông qua sử dụng cột có màng silica gel tương tự như nguyên lý tách chiết DNA đã nêu ở phần 2.2.2.

2.2.5. Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được pha loãng về nồng độ 100 ng/µL

dùng cho phản ứng cắt.

Đê tiến hành phản ứng cắt, chúng tôi sử dụng các enzym FastDigest KpnI,

FastDigest TaqI, FastDigest BamI để cắt 3 alen NAT2*5, *6, *7. Dựa vào vị trí của enzym

cắt trên gen NAT2, kích thước của các băng điện di theo từng kiểu gen dự kiến được Hình 2.4 mô tả. Alen NAT2*5 (c.341T > C) không có vị trí nhận biết của enzym cắt, tuy

nhiên lại liên kết chặt chẽ với c.481C > T có vị trí nhận biết của KpnI. Chính vì vậy,

kiểu gen NAT2*5 được xác định thông qua kiểu gen của c.481C > T. Thành phần và

điều kiện của phản ứng cắt được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2. 1. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt

Thể tích 1 phản Điều kiện cắt Thành phần ứng (10 µL)

Đệm 10X 1 µL

Ủ 5 phút ở 37 ˚C, bất hoạt FastDigest enzym 1 µL

5 phút ở 80˚C. Nước khử ion 4,5 µL

DNA khuôn 100 ng/µL 3,5 µL

Hình 2. 4. Kết quả dự kiến cắt alen NAT2*5, NAT2*6 và NAT2*7. (TT: đồng hợp

tử kiểu dại; CT: dị hợp tử; CC: đồng hợp tử đột biến; GG: đồng hợp tử kiểu dại; AG:

dị hợp tử; AA: đồng hợp tử đột biến)

Chiều dài đoạn gen ước tính sau khi cắt alen NAT2*5 và NAT2*7 lớn hơn

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

200bp và các đoạn gen có chiều dài khác biệt trên 200 bp, vì vậy tiến sản phẩm cắt 2

alen này được điện di trên gel agarose 2% với thang chuẩn O’ GeneRuler 1kb DNA

ladder (ThermoScientific). Sản phẩm hiển thị dưới ánh sáng UV thông qua máy soi

gel. Trong khi đó, chiều dài ước tính của sản phẩm cắt NAT2*6 nhỏ hơn 400 bp và

chiều dài đoạn gen cách nhau ít nhất là 15 bp, vì vậy chúng tôi điện di trên gel acrylamide 10%, sử dụng thang chuẩn O’ GeneRuler 50bp DNA ladder để có thể thu

được hình ảnh cắt rõ nhất, sau đó sẽ sử dụng phương pháp nhuộm bạc để hiện hình

sản phẩm.

2.2.6. Xác định kiểu gen NAT2 bằng phương pháp giải trình tự

20 µL sản phẩm PCR đã được kiểm tra trên gel agarose và tinh sạch bằng kit sẽ

được gửi đến hãng First base (Malaysia ) để giải trình tự bằng cách sử dụng cùng 1

mồi cho cả đoạn gen NAT2. Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi người bệnh.

Cách đọc kết quả giải trình tự như sau: Trong phần mềm BioEdit, mỗi

nucleotit được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu

xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí mỗi nucleotit, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu

thì người bệnh có kiểu gen đồng hợp tử, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị

hợp tử. Ngoài 6 SNP trên, chúng ta có thể xác định nhiều SNP khác trên đoạn gen đã

được giải trình tự, giúp tìm được nhiều mối liên hệ hơn trong cùng 1 bệnh hoặc nhiều

bệnh trên cùng 1 gen của 1 cá thể.

2.2.7. Xác định tần số của các SNP và dự đoán kiểu hình acetyl hóa

Tần số kiểu gen và alen được xác định theo công thức sau (giả sử với kiểu gen

𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑚𝑎𝑛𝑔 𝑔𝑒𝑛 𝑋

X gồm 2 dạng alen là C và T, cho 3 kiểu gen là CC, CT, TT):

𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢

- Tần số của mỗi kiểu gen: Tần số kiểu gen X =

f (CT) - Tần số của mỗi alen: Tần số alen C: f (C) = f (CC) +

Tần số alen T: f (T) = f (TT) + f (CT)

Trong đó, f (CC), f (TT), f (CT) là tần số các kiểu gen tương ứng CC, TT, CT.

- Xác định kiểu hình.

Đối với kiểu hình acetyl hóa dựa trên 3 SNP : kiểu hình acetyl hóa chậm khi có

lớn hơn 1 alen đột biến, kiểu hình acetyl hóa trung bình khi có 1 alen đột biến và kiểu

hình acetyl hóa nhanh khi không có sự xuất hiện của alen đột biến trên cả 3 SNP

nghiên cứu. Đối với kiểu hình 6 SNP : trên web NAT2PRED nhập dữ liệu cả 6 SNP

của cùng một người bệnh để xác định kiểu hình acetyl hóa [65].

Dựa trên kết quả giải trình tự sẽ tính được tần số phân bố của SNP và đối chiếu

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

với công thức di truyền quần thể Hardy-Weinberg. Mức độ khác biệt giữa các tần số

các alen và kiểu gen thu được trong thí nghiệm và với số liệu mong đợi được kiểm tra

qua phép thử χ2.

2.3. Đạo đức nghiên cứu

Nghiên cứu đảm bảo các quy định về đạo đức trong thiết kế thử nghiệm lâm sàng của Bộ Y tế. Người bệnh trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ

về mục đích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh

hưởng bất lợi của nghiên cứu tới người bệnh. Những người bệnh tham gia nghiên cứu

sẽ được kí bản đồng thuận tham gia nghiên cứu. Người bệnh có quyền rút khỏi nghiên

cứu bất cứ lúc nào. Các thông tin của người bệnh được đảm bảo bí mật tuyệt đối và

chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu.

Nghiên cứu đã được thông qua tại Hội đồng đạo đức Khoa Y Dược, Đại học

Quốc gia Hà Nội trước khi triển khai thực hiện. Mẫu bệnh án và phiếu xác nhận tự

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

nguyện tham gia nghiên cứu của người bệnh được thu thập đầy đủ.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Tách chiết DNA tổng số

Các mẫu máu thu được từ 100 người bệnh được tách DNA bằng kit của Omega, sản phẩm tách chiết điện di trên gel agarose 1,2%. Kết quả điện di sản phẩm

DNA tổng số từ mẫu máu của các người bệnh (Hình 3.1) cho thấy các sản phẩm DNA

tổng số từ mẫu máu của các người bệnh đều có một băng DNA rõ nét, chất lượng

DNA từ các mẫu khác nhau tương đối đồng đều và ổn định, thể hiện qua các băng

điện di có độ sáng cao tương ứng với băng 23,1 kb của thang chuẩn.

Kết quả đo mật độ hấp thụ quang ở 260 nm của sản phẩm DNA tổng số cho

thấy nồng độ DNA thu được dao động từ 20 - 230 ng/µL, chỉ số OD260/OD280 phần lớn

đều nằm trong khoảng từ 1,6 đến 2,2 (kết quả từng mẫu xem ở Phụ lục 2). Như vậy,

DNA tổng số thu được ít bị đứt gãy với một băng duy nhất, đảm bảo tinh sạch và đủ

điều kiện để tiến hành phản ứng nhân dòng tiếp theo.

Hình 3. 1. Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2%. Làn M1: thang chuẩn

DNA λ/HindIII; Làn 1 – 12: sản phẩm DNA tổng số của 12 mẫu nghiên cứu.

3.2. Nhân dòng đoạn gen NAT2 bằng PCR

3.2.1 Tối ưu quy trình PCR

Khi tiến hành PCR, nhiệt độ gắn mồi là yếu tố quan trọng cần được tối ưu để đảm bảo PCR có hiệu suất cao nhất. Vì vậy, chúng tôi tiến hành PCR trên 10 nhiệt độ

khác nhau trong dải nhiệt từ 51,1oC đến 59,9oC. Nồng độ DNA nhân dòng tối ưu được

xác định từ dải nồng độ 25, 50, 84, 150, 200 và 250 ng/µL.

Kết quả điện di trên Hình 3.2A cho thấy tại nhiệt độ gắn mồi 57,8oC đến 58,9oC

sản phẩm PCR thu được băng đặc hiệu, sáng rõ có kích thước phù hợp với lí thuyết

(1093 bp).Tuy nhiên, tại nhiệt độ gắn mồi 52,6oC đến 55,8oC có xuất hiện băng phụ,

còn tại nhiệt độ 52,6oC; 53,6oC; 59,5oC và 59,9oC các băng xuất hiện mờ, không rõ nét.

Như vậy, nhiệt độ gắn mồi 58oC cho băng sáng nhất, rõ nét và không có băng phụ nên

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

được chọn là nhiệt độ gắn mồi cho các phản ứng tiếp theo. Kết quả tối ưu nồng độ

DNA trên Hình 3.2B cho thấy PCR thành công với nồng độ từ 150-250 ng/µL, tuy

nhiên tại nồng độ 150 ng/µL và 250 ng/µL cho băng sáng mờ, nồng độ 200 ng/µL cho

băng sáng rõ nét, không có băng phụ nên được chọn làm nồng độ tối ưu.

Hình 3. 2. Kết quả tối ưu phản ứng PCR nhân dòng NAT2 trên gel agarose 1,5%. (A) Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi; (B) Kết quả tối ưu nồng độ DNA; Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm.

3.3.2 Nhân dòng gen NAT2 của 100 mẫu nghiên cứu

Sử dụng điều kiện sau khi tối ưu với thành phần và chu trình nhiệt như trên

(Bảng 3.1), nhóm nghiên cứu đã nhân dòng thành công 100 sản phẩm. Hình 3.3 là kết

quả điện di nhân dòng gen NAT2 của 10 mẫu đầu tiên. Hình ảnh là một băng sáng rõ

nét cho thấy phản ứng PCR đạt hiệu suất và độ đặc hiệu cao, đảm bảo tham gia các

phản ứng tiếp theo. Thí nghiệm PCR luôn sử dụng đối chứng âm và cho kết quả âm

tính, chứng tỏ quá trình thao tác không bị nhiễm DNA ngoại lai. Kích thước băng sau

khi so sánh với thang chuẩn cho kết quả phù hợp với kích thước lý thuyết, xấp xỉ 1093

bp.

Bảng 3. 1. Thành phần và điều kiện phản ứng nhân dòng gen NAT2

Nồng độ Thể tích Chu trình nhiệt Thành phần hoạt động (10 µL)

Nước khử ion 3,4 -Biến tínhban đầu:

Master Mix Kapa2G Robust 95oC trong 3 phút 1X 5 Hotstart DNA polymerase - 35 chu kì:

95oC trong 15 giây Mồi xuôi 10 µM 0,3 µM 0,3

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

58oC trong 15 giây 72oC trong 1 phút Mồi ngược 10 µM 0,3 µM 0,3

-Kéo dài cuối: DNA khuôn 200 ng/µL 1

72oC trong 10 phút

Hình 3. 3. Kết quả nhân dòng 10 mẫu nghiên cứu gen NAT2 theo điều kiện tối

ưu. Làn M: thang chuẩn kích thước DNA 1kb; Làn (-): đối chứng âm.

3.3 Xác định kiểu gen NAT2 bằng PCR-RFLP

Xác định kiểu gen NAT2*5 bằng FastDigest KpnI. Kiểu gen đồng hợp tử kiểu

dại CC sẽ cho hai băng với kích thước là 659 bp và 434 bp; kiểu gen dị hợp tử CT cho

ba băng có kích thước lần lượt là 1093, 659 và 434 bp; kiểu gen đồng hợp tử đột biến

TT không bị cắt cho một băng với kích thước 1093 bp. (Hình 3.4A).

Hình 3. 4. Phân tích kiểu gen NAT2 dựa vào PCR-RFLP. (A) Các kiểu gen NAT2*5, *7 điện di trên gel agarose 2%; M1: thang chuẩn kích thước DNA 1kb. (B)

Các kiểu gen NAT2*6 điện di trên gel acrylamide 10%; M2: thang chuẩn kích thước

DNA 50bp; Làn (-): đối chứng âm.

Xác định kiểu gen NAT2*6 bằng FastDigest TaqI. Kiểu gen đồng hợp tử kiểu

dại GG sau khi cắt bằng enzym giới hạn sẽ cho 4 băng điện di với kích thước 316,

226, 170 và 381 bp. Kiểu gen dị hợp tử GA cho 5 băng điện di với kích thước 396,

381, 316, 226 và 170 bp. Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA sẽ cho 3 băng điện di với

kích thước 396, 381 và 316 bp (Hình 3.4B).

Xác định kiểu gen NAT2*7 bằng FastDigest BamHI: Kiểu gen đồng hợp tử

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

kiểu dại GG sẽ cho 2 băng với kích thước 810 bp và 283 bp, kiểu gen dị hợp GA cho 3 28

băng với kích thước 1093, 810 và 283 bp. Kiểu gen đồng hợp tử đột biến AA không bị

cắt cho 1 băng duy nhất với kích thước 1093 bp (Hình 3.4A).

3.4. Xác định kiểu gen NAT2 bằng giải trình tự.

Đồng hợp tử kiểu dại Dị hợp Đồng hợp tử đột biến SNP

TT TC CC

NAT2*5

(T341C)

GG GA AA

NAT2*6

(G590A)

GA AA GG

NAT2*7 (G857A)

CC CT TT

NAT2*11

(C481T)

AA AG GG

NAT2*12

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

(A803G)

CC CT TT

NAT2*13

(C282T)

Hình 3. 5. Kết quả xác định các kiểu gen NAT2 trên BioEdit version 7.1.9.

Hình 3.5 là hình ảnh thu được về các loại kiểu gen của 6 alen khi phân tích kết

quả giải trình tự trên phần mềm BioEdit 7.1.9. Tất cả các kiểu gen của 6 alen NAT2*5,

*6, *7, *11, *12, *13 đều xuất hiện trong mẫu nghiên cứu của chúng tôi.

3.5 Kết quả phân bố tần số alen và tỷ lệ kiểu gen, kiểu hình NAT2.

Kết quả phân tích trên 100 mẫu nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ 6 alen NAT2*5, *6,

*7, *11, *12, *13 lần lượt là 6%, 32%, 12%, 6%, 7% và 49% (Bảng 3.2). Kết quả tỷ

lệ kiểu hình acetyl hóa dựa trên 3 SNP và 6 SNP hoàn toàn giống nhau, tỷ lệ kiểu hình

acetyl hóa nhanh, trung bình, chậm thể hiện ở Bảng 3.3 lần lượt là 25 %, 38 % và 37

% .

Bảng 3. 2. Kết quả phân tích kiểu gen và tần số của đa hình NAT2

Kiểu gen

Đồng Đồng SNP Tần số alen p - value χ2 Dị hợp hợp tử hợp tử tử kiểu dại đột biến

NAT2*5 TT=89 TC=10 CC=1 T=0,94 C=0,06 0,256 1,288

NAT2*6 GG=50 GA=37 AA=13 G=0,685 A=0,32 0,154 2,034

NAT2*7 GG=78 GA=20 AA=2 G=0,88 A=0,12 0,596 0,281

NAT2*11 CC=89 CT=10 TT=1 C=0,94 T=0,06 0,256 1,288

NAT2*12 AA=88 AG=11 GG=1 A=0,93 G=0,07 0,342 0,903

NAT2*13 CC=29 CT=44 TT=27 C=0,51 T=0,49 0,232 1,432

Bảng 3. 3. Tỷ lệ kiểu hình NAT2 trên 100 người bệnh mắc lao người Việt Nam

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Tổng Kiểu hình Nhanh Trung bình Chậm

Số lượng ( người 25 38 37 100 bệnh)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Tỷ lệ (%) 25 % 38 % 37 % 100 %

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

4.1 Tối ưu hóa quy trình phân tích đa hình di truyền NAT2

Nhóm nghiên cứu lựa chọn 2 phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự để tiến

hành nghiên cứu vì những ưu điểm của mỗi phương pháp về lý thuyết có tính bổ sung

lẫn nhau. Sau khi tiến hành nghiên cứu, hiệu quả của mỗi phương pháp khi phân tích

các kiểu gen NAT2 cụ thể như sau.

4.1.1. Phương pháp PCR-RFLP

Khó khăn của nhân dòng gen NAT2 một phần do độ dài đoạn gen cần khuếch

đại lớn hơn 1 kb. Bên cạnh đó, các thuốc người bệnh đã sử dụng có thể tồn lưu trong

mẫu DNA gây ức chế phản ứng PCR. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn Kapa2GT M

Robust Hotstart Ready Mix đã có sẵn tất cả các chất cần thiết cho PCR, trừ mồi và

DNA, qua đó giúp đơn giản hóa quy trình thao tác, giảm 20% -50% thời gian thực

hiện so với các enzym khác. Ưu điểm chính của enzym Kapa2G là khả năng PCR dù

có sự hiện diện của một số chất ức chế, hoặc các mẫu DNA có độ tinh sạch chưa cao.

Mặt khác, ngoài hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase, Kapa2G còn có hoạt tính 5’-3’

exonuclease cho phép tăng độ chính xác trong quá trình khuếch đại gen [63].

Ngoài enzym Kapa2G, HotStartTaq DNA polymerase của hãng QIAGEN cũng

cho kết quả nhân dòng với hiệu suất và độ đặc hiệu cao. Ưu điểm của HotStartTaq DNA polymerase QIAGEN là dễ dàng thực hiện nhân dòng với cả các mẫu có nồng

độ DNA thấp, các mẫu DNA phức tạp khó nhân dòng. Buffer dùng cho PCR của

QIAGEN được thiết kế với điều kiện ủ mồi nghiêm ngặt, nồng độ Mg2+ cao hơn các

buffer PCR thông thường qua đó làm tăng hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng.

Enzym của QIAGEN còn có ưu điểm là có dung dịch Q (thay vì DMSO), một chất

không độc hại có tác dụng thay đổi độ tan chảy của DNA, tạo điều kiện khuếch đại

các mẫu khó khuếch đại bằng các enzym thông thường [66].

4.1.2. Phương pháp giải trình tự

Phương pháp này được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định đột biến, được ứng

dụng rộng rãi trên toàn thế giới đặc biệt trong lĩnh vực di truyền y học. Với sự phát

triển ngày càng đi lên của công nghệ nói chung và công nghệ y sinh nói riêng, giá

thành giải trình tự cho mỗi mẫu phân tích tại Việt Nam ngày càng giảm, số lượng các

cơ sở giải trình tự trong nước ngày càng nhiều. Vì vậy, tại các cơ sở y tế nghiên cứu

không có hệ thống giải trình tự vẫn có thể tiến hành gửi mẫu sang cơ sở khác đọc. Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loại đột biến,

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

vị trí, đặc biệt giúp xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ

nhạy rất cao. Giải trình tự là phương pháp tốt nhất để xác định chính xác cùng lúc tất

cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp cho các nghiên cứu chưa xác

định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm. Trên thực tế, một gen có thể có rất

nhiều đột biến liên quan đến nhiều bệnh khác nhau. Vì vậy, trên cùng 1 đoạn gen đã được giải trình tự, chúng ta có thể cung cấp dữ liệu kiểu gen đầy đủ nhất của đối

tượng tham gia nghiên cứu. Trong nghiên cứu này, cặp mồi sử dụng cho phép nhân

dòng toàn bộ vùng gen mã hóa cho enzym NAT2, vì vậy giải trình tự cung cấp rất

nhiều thông tin di truyền về gen NAT2, kể cả các alen khác trên gen NAT2. Việc xác

định được tất cả các đa hình trên gen NAT2 lần đầu tiên cung cấp bộ dữ liệu đa hình di

truyền gen NAT2 ở người bệnh lao.

Hiện nay phương pháp giải trình tự đang được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.

Các đột biến DNA được phát hiện có vai trò trong đánh giá nguy cơ ung thư hoặc xác

định tính hiệu quả của các thuốc điều trị đích sinh học, cho phép chẩn đoán nguy cơ

và tình trạng mắc các bệnh lý thần kinh, bệnh lý di truyền như bệnh Parkinson, bệnh

Huntington, teo cơ Lateral Sclerosis và các loại bệnh mất trí nhớ như bệnh Alzheimer [4]. Ngoài ra, kết quả giải trình tự còn giúp chẩn đoán xác định việc nhiễm một số loại

virus, vi khuẩn và nấm, đánh giá sự liên quan giữa đột biến và khả năng đáp ứng hoặc

kháng một vài loại thuốc. Ngày nay, càng ngày càng có nhiều ứng dụng của giải trình

tự được tìm ra cho thấy tầm quan trọng của phương pháp giải trình tự đối ngành y sinh

học, dược học và các ngành liên quan [4].

Phương pháp PCR-RFLP có những ưu điểm vượt trội về thời gian thao tác

nhanh, chi phí thấp và dễ thực hiện, vì vậy nhiều nhà nghiên cứu sử dụng phương

pháp RFLP để tiến hành phân tích kiểu hình acetyl hóa thông qua 3 alen NAT2*5, *6,

*7 [43, 59]. Như vậy, khi áp dụng vào thực hành lâm sàng, đối với các người bệnh cần

yêu cầu gửi kết quả sớm, phương pháp RFLP là một lựa chọn sáng giá. Phương pháp

RFLP phân tích 3 alen NAT2*5, *6, *7 cho kết quả kiểu gen tương đồng hoàn toàn với giải trình tự, các kiểu hình xác định dựa trên 3 SNP và 6 SNP trong nghiên cứu không

có sự khác biệt, giống nhau hoàn toàn. Như vậy, chúng tôi khuyến cáo sử dụng kĩ

thuật RFLP để dự đoán kiểu hình acetyl hóa thông qua 3 alen NAT2*5, *6, *7.

4.2. Về đa hình di truyền NAT2

4.2.1. Tần số alen và tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa

Các biến thể di truyền NAT2 đóng vai trò quan trọng trong khả năng acetyl hóa

của NAT2 tại gan, có thể tác động đến chuyển hóa thuốc và tính nhạy cảm với một số

bệnh nhất định. Phần lớn các nghiên cứu bỏ qua phân tích các đa hình không làm thay

đổi chức năng của enzym, tập trung vào số ít các đột biến “chỉ thị” cho phép dự đoán

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

được trạng thái acetyl hóa như NAT2*5,*6 và *7, *11, *12, *13. Vì vậy, nghiên cứu

của chúng tôi đã thực hiện trên 100 người bệnh người Việt Nam mắc lao, kết quả tần

số 6 alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 lần lượt là 6%, 32%, 12%, 49%, 6% và 7%.

Kết hợp thêm các dữ liệu tần số alen NAT2 đã được công bố [61], tôi tiến hành so sánh

kết quả của nghiên cứu với một số vùng và lãnh thổ khác nhau. Như thể hiện trong Hình 4.1, alen NAT2*5 xuất hiện với tần số nhỏ hơn 10% ở quần thể Đông Á, tuy

nhiên ở các quần thể khác tần số của alen này khá cao từ 29% đến 45%. Alen NAT2*7

xuất hiện ở quần thể Châu Âu và Châu Phi nhỏ hơn 3%, trong khi ở quần thể Đông Á

xuất hiện với tần số cao nhất là 19%, trong nghiên cứu của chúng tôi là 12% (p =

0,256). Alen NAT2*6 chiếm tỷ lệ khá cao ở các vùng là từ 23% đến 36%. Trong khi

NAT2*11 chênh lệch nhau không nhiều giữa các vùng địa lý, thì NAT2*12 và *13 có

sự khác biệt rõ rệt, nhỏ hơn 10% ở người Việt Nam, Đông Á và trên 35% ở các vùng

khác [61]. Như vậy, tỷ lệ phân bố các alen là khác nhau giữa các vùng và dân tộc, tuy

nhiên lại có sự tương đồng của các vùng địa lý gần nhau như trong nghiên cứu, trên

nhóm dân tộc Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam và trên người Đông Á. Điều

này cho thấy có sự ảnh hưởng của gần gũi địa lý đến cấu trúc di truyền quần thể.

60

54

NAT2*5

49

47

50

45

44

NAT2*6

43

39

37

40

36

35

NAT2*7

34

32

31

30

29

28

NAT2*11

30

26

24

19

18

NAT2*12

17

20

12

11

NAT2*13

7

10

7

6

5

4

3

0 Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu Nghiên cứu Hồ Chí

Đông Á

Nam Á

Minh

Hình 4. 1. Các tần số phân bố của alen NAT2*5, *6, *7, *11, *12, *13 tại một số

vùng và khu vực trên thế giới. Các mẫu được sắp xếp theo vị trí địa lý, bao gồm:

Châu Phi (n = 661), Châu Mỹ (n = 347), Châu Âu (n = 503) , Hồ Chí Minh ( Dân tộc

Kinh ở thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam, n = 198), nghiên cứu (nhóm người Việt

Nam mắcl lao, n = 100), Đông Á (n = 504), Nam Á (n = 489) [61]

Song song với các nghiên cứu về tần số các alen gây ra kiểu hình acetyl hóa

chậm, các nghiên cứu về tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm, nồng độ INH sau khi uống

của mỗi kiểu hình và liều điều trị thích hợp cho mỗi cá thể cũng đã và đang được thực hiện tại nhiều nước trên thế giới. Geetha Ramachandran và S. Swaminathan năm 2012

đã kết luận tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm là 10% ở người Mông Cổ như Eskimos,

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Nhật Bản và Trung Quốc, 90% ở Trung Đông, 60% ở Negroid, da trắng và Nam Ấn

Độ và 72% ở Mỹ [49]. Kiểu hình acetyl hóa chậm trong nghiên cứu của chúng tôi là

37%, thấp hơn so với Ấn Độ, Mỹ và Negroid; cao hơn ở người Mông Cổ, Nhật bản và

Trung Quốc. Trong một nghiên cứu lớn hơn trên 99 quần thể khác nhau trên thế giới

của Audrey Sabbagh và cộng sự năm 2011 đã cho thấy một cái nhìn toàn thể hơn về sự phân bố khác nhau của kiểu hình acetyl hóa chậm (Hình 4.2). Nghiên cứu chỉ ra

rằng sự phân bố này liên quan đến nghề nghiệp chủ yếu ở mỗi quốc gia hoặc vùng

lãnh thổ khác nhau. Điều này có thể do sự thích ứng với điều kiện môi trường đã ảnh

hưởng lên bộ gen của con người, gây ra sự thay đổi về tần số alen để đáp ứng với sự

thay đổi về môi trường phù hợp [29].

Hình 4. 2. Sự phân bố kiểu hình acetyl hóa chậm trên 99 quần thể trên thế giới

Mỗi biểu đồ hình tròn báo cáo tỷ lệ phần trăm, màu cam thể hiện tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa chậm, màu vàng thể hiện tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa nhanh và trung bình [13]. Nghiên cứu của Toure A. và cộng sự trên 96 người bệnh mắc lao dựa trên 2

phương pháp chính là đo nồng độ INH trong huyết tương sau khi uống INH 3 giờ và 6

giờ để xác định chỉ số acetyl hóa và kiểu hình acetyl hóa là nhanh hay chậm và xác

định kiểu gen NAT2 thông qua phương pháp PCR - RFLP hoặc giải trình tự [7]. Việc

đo nồng độ INH vào thời điểm 3 giờ sau khi uống để xác định nồng độ đỉnh của INH

trong huyết thanh và chất chuyển hóa của INH là acetylisoniazid, đo vào thời điểm 6

giờ để xác định tình trạng hấp thu của mỗi cá nhân. Kết quả nghiên cứu cho thấy các alen NAT2*4, *5A, *6A, *13A là quan trọng nhất và kết quả kiểu hình acetyl hóa

tương đồng giữa hai phương pháp trên. Đồng thời nghiên cứu cũng chứng minh sự gia

tăng nồng độ INH huyết tương sau 3 giờ và 6 giờ của acetyl chậm cao hơn acetyl

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

nhanh [7].

Donald và cộng sự đã nghiên cứu tác động của liều isoniazid và kiểu gen

NAT2 trên cơ sở dược động học và dược lực học của INH ở người bệnh là người lớn

mắc lao phổi. Nghiên cứu cho thấy rằng sự acetyl hóa nhanh của INH nhận liều hàng

ngày là 6 mg/kg có tác dụng tương tự như liều 3 mg/kg/ngày của kiểu hình acetyl hóa chậm. Nhóm nghiên cứu cho rằng việc giảm liều INH dưới 6 mg/kg sẽ là bất lợi đối

với người có kiểu hình acetyl hóa nhanh, nhưng liều 3 mg/kg là đủ cho người có kiểu

hình acetyl hóa chậm để đạt được nồng độ INH điều trị hiệu quả [45]. Nghiên cứu trên

326 người bệnh ở Ấn Độ cho thấy tỷ lệ acetyl hóa chậm, trung bình, nhanh lần lượt là

58%, 35%, 7%. Nồng độ INH trong máu sau 2 giờ sử dụng INH đơn độc (6 mg/kg)

của kiểu hình acetyl hóa chậm, trung bình, nhanh là 10,2 µg/mL; 8,1 µg/mL; 4,1

µg/mL (Hình 4.3). Như vậy, người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm có nồng độ

INH trong máu cao hơn 2 kiểu hình còn lại, điều này dẫn đến sự tăng tạo thành các

chất trung gian gây độc cho cơ thể [26]. Một nghiên cứu khác trên 201 người bệnh tại

Ấn Độ về tần số các đa hình NAT2 và mối liên quan giữa kiểu hình acetyl hóa và nồng

độ INH sử dụng phương pháp PCR-RFLP và HPLC cho kết quả tần số tương đương với các nghiên cứu trước đó ở Ấn Độ là 55%, 32%, 13%; tuy nhiên nồng độ INH

trong huyết tương của kiểu hình acetyl hóa chậm cao hơn các nghiên cứu khác [39].

Hình 4. 3. Nồng độ INH sau 2 giờ của mỗi kiểu hình acetyl hóa[26]

Hầu hết các nghiên cứu về mối tương quan giữa hiệu quả của liều INH và kiểu hình acetyl hóa đều chỉ ra rằng các người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm nên sử

dụng liều thấp hơn liều được khuyến cáo. Nghiên cứu đối chứng ngẫu nhiên trên 172

người bệnh của Nhật Bản năm 2013 đã chứng minh điều trị liều INH theo kiểu gen

NAT2 giúp cải thiện khả năng dung nạp thuốc và tăng hiệu quả của phác đồ 6 tháng

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

đối với người bệnh lao phổi mới. Mục tiêu của nghiên cứu là xác định tỷ lệ tổn thương 36

gan do INH (INH-DILI) trong 8 tuần điều trị và tỷ lệ thất bại điều trị sớm ở tuần thứ 8.

Kiểm tra kết quả điều trị thông qua kết quả dương tính với vi khuẩn lao ở tuần thứ 8

hoặc hình ảnh X- Quang phổi không cải thiện (với người bệnh cấy đờm âm tính ban

đầu). Nghiên cứu sử dụng liều điều trị theo kiểu gen hay còn gọi là dược di truyền học (Pharmacogenetic/-nomics - PGx) và theo liều chuẩn (Standard treatment dose -STD)

theo các mức cân nặng trong 6 tháng với cả 3 kiểu hình. Trong phác đồ PGx liều sử

dụng cho kiểu hình acetyl hóa chậm sẽ giảm 0,5 lần STD, kiểu hình acetyl hóa trung

bình dùng bằng STD và kiểu hình acetyl hóa nhanh tăng 1,5 lần STD. Như vậy, liều

dùng tương ứng lần lượt là 7,5 mg/kg với kiểu hình nhanh; 5 mg/kg với kiểu hình

trung bình, và 2,5 mg/kg với kiểu hình chậm. Với liều STD và PGx, kết quả thu được

sau 8 tuần thể hiện ở Hình 4.4 cho thấy tỷ lệ tổn thương gan tăng theo thời gian và

tăng mức độ nhanh ở với những người bệnh kiểu hình acetyl hóa chậm sử dụng STD.

Hình 4. 4. Tỷ lệ tổn thường gan do INH gây ra (INH-DILI) theo thời gian trong

số 172 người bệnh. Kiểu gen RA type: acetyl hóa nhanh; IA type: acetyl hóa trung

bình, RA type: acetyl hóa chậm; PGx điều trị theo kiểu gen; STD điều trị theo liều

chuẩn thông thường [23]

Tuy nhiên, tỷ lệ này gần như bằng không khi điều trị theo PGx [23]. Kết quả tỷ

lệ kiểu hình acetyl hóa chậm và nhanh ở người Nhật Bản lần lượt là 9,3% và 53,3%. Trong các người bệnh điều trị theo phác đồ chuẩn, 78% kiểu hình acetyl hóa chậm gặp

INH – DILI trong khi điều trị liều INH theo kiểu gen NAT2 ghi nhận không có người

bệnh nào gặp INH –DILI hoặc thất bại điều trị sớm ở tuần thứ 8. Với kiểu hình acetyl

hóa nhanh, thất bại điều trị sớm của phác đồ chuẩn so với điều trị theo kiểu gen là

15% so với 38%. Do đó, nghiên cứu đưa ra kết luận phác đồ điều trị theo kiểu gen

cho tỷ lệ các tác dụng không mong muốn, INH – DILI, thất bại điều trị sớm thấp hơn

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

so với phác đồ chuẩn thông thường [23].

Các phân tích tổng hợp dựa trên nhiều nghiên cứu đã được một số tác giả thống

kê và đưa ra kết luận về tính đa hình của NAT2 cũng như ảnh hưởng của nó với đáp

ứng điều trị và các tác dụng không mong muốn. Cụ thể, năm 2015, Shi J và cộng sự

tiến hành phân tích tổng hợp 27 nghiên cứu khác trên 1289 trường hợp với 5462 nhóm chứng. Kết quả cho thấy nguy cơ tổn thương gan do INH sẽ tăng lên ở các cá thể có

kiểu hình acetyl hóa chậm khi dùng liều INH chuẩn [25]. Phân tích của Khan S và

cộng sự năm 2019 dựa trên 12 nghiên cứu với 3613 nhóm chứng, 933 trong số đó có

tổn thương gan với các biểu hiện trên lâm sàng do thuốc kháng lao. Kết quả phân tích

cho thấy các biến thể di truyền gen NAT2 có vai trò quan trọng trong nhiễm độc gan

do sử dụng INH, xác định kiểu gen NAT2 sẽ giúp dự đoán sớm đáp ứng với INH để

điều chỉnh liều cho phù hợp [50]. Hầu hết các phân tích tổng hợp đều cho kết luận

kiểu hình acetyl hóa chậm làm tăng khả năng gây độc cho gan ở những người sử dụng

INH, với biểu hiện chủ yếu là tăng tần số và mức độ các tác dụng không mong muốn

do INH gây ra. Như vậy, nhiều nhóm nhà nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của

điều trị INH theo kiểu gen, vì vậy nhiều nước trên thế giới, đặc biệt tại các nơi có tỷ lệ bệnh lao cao đã tiến hành ứng dụng điều trị PGx vào thực tiễn nhằm nâng cao tỷ lệ

đáp ứng điều trị cũng như giảm hiệu quả không mong muốn.

Theo kết quả tổng hợp của các nghiên cứu trên thế giới, hiện nay có tất cả 108

halotype NAT2, trong đó có 28 halotype gây ra kiểu hình acetyl hóa chậm và 7

halotype gây ra kiểu hình acetyl hóa nhanh (Phụ lục 1). Trong mỗi nghiên cứu chỉ xác

định một số lượng halotype tùy thuộc vào cỡ mẫu và số SNP nghiên cứu Các halotype

khác nhau sẽ gây ảnh hưởng khác nhau đến enzym NAT2, do đó ảnh hưởng đến DILI

sẽ khác nhau. Một nghiên cứu phân tích tổng hợp trên 37 nghiên cứu với 1527 trường

hợp và 7184 nhóm chứng cho kết luận halotype NAT2*6/*7 có liên quan đến INH-

DILI hơn hẳn so với các kiểu hình acetyl hóa chậm khác [60]. Như vậy, việc xác định

mỗi liên quan giữa halotype và mức độ nặng của tác dụng phụ có thể giúp đánh giá chính xác hơn trong điều trị theo kiểu gen để đạt được hiệu quả mong muốn.

Trong nghiên cứu này của mới chỉ dừng lại ở việc xây dựng quy trình phân tích

gen, bước đầu đánh giá tỷ lệ tần số alen, tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa của người Việt

Nam. Nhưng kết quả nghiên cứu sẽ giúp định hướng cho các nghiên cứu trong tương

lai về mối tương quan giữa kiểu gen NAT2 và nồng độ INH, tác dụng phụ cũng như

hiệu quả điều trị của INH với bệnh lao. Từ đó đưa ra các phác đồ điều trị với từng cá

thể để giảm thấp nhất các hiệu quả không mong muốn. Để đánh giá rõ hơn vai trò của

kiểu hình acetyl hóa chậm, chúng tôi khuyến nghị mở rộng thực hiện các nghiên cứu tiếp theo đánh giá nồng độ INH trên các người bệnh đã phân tích kiểu gen NAT2. Từ

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

đó đánh giá mối liên quan giữa các đa hình di truyền NAT2 với các đáp ứng điều trị,

xác định mối tương quan giữa các tác dụng không mong muốn và kiểu hình acetyl

hóa, tiến tới cá thể hóa liều điều trị INH để đạt hiệu quả tốt nhất trên từng người bệnh.

4.2.2. Về mối liên quan giữa NAT2 và một số bệnh khác

NAT2 chuyển hóa các hợp chất amin thơm, dị vòng và các hợp chất gây ung

thứ, vì vậy với các cá thể có phơi nhiễm với yếu tố ung thư như khói thuốc lá, benzen

thì NAT2 đóng một vai trò quan trọng hơn cả. Các nghiên cứu lớn trên thế giới chỉ ra

tầm quan trọng của NAT2 nguy cơ ung thư, đặc biệt là ung thư bàng quang, ung thư tiền liệt tuyến [35], ung thư vú, ung thư đại tràng [10]. Về mối tương quan giữa kiểu

hình acetyl hóa chậm và ung thư bàng quang, Marcus PM và cộng sự đã tiến hành một

phân tích tổng hợp 22 nghiên cứu (2496 ca lâm sàng, 3340 nhóm chứng) trước đó. Kết

quả chỉ ra rằng tình trạng acetyl hóa chậm có liên quan đến sự gia tăng nguy cơ ung

thư bàng quang ở những người bệnh có phơi nhiễm với các hóa chất dễ gây ung thư

bàng quang [44]. Cụ thể, ở nước Anh một nghiên cứu trên 95 người bệnh ung thư

bàng quang do làm việc trong môi trường tiếp xúc thường xuyên với benzen có 57%

là kiểu hình acetyl hóa chậm; ở Leverkusen, Đức có 82% trong số 92 người bệnh bị

ung thư bàng quang do tiếp xúc thường xuyên với benzen có kiểu hình acetyl hóa

chậm. Điều này chỉ ra tính nhạy cảm với ung thư bàng quang ở những người tiếp xúc

với amin thơm tăng đáng kể ở kiểu hình acetyl hóa chậm [44].

Như đã biết, NAT2 chuyển hóa cả các hợp chất hydralazin, đây là một trong

các loại thuốc điều trị tăng huyết áp thông qua cơ chế giãn trực tiếp tiểu động mạch.

Thuốc có tác dụng tốt trong các trường hợp tăng huyết áp ở phụ nữ mang thai và tăng

huyết áp kháng trị với các thuốc khác. Trong một nghiên cứu trên các tình nguyện

viên khỏe mạnh với cùng liều hydralazin là 182 mg, kết quả cho thấy nồng độ

hydralazin trong huyết tương sau khi uống ở người có kiểu hình acetyl hóa chậm cao

gấp 2,2 lần so với kiểu hình acetyl hóa nhanh [9]. Trong một vài nghiên cứu khác, sử

dụng hydralazin liều 83 mg ở kiểu hình acetyl hóa chậm và 182 mg ở kiểu hình acetyl

hóa nhanh. Kết quả cho thấy, tác dụng hạ huyết áp tương đương nhau và có sự giảm

tác dụng phụ so với liều 182 mg ở kiểu hình acetyl hóa chậm trước đó. Trong nghiên

cứu năm 2014 trên 169 người bệnh điều trị với hydralazin do tăng huyết áp kháng trị, nhóm nghiên cứu kết luận các người bệnh có kiểu hình acetyl hóa chậm giảm huyết áp

nhanh và mạnh hơn, song lại có nhiều tác dụng phụ hơn [32]. Như vậy, hiệu quả và độ

an toàn của các người bệnh sử dụng hydralazin có thể được cải thiện khi điều trị theo

kiểu gen NAT2 [9]. NAT2 đã chứng minh được vai trò của nó trong chuyển hóa các

loại thuốc kể trên, từ đó ứng dụng vào thực tế lâm sàng để đạt hiệu quả tốt hơn trong

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

điều trị lao nói riêng và các thuốc chuyển hóa bởi NAT2 nói chung.

KẾT LUẬN

Từ nghiên cứu được thực hiện trên 100 người bệnh mắc lao đến từ 3 bệnh viện

khu vực phía Bắc (gồm Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện 74 Trung ương và Bệnh viện Phổi Hà nội) trong thời gian từ tháng 6/2017 đến tháng 9/2018, tôi rút ra

một số kết luận chính sau:

1. Về tối ưu quy trình phân tích đa hình gen NAT2

Đề tài đã tối ưu và xây dựng được quy trình phân tích các đa hình gen NAT2 từ

DNA phân lập từ mẫu máu của người bệnh lao đang điều trị isoniazid bằng 2 phương

pháp PCR – RFLP.

2. Về tần suất phân bố các đa hình di truyền trong quần thể nghiên cứu.

Tần suất phân bố các alen đột biến là khác nhau, trong đó alen NAT2*13 chiếm

tỷ lệ cao nhất là 49%, tiếp theo là NAT2*6 với tỷ lệ 32%. Các vị trí còn lại chiếm tỷ lệ

khá thấp với NAT2*7, NAT2*12, NAT2*11, NAT2*5 lần lượt là 12%, 7%, 6% và 6%.

Các tần số kiểu gen và alen phù hợp theo luật phân bố di truyền quần thể Hardy- Weinberg chỉ ra cấu trúc di truyền này có thể đại diện cho quần thể ổn định nhất định

ở Việt Nam.

Tỷ lệ kiểu hình acetyl hóa thu được trên 100 người bệnh: tương ứng với 3

nhóm (acetyl hóa nhanh, trung bình và chậm) lần lượt là 25%, 38% và 37%. Phân hóa

các nhóm kiểu hình với tỉ lệ như vậy cho thấy xu hướng đáp ứng thuốc chuyển hóa

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

bởi NAT2 như isoniazid khác nhau đáng kể ở người bệnh lao Việt Nam.

KIẾN NGHỊ

Từ kết quả ban đầu thu được về tần số alen và kiểu hình acetyl hóa thu được

trong nghiên cứu tôi xin đưa ra kiến nghị sau:

Thực hiện thêm các nghiên cứu đánh giá nồng độ INH sau khi dùng thuốc, tác

động gây độc của gan ở các người bệnh đã phân tích kiểu gen NAT2. Từ đó đánh giá

mối tương quan giữa đa hình di truyền NAT2 với các đáp ứng điều trị thuốc, các tác

dụng không mong muốn, xây dựng mối tương quan giữa kiểu gen và liều dùng INH. Xây dựng thuật toán tính liều INH cho người bệnh mắc lao ở Việt Nam, từ đó tiến tới

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

cá thể hóa liều điều trị INH để đạt hiệu quả tốt nhất trên từng người bệnh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT 1. Bộ Y tế (2017), Chương trình chống lao Quốc gia Việt Nam, Hướng dẫn chẩn

đoán, điều trị và dự phòng bệnh lao, NXB Y học, Hà Nội.

2. Ngô Quý Châu (2012), Bệnh Hô Hấp, NXB Bộ Y Tế, Hà Nội, 105.

3. Nguyễn Việt Cồ (2012), Bệnh học lao, NXB Bộ Y Tế, Hà Nội, 208-209.

4. PGS TS Nguyễn Nghiêm Luật (2014), Những ứng dụng của kỹ thuật giải trình tự

DNA thế hệ mới trên máy PyroMark Q24 trong Y học Lâm sàng.

5. Đỗ Lê Thăng và Đinh Đoàn Long (2013), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào,

Phân tích gen và sản phẩm của gen, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội,338-

340.

6. Tạ Thành Văn (2010), PCR và một số kỹ thuật y sinh học phân tử, Các phương

pháp phân tích bộ gen, NXB Y học, Hà Nội.

TIẾNG ANH

7. Toure A, Cabral M, Niang A, et al (2016), "Prevention of isoniazid toxicity by

NAT2 genotyping in Senegalese tuberculosis patients", Toxicol Rep, 3,826–831.

8. Fretland M. A., Leff M. A., Doll, et al (2001), "Functional characterization of

human N-acetyltransferase 2 (NAT2) single nucleotide polymorphisms",

Pharmacogenetics, 11,207-215.

9. Cecily E. Allen và Mark A. Doll (2017), "N-Acetyltransferase 2 Genotype-

Dependent N-Acetylation of Hydralazine in Human Hepatocytes", Drug

Metabolism and Disposition, 45(12),1276-1281.

10. Lilla C, Verla-Tebit E, Risch A, et al (2006), "Effect of NAT1 and NAT2 genetic

polymorphisms on colorectal cancer risk associated with exposure to tobacco

smoke and meat consumption", Cancer Epidemiol Biomark Prev, 15,99–107. the human acetylator polymorphism 11. Evans DA (1984 ), "Survey of in

spontaneous disorders ", J Med Genet, 21,243–253.

12. Evans DA, Manley KA, và Mc KV (1960), "Genetic control of isoniazid

metabolism in man", Br Med J, 2,485–491.

13. Pierre Darlu, Brigitte Crouau-Roy, Audrey Sabbagh, et al (2011), "Arylamine N-

Acetyltransferase 2 (NAT2) Genetic Diversity and Traditional Subsistence: A

Worldwide Population Survey", John Relethford, 6(4),18507.

14. Sim E, Abuhammad A, và Ryan A (2014), "Arylamine N-acetyltransferases: froM

drug metabolism and pharmacogenetics to drug discovery", British Journal of

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Pharmacology, 171,2705–2725.

15. Sim E và Stanley LA (2008), "Update on the pharmacogenetics of NATs:

structural considerations", Pharmacogenomics, 9(11),1673–1693.

16. Sim E, Payton M, Noble M, et al (2000), "An update on genetic, structural and

functional studies of arylamine N-acetyltransferases in eucaryotes and

procaryotes", Hu‐man Molecular Genetics, 9,2435-41.

17. David A. Flockhart và Zeruesenay Desta (2009), "Pharmacogenerics of Drug

metabolism ", Clinical and Translational Science.

18. Lu-Jun He, Yue-Ming Yu, Fang Qiao, et al (2005), "Genetic polymorphisms of

N-acetyltransferase 2 and colorectal cancer risk", World J Gastroenterol, 11(27),4268-4271.

19. David W Hein và Mark Antony Doll (2012), "Accuracy of various human NAT2

SNP genotyping panels to infer rapid, intermediate and slow acetylator

phenotypes", Pharmacogenomics, 13(1),31–41.

20. Cho HJ, Koh WJ, Ryu YJ, et al (2007), "Genetic polymorphisms of NAT2 and

CYP2E1 associated with anti tuberculosis drug-induced hepatotoxicity in Korean

patients with pulmonary tuberculosis", Tuberculosis (Edinb), 87(6),551–556.

21. Sandoz Inc (2016), FDA label Isoniazid, U.S. Department of Health and Human

Services.

22. Mem. Inst và Oswaldo Cruz (2011), "Genetic polymorphisms of NAT2, CYP2E1

and GST enzymes and the occurrence of antituberculosis drug-induced hepatitis in Brazilian TB patients", Rio de Janeiro, 106(6).

23. Azuma J, Ohno M, Kubota R, et al (2013), "NAT2 genotype guided regimen

reduces isoniazid-induced liver injury and early treatment failure in the 6-month

four-drug standard treatment of tuberculosis: A randomized controlled trial for

pharmacogenetics-based therapy", Eur J Clin Pharmacol.

24. Butcher N J, Boukouvala S, Sim E, et al (2002), "Pharmacogenetics of the

arylamine N-acetyltransferases", The Pharmacogenomics Journal, 2,30–42

25. Shi J, Xie M, Wang J, et al (2015), "Susceptibility of N-acetyltransferase 2 slow

acetylators to antituberculosis drug-induced liver injury: a meta-analysis.",

Pharmacogenomics. , 16(8),2083-2097.

26. Hemanth Kumar A. K., Ramesh K., Kannan T., et al (2017), "N-acetyltransferase

isoniazid concentrations in patients with

gene polymorphisms & plasma tuberculosis", Indian J Med Res, 145(1),118–123.

27. Suzanne Kennedy (2010), "how DNA extration kits work in the lab", biteSizeBio.

28. Daniel J. Klein, Sotiria Boukouvala, Ellen M. McDonagh, et al (2016),

"PharmGKB summary: Isoniazid Pathway, Pharmacokinetics", Pharmacogenet

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Genomics KB, 26(9),436-44.

29. Laland KN, Odling-Smee J, và Myles S (2010), "How culture shaped the human

genome: bringing genetics and the human sciences together", Nat Rev Genet,

11,137-148.

30. Vatsis KP, Weber WW, Bell DA, et al (1995), "Nomenclature for N-

acetyltransferases", Pharmacogenetics, 5(1),1-17.

31. Igor B. Kuznetsov, Michael McDuffie, và Roxana Moslehi (2009), "A web server

for inferring the human N-acetyltransferase-2 (NAT2) enzymatic phenotype from

NAT2 genotype", BIOINFORMATICS, 25(9),1185–1186.

32. Spinasse LB, Santos AR, Suffys PN, et al (2014), "Different phenotypes of the

NAT2 gene influences hydralazine antihypertensive response in patients with

resistant hypertension", Pharmacogenomics, 15,169-178.

33. Dinh Doan Long, Pham Thi Hong Nhung, Tran Thi Thuy Anh, et al (2011),

"Multiple mutations of N-acetyltransferase 2 gene in Vietnamese idetified by Tm

monitoring of fluorogenic hybridization probes", VNU Journal of Science,

27(2S),211-217.

34. Dinh Doan Long, Pham Thi Hong Nhung, Tran Thi Thuy Anh, et al (2011),

"Variability in the frequency of Single nucleotide polymorphisms of N-acetyl

transferase (NAT2) gene in Vietnamese", VNU Journal of Science, 27(4).

35. Garcia-Closas M, Malats N, Silverman D, et al (2005), "NAT2 slow acetylation,

GSTM1 null genotype, and risk of bladder cancer: results from the Spanish

Bladder Cancer Study and meta-analyses", Lancet, 366,649–659.

36. Kinzig-Schippers M, Tomalik-Scharte D, Jetter A, et al (2005), "Should We Use

N-Acetyltransferase Type 2 Genotyping To Personalize Isoniazid Doses?",

Antimicrob Agents Chemother, 49(5),1733-8.

37. Ohno M, Yamaguchi I, Yamamoto I, et al (2000), "Slow N-acetyltransferase 2

incidence of affects the isoniazid and rifampicin induced

genotype hepatotoxicity", Int J Tuberc Lung Dis, 4(3),256-261.

38. Ma MK, Woo MH, và Mcleod HL (2002), "Genetic basis of drug metabolism.",

Am J Health Syst Pharm, 59,2061–2069.

39. Singh N, Dubey S, Chinnaraj S, et al (2009), "Study of NAT2 gene

polymorphisms in an Indian population: Association with plasma isoniazid

concentration in a cohort of tuberculosis patients", Mol Diagn Ther, 13,49–58.

40. World health organization (2018), Global tuberculosis report 2018.

41. Sandosh Padmanabhan (2014), Handbook of Pharmacogenomics and Stratified

Medicine, Pharmacogenomics in India, 46, 1037-1059.

42. Bhushan Patwardhan và Rathnam Chaguturu (2017), Innovative Approaches in

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Drug Dícovery, Pharmacogenomics, 7, 195-234.

43. Bose PD, Sarma MP, Medhi S, et al (2011), "Role of polymorphic N-acetyl

transferase2 and cytochrome P4502E1 gene in antituberculosis treatment-induced

hepatitis", J Gastroenterol Hepatol, 26,312–318.

44. Marcus PM1, Vineis P, và Rothman N (2000), "NAT2 slow acetylation and bladder cancer risk: a meta-analysis of 22 case-control studies conducted in the

general population.", Pharmacogenomics, 10(2),115-22.

45. Donald PR, Parkin DP, Seifart HI, et al (2007), "The influence of dose and N-

acetyl transferase-2 (NAT2) genotype and phenotype on the pharmacokinetics and

pharmacodynamics of isoniazid", Pharmacokinet Dispos, 63(7),633–639.

46. Wang PY, Xie SY, Hao Q, et al (2012), "NAT2 polymorphisms and susceptibility

to anti-tuberculosis drug-induced liver injury: meta-analysis", Int J Tuberc Lung

Dis, 16(5),589–595.

47. Bonicke R và Reif W (1953), "Enzymatische inak activierung von

isonicotinsaurehydrazid im menschlichen und tierischen organismus ", Arch Exp

Pathol Pharmacol, 220 - 321.

48. H. Smeets R.J.E. Jongbloed, P.A. Doevendans, et al (2005), "Methods in

molecular cardiology: DHPLC mutation detection analysis", Neth Heart J.,

13(1),11-17.

49. Geetha Ramachandran và Soumya Swaminathan (2012), "Role of

pharmacogenomics in the treatment of tuberculosis: a review",

Pharmacogenomics Pers Med, 5, 89–98.

50. Khan S, Mandal RK, Elasbali AM, et al (2019), "Pharmacogenetic association

between NAT2 gene polymorphisms and isoniazid induced hepatotoxicity: trial

sequence meta-analysis as evidence", Biosci Rep, 39(1).

51. Parkin D. P S., Vandenplas F. J., Botha, et al (1997), "Trimodality of isoniazid

elimination: phenotype and genotype in patients with tuberculosis.", Am. J Respir Crit Care Med, 155,1717-1722.

52. Sharma SK, Balamurugan A, Saha PK, et al (2002), "Evaluation of clinical and

immunogenetic risk factors for the development of hepatotoxicity during

antituberculosis treatment", Am J Respir Crit Care Med, 166,916-919.

53. Takayo Sotsuka, Yuka Sasaki, Shigekazu Hirai, et al (2011 ), "Association of

Isoniazid-metabolizing Enzyme Genotypes and Isoniazid -induced Hepatotoxicity

in Tuberculosis Patients", In Vivo, 25(5),803-812.

54. Ebisawa T và Deguchi T (1991), "Structure and restriction fragment length

polymorphism of genes for human liver arylamine N-acetyltransferases ",

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Biochem Biophys Res Commun, 177,1252–1257.

55. Weber W W và Hein

D W (1985), "N-acetylation pharmacogenetics",

Pharmacological Reviews, 37(1),25-79.

56. Jason M. Walraven, Yu Zang, và John O. Trent (2008), "Structure/Function

Evaluations of Single Nucleotide Polymorphisms in Human N-Acetyltransferase 2", Curr Drug Metab, 9(6),471-486.

57. WHO (2003), Global tuberculosis control-surveillance, planning, financing-

Global Tuberculosis Control

58. Jarrar Y, Ismail S, và Irshaid Y (2010), "N-acetyltransferase-2 (NAT2) genotype

frequency among Jordanian volunteers", Int J Clin Pharmacol Ther, 48,688–694.

59. Huang YS, Chern HD, Su WJ, et al (2003), "Cytochrome P450 2E1 genotype and

the susceptibility to antituberculosis drug-induced hepatitis", Hepatology,

37(4),924–930.

60. Min Zhang, Shuqiang Wang, Bob Wilffert, et al (2018), "The association between

the NAT2 genetic polymorphisms and risk of DILI during anti-TB treatment: a

systematic review and meta-analysis: Slow NAT2 genotype is a risk factor for AT-DILI", British Journal of Clinical Pharmacology, 84(12),2747–2760.

WEB

61. 1000 Genomes Project Phase 3 allele frequencies (2018), truy cập ngày 2/4/2019,

http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Population?db=core;r=8:183998

44-18400844;v=rs1801280;vdb=variation;vf=1243314.

62. Human gene for arylamine N-acetyltransferase (EC 2.3.1.5) (2019), Genbank

asession Number, truy cập ngày 4/4/2019, tại trang web https://

www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide?cmd=Retrieve&dopt=GenBank&list_uids=282

27.

63. KAPABIOSYSTEMS (2017), KAPA2G™ Robust HotStart Ready Mix (2X), truy

cập ngày 7/7/2017, tại trang web www.kapabiosystems.com.

64. Gaurab Karki (2017), Restriction fragment length polymorphism (RFLP):

principle, procedure and application, truy cập ngày 30/9/2018, tại trang web

https://www.onlinebiologynotes.com/restriction-fragment-length-polymorphism-

rflp-principle-procedure-application/.

65. Igor B. Kuznetsov (2009), NAT2PRED: a web-server for inferring the acetylator

phenotype of the human N-acetyltransferase-2 (NAT2) from NAT2 genotype, truy

cập ngày 4/4/2019, tại trang web http://nat2pred.rit.albany.edu./.

66. QIAGEN (2010), HotStarTaq® PCR Handbook, QIAGEN, truy cập ngày

7/7/2017, tại trang web www.qiagen.com.

67. Isoniazid side effects - from FDA reports (2018), Isoniazid: 11,053 reports, truy

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

cập ngày 4/4/2019, tại trang web https://www.ehealthme.com/drug/isoniazid/. 46

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Các dạng alen NAT2 [5]

Haplotype Nucleotid thay đổi Axit amin thay thế Kiều hình acetyl

NAT2*4 Kiểu dại Kiểu dại Nhanh

NAT2*5A Chậm

NAT2*5B Chậm

NAT2*5C Chậm I114T L161L I114T L161L K268R I114T K268R 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 341T>C (rs1801280) 803A>G (rs1208)

NAT2*5D 341T>C (rs1801280) I114T Chậm

NAT2*5E Chậm

NAT2*5F Chậm

NAT2*5G Chậm

I114T R197Q I114T L161L V253V K268R Y94Y I114T L161L K268R 341T>C (rs1801280) 590G>A (rs1799930) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 759C>T (rs56011192) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

NAT2*5H Chậm

I114T L161L K268R 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

NAT2*5I Chậm

Chậm

NAT2*5Je

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

NAT2*5K I114T L137F L161L K268R Y94Y I114T R197Q Y94Y I114T 341T>C (rs1801280) 411A>T (rs4986997) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 590G>A (rs1799930) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280)

NAT2*5KAf

NAT2*5L

NAT2*5M

NAT2*5N

NAT2*5O

NAT2*5P

NAT2*5Qf

NAT2*5Rf

NAT2*5Sf

NAT2*5Tf

NAT2*5TAf

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Y94Y I114T G286E L24I I114T L161L K268R I114T L161L K268R V280M I114T I158L L161L K268R C68Y I114T L161L K268R Y94Y I114T L161L T193M R197Q K268R I114T R197Q K268R Y94Y I114T R197Q K268R I114T G286E Y94Y I114T K268R Y94Y I114T K268R G286E 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 857G>A (rs1799931) 70T>A (rs45477599) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 838G>A (rs56393504) 341T>C (rs1801280) 472A>C (rs139351995) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 203G>A (rs72466458) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 578C>T (rs79050330) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208) 341T>C (rs1801280) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208) 341T>C (rs1801280) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 803A>G (rs1208) 857G>A (rs1799931)

NAT2*5Uf

NAT2*5Vf

Y94Y I114T L161L R197Q K268R Y94Y I114T L161L

NAT2*5VAf

Y94Y I114T L161L G286E

NAT2*5Wf

NAT2*5Xf

NAT2*5Yf

NAT2*5Zf

NAT2*6A Chậm

NAT2*6B Chậm

NAT2*6C Chậm

NAT2*6D Chậm

NAT2*6E Chậm

NAT2*6F

NAT2*6G

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 282C>T (rs1041983) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 857G>A (rs1799931) 341T>C (rs1801280) 354T>C (rs146405047) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 341T>C (rs1801280) 403C>G (rs12720065) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 622T>C (rs56387565) 803A>G (rs1208) 191G>A (rs1801279) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 590G>A (rs1799930) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208) 111T>C (rs72554615) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 481C>T (rs1799929) 590G>A (rs1799930) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 518A>G 590G>A (rs1799930) I114T N118N L161L K268R I114T L135V L161L K268R I114T L161L Y208H K268R R64Q I114T L161L Y94Y R197Q R197Q Y94Y R197Q K268R F37F Y94Y R197Q L161L R197Q R197Q K268R Y94Y K173R R197Q

NAT2*6H

282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 766A>G (rs55700793) Y94Y R197Q K256E

NAT2*6I

NAT2*6J

NAT2*6K

NAT2*6L

NAT2*6M

NAT2*6N

NAT2*6Of

NAT2*6Pf

NAT2*6Qf

NAT2*6Rf

NAT2*6Sf

NAT2*6Tf

NAT2*6Uf

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 838G>A (rs56393504) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 638C>T (rs138707146) 282C>T (rs1041983) 345C>T (rs45532639) 590G>A (rs1799930) 152G>T (rs72466457) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 590G>A (rs1799930) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 838G>A (rs56393504) 403C>G (rs12720065) 590G>A (rs1799930) 282C>T (rs1041983) 308C>T 590G>A (rs1799930) 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 590G>A (rs1799930) 803A>G (rs1208) 590G>A (rs1799930) 857G>A (rs1799931) 481C>T (rs1799929) 590G>A (rs1799930) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 579G>T (rs144176822) Y94Y R197Q V280M G286E Y94Y R197Q G286E Y94Y R197Q P213L Y94Y D115D R197Q G51V Y94Y R197Q Y94Y L161L R197Q Y94Y R197Q V280M L135V R197Q Y94Y T103I R197Q Y94Y L161L R197Q K268R R197Q G286E L161L R197Q G286E Y94Y R197Q T19T

NAT2*6Vf

NAT2*7A Chậm

NAT2*7B Chậm

NAT2*7C

NAT2*7D

NAT2*7Ef

NAT2*7Ff

NAT2*7Gf

NAT2*10 NAT2*11A Chậm Nhanh

NAT2*11B

NAT2*12A Nhanh

NAT2*12B Nhanh

NAT2*12C Nhanh

NAT2*12D Chậm

NAT2*12E

NAT2*12F

NAT2*12G

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

NAT2*12H 403C>G (rs12720065) 590G>A (rs1799930) 838G>A (rs56393504) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 803A>G (rs1208) 857G>A (rs1799931) 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 857G>A (rs1799931) 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 857G>A (rs1799931) 226T>G 282C>T (rs1041983) 857G>A (rs1799931) 499G>A (rs72554617) 481C>T (rs1799929) 481C>T (rs1799929) Δ859 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 803A>G (rs1208) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 364G>A (rs4986996) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 578C>T (rs79050330) 803A>G (rs1208) 622T>C (rs56387565) 803A>G (rs1208) 609G>T (rs45618543) 803A>G (rs1208) 403C>G (rs12720065) 803A>G (rs1208) L135V R197Q V280M G286E Y94Y G286E Y94Y K268R G286E R64Q Y94Y G286E Y94Y L161L G286E Y94Y L161L K268R G286E Y76D Y94Y G286E E167K L161L L161L S287 K268R Y94Y K268R L161L K268R D122N K268R Y94Y T193M K268R Y208H K268R E203D K268R L135V K268R

NAT2*12I

NAT2*12J

NAT2*12Kf

NAT2*12Lf

NAT2*12Mf

NAT2*12Nf

NAT2*12Of

NAT2*12Pf

NAT2*13A Y76Y K268R I10T K268R I158L K268R F222C K268R Y94Y L161L K268R N41Y K268R I10T E203D K268R I158L L161L K268R Y94Y 228C>T (rs72466459) 803A>G (rs1208) 29T>C (rs72466456) 803A>G (rs1208) 472A>C (rs139351995) 803A>G (rs1208) 665T>G 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 121A>T (rs149283608) 803A>G (rs1208) 29T>C (rs72466456) 609G>T (rs45618543) 803A>G (rs1208) 472A>C (rs139351995) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 282C>T (rs1041983) Nhanh

NAT2*13B

NAT2*13Cf

NAT2*13Df

NAT2*13Ef

NAT2*13Ff

NAT2*13Gf Y94Y T193M Y94Y F222C Y94Y K256E Y94Y T214I Y94Y V280M Y94Y I158L 282C>T (rs1041983) 578C>T (rs79050330) 282C>T (rs1041983) 665T>G 282C>T (rs1041983) 766A>G (rs55700793) 282C>T (rs1041983) 641C>T 282C>T (rs1041983) 838G>A (rs56393504) 282C>T (rs1041983) 472A>C (rs139351995)

NAT2*14A 191G>A (rs1801279) R64Q Chậm

NAT2*14B Chậm R64Q Y94Y 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983)

NAT2*14C Chậm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

R64Q I114T L161L K268R 191G>A (rs1801279) 341T>C (rs1801280) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208)

NAT2*14D Chậm

NAT2*14E Chậm

NAT2*14F Chậm

NAT2*14G Chậm

NAT2*14H

NAT2*14I

NAT2*14Jf

191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 590G>A (rs1799930) 191G>A (rs1801279) 803A>G (rs1208) 191G>A (rs1801279) 341T>C (rs1801280) 803A>G (rs1208) 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 803A>G (rs1208) 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 683C>T (rs45518335) 191G>A (rs1801279) 481C>T (rs1799929) 803A>G (rs1208) 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 633G>A R64Q Y94Y R197Q R64Q K268R R64Q I114T K268R R64Q Y94Y K268R R64Q Y94Y P228L R64Q L161L K268R R64Q Y94Y T211T

NAT2*14Kf

191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) 838G>A (rs56393504) R64Q Y94Y V280M

NAT2*14Lf

7A>G (rs200893121) 191G>A (rs1801279) 282C>T (rs1041983) I3V R64Q Y94Y

NAT2*17 434A>C (rs72554616) Q145P Chậm

NAT2*18 845A>C (rs56054745) K282T Nhanh

NAT2*19 190C>T (rs1805158) R64W Chậm

NAT2*20 600A>G (rs72466461) E200E

NAT2*21 458C>T (rs72466460) T153I

NAT2*22f 609G>T (rs45618543) E203D

NAT2*23f 70T>A (rs45477599) L24I

NAT2*24f 403C>G (rs12720065) L135V

NAT2*25f 665T>G F222C

NAT2*26f 809T>C I270T

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

NAT2*27 589C>T R197

PHỤ LỤC 2. Giá trị đo hấp thụ quang của các mẫu DNA tổng số

STT STT STT OD260 /OD280 OD260 /OD280 OD260 /OD280

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Nồng độ DNA ng/µl 62,3 41,2 26,2 128,8 46,1 102,8 33,1 54,4 36,2 37,7 29,8 36,8 229,8 133,3 24,6 66,4 51,5 132,2 29,6 61,3 22,1 112,6 26,3 44,1 146,1 20,4 89,7 68,7 113,9 26,7 50,00 23,50 30,75 48,20 1,99 1,71 1,79 1,80 1,74 1,77 1,70 1,72 1,92 2,00 1,81 2,12 1,83 1,68 1,95 1,81 1,79 1,84 1,86 1,70 1,88 1,78 1,81 1,75 1,79 1,82 1,83 1,74 1,80 1,99 1,852 2,108 1,940 1,679 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 Nồng độ DNA ng/µl 24,0 22,3 24,2 31,4 25,3 42,6 24,7 23,6 31,7 27,0 54,2 26,4 36,6 23,7 31,5 27,7 26,3 29,4 29,6 23,5 23,5 22,9 20,7 20,5 21,3 26,4 23,5 23,0 32,5 23,1 20,5 31,1 32,60 27,80 Nồng độ DNA ng/µl 22,30 38,70 33,95 29,6 38,15 133,30 70,95 37,75 66,80 54,20 36,01 87,75 72,35 70,95 91,10 59,65 108,55 47,20 60,25 32,30 62,25 53,90 40,90 49,00 53,3 34,5 46,9 53,5 32,5 43,7 45,0 72,5 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 2,10 2,10 1,77 1,72 1,83 1,82 1,83 1,74 1,70 1,70 1,83 1,90 1,88 1,67 1,67 1,83 1,56 1,86 1,52 1,57 1,58 1,59 1,51 1,50 1,60 1,56 1,97 1,57 1,53 1,77 2,00 1,79 1,757 1,650 2,00 1,60 1,68 1,97 1,98 1,70 1,76 1,61 1,83 1,84 2,01 1,92 1,82 1,907 1,93 1,94 1,86 1,84 1,93 1,91 1,92 1,90 1,99 2,01 1,87 1,83 1,79 1,82 1,99 2,00 1,96 1,82