Luận án Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu tách, điều chế chất chuẩn và xây dựng quy trình phân tích một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:179

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm xây dựng được quy trình tách chiết, điều chế chất chuẩn và phân tích một số HCTN có HTSH từ một số cây thuốc phân bố ở các địa phương của nước ta: cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.), Mật nhân (Eurycoma longifolia J.), Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)), Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K. Schum.) - một loài cây mới phát hiện. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu tách, điều chế chất chuẩn và xây dựng quy trình phân tích một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Huế - Năm 2020 i
ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Hóa Phân tích Mã số: 9 44 01 18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện 2. PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng Huế - Năm 2020 ii
LỜI CAM ĐOAN Luận án này đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện và PGS.TS. Nguyễn Hữu Tùng. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả trong luận án là trung thực, đƣợc các đồng tác giả cho phép sử dụng và chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đó. Tác giả Đoàn Mạnh Dũng i
LỜI CẢM ƠN Luận án đƣợc hoàn thành dƣới sự hƣớng dẫn hết sức tận tình và đầy tâm huyết của Thầy Nguyễn Đình Luyện và Thầy Nguyễn Hữu Tùng. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS. TS Nguyễn Đình Luyện - Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Huế, PGS.TS. Nguyễn Hữu Tùng - Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội là ngƣời đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng nhất với GS. TS Trần Đình Thắng – Trƣờng Đại học Vinh, ngƣời Thầy đã dìu dắt, hỗ trợ mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trên con đƣờng nghiên cứu khoa học. Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, Phòng Sau đại học, Khoa Hóa học cùng quý thầy cô giáo giảng dạy lớp nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tác giả xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp gần xa đã giúp đỡ, động viên, khích lệ tác giả trong suốt quá trình làm luận án. Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, ngƣời thân và các ngƣời bạn của tác giả, những ngƣời đã luôn mong mỏi, động viên và tiếp sức cho tác giả để hoàn thành bản luận án này. Tác giả Đoàn Mạnh Dũng ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... I LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ II MỤC LỤC ................................................................................................................. III KÝ HIỆU VIẾT TẮT ................................................................................................ V DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ........................................................................... VII DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ................................................................................. IX MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 4 1.1. Giới thiệu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học và một số cây thuốc ............................................................................................................................4 1.1.1. Giới thiệu chung ................................................................................................. 4 1.1.2. Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ...............................................................................................................................5 1.1.3. Một số loài cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ..... 6 1.2. Các phƣơng pháp phân tích các hợp chất thiên nhiên ....................................... 11 1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký khí .................................................................................. 11 1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng ................................................................................ 12 1.3. Một số nghiên cứu liên quan đến luận án .......................................................... 16 Chƣơng 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 22 2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 22 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 23 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 25 2.3.1. Thông tin về mẫu ............................................................................................ 25 2.3.2. Phƣơng pháp chiết tách/phân lập .................................................................... 27 2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc và đặc trƣng hóa - lý của HCTN .................. 29 2.3.4. Phƣơng pháp tinh chế hctn để tạo ra chất chuẩn ............................................. 29 2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn và dữ liệu chất chuẩn ...... 30 2.3.6. Phƣơng pháp phân tích các HCTN ................................................................. 30 2.3.7. Phƣơng pháp đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ....................... 32 iii
2.3.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu............................................................................... 34 2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ............................................................................. 24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 35 3.1. Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên ........................... 35 3.1.1. Chiết tách các HCTN từ cây Diệp hạ châu và đặc trƣng cấu trúc .................. 35 3.1.2. Chiết tách các HCTN từ cây Đan sâm và đặc trƣng cấu trúc ......................... 42 3.1.3. Chiết tách các HCTN từ cây Mật nhân và đặc trƣng cấu trúc ........................ 49 3.2. Tinh chế hợp chất thiên nhiên để tạo ra chất chuẩn ........................................... 53 3.2.1. Chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin ................................................... 54 3.2.2. Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA .......................... 55 3.2.3. Chất chuẩn eurycomanone .............................................................................. 57 3.3. Quy trình phân tích hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ........................ 58 3.4.1. Tính ổn định của hệ thống thiết bị .................................................................. 65 3.4.2. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp phân tích ......................................................... 69 3.4.3. Khoảng tuyến tính .......................................................................................... 72 3.5. Áp dụng thực tế .................................................................................................. 79 3.5.1. Kiểm soát chất lƣợng của phƣơng pháp phân tích .......................................... 79 3.5.2. Hàm lƣợng các hctn trong các mẫu thực tế..................................................... 86 3.6. Các hợp chất acetogenin chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm ........................... 92 3.6.1. Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin ............................................... 94 3.6.2. Định tính các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3 ............................... 95 3.6.3. Định lƣợng các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3............................ 97 3.7. Hàm lƣợng tinh dầu chiết tách từ cây Riềng đuôi nhọn .................................... 98 KẾT LUẬN .............................................................................................................105 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 109 Danh mục các công trình công bố kết quả nghiên cứu của luận án ........................ 107 PHỤ LỤC ................................................................................................................122 iv
KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Việt Tiếng Anh ACN Acetonitril ACRS Chất chuẩn đối chiếu hóa Asean Chemical học của ASEAN Reference Substance AOAC Hiệp hội các nhà khoa Association of Official học Phân tích Hoa Kỳ Analytical Chemists ASEAN Hiệp hội các nƣớc Đông Association of Southeast Nam Á Asian Nations CCĐC Chất chuẩn đối chiếu CE Điện di mao quản Capillary Electrophoresis DAD Detector chuỗi diot Diot Array Detector ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun Electron Spray Ionisation mù electron – Mass Spectrometry EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FLD Detector huỳnh quang Fluorescence Detector GC Sắc kí khí Gas Chromatography GC-MS Sắc ký lỏng ghép nối Gas Chromatography – khối phổ Mass Spectrometry HCTN Hợp chất thiên nhiên HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography HPLC-MS Sắc kí lỏng - khối phổ High Performance Liquid Chromatography– Mass Spectrometry HTSH Hoạt tính sinh học Bioactive HCTN Hợp chất thiên nhiên Natural compounds v
Viết tắt Tiếng Việt Tiếng Anh LC-MS/MS Sắc ký lỏng ghép 2 lần Liquid Chromatograph khối phổ Tandem Mass Spectrometer LOD Giới hạn phát hiện Limit of detection LOQ Giới hạn định lƣợng Limit of quantity MeOH Methanol NMR Cộng hƣởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance NPLC Sắc ký lỏng pha thuận Normal Phase Liquid Chromatography PPPT Phƣơng pháp phân tích Analysis method PTN Phòng thí nghiệm Laboratory RPLC Sắc ký lỏng pha đảo Reversed Phase Liquid Chromatography RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối Relative Standard Deviation SKĐ Sắc kí đồ SPE Chiết pha rắn Solid Phase Extraction TCCL Tiêu chuẩn chất lƣợng TLC Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography UV-Vis Tử ngoại – khả kiến Ultraviolet – Visible VQG Vƣờn quốc gia vi
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu................17 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của PU-1 và so sánh với công bố ở tài liệu ................39 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của PU-2 và so sánh với công bố ở tài liệu ................41 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của SM-1 và so sánh với công bố ở tài liệu ..........................46 Bảng 3. 4 Dữ liệu phổ NMR của SM-2 và so sánh với công bố ở tài liệu ...............47 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của SM-3 và so sánh với công bố ở tài liệu ...............48 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của EL-1 và so sánh với công bố ở tài liệu ................52 Bảng 3.7. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin.................................................................................................................54 Bảng 3.8. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn tanshinone I, cryptotashinone và tanshinone IIA............................................................................56 Bảng 3.9. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn eurycomanone .................57 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin ...............................................67 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA .............................68 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích Eurycomanone ...................................................................................................69 Bảng 3.13. Kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích Eurycomanone .80 Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các PP LC-MS/MS và UPLC-DAD .......81 Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với hypophyllanthin và phyllanthin ................................................................................83 Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA ....................................................84 Bảng 3.17. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất hypophyllanthin, phyllanthin và eurycomanone ..................................................................................86 Bảng 3.18. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA .........................................................................86 vii
Bảng 3.19. Hàm lƣợng (mg/g) hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu ...........................................................88 Bảng 3.20. Hàm lƣợng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone trong các mẫu cây Đan sâm ......................................................................................90 Bảng 3.21. Hàm lƣợng (mg/g) eurycomanone trong cây Mật nhân ở các địa phƣơng khác nhau...................................................................................................................91 Bảng 3.22. Phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn và LOD, LOQ của phƣơng pháp phân tích .............................................................................................................................98 Bảng 3.23. Hàm lƣợng (%) các cấu tử và các nhóm hợp chất có mặt trong tinh dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn ................................................102 viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1. Công thức cấu tạo của hypophyllanthin ...................................................38 Hình 3.2. Công thức cấu tạo của phyllanthin ...........................................................40 Hình 3.3. Công thức cấu tạo của cryptotanshinone ..................................................45 Hình 3.4. Công thức cấu tạo của tanshinon IIA ........................................................47 Hình 3.5. Công thức cấu tạo của Tanshinon I ...........................................................48 Hình 3.6. Công thức cấu tạo của Eurycomanone .....................................................52 Hình 3.7. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin: .................................55 Hình 3.8. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của phyllanthin: .........................................55 Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone I: ....................................56 Hình 3.10. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của cryptotanshinone: ..........................56 Hình 3.11. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone IIA .............................57 Hình 3.12. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất eurycomanone: ..............58 Hình 3.13. Phổ ESI-MS của hợp chất hypophyllanthin ............................................59 Hình 3.14. Phổ ESI-MS của hợp chất phyllanthin ....................................................59 Hình 3.15. Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD ...................................................................60 Hình 3.16. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone I ..................................................62 Hình 3.17. Phổ ESI-MS của hợp chất cryptotanshinone ..........................................62 Hình 3.18. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone IIA ..............................................62 Hình 3.19. Quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD..................................63 Hình 3.20. Quy trình phân tích eurycomanone bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ......64 Hình 3.21. Phổ ESI-MS của hợp chất eurycomanone ..............................................65 Hình 3.22. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) hypophyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau (b) phyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau và (c) hypophyllanthin và phyllanthin ...........................................................................70 Hình 3.23. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) tanshinone I, ứng với các nồng độ khác nhau; (b) cryptotanshinone, ứng với các nồng độ khác nhau; (c) tanshinone IIA, ứng với các nồng độ khác nhau; và (d) tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA. ........................................................................71 Hình 3.24. Sắc đồ LC-MS/MS đối vơi dung dịch chuẩn chứa: eurycomanone, ứng ix
với các nồng độ khác nhau ........................................................................................72 Hình 3.25. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................................................................74 Hình 3.26. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phƣơng pháp LC- MS/MS ......................................................................................................................74 Hình 3.27. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với (a) hypophyllanthin và (b) phyllanthin trong phƣơng pháp UPLC-DAD ...............................................................................74 Hình 3.28. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I trong phƣơng pháp LC- MS/MS ......................................................................................................................76 Hình 3.29. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với cryptotanshinone trong phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................................................................77 Hình 3.30. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone IIA trong phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................................................................77 Hình 3.31. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với (a) tanshinone I (b) cryptotanshinone và (c) tanshinone IIA trong phƣơng pháp UPLC-DAD ............................................78 Hình 3.32. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với eurycomanone trong phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................................................................78 Hình 3.33. Sắc đồ của mẫu DHC-VX .......................................................................87 Hình 3.34. Sắc đồ của mẫu lá Diệp hạ châu .............................................................89 Hình 3.35. Sắc đồ của mẫu Đan sâm ở Sapa ............................................................89 Hình 3.36. Sắc đồ của (a) mẫu Mật nhân ở Hà Giang; (b) mẫu Mật nhân ở Bắc Giang ...................................................................................................................................91 Hình 3.37. Quy trình phân tích định tính, định lƣợng các hợp chất acetogenin từ dịch chiết của cây Mãng cầu xiêm ............................................................................93 Hình 3.38. Phổ 1H-NMR của phân đoạn AMF-3 trong dung môi CDCl3. ..............95 Hình 3.39. Sắc đồ HPLC-PDA đối với phân đoạn AMF-3. .....................................96 Hình 3.40. Phổ MALDI-TOF-HRMS của các hợp chất acetogenin trong phân đoạn AMF-3 .......................................................................................................................97 Hình 3.41. Quy trình phân tích định tính, bán định lƣợng các hợp chất trong tinh dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn ................................................100 x
MỞ ĐẦU Việt Nam nằm ở một trong những khu hệ thực vật phong phú nhất trên thế giới, khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á. Với bờ biển dài 3200 km và đƣờng biên giới trên đất liền dài tới 4630 km, rừng núi chiếm 3/4 diện tích cả nƣớc, đất nƣớc ta sở hữu một nguồn tài nguyên động thực vật vô cùng phong phú. Theo các tài liệu đã công bố, hiện nay có khoảng trên 12000 loài thực vật hiện hữu ở Việt Nam [6], [7], [10], [20], [24]. Theo thống kê của Phan Kế Lộc thì đã có 10386 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc 2257 chi và 305 họ (trong đó có 733 loài chỉ gặp trong trồng trọt) [26]. Những nghiên cứu phát hiện thuốc từ nguồn thảo dƣợc Việt Nam nhằm giúp chủ động nguồn nguyên liệu sẵn có cũng đã đƣợc chú ý thực hiện. Một phần các thuốc hiện đại là các hợp chất thiên nhiên hoặc các dẫn xuất của chúng đƣợc sử dụng trực tiếp trong công nghiệp dƣợc và chúng đƣợc phát triển và ứng dụng rất nhanh ở châu Âu và Bắc Mỹ. Các chƣơng trình sử dụng thuốc cổ truyền tại các nƣớc đang phát triển nhƣ Mexico, Trung Quốc và Nigeria đang đƣợc xúc tiến mạnh mẽ đặc biệt là sử dụng chúng để hỗ trợ điều trị bệnh bằng các thực phẩm chức năng [8], [10], [21]. Các nội dung chính trong những nghiên cứu về các HCTN có hoạt tính sinh học là (i) Xây dựng các quy trình tách chiết thích hợp để thu đƣợc các hợp chất có HTSH có giá trị cho các ngành dƣợc, công nghệ sinh học, y sinh... ; (ii) Tách chiết và tinh chế để thu đƣợc các HCTN có HTSH làm chất chuẩn để định lƣợng chúng trong các loài cây thuốc (thực vật nói chung) khác nhau; (iii) Xây dựng quy trình phân tích (định tính và định lƣợng) các HCTN có HTSH trong các đối tƣợng mẫu khác nhau; (iv) Phân tích cấu trúc và xác định HTSH của các hợp chất mới; (v) Nghiên cứu xác định HTSH của các hợp chất thiên nhiên và ứng dụng chúng vào các lĩnh vực khác nhau. Nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về tách các HCTN có HTSH từ cây Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân...bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và phân tích hàm lƣợng bằng HPLC [18], [27], [31]. Một số nghiên cứu đã xây dựng quy trình phân tích HCTN có HTSH nhƣ acetogenin [46], [51], [90], tinh dầu bằng 1
phƣơng pháp GC-MS, LC-MS/MS [33]. Mặt khác, gần đây, một số nghiên cứu về các loài annona, bao gồm Mãng cầu xiêm (A. muricata) cho thấy chúng có chứa một nguồn phong phú các hợp chất acetogenin annonaceous (AGEs) [98]. Các nghiên cứu về cây thuộc chi Riềng đã cho thấy loài này chứa nhiều hợp chất có HTSH có giá trị nhƣ camphor, camphen, borneol và bornyl acetat,… đƣợc sử dụng rộng rãi làm hƣơng liệu mĩ phẩm, thực phẩm và làm gia vị trong các món ăn [33]. Cho đến nay, mới có một vài nghiên cứu tập trung phân tích nhóm chất có HTSH acetogenin trong cây Mãng cầu xiêm và phân tích các hợp chất trong toàn bộ cây Riềng đuôi nhọn [46], [51], [70], [89], [90]. Song, chƣa có nghiên cứu nào xác định đƣợc hàm lƣợng mỗi chất có HTSH trong các bộ phân của cây, để định hƣớng cho các nghiên cứu tiếp theo tách chiết các hợp chất có giá trị từ các bộ phận riêng biệt của cây. - Về hƣớng (ii) – tinh chế để thu đƣợc các chất tinh khiết cũng đƣợc nhiều nghiên cứu quan tâm, song chủ yếu là các PTN/các hãng dƣợc chuyên ngành nghiên cứu và giá thành chất chuẩn có HTSH khá đắt. Trong khi đó, ở VN, cho đến nay, những nghiên cứu theo hƣớng này còn rất hạn chế. Xuất phát từ các vấn đề trên, luận án này đƣợc thực hiện nhằm mục đích đóng góp tích cực vào các hƣớng nghiên cứu (i), (ii) và (iii) ở trên. Mục đích của nghiên cứu luận án: Luận án này đƣợc thực hiện nhằm xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, điều chế chất chuẩn và phân tích một số HCTN có HTSH từ một số cây thuốc phân bố ở các địa phƣơng của nƣớc ta: cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.), Mật nhân (Eurycoma longifolia J.), Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)), Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K. Schum.) - một loài cây mới phát hiện. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án: Để đạt đƣợc những mục đích trên, các nội dung nghiên cứu chính bao gồm: - Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết các hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin từ cây Diệp hạ châu; hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA từ cây Đan sâm và hợp chất eurycomanone từ cây Mật nhân bằng 2
các phƣơng pháp sắc ký; - Tinh chế các hợp chất thu đƣợc (phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA, eurycomanone) để tạo ra các chất chuẩn cho phân tích định tính và định lƣợng chúng trong các dƣợc liệu khác nhau; - Xây dựng quy trình phân tích các hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiện đại LC-MS/MS, UPLC-DAD để có thể áp dụng cho các PTN phân tích ở nƣớc ta; - Nghiên cứu xác định hàm lƣợng các hợp chất có HTSH trong dịch chiết lá cây Mãng cầu xiêm bằng phƣơng pháp sắc ký hiện đại: sắc ký lỏng ghép nối với các detector khác nhau (qNMR, HPLC-PDA, MALDI-TOP HRMS) và các hợp chất có trong tinh dầu các bộ phận (lá, thân, rễ...) của cây Riềng đuôi nhọn bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ (GC-MS). 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ MỘT SỐ CÂY THUỐC 1.1.1. Giới thiệu chung Hợp chất thiên nhiên hay hợp chất tự nhiên là các chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc đƣợc con ngƣời tách ra từ các loại động vật, thực vật trong tự nhiên có thể có hoạt tính sinh học hoặc có tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc. Trong sự phát triển của loài ngƣời, thiên nhiên có vai trò vô cùng quan trọng, nó không chỉ cho chúng ta nơi cƣ ngụ mà còn cung cấp cho chúng ta những vật chất thiết yếu cho cuộc sống. Hóa học các hợp chất thiên nhiên là hóa học các hợp chất hữu cơ đƣợc tạo ra từ các tổ chức sống (vi sinh vật, nấm, động thực vật...) tìm thấy trong tự nhiên, thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc học đƣợc sử dụng để phát hiện và phát triển thuốc chữa bệnh [108]. Ngƣời ta cũng cần dựa vào những khái niệm cơ bản về tính chất của các chất (alkaloit có tính kiềm yếu và chứa nitơ), về các đơn vị hợp thành phân tử (terpenoit tạo thành từ các đơn vị isopren) hay trên cơ sở các mối liên kết cơ bản (các glycosit do có các liên kết glycosit)... để phân chia các lớp chất chính trong tự nhiên. Nhƣ vậy, các hợp chất thiên nhiên có thể phân chia thành các lớp chất chính sau: các hợp chất terpenoit, các hợp chất steroit, các hợp chất alkaloit, các hợp chất flavonoit, các hợp chất phenolic, các hợp chất lipit, các hợp chất cacbohydrat, các hợp chất axit amin, peptit và protein, vitamin [21], [29], [108]. Các loài thực vật có chứa khoảng 5 triệu hợp chất hóa học. Cho tới nay, đã có 0,5 %, nghĩa là 1.300 cây đƣợc nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và giá trị chữa bệnh [15]. Thuốc từ dƣợc liệu đƣợc sử dụng không chỉ các nƣớc Á Đông mà còn đƣợc tiêu thụ một lƣợng khá lớn ở các nƣớc phƣơng Tây. Ở các nƣớc có nền công nghiệp phát triển thì một phần tƣ số thuốc kê trong các đơn có chứa hoạt chất từ dƣợc liệu…[32]. Các hợp chất thiên nhiên là nguồn cung cấp các phân tử có sự đa dạng rất lớn về cấu trúc và hoạt tính sinh học. Sự đa dạng về cấu trúc hoá học của các hợp chất thiên 4
nhiên có thể có liên quan đến sự đa dạng sinh học của các nguồn thiên nhiên sinh tổng hợp ra các hợp chất này. Hơn nữa, các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất dẫn đƣờng hoặc phân tử hiện đại cho tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên đóng vai trò là nguồn các hợp chất dẫn đƣờng làm phong phú và đa dạng về cấu trúc của các hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp thuốc [21]. 1.1.2. Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Cho đến nay ở Việt Nam và trên toàn thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về chiết tách các HCTN có HTSH. Một trong những nghiên cứu đầu tiên là tách chiết thành công artermisin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) và chuyển hóa thành nó thành các dẫn xuất có hoạt tính cao hơn (artermether, artesunat…) làm thuốc chống sốt rét. Nghiên cứu phân lập taxol từ cây thông đỏ (Taxus baccata L); Chiết l-tetrahydropalmatin từ rễ củ của một số loại cây Bình vôi (Stephania spp.) làm thuốc an thần; Tách chiết berberin từ loài cây Vàng đắng (Coscinium fenestratum); Tách curcumin từ cây Nghệ (Curcuma longa L.), rutin từ nụ Hoa hòe (Styphnolobium japonicum L.); Tách vinblastin, vincristin từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus L.)… [20], [35]. Hàng ngàn năm nay, tự nhiên là nguồn cung cấp các tác nhân điều trị bệnh, với con số ấn tƣợng về lƣợng thuốc hiện đại có nguồn gốc tự nhiên dựa trên cơ sở sử dụng làm thuốc truyền thống của chúng. Một số lƣợng lớn thuốc bán chạy nhất trong thế kỷ 20 đều đƣợc tách chiết từ các thảo dƣợc khác nhau nhƣ: vincristin từ cây Dừa cạn - Vinca rosea, morphin từ cây Anh túc - Papaver somniferum, Taxol từ cây Thông đỏ - Taxus brevifolia... Riêng trong năm 2001, đã có tới 8 hợp chất (simvastatin, pravastatin, amoxycillin, axit clavulanic, azithromycin, ceftriaxone, cyclosporin và paclitaxel) có mặt trong số 30 thuốc bán chạy nhất trên thế giới với tổng kinh phí khoảng 16 tỷ đô la Mỹ [29], [108]. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung vào tách chiết các HCTN có hoạt tính sinh học từ một số loài thảo dƣợc có sẵn ở nhiều địa phƣơng của nƣớc ta nhƣ cây Diệp hạ châu, cây Đan sâm, cây Mật nhân, cây Mãng cầu xiêm và cây Riềng đuôi nhọn... 5
1.1.3. Một số loài cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.1.3.1. Cây Diệp hạ châu Cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) còn có tên gọi khác là cây Chó đẻ răng cƣa, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là một loại thảo mộc đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc cổ truyền chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, bệnh gan, sốt, đái tháo đƣờng... Hiện nay các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ Diệp hạ châu khá nhiều. Thành phần hóa học bao gồm lignan, tannin, flavonoid, axit phenolic, terpenoid và các loại hợp chất khác. Đến nay, 93 hợp chất đã đƣợc xác định và cấu trúc đƣợc làm sáng tỏ từ các chất chiết xuất từ cây Diệp hạ châu bao gồm 22 lignan, 16 tannin, 12 flavonoid, 21 phenolic, 13 terpenoid và các chất chuyển hóa thứ cấp khác. Thành phần có hoạt tính quan trọng nhất đƣợc tập trung nghiên cứu chủ yếu là phyllanthin, hypophyllanthin, corilagin, geraniin, brevifolin, các dẫn xuất của nó và rutin. Các hợp chất chiết từ các loài Chó đẻ thân xanh (P. amarus), cây Diệp hạ châu (P. urinaria) có hoạt tính kháng virus, kháng khuẩn, đặc biệt là ức chế hoạt động của virus viêm gan B. Lignan là các hợp chất đóng một vai trò quan trọng trong các hệ thống phòng thủ thực vật. Lignan có các hoạt tính sinh học nhƣ là chất chống oxy hóa, chống ung thƣ, estrogen, kháng virus và hạ huyết áp. Các ngành công nghiệp dƣợc phẩm sử dụng chúng làm tiền chất cho sự tổng hợp của thuốc chống ung thƣ. Phyllanthin là một lignan có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, miễn dịch và bảo vệ gan đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều bệnh gan [7], [10], [62]. Ngoài ra, phyllanthin có hoạt tính chống oxy hóa bao gồm ức chế superoxide enzyme dismutase (SOD) và glutathione reductase và làm giảm tổn thƣơng oxy hóa do ethanol gây ra trong tế bào gan chuột. Nó có tác dụng làm gia tăng lƣợng glutathione có vai trò bảo vệ và phục hồi tế bào gan, làm giảm men gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B. Các nghiên cứu chỉ ra rằng hypophyllanthin là một lignan cô lập từ P. urinaria có tiềm năng hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, miễn dịch kháng virut, chống ung thƣ, chống virut viêm gan B và tác dụng bảo vệ gan. Nó có tác dụng làm gia tăng lƣợng glutathione có vai trò bảo vệ và phục hồi tế bào gan, làm giảm men gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B [50], [64], [87]. 6
1.1.3.2. Cây Đan sâm Cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) thuộc chi Salvia, họ Hoa môi (Lamiaceae) còn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm. Thành phần hóa học chính trong cây Đan sâm là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác. Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của Đan sâm đã đƣợc chia thành hai nhóm là tanshinontan trong lipid và acid phenolic tan trong nƣớc [6], [7], [10]. Đến nay, hơn 20 acid phenolic phân lập từ rễ cây Đan sâm đã đƣợc nghiên cứu. Các chất có hoạt tính thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon... Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã đƣợc phân lập và sinh tổng hợp [55], [103]. Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của cây Đan sâm. Các tác dụng đã đƣợc chứng minh bao gồm: làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ [57], [85]. Ngoài ra, Đan sâm còn đƣợc chứng minh có tác dụng chống đau thắt ngực [44], [54]. Tác dụng làm hạ đƣờng huyết, hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [49], [54]. Tác dụng an thần, chống vi khuẩn, chống nấm, tốt cho trƣờng hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa và mề đay [60], [103], [118]. Hoạt tính chống viêm [35], hoạt tính chống oxy hóa mạnh [7], [54], và có tác dụng chống ung thƣ [2], [85]. Cryptotanshinon là thành phần đƣợc phân lập từ rễ của cây Đan sâm, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, chống dermatophytic, chất chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thƣ, hoạt động của cryptotanshinon cũng có thể ức chế các tế bào sản xuất endothelia endothelin-1 và tạo ra sự khác biệt của một số tế bào nhƣ các tế bào gốc trung mô tủy xƣơng. Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng giảm đáng kể kích thƣớc vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim [57], [103]. Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim [118]. Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon I có tác dụng giảm đáng kể kích thƣớc vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim. Tanshinon I ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim [49], [118]. 7
1.1.3.3. Cây Mãng cầu xiêm Cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)) có tên gọi khác là Na xiêm hay mãng cầu gai thuộc chi Annona, họ Na [94]. Nghiên cứu về thành phần hóa học của Mãng cầu xiêm cho thấy sự đa dạng về cấu trúc hợp chất bởi có nhiều lớp chất đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc. Khái quát từ các công trình nghiên cứu đã cho biết các lớp chất bao gồm: cacbohydrat, lipit, amino axit, phenolic axit, proanthocyanidin, tannin, flavonoit, monotecpen, sesquitecpen, ditecpen, tritecpen, ancaloit, polyprenol, hợp chất thơm, cyclopeptit, acetogenin,.. [22], [59]. Trong số đó, các hợp chất acetogenin có cấu trúc rất đặc biệt và chỉ đƣợc tìm thấy trong Mãng cầu xiêm cũng nhƣ các loài thuộc họ na, sự độc đáo này không chỉ dừng lại ở cấu trúc hóa học mà hoạt tính sinh học của chúng cũng nổi bật nhờ khả năng gây độc các dòng tế bào ung thƣ trên cơ thể con ngƣời, đồng thời cấu trúc của các hợp chất này cũng khá đa dạng [95], [100]. Mãng cầu xiêm (lá, rễ và hạt) đƣợc dùng làm thuốc tại rất nhiều nơi trên thế giới, nhất là tại các quốc gia Nam Mỹ [8], [9]. Phần lớn các nghiên cứu về ung thƣ trên chi Annona tập trung vào lớp chất mới có nguồn gốc từ thiên nhiên đƣợc gọi là annonaceous acetogenin. Ba nhóm nghiên cứu độc lập đã phân lập các hợp chất acetogenin từ chi Annona này đã cho thấy khả năng chống khối u, chống ung thƣ và chống lại các độc tính có chọn lọc với các loại tế bào ung thƣ khác nhau (mà không làm hại các tế bào khỏe mạnh), có tám nghiên cứu lâm sàng đã đƣợc công bố dựa trên các phát hiện này. Nhiều hợp chất acetogenin đã chứng minh tính gây độc chọn lọc về tác dụng gây độc các tế bào ung thƣ với liều lƣợng rất thấp khoảng 1/106. Cụ thể là dòng tế bào bào ung thƣ biểu mô ở phổi, dòng khối u ở ngực ngƣời, ung thƣ tuyến tiền liệt, dòng tế bào ung thƣ biểu mô tuyến tụy, dòng tế bào ung thƣ tuyến đại tràng, dòng tế bào ung thƣ gan dòng tế bào ung thƣ hệ bạch huyết ở ngƣời và nhiều loại thuốc kháng ung thƣ ác tính ở ngực ngƣời [59], [95]. Xem xét hoạt động kháng u và gây độc tế bào, annonacin có thể đƣợc sử dụng nhƣ là một chất dẫn đƣờng để phát triển tiềm năng của các tác nhân chống ung thƣ. Tuy nhiên, một chú ý rất quan trọng là annonacin chỉ ức chế sự phát triển bình thƣờng của các khối u phổi trong thời gian kéo dài hai tuần, nó không tiêu diệt các khối u và cũng không làm ngừng sự tăng trƣởng của chúng một cách hoàn toàn [22]. 8