TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ CHIẾT PHÂN ĐOẠN RỄ CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) TRỒNG TẠI AN GIANG
Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS. TRẦN CÔNG LUẬN ThS. ĐỖ VĂN MÃI
Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ KIM TUYỀN MSSV: 12D720401259 LỚP: ĐH DƯỢC 7C
Cần Thơ, năm 2017
i
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu để hoàn thành khoá luận tại bộ môn dược liệu trường Đại
học Tây Đô, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè
và gia đình.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Trần Công Luận, ThS. Đỗ Văn Mãi người thầy tận tuỵ, nhiệt tình đã dìu dắt, giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô của bộ môn dược liệu trường
Đại học Tây Đô đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong toàn bộ thời gian thực hiện khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Tây Đô đã tận tình
dạy bảo em trong suốt những năm học vừa qua.
Cuối cùng, em xin tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới Cha mẹ, gia đình, bạn
bè, những người thân đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian học
tập và hoàn thành khoá luận.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2017
Sinh viên
TRẦN THỊ KIM TUYỀN
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
một công trình nào khác.
Sinh viên
TRẦN THỊ KIM TUYỀN
iii
TÓM TẮT
Khóa luận tốt nghiệp đại học - Khóa học: 2012 – 2017 Chuyên ngành Dược học - Mã số: 52720401
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn của rễ cây Đinh lăng
(Polyscias fruticosa (L.) Harms) trồng tại An Giang Sinh viên: Trần Thị Kim Tuyền
Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. Trần Công Luận
ThS. Đỗ Văn Mãi
Mở đầu Trong y học cổ truyền, cây Đinh lăng từ lâu đã được sử dụng như một vị thuốc thông
huyết mạch. Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra Đinh lăng có các tác dụng dược lý
tương tự như Nhân sâm nhưng giá thành lại rẻ hơn và dễ trồng hơn Nhân sâm nên
chúng đã đang được quan tâm nghiên cứu. Ở Việt Nam, nguồn dược liệu Đinh lăng
dồi dào, hứa hẹn là một nguồn khai thác các thành phần hóa học của chúng đầy tiềm
năng. Đề tài này hướng tới việc khảo sát các thành phần hóa học trong cây Đinh lăng
để cung cấp nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu là cây Đinh lăng, được thu hái tại Tri Tôn – An Giang. Sau khi qua quá
trình sơ chế ban đầu thì đối tượng được khảo sát các đặc điểm về vi học, thử độ tinh
khiết, nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ cây Đinh lăng với phương pháp chiết lỏng – lỏng. Sau khi phơi khô 9,3 kg rễ Đinh lăng, ngấm kiệt với cồn 96 %. Tiến hành
cô thu hồi cồn, thu được 1,75 kg cao rễ tiến hành lắc phân bố với các dung môi có độ
phân cực tăng dần. Cô thu hồi dung môi, thu được các cao tương ứng.
Kết quả và bàn luận
Từ 9,3 kg rễ Đinh lăng, bằng kỹ thuật ngấm kiệt với cồn 96 %, sau đó lắc phân bố tuần tự với diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol, đã thu được 300 g cao Et2O, 30 g cao EtOAc, 405 g cao n-BuOH và 800 g cao nước cuối cùng. Song song đó, cũng thu được kết quả của các đặc điểm về vi học, thử độ tinh khiết và khảo sát sơ bộ thành phần hóa
học của Đinh lăng. Kết luận: Bằng các kỹ thuật đơn giản đã khảo sát được các đặc điểm về vi học, độ tinh khiết của cây. Với phương pháp ngấm kiệt và lắc phân bố đã thu được các cao phân đoạn. Để làm tài liệu cho các nghiên cứu sau.
iv
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... VII
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... IX
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... X
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 2
2.1.TỔNG QUAN VỀ ĐINH LĂNG ......................................................................... 2
2.1.1.Vị trí, phân loại Đinh lăng .............................................................................. 2
2.1.2.Tên Việt Nam, tên khoa học, tên gọi khác ..................................................... 3
2.1.2.1.Tên Việt Nam ........................................................................................... 3
2.1.2.2.Tên khoa học ........................................................................................... 3
2.1.2.3.Tên gọi khác ............................................................................................ 3
2.1.3.Một số loài Đinh lăng khác ............................................................................. 4
2.1.3.1.Đinh lăng lá tròn ..................................................................................... 4
2.1.3.2.Đinh lăng lá ráng .................................................................................... 4
2.1.3.3.Polyscias sambucifolia (Sieber) Harms. ................................................. 4
2.1.3.4.Đinh lăng trổ ........................................................................................... 4
2.1.3.5.Đinh lăng lá răng .................................................................................... 5
2.1.3.6.Polyscias grandifolia Volkens. ................................................................ 5
2.1.3.7.Đinh lăng đĩa ........................................................................................... 5
2.1.4.Đặc điểm thực vật Đinh lăng .......................................................................... 5
2.1.4.1.Mô tả ........................................................................................................ 5
2.1.4.2.Sinh thái ................................................................................................... 6
2.1.5.Thu hái chế biến .............................................................................................. 6
2.1.6.Phân bố thu hái ............................................................................................... 6
2.1.7.Trồng trọt ........................................................................................................ 7
2.1.8.Thành phần hóa học ........................................................................................ 8
2.1.9.Tác dụng dược lý ........................................................................................... 20
v
2.1.10.Công dụng và liều dùng ............................................................................... 23
2.1.10.1.Công dụng ............................................................................................ 23
2.1.10.2.Liều dùng .............................................................................................. 23
2.1.11.Sản phẩm Đinh lăng có mặt trên thị trường ................................................. 25
2.2.TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT ................................... 27
2.3.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH ...................................................... 30
2.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng .............................................................................. 31
2.3.2. Kỹ thuật chiết rắn - lỏng........................................................................... 33
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 38
3.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 38
3.1.1.Nguyên liệu .................................................................................................... 38
3.1.2.Hóa chất và dung môi .................................................................................... 38
3.1.3.Trang thiết bị .................................................................................................. 38
3.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 39
3.2.1.Thu hái xử lý và bảo quản Đinh lăng............................................................. 39
3.2.1.1.Thu hái .................................................................................................... 39
3.2.1.2.Xử lý và bảo quản ................................................................................... 39
3.2.2.Nghiên cứu về đặc điểm vi học ..................................................................... 39
3.2.2.1.Khảo sát hình thái .................................................................................. 39
3.2.2.2.Khảo sát vi phẫu ..................................................................................... 39
3.2.2.3.Khảo sát bột dược liệu ........................................................................... 40
3.2.3.Thử tinh khiết ................................................................................................. 40
3.2.3.1.Xác định độ ẩm ....................................................................................... 40
3.2.3.2.Xác định tro toàn phần ........................................................................... 41
3.2.3.3.Xác định chất chiết được trong dược liệu .............................................. 41
3.2.4.Nghiên cứu về hóa học .................................................................................. 41
3.2.4.1.Định tính ................................................................................................. 41
3.2.4.2.Định tính sơ bộ các nhóm chính trong thân và rễ Đinh lăng................. 43
3.2.4.3.Chiết xuất và tách phân đoạn ................................................................. 49
3.2.4.4.Thăm dò hệ sắc ký các cao phân đoạn ................................................... 52
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 53
4.1.THỰC VẬT HỌC ............................................................................................... 53
vi
4.1.1.Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 53
4.1.2.Đặc điểm vi phẫu ........................................................................................... 59
4.1.3.Đặc điểm bột dược liệu .................................................................................. 65
4.2.THỬ TINH KHIẾT ............................................................................................ 70
4.2.1.Độ ẩm ............................................................................................................. 70
4.2.2.Xác định độ tro .............................................................................................. 71
4.2.3. Chất chiết được trong dược liệu ................................................................... 70
4.3.NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ TÁCH PHÂN ĐOẠN .................................... 71
4.3.1.Định tính ........................................................................................................ 71
4.3.2.Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng ................. 76
4.3.3.Chiết xuất ....................................................................................................... 78
4.3.4.Tách phân đoạn bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ............................................ 79
4.4.THĂM DÒ HỆ DUNG MÔI .............................................................................. 80
4.4.1.Sắc ký lớp mỏng cao diethyl ether ................................................................. 80
4.4.2.Sắc ký lớp mỏng cao ethyl acetat .................................................................. 82
4.4.3.Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol ..................................................................... 84
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................. 87
5.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 87
5.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm vi học .................................................................... 87
5.1.2. Thử tinh khiết ................................................................................................ 87
5.1.3. Nghiên cứu về hóa học ................................................................................. 87
5.2. ĐỀ XUẤT ............................................................................................................ 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 89
vii
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí và phân loại của loài Polyscias fruticosa (L.) Harms ............... 2
Hình 2.2. Toàn cây và lá Đinh lăng .. ........................................................................... 4
Hình 2.3. Toàn cây và hoa Đinh lăng . ......................................................................... 6
Hình 2.4. Một số acid amin có trong Đinh lăng .......................................................... 8
Hình 2.5. Một số vitamin có trong Đinh lăng . ............................................................ 9
Hình 2.6. Một số hợp chất chính có trong tinh dầu ..................................................... 16
Hình 2.7. Một số flavonoid từ lá Đinh lăng .. .............................................................. 16
Hình 2.8. Công thức falcarindiol của cây Đinh lăng .. ................................................. 18
Hình 2.9. Công thức chung saponin triterpenoid của cây Đinh lăng ........................... 18
Hình 2.10. Sản phẩm Đinh lăng .................................................................................. 27
Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết . ..................................................................... 43
Hình 3.2. Sơ đồ tách các chất trong dịch chiết ether .. ................................................. 44
Hình 3.3. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn ... ......................... 45
Hình 3.4. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn thủy phân ............ 46
Hình 3.5. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nước ................ 47
Hình 3.6. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết nước thủy phân ... ..... 48
Hình 3.7. Sơ đồ tách chiết phân đoạn . ......................................................................... 50
Hình 4.1. Toàn cây và lá Đinh lăng .. ........................................................................... 52
Hình 4.2. Hình thái bên ngoài của lá Đinh lăng ........................................................... 53
Hình 4.3. Cụm hoa Đinh lăng ............. ......................................................................... 54
Hình 4.4. Hình thái bên ngoài hoa Đinh lăng .. ............................................................ 55
Hình 4.5. Hình toàn cây và thân Đinh lăng . ................................................................ 56
Hình 4.6. Hình đường kính thân Đinh lăng . ................................................................ 56
Hình 4.7. Hình hình thái bên ngoài rễ Đinh lăng ......................................................... 57
Hình 4.8. Hình thái bên ngoài rễ chính và rễ con Đinh lăng ... .................................... 58
Hình 4.9. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 10X .. ............................................................ 59
viii
Hình 4.10. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 40X .. .......................................................... 59
Hình 4.11. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 10X .. ............................................... 60
Hình 4.12. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 40X .. ............................................... 61
Hình 4.13. Vi phẫu thân Đinh lăng vật kính 10X ... ..................................................... 62
Hình 4.14. Hình vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 10X .. ................................................. 63
Hình 4.15. Vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 40X . .......................................................... 64
Hình 4.16. Bột lá Đinh lăng soi vi phẫu . ..................................................................... 65
Hình 4.17. Soi bột lá Đinh lăng vật kính 40X . ............................................................ 66
Hình 4.18. Bột thân Đinh lăng soi bột .. ....................................................................... 66
Hình 4.19. Soi bột thân Đinh lăng vật kính 40X .......................................................... 67
Hình 4.20. Bột rễ Đinh lăng ........................................................................................ 67
Hình 4.21. Soi bột rễ Đinh lăng vật kính 40X . ............................................................ 68
Hình 4.22. Định tính cao rễ bằng hệ n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5)............. 72
Hình 4.23. Định tính cao rễ bằng hệ Toluen - ethyl acetat (7 : 3) ................................ 73
Hình 4.24. Định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng ................................................... 74
Hình 4.25. Định tính saponin thân Đinh lăng bằng SKLM . ........................................ 75
Hình 4.26.Sơ đồ chiết xuất rễ Đinh lăng ..................................................................... 77
Hình 4.27. Sơ đồ tách phân đoạn . ................................................................................ 79
Hình 4.28. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S1 ................................................... 80
Hình 4.29. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S2 ................................................... 80
Hình 4.30. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S3 ................................................... 81
Hình 4.31. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S1 ..................................................... 82
Hình 4.32. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S2 ..................................................... 83
Hình 4.33. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S3 ..................................................... 83
Hình 4.34. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S1 ... ..................................................... 84
Hình 4.35. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S2 ......................................................... 84
Hình 4.36. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S3 ......................................................... 85
ix
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Tóm tắt các saponin triterpen trong cây Đinh lăng ... ................................ 19
Bảng 4.1. Độ ẩm bột dược liệu Đinh lăng ... .............................................................. 69
Bảng 4.2. Độ ẩm cao toàn phần Đinh lăng .. .............................................................. 69
Bảng 4.3. Tiêu chuẩn độ tro của dược liệu .. .............................................................. 70
Bảng 4.4. Chất chiết được trong dược liệu ................................................................ 70
Bảng 4.5. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng ............ 76
Bảng 4.6. Khối lượng và độ ẩm các cao phân đoạn trong cao rễ ... ........................... 78
x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chloroform
CHCl3
Dược điển Việt Nam
DĐVN
Diethyl ether
Et2O
Ethyl acetat
EtOAc
Ethanol
EtOH
Nước
H2O
Methanol
MeOH
Mass Spectotrocopy - Phổ khối
MS
n-butanol
n-BuOH
Sắc ký lớp mỏng
SKLM
Tài liệu tham khảo
TLTK
Toàn phần
TP
Thuốc thử
TT
Ultraviolet -Tử ngoại
UV
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Từ xa xưa các dân tộc ở Châu Á đã biết sử dụng các loại cây cỏ, hoa, lá trong tự nhiên
để chữa bệnh tật. Tuy nhiên sự kết hợp hài hòa giữa các vị thuốc cây cỏ chủ yếu dựa
trên các kinh nghiệm dân gian về công dụng của các loài thảo dược.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu hiểu biết của con người về các loài thảo dược ngày càng sâu rộng hơn. Việc nghiên cứu sâu các thành phần hóa học
để hiểu rõ nguồn gốc hoạt tính của cây thuốc chữa bệnh trở thành một lĩnh vực thu hút
được sự chú ý của giới khoa học.
Ở nước ta, việc sử dụng cây cỏ để chữa bệnh là rất phổ biến trong dân gian. Trong thời gian gần đây có rất nhiều thông tin cho rằng tác dụng chữa bệnh của Đinh lăng giống
như Nhân sâm nên người ta thường gọi Đinh lăng là Nhân sâm ở Việt Nam. Đây là
một cây thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) với tên khoa học là Polyscias fruticosa (L.)
Harms. Trong dân gian, Đinh lăng được sử dụng rất rộng rãi trong việc tăng cường sức
khỏe, tăng cường lưu thông khí huyết, giảm đau thấp khớp,… (Phạm Hoàng Hộ,
2003).
Trong y học phương Đông, Đinh lăng được sử dụng như một vị thuốc bổ, kích thích
tiêu hóa, giải độc kháng khuẩn, tiêu viêm,... Nó có nhiều ưu điểm như dễ trồng, dễ sử
dụng và mang nhiều tác dụng tiêu biểu của họ Nhân sâm. Trong thập nhiên 70, rễ Đinh
lăng được các nhà khoa học Liên Xô, Viện y học quân sự, Viện dược liệu và trường
đại học Dược Hà Nội nghiên cứu về thành phần hóa học, một số tác dụng dược liệu và
lâm sàng (Đỗ Huy Bích, 2006).
Tuy nhiên, phần lớn các thông tin về tác dụng chữa bệnh của Đinh lăng từ kinh
nghiệm dân gian. Những kinh nghiệm đó chưa được chứng minh rõ ràng bằng các
nghiên cứu. Chính vì vậy mà đề tài “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và chiết
phân đoạn rễ cây Đinh lăng” được thực hiện nhằm đóng góp một phần khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học của rễ và trong các phân đoạn chiết tách rễ của cây Đinh lăng
Polyscias fruticosa (L.) Harms thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), so sánh thành phần hóa học giữa thân và rễ Đinh lăng, cung cấp thêm những vấn đề có liên quan đến dược liệu như tổng quan về thực vật học, tác dụng dược lý, công dụng và một số bài thuốc có chứa Đinh lăng.
1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ ĐINH LĂNG 2.1.1. Vị trí, phân loại Đinh lăng
Theo như mô tả của TS Trương Thị Đẹp (2014) Đinh lăng thuộc họ Nhân sâm
(Araliaceae), chi Polyscias, loài Polyscias fruticosa (L.) Harms (Trương Thị Đẹp
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Thù Du (Cornidae)
Bộ Ngũ Gia Bì (Araliales)
Họ Nhân sâm (Araliaceae)
Chi Polyscias
Loài Polyscias fruticosa (L.) Harms
(2014).
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí và phân loại của loài Polyscias fruticosa (L.) Harms
Đặc điểm họ Nhân sâm (Araliaceae)
Các chi thuộc họ Ngũ gia bì thường tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có rất ít chi trong vùng ôn đới; các chi thường tập trung chủ yếu ở phía Nam,
Đông Nam Á và đảo Thái Bình Dương (Armen Takhtajan, 2009; Trương Thị Đẹp, 2014).
Thân: Cỏ (Panax) hay cây gỗ nhỏ mọc đứng hay cây gỗ to ít phân nhánh, đôi khi leo.
2
Lá: Thường mọc cách ở góc thân, mọc đối ở ngọn, đôi khi mọc vòng. Lá có thể đơn
hay kép hình lông chim hoặc kép hình chân vịt. Phiến lá nguyên, có khía răng hoặc có thùy. Lá kèm rụng sớm hay dính vào cuống lá. Bẹ lá tương đối phát triển.
Cụm hoa: Tán đơn hay kép, tụ thành chùm, đầu ở nách lá hay ngọn cành.
Hoa: Nhỏ, hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, 4 vòng.
Bao hoa: Lá đài thu hẹp chỉ còn 5 răng, 5 cánh hoa rời và dễ rụng sớm. Bộ nhị: 5 nhị
xen kẽ cánh hoa.
Bộ nhụy: 5 lá noãn dính nhau thành bầu dưới có 5 ô, mỗi ô 1 noãn; đôi khi có 10 lá
noãn, ít khi giảm còn 3 hay 1 lá noãn; vòi rời.
Quả: Mọng hay quả hạch. Hạt có nội nhũ.
Ở Việt Nam có trên 20 chi: Acanthompanax, Aralia, Aralidium, Arthrophyllum,
Brassaiopsis, Dendropanax, Dizygotheca, Evodiopanax, Grushvitzkia, Hedera,
Heteropanax, Macropanax, Panax, Plerandropsis, Polycias (Nothopanax),
Pseudopanax, Schefflera, Scheffleropsis, Tetrapanax, Trevesia, Tupidanthus; gần 120
loài (Armen Takhtajan, 2009; Trương Thị Đẹp, 2014).
Tên Việt Nam, tên khoa học, tên gọi khác
2.1.2. 2.1.2.1. Tên Việt Nam
Tên Việt Nam: Đinh lăng.
2.1.2.2. Tên khoa học
Cây Đinh lăng có tên khoa học là Polyscias fruticosa (L.) Harms, họ Nhân sâm (Araliaceae) (Dược điển Việt Nam IV, 2009).
Tên đồng nghĩa: Nothopanax fruticosus (L.) Harms (Đỗ Tất Lợi, 2004),
Tieghemopanax fruticosa (L.) Vig. (Phạm Hoàng Hộ, 2003), Panax fruticosum I
(J.Seidemann, 2005), Panax fruticosa L. ( Phạm Hoàng Hộ, 2003; Đỗ Huy Bích và cs,
2006).
2.1.2.3. Tên gọi khác
Đinh lăng còn có các tên gọi khác như: Đinh lăng lá nhỏ, cây Gỏi cá, Nam dương lâm. Tên nước ngoài: Ming aralie; Tea tree; Ginseng tree (Anh); Polyscias (Pháp); Strau - chige Fiederaralie (Greman); Taiwan momiji (Japanese); Bani, Makan, Papua (Philipion); Ovang (Sumatra) (DĐVN IV, 2009; Đỗ Huy Bích và cs, 2006).
3
Hình 2.2. Toàn cây và lá Đinh lăng
2.1.3. Một số loài Đinh lăng khác 2.1.3.1. Đinh lăng lá tròn
Tiểu mộc cao 1 - 2 m, thơm. Lá kép thường mang 3 lá chét trên một cuống dài, lá chét
hình tròn, đầu tù, xanh đậm, không lông, bìa có răng nhọn, cuống phụ 1 cm; cuống có
đáy thành bẹ. Chùm tụ tán mang tán to 1 - 1,5 cm; hoa có 6 cánh hoa, 6 tiểu nhụy.
Thường được trồng làm kiểng, gốc Tân - Caledonia III (Phạm Hoàng Hộ, 2003; Đỗ
Huy Bích và cs, 2006).
2.1.3.2. Đinh lăng lá ráng
Được gọi là Polyscias ilicifolia Bailf.
Có tên khác là Polyscias cumingiana (C.Presl) Fern. - Vill, Anthrophyllum pinnatum
(Lam.) Clarke (J.Seidemann, 2004).
Tiểu mộc cao đến 2,5 m; thân có bì khổng. Lá kép có 11 - 13 lá chét; lá chét hình mác
có răng cưa và sâu. Lá đặc biệt đa dạng: ở thân non, kép 1 - 2 lần thành đoạn hẹp
nhọn, bìa có răng nhọn, dạng lá ráng; ở nhánh già lá đơn, xoan đến thon, thường lục
tươi, gân giữa tía. Trồng ở đảo Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2006; Phạm Hoàng Hộ, 2003).
2.1.3.3. Polyscias sambucifolia (Sieber) Harms.
Trồng ở Hà Nội làm thuốc, gốc Châu Úc (Phạm Hoàng Hộ, 2003).
2.1.3.4. Đinh lăng trổ
Tên khoa học là Polyscias guilfoylei (Cogn. & Marche) Bail.
Lá kép có 7 lá chét: lá chét thường có viền trắng (Đỗ Huy Bích và cs, 2006).
4
2.1.3.5. Đinh lăng lá răng
Tên khoa học là Polyscias serrata Balf.
Cây kiểng. Bụi cao 50 - 150 cm; thân xám trắng, không lông, cành non xanh. Lá thơm,
2 lần kép (Pham Hoàng Hộ, 2003).
2.1.3.6. Polyscias grandifolia Volkens, 1965 Micronesica.
Trồng ở Hà Nội (Phạm Hoàng Hộ, 2003).
2.1.3.7. Đinh lăng đĩa
Tên khoa học là Polysicas scutellarius (Burm. f.) Merr.
Cây nhỏ, cao 1 - 2 m; thân nâu đen, có bì khẩu trắng. Lá đơn hay do 2 - 3 lá phụ, phiến
tròn bũm như cái dĩa hay bán cầu, xanh hay trổ, không lông. Chùm tụ tán thông dài; tán 5 - 8 hoa, hoa giữa không cọng; cánh hoa xanh, cao 3,5 mm. Có nguồn gốc từ
Mexico (Phạm Hoàng Hộ, 2003).
Đặc điểm thực vật Đinh lăng
2.1.4. 2.1.4.1. Mô tả
Cây nhỏ dạng bụi, xanh tốt quanh năm, có thể cao từ 1,5 - 2 m. Thân nhám, không gai,
ít phân nhánh, mang nhiều vết sẹo to, màu xám, các nhánh non có nhiều lỗ bì lồi. Lá
kép, mọc so le, kép lông chim 2 - 3 tán, dài 20 - 40 cm; lá chét có răng cưa nhọn
không đều, đôi khi chia thùy, gốc và thuôn nhọn, có mùi thơm khi vò nát; cuống lá dài,
phát triển thành bẹ to ở phần cuối; các đoạn đều có cuống.
Cụm hoa mọc ở ngọn thành hình chùy ngắn mang nhiều tán; lá bắc rộng, sớm rụng; loa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám; mép uốn lượn; tràng 5 cánh trái xoan; nhị 5, chỉ
nhị ngắn; bán hạ, 2 ô.
Quả dẹt, hình trứng rộng, màu trắng bạc.
Mùa hoa quả: Tháng 4 - 7 (Armen Takhtajan, 2009; Phạm Hoàng Hộ, 2003; Trương
Thị Đẹp, 2014; Võ Văn Chi, 2012).
5
Hình 2.3. Toàn cây và hoa Đinh lăng
2.1.4.2. Sinh thái
Cây có khả năng tái sinh dinh dưỡng cao. Người ta thường trồng chủ yếu bằng cách
giâm cành; chọn những cành già, chặt thành đoạn ngắn 15 - 20 cm, cắm nghiêng
xuống đất. Thời gian gieo trồng vào tháng 2 - 4 hoặc tháng 8 - 10. Đinh lăng ưa đất
cao ráo, hơi ẩm (Võ Văn Chi, 2012).
2.1.5. Thu hái chế biến
Thu hoạch rễ của cây đã trồng từ 3 năm trở lên (cây trồng càng lâu năm càng tốt).
Rễ củ thu hái thường vào mùa thu, lúc này rễ mềm, nhiều hoạt chất, rửa sạch. Rễ nhỏ
để nguyên, rễ to chỉ dùng vỏ rễ. Thái rễ mỏng, đem rửa sạch, phơi khô ở chỗ mát,
thoáng gió để đảm bảo mùi thơm và hoạt chất. Khi dùng để nguyên hoặc tẩm rượu gừng 5 %, sao qua, rồi tẩm 5 % mật ong hoặc mật mía.
Lá thu hái quanh năm thường dùng tươi (DĐVN IV, 2009; Võ Văn Chi, 2012).
2.1.6. Phân bố thu hái Chi Polyscias Forst & Forst f. có gần 100 loài trên thế giới, phân bố rải rác ở các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới, nhất là một số đảo ở Thái Bình Dương. Ở Việt Nam
có khoảng 7 loài đều là cây trồng.
Đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynesic ở Thái Bình Dương. Cây được trồng ở Malaysyia, Indonesia, Campuchia, Lào… Ở Việt Nam, Đinh lăng cũng có từ lâu trong
6
nhân dân và được trồng khá phổ biến ở vườn gia đình, đình chùa, trạm xá, bệnh
viện,… để làm cảnh, làm thuốc và rau gia vị.
Đinh lăng là loại cây ưa ẩm và có thể chịu bóng, trồng được trên nhiều loại đất, thậm
chí với một lượng đất rất ít trong chậu nhỏ, cây vẫn có thể sống được theo kiểu cây
cảnh bonsai. Trồng bằng cành sau 2 - 3 năm cây có hoa quả. Chưa quan sát được cây con mọc từ hạt.
Đinh lăng có khả năng tái sinh vô tính khỏe. Từ một đoạn thân hoặc cành cắm xuống
đất đều trở thành cây mới (Đỗ Huy Bích, 2006; Võ Văn Chi, 2012; Đỗ Tất Lợi, 2004;
Phạm Hoàng Hộ, 2003; Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007).
2.1.7. Trồng trọt
Đinh lăng được trồng phân tán ở khắp nơi, để làm cảnh, lá làm gia vị, rễ làm thuốc.
Hiện nay, một số nơi đã bắt đầu trồng Đinh lăng ở quy mô sản xuất thử (1000 - 2000 m2).
Đinh lăng được nhân giống bằng cành trong chậu, góc sân, góc vườn,… người ta chỉ
cần lấy một đoạn thân cành cấm xuống đất là được. Nếu trồng diện tích lớn, chọn cành
bánh tẻ có đường kính 1 - 1,5 cm, cắt thành từng đoạn dài 5 - 7 cm, giâm trong cát ẩm
(70 %). Sau 7 - 10 ngày, hom giống nảy mầm và sau 1,5 - 2 tháng có thể ra ngòi. Cành
giâm lúc đầu chỉ ra rễ ở đầu dưới của cành. Thực tiễn thấy rằng, rễ này nhỏ và chất
lượng kém hơn rễ phát sinh từ gốc chồi tái sinh. Tuy nhiên, chồi tái sinh của Đinh lăng
ra rễ rất chậm. Đó là lý do tại sao Đinh lăng lâu được thu hoạch. Vấn đề này đang được nghiên cứu để tìm giải pháp khắc phục.
Đất trồng Đinh lăng cần nhiều màu, tầng canh tác sâu. Tơi xốp, cao ráo, thoát nước và
tiện tưới. Sau khi làm đất, khơi rãnh thoát nước hoặc lên thành luống, bứng cây con ra
trồng với khoảng cách 0,8 x 0,6 m. Mỗi gốc cây, cần bón lót 3 - 5 kg phân chuồng
hoặc phân rơm mục. Đinh lăng trồng được quanh năm, tốt nhất là giâm cành vào tháng
5 - 6 và trồng vào tháng 7 - 8. Khi trồng nên cắt bớt lá để hạn chế thoát hơi nước, giúp cây nhanh hồi phục. Cây ưa bóng và ưa ẩm nên có thể trồng xen dưới tán cây trong
vườn. Thường xuyên làm cỏ, nhất là lúc mới trồng cây.
Từ giữa mùa xuân đến mùa thu, thời kỳ sinh trưởng mạnh, cần bón thúc cho cây. Dùng nước phân chuồng, nước giải pha loãng, phân vi sinh, liều lượng tùy thuộc độ sinh trưởng của cây.
Đinh lăng không có sâu bệnh nghiêm trọng. Cây trồng sau 7 - 10 năm mới được thu hoạch. Cây càng già, năng suất và chất lượng rễ càng cao (Đỗ Huy Bích, 2006).
7
2.1.8. Thành phần hóa học
Năm 1989, Nguyễn Khắc Viện đã nghiên cứu và cho thấy trong rễ có 4 % saccarose, một chất kết tinh A chưa xác định cấu trúc hóa học, có điểm sôi trong khoảng 158 - 161 oC, tan nhiều trong chloroform và aceton (Nguyễn Khắc Viện, 1989).
Năm 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã công bố trong thành phần của rễ, thân và lá có các glycosid, alkaloid, tanin, vitamin B1 và khoảng 20 loại acid amin như
arginin, alanin, asparagin, acid glutamic, leucin, lysin, phenylalanin, prolin, threonin,
Arginin
Alanin
Asparagin
Cystein
Acid Glutamic
Leucin
Metionin
Phenylalanin
Prolin
Threonin
Tyrosin
Tryptophan
Lysin
Hình 2.4. Một số acid amin có trong Đinh lăng
tyrosin, cystein, tryptophan, metionin... (Nguyễn Thới Nhâm và cs, 1990).
8
Năm 1990, Brophy Joseph J. và cộng sự đã dùng phương pháp GC - MS để phân
E-γ-bisabolen và α-bergamoten (Brophy J.J et al., 1990).
tích thành phần tinh dầu của lá cây mọc ở Fiji và Thái Lan. Kết quả cho thấy trong tinh dầu có khoảng 24 cấu tử, trong đó có 4 chất chính là: β-elemen; β-germacren-D;
Năm 1991, Võ Xuân Minh cùng cộng sự đã khảo sát hàm lượng saponin toàn phần trong các bộ phận của cây Đinh lăng với kết quả: Rễ (0,49 %), vỏ rễ (1,00 %), lõi rễ
(0,11 %) và lá (0,38 %) (Võ Xuân Minh và cs, 1991).
Năm 1992, trong nghiên cứu tiếp theo, Võ Xuân Minh cho biết trong cây Đinh lăng có
Vitamin B1 (Thiamin)
Vitamin B2 (Riboflavin)
Vitamin C (Acid ascorbic)
Vitamin B6 (Pyridoxin)
các alcaloid, glucosid, saponin, các vitamin tan trong nước như B1, B2, B6, C. Nghiên cứu cũng cho thấy rễ cây Đinh lăng có chứa tới 20 acid amin (Võ Xuân Minh, 1992).
Hình 2.5. Một số vitamin có trong Đinh lăng
Năm 1992, Lutomski và cộng sự đã cô lập từ rễ 5 hợp chất thuộc loại hợp chất
(8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on;
polyacetylen: (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol; (8E)-heptadeca-1,8-dien- 4,6-diyn-3-ol-10-on; falcarinol và panaxydol (Lutomski et al., 1992).
9
(8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10- (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-
diol 10-on
Palcarinol (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol- 10-on
Panaxydol
Cũng vào năm 1992, Nguyễn Thị Nguyệt và cộng sự đã cô lập được acid oleanolic
(1) (Nguyễn Thị Nguyệt và cs, 1992; Nguyễn Thị Nguyệt, Võ Xuân Minh, Nguyễn
văn Bàn, 1992).
O-β-D-galactopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyloleanolic (2) (Chaboud A et al., 1995).
Năm 1995, Chaboud A. và cộng sự đã cô lập từ lá một saponin triterpen, đó là acid 3-
10
Năm 1996, Chaboud A. và cộng sự đã cô lập từ lá khô, một saponin triterpen là: Acid
3-O-[α-rhamnopiranosyl-(1-4)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D glucopyranosyl] leanolic (3) (Chaboud A et al., 1996).
Năm 1998, Võ Duy Huấn cùng cộng sự đã cô lập được 11 saponin triterpen:
Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (4) (Võ Duy
Huấn và cs, 1998).
Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (5)
11
Acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic (6)
Acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic (7)
Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic(8)
12
3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→ 4)-β-D-glucuronopyranosyl oleanolic 28-O-β-D-
glucopyranosyl ester (9)
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-
glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (10)
3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2),β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β–D-
glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (11)
13
3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β–D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (12)
3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-α-L-
rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl ester (13)
14
3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- glucuronopyranosyloleanolic 28-O-[ α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β–D-glucopyranosyl
ester. (14)
Năm 2010, Nguyễn Thị Lan bằng phương pháp GC và GC/MS để phân tích thành
phần tinh dầu của lá cây Đinh lăng ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa. Kết quả cho thấy trong tinh dầu Đinh lăng có 15 hợp chất như là β-elemen, -elemen, E-γ-bisabolen, α-
β-elemen
-elemen
E-γ-bisabolen (3)
α-bergamoten
bergamoten, β-germacren-D, Gecmacren-B, -farnesen (Nguyễn Thị Lan, 2010).
15
β-germacren-D
Gecmacren-B
-farnesen
Hình 2.6. Một số hợp chất chính có trong tinh dầu
Năm 2012, Viện hóa sinh biển - Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam đã phân lập
được 3 hợp chất flavonoid từ lá Đinh lăng là quercitrin, afzelin và kaempferol-3-O-
quercitrin
afzelin
kaempferol-3-O-rutinosid
rutinosid (Nguyễn Thị Luyến và cs, 2012).
Hình 2.7. Một số flavonoid từ lá Đinh lăng
Năm 2014, Hồ Lương Nhật Vinh từ lá cây Đinh lăng đã 3 saponin triterpen:
3-O-[β-D-galactopyranosyl(1→4)-β-D glucoronopyranosyl] oleanolic acid 28-O-β- D-glucopyranosyl ester (15) ( Hồ Lương Nhật Vinh, 2014).
16
3-O-{β-D glucopyranosyl(1→2)-[β-D-galactopyranosyl(1→4)]-β-D-
glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-
glucopyranosyl] ester (16).
3-O-{β-D-glucopyranosyl(1→2)-[β-D-galactopyranosyl(1→4)]-β-D-
glucoronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (17) (Hồ Lương
Nhật Vinh, 2014).
17
Năm 2016 Trần Thị Hồng Hạnh cùng cộng sự đã phân lập được 3 saponin triterpen
từ lá Đinh lăng. Trong đó 3-O-{𝛽-D-glucopyranosyl-(1→2)-[𝛽-D-glucopyranosyl- (1→4)]-𝛽-D-glucuronopyranosyl} oleanolic acid 28-O-𝛽-D-glucopyranosyl-(1→2)-𝛽-
D-galactopyranosyl ester là saponin được phân lập lần đầu tiên, và được đặt tên là
polyscioside I (18) (Trần Thị Hồng Hạnh, 2016).
Năm 2016, Nguyễn Thị Bích Thu và công sự Viện dược liệu đã phân lập được 5 hợp
chất saponin triterpen từ rễ Đinh lăng. Và trong đó có một hợp chất lần đầu tiên được
phân lập là falcarindiol (Nguyễn Thị Bích Thu và cs, 2016).
falcarindiol
Hình 2.8. Công thức falcarindiol của cây Đinh lăng
Hình 2.9. Công thức chung saponin triterpenoid của cây Đinh lăng
18
Bảng 2.1. Tóm tắt các saponin triterpen trong cây Đinh lăng
R1
R2
(1)
H
H
(2)
Gal-(1→2)-Glc-
H
(3)
Rha-(1→4)-Glc-
Glc-
(4)
Glc-(1→4)-Glc-
H
(5)
Glc-(1→2)-Glc-
H
Glc-(1→2) Glc-
(6)
H
Glc-(1→4)
Ara-(1→2) Glc-
(7)
H
Glc-(1→4)
Gal-(1→2) Glc-
(8)
H
Glc-(1→3)
(9)
Glc-(1→4)-Glc-
Glc-
Glc-(1→2) Glc-
(10)
Glc-
Glc-(1→4)
Ara-(1→2) Glc-
(11)
Glc-
Glc-(1→4)
Gal-(1→2) Glc-
(12)
Glc-
Glc-(1→3)
(13)
Glc-(1→4) - Glc-
Rha-(1→3)-Glc-
Glc-(1→2) Glc-
(14)
Rha-(1→3)-Glc-
Glc-(1→4)
(15)
Gal-(1→4)-Glc-
Glc-
19
Glc-(1→2) Glc-
(16)
Glc-(1→2)-Glc-
Gal-(1→4)
Glc-(1→2) Glc-
(17)
Glc-
Gal-(1→4)
Glc-(1→2) Glc-
(18)
Glc-(1→2)-Gal-
Glc-(1→4)
2.1.9. Tác dụng dược lý
Đinh lăng là loài cây quen thuộc với nhiều gia đình Việt Nam. Ở nước ta, Đinh lăng có
từ lâu và được trồng phổ biến ở vườn trong gia đình, trong khuôn viên đình chùa, trạm
xá, bệnh viện để làm cảnh, làm thuốc và còn được làm gia vị. Trong cuộc sống thường
ngày, lá cây được sử dụng như rau sống hoặc có thể ăn kèm trong món gỏi cá. Theo y học cổ truyền, rễ cây có vị ngọt, hơi đắng, tính mát, có tác dụng thông huyết mạch, bồi
bổ khí huyết; lá Đinh lăng có vị đắng, tính mát có tác dụng giải độc thức ăn, chống dị
ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ. Toàn cây Đinh lăng bao gồm rễ, thân, lá đều có thể sử
dụng làm thuốc với nhiều công dụng và bài thuốc khác nhau.
Từ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, Đinh lăng đã được nhiều nhà khoa học nghiên
cứu bài bản về tính ưu việt trên nhiều góc độ khác nhau trong nhiều năm.
Theo nghiên cứu của GS Ngô Ứng Long và cộng sự của ông thuộc học viện Quân y.
Trong rễ Đinh lăng có chứa nhiều saponin giống như sâm, các vitamin B1, B2, B6, C
và 20 acid amin cần thiết cho cơ thể và những acid amin không thể thay thế được như
lyzin, cystein, methionin.
Song song đó, TS Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự tại Trung tâm Sâm và dược liệu TP HCM cũng đã dành nhiều thời gian và tâm huyết nghiên cứu tác dụng của cây Đinh
lăng trong suốt 7 năm (2000 - 2007). Những nghiên cứu của TS Hương đã chỉ ra Đinh lăng có các tác dụng dược lý tương tự như cây sâm nhưng giá thành lại rẻ hơn và dễ
trồng hơn sâm. Cụ thể, theo nghiên cứu của tác giả, cây có tác dụng tăng thể lực, kích thích các hoạt động của não bộ, giải tỏa lo âu, mệt mỏi, chống oxy hóa, bảo vệ gan và kích thích miễn dịch.
Qua các kết quả nghiên cứu trên, với những tác dụng quý của mình, Đinh lăng được gợi ý cho các đối tượng như dùng cho lực lượng vũ trang với tác dụng tăng lực, tăng
20
khả năng làm việc, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể; dùng cho vận động viên thể
thao để tăng độ dẻo dai, tăng sức bền, tăng thành tích thi đấu. Bên cạnh đó, Đinh lăng còn dùng cho phi hành gia trong thời gian rèn luyện để tăng sinh thích nghi, tăng sức
chịu đựng của cơ thể, tăng sức đề kháng, giảm sự mệt mỏi trong điều kiện môi trường
bất lợi. Đinh lăng là sâm quý của người Việt bởi các tác dụng dược lý trên cơ thể cũng như tính an toàn cho bệnh nhân sử dụng (Đỗ Huy Bích, 2006; Trần Yên, 1994; Ngô
Ứng Long và cs, 1993; www.wikiwand.com).
Đinh lăng có một số tác dụng cụ thể như sau:
Tăng lực trên động vật thí nghiệm và trên người. Thân và lá cũng có tác dụng tăng lực nhưng yếu hơn so với rễ.
Làm tăng hiệu lực điều trị của cloroquin trong bệnh sốt rét thực nghiệm trên động vật.
Tăng co bóp tử cung và tăng tiết niệu.
Tác dụng an thần và ít độc.
Đinh lăng đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng nội tiết kiểu oestrogen.
Nước sắc Đinh lăng có tác dụng kháng đối với trùng roi Euglena vindis, trùng tiêm
mao Paramecium caudatum và một số động vật nguyên sinh khác trong nước ngâm
rơm và nước ao. Nước sắc Đinh lăng còn có tác dụng chống choáng phản vệ ở mức độ
vừa, bảo vệ được 60 % chuột lang qua cơn choáng.
Dựa theo kinh nghiệm nhân gian, Đinh lăng được áp dụng điều trị bệnh nhân lỵ amip
cấp. Sau 10 ngày, hết triệu chứng lâm sàng, và sau 16 ngày xét nghiệm lại, trong phân hết thể amip thực huyết, hết kén.
Đinh lăng có tác dụng kháng Entamoeba histolyica, làm đơn bào co thành kén và có
tác dụng kích thích miễn dịch gây chuyển dạng lympho bào trong thí nghiệm nuôi cấy
in vitro.
Đinh lăng đã được nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch không đặc hiệu trong thí nghiệm gây mẫn cảm chuột nhắt bằng hồng cầu cừu. Sau đó 4 ngày, mổ tách tế bào
lách và ủ với kháng nguyên trong môi trường. Đếm số tế bào mảng dung huyết và thấy Đinh lăng thể hiện tác dụng kích thích miễn dịch mạnh. Đã thử tác dụng chống trầm uất theo nghiệm pháp “trạng thái thất vọng”, chống trầm uất. Trong thí nghiệm trên động vật được uống Đinh lăng cũng như trong thí nghiệm in vitro, ủ tổ chức não hoặc gan với chiết Đinh lăng và sau đó định lượng hoạt độ men MAO, thấy Đinh lăng có
tác dụng ức chế mạch hoạt độ men MAO ở não và gan. Đinh lăng còn có tác dụng giảm chứng tăng cholesterol trong máu gây theo cơ chế nội sinh bằng Tween 80 (Nguyễn Thị Thu Hương, 2009; Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, 2001).
21
Dịch chiết Đinh lăng còn được thử tác dụng với ATPase màng tế bào, thấy K+ Na+ ATPase điều được kích thích bởi dịch chiết thân, rễ và lá của cây. Đối với ATPase dạng hòa tan, kết quả tương tự như ATPase của màng tế bào. Sự kích thích hoạt tính men của dịch chiết Đinh lăng có khả năng đề kháng sự kìm hãm K+ Na+ ATPase của aminazin. Đinh lăng có tác dụng kích thích sinh dục ở động vật già và kích thích tăng sinh lực ở động vật gây mệt mỏi, tác dụng kéo dài và bền vững.
Đinh lăng ít độc hơn cả Nhân sâm và khác với Nhân sâm, nó không làm tăng huyết áp.
Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể. Đinh lăng làm cho
nhịp tim sớm trở lại bình thường sau khi chạy dai sức làm cơ thể chịu được nóng. Người bệnh bị suy mòn uống Đinh lăng chóng phục hồi cơ thể, ăn ngon, ngủ tốt, tăng
cân. Falcarinol và heptadeca thể hiện hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram
dương mạnh và vi khuẩn gây bệnh nấm da, cho thấy hoạt tính kháng nấm. Hoạt tính
kháng khuẩn của falcarinol được tìm thấy mạnh hơn 15 - 35 lần so với erythromycin,
chloramphenicol và oxytetracycline (Đỗ Huy Bích, 2006; Võ Văn Chi, 2012; Đỗ Tất
Lợi, 2004; Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2003).
Năm 1961, các khoa dược lý, dược liệu và giải phẫu bệnh lý Viện y học quân sự Việt
Nam nghiên cứu tác dụng của Đinh lăng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể và một số tác
dụng khác đã đi đến kết luận sau:
- Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí nghiệm cấp tính tương tự như Sâm. - Với liều 0,1 ml cao lỏng Đinh lăng cho 20 g thể trọng sống làm giảm hoạt động của chuột trắng. - Đinh lăng có tác dụng trực tiếp trên cơ tim ếch với liều nhất định làm giảm trương lực cơ tim, làm tim co bóp yếu và thưa, tiến tới tim ngừng đập. - Dùng dịch nước 0,2 đến 1 % rễ Đinh lăng gây co mạch tai thỏ. - Với liều 0,5 ml dung dịch cao Đinh lăng 100 – 200 % trên 1 kg thể trọng tiêm tĩnh mạch vành tai làm tăng cường hô hấp về biên độ và tần số: Huyết áp nhất thời
hạ xuống. - Trên tử cung tại chỗ, với liều 1 ml dung dịch cao Đinh lăng 100 % cho 1 kg thể trọng tiêm tĩnh mạch vành tai làm tăng co bóp tử cung nhẹ. - Đinh lăng có tác dụng tăng tiết niệu trên 5 lần so với bình thường với liều uống 2 ml dung dịch Đinh lăng 100 % cho 100 g thể trọng (thí nghiệm trên chuột bạch Trung Quốc). - Liều độc: Đinh lăng ít độc hơn so với Nhân sâm và Ngũ gia bì. Cho chuột uống với liều 50 g/kg thể trọng chuột vẫn sống bình thường.
22
- Làm tăng sức đề kháng của chuột đối với tác hại của bức xạ siêu tần. - GS Ngô Ứng Long và Xavaev (Liên Xô cũ) đã cùng nhận thấy Đinh lăng có tác dụng tốt đối với các nhà du hành vũ trụ khi luyện tập ở tư thế tĩnh, đầu dốc ngược. - Thực nghiệm trên người, viên bột rễ Đinh lăng làm tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể dục, thể thao trong các nghiệm pháp gắng sức cũng như luyện tập (Đỗ Tất Lợi, 2004; Ngô Ứng Long và cs, 1993; Nguyễn Thị Thu Hương
và cs, 2003).
2.1.10. Công dụng và liều dùng 2.1.10.1. Công dụng
Theo y học hiện đại, cây Đinh lăng có một số tác dụng chính như: Tác dụng bổ chung,
ăn ngon, dễ ngủ và tăng cân, tăng lực, tăng khả năng lao động nặng và phục hồi sức
khỏe tốt, hoạt hóa các tế bào thần kinh, tăng cường trí nhớ (Quách Tuấn Vinh, 2005;
Nguyễn Thượng Dong và cs 2007).
Theo Đông y: Đinh lăng có tác dụng giải độc, ban chẩn, thương hàn nhập lý, thông
tiểu tiện, mát phổi, ho ra máu, kiết lỵ, phong thấp, nhức mỏi chân tay (Quách Tuấn
Vinh, 2005).
Rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ tăng lực, chữa cơ thể suy nhược, gầy yếu, mệt
mỏi, tiêu hóa kém, phụ nữ sau khi sinh ít sữa. Có nơi còn dùng chữa ho, đau tử cung,
thuốc lợi tiểu, chống độc và co rút tử cung (Phạm Hoàng Hộ, 2003; DĐVN IV, 2009).
Lá chữa cảm sốt, mụn nhọt sưng tấy, sưng vú, dị ứng mẩn ngứa, vết thương (giã đắp). Thân và cành chữa thấp khớp, đau lưng.
Ở Ấn Độ, Đinh lăng được dùng làm thuốc làm săn da và trị sốt rét. Rễ và lá sắc uống
có tác dụng lợi tiểu chữa sỏi thận, sỏi bàng quang, chứng khó tiểu tiện. Bột lá được giã
với muối và đắp trị vết thương (DĐVN IV, 2009; Đỗ Tất Lợi, 2004).
2.1.10.2. Liều dùng
Ngày dùng từ 1 g đến 6 g, dạng thuốc sắc hoặc 2 g trở lên với thuốc tán bột (Dược
Điển Việt Nam IV, 2009).
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu dược lý, Viện y học quân sự Việt Nam năm 1964 cho thí nghiệm dùng trên người với liều 0,23 g đến 0,50 g bột Đinh lăng trong một ngày dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu nhẹ độ (khoảng 30o) thì có kết quả tăng sức dẻo dai của cơ thể như khi nghiên cứu trong qui mô phòng thí nghiệm (Đỗ Tất Lợi, 2004).
23
Một số bài thuốc
Chữa mỏi mệt mỏi, biếng hoạt động
Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 5 g. Thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia
2 – 3 lần uống trong ngày.
Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, ho, đau, tức ngực, nước tiểu vàng
Đinh lăng rễ tươi (rễ, cành) 30 g, lá hoặc vỏ Chanh 10 g, vỏ Quýt 10 g, Sài hồ (rể, lá,
cành) 20 g, lá Tre tươi 20 g, Cam thảo dây hoặc Cam thảo đất 30 g, Rau má tươi 30 g,
Me đất 20 g. Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống 3 lần trong
ngày.
Chữa sưng vú
Cành lá Đinh lăng 30 – 40 g. Thêm 300 ml, sắc còn 200 ml, uống nóng. Ngày uống 1 –
2 lần.
Thuốc lợi sữa
Lá Đinh lăng tươi 50 – 100 g, Bong bóng lợn 1 cái. Băm nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu
cháo ăn.
Chữa đau tử cung
Cành lá Đinh lăng rửa sạch sao vàng, sắc uống thay nước. Đây là kinh nghiệm của Hải
Thượng Lãn Ông.
Chữa mẩn ngứa do dị ứng
Lá Đinh lăng 80 g, sao vàng, sắc uống. Dùng trong 2 - 3 tháng.
Chữa thiếu máu
Rễ Đinh lăng, Hà thủ ô, Thục địa, Hoàng tinh, mỗi vị 100 g, Tam thất 20 g. Tán bột,
sắc uống ngày 100 g.
Chữa viêm gan mạn tính
Rễ Đinh lăng 12 g, Nhân trần 20 g, Ý dĩ 16 g; Chi tử, Hoài sơn, Biển đậu, rễ Cỏ tranh, Xạ tiền tử, Ngũ gia bì, mỗi vị 12 g; Uất kim, Nghệ, Ngưu tất, mỗi vị 8 g. Sắc uống, ngày một thang.
Chữa liệt dương
Rễ Đinh lăng, Hoài sơn, Ý dĩ, Hoàng tinh, Hà thủ ô, Kỳ tử, Long nhãn, Cám nếp, mỗi vị 12 g; Trâu cổ, Cao ban long, mỗi vị 8 g; Sa nhân 6 g. Sắc uống, ngày một thang.
Chữa sốt rét
24
Rễ Đinh lăng, Sài hồ, mỗi vị 20 g; Rau má 16 g; lá Tre, Cam thảo nam, mỗi vị 12 g;
Bán hạ sao vàng 8 g, Gừng 6 g. Sắc uống.
Chữa phong tê thấp, đau xương khớp, đau lưng
Đinh lăng 100 g, thái khúc, sao vàng, sắc uống hằng ngày thay nước.
Phòng tác dụng của thuốc điều trị lao
Lá Đinh lăng sao vàng 20 g - 25 g, hãm uống nước dùng hằng ngày.
Phòng co giật ở trẻ em
Lấy lá Đinh lăng phơi khô rồi lót vào gối hay trải xuống giường cho trẻ em nằm.
(Đỗ Huy Bích, 2006; Quách Tuấn Vinh, 2005; chuthapdo.org.vn; ydvn.net).
2.1.11. Sản phẩm Đinh lăng có mặt trên thị trường
Rượu Đinh lăng
❖ Thành phần
- Rễ Đinh lăng khô khoảng 100 g - 150 g. - 1 lít rượu ngon có độ cồn khoảng 35 - 40o.
❖ Công dụng
- Khí huyết lưu thông, ăn ngon, ngủ yên, tăng cường sinh lực. - Trị đau xương khớp.
Đinh lăng trà TRC
❖ Thành phần
- Đinh lăng......................................1,5 g - Lá Vằng........................................0,2 g - Lá Sen...........................................0,2 g - Cỏ ngọt..........................................0,1 g
❖ Công dụng
- Tăng tuần hoàn não, giảm hội chứng tiền đình, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, ù tai. - Tăng khả năng tập trung, giảm tình trạng căng thẳng thần kinh, mất trí nhớ, run chân tay. ❖ Cách dùng
- Nhúng túi trà vào trong nước sôi, chờ 3 - 5 phút. - Ngày dùng từ 4 - 6 túi (lasen.com.vn).
Trà Đinh lăng
25
❖ Thành phần - Đinh lăng - Cỏ ngọt ❖ Công dụng
- Tăng tuần hoàn não, giảm hội chứng tiền đình: Đau đầu, chóng mặt, ù tai, mất ngủ, mất thăng bằng. - Tăng khả năng tập trung, giảm tình trạng căng thẳng thần kinh, mất trí nhớ, run chân tay. ❖ Cách dùng
- Dùng cho mọi lứa tuổi. - Những túi trà vào ấm nước sôi 150 ml - 200 ml, chờ 2 - 3 phút. Có thể thêm đá theo ý thích (quagac.com).
Hoạt huyết dưỡng não HBN
❖ Thành phần
150 mg
10 mg
vừa đủ 1 viên
- Cao mềm Đinh lăng - Cao lá Bạch quả - Tá dược ❖ Công dụng
- Phòng và điều trị chứng suy giảm trí nhớ, thiếu tuần hoàn não. - Thích hợp cho người làm việc trí óc căng thẳng bị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mệt mỏi. ❖ Cách dùng
- Người lớn: 1 - 2 viên/lần, ngày uống 2 - 3 lần. - Trẻ em trên 6 tuổi: 1 viên/lần, ngày uống 2 lần.
Gối lá Đinh lăng
❖ Thành phần - Lá Đinh lăng. - Vỏ gối. ❖ Công dụng
Gối lá Đinh lăng được làm đúng quy cách tiêu chuẩn sẽ cho bé giấc ngủ ngon, chống mồ hôi trộm, hết tật giật mình, tránh được muỗi và côn trùng.
❖ Cách dùng
Đối với trẻ từ 0 - 24 tháng tuổi nên sử dụng gối size 26 cm x 40 cm. Trẻ trên 24 tháng tuổi nên sử dụng gối size 30 cm x 46 cm (goianhviet.com).
26
Gỏi cá Rượu Đinh lăng
Trà Đinh lăng Đinh lăng trà - TRC
Gối Đinh lăng - Anh Việt Hoạt huyết dưỡng não HBN
Hình 2.10. Sản phẩm Đinh lăng
2.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT
Để khảo sát thành phần hóa thực vật của một loài cây thì các nhà nghiên cứu đã đưa ra quyết định và làm việc trên một loài cây mà tùy vào mục đích lựa chọn trước. Việc lựa chọn này phụ thuộc rất nhiều tài liệu tham khảo và các phương tiện sẵn có hoặc liên kết được của phòng thí nghiệm đó. Các tài liệu tham khảo đó có thể là dữ liệu tin học NAPRALERT cho biết các thông tin về hóa - thực vật, đặc điểm thực vật, hoạt tính sinh học của hợp chất cụ thể, hoặc tất cả các thông tin về vùng địa phương, từng quốc gia (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
27
Trong nghiên cứu và sản xuất dược liệu và các chế phẩm từ Dược liệu, để chiết xuất
và tinh chế các cao chiết Dược liệu; kiểm soát và đảm bảo chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu hay phân lập các chất tinh khiết người ta cần phải biết thành
phần (ở mức độ cao hơn là cấu trúc hóa học) của các chất trong dược liệu đó. Trong sử
dụng Dược liệu, có nhiều trường hợp dược liệu được sử dụng nhiều và có hiệu quả trong điều trị nhưng thành phần hóa học của chúng lại không được biết đầy đủ hay đôi
khi hoàn toàn chưa được nghiên cứu sâu. Ngày nay việc hiểu biết về thành phần hóa
thực vật của các dược liệu càng trở nên quan trọng hơn khi mà tiêu chuẩn hóa Dược
liệu, kiểm soát chất lượng dược liệu và các dạng chế phẩm từ dược liệu có xu hướng là những yêu cầu bắt buộc để đảm bảo tính an toàn, hiệu quả và chất lượng của sản
phẩm cho người sử dụng.
Thành phần hóa học của một dược liệu rất phức tạp và thường không thể được biết
tường tận. Vì thế, thông thường ở mức độ đơn giản nhất, việc nghiên cứu thành phần
hóa học của dược liệu thường được bắt đầu bằng việc xác định các nhóm hợp chất
thường gặp trong thực vật bằng các phản ứng hóa học. Việc xác định này được gọi là
“Phân tích thành phần hóa thực vật”.
Trong phân tích thành phần hóa thực vật, người ta thường sử dụng các phản ứng hóa
học đặc trưng cho một nhóm hợp chất để xác định sự có mặt của nhóm hợp chất này
trong nguyên liệu thực vật. Việc phân tích này được tiến hành theo 2 bước:
Phân tích sơ bộ: Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành một vài phân đoạn đơn giản bằng cách sử dụng các quy trình chiết đơn giản, trong những điều kiện
nhất định (dung môi, pH môi trường v.v…). Định tính nhanh các hợp chất trong các
phân đoạn bằng một số thuốc thử chung.
Định tính xác định: Dùng các quy trình chiết đặc hiệu hơn, nhiều phản ứng đặc hiệu
hơn để xác nhận sự có mặt của nhóm hợp chất.
Không phải tất cả các nhóm hợp chất trong dược liệu đều có thể được định tính. Phân
tích thành phần hóa thực vật chỉ có thể xác định một số nhóm hợp chất phổ biến trong
thực vật.
Ở mức độ cao hơn, việc định tính các nhóm hợp chất bằng các phương pháp khác nhau như: Các phương pháp sắc ký kết hợp với định tính hóa học, kết hợp với phân tích quang phổ cũng có thể được sử dụng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014).
Quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên
liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học (thường được gọi là phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật) dựa trên nguyên tắc:
28
Phân tách hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thành những phân đoạn đơn giản.
Dùng các phản ứng hóa học đặc trưng (thường là các phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch chiết.
Kết quả của các phản ứng đặc trưng, đặc biệt là các phản ứng màu, phụ thuộc nhiều
vào mức độ “tinh khiết” của nhóm chất đó trong môi trường phản ứng. Phản ứng của một hợp chất hay một nhóm hợp chất “tinh khiết” có thể khác biệt nhiều hay ít, đôi khi
khác biệt hoàn toàn với phản ứng của nó trong một hỗn hợp. Trong hỗn hợp, các nhóm
hợp chất ảnh hưởng đến kết quả phản ứng của một nhóm hợp chất khác thường được
xem là các “tạp chất”. Các “tạp chất” này có thể ảnh hưởng đến kết quả định tính theo hai hướng:
- Cản trở phản ứng, làm cho phản ứng khó xảy ra hay không thể xảy ra. - Cản trở việc nhận định kết quả phản ứng do bản thân chúng che lắp kết quả phản ứng hay chúng cũng phản ứng với thuốc thử và tạo ra sản phẩm che lắp kết quả.
Vì thế, việc tách các chất có trong nguyên liệu thực vật thành các phân đoạn có các
thành phần đơn giản trước khi tiến hành định tính là cần thiết để có thể thu được một
kết quả tốt. Trong phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vât, tách các phân đoạn đơn
giản chủ yếu dựa vào tính tan của các nhóm hợp chất trong các môi trường (dung môi,
pH) khác nhau.
Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành các nhóm theo độ phân cực của
chúng. Thông thường chúng được phân thành 3 nhóm:
- Nhóm các chất không hoặc kém phân cực. - Nhóm các chất có độ phân cực trung bình. - Nhóm các chất có độ phân cực mạnh.
Trong một số trường hợp, sự thay đổi mức độ ion hóa của phân tử (dẫn tới thay đổi
tính tan) của một nhóm chất trong môi trường acid hay base cũng được dùng để tách
các phân nhóm.
Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính một hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện. Chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng. Có một số quy trình khác nhau để định tính các nhóm hợp chất thường gặp trong thực vật. Các quy trình khác nhau chủ yếu ở việc sử dụng dung môi để chiết tách hỗn hợp
và số lượng các nhóm hợp chất được định tính.
Một số quy trình phân tích được sử dụng trong sàng lọc các chất vô cơ và hữu cơ đã được sử dụng từ lâu trong các phòng thí nghiệm là quy trình phân tích của Stas - Otto.
29
Quy trình này sử dụng chủ yếu cho các hỗn hợp các chất tổng hợp. Các quy trình phân
tích được sử dụng trong phân tích thành phần hóa học của các thực vật có thể kể là quy trình phân tích của Puri (Hungari), của Schreiber (Đức) và quy trình phân tích của I.
Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) v.v…
Trong các quy trình trên, quy trình phân tích của I. Ciulei (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) thường được dùng vì những ưu điểm của nó so với các quy
trình khác. Nó xác định được nhiều nhóm hợp chất trong nguyên liệu thực vật, cách
thực hiện không quá phức tạp và có thể tiến hành trong một khoảng thời gian ngắn,
với một lượng nguyên liệu nhỏ (khoảng 5 - 25 g). Kết quả có thể cho một khái niệm về thành phần hóa thực vật của một dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014).
2.3. Một số phương pháp chiết tách
Mục đích của việc tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên.
Khảo sát thành phần hóa học của một cây mới, trước đó chưa ai nghiên cứu và xem
những chất này có hoạt tính sinh học. Muốn biết được điều này cần phải cô lập hợp
chất đạt độ tinh khiết > 95 % mới có thể khảo sát cấu trúc hóa học bằng phương pháp
quang phổ hiện đại.
Cần có thêm lượng mẫu một hợp chất đã biết cấu trúc hóa học, muốn khảo sát thêm về
hoạt tính sinh học của chất đó. Nếu việc thử nghiệm cho kết quả hấp dẫn thì sẽ xem
xét có thể tổng hợp hóa học hợp chất đó để có số lượng nhiều hơn.
Tìm hiểu một hợp chất đã biết và xem chất này được sản sinh ra từ bộ phận nào của sinh vật.
Tìm hiểu sự khác biệt của những chất biến dưỡng thứ cấp được sản sinh ra từ cùng
một nguồn tự nhiên nhưng không cùng điều kiện sinh thái: Thí dụ tìm hiểu xem hai
thực vật cùng họ (family), cùng chi (genus), cùng loài (species) nhưng mọc ở hai nơi
có điều kiện khí hậu, đất đai thổ nhưỡng khác nhau có chứa cùng những hợp chất tự
nhiên và những chất này có cùng hàm lượng hay không.
Có nhiều phương pháp để tách chiết, cô lập hợp chất tự nhiên từ cây cỏ: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký gel, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trong hướng hợp chất thiên nhiên, việc cô lập chất phức tạp hơn vì không biết được cây đang khảo sát có chứa các hợp chất với cấu trúc hóa học như thế nào. Biết rằng cây cỏ cần khảo sát có chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì
thế nếu muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì vậy, người ta thường chuẩn bị một loạt các cao chiết có tính phân cực tăng dần, như thế mỗi loại cao chiết chứa tương đối ít
30
hợp chất, giúp cho quá trình cô lập hợp chất tinh chất dễ dàng. Muốn có các loại cao
có độ phân cực khác nhau, sử dụng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc chung là “các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau”: Dung môi không phân
cực hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi có tính phân cực trung bình sẽ
hòa tan các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các
chất. Tùy theo cơ chế và đặc điểm của quá trình chiết mà người ta phân ra:
- Chiết lỏng - lỏng (phân bố lỏng - lỏng) với cơ chế chính là quá trình phân bố của
chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố.
- Chiết rắn - lỏng với cơ chế chính là sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
Trong chiết rắn - lỏng, chất tan có thể đi vào dịch chiết bằng sự hòa tan đơn giản,
nhưng cũng có thể chịu sự tác động bởi nhiều các quá trình khác như khi chiết các chất
tan từ một Dược liệu.
Trong quá trình chiết thông thường, các tiểu phân chất rắn chịu tác động của dung môi
trong điều kiện như nhau. Các chất tan hòa tan trong dung môi thành dung dịch và tạo
nên dịch chiết, sự hòa tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan. Trong quá trình
chiết các chất từ các tổ chức sống (các mô tế bào động, thực vật và vi sinh vật), các
chất nằm bên trong các tế bào, cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì thế các chất
tan sau khi hòa tan thành dung dịch còn phải vượt qua vách tế bào ra khỏi các mô để đi vào dịch chiết. Quá trình chiết các chất tan từ các tổ chức sinh học vì thế thường được
gọi là quá trình “chiết xuất” (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
2.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng
Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi. Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột
cây được tận trích với metanol 80 %, đuổi dung môi thu được alcol thô ban đầu) hoặc
dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập được riêng những hợp chất tinh
khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ eter dầu hỏa…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo…), dung môi
phân cực trung bình (thí dụ như dietyleter, chloroform…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức eter - O -, aldehyd - CH =
31
O, ceton - CO -,…) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ metanol…) hòa tan các hợp
chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức - OH, - COOH …) (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai
pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng,
được biểu diễn bằng hằng số phân bố K.
Ca= Nồng độ của chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng.
K =
Cb= Nồng độ của chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng 𝐶𝑎 𝐶𝑏
Mục đích chính của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ, tinh chế hóa một hợp chất nào đó. Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này có hằng số phân
bố tương đối lớn còn các chất tạp bẩn cũng như các chất khác thì có cấu trúc hóa học
không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết
lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó.
Hằng số của chất tan tương đối ít thay đổi theo nhiệt độ hoặc nồng độ của chất tan đó
có trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên hằng số này thay đổi nhiều tùy thuộc vào dung
môi (độ phân cực, đặc tính ái nước của dung môi) và dung dịch nước. Riêng với dung
dịch nước, pH của dung dịch có những ảnh hưởng rất quan trọng, nhất là ở pH acid
yếu và ở pH base yếu.
Việc chiết lỏng - lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước. Sử dụng các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với
nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước, để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất
có tính phân cực khác nhau. Và còn tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung môi và nước
mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hay ở lớp dưới so với pha nước.
Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi hữu cơ phân cực hơn thí dụ như: Ether dầu hỏa hoặc hexan, ether etyl, chloroform,
ethyl acetat, n-butanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến không còn chất hòa tan vào dung môi thì chuyển sang chiết với dung môi có độ phân cực cao hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan với nước như: Na2SO4, MgSO4, CaSO4,…, loại dung môi (bằng cách cô thu hồi dung môi) và cuối cùng là thu được cao chiết.
Muốn kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn ở lại trong pha nước….thì ta có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM);
32
trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và pha hữu cơ. Sự chiết bởi một
dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Song song
đó, chúng ta cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên
một tấm kiếng sạch, sau khi đuổi bay hết dung môi, thì giọt dung dịch lần thứ n đó không còn để lại vết nào trên tấm kiếng đó.
Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng - lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt
độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi cũng sẽ tăng lên và những nguyên
tắc nêu trên sẽ có nhiều sự thay đổi.
Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở
những lần chiết sau, dung môi trong bình lóng sẽ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong
việc tách pha thành hai lớp. Để khắc phục nhược điểm này, có thể sử dụng các cách
như: dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặc cọ xát nhẹ vào bình chỗ mặt thoáng
của dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí; muối NaCl làm giảm sự hòa tan vào nhau giữa
acetonitril và nước, một lượng tối thiểu khoảng 20 g NaCl được cho vào một lít dung
dịch gồm acetonitril: nước (1 : 1) sẽ làm dung dịch này tách thành 2 lớp; độ hòa tan
của một vài hợp chất thay đổi đáng kể khi có sự hiện diện của nước (Nguyễn Kim Phi
Phụng, 2007).
2.3.2. Kỹ thuật chiết rắn - lỏng
Một số phương pháp chiết rắn - lỏng:
- Kỹ thuật chiết ngấm kiệt. - Kỹ thuật chiết ngâm dầm. - Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Soxhlet. - Kỹ thuật chiết bằng máy chiết Kumagawa. - Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước. - Chiết các nguyên liệu tươi. - Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn.
Kỹ thuật chiết ngấm kiệt.
Ngấm kiệt là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi dịch chiết đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới
nơi có lượng hoạt chất cao hơn.
33
Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt để hơn,
lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn.
Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt v.v… có thể được sử dụng để gia tăng
quá trình chiết.
Quá trình ngấm kiệt được thực hiện trong bình chiết được gọi là bình ngấm kiệt. Hình dạng, cấu tạo và kích thước của bình ngấm kiệt có thể thay đổi tùy theo mục đích sử
dụng nhưng thông thường phần thân chính của bình ngấm kiệt có dạng hình nón cụt có
thể kín và có van điều chỉnh lưu lượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở
cả hai đầu.
Quá trình ngấm kiệt có thể được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Bình được thiết kế với bộ
phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao. Chú ý: Khi
ngấm kiệt ở nhiệt độ cao có thể làm tăng tốc độ chiết nhưng có thể dẫn đến phân hủy
chất dễ chuyển hóa bởi nhiệt.
Có thể thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết trên từng bình ngấm kiệt riêng lẻ hay
kết hợp nhiều bình ngấm kiệt nối tiếp với nhau (ngấm kiệt ngược dòng). Trong ngấm
kiệt ngược dòng, hệ thống được bố trí sao cho dịch chiết loãng của bình chiết trước sẽ
là dung môi đầu cho bình chiết sau và mỗi bình chỉ lấy ra một lượng dịch chiết đậm
đặc nhất định. Với ngấm kiệt ngược dòng, lượng dịch chiết thu được từ mỗi bình luôn
nhỏ hơn nhiều và có nồng độ cao nhất so với ngấm kiệt từng bình riêng lẻ mà vẫn đảm bảo chiết kiệt Dược liệu.
Có 3 phương pháp ngấm kiệt:
- Ngấm kiệt thường. - Ngấm kiệt kèm sấy phun. - Ngấm kiệt ngược dòng.
Ngấm kiệt thường là phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn
kém, phức tạp.
- Dụng cụ:
Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, inox, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết.
- Tiến hành:
34
Dược liệu được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm. Mẫu không nên to hơn vì sẽ chiết
không kiệt, mẫu được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa hoặc có thể trương nở… sẽ cản trở dòng chảy.
Bột dược liệu được làm ẩm với một lượng dung môi chiết với một lượng vừa đủ để
trong khoảng 4 giờ.
Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ. Đậy bề mặt lớp bột đã
làm ẩm bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho
dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi chiết vào bình cho
đến khi dung môi phủ xấp xấp trên lớp mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.
Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ, mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch
chiết chảy ra từng giọt nhanh chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc
dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra
khỏi bình này.
Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung
dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng
hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp
xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi thời điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút
ra khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài
lần để chiết kiệt hoạt chất trong Dược liệu.
Sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt v.v…
có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
❖ Phương pháp ngâm lạnh
Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm bình thường không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. Trong thời gian này, cân bằng về nồng độ hoạt chất giữa bên trong và bên ngoài thành tế bào được thiết lập và quá trình thẩm thấu sẽ kết thúc. Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn,
từ một đến nhiều ngày, tùy theo Dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
❖ Phương pháp ngâm nóng
35
Phương pháp ngâm nóng là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn ở
nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi.
Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng
độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn.
Quá trình hãm trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày (hãm thuốc, hãm trà) chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nước. Chưng cũng có thể coi là một
biến thể của phương pháp này (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa
Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho
phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet thực ra gần với phương pháp ngâm lạnh hơn.
Túi đựng bột dược liệu của kỹ thuật Kumagawa gần nguồn nhiệt hơn.
Chiết hồi lưu với quy mô nhỏ.
Dụng cụ gồm 3 phần chính.
- Bình cầu đun có điều nhiệt.
- Thân Soxhlet.
- Bộ sinh hàn.
Dịch chiết sẽ được thu tại bình cầu đun.
Thời gian chiết 12 – 24 – 36 giờ.
Ưu điểm:
Lượng dung môi sử dụng nhỏ mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất.
Nhược điểm:
Khó thực hiện cho một lượng lớn Dược liệu. Thông thường, chỉ dùng để chiết trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô pilot.
Không khấy trộn được trong quá trình chiết xuất.
Kỹ thuật chiết bằng lôi cuốn theo hơi nước.
Kỹ thuật đặc trưng để chiết ra khỏi cây cỏ các loại hợp chất có tính bay hơi được, ví dụ như tinh dầu.
Chiết các nguyên liệu tươi
36
Với các mô sống của động vật hay các dược liệu mỏng manh như lá, hoa người ta có
thể chiết nhanh các chất trong tế bào với các dung môi nước hoặc thân nước bằng cách xay nhỏ mô động thực vật trong dung môi.
Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh
khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10,000 vòng/ phút) trong một thời gian ngắn khoảng 5 - 10 phút. Với tốc dộ này, các mô được phân tán rất nhỏ, tế bào bị vỡ và các
chất tan đi thẳng từ dịch tế bào vào dịch chiết chủ yếu bằng quá trình hòa tan. Sự thẩm
thấu, nếu có cũng chỉ đóng vai trò thứ yếu.
Với cách chiết này, toàn bộ các chất trong tế bào gồm cả các chất chuyển hóa bậc II lẫn các chất đại phân tử đều có mặt trong dịch chiết. Cách chiết này có lợi khi nghiên
cứu các protein, các chất mà hoạt tính sinh học phụ thuộc vào cấu trúc lập thể thứ các
của phân tử. Trong nghiên cứu Dược liệu, để hạn chế hoạt động của các enzym có thể
làm thay đổi cấu trúc các chất và hạn chế các tạp chất như protein, polysaccharid, dung
môi sử dụng có thể là cồn hay aceton.
Quá trình chiết này do được thực hiện bằng máy khuấy có tốc độ cao nên cũng được
gọi là turbo - extraction (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Các phương pháp chiết khác
Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, trong thực tế người ta còn dùng các kỹ thuật
hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan như chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất
sử dụng vi sóng, chiết dưới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết như chiết chất lỏng siêu tới hạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
37
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Nguyên liệu
- Mẫu cây tươi cả lá, thân, rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms).
- Thân và rễ Đinh lăng dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và chiết phân đoạn.
3.1.2. Hóa chất và dung môi
Ngoài một số dung môi hóa chất cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm, trong phần thực
nghiệm có sử dụng:
- Hóa chất khảo sát vi học: Dung dịch javel 50 %, dung dịch acid acetic 1 %, dung
dịch iod 0,1 % (son phèn), dung dịch carmin 1 %, nước cất.
- Dung môi chiết xuất: EtOH 96 %, MeOH.
- Dung môi dùng trong lắc phân bố, sắc ký lớp mỏng: Diethyl ether, ethyl acetat,
n-butanol.
- Dung môi sắc ký lớp mỏng: Chloroform, methanol, n-hexan, n-butanol, diethyl ether,
ethyl acetat, petroleum ether, benzen.
- SKLM dùng bản silica gel F254 Merck tráng sẵn trên nền nhôm.
- Chất chuẩn: Acid oleanoid chuẩn.
- Phát hiện vết chất: Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm, thuốc thử vanillin
sulfuric (VS), thuốc thử acid sulfuric 10 %/EtOH.
3.1.3. Trang thiết bị
- Bếp cách thủy.
- Bình sắc ký Tây Ban Nha.
- Cân phân tích OHAUS PAJ 2102.
- Cân phân tích 4 số.
- Đèn UV 254 và 365 nm.
- Điện thoại di động SAMSUNG J7 Prime.
- Kính hiển vi OLYMPUS CX22.
- Máy cô quay Shendi RE-52CS-1.
- Máy khuấy EMCLAB OS20-Pro.
- Tủ lạnh SANYO.
38
- Tủ sấy DRYING OVEN.
- Các dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm.
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Thu hái xử lý và bảo quản Đinh lăng 3.2.1.1. Thu hái
Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được thu hái ngày 11/11/2016 tại Tri
Tôn - An Giang, dược liệu thu hái về được PGS.TS. Trần Công Luận định danh và
so sánh với các tài liệu tham khảo xác định được là đúng loài Đinh lăng (Polyscias
fruticosa (L.) Harms) (Đỗ Tất Lợi, 2004; Võ Văn Chi, 2012).
3.2.1.2. Xử lý và bảo quản
Để khảo sát cây khô thì rễ tươi và thân tươi sau khi thu hái được làm sạch và phơi khô ở nhiệt độ phòng hoặc sấy trong tủ sấy ở 60 - 80 oC, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời gay gắt vì tia tử ngoại (UV) có trong ánh sáng mặt trời có thể kích thích
phản ứng hóa học, tạo nên các hợp chất giả tạo. Tiến hành xay thành bột dược liệu để
sử dụng cho nghiên cứu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014).
Để khảo sát cây tươi (khảo sát về đặc điểm vi học), Đinh lăng sau khi được thu hái,
làm sạch thì đem đi khảo sát ngay, tránh để trong thời gian lâu vì sẽ làm mất các tế bào
hay các tế bào sẽ không còn nguyên vẹn,.. chọn mẫu phải chính xác, có tính đại diện,
không quá già không quá non (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM,
2014).
Lưu trữ mẫu: Mẫu được lưu trữ tại Bộ môn dược liệu, Trường Đại Học Tây Đô.
3.2.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học 3.2.2.1. Khảo sát hình thái
Quan sát các đặc điểm hình thái của toàn cây Đinh lăng tươi và mô tả bộ phận dùng
bên ngoài của dược liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng,…(ĐH Y Dược TPHCM, 2014, Phạm Hoàng Hộ, 2003).
3.2.2.2. Khảo sát vi phẫu
Chọn mẫu có tính đại diện, không quá già cũng không quá non. Để quan sát cấu tạo bên trong của những cơ quan thực vật thì nó được thực hiện bằng phương pháp cắt lát mỏng bằng tay và nhuộm hai màu với các cơ quan cắt ra thành từng khoanh (vi phẫu)
trước khi quan sát. Nếu mẫu cắt là lá thì thường lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và một phần cuống lá ở hai bên. Nếu là thân thì thường cắt ở lóng. Nếu là rễ thì cắt ở phần rễ non (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014).
39
Có 2 loại phẫu thức được sử dụng:
Phẫu thức ngang: Lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt.
Phẫu thức dọc: Lát cắt nằm trong mặt phẳng song song với trục mẫu cắt, thường sử
dụng cho thân và rễ để quan sát các ống tiết hay ống nhựa mủ.
Nhuộm mẫu bằng cách nhuộm kép son phèn lục iod:
- Ngâm lát cắt vào dung dịch javel cho đến khi thấy lát cắt trắng, sau đó rửa lại bằng nước cất nhiều lần. - Tiếp theo ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic trong vài phút để loại bỏ hết javel. Rửa lại bằng nước cất. - Ngâm lát cắt vào dung dịch son phèn lục iod cho đến khi lát cắt bắt được màu. Rửa lại nhiều lần bằng nước cất cho đến hết màu. - Vi phẫu sau khi nhuộm xong thì được ngâm trong nước cất.
Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và được ghi nhận lại bằng các
thiết bị điện tử như máy ảnh, điện thoại di động,… (ĐH Y Dược TPHCM, 2014;
Trương Thị Đẹp, 2014).
3.2.2.3. Khảo sát bột Dược liệu
Lấy bộ phận lá, thân, rễ dược liệu Đinh lăng khảo sát (cũng là mẫu dùng cắt vi phẫu) cắt nhỏ, phơi sấy ở nhiệt độ 60 oC (hoặc phơi trong bóng râm) đến khô, xay bột mịn, rây qua rây cỡ 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được đem đi sấy, xay và rây.
Bột dược liệu được quan sát bằng cách: Lấy một lượng nhỏ bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên một phiến kính (lame) rồi nhỏ 1 - 2 giọt nước sau đó khuấy kỹ sau đó
đậy lamelle lại và cuối cùng là soi kính hiển vi bắt đầu bằng vật kính 10X, sau đó với
vật kính 40X.
Trước khi soi kính hiển vi phải quan sát bằng cảm quan để có thêm yếu tố kiểm
nghiệm.
Các cấu tử tìm thấy được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính (ĐH Y Dược
TPHCM, 2014).
3.2.3. Thử tinh khiết 3.2.3.1. Xác định độ ẩm
Phương pháp: Dùng cân phân tích OHAUS PAJ 2102 để tiến hành xác định độ ẩm của
dược liệu.
Độ ẩm dược liệu không quá 13,0 %, tiến hành theo phụ lục 9.6 của DĐVN IV (2009).
40
Cách thực hiện bằng cách trải mỏng khoảng 1,5 g dược liệu đã được nghiền mịn lên
dĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng cân phân tích OHAUS PAJ 2102.
3.2.3.2. Xác định tro toàn phần
- Không quá 8,0 %. - Cách tiến hành: Cân khoảng 2 g dược liệu tiến hành theo phụ lục 9.8, phương pháp của DĐVN IV (2009).
3.2.3.3. Xác định chất chiết được trong dược liệu
- Không được ít hơn 5,0 %. Theo phụ lục 12.10 DĐVN IV. - Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón. Thêm khoảng 50 ml nước cất, đậy kín, cân lại khối lượng, sau đó để yên trong 1 giờ. Đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình ra cân lại khối lượng, dùng nước bổ sung lại khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc thô vào bình lấy khoảng 25 ml vào cốc thủy tinh đã được bì khối lượng cốc. Cô cách thủy đến cắn khô cắn thu được đem sấy ở 105 oC trong 3 giờ lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân nhanh để xác định khối lượng và tính phần trăm chất chiết được.
X % = % b x 20,000 a x (100 − h)
Trong đó:
b: Khối lượng cắn (g).
a: Khối lượng dược liệu cân (g).
h: Độ ẩm (%).
Nghiên cứu về hóa học
Tất cả các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên đều được lấy kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thử độc lập. 3.2.4. 3.2.4.1. Định tính Theo Dược Điển Việt Nam IV (2009).
❖ Bột dược liệu Đinh lăng
Phản ứng tạo bọt và màu
Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt bền trong 10 phút.
Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
- Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ.
41
- Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) Fehling, sau đó đun sôi hiện tủa đỏ gạch.
Lấy một ít bột dược liệu đặt trên khay sứ, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch Lugol (TT) bột chuyển sang màu xanh đen (Dược điển Việt Nam IV, 2009).
❖ Cao Đinh lăng
Phản ứng tạo bọt và màu
Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt
bền trong 10 phút.
Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy
dịch lọc làm các phản ứng sau:
- Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu
đỏ phía trên có màu xanh.
- Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) fehling, sau đó đun sôi hiện tủa đỏ gạch (Dược điển Việt Nam IV, 2009).
Phương pháp Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4):
Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Merck.
Dung môi khai triển: n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5, lớp trên).
Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn.
Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Dung môi khai triển: Chloroform - methanol - nước (65 : 35 : 10; lớp dưới).
Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn.
Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT) và (TT) acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009).
Chấm sắc ký với chất chuẩn Acid oleanolic.
Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat (7 : 3).
Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu, các cao phân đoạn và chất chuẩn acid oleanolic.
42
Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 100 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009).
3.2.4.2. Định tính sơ bộ các nhóm chính trong thân và rễ Đinh lăng
Nguyên tắc: Chiết tách nguyên liệu thành các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với các dung môi: Ether ethylic, ethanol và nước. Thực hiện trên 20 g dược liệu, chiết
phân đoạn thu được 50 ml dịch chiết ether ethylic, 50 ml dịch chiết ethanol, 50 ml dịch
chiết nước. Xác định các nhóm chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học
đặc trưng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014).
43
Mẫu thử
Ether ethylic
Bã Dược liệu Dịch chiết ether
Ethanol / hồi lưu
Bã Dược liệu Dịch chiết cồn
HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether
Nước / cách thủy Dịch chiết cồn thủy phân
Bã Dược liệu Dịch chiết nước
HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether
Dịch chiết nước thủy phân
Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết
44
Bốc hơi đến cắn. Hòa
Flavonoid
Có màu đỏ
tan trong cồn. Làm phản ứng cyanidin
Phản ứng
Anthraquinon
Dung dịch kiềm có màu
Bortrager
đỏ
Bốc hơi trên chén sứ
Tăng cường độ phát
Coumarin
quang khi soi UV
đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi trong
UV
Bốc hơi đến cắn, hòa cắn trong nước acid.
Alkaloid
Có tủa
Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid
Dịch chiết
ether
Lớp phân cách có màu đỏ nâu – tím và vòng màu
Bốc hơi trên chén sứ đến cắn. Làm phản
Triterpenoid
lục hay tím khuếch tán lên
ứng Liebermann- Burchard
Acid sulfuric đặc
Màu lục – xanh dương đậm
Bốc hơi trên chén sứ
Carotenoid
đến cắn
Thuốc thử Carr-Price Màu xanh chuyễn sang đỏ
Tinh dầu
Cắn có mùi thơm
Bốc hơi trên chén sứ. Có mùi thơm, thêm vài giọt cồn, bốc hơi hết cồn
Nhỏ lên giấy
Có vết
Chất béo
trong mờ
mỏng. Bay hơi ether
Hình 3.2. Sơ đồ phân tích các chất trong dịch chiết ether.
45
Có bọt khí
Acid hữu cơ
bay lên
Thêm một ít tinh thể Na2CO3
Hợp chất khử
Có tủa đỏ gạch
Phản ứng với thuốc thử Fehling
Có bọt
Saponin
bền trên 15 phút
Bốc hơi tới cắn. Hòa trong nước, lắc mạnh
Tanin
Xanh rêu-xanh đen với FeCl3 tủa bông với gelatin muối
Phản ứng với dung dịch FeCl3 và dung dịch gelatin muối
Thêm vài giọt
Flav.anthocya
Đỏ với dung dịch acid. Xanh với
Dịch
nin
HCl 10 % và KOH 10 %
dung dịch kiềm
chiết
Có màu
cồn
Flav.Proantho cyanin
đỏ
Đun cách thủy 10 phút với HCl 10 %
Có màu
Làm phản ứng cyanidin
Flavonoid-¥- pyron
đỏ
Bốc hơi đến cắn. Phản
Tím với thuốc thử
Glycosid tim
Raymond- Marthoud, đỏ với
ứng với TT Raymond- Marthoud và Xanthydrol
xanthydrol
Coumarin
Bốc hơi đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi trong UV365
Tăng cường độ phát quang
Có tủa
Alkaloid
Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid
Hình 3.3. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn.
46
Có màu
Flav-¥-pyron
Tím với thuốc thử
Bốc hơi tới cắn, làm phản ứng
Phản ứng cyanidin đỏ
Glycosid tím
Raymond- Marthound
với thuốc thử Raymond-
Marthound
Có
Dịch Dịch chiết chiết
Anthraquinon
Phản ứng Borntrager
màu đỏ
cồn ether
Bốc hơi tới cắn.
Tăng cường độ phát
Nhỏ dung dịch
Coumarin
quang trong UV
Bốc hơi tới
kiềm 10 % soi trong UV365
Triterpenoid
cắn. Làm phản ứng
Có màu đỏ nâu- tím.Màu xanh lục hay màu tím
Liebermann- Burchard
khuếch tán lên từ lớp phân cách
Hình 3.4. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn thủy phân.
47
Có tủa
Pha loãng trong 5 % thể tích cồn 95
Polyuronid
bông trắng
% hay aceton
Có tủa
Hợp chất
Làm phản ứng với thuốc thử Fehling
đỏ gạch
khử
Có bọt khí
bay lên
Acid hữu cơ
Thêm một ít tinh thể Na2CO3
Có bọt bền
Bốc hơi tới cắn, hòa trong cồn 25 %. Pha
Saponin
trong 15 phút
Tanin
Xanh rêu-xanh đen với FeCl3, tủa bông trắng ngà với
loãng với nước, lắc mạnh Phản ứng với dung dịch FeCl3 và gelatin-muối
gelatin-muối
Dịch
Đỏ trong môi
chiết
Thêm vài giọt HCl 10 % và
nước
Fla.Antho cyanidin
KOH 10 %
trường acid, xanh trong
kiềm
Có màu
Flav.Proa
đỏ
nthocyani din
Đun cách thủy 10 phút với HCl 10% Bốc hơi tới cắn,
Có màu đỏ
Flavonoid -¥-pyron
hòa lại trong cồn 25 %.Làm phản ứng
cyanidin
Tím với
Bốc hơi tới cắn. Làm phản ứng với TT
Glycosid tim
Raymond- Marthound đỏ
Raymond-Marthound và xanhthydrol
Làm phản ứng với TT
Alkaloid
chung alkaloid
mận với xanhthydrol Có tủa
Hình 3.5. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nước.
48
Phản ứng
Có màu
Flavonoid.¥ -
cyanidin
pyron
Bốc hơi tới cắn,
đỏ
làm phản ứng Raymond-
Marthoud
Glycosid tim Có màu tím
Dịch Dịch
Có
chiết nước chiết ether
Anthraquinon
Phản ứng Borntrager
màu đỏ
Bốc hơi tới
Có màu đỏ nâu – tím. Màu xanh lục
Triterpenoid
cắn, làm phản ứng
hay tím khuếch tán từ lên từ lớp
Liebermann
phân cách
Hình 3.6. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết nước thủy phân.
3.2.4.3. Chiết xuất và tách phân đoạn
Quy trình chiết xuất phân đoạn rễ Đinh lăng
Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 96 %.
dược liệu sau khi được phơi sấy và xay nhỏ, đem đi làm ẩm bằng ethanol 96 % trong
khoảng 2 - 4 giờ. Sau đó dược liệu được cho vào bình ngấm kiệt và cho dung môi chiết
ethanol 96 % vào bình ngấm kiệt cách mặt dược liệu từ 2 - 3 cm. Dược liệu được ngăn
lại bằng giấy lọc để không để dược liệu nổi trên bề mặt. Bình ngấm kiệt được ngấm
kiệt trong vòng 12 - 24 giờ. Dịch chiết được rút với tốc độ 5 ml/phút, chiết kiệt đến khi dịch chiết không còn vết trên bản mỏng (kiểm tra sắc ký lớp mỏng với thuốc thử
H2SO4/EtOH 20 %) hoặc được kiểm tra bằng cách nhỏ vài giọt dịch chiết từ bình ngấm kiệt lên lame rồi để cho khô tự nhiên, nếu không còn vết trên lame thì tức là dịch chiết đã được chiết kiệt.
Gộp tất cả dịch chiết từ bình ngấm kiệt lại, trộn đều, cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay trong điều kiện áp suất giảm ở nhiệt độ khoảng 60 oC để đuổi hết ethanol ta thu được cao toàn phần.
Cao được bảo quản trong chai kín, dán nhãn cụ thể.
49
- Dụng cụ chiết xuất: Gồm bình ngấm kiệt hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. - Thực hành: Bột rễ Đinh lăng và thân Đinh lăng được xay thô và được rây qua lỗ rây 3 mm. Mẫu dược liệu không nên to hơn 3 mm vì sẽ khó chiết kiệt được dược liệu, mẫu dược liệu cũng không được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa
hoặc có thể trương nở… sẽ cản trở dòng chảy có thể gây ra hiện tượng nghẹt (tắt)
van của bình ngấm kiệt. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông và một tấm
lưới. Bột rễ và thân được đặt vào bình, lên trên lớp lưới, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để
cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần thiết vào
bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp trên lớp mặt cách bề mặt dược liệu khoảng
2 - 3 cm. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.
Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ, mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt thu được dịch chiết từ bình ngấm kiệt cô dịch chiết thu được cao toàn phần của Dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Nguyễn Kim Phi
Phụng, 2007).
Phân tách cao toàn phần thành các phân đoạn bằng kỹ thuật lỏng - lỏng
Cao toàn phần được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc phần dịch này
lần lượt với các dung môi sau: Diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol. Các phân đoạn thu được đem cô dưới áp suất giảm tới cao đặc bằng máy cô quay thu hồi dung môi.
50
Bột dược liệu
Chiết ngấm kiệt với EtOH 96 %
Bã dược liệu
Dịch chiết cồn
Cô quay
Cao cồn
Hòa với nước
Dịch nước
Lắc với diethyl ether
Dịch nước
Dịch diethyl ether
Lắc với ethyl acetat
Cô quay
Dịch nước
Dịch ethyl acetat
Cao diethyl ether
Lắc với n-butanol
Cô quay
Dịch nước
Cao ethyl acetat
Dịch n-butanol
Cô cách thủy
Cô quay
Cao n-butanol
Cao nước
Hình 3.7. Sơ đồ tách chiết phân đoạn
51
3.2.4.4. Thăm dò hệ sắc ký các cao phân đoạn
Sắc ký lớp mỏng cao Diethyl ether
Tiến hành : Sắc ký lớp mỏng trên cao diethyl ether với các hệ dung môi:
S1= N-hexan - ethyl acetat (4 : 1). S2= Petroleum ether – diethyl ether (2 : 1).
S3= Benzen - chloroform (10 : 1).
Sắc ký lớp mỏng cao Ethyl acetat
Tiến hành: Sắc ký lớp mỏng trên cao ethyl acetat với các hệ dung môi:
S1= Chloroform – methanol (95 : 5). S2= N-hexan – ethyl acetat (1 : 1).
S3= Petroleum ether - diethyl ether (3 : 7).
Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol
Tiến hành: Sắc ký lớp mỏng trên cao n-butanol với các hệ dung môi:
S1= Chloroform – methanol (9 : 1). S2= Chloroform (100 %).
S3= Chloroform – methanol (8 : 2).
52
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. THỰC VẬT HỌC 4.1.1. Đặc điểm hình thái
Tiến hành theo mục 3.2.2.1. thì thu được một số kết quả như sau:
Hình 4.1. Toàn cây và lá Đinh lăng
53
Hình 4.2. Hình thái bên ngoài của lá Đinh lăng
Cây nhỏ dạng bụi, cao từ 0,5 - 2 m. Thân nhẵn màu vàng nâu, ít phân nhánh. Lá màu xanh lục sáng, gân lá màu vàng nhạt, cuống lá màu nâu sáng. Lá kép mọc so le (bề rộng của lá 1,2 cm, bề dài của lá khoảng 3,8 cm) có bẹ, phiến lá xẻ 3 lần lông chim, mép có răng cưa không đều, chóp nhọn, lá chét và các đoạn đều có cuống, cuống lá dài phát triển to thành bẹ lá. Lá có mùi thơm nhẹ khi vò nát. Lá Đinh lăng được mô tả phù hợp với mô tả của Võ Văn Chi (2012).
54
‘
Hình 4.3. Cụm hoa Đinh lăng
55
Hình 4.4. Hình thái bên ngoài hoa Đinh lăng
Cụm hoa mọc ở ngọn thành hình chùy ngắn mang nhiều tán; hoa rất dễ rụng; hoa nhỏ,
màu lục nhạt hoặc trắng xám, mép uốn lượn; tràng 5 cánh trái xoan; nhị 5, chỉ nhị
ngắn; quả màu nâu đen (dài khoảng 1 cm). Chiều dài của hoa chưa nở khoảng 0,6 cm,
chiều ngang khoảng 0,3 cm. Cụm hoa chưa nở có màu xanh nhạt kèm nâu. Các hoa
đơn lẻ cụm lại thành cụm hoa tròn đều. Các mô tả phù hợp với mô tả của Phạm Hoàng
Hộ (2003).
56
Hình 4.5. Hình toàn cây và thân Đinh lăng
Hình 4.6. Hình đường kính thân Đinh lăng
Thân Đinh lăng màu vàng nhạt hay nâu rất nhạt, da sần sùi, kích thước của thân tùy thuộc vào số năm mà cây được trồng. Thân cây trồng khoảng được 3 năm có đường kính thân khoảng 1 cm, chiều dài thân cây khoảng 0,5 - 1 m. Tùy vào vị trí thân cây mà có kích thước khác nhau. Thân cây ở gần gốc cây (rễ) có bán kính lớn hơn so với các thân cây ở gần ngọn Mô tả thân Đinh lăng phù hợp với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003).
57
Hình 4.7. Hình hình thái bên ngoài rễ Đinh lăng
58
Hình 4.8. Hình thái bên ngoài rễ chính và rễ con Đinh lăng
Rễ cong queo có màu vàng nhạt, vàng hay mà nâu nhạt, thường được thái thành các lát
mỏng, mặt cắt ngang màu vàng nhạt. Mặt ngoài màu trắng xám có nhiều vết nhăn dọc, nhiều lỗ vỏ nằm ngang và vết tích của các rễ con. Rễ khoảng 3 năm tuổi có đường kính rễ chính khoảng 8 cm, các rễ con có đường kính khoảng 3 - 4 cm Mô tả hình thái rễ Đinh lăng tại Tri Tôn - An Giang phù hợp với hình thái mô tả của Phạm Hoàng
Hộ (2003) và DĐVN (2009).
Nhận xét:
- Mẫu Đinh lăng trồng tại An Giang về mặt thực vật học tương tự với miêu tả trong Dược điển Việt Nam IV. - Đường kính và chiều dài của rễ Đinh lăng thì tương đối đồng đều với đường kính và chiều dài của Đinh lăng được mô tả trong Dược điển Việt Nam IV.
4.1.2. Đặc điểm vi phẫu
Theo mục 3.2.2.2. khảo sát các đặc điểm về vi phẫu của các bộ phận cây Đinh lăng.
Vi phẫu lá Đinh lăng
Gân giữa: Lồi ở 2 mặt. Biểu bì tế bào hình chữ nhật không đều, kích thước gần tương đương ở 2 biểu bì trên và dưới, cutin mỏng. Mô dày góc 2 - 3 lớp tế bào đa giác kích
thước đều nhau. Mô mềm đạo nhiều lớp tế bào đa giác tròn hoặc gần tròn, kích thước không đều. Bó dẫn xếp hình cung với gỗ ở trên libe ở dưới. Libe xếp thành cụm nhỏ. Mạch gỗ xếp thành dãy 3 - 5 mạch xen kẽ mô mềm gỗ vách cellulose. Túi tiết ly bào kích thước khác nhau nhiều trong vùng mô mềm đạo.
Phiến lá: Biểu bì tế bào hình chữ nhật, biểu bì trên kích thước lớn hơn biểu bì dưới, cutin mỏng, lỗ khí ở biểu bì dưới. Mô mềm khuyết 6 - 7 lớp tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, chứa lục lạp. Bó dẫn phụ rải rác gỗ ở trên, libe ở dưới.
59
Biểu bì trên Mô dày
Mô mềm đạo
Tinh thể calci oxalat Gỗ Libe Mô mềm tủy Túi tiết Mô dày góc Biểu bì dưới
Hình 4.9. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 10X
Tế bào khí khổng dị bào Vách tế bào
Cutin lồi Tinh thể calci oxalat Túi tiết
Hình 4.10. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 40X
60
Vi phẫu cuống lá
Vi phẫu tiết diện gần tròn một đầu bằng. Lớp biểu bì hơi dợn sóng, tế bào hình chữ nhật, kích thước lớn hơn tế bào mô dày, đều. Mô dày 2-4 lớp tế bào đa giác gần tròn,
kích thước không đều. Mô mềm vỏ đạo nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước lớn hơn tế
bào mô dày, không đều, xếp lộn xộn. Nhiều bó libe gỗ xếp thành vòng không liên tục, libe ở ngoài gỗ ở trong. Gỗ và libe có cấu tạo cấp 2. Libe xếp thành từng cụm nhiều
lớp tế bào đa giác, kích thước không đều, xếp thành dãy xuyên tâm; mô mềm gỗ tế bào
đa giác xếp thành dãy. Mô mềm tủy đạo tế bào hình đa giác hoặc đa giác gần tròn,
kích thước không đều, 2-4 lớp tế bào dưới gỗ vách tẩm chất gỗ mỏng.
Biểu bì Mô dày Mô mềm vỏ Tinh thể calci oxalat Libe
Mô mềm tủy
Gỗ 1
Gỗ 2
Hình 4.11. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 10X
61
Tế bào biểu bì Gỗ 1
Gỗ 2
Mô dày góc
Mô mềm tủy
Hình 4.12. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 40X
Nhận xét: Mô tả đặc điểm vi phẫu của cuống lá Đinh lăng có những đặc điểm về mô dày gốc, mô gỗ, mô libe, tế bào biểu bì, mô mềm tủy, tinh thể calxi oxalat,… giống
với những mô tả về cấu tạo các mô, vị trí sắp xếp,…cấu tạo cấp 2 của ngành Ngọc lan
(Trương Thị Đẹp, 2014).
Vi phẫu thân Đinh lăng
Vi phẫu tiết diện tròn. Các mô gồm: Biểu bì hóa mô cứng bên ngoài bần, bị bong ra ở
lỗ vỏ. Bần nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, kích thước không đều, vách mỏng uốn lượn,
xếp xuyên tâm. Mô dày góc nhiều lớp tế bào đa giác tròn, kích thước không đều. Mô
mềm vỏ đạo nhiều lớp tế bào hình đa giác hay bầu dục kích thước không đều, một số
tế bào vách uốn lượn. Libe tế bào hình đa giác, vách uốn lượn, xếp thành cụm dẹt, kích
thước không đều, vách hơi uốn lượn. Gỗ liên tục, dày gấp 3-4 lần libe; mạch gỗ hình
đa giác, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ tế
bào đa giác, kích thước nhỏ. Tia tủy hẹp 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật có tinh bột rất
nhiều. Mô mềm tủy đạo tế bào đa giác kích thước không đều. Tinh thể calci oxalat
hình cầu gai rải rác trong mô mềm vỏ. Đặc điểm vi phẫu cho thấy đối tượng nghiên
cứu ở An Giang có những đặc điểm về vi phẫu của thân giống với những miêu tả các
tế bào của Dược điển Việt Nam IV (2009) và mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003).
62
Bần
Biểu bì
Tinh thể calci oxalat
Mô dày
Mô mềm vỏ
Libe
Gỗ 1
Gỗ 2
Hình 4.13. Vi phẫu thân Đinh lăng vật kính 10X
Vi phẫu rễ Đinh lăng
Vi phẫu tiết diện gần tròn. Các mô gồm: Bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, vách
mỏng uốn lượn xếp xuyên tâm, bong tróc rất nhiều. Mô mềm vỏ nhiều lớp tế bào đa
giác, kích thước khác nhau, vách uốn lượn. Libe gỗ: Libe tế bào đa giác vách uốn lượn
dày mỏng xen kẽ nhau thành tầng. Gỗ chiếm tâm không liên tục; mạch gỗ tế bào đa
giác tròn, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ tế
bào đa giác, vách cellulose. Gỗ thường chiếm phần lớn diện tích của vi phẫu, rễ càng
già thì phần gỗ càng nhiều. Tia tủy 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật. Tinh thể calci oxalat
hình cầu gai nhiều trong mô mềm vỏ.
63
Bần
Mô mềm vỏ
Libe 1
Libe 2
Tia tủy
Gỗ
Hình 4.14. Hình vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 10X
Vùng gỗ Toàn thân Đinh lăng
64
Tia gỗ Túi tiết ly bào
Lớp bần Lông hút
Hình 4.15. Vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 40X
Nhận xét: Những mô tả về đặc điểm của các mô, các tế bào, lông hút, kích thước túi
tiết,..giống với những mô tả của Dược Điển Việt Nam IV (2009). 4.1.3. Đặc điểm bột Dược liệu
Soi bột lá Đinh lăng
Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột lá Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột lá
Đinh lăng màu xanh, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt, hơi hăng.
Soi dưới kính hiển vi thấy:
65
Hình 4.16. Bột lá Đinh lăng soi vi phẫu
- Nhiều hạt tinh bột hình chuông, hình đa giác, đường kính từ 10 - 20 µm nằm
riêng lẻ, hạt tinh bột kép 2, 3, 4 hay tụ tập thành khối.
- Tinh thể calcioxalat hình khối, hình sao. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn.
Sợi kèm tinh thể Lông đơn bào
Tinh thể calci oxalat hình cầu gai
Tinh thể calci oxalat Hạt tinh bột hình chuông Mạch mạng
hình khối
66
Mạch điểm Khối nhựa mang màu Mảnh mô mềm
Hình 4.17. Soi bột lá Đinh lăng vật kính 40X
Soi bột thân Đinh lăng
Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột thân Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột
thân Đinh lăng màu vàng nhạt, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt.
.
Hình 4.18. Bột thân Đinh lăng soi bột
Soi dưới kính hiển vi thấy:
- Tinh thể calcioxalat hình khối. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. - Mạch điểm. - Khối tinh bột.
67
Tinh thể calci oxalat Khối nhựa mang màu Mảnh mô mềm
Mạch mạng Mạch xoắn Lông đa bào
Mạch điểm Lông đơn bào Khối tinh bột
Hình 4.19. Soi bột thân Đinh lăng vật kính 40X
Soi bột rễ Đinh lăng
Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột rễ Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột rễ
Đinh lăng màu vàng nhạt, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt.
Hình 4.20. Bột rễ Đinh lăng
68
Mạch mạng Mạch xoắn Mạch điểm
Sợi kèm tinh thể Mảnh mô mềm Hạt tinh bột
Bó sợi Sợi mô cứng Mạch vạch
Hình 4.21. Soi bột rễ Đinh lăng vật kính 40X
Soi dưới kính hiển vi thấy:
- Tinh thể calci oxalat hình khối. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. - Mạch điểm.
69
- Khối tinh bột. - Sợi kèm tinh thể. - Bó sợi. - Sợi mô cứng.
Nhận xét: Các đặc điểm cấu tử soi bột Đinh lăng cho thấy giống với những mô tả
của Dược Điển Việt Nam IV (2009). 4.2. THỬ TINH KHIẾT 4.2.1. Độ ẩm
❖ Độ ẩm bột dược liệu
Theo mục 3.2.3.1. Kết quả cho thấy bột dược liệu Đinh lăng có độ ẩm đạt theo tiêu
chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (≤ 13,0 %).
Bảng 4.1. Độ ẩm bột dược liệu Đinh lăng
Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Thân Đinh lăng 5,0 % 5,8 % 6,2 % 5,7 %
Rễ Đinh lăng 5,2 % 6,4 % 7,9 % 6,5 %
Nhận xét: Độ ẩm dược liệu đạt với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2009) chuyên
luận Đinh lăng. Độ ẩm của thân và rễ chênh lệch không cao, nằm trong khoảng từ 5,5 -
6,5 %.
❖ Độ ẩm cao Đinh lăng
Theo mục 3.2.3.1. Kết quả cho thấy cao Đinh lăng có độ ẩm đạt theo tiêu chuẩn của
Dược điển Việt Nam IV phụ lục 1.1, độ ẩm cao đặc không được quá 20,0 %.
Bảng 4.2. Độ ẩm cao toàn phần Đinh lăng
Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Thân Đinh lăng 3,2 % 3,5 % 6,9 % 4,5 %
Rễ Đinh lăng 0,4 % 0,5 % 0,7 % 0,5 %
Nhận xét: Độ ẩm dược liệu đạt với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV chuyên luận Đinh lăng.
70
4.2.2. Xác định độ tro
Theo mục số 3.2.3.2. Kết quả cho thấy độ tro đo được đạt tiêu chuẩn so với tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (không quá 8,0 %).
Bảng 4.3. Tiêu chuẩn độ tro của Dược liệu
Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Thân Đinh lăng 0,7 % 1,1 % 0,9 % 0,9 %
Rễ Đinh lăng 0,4 % 0,7 % 0,3 % 0,5 %
Nhận xét: Tro toàn phần của thân và rễ Đinh lăng nằm trong khoảng 0,5 - 0,9 %.
Dược liệu khô đạt tiêu chuẩn tro toàn phần theo DDVN IV chuyên luận Đinh lăng.
4.2.3. Xác định chất chiết được trong dược liệu
Bảng 4.4. Chất chiết được trong dược liệu
Trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Dược liệu
17,9 % 17,9 % 16,8 % 18,9 % Thân Đinh lăng
20,5 % 21,2 % 21,4 % 18, 8 % Rễ Đinh lăng
Nhận xét: Chất chiết được trong thân và rễ Đinh lăng nằm trong khoảng 17 - 20 %.
Dược liệu khô đạt tiêu chuẩn chất chiết được theo tiêu chuẩn DĐVN IV
chuyên luận cây Đinh lăng. 4.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ TÁCH PHÂN ĐOẠN 4.3.1. Định tính
❖ Định tính trên bột dược liệu
Phản ứng tạo bọt
Nhận xét: Dịch nước Đinh lăng tạo bọt và cột bọt bền sau 10 phút. Trong khoảng thời gian từ 0 đến 2 phút bọt saponin đạt 0,7 cm, thời gian từ 2 phút đến 5 phút thì bọt saponin đạt 0,5 cm và sau 10 phút bọt đạt 0,3 cm. Sau thời gian 10 phút bọt vẫn bền Chứng tỏ dược liệu Đinh lăng có saponin. Đạt theo mô tả của DĐVN IV (2009).
71
Phản ứng tạo màu
Nhận xét: Khi cho từ từ acid sulfuric (TT) vào thành ống nghiệm chứa hỗn hợp dịch lọc và anhydrid acetic (TT) thì tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ Đạt theo tiêu chuẩn của DĐVN IV chuyên luận Đinh lăng.
Và khi cho thuốc thử Fehling vào dịch lọc đun sôi thì xuất hiện tủa đỏ gạch Đạt theo mô tả của DĐVN IV.
Khi cho thuốc thử Lugol vào bột dược liệu thì không xuất hiện màu xanh đen Đạt theo mô tả của DĐVN IV.
Nhận xét: Tất cả các phản ứng định tính trên bột dược liệu theo tiêu chuẩn của DĐVN IV chuyên luận Đinh lăng đều đạt Chứng tỏ Đinh lăng được trồng tại An Giang đạt theo tiêu chuẩn DĐVN IV.
❖ Định tính trên cao Đinh lăng
Tiến hành theo mục 3.2.4.4. thu được kết quả như sau:
Phản ứng tạo bọt:
Nhận xét: Dịch lọc A tạo bọt và cột bọt bền sau 10 phút. Trong khoảng thời gian từ 0
đến 5 phút bọt saponin đạt 1cm, thời gian từ 5 phút đến 10 phút thì bọt saponin đạt 0,8 cm. Sau thời gian 10 phút bọt vẫn bền Chứng tỏ dược liệu Đinh lăng có saponin. Đạt theo mô tả của DĐVN IV (2009).
Phản ứng tạo màu:
Nhận xét: Khi cho từ từ acid sulfuric (TT) vào thành ống nghiệm chứa hỗn hợp dịch chiết chloroform và anhydrid acetic (TT) thì có xuất hiện vòng màu hồng đến tím đậm
giữa 2 lớp dung dịch. Đạt theo mô tả của bản bổ sung DĐVN IV.
Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4):
Bản mỏng: Silica gel 60 F254.
Dung môi khai triển: n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5)
Mẫu thử: Các cao toàn phần và phân đoạn
Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
72
Soi đèn UV 254 nm Soi đèn UV 365 nm
Sau khi nhúng thuốc thử Acid sulfuric 10%
Hình 4.22. Định tính cao rễ bằng hệ n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5)
Nhận xét: Các vết tách rõ nhưng do trong rễ Đinh lăng có nhiều đường nên còn kéo vệt ở phía dưới bản mỏng. Sau khi nhúng thuốc thử các vết có màu tím nhạt hơi hồng chứng tỏ các cao phân đoạn có chứa hàm lượng saponin.
Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH - H2O (65 : 35 : 10; lớp dưới)
Mẫu thử: cao toàn phần và các cao phân đoạn.
73
Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT) và (TT) acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
UV 254 nm UV 365 nm
Vanilin sulfuric (TT) Acid sulfuric 10%/ cồn
Hình 4.24. Định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng
Nhận xét: Sau khi nhúng thuốc thử các vết hiện màu tím nhạt. Chứng tỏ trong cao toàn phần, cao các phân đoạn có saponin, terpenoid hiện diện. Nhưng do trong rễ Đinh lăng có nhiều đường nên còn kéo vệt ở phía dưới bản mỏng.
Chấm sắc ký với chất chuẩn Acid oleanolic.
Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (7 : 3).
74
Mẫu thử: cáo toàn phần, cao phân đoạn và acid chuẩn oleanolic
Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 100 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm
Sau khi nhúng (TT) Acid sulfuric 10%
Hình 4.23. Định tính cao rễ bằng hệ Toluen - ethyl acetat (7 : 3)
Nhận xét: Sau khi chấm SKLM với acid aloeanolic chuẩn thì phát hiện trong cao tổng rễ, phân đoạn Et2O, phân đoạn EtOAc đều có hiện diện của acid chuẩn, có khoảng Rf giống nhau. Nhưng do hàm lượng ít hơn so với chất chuẩn nên các vết không được rõ nét so với chất chuẩn.
75
Định tính saponin thân Đinh lăng bằng sắc kí lớp mỏng
Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH - H2O (65 : 35 : 10; lớp dưới)
Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
UV 365 nm vanilin sulfuric UV 245 nm
Hình 4.25. Định tính saponin thân Đinh lăng bằng SKLM
Nhận xét: Thân Đinh lăng có chứa saponin như rễ Đinh lăng. Các vết của thân tương tự như rễ Đinh lăng Chứng tỏ thành phần saponin gần giống nhau.
4.3.2. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng Xác định các nhóm hợp chất sau:
6. Coumarin 1. Chất béo 11. Triterpenoid thủy phân
2. Carotenoid 7. Anthraquion 12. Saponin
3. Tinh dầu 8. Flavonoid 13. Acid hữu cơ
4. Triterpenoid tự do 9. Glycosid tim 14. Chất khử
5. Alkaloid 10. Tanin 15. Hợp chất polyuronid
76
Bảng 4.5. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng
Kết quả định tính chung Đinh lăng
Nhóm hợp chất
Thuốc thử
Thân
Rễ
Chất béo
Nhỏ dd lên giấy
+
+
Carotenoid
Carr-price
-
-
-
-
H2SO4
Tinh dầu
Bốc hơi tới cắn
+
++
Triterpenoid tự do
++
++
Liebermann- Burchard
Alkaloid
+
++
Thuốc thử chung Alkaloid
Coumarin
++
++
Phát quang trong kiềm
Antraglycosid
KOH 10 %
+
+
Flavonoid
Mg/ HClđđ
+
+
Glycosid tim
TT vòng lacton
+
+
TT đường 2-
+
+
desoxy
Anthocyanosid
HCl/ KOH
+
+
Pro- anthocyanidin
HCl/ to
+
+
Polyphenol
+
-
DD FeCl3
+
Tanin
DD gelatin muối
+
Saponin
TT Liebermann
++
+++
77
Lắc với dd nước
++++
++++
Acid hữu cơ
++
++
Na2CO3
Chất khử
TT Fehling
++
++
loãng với
Hợp chất Polyuronic
++
+
Pha cồn 90 %
(+): Có ít.
(++): Có.
(+++): Có nhiều.
(++++): Có rất nhiều.
Chú thích: (-): Âm tính. (±): Không rõ.
Nhận xét: Sau khi tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất thì thu được các nhóm hợp
cơ, glycosid tim... Trong đó hợp chất saponin chiếm hàm lượng nhiều nhất. So sánh thành phần hóa học giữa thân và rễ Đinh lăng cho thấy thành phần hóa học giữa thân
chất như: Saponin, flavonoid, alkaloid, tanin, coumarin, chất béo, tinh dầu, các acid hữu
và rễ là như nhau. Song song đó, chúng cũng có sự khác biệt nhưng không đáng kể.
Thành phần hóa học trong khóa luận này khảo sát giống với khảo sát của Dược Điển
Việt Nam IV (2009) và trong các khảo sát trước đó. Như vậy thành phần hóa học của
cây Đinh lăng trồng tại Tri Tôn - An Giang phù hợp với các nghiên cứu trước đó.
4.3.3. Chiết xuất
Rễ Đinh lăng
(9,3 kg)
Ngấm kiệt với cồn 96 %
Dịch chiết cồn
(137 670 ml)
Cô quay
Cao cồn
(1,75 kg)
Tiến hành theo mục 3.2.4.3. thu được kết quả như sau:
78
Hình 4.26. Sơ đồ chiết xuất rễ Đinh lăng
Từ 9,3 kg dược liệu rễ Đinh lăng ban đầu bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 96 % thu được 137 670 lít dịch chiết (tổng lượng dung môi cồn 96 % là 178 275 ml), cô dịch
chiết dưới áp suất giảm thu được 1750 g cao chiết toàn phần (độ ẩm 0,5 %), quy về
cao khô được 1741 g (hiệu suất chiết được là 18,7 %).
4.3.4. Tách phân đoạn bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
Tiến hành theo mục 3.2.4.3. 1,75 kg cao toàn phần được hòa với lượng nước tối thiểu và được lắc lần lượt với các dung môi: Et2O, EtOAc, n-BuOH. Các phân đoạn thu được cô dưới áp suất giảm thu được kết quả như sau:
Bảng 4.6. Khối lượng và độ ẩm các cao phân đoạn trong cao rễ
Phân đoạn Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%) Độ ẩm cao (%)
300 14,9 13 Et2O
EtOAc 30 1,7 1,7
n-BuOH 405 22,8 1,65
Nước 800 42,0 8,1
79
Cao rễ TP (1,75 kg)
Cô quay
Et2O 79 lít
Dịch nước
Cao Et2O (300 g)
Cô quay
EtOAc 52 lít EtOAc 52 lít
Dịch nước
Cao EtOAc (30 g)
Cô quay
n-BuOH 82 lít
Cao n-BuOH (405 g)
Dịch nước
Cô quay
Cao nước (800 g)
Hình 4.27. Sơ đồ tách phân đoạn
4.4. THĂM DÒ HỆ DUNG MÔI 4.4.1. Sắc ký lớp mỏng cao diethyl ether
Theo mục số 3.2.4.4. cao diethyl ether được tiến hành SKLM để chọn ra hệ sắc ký hợp lý cho việc tiến hành lên cột phân lập các hợp chất. Cao Et2O sau khi được tham khảo
một số tài liệu thì được tiến hành dò trên 3 hệ dung môi:
S1: N-hexan - ethyl acetat (4 : 1) S2: Petroleum ether – diethyl ether ( 2 : 1)
S3: Benzen - chloroform (10 : 1)
80
Nhúng thuốc thử UV 365 nm UV 254 nm
(TT) acid sulfuric 10%/cồn
Hình 4.28. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S1
UV 254 nm UV 365 nm
Hình 4.29. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S2
81
(TT) acid sulfuric 10%/cồn
UV 254 nm UV 365 nm
Hình 4.30. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S3
Nhận xét:
Qua 3 hệ dung môi khảo sát thì chọn được hệ dung môi S1= n-hexan - ethyl acetat
(4 : 1) để tiến hành sắc ký cột để phân lập các chất vì khi soi UV 254 nm và UV 365
nm thì bản mỏng hiện 1 vết nằm trong khoảng Rf (0,25 - 0,35), sau khi nhúng thuốc
thử các vết tách đều, không kéo vệt, vết gọn,.. Không chọn hệ S2 và S3 vì bản mỏng kéo vệt, vết bị kéo, các vết nằm gần nhau, không tách rõ khó tách được các chất.
4.4.2. Sắc ký lớp mỏng cao ethyl acetat
Theo mục số 3.2.4.4. tiến hành SKLM trên cao ethyl acetat để lựa chọn ra hệ sắc ký
thích hợp cho việc tiến hành phân lập hợp chất từ cao. Cao EtOAc sau khi được tham
khảo một số tài liệu thì được tiến hành thăm dò trên 3 hệ dung môi:
S1: Chloroform - methanol (95 : 5) S2: N-hexan - ethyl acetat (1 : 1)
S3: Petroleum ether - diethyl ether (3 : 7)
82
(TT) acid sulfuric 10%/cồn
UV 254 nm UV 365 nm
(TT) acid sulfuric 10%/cồn
Hình 4.31. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S1
UV 254 nm UV 365 nm
Hình 4.32. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S2
83
(TT) acid sulfuric 10%/cồn
UV 365 nm UV 254 nm
Hình 4.33. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S3
Nhận xét:
Qua 3 hệ dung môi khảo sát thì chọn được hệ dung môi S2 để tiến hành sắc ký cột để
phân lập các chất vì khi soi UV 254 nm và UV 365 nm thì bản mỏng hiện 1 vết nằm
trong khoảng Rf thích hợp (0,25 - 0,35) và khi nhúng thuốc thử các vết tách đều,
không kéo vệt, vết gọn,.. Không chọn hệ S1 và S3 vì bản mỏng kéo vệt, vết bị kéo, các vết nằm gần nhau, không tách rõ khó tách được các chất.
4.4.3. Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol
Theo mục số thì 3.2.4.4. tiến hành SKLM trên cao n-butanol để chọn ra hệ sắc ký thích
hợp cho việc tiến hành phân lập hợp chất từ cao. Cao n-butanol sau khi được tham
khảo một số tài liệu thì được tiến hành dò trên 3 hệ dung môi:
S1: Chloroform - methanol (9 : 1) S2: Clorofrom 100 %
S3: Chloroform - methanol (8 : 2)
84
Vanilin sulfuric (TT) UV 254 nm UV 365 nm
Hình 4.34. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S1
UV 254 nm UV 365 nm Vanilin sulfuric (TT)
Hình 4.35. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S2
85
UV 365 nm UV 254 nm Vanilin sulfuric (TT)
Hình 4.36. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S3
Nhận xét:
Qua 3 hệ dung môi khảo sát thì chon hệ dung môi S1= Chloroform - methanol (9 : 1)
để tiếp tục tiến hành phân lập các hợp chất. Chọn hệ dung môi S1vì vết gọn, không
kéo vệt, vết gọn. Hệ S2 và S3 vết bị kéo vệt, Rf còn thấp.
86
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1. KẾT LUẬN
Sau 6 tháng tiến hành thực hiện đề tài, khóa luận thu được kết quả như sau:
5.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm vi học
Đặc điểm về hình thái lá Đinh lăng cao từ 0,5 - 2 m, bề rộng lá 1,2 cm, lá xẻ 3 lần kép
lông chim mọc so le, mép răng cưa và có mùi thơm. Cụm hoa mọc thành từng cụm có chùy ngắn, hoa màu lục nhạt, nhị 5, chỉ nhị ngắn, quả màu nâu đen dài khoảng 1 cm.
Thân Đinh lăng có màu vàng nhạt, da sần sùi. Rễ Đinh lăng có màu vàng nhạt, đường
kính rễ 3 năm khoảng 8 cm giống với những mô tả của các nghiên cứu trước đó.
Đặc điểm về vi phẫu: Quan sát dưới kính hiển vi và được ghi nhận lại hình ảnh trực
tiếp qua thị kính thấy được các các mô: Biểu bì, bần, mô dày, cutin lồi, bó gỗ, libe,
tinh thể calci oxalat,… giống với những mô tả của các nghiên cứu trước đó.
Đặc điểm về soi bột: Sau khi tiến hành soi bột dược liệu Đinh lăng, quan sát dưới kính
hiển vi thì thấy được các cấu tử như: Tinh thể calcioxalat hình khối, lông che chở đơn
bào, đa bào, mảnh mô mềm, mảnh mạch mạng, mạch vạch, mạch xoắn, mạch điểm,
khối tinh bột, sợi kèm tinh thể, bó sợi. Những cấu tử tìm thấy được giống với Dược
điển Việt Nam IV chuyên luận Đinh lăng.
5.1.2. Thử tinh khiết
Độ ẩm rễ Đinh lăng đạt 6,5 %, thân Đinh lăng 5,6 %, cao rễ Đinh lăng 4,5 %, cao thân
Đinh lăng 0,5 %.
Độ tro rễ Đinh lăng 0,5 %, thân Đinh lăng 0,9 %.
Chất chiết được trong thân Đinh lăng la 17,9 %, rễ Đinh lăng 20,5 %
Hiệu suất chiết của cao toàn phần là 18,7 %, cao diethyl ether 14,9 %, cao ethyl acetat
1,7 %, cao n-butanol 22,8 % và cao nước cuối cùng là 42,0 %.
5.1.3. Nghiên cứu về hóa học
- Sau khi tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất thì thu được các nhóm hợp chất như: Saponin, flavonoid, alkaloid, tanin, coumarin, chất béo, tinh dầu, các acid hữu cơ, glycosid tim... Trong đó hợp chất saponin chiếm hàm lượng nhiều nhất. So sánh thành phần hóa học giữa thân và rễ Đinh lăng cho thấy thành phần hóa học giữa thân và rễ là như nhau. Thành phần hóa học trong khóa luận này khảo sát giống với
khảo sát của Dược Điển Việt Nam IV (2009) và trong các khảo sát trước đó. Như
87
vậy thành phần hóa học của cây Đinh lăng trồng tại Tri Tôn - An Giang giống với
các nghiên cứu trước đó. - Chiết ngấm kiệt 9,3 kg rễ Đinh lăng, tách phân đoạn thu được các cao phân đoạn sau: Cao diethyl ether 300 g, cao ethyl acetat 30 g, cao n-butanol 405 g và 800 g cao
nước cuối cùng. - Từ những cao tách phân đoạn thì đã tìm ra được các hệ dung môi thích hợp để tiến hành Sắc ký cột phân lập các hợp chất tự nhiên:
• Cao diethyl ether dùng hệ n-hexan - ethyl acetat (4 : 1).
• Cao ethyl acetat dùng hệ n-hexan - ethyl acetat (1 : 1).
• Cao n-butanol dùng hệ Chloroform - methanol (9 : 1).
5.2. ĐỀ XUẤT
Do điều kiện thời gian còn hạn chế khóa luận này chỉ mới đạt được một phần kết quả
khiêm tốn.
Sau khi kết thúc khóa luận, em xin đưa ra một số đề xuất như sau:
- Khảo sát thành phần hóa học trong các phân đoạn và đồng thời phân lập các hợp chất từ những cao:
• Diethyl ether.
• Ethyl acetat.
• N-butanol.
- Thử một số tác dụng dược lý trên các cao phân đoạn:
• Bảo vệ gan.
• Hoạt tính oxy hóa.
• Hoạt huyết dưỡng não.
- Qua kết quả nghiên cứu thấy được thành phần hóa học của thân Đinh lăng tương tự với rễ. Song song đó, các nghiên cứu trước đây chủ yếu được thực hiện trên lá và
rễ. Vì vậy cần có thêm nhiều nghiên cứu về thân Đinh lăng hơn nữa để thân có thể được sử dụng làm thuốc như lá và rễ.
88
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Takhtajan Armen et al. (2009). Flowering plants. Springer. Pp. 478. [2] Bộ môn dược liệu (2014). Phương pháp nghiên cứu dược liệu. NXB ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh. [3] Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. NXB Y học Hà Nội. Tr.882 – 884. [4] Bộ Y Tế (2015). Dược điển Việt Nam IV Bổ Sung. NXB Y học Hà Nội. Tr.1154 – 1156. [5] Chaboud A., Rougny A., Proliac A., Raynaud J., Cabalion P. (1995). A new triterpenoid saponin from Polyscias fruticosa, Fr. Pharmazie. 50(5). Pp. 371. [6] Chaboud A., Rougny A., Proliac A., Raynaud J., Cabalion P. (1996), A oleanolic saponin from Polyscias fruticosa Harms var yellow leaves. Pharmazie.
51(8). Pp. 611 - 612. [7] Đỗ Huy Bích và cs (2006). Cây thuốc và Động Vật làm thuốc ở Việt Nam. NXB Khoa Học và Kĩ Thuật. Tập 1. Tr. 793- 786. [8] Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Hồng Đức. Tr 828 - 829. [9] Hồ Lương Nhật Vinh (2014). Nghiên cứu thành phần hóa học. tác dụng ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết lá cây Đinh lăng
(Polyscias fruticosa (L.) Harms). Luận văn thạc sĩ dược học ngành Dược học cổ
truyền. Khoa Dược. Trường Đại học Dược Hà Nội. [10] Seidemann J. (2004). Word spice plants. Springer. Pp. 303. [11] Lutomski J et al. (1992). Polyacetylenes in the Araliaceae family. Herba Polonica. Vol 38(1). Pp. 3 - 11. [12] Ngô Ứng Long và cs (1993). Nghiên cứu dược lý cây Đinh lăng trên chức năng của hệ thần kinh ngoại biên. Tạp chí Dược học. Số 5. Tr. 10 - 12. [13] Nguyễn Thới Nhâm, Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích (1990). Tác dụng dược lí của cao toàn phần chiết xuất từ rễ và lá Đinh lăng Polyscias
fruticosa L. Harms. Araliaceae. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học. Viện Dược liệu. [14] Nguyễn Khắc Viện (1989). Góp phần nghiên cứu tác dụng dược lí của cao rễ Đinh lăng trên một số chức năng của cơ thể. Luận án PTS. Ngành Dược lý. Học viện Quân Y. [15] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập các hợp chất tự nhiên. NXB ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
89
[16] Nguyễn Thị Lan (2010). Xác định thành phần hóa học tinh dầu cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L). Harms) ở Nghệ An và Thanh Hóa. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Hóa hữu cơ. Khoa Hóa Học. Trường Đại học Vinh. [17] Nguyễn Thị Luyến và cs (2012). Hợp chất flavonoid glycoside có tác dụng ức chế alpha-amylase phân lập từ lá Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Số 6. Tập 17. [18] Nguyễn Thị Nguyệt và cs (1992). Một số kết quản ghiên cứu về saponin trong Đinh lăng. Tạp chí dược học. Số3. Tr.15 - 16. [19] Nguyễn Thị Nguyệt, Võ Xuân Minh, Nguyễn văn Bàn (1992). Một số kết quả nghiên cứu về saponin trong Đinh lăng. Tạp chí Dược học. Số 3. Tr. 15 - 16. [20] Nguyễn Thị Thu Hương (2009). Tác dụng chống trầm cảm của cao chiết cồn từ lá Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Tập 14. Số 3/2009. [21] Nguyễn Thị Thu Hương và cs (2003).Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của cây Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Số 5. Tập 8. Tr. 142 - 146. [22] Nguyễn Thị Thu Hương và cs (2004).Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của cây Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Số 3. Tr. 85 - 89. [23] Nguyễn Thị Thu Hương và Lương Kim Bích (2001). Nghiên cứu tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Tập 6. Tr. 84 - 86. [24] Nguyễn Thượng Dong và cs (2007). Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm. NXB Khoa Học và Kĩ Thuật. [25] Phạm Hoàng Hộ (2003). Cây cỏ Việt Nam. NXB Trẻ. Tập 2. Tr. 516 - 518. [26] Phạm Thị Nguyệt Hằng và Nguyễn Minh Khởi (2017). Tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây thiếu máu não cục bộ tạm thời và bước đầu nghiên cứu cơ chế
tác dụng của cao cồn rễ Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Tập 22. Số 2/2017. Tr. 113 -
119. [27] Quách Tuấn Vinh (2005). 60 cây mẫu trong vườn thuốc. NXB Y học. Tr. 76 - 77. [28] Quách Tuấn Vinh (2006). Dùng cây thuốc. NXB Quân Đội. Tr. 116 - 117. [29] Tran Thi Hong Hanh et al. (2016). α-Amylase and α-glucosidase inhibitory saponins from Polyscias fruticosa leaves. Journal of Chemistry. Vol 2016. [30] Trần Yên (1994). Tác dụng tăng cường trí nhớ của cao rễ Đinh Lăng trên động vật sau scopolamin và sau shock điện. Tạp chí thông tin Y học cổ truyền. Số 8. Tr. 34 - 42. [31] Trương Thị Đẹp (2014). Thực vật dược. NXB giáo dục. Tr. 263 - 264. [32] Vo Duy Huan et al. (1998). Oleanane saponin from Polyscias fruticosa (L.) Harms. Phytochemistry. Vol 47(3). Pp. 451-457. [33] Võ Văn Chi (2012). Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học. Tr. 937 - 938.
90
[34] Võ Xuân Minh (1991). Góp phần tìm hiểu về thành phần hóa học và dạng bào chế của cây Đinh lăng. Tạp chí Dược học. Tập 3. Tr. 19-21. [35] Võ Xuân Minh (1992). Nghiên cứu về saponin Đinh lăng và dạng bào chế từ Đinh lăng. Luận án PTS KH Y dược. Đại học Dược Hà Nội.
TRANG WEB
[36] Tác dụng chữa bệnh của Đinh lăng. chuthapdo.org.vn/tac-dung-chua-benh- khong-ngo-cua-cay-dinh-lang-8735.html ngày truy cập 04/6/2017, vào lúc 11:38 pm. [37] Trà Đinh lăng TRC. lasen.com.vn/dinh-lang-tra---
trc?gclid=CjwKEAjw387JBRDPtJePvOej8kASJADkV9TL7wnQ46yWUYWU_Bg
yhvfYddWlARIVqrFVoYnoELN1qRoCzGjw_wcB, ngày truy cập 05/6/2017, vào
lúc 1:02 am. [38] Trà Đinh lăng. quagac.com/san-pham/tra-dinh-lang-614.html, ngày truy cập 05/6/2017, vào lúc1:10 am [39] Hoạt huyết dưỡng não HBN. hadico.vn/san-pham/Than-kinh-tim-mach/Hoat- huyet-duong-nao-HBN.100316110146.html, ngày truy cập 05/6/2017, vào lúc 1:26
am [40] Gối Đinh lăng. goianhviet.com/cach-lam-goi-la-dinh-lang-hay-con-goi-la-goi- dinh-lang-nc2, ngày truy cập 14/6/2017, truy cập vào 2:23 am. [41] Y Dược Việt Nam. ydvn.net/contents/view/307.cay-dinh-lang-polyscias- fruticosa-l-harms.html, ngày truy cập 16/6/2017. Truy cập vào 8:54 am.
91
