Luận án Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu tách, điều chế chất chuẩn và xây dựng quy trình phân tích một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐOÀN MẠNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ

HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Huế - Năm 2020

i

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐOÀN MẠNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ

HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 9 44 01 18

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện

2. PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng

Huế - Năm 2020

ii

LỜI CAM ĐOAN

Luận án này đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Khoa học,

Đại học Huế, dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn

Đình Luyện và PGS.TS. Nguyễn Hữu Tùng. Tôi xin cam

đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả trong

luận án là trung thực, đƣợc các đồng tác giả cho phép sử

dụng và chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đó.

Tác giả

Đoàn Mạnh Dũng

i

LỜI CẢM ƠN

Luận án đƣợc hoàn thành dƣới sự hƣớng dẫn hết sức tận tình và đầy tâm

huyết của Thầy Nguyễn Đình Luyện và Thầy Nguyễn Hữu Tùng.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS. TS Nguyễn Đình

Luyện - Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Huế, PGS.TS. Nguyễn Hữu Tùng -

Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội là ngƣời đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo

mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng nhất với GS. TS Trần Đình Thắng –

Trƣờng Đại học Vinh, ngƣời Thầy đã dìu dắt, hỗ trợ mọi điều kiện tốt nhất cho tôi

trên con đƣờng nghiên cứu khoa học.

Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học

Khoa học, Đại học Huế, Phòng Sau đại học, Khoa Hóa học cùng quý thầy cô giáo

giảng dạy lớp nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.

Tác giả xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp gần xa đã giúp đỡ, động

viên, khích lệ tác giả trong suốt quá trình làm luận án.

Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, ngƣời thân và các

ngƣời bạn của tác giả, những ngƣời đã luôn mong mỏi, động viên và tiếp sức cho

tác giả để hoàn thành bản luận án này.

Tác giả

Đoàn Mạnh Dũng

ii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... I

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ II

MỤC LỤC ................................................................................................................. III

KÝ HIỆU VIẾT TẮT ................................................................................................ V

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ........................................................................... VII

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ................................................................................. IX

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 4

1.1. Giới thiệu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học và một số cây

thuốc ............................................................................................................................ 4

1.1.1. Giới thiệu chung ................................................................................................. 4

1.1.2. Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh

học ............................................................................................................................... 5

1.1.3. Một số loài cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ..... 6

1.2. Các phƣơng pháp phân tích các hợp chất thiên nhiên ....................................... 11

1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký khí .................................................................................. 11

1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng ................................................................................ 12

1.3. Một số nghiên cứu liên quan đến luận án .......................................................... 16

Chƣơng 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 22

2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 22

2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 23

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 25

2.3.1. Thông tin về mẫu ............................................................................................ 25

2.3.2. Phƣơng pháp chiết tách/phân lập .................................................................... 27

2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc và đặc trƣng hóa - lý của HCTN .................. 29

2.3.4. Phƣơng pháp tinh chế hctn để tạo ra chất chuẩn ............................................. 29

2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn và dữ liệu chất chuẩn ...... 30

2.3.6. Phƣơng pháp phân tích các HCTN ................................................................. 30

2.3.7. Phƣơng pháp đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ....................... 32

iii

2.3.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................... 34

2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ............................................................................. 24

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 35

3.1. Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên ........................... 35

3.1.1. Chiết tách các HCTN từ cây Diệp hạ châu và đặc trƣng cấu trúc .................. 35

3.1.2. Chiết tách các HCTN từ cây Đan sâm và đặc trƣng cấu trúc ......................... 42

3.1.3. Chiết tách các HCTN từ cây Mật nhân và đặc trƣng cấu trúc ........................ 49

3.2. Tinh chế hợp chất thiên nhiên để tạo ra chất chuẩn ........................................... 53

3.2.1. Chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin ................................................... 54

3.2.2. Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA .......................... 55

3.2.3. Chất chuẩn eurycomanone .............................................................................. 57

3.3. Quy trình phân tích hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ........................ 58

3.4.1. Tính ổn định của hệ thống thiết bị .................................................................. 65

3.4.2. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp phân tích ......................................................... 69

3.4.3. Khoảng tuyến tính .......................................................................................... 72

3.5. Áp dụng thực tế .................................................................................................. 79

3.5.1. Kiểm soát chất lƣợng của phƣơng pháp phân tích .......................................... 79

3.5.2. Hàm lƣợng các hctn trong các mẫu thực tế ..................................................... 86

3.6. Các hợp chất acetogenin chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm ........................... 92

3.6.1. Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin ............................................... 94

3.6.2. Định tính các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3 ............................... 95

3.6.3. Định lƣợng các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3 ............................ 97

3.7. Hàm lƣợng tinh dầu chiết tách từ cây Riềng đuôi nhọn .................................... 98

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 109

Danh mục các công trình công bố kết quả nghiên cứu của luận án ........................ 107

PHỤ LỤC ................................................................................................................ 122

iv

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Viết tắt

Tiếng Việt

Tiếng Anh

ACN

Acetonitril

ACRS

Chất chuẩn đối chiếu hóa

Asean

Chemical

học của ASEAN

Reference Substance

AOAC

Hiệp hội các nhà khoa

Association of Official

học Phân tích Hoa Kỳ

Analytical Chemists

ASEAN

Hiệp hội các nƣớc Đông

Association of Southeast

Nam Á

Asian Nations

Chất chuẩn đối chiếu

CCĐC

Điện di mao quản

Capillary Electrophoresis

CE

Detector chuỗi diot

Diot Array Detector

DAD

ESI-MS

Khối phổ - ion hóa phun

Electron Spray Ionisation

mù electron

– Mass Spectrometry

Ethyl acetat

EtOAc

Ethanol

EtOH

Detector huỳnh quang

Fluorescence Detector

FLD

Sắc kí khí

Gas Chromatography

GC

GC-MS

Sắc ký lỏng ghép nối

Gas Chromatography –

khối phổ

Mass Spectrometry

Hợp chất thiên nhiên

HCTN

Sắc kí lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid

HPLC

Chromatography

HPLC-MS

Sắc kí lỏng - khối phổ

High Performance Liquid

Chromatography– Mass

Spectrometry

HTSH

Hoạt tính sinh học

Bioactive

HCTN

Hợp chất thiên nhiên

Natural compounds

v

Viết tắt

Tiếng Việt

Tiếng Anh

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng ghép 2 lần

Liquid Chromatograph

khối phổ

Tandem

Mass

Spectrometer

Giới hạn phát hiện

Limit of detection

LOD

Giới hạn định lƣợng

Limit of quantity

LOQ

Methanol

MeOH

Cộng hƣởng từ hạt nhân

Nuclear

Magnetic

NMR

Resonance

NPLC

Sắc ký lỏng pha thuận

Normal Phase Liquid

Chromatography

Phƣơng pháp phân tích

Analysis method

PPPT

Phòng thí nghiệm

Laboratory

PTN

Sắc ký lỏng pha đảo

Reversed Phase Liquid

RPLC

Chromatography

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

Relative

Standard

Deviation

Sắc kí đồ

SKĐ

Chiết pha rắn

Solid Phase Extraction

SPE

Tiêu chuẩn chất lƣợng

TCCL

Sắc kí lớp mỏng

Thin

Layer

TLC

Chromatography

Tử ngoại – khả kiến

Ultraviolet – Visible

UV-Vis

Vƣờn quốc gia

VQG

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu ................ 17

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của PU-1 và so sánh với công bố ở tài liệu ................ 39

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của PU-2 và so sánh với công bố ở tài liệu ................ 41

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của SM-1 và so sánh với công bố ở tài liệu .......................... 46

Bảng 3. 4 Dữ liệu phổ NMR của SM-2 và so sánh với công bố ở tài liệu ............... 47

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của SM-3 và so sánh với công bố ở tài liệu ............... 48

Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của EL-1 và so sánh với công bố ở tài liệu ................ 52

Bảng 3.7. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn hypophyllanthin và

phyllanthin ................................................................................................................. 54

Bảng 3.8. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn tanshinone I,

cryptotashinone và tanshinone IIA............................................................................ 56

Bảng 3.9. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn eurycomanone ................. 57

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi

phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin ............................................... 67

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân

tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA ............................. 68

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân

tích Eurycomanone ................................................................................................... 69

Bảng 3.13. Kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi

phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích Eurycomanone . 80

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các PP LC-MS/MS và UPLC-DAD ....... 81

Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với

hypophyllanthin và phyllanthin ................................................................................ 83

Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với

tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA .................................................... 84

Bảng 3.17. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất hypophyllanthin,

phyllanthin và eurycomanone .................................................................................. 86

Bảng 3.18. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất tanshinone I,

cryptotanshinone và tanshinone IIA ......................................................................... 86

vii

Bảng 3.19. Hàm lƣợng (mg/g) hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu thực

phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu ........................................................... 88

Bảng 3.20. Hàm lƣợng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone

trong các mẫu cây Đan sâm ...................................................................................... 90

Bảng 3.21. Hàm lƣợng (mg/g) eurycomanone trong cây Mật nhân ở các địa phƣơng

khác nhau................................................................................................................... 91

Bảng 3.22. Phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn và LOD, LOQ của phƣơng pháp phân

tích ............................................................................................................................. 98

Bảng 3.23. Hàm lƣợng (%) các cấu tử và các nhóm hợp chất có mặt trong tinh dầu

chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn ................................................ 102

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 3.1. Công thức cấu tạo của hypophyllanthin ................................................... 38

Hình 3.2. Công thức cấu tạo của phyllanthin ........................................................... 40

Hình 3.3. Công thức cấu tạo của cryptotanshinone .................................................. 45

Hình 3.4. Công thức cấu tạo của tanshinon IIA ........................................................ 47

Hình 3.5. Công thức cấu tạo của Tanshinon I ........................................................... 48

Hình 3.6. Công thức cấu tạo của Eurycomanone ..................................................... 52

Hình 3.7. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin: ................................. 55

Hình 3.8. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của phyllanthin: ......................................... 55

Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone I: .................................... 56

Hình 3.10. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của cryptotanshinone: .......................... 56

Hình 3.11. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone IIA ............................. 57

Hình 3.12. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất eurycomanone: .............. 58

Hình 3.13. Phổ ESI-MS của hợp chất hypophyllanthin ............................................ 59

Hình 3.14. Phổ ESI-MS của hợp chất phyllanthin .................................................... 59

Hình 3.15. Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin bằng

phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD ................................................................... 60

Hình 3.16. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone I .................................................. 62

Hình 3.17. Phổ ESI-MS của hợp chất cryptotanshinone .......................................... 62

Hình 3.18. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone IIA .............................................. 62

Hình 3.19. Quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và

tanshinone IIA bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD.................................. 63

Hình 3.20. Quy trình phân tích eurycomanone bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ...... 64

Hình 3.21. Phổ ESI-MS của hợp chất eurycomanone .............................................. 65

Hình 3.22. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) hypophyllanthin,

ứng với các nồng độ khác nhau (b) phyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau và

(c) hypophyllanthin và phyllanthin ........................................................................... 70

Hình 3.23. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) tanshinone I, ứng

với các nồng độ khác nhau; (b) cryptotanshinone, ứng với các nồng độ khác nhau;

(c) tanshinone IIA, ứng với các nồng độ khác nhau; và (d) tanshinone I,

cryptotanshinone và tanshinone IIA. ........................................................................ 71

Hình 3.24. Sắc đồ LC-MS/MS đối vơi dung dịch chuẩn chứa: eurycomanone, ứng

ix

với các nồng độ khác nhau ........................................................................................ 72

Hình 3.25. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phƣơng pháp

LC-MS/MS ................................................................................................................ 74

Hình 3.26. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phƣơng pháp LC-

MS/MS ...................................................................................................................... 74

Hình 3.27. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với (a) hypophyllanthin và (b) phyllanthin

trong phƣơng pháp UPLC-DAD ............................................................................... 74

Hình 3.28. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I trong phƣơng pháp LC-

MS/MS ...................................................................................................................... 76

Hình 3.29. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với cryptotanshinone trong phƣơng pháp

LC-MS/MS ................................................................................................................ 77

Hình 3.30. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone IIA trong phƣơng pháp

LC-MS/MS ................................................................................................................ 77

Hình 3.31. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với (a) tanshinone I (b) cryptotanshinone

và (c) tanshinone IIA trong phƣơng pháp UPLC-DAD ............................................ 78

Hình 3.32. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với eurycomanone trong phƣơng pháp

LC-MS/MS ................................................................................................................ 78

Hình 3.33. Sắc đồ của mẫu DHC-VX ....................................................................... 87

Hình 3.34. Sắc đồ của mẫu lá Diệp hạ châu ............................................................. 89

Hình 3.35. Sắc đồ của mẫu Đan sâm ở Sapa ............................................................ 89

Hình 3.36. Sắc đồ của (a) mẫu Mật nhân ở Hà Giang; (b) mẫu Mật nhân ở Bắc Giang

................................................................................................................................... 91

Hình 3.37. Quy trình phân tích định tính, định lƣợng các hợp chất acetogenin từ

dịch chiết của cây Mãng cầu xiêm ............................................................................ 93 Hình 3.38. Phổ 1H-NMR của phân đoạn AMF-3 trong dung môi CDCl3. .............. 95 Hình 3.39. Sắc đồ HPLC-PDA đối với phân đoạn AMF-3. ..................................... 96

Hình 3.40. Phổ MALDI-TOF-HRMS của các hợp chất acetogenin trong phân đoạn

AMF-3 ....................................................................................................................... 97

Hình 3.41. Quy trình phân tích định tính, bán định lƣợng các hợp chất trong tinh dầu

chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn ................................................ 100

x

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm ở một trong những khu hệ thực vật phong phú nhất trên thế

giới, khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á. Với bờ biển dài 3200 km và đƣờng biên

giới trên đất liền dài tới 4630 km, rừng núi chiếm 3/4 diện tích cả nƣớc, đất nƣớc ta

sở hữu một nguồn tài nguyên động thực vật vô cùng phong phú. Theo các tài liệu đã

công bố, hiện nay có khoảng trên 12000 loài thực vật hiện hữu ở Việt Nam [6], [7],

[10], [20], [24]. Theo thống kê của Phan Kế Lộc thì đã có 10386 loài thực vật bậc

cao có mạch thuộc 2257 chi và 305 họ (trong đó có 733 loài chỉ gặp trong trồng

trọt) [26]. Những nghiên cứu phát hiện thuốc từ nguồn thảo dƣợc Việt Nam nhằm

giúp chủ động nguồn nguyên liệu sẵn có cũng đã đƣợc chú ý thực hiện. Một phần

các thuốc hiện đại là các hợp chất thiên nhiên hoặc các dẫn xuất của chúng đƣợc sử

dụng trực tiếp trong công nghiệp dƣợc và chúng đƣợc phát triển và ứng dụng rất

nhanh ở châu Âu và Bắc Mỹ. Các chƣơng trình sử dụng thuốc cổ truyền tại các

nƣớc đang phát triển nhƣ Mexico, Trung Quốc và Nigeria đang đƣợc xúc tiến mạnh

mẽ đặc biệt là sử dụng chúng để hỗ trợ điều trị bệnh bằng các thực phẩm chức năng

[8], [10], [21].

Các nội dung chính trong những nghiên cứu về các HCTN có hoạt tính sinh

học là (i) Xây dựng các quy trình tách chiết thích hợp để thu đƣợc các hợp chất có

HTSH có giá trị cho các ngành dƣợc, công nghệ sinh học, y sinh... ; (ii) Tách chiết

và tinh chế để thu đƣợc các HCTN có HTSH làm chất chuẩn để định lƣợng chúng

trong các loài cây thuốc (thực vật nói chung) khác nhau; (iii) Xây dựng quy trình

phân tích (định tính và định lƣợng) các HCTN có HTSH trong các đối tƣợng mẫu

khác nhau; (iv) Phân tích cấu trúc và xác định HTSH của các hợp chất mới; (v)

Nghiên cứu xác định HTSH của các hợp chất thiên nhiên và ứng dụng chúng vào

các lĩnh vực khác nhau.

Nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về tách các HCTN có HTSH từ

cây Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân...bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và phân

tích hàm lƣợng bằng HPLC [18], [27], [31]. Một số nghiên cứu đã xây dựng quy

trình phân tích HCTN có HTSH nhƣ acetogenin [46], [51], [90], tinh dầu bằng

1

phƣơng pháp GC-MS, LC-MS/MS [33]. Mặt khác, gần đây, một số nghiên cứu về

các loài annona, bao gồm Mãng cầu xiêm (A. muricata) cho thấy chúng có chứa

một nguồn phong phú các hợp chất acetogenin annonaceous (AGEs) [98]. Các

nghiên cứu về cây thuộc chi Riềng đã cho thấy loài này chứa nhiều hợp chất có

HTSH có giá trị nhƣ camphor, camphen, borneol và bornyl acetat,… đƣợc sử dụng

rộng rãi làm hƣơng liệu mĩ phẩm, thực phẩm và làm gia vị trong các món ăn [33].

Cho đến nay, mới có một vài nghiên cứu tập trung phân tích nhóm chất có HTSH

acetogenin trong cây Mãng cầu xiêm và phân tích các hợp chất trong toàn bộ cây

Riềng đuôi nhọn [46], [51], [70], [89], [90]. Song, chƣa có nghiên cứu nào xác định

đƣợc hàm lƣợng mỗi chất có HTSH trong các bộ phân của cây, để định hƣớng cho

các nghiên cứu tiếp theo tách chiết các hợp chất có giá trị từ các bộ phận riêng biệt

của cây.

- Về hƣớng (ii) – tinh chế để thu đƣợc các chất tinh khiết cũng đƣợc nhiều

nghiên cứu quan tâm, song chủ yếu là các PTN/các hãng dƣợc chuyên ngành nghiên

cứu và giá thành chất chuẩn có HTSH khá đắt. Trong khi đó, ở VN, cho đến nay,

những nghiên cứu theo hƣớng này còn rất hạn chế.

Xuất phát từ các vấn đề trên, luận án này đƣợc thực hiện nhằm mục đích đóng

góp tích cực vào các hƣớng nghiên cứu (i), (ii) và (iii) ở trên.

Mục đích của nghiên cứu luận án:

Luận án này đƣợc thực hiện nhằm xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, điều

chế chất chuẩn và phân tích một số HCTN có HTSH từ một số cây thuốc phân bố ở

các địa phƣơng của nƣớc ta: cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), Đan sâm

(Salvia miltiorrhiza B.), Mật nhân (Eurycoma longifolia J.), Mãng cầu xiêm

(Annona muricata (Soursop)), Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K. Schum.) - một

loài cây mới phát hiện.

Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:

Để đạt đƣợc những mục đích trên, các nội dung nghiên cứu chính bao gồm:

- Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết các hợp chất phyllanthin,

hypophyllanthin từ cây Diệp hạ châu; hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone,

tanshinone IIA từ cây Đan sâm và hợp chất eurycomanone từ cây Mật nhân bằng

2

các phƣơng pháp sắc ký;

- Tinh chế các hợp chất thu đƣợc (phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I,

cryptotanshinone, tanshinone IIA, eurycomanone) để tạo ra các chất chuẩn cho phân

tích định tính và định lƣợng chúng trong các dƣợc liệu khác nhau;

- Xây dựng quy trình phân tích các hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin,

tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone bằng phƣơng

pháp sắc ký lỏng hiện đại LC-MS/MS, UPLC-DAD để có thể áp dụng cho các PTN

phân tích ở nƣớc ta;

- Nghiên cứu xác định hàm lƣợng các hợp chất có HTSH trong dịch chiết lá

cây Mãng cầu xiêm bằng phƣơng pháp sắc ký hiện đại: sắc ký lỏng ghép nối với các

detector khác nhau (qNMR, HPLC-PDA, MALDI-TOP HRMS) và các hợp chất có

trong tinh dầu các bộ phận (lá, thân, rễ...) của cây Riềng đuôi nhọn bằng phƣơng

pháp sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ (GC-MS).

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC VÀ MỘT SỐ CÂY THUỐC

1.1.1. Giới thiệu chung

Hợp chất thiên nhiên hay hợp chất tự nhiên là các chất hóa học có nguồn gốc

từ thiên nhiên hoặc đƣợc con ngƣời tách ra từ các loại động vật, thực vật trong tự

nhiên có thể có hoạt tính sinh học hoặc có tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc.

Trong sự phát triển của loài ngƣời, thiên nhiên có vai trò vô cùng quan trọng, nó

không chỉ cho chúng ta nơi cƣ ngụ mà còn cung cấp cho chúng ta những vật chất

thiết yếu cho cuộc sống. Hóa học các hợp chất thiên nhiên là hóa học các hợp chất

hữu cơ đƣợc tạo ra từ các tổ chức sống (vi sinh vật, nấm, động thực vật...) tìm thấy

trong tự nhiên, thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc học đƣợc sử dụng để phát hiện và

phát triển thuốc chữa bệnh [108].

Ngƣời ta cũng cần dựa vào những khái niệm cơ bản về tính chất của các chất

(alkaloit có tính kiềm yếu và chứa nitơ), về các đơn vị hợp thành phân tử (terpenoit

tạo thành từ các đơn vị isopren) hay trên cơ sở các mối liên kết cơ bản (các glycosit

do có các liên kết glycosit)... để phân chia các lớp chất chính trong tự nhiên. Nhƣ

vậy, các hợp chất thiên nhiên có thể phân chia thành các lớp chất chính sau: các hợp

chất terpenoit, các hợp chất steroit, các hợp chất alkaloit, các hợp chất flavonoit, các

hợp chất phenolic, các hợp chất lipit, các hợp chất cacbohydrat, các hợp chất axit

amin, peptit và protein, vitamin [21], [29], [108].

Các loài thực vật có chứa khoảng 5 triệu hợp chất hóa học. Cho tới nay, đã có

0,5 %, nghĩa là 1.300 cây đƣợc nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa

học và giá trị chữa bệnh [15]. Thuốc từ dƣợc liệu đƣợc sử dụng không chỉ các nƣớc

Á Đông mà còn đƣợc tiêu thụ một lƣợng khá lớn ở các nƣớc phƣơng Tây. Ở các

nƣớc có nền công nghiệp phát triển thì một phần tƣ số thuốc kê trong các đơn có

chứa hoạt chất từ dƣợc liệu…[32].

Các hợp chất thiên nhiên là nguồn cung cấp các phân tử có sự đa dạng rất lớn về

cấu trúc và hoạt tính sinh học. Sự đa dạng về cấu trúc hoá học của các hợp chất thiên

4

nhiên có thể có liên quan đến sự đa dạng sinh học của các nguồn thiên nhiên sinh tổng

hợp ra các hợp chất này. Hơn nữa, các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ

thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất

dẫn đƣờng hoặc phân tử hiện đại cho tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Việc sử dụng

các sản phẩm thiên nhiên đóng vai trò là nguồn các hợp chất dẫn đƣờng làm phong phú

và đa dạng về cấu trúc của các hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp thuốc [21].

1.1.2. Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính

sinh học

Cho đến nay ở Việt Nam và trên toàn thế giới đã có khá nhiều công trình

nghiên cứu về chiết tách các HCTN có HTSH. Một trong những nghiên cứu đầu

tiên là tách chiết thành công artermisin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia

annua L.) và chuyển hóa thành nó thành các dẫn xuất có hoạt tính cao hơn

(artermether, artesunat…) làm thuốc chống sốt rét. Nghiên cứu phân lập taxol từ

cây thông đỏ (Taxus baccata L); Chiết l-tetrahydropalmatin từ rễ củ của một số loại

cây Bình vôi (Stephania spp.) làm thuốc an thần; Tách chiết berberin từ loài cây

Vàng đắng (Coscinium fenestratum); Tách curcumin từ cây Nghệ (Curcuma longa

L.), rutin từ nụ Hoa hòe (Styphnolobium japonicum L.); Tách vinblastin, vincristin

từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus L.)… [20], [35]. Hàng ngàn năm nay, tự

nhiên là nguồn cung cấp các tác nhân điều trị bệnh, với con số ấn tƣợng về lƣợng

thuốc hiện đại có nguồn gốc tự nhiên dựa trên cơ sở sử dụng làm thuốc truyền thống

của chúng. Một số lƣợng lớn thuốc bán chạy nhất trong thế kỷ 20 đều đƣợc tách

chiết từ các thảo dƣợc khác nhau nhƣ: vincristin từ cây Dừa cạn - Vinca rosea, morphin từ cây Anh túc - Papaver somniferum, Taxol từ cây Thông đỏ - Taxus brevifolia... Riêng trong năm 2001, đã có tới 8 hợp chất (simvastatin, pravastatin,

amoxycillin, axit clavulanic, azithromycin, ceftriaxone, cyclosporin và paclitaxel)

có mặt trong số 30 thuốc bán chạy nhất trên thế giới với tổng kinh phí khoảng 16 tỷ

đô la Mỹ [29], [108].

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung vào tách chiết các

HCTN có hoạt tính sinh học từ một số loài thảo dƣợc có sẵn ở nhiều địa phƣơng của

nƣớc ta nhƣ cây Diệp hạ châu, cây Đan sâm, cây Mật nhân, cây Mãng cầu xiêm và

cây Riềng đuôi nhọn...

5

1.1.3. Một số loài cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

1.1.3.1. Cây Diệp hạ châu

Cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) còn có tên gọi khác là cây Chó đẻ

răng cƣa, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là một loại thảo mộc đƣợc sử dụng

nhiều trong các bài thuốc cổ truyền chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm

da, lở ngứa, bệnh gan, sốt, đái tháo đƣờng... Hiện nay các sản phẩm thuốc có nguồn

gốc từ Diệp hạ châu khá nhiều. Thành phần hóa học bao gồm lignan, tannin,

flavonoid, axit phenolic, terpenoid và các loại hợp chất khác. Đến nay, 93 hợp chất

đã đƣợc xác định và cấu trúc đƣợc làm sáng tỏ từ các chất chiết xuất từ cây Diệp hạ

châu bao gồm 22 lignan, 16 tannin, 12 flavonoid, 21 phenolic, 13 terpenoid và các

chất chuyển hóa thứ cấp khác. Thành phần có hoạt tính quan trọng nhất đƣợc tập

trung nghiên cứu chủ yếu là phyllanthin, hypophyllanthin, corilagin, geraniin,

brevifolin, các dẫn xuất của nó và rutin. Các hợp chất chiết từ các loài Chó đẻ thân

xanh (P. amarus), cây Diệp hạ châu (P. urinaria) có hoạt tính kháng virus, kháng

khuẩn, đặc biệt là ức chế hoạt động của virus viêm gan B. Lignan là các hợp chất

đóng một vai trò quan trọng trong các hệ thống phòng thủ thực vật. Lignan có các

hoạt tính sinh học nhƣ là chất chống oxy hóa, chống ung thƣ, estrogen, kháng virus

và hạ huyết áp. Các ngành công nghiệp dƣợc phẩm sử dụng chúng làm tiền chất cho

sự tổng hợp của thuốc chống ung thƣ. Phyllanthin là một lignan có hoạt tính chống

oxy hóa, chống viêm, miễn dịch và bảo vệ gan đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều

bệnh gan [7], [10], [62]. Ngoài ra, phyllanthin có hoạt tính chống oxy hóa bao gồm

ức chế superoxide enzyme dismutase (SOD) và glutathione reductase và làm giảm

tổn thƣơng oxy hóa do ethanol gây ra trong tế bào gan chuột. Nó có tác dụng làm

gia tăng lƣợng glutathione có vai trò bảo vệ và phục hồi tế bào gan, làm giảm men

gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B. Các nghiên cứu chỉ ra

rằng hypophyllanthin là một lignan cô lập từ P. urinaria có tiềm năng hoạt tính sinh

học bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, miễn dịch kháng virut, chống

ung thƣ, chống virut viêm gan B và tác dụng bảo vệ gan. Nó có tác dụng làm gia

tăng lƣợng glutathione có vai trò bảo vệ và phục hồi tế bào gan, làm giảm men gan

do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B [50], [64], [87].

6

1.1.3.2. Cây Đan sâm

Cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) thuộc chi Salvia, họ Hoa môi

(Lamiaceae) còn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm. Thành phần hóa học chính

trong cây Đan sâm là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần

khác. Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của Đan sâm đã đƣợc chia thành hai

nhóm là tanshinontan trong lipid và acid phenolic tan trong nƣớc [6], [7], [10]. Đến

nay, hơn 20 acid phenolic phân lập từ rễ cây Đan sâm đã đƣợc nghiên cứu. Các chất

có hoạt tính thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA,

cryptotanshinon... Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã đƣợc phân lập và

sinh tổng hợp [55], [103]. Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của

cây Đan sâm. Các tác dụng đã đƣợc chứng minh bao gồm: làm giãn mạch vành,

chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ [57], [85]. Ngoài ra, Đan sâm còn đƣợc

chứng minh có tác dụng chống đau thắt ngực [44], [54]. Tác dụng làm hạ đƣờng

huyết, hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [49], [54]. Tác dụng

an thần, chống vi khuẩn, chống nấm, tốt cho trƣờng hợp nấm ngoài da, mụn trứng

cá, rụng tóc, ngứa và mề đay [60], [103], [118]. Hoạt tính chống viêm [35], hoạt

tính chống oxy hóa mạnh [7], [54], và có tác dụng chống ung thƣ [2], [85].

Cryptotanshinon là thành phần đƣợc phân lập từ rễ của cây Đan sâm, có hoạt

tính kháng khuẩn mạnh, chống dermatophytic, chất chống oxy hóa, chống viêm và

chống ung thƣ, hoạt động của cryptotanshinon cũng có thể ức chế các tế bào sản

xuất endothelia endothelin-1 và tạo ra sự khác biệt của một số tế bào nhƣ các tế bào

gốc trung mô tủy xƣơng. Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có

tác dụng giảm đáng kể kích thƣớc vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn

gốc tự do ở màng ty thể tim [57], [103]. Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa

LDL và hoạt động của angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim [118].

Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon I có tác dụng giảm đáng kể kích

thƣớc vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim.

Tanshinon I ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của angiotensin II, từ đó

làm giảm phì đại tế bào cơ tim [49], [118].

7

1.1.3.3. Cây Mãng cầu xiêm

Cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)) có tên gọi khác là Na xiêm

hay mãng cầu gai thuộc chi Annona, họ Na [94]. Nghiên cứu về thành phần hóa học

của Mãng cầu xiêm cho thấy sự đa dạng về cấu trúc hợp chất bởi có nhiều lớp chất

đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc. Khái quát từ các công trình nghiên cứu đã

cho biết các lớp chất bao gồm: cacbohydrat, lipit, amino axit, phenolic axit,

proanthocyanidin, tannin, flavonoit, monotecpen, sesquitecpen, ditecpen, tritecpen,

ancaloit, polyprenol, hợp chất thơm, cyclopeptit, acetogenin,.. [22], [59]. Trong số

đó, các hợp chất acetogenin có cấu trúc rất đặc biệt và chỉ đƣợc tìm thấy trong

Mãng cầu xiêm cũng nhƣ các loài thuộc họ na, sự độc đáo này không chỉ dừng lại ở

cấu trúc hóa học mà hoạt tính sinh học của chúng cũng nổi bật nhờ khả năng gây

độc các dòng tế bào ung thƣ trên cơ thể con ngƣời, đồng thời cấu trúc của các hợp

chất này cũng khá đa dạng [95], [100]. Mãng cầu xiêm (lá, rễ và hạt) đƣợc dùng làm

thuốc tại rất nhiều nơi trên thế giới, nhất là tại các quốc gia Nam Mỹ [8], [9]. Phần

lớn các nghiên cứu về ung thƣ trên chi Annona tập trung vào lớp chất mới có nguồn

gốc từ thiên nhiên đƣợc gọi là annonaceous acetogenin. Ba nhóm nghiên cứu độc

lập đã phân lập các hợp chất acetogenin từ chi Annona này đã cho thấy khả năng

chống khối u, chống ung thƣ và chống lại các độc tính có chọn lọc với các loại tế

bào ung thƣ khác nhau (mà không làm hại các tế bào khỏe mạnh), có tám nghiên

cứu lâm sàng đã đƣợc công bố dựa trên các phát hiện này. Nhiều hợp chất

acetogenin đã chứng minh tính gây độc chọn lọc về tác dụng gây độc các tế bào ung thƣ với liều lƣợng rất thấp khoảng 1/106. Cụ thể là dòng tế bào bào ung thƣ biểu mô

ở phổi, dòng khối u ở ngực ngƣời, ung thƣ tuyến tiền liệt, dòng tế bào ung thƣ biểu

mô tuyến tụy, dòng tế bào ung thƣ tuyến đại tràng, dòng tế bào ung thƣ gan dòng tế

bào ung thƣ hệ bạch huyết ở ngƣời và nhiều loại thuốc kháng ung thƣ ác tính ở

ngực ngƣời [59], [95]. Xem xét hoạt động kháng u và gây độc tế bào, annonacin có

thể đƣợc sử dụng nhƣ là một chất dẫn đƣờng để phát triển tiềm năng của các tác

nhân chống ung thƣ. Tuy nhiên, một chú ý rất quan trọng là annonacin chỉ ức chế sự

phát triển bình thƣờng của các khối u phổi trong thời gian kéo dài hai tuần, nó

không tiêu diệt các khối u và cũng không làm ngừng sự tăng trƣởng của chúng một

cách hoàn toàn [22].

8

1.1.3.4. Cây Mật nhân

Cây Mật nhân (Eurycoma longifolia J.) là một loài thực vật có hoa thuộc họ

Simaroubaceae [7], [45], [96]. Các nghiên cứu cho thấy cây Mật nhân chứa các lớp

chất có hoạt tính sinh học nhƣ quassinoid, alkaloid, triterpenoid, steroid, dẫn xuất

squalene

và

eurycolactone,

eurycomalactone,

laurycolactone,

biphenyl

neolignan...[96]. Theo y học cổ truyền, Mật nhân có vị đắng, tính mát, có tác dụng

thanh nhiệt, tiêu viêm, lợi thấp, lợi tiểu, thƣờng dùng chữa tiểu tiện ra máu, nhức

mỏi, ăn không tiêu, đầy hơi, chƣớng bụng,... Vỏ rễ cây Mật nhân có vị rất đắng nên

sử dụng làm thuốc tẩy giun, trị sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc, thuốc trị ghẻ lở…. Dịch

chiết từ rễ của Mật nhân đƣợc sử dụng làm thuốc chữa rối loạn chức năng tình dục,

lão hóa, sốt rét, ung thƣ, tiểu đƣờng, lo âu, đau nhức, táo bón, hồi sức, sốt, tăng

năng lƣợng, tăng sức mạnh, bệnh bạch cầu, loãng xƣơng, căng thẳng, giang mai...

[24], [36], [45]. Eurycomanone là một quassinoid có hoạt tính sinh học cao đƣợc

phân lập từ mật nhân, hợp chất này vẫn chƣa đƣợc tìm thấy ở các loài thực vật khác

ngoài mật nhân, và đƣợc coi là một hợp chất đánh dấu đặc trƣng của cây Mật nhân

[45], [96]. Eurycomanone là một quassinoid chính trong dịch chiết từ rễ E.

longifolia, nó làm tăng đáng kể sản xuất testosterone theo liều lƣợng. Nó tăng

cƣờng sự tạo men testosterone ở các tế bào tinh hoàn của chuột bằng cách ức chế sự

chuyển đổi aromatase của testosterone thành estrogen. Nó giúp điều trị vô sinh, tăng

cƣờng sinh lực phái mạnh và có tác dụng chống estrogen [96].

1.1.3.5. Riềng đuôi nhọn

Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K. Schum.) thuộc chi Riềng (Alpinia), họ

Gừng (Zingiberaceae). Là loài cây có giá trị sử dụng làm thuốc, làm cảnh, cho tinh

dầu… (theo kinh nghiệm dân gian). Tinh dầu từ thân rễ (tƣơi hoặc khô) của hầu hết

các loài riềng đều có chứa các hợp chất có tính kháng khuẩn, kháng nấm, tiêu diệt

các loài kí sinh và côn trùng. Những thử nghiệm invivo và invitro đã cho thấy dịch

chiết từ thân rễ ở một số loài riềng (bằng nƣớc, alcohol, ete) đều có tác dụng diệt

khuẩn mạnh, chẳng hạn các loại khuẩn: Bacillus subtilus, Eschirichia coli,

Stachilococcus aureus [12], [14], [78]. Giữa hƣơng thơm và tinh dầu riềng cũng có

những mối quan hệ chặt chẽ, trong tinh dầu riềng có chứa chủ yếu các hợp chất

9

camphor, camphen, borneol và bornyl acetat, chính bởi các hợp chất này làm cho

các loài riềng đều có tính hăng cay, đƣợc sử dụng rộng rãi làm hƣơng liệu mĩ phẩm,

thực phẩm và làm gia vị trong các món ăn. Tinh dầu riềng nếp có chứa các hợp chất

có tác dụng nhƣ những tác nhân chống nấm và diệt khuẩn rất tốt [37], [66], [71].

Chúng còn có khả năng bảo vệ nhiều loài thực vật nhờ khả năng tiêu diệt các loài vi

sinh vật gây bệnh [37], [75]. Khi khảo sát riêng rẽ hoạt tính của sáu hợp chất chính

trong tinh dầu từ thân rễ loài A. galanga, kết quả còn cho thấy: terpinen-4-ol là hợp

chất hoạt động nhất; n-pentan cùng dietyl ete chiết từ thân rễ khô là tác nhân chống

lại Trichophyton meutagrophytes; acetoxy chavicol acetat có hoạt tính chống lại 7

loại nấm với nồng độ nhỏ nhất nằm trong khoảng 20-250µg/ml. Tuy có hoạt tính

cao nhƣng tinh dầu riềng chƣa đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học hiện đại [76],

[99], [115]. Tinh dầu ở loài Alpinia calcarata có khả năng chống oxy hóa gốc tự do

trong kháng nấm trên cây trồng [42], [43]. Tinh dầu quả của loài Alpinia maclurei

có khả năng kháng lại tụ cầu khuẩn [113]. Từ tinh dầu rễ của loài A. pinnaensis ở

Việt Nam đƣợc Văn Ngọc Hƣớng và cộng sự công bố có khả năng kháng vi sinh vật

kiểm định [33]. Nhƣ vậy, trƣớc đây các nhà nghiên cứu chỉ chú trọng vào đánh giá

về thành phần loài tinh dầu trong thực vật. Tuy nhiên, thời gian gần đây đã thử hoạt

tính sinh học của các mẫu tinh dầu đƣợc nghiên cứu, hầu hết các loại tinh dầu đều

có tính ứng dụng cao nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, kháng côn trùng,..

Thực vật luôn là nguồn cung cấp sản phẩm thiên nhiên phong phú cho y học kể

cả các hoạt chất sử dụng trực tiếp hay các chất dẫn đƣờng tạo hoạt chất có hoạt tính

cao bằng phƣơng pháp tổng hợp. Thực vật còn cung cấp đa dạng các cấu trúc phức

tạp mà hầu nhƣ không thể tổng hợp đƣợc trong phòng thí nghiệm. Hơn thế nữa, trong

quá trình tiến hóa, để tồn tại các thực vật còn có khả năng tạo ra các hợp chất có hoạt

tính cao hơn ngăn cản các động vật tiêu thụ chúng. Ngày nay, rất ít các loài động thực

vật đã đƣợc nghiên cứu toàn diện, phần lớn chúng chƣa đƣợc nghiên cứu, khám phá.

Những nhóm chất chính trong giới thực vật gồm: phytosterol, terpenoit, alkaloit,

glycosit, đƣờng, các phenol và polyphenol tự nhiên [29].

Tiềm năng của thực vật bậc cao là nguồn cung cấp dƣợc phẩm mới nhƣng chỉ

đƣợc khảo sát bƣớc đầu. Trong số các sinh vật thì chỉ một tỷ lệ phần trăm nhỏ là đã

10

đƣợc nghiên cứu về mặt hóa học thực vật, và một phần còn nhỏ hơn nữa đƣợc đƣa

vào các nghiên cứu sàng lọc sinh học và dƣợc lý học [21], [29], [108].

1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Để phân tích các HCTN có HTSH ngƣời ta thƣờng sử dụng các phƣơng pháp

khác nhau nhƣ: Phân tích định tính bằng phƣơng pháp sắc ký giấy (TLC); Phân tích

định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký khí (GC) hoặc phƣơng pháp sắc ký lỏng (LC)

ghép nối với các detector khác nhau.

Để phân tích cấu trúc các HCTN nói riêng và các hợp chất hữu cơ nói chung,

ngƣời thƣờng sử dụng các phƣơng pháp phổ khác nhau nhƣ quan phổ hấp thụ phân

tử (UV-Vis), quang phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt

nhân (NMR)...

Dƣới đây sẽ giới thiệu sơ lƣợc về các phƣơng pháp GC, LC.

1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký khí

Trong thảo dƣợc cũng tồn tại nhiều thành phần, trong đó có thành phần rất dễ

bay hơi. Các thành phần rất dễ bay hơi này có những đặc tính riêng biệt của từng

loài thảo dƣợc, chính những tính riêng biệt này tạo ƣu thế cho việc xây dựng sắc ký

dấu vân tay của các thảo dƣợc theo phƣơng pháp sắc ký khí. Phân tích bằng GC thu

đƣợc sự chính xác và độ nhạy cao cho các thành phần hóa học dễ bay hơi. Tuy

nhiên, phƣơng pháp phân tích này cũng gặp khó khăn khi các mẫu thảo dƣợc ở dạng

phân cực và không phải là thành phần dễ bay hơi.

Trong phƣơng pháp sắc ký khí ghép nối detector khối phổ (GC-MS), mẫu

đƣợc tiêm vào cổng bơm của thiết bị GC, đƣợc làm bay hơi, và đƣợc tách trong cột

GC, sau đó đƣợc phân tích bởi detector MS và ghi phổ. Thời gian từ lúc tiêm mẫu

và rửa giải ra khỏi cột đƣợc gọi là thời gian lƣu (tR). Các thiết bị sử dụng cho GC-

MS thông thƣờng bao gồm một cổng tiêm ở một đầu của một cột kim loại (thƣờng

đƣợc đóng gói với một loại vật liệu nhƣ silicagel để thúc đẩy quá trình tách tối đa)

và một máy dò (MS) ở đầu kia của cột. Một khí mang (có thể là argon, heli, nitơ,

hydro, hay một vài khí khác) đẩy mẫu xuống cột. Trong lúc GC phân tách các hợp

chất trong hỗn hợp, các detector MS cung cấp thông tin hỗ trợ trong việc xác định

cấu trúc của mỗi hợp chất. Các cột sử dụng trong GC-MS có thể là hai loại sau: cột

11

mao quản và cột nhồi [25].

Các bộ ghép nối hay đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong GC-MS là các kiểu ion

hóa va chạm electron (EI) và ion hóa hoá học (CI). Tuy nhiên, trong hệ thống GC-

MS hiện đại, có thể sử dụng nhiều kiểu khác nhau để phát hiện các ion phân tử. Ví

dụ, khối phổ TOF kết hợp trục giao với GC đƣợc sử dụng để xác định độ tinh khiết

và nhận danh các hợp phần bằng cách đo và tính toán chính xác khối lƣợng của các

thành phần nguyên tố. Ngày nay, một máy GC-MS đƣợc tích hợp trực tuyến với cơ

sở dữ liệu MS khác nhau của một số hợp chất tham khảo để tìm kiếm các phổ phù

hợp cho các hợp chất tách đƣợc [25], [38]. Hệ khối phổ là hệ có độ nhạy cao, đƣợc

sử dụng để phân tích khối lƣợng. Thông tin mang lại là khối lƣợng phân tử cũng

nhƣ các thông tin có liên quan đến cấu trúc của phân tử. GC-MS, đó là một kỹ thuật

ghép nối phát triển từ việc kết hợp kỹ thuật GC và MS, là loại hình ghép nối đầu

tiên trở nên hữu ích cho mục đích nghiên cứu và phát triển. GC-MS đã đƣợc ứng

dụng rộng rãi trong việc phân tích tinh dầu có mặt trong thảo dƣợc. Với GC-MS

ngƣời ta biết đƣợc những thông tin liên quan đến định tính và định lƣợng các thành

phần có mặt trên bản sắc ký, những thông tin này rất hữu ích trong các nghiên cứu

đánh giá mối tƣơng quan giữa thành phần hóa học và hoạt tính của thảo dƣợc [38],

[104]. Với MS, phƣơng pháp phát hiện hay đƣợc sử dụng là quang phổ khối lƣợng

bẫy ion, tứ cực (một hoặc ba tứ cực) và thời gian bay (TOF) là những công cụ đƣợc

dùng thƣờng xuyên nhất, ngày nay cả LC-MS và GC-MS cũng là các kỹ thuật ghép

nối đƣợc sử dụng phổ biến nhất [111]. Khối phổ thu đƣợc bằng kỹ thuật ghép nối

này cung cấp thông tin về cấu trúc dựa trên việc giải thích của các phân mảnh. Độ

phong phú tƣơng đối của các mảnh ion có thể đƣợc so sánh với thƣ viện phổ. Các

hợp chất rất dễ bay hơi, kích thƣớc nhỏ, và bền vững ở nhiệt độ cao trong điều kiện

GC có thể dễ dàng phân tích bằng GC-MS. Đôi khi, một số hợp chất phân cực mà

đặc biệt khi chúng có chứa nhóm hydroxyl thì cần phải đƣợc dẫn xuất hoá để phân

tích GC-MS. Kỹ thuật dẫn xuất phổ biến nhất là sự chuyển hóa chất phân tích thành

dẫn xuất trimetylsilyl của nó [38].

1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một công cụ phân tích hiện

12

đại, đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu các HCTN hiện

nay. Lợi thế của việc sử dụng công cụ HPLC trong việc phân tích các thảo dƣợc bởi

vì các thiết bị này rất dễ sử dụng và không bị hạn chế bởi các thành phần bay hơi

hay không bay hơi cũng nhƣ độ bền, độ phân cực của mẫu nghiên cứu. Thông

thƣờng hệ HPLC thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích hầu hết các hợp chất có mặt

trong thảo dƣợc. Các hợp chất có khả năng hấp thụ quang thì sử dụng detector UV-

Vis hoặc detector hấp thụ huỳnh quang Fluorescene detector, đối với các hợp chất

không có khả năng hấp thụ quang thì sử dụng detector tán xạ ánh sáng ELSD

(Evaporative Light Scattering Detector) [91], [111]. Sự phát triển của kỹ thuật ghép

nối LC với các detector khác nhau đã giúp nâng cao hiệu quả tách và phân tích và

do vậy, trong 20 năm qua đã ra đời các hệ thống thiết bị hiện đại nhƣ LC/UV,

LC/UV- DAD, LC/MS và gần đây là LC/NMR. Với các hệ thiết bị đó, không chỉ

thuận lợi trong phân tích (định tính, định lƣợng) các HCTN, mà còn cho phép phân

tích cấu trúc và nhận dạng chất, đồng thời lƣu trữ dữ liệu phổ của các hợp chất mới

để ngày càng bổ sung vào thƣ viện phổ của các HCTN trong các phần mềm đi kèm

các hệ thiết bị đó. Mặt khác, các hệ thiết bị đó còn hỗ trợ thuận lợi việc nghiên cứu

và phân tích các loại mẫu phức tạp nhƣ các mẫu thực vật thô, các hợp phần tách

chiết từ các mẫu thực vật... (các mẫu phức tạp đó có thể chứa đến hàng trăm thành

phần khác nhau) [72], [73], [74].

Để tiến hành phân tích, trƣớc hết mẫu đƣợc ly trích bằng một dung môi hữu cơ

và đƣợc làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết

đƣợc làm sạch và đƣợc hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với

các detector UV, PDA, FLD hoặc MS, MS/MS. Detector huỳnh quang (FLD) – một

trong những detector có độ nhạy cao – cũng thƣờng đƣợc sử dụng, song trƣớc khi

qua detetor FLD, chất phải đƣợc dẫn qua cột DA (để nó phản ứng với một chất chọn

lọc, tạo dẫn xuất huỳnh quang). Nguyên lý tách trong phƣơng pháp LC nói chung

và HPLC nói riêng là dựa vào ái lực của các cấu tử với 2 pha (khi dòng mẫu đi qua

cột tách) - pha tĩnh (có thể là dạng pha đảo hoặc pha thuận), thƣờng là pha rắn và

pha động (lỏng) và do vậy, mỗi cấu tử sẽ đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở các thời gian

khác nhau (đƣợc gọi là thời gian lƣu) theo một trình tự xác định. Cấu tử ra khỏi cột

13

đƣợc đƣa vào detector UV, PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) hoặc detector

khối phổ MS/MS. Với detector UV hay DAD, cấu tử đƣợc định lƣợng bằng cách đo

độ hấp thụ quang của nó ở một bƣớc sóng lựa chọn xác định. Khi sử dụng detector

MS, trƣớc hết cấu tử (sau khi ra khỏi cột tách) đƣợc ion hóa (trong nguồn ion hóa)

tạo thành các ―mảnh‖ (fragment) khác nhau và tiếp theo, chúng đƣợc tách ra khỏi

nhau (trong bộ phận phân tích khối lƣợng) dựa vào thông số m/z. Phổ khối lƣợng

của tất cả các mảnh đƣợc ghi bởi detector MS và từ đó, cho phép phân tích định tính

và định lƣợng một cách thuận lợi và chính xác. Hiện nay, GC-MS, GC-MS/MS và

HPLC-MS, HPLC-MS/MS đƣợc xem là những phƣơng pháp phân tích hiệu quả và

đạt đƣợc độ nhạy cao nhất trong lĩnh vực phân tích hữu cơ [47]. Mặt khác, để cải

thiện độ nhạy và khả năng phân tách các mảnh một cách chính xác, ngƣời ta còn sử

dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau nhƣ ES (phun mù electron), APCI (ion hóa hóa

học ở áp suất khí quyển), TSP (nhiệt phun), CFFAB (dòng bắn phá nguyên tử

nhanh liên tục... và kỹ thuật phân tách khối lƣợng khác nhau nhƣ hệ tứ cực

(Quardrupole / Q), bẫy ion (CNTT), thời gian bay (TOF)... [72].

Phổ LC/MS/MS đƣợc sử dụng cơ sở dữ liệu MS/MS của sản phẩm tự nhiên có

thể đƣợc xem xét cho sàng lọc nhanh. Nhƣ vậy, LC/MS có thể là một kỹ thuật cực

kỳ mạnh mẽ để sàng lọc chiết xuất thực vật thô, nhƣng các điều kiện ion hoá phải

đƣợc tối ƣu hóa cẩn thận [47]. Việc sử dụng LC-MS-MS ngày càng gia tăng. Kỹ

thuật ghép nối giữa HPLC với UV và khối phổ (LC-UV-MS) đã mang lại nhiều

thuận lợi khi kết hợp với sàng lọc sinh học để tăng nhanh tốc độ điều tra các sản

phẩm thiên nhiên.

Trong số các kỹ thuật quang phổ có sẵn cho đến nay, có lẽ NMR có độ nhạy

kém nhất, nhƣng nó cung cấp thông tin cấu trúc hiệu quả nhất cho việc làm sáng tỏ

cấu trúc của hợp chất thiên nhiên. Sự phát triển của kỹ thuật cho phép ghép nối trực

tiếp giữa các hệ thống HPLC với NMR, dẫn đến làm phát sinh các kỹ thuật thực

nghiệm mới HPLC-NMR hoặc LC-NMR, các kỹ thuật này đã từng đƣợc phát triển

rộng rãi hơn 15 năm qua. Kỹ thuật HPLC-NMR đầu tiên sử dụng nam châm siêu

dẫn đã đƣợc báo cáo trong những năm đầu thập niên 1980. Tuy nhiên, việc sử dụng

kỹ thuật ghép nối này trong các phòng thí nghiệm phân tích chỉ bắt đầu vào cuối

14

những năm 1990. LC-NMR hứa hẹn mang lại giá trị to lớn trong việc phân tích các

hỗn hợp phức tạp của tất cả các loại hợp chất, đặc biệt là phân tích hợp chất thiên

nhiên và các chất chuyển hóa có liên quan đến chất làm thuốc trong dung dịch sinh

học. Kỹ thuật LC- NMR có thể đƣợc thực hiện trong cả hai chế độ dòng chảy liên

tục và dòng chảy dừng. Một loạt các vấn đề phân tích sinh học có thể đƣợc giải quyết bằng cách sử dụng hệ thống 500, 600, và 800 MHz với detector 1H, 13C, 2H, 19F, và 31P.

Ngoài các thiết bị đo đạc NMR và HPLC, điều kiện tiên quyết chính cho LC-

NMR trực tuyến là detector dòng chảy liên tục và cài đặt một van trƣớc khi detector

ghi phổ NMR kiểu dòng chảy liên tục hoặc dòng chảy dừng [40]. Một máy dò UV-

Vis cũng đƣợc sử dụng nhƣ là một detector sơ cấp đối với hoạt động của LC. Sử dụng cƣờng độ từ trƣờng cao hơn 9,4 T đƣợc áp dụng, ví dụ, cộng hƣởng 1H-NMR

tần số 400MHz cho ghép nối HPLC-NMR chuẩn. Bộ cảm biến phân tích dòng chảy

đƣợc xây dựng trƣớc tiên để thu đƣợc NMR dòng chảy liên tục. Tuy nhiên, yêu cầu

để xác định đầy đủ cấu trúc của các hợp chất chƣa biết, đặc biệt là các hợp chất

thiên nhiên mới, đƣa đến việc ứng dụng kiểu dòng chảy dừng. Trong thực tế, những

lợi ích của vòng tuần hoàn từ chu trình kín của việc tách-nhận dạng, cùng với tiềm

năng của việc sử dụng tất cả các kỹ thuật NMR-2D và NMR-3D sẵn có hoàn toàn tự

động, đã thúc đẩy việc áp dụng chế độ dòng chảy dừng, ví dụ, chế độ khoảng thời

gian [39], [83].

Nói chung, trong hệ thống LC-NMR, thiết bị LC bao gồm bộ bơm mẫu tự

động, bơm LC, cột, và một máy dò không NMR (ví dụ, UV, DAD, EC, chỉ số khúc

xạ, hoặc tính phóng xạ). Từ detector này, dòng chảy đƣợc dẫn vào thiết bị ghép nối

LC-NMR, có thể đƣợc trang bị với các vòng bổ sung cho bộ nhớ trung gian của các

đỉnh LC đƣợc chọn. Dòng chảy từ thiết bị ghép nối LC-NMR sau đó đƣợc đƣa vào

detector NMR cảm biến dòng chảy hoặc vào vùng chứa dung dịch thừa. Dòng chảy

sau khi đi qua detector nó đƣợc chuyển đến bể chứa phân đoạn để thu hồi và tiếp

tục khảo sát các phân đoạn khác nhau đƣợc phân tích bằng NMR. Một khối phổ kế

cũng có thể đƣợc gắn vào hệ thống thông qua một thiết bị tách ở đầu ra của thiết bị

ghép nối LC-NMR [40].

15

LC-NMR đại diện cho một kỹ thuật bổ sung hứa hẹn đầy tiềm năng cho kỹ

thuật LC-UV-MS để phân tích chi tiết cấu trúc trực tuyến. Trên thực tế, những tiến

bộ gần đây trong công nghệ NMR đã cải tiến kỹ thuật LC-NMR trở thành một công

cụ phân tích mạnh mẽ. Sự phát triển của các kỹ thuật thu hồi dung môi hiệu quả cho phép đo phổ LC-1H-NMR hiệu quả cao, cả chế độ dòng chảy liên tục và dòng chảy

dừng trong điều kiện HPLC pha đảo. Các dung môi không đƣợc đơteri hoá nhƣ

MeOH hoặc MeCN có thể đƣợc sử dụng trong khi đó, nƣớc đƣợc thay thể bằng

D2O.

Những kết quả đạt đƣợc trong việc sử dụng LC/NMR trong những năm gần

đây là rất ấn tƣợng và kỹ thuật này cung cấp vô giá thông tin trực tuyến trong phân

tích chiết xuất thực vật thô [47].

1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

Theo sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật và sự phát triển của các phƣơng pháp

phân tích hiện đại, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về các HCTN,

các sản phẩm từ HCTN và ứng dụng của nó. Những năm gần đây, các loại mẫu

nghiên cứu và các phƣơng pháp nghiên cứu càng trở nên phong phú và thiết thực

với thực tiễn cuộc sống. Ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng những phƣơng pháp

nào trong nghiên cứu phân tích các HCTN có HTSH nhƣ UV-Vis, HPLC-UV, CE,

LC-MS… Nói chung, có thể cho rằng, những nghiên cứu sử dụng các phƣơng pháp

hiện đại nhƣ UPLC-DAD, LC-MS/MS còn rất hạn chế. Một số nghiên cứu liên

quan đến tách chiết và phân tích các HCTN có HTSH trong các cây (Diệp hạ châu,

Đan sâm, Mật nhân, Mãng cầu xiêm và Riềng đuôi nhọn) đƣợc nêu ở bảng 1.1.

16

Bảng 1.1. Một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu

STT Cây Chất phân lập/phân tích Mẫu PT Phƣơng pháp Đặc điểm Năm TLTK LOD (ng/mL)

Hypophyllanthin, phyllanthin 1993 [101] - 1 Sắc ký, NMR, MS

Hypophyllanthin, phyllanthin Sắc ký, NMR, 2003 [52] 2 và các lignans khác MS

Sử dụng các phƣơng

Hypophyllanthin, phyllanthin HPLC-SPE- pháp kết hợp để phân tích các chất có cấu 2005 [110] 3 và các lignans khác NMR, C8 Toàn bộ cây trúc tƣơng tự nhau. Thời gian dài, thể tích

bơm mẫu nhiều

Độ nhạy kém, độ Diệp hạ châu Hypophyllanthin, phyllanthin HPTLC 80/40 2006 [61] 4 chính xác thấp

Sắc ký, C18, - Phyllanthin 2009 [79] 5 NMR, MS

- Phyllanthin Độ tinh sạch 98% 2014 [67] 6 Sắc ký, C18, NMR, MS

HPLC-MS/MS 0,1-2,0 Độ nhạy cao 2015 [63] 7 Hypophyllanthin, phyllanthin và các chất khác

17

Huyết tƣơng chuột Hypophyllanthin, phyllanthin HPLC 55 2019 [112] 8 Thời gian phân tích dài (50p), các pic chƣa

tách nhau rõ

Phyllanthin HPLC-UV 2011 [34] 33 9

Cây Diệp hạ Thời gian phân tích Phyllanthin UPLC-FD 2018 [30] 2,1 10 châu dài

Phyllanthin HPLC-UV 2013 [16] 11

Sắc ký ngƣợc

2004 [65] 12 Cryptotanshinone, tanshinoneI và tanshinoneIIA Phƣơng pháp phân tích kết hợp dòng, UV-Vis, LC-MS

2005 [82] 13 Cryptotanshinone, tanshinoneI và tanshinoneIIA Sắc ký, NMR, MS Các phƣơng pháp sắc ký để phân lập

Phenolic acids 2005 [116] Thời gian phân tích dài, phân tích đồng 14 HPLC-UV and HPLC-MS thời hỗn hợp chất

Thời gian phân tích

2005 [117] 15 Diterpenes, flavonolignans và các hợp chất phenolic Thực phẩm chức năng HPLC-DAD- ESI MS dài, phân tích đồng thời hỗn hợp chất

0,13,

Cây Đan sâm Dihydrotanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone I HPLC-MS/MS 2006 [84] 16 0,08, 0,06 và Giới hạn phát hiện thấp và tanshinone IIA 0,05 Cây thuốc

18

HPLC-UV 25-50 2008 [53] 17 Cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA Thời gian phân tích dài, phân tích đồng thời nhiều chất

HPLC-MS/MS 0,1-2 2008 [93] Phân tích đồng thời nhiều chất, giới hạn 18 Cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA Huyết tƣơng phát hiện bé

Nhiều hợp chất đặc trƣng của Phân tích đồng thời kết hợp phân tích vân 2015 [86] UHPLC-DAD 19 cây Đan sâm tay

HPLC-ECD,

40-66 2018 [77] 20 Cryptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA Kết hợp nhiều phƣơng pháp HPLC-UV HPLC-MS

Cryptotanshinone, tanshinone I Kết hợp nhiều phƣơng HPLC-DAD LC-SQD–MS 0,1-2 2020 [114] 21 and tanshinone IIA pháp hiện đại

LC–MS/MS

Cây thuốc 2018 [13] HPLC-UV 22 Cryptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA Thời gian phân tích dài

Phân lập và xây dựng

Tanshinone IIA HPLC-DAD [11] 23

phƣơng pháp định lƣợng

Eurycomanone 2011 [106] 24 Phân lập và xác định cấu trúc Sắc ký, NMR, MS

19

Cây Mật nhân Eurycomanone Phân lập và xác định cấu trúc, thử hoạt tính 2017 [80] 25 Sắc ký, NMR, MS sinh học

26 Ankaloid Dƣợc liệu HPLC-PAD 2002 [56] Xác định hàm lƣợng các hợp chất

Phƣơng pháp

Phƣơng pháp tin cậy, Huyết sắc ký lỏng - khối phổ 2 lần 27 Eurycomanone 2 2017 [97] tƣơng chuột giới hạn phát hiện thấp

tƣơng tác nhanh (HILIC- MS/MS)

Xây dựng quy trình 28 Eurycomanone Dƣợc liệu HPLC-UV 2020 [17] phân tích

Huyết MALDI-TOF 29 Acetogenin 2009 [51] tƣơng MS

1H-qNMR

20

Mãng cầu xiêm Phƣơng pháp đặc 30 Acetogenin Cây 0,5mM [46] hiệu, hiện đại

Nhận xét chung:

- Hƣớng nghiên cứu các cây thuốc chứa các HCTN có HTSH ngày càng

đƣợc quan tâm trên thế giới cũng nhƣ ở nƣớc ta. Song, ở các quốc gia, địa phƣơng

khác nhau chúng thƣờng có những đặc điểm khác nhau và do vậy, hƣớng nghiên

cứu này thƣờng tập trung vào các cây thuốc bản địa. Các cây thuốc nhƣ: cây Diệp

hạ châu, cây Đan sâm, cây Mật nhân, cây Mãng cầu xiêm, cây Riềng đuôi nhọn

phân bố ở nhiều địa phƣơng của nƣớc ta nhƣ Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh...

nhƣng nói chung, các nghiên cứu về chúng còn rất hạn chế.

- Ở nƣớc ta, tuy đã có một vài nghiên cứu về tách chiết các HCTN có HTSH

từ các

loài cây ở

trên nhƣ: phyllanthin, hypophyllanthin,

tanshinone I,

cryptotanshinone, tanshinone IIA, eurycomanone, acetogenin và tinh dầu thu đƣợc

từ chúng, nhƣng hầu hết mới chỉ tập trung vào tách chiết sơ bộ và xây dựng quy

trình phân tích định tính, định lƣợng một hoặc một vài hợp chất tách chiết đƣợc từ

một đối tƣợng mẫu. Chất chuẩn dùng cho phân tích định tính và định lƣợng hầu hết

phải mua ở nƣớc ngoài với giá thành cao, thời gian chờ đợi lâu và do vậy, thiếu chủ

động. Những nghiên cứu tinh chế để thu đƣợc các HCTN dùng làm chất chuẩn cho

phân tích hầu nhƣ chƣa đƣợc quan tâm.

- Tuy đã có quy trình phân tích riêng lẻ một chất hoặc đồng thời một vài chất

có HTSH kể trên, song do tính đa dạng của pha nền (matrix) của các đối tƣợng mẫu

(các thực vật hay thảo dƣợc khác nhau), nên vẫn cần thiết phải nghiên cứu xây dựng

quy trình phân tích đồng thời các hợp chất có HTSH sao cho phù hợp với các đối

tƣợng mẫu khác nhau để có thể áp dụng trong các phòng thí nghiệm ở nƣớc ta.

- Do cây Mãng cầu xiêm chứa nhóm hợp chất acetogenin có nhiều HTSH giá

trị, nhƣng những nghiên cứu về nhóm hợp chất có HTSH này còn rất ít, nên cần tiếp

tục nghiên cứu. Mặt khác, một số nghiên cứu cho rằng, tinh dầu trong cây Riềng

đuôi nhọn – một loài cây mới phát hiện gần đây - cũng có HTSH, song cho đến nay,

hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu nào về xác định thành phần tinh dầu trong các bộ phân

của cây.

Rõ ràng, những nghiên cứu liên quan đến các vấn đề trên là rất cần thiết và

chúng cũng là các nội dung nghiên cứu chính của đề tài luận án.

21

Chƣơng 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu:

* Các HCTN có HTSH (từ đây, để cho gọn, gọi tắt là HCTN) trong hợp phần

chiết từ một số loài cây thuốc nhƣ sau:

+ Hợp phần chiết từ cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) chứa hợp chất

phyllanthin và hypophyllanthin.

+ Hợp phần chiết từ cây cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) chứa hợp chất

tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA.

+ Hợp phần chiết từ cây Mật nhân (Eurycoma longifolia J.) chứa hợp chất

eurycomanone.

+ Dịch chiết từ lá cây Mãng cầu xiêm chứa nhóm chất có HTSH acetogenin.

+ Tinh dầu (có hoạt tính sinh học) chiết từ các bộ phận của cây Riềng đuôi

nhọn (Alpinia macroura K. Schum).

* Các phƣơng pháp tách chiết các HCTN từ các loài cây thuốc (thảo dƣợc);

* Các phƣơng pháp tính chế các HCTN để đạt độ tinh khiết cao nhằm tạo ra

chất chuẩn cho phân tích định tính và định lƣợng;

* Các phƣơng pháp phân tích các HCTN.

- Phạm vi nghiên cứu:

Do các loài cây nghiên cứu phân bố ở nhiều địa phƣơng khác nhau ở nƣớc ta

và chúng đƣợc thu hái ở các độ tuổi khác nhau, nên trong đề tài này chỉ tập trung

khảo sát các loài cây đƣợc phân bố với mật độ cao và đã đƣợc quan tâm nghiên cứu

trong nhiều năm qua ở một địa phƣơng lựa chọn và thời điểm thu hái khoảng 2 – 3

năm tuổi:

* Cây Diệp hạ châu, Mãng cầu xiêm, Riềng đuôi nhọn đƣợc phân bố ở Nghệ

An, 2 năm tuổi;

* Cây Đan sâm đƣợc phân bố ở Sa Pa, Mộc Châu, Mƣờng Lống, Hà Giang,

Quảng Tây và Lâm Đồng, 2 năm tuổi;

* Cây Mật nhân đƣợc phân bố ở Bắc Giang, Nghệ An, Đắk Nông, Hòa Bình,

Vũng Tàu, Hà Giang, 3 năm tuổi.

22

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu của đề tài luận án bao gồm:

(1). Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng (dung môi, tỷ lệ dung môi…) đến quá

trình chiết tách bằng kỹ thuật chiết dung môi và sắc ký cột để xây dựng quy trình

tách chiết các phân đoạn giàu HCTN từ các cây thuốc quan tâm:

- Chiết tách hợp phần giàu chất hypophyllanthin và phyllanthin từ cây Diệp hạ

châu.

- Chiết tách hợp phần giàu chất tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone

IIA từ cây Đan sâm.

- Chiết tách hợp phần giàu chất eurycomanone từ cây Mật nhân.

(2). Tinh chế một số HCTN từ hợp phần tƣơng ứng đến độ tinh khiết đạt yêu

cầu làm chất chuẩn cho phân tích:

- Tinh chế những chất phyllanthin, hypophyllanthin,

tanshinone I,

cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone nào bằng kỹ thuật HPLC điều

chế;

- Xác định các đặc trƣng của chất (cấu trúc, đặc trƣng hóa – lý) bằng các

phƣơng pháp phân tích NMR, MS, UV-Vis;

(3). Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố (dung dịch đệm và pH, dung

môi/pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng…) để xây dựng quy trình phân tích các

HCTN quan tâm bằng phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD, bao gồm:

phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA và

eurycomanone;

(4). Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích qua độ ổn định, độ đặc

thù, độ lặp lại, khoảng tuyến tính (đối với chất chuẩn).

(5). Áp dụng quy trình phân tích xây dựng đƣợc vào thực tế:

- Kiểm soát chất lƣợng của PPPT qua độ lặp lại, độ đúng, LOD (đối với mẫu

thực tế).

- Phân tích đồng thời cho các hợp chất hypophyllanthin và phyllanthin trong

các mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu bằng LC-MS/MS và

UPLC-DAD.

23

- Phân tích đồng thời cho các hợp chất hypophyllanthin và phyllanthin từ các

bộ phận của cây Diệp hạ châu thu hái ở Nghệ An bằng LC-MS/MS.

- Phân tích đồng thời cho các hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone và

tanshinone IIA trong mẫu dƣợc liệu Đan sâm thu hái ở Sa Pa, Mộc Châu, Mƣờng

Lống, Hà Giang, Quảng Tây và Lâm Đồng bằng LC-MS/MS và UPLC-DAD.

- Phân tích eurycomanone trong mẫu dƣợc liệu Mật nhân đƣợc thu hái tại Bắc

Giang, Nghệ An, Đắk Nông, Hòa Bình, Vũng Tàu và Hà Giang bằng LC-MS/MS.

(6). Tách chiết và phân tích dịch chiết từ lá Mãng cầu xiêm chứa nhóm

acetogenin bằng phƣơng pháp ghép nối kết hợp qNMR và HPLC-PDA-HRMS.

(7). Phân tích tinh dầu từ các bộ phân của cây Riềng đuôi nhọn bằng phƣơng

pháp GC-MS.

2.3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập nhƣ hexan (Hex), methanol

(MeOH), ethanol (EtOH), chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), butanol

(BuOH) đều là loại tinh khiết dùng cho nghiên cứu chiết tách các HCTN (đƣợc

chƣng cất từ các hóa chất đạt tiêu chuẩn công nghiệp).

- Nƣớc dùng để tráng rửa chai lọ và các dụng cụ, pha chế hóa chất là nƣớc

cất 2 lần Genpure UV - Thermo, Đức.

- Các dung môi dùng cho phân tích đều là loại tinh khiết dùng cho phân tích

các chất hữu cơ (Merck, Đức) gồm: methanol, acetonitrile, acid formic., (Merck).

- Vật liệu (hay pha tĩnh) nhồi cột dùng cho sắc ký cột (CC): silica gel

(Kieselgel 60, 70-230 mesh và 20-400 mesh, Merck). Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử

dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 (1.05554, Merck). Phát hiện chất

bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng chất hiện màu là

hơi iot. Các thiết bị, dụng cụ chính đƣợc nêu ở bảng 2.3.

24

Bảng 2.1. Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

Kiểu thiết bị Hãng sản xuất Tên thiết bị (model) (quốc gia)

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu Agilent Technologies Agilent (USA) năng cao LC-MS/MS 6420 Triple Quad

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu Agilent 1290 Agilent (USA) năng cao (HPLC-DAD)

EC-C18 (100 × 2,1 mm, Cột sắc ký Agilent (USA) 2,7 μm)

Hệ thống sắc ký lỏng điều Agilent 218 Purification Agilent (USA) chế System

ZORBAX SB-C18 (100 x Cột sắc ký G Agilent (USA)FL (Đức) 21,2 mm, 5,0 μm)

đo Jasco DIP-360 digital Máy đo năng suất quay cực Sanyo, Nhật Bản polarimeter

Máy lọc nƣớc siêu sạch Genpure UV Thermo, Đức

Cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker 500MHz Mỹ

Máy ly tâm Vortex Mỹ

Cân phân tích 4 số OHAUS PA214 Mỹ

Máy đo khối phổ ESI-MS micr OTOF-Q II 10187 Mỹ

2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Thông tin về mẫu

Các loại mẫu đầu dùng cho nghiên cứu trong đề tài này đều đƣợc cung cấp bởi

các cơ sở chuyên nghiên cứu về các HCTN ở nƣớc ta. Các mẫu đều đƣợc lấy theo

kiểu lấy mẫu tổ hợp để thu đƣợc mẫu đại diện cho vùng nghiên cứu và đƣợc sơ chế,

25

bảo quản theo đúng quy định về bảo quản mẫu cho nghiên cứu về các HCTN. Mặt

khác, các mẫu đó đều là các mẫu phù hợp với các đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

nêu trên.

Có 2 nhóm mẫu: (i) Nhóm mẫu sử dụng cho chiết tách, phân lập tạo chất

chuẩn phân tích (cây Diệp hạ châu, cây Đan sâm và cây Mật nhân); (ii) Nhóm mẫu

sử dụng cho phân tích hàm lƣợng (cây Diệp hạ châu, thực phẩm chức năng bào chế

từ cây Diệp hạ châu, cây Đan sâm, cây Mật nhân thu hái ở các vùng dƣợc liệu khác

nhau, cây Mãng cầu xiêm và cây Riềng đuôi nhọn).

Bảng 2.2. Thông tin mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu(*)

STT

Ký hiệu

Công ty sản xuất

NSX

HSD

Số lô

1 DHC-VX

24/12/2016 24/12/2018 061216C

2 DHC-DH

-

03/01/16 03/01/19

3 DHC-PNC

27/03/20 012017 28/03/2017

4 DHC-PV

11/04/20 0117 12/4/2017

CT TNHH Vạn Xuân CT CP phát triển thƣơng mại và dịch vụ DH Việt Nam CT TNHH dƣợc phẩm AHEPRO Việt Nam CT cổ phần dƣợc phẩm DANAPHA CT CP dƣợc phẩm

5 DHC-DD5

5 Dƣợc 21/04/19 010416 21/04/2016

6 DHC-KH

(*) NSX: thời gian sản xuất; HSD: thời hạn sử dụng.

02/05/19 010517 03/05/17 Đông FIDOPHARM CT CP dƣợc VTYT Khải Hà

Bảng 2.3. Thông tin về các mẫu cây

STT Ký hiệu Tên mẫu Địa điểm thu mẫu Thời gian thu mẫu

Sapa – Lào Cai 1

Lâm Hà – Lâm Đồng 2 DS-SP(*) DS-LD

Rễ cây Đan sâm 10/2016 Quản Bạ - Hà Giang 3 DS-HG

Mộc Châu – Sơn La 4 DS-MC

26

Quảng Tây – Trung Quốc 5 DS-QT

Mƣờng Lống – Nghệ An 6 DS-ML

Phú Mỹ - Vũng Tàu 7 MN-VT

Krông Nô - Đắk Nông 8 MN-DN

Lạc Sơn - Hòa Bình 9 MN-HB Rễ cây Mật nhân 10/2017 Mƣờng Lống – Nghệ An

Sơn Động - Bắc Giang

Quản Bạ - Hà Giang

10/2017

Nam Đàn – Nghệ An

14

Thân cây DHC

10/2017

Nam Đàn – Nghệ An

DHC- Than(*)

10/2017

Nam Đàn – Nghệ An

15 DHC-Re(*) Rễ cây DHC 16 AM

10 MN-ML 11 MN-BG(*) 12 MN-HG 13 DHC-La(*) Lá cây DHC

Mãng cầu xiêm 10/2014 Nam Đàn – Nghệ An

17 RDN-La Lá cây RDN

18 RDN-Than Thân cây RDN

19 RDN-Re Rễ cây RDN 10/2016 Vƣờn quốc gia Pù Mát – Nghệ An 20 RDN-Hoa Hoa cây RDN

21 RDN-Qua Quả cây RDN

(*) Mẫu sử dụng cho chiết tách, phân lập tạo chất chuẩn; DHC: Diệp hạ châu; RDN: Riềng đuôi nhọn 2.4.2. Phƣơng pháp chiết tách/phân lập

(i) Chiết tách các hợp phần từ cây khảo sát:

Tiến hành sử dụng 10 L dung môi (MeOH đối với mẫu Diệp hạ châu và

EtOH đối với mẫu Đan sâm và Mật nhân) ngâm 2-5 kg mẫu kết hợp chiết siêu âm

trong 2h. Sau đó lọc lấy dịch chiết thu đƣợc. Lặp lại quá trình 3 lần. Tất cả dịch

chiết thu đƣợc loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không. Phần cao chiết thu

đƣợc tiếp tục phân bố trong 5L nƣớc cất và tiến hành chiết lỏng lỏng lần lƣợt với

các dung môi có độ phân cực tăng dần (hexan, etyl axetat, cloroform, butanol). Mỗi

loại dung môi tiến hành 3 lần, gom dịch chiết của mỗi loại dung môi sau đó tiến

hành loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không, ghi lại kết quả thu đƣợc.

(ii) Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để lựa chọn dung môi:

Đối với các mẫu sử dụng tách chiết và phân lập các HCTN, trƣớc hết cần thực

hiện sắc ký lớp mỏng (TLC) để lựa chọn phân đoạn chứa nhiều hợp chất dễ tách và

lựa chọn dung môi thích hợp cho giai đoạn tách chiết tiếp theo bằng phƣơng pháp

sắc ký cột [19], [20].

27

Phƣơng pháp TLC đƣợc tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254

tráng sẵn, độ dày 0,2 mm. Hiện màu bằng phun hơi iot và chiếu xạ UV ở bƣớc sóng

254 nm [109].

Trình tự các bước thực hiện TLC:

- Lấy 0,005 gam (5 mg) các mẫu cao chiết tách đƣợc ở trên hòa tan vào 5 mL

dung môi MeOH, sau đó chấm một giọt dung dịch mẫu lên bản mòng silicagel dài 

rộng  5  1 cm, đƣợc đặt trong bình triển khai TLC, chứa dung môi khảo sát (5

mL) sao cho phần ngập trong dung môi là 0,5 cm; Thực hiện triển khai TCL trong 5

phút; Lấy bản mỏng ra, sấy khô và hiện màu bằng hơi iot.

- Tính hệ số lƣu giữ (Rf) đối với chất cần chiết tách (chất thử), nhận giá trị từ 0

đến 1 – là đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trong dung

môi xác định. Rf bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử (dR) và khoảng

dịch chuyển của dung môi hay pha động (dM).

Cuối cùng, so sánh các giá trị Rf để chọn dung môi thích hợp – là dung môi

cho giá trị Rf nằm trong khoảng 1/3 – 2/3.

(iii) Tách chiết bằng phương pháp sắc ký cột:

Sau khi đã lựa chọn đƣợc dung môi thích hợp từ khảo sát ở trên, tiến hành sắc

ký cột tiếp theo để thu đƣợc hợp phần chứa các chất quan tâm và tinh chế các chất

đến tinh khiết. Phƣơng pháp chiết tách bằng sắc ký cột đƣợc thực hiện với pha động

(dung môi thích hợp) và cột chứa các pha tĩnh khác nhau: Silica gel, sử dụng

silicagel với cỡ hạt 230 - 400 mesh; pha tĩnh là pha đảo C18; pha tĩnh Sephadex

LH-20. Trong một số trƣờng hợp, có thể sử dụng các cột liên tiếp chứa các pha tĩnh

khác nhau. Từ đó, chọn pha tĩnh phù hợp cho sắc ký cột để tách chiết và tinh chế.

Trình tự thực hiện phương pháp sắc ký cột: Lấy 10 g mẫu cao chiết đƣợc lựa

chọn cho sắc ký cột đƣợc hòa tan vào trong 50 mL dung môi methanol (MeOH)

chứa 50 gam silicagel, tạo thành thể huyền phù; Sau đó, sấy khô ở nhiệt độ phòng

(dùng máy sấy chuyên dụng thổi trên bề mặt), rồi nghiền nhỏ bằng chày cối sứ và

nạp toàn bộ lên cột có kích thƣớc khác nhau (20 – 80 cm, đƣờng kính 1 – 5 cm, tùy

thuộc đối tƣợng mẫu và chất cần tách) đã đƣợc nhồi trƣớc các hạt silicagel (chiếm

1/3 – 2/3 chiều cao cột tùy thuộc vào đối tƣợng mẫu và chất cần tách). Tiếp theo,

28

cho dung môi qua cột (dung môi thích hợp đã lựa chon từ khảo sát trong phƣơng

pháp TLC ở trên) với tổng thể tích dung môi 200 mL – 2000 mL với tốc độ chảy tự

nhiên ở áp suất thƣờng, sẽ thu đƣợc các phân đoạn khác nhau, mỗi phân đoạn 50

mL.

(iv) Tinh chế tiếp tục để thu được chất tinh khiết:

Lựa chọn một hoặc một vài phân đoạn chứa chất quan tâm (thu đƣợc từ sắc ký

cột) để lặp lại tiến trình theo phƣơng pháp TLC, rồi sắc ký cột theo cách tƣơng tự

nhƣ trên để sao cho thu đƣợc chất tính khiết cỡ 95 % (độ tinh khiết của chất đƣợc

xác định qua dữ phân tích dữ liệu phổ NMR, kết hợp với sắc đồ HPLC của nó).

Nơi thực hiện: Trung tâm Thực hành – Thí nghiệm – Trƣờng Đại học Vinh

2.4.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc và đặc trƣng hóa - lý của HCTN

- Phương pháp phân tích cấu trúc: Các chất tính khiết thu đƣợc ở trên đƣợc

đem phân tích cấu trúc bằng các phƣơng pháp đƣợc dùng phổ biến nhƣ phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), nhằm khẳng định chắc

chắn về cấu trúc của hợp chất tinh chế đƣợc.

Điều kiện ghi phổ NMR: Hòa tan mẫu chứa chất tinh khiết (độ tinh khiết cỡ 95 %) vào dung môi CD3OD và đem đo phổ 1H-NMR ở bƣớc sóng 400 và 500 MHz, đo phổ 13C-NMR ở bƣớc sóng 100 và 125 MHz.

Nơi thực hiện: Phòng NMR - Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam.

- Phương pháp xác định đặc trưng hấp thụ phân tử: Áp dụng phƣơng pháp

quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis để xác định đặc trƣng hấp thụ phân tử của chất

tinh khiết thu đƣợc ở trên: Quét phổ của dung dịch chất tinh khiết (đƣợc hòa trong

MeOH) trong khoảng bƣớc sóng 190 nm – 900 nm và xác định bƣớc sóng hấp thụ

cực đại.

Nơi thực hiện: Trung tâm Thực hành – Thí nghiệm – Trƣờng Đại học Vinh

2.4.4. Phƣơng pháp tinh chế HCTN để tạo ra chất chuẩn

Theo yêu cầu của AOAC và Dƣợc điển Việt Nam, một chất đƣợc xem là chất

chuẩn (hay chất đối chiếu) phải thỏa mãn các yêu cầu sau: Độ tinh khiết trên 95 %;

Chất phải bền với ánh sáng và nhiệt độ phòng, và có thể lƣu giữ đƣợc trong thời

gian tối thiểu 1 – 3 năm [1], [4], [3], [58].

29

Phương pháp tinh chế: Để thu đƣợc chất tinh khiết thỏa mãn yêu cầu của một

chất chuẩn, tiến hành tinh chế chất có độ tinh khiết cỡ 95 % thu đƣợc ở trên bằng 2

phƣơng pháp khác nhau:

- Phƣơng pháp sắc kí cột: Tiến hành tƣơng tự nhƣ giai đoạn chiết tách/phân

lập, nhƣng ở đay thay đổi kiểu pha tĩnh và kỹ thuật sắc ký: Trƣớc hết, thực hiện sắc

kí hấp phụ pha thuận với pha tĩnh silicagel, tiếp theo thực hiện sắc kí phân bố pha

đảo với pha tĩnh C18 hoặc sắc kí thấm gel với pha tĩnh Sephadex LH-20.

- Phƣơng pháp HPLC điều chế: Sử dụng phƣơng pháp HPLC với dung môi, tỷ

lệ dung môi và tốc độ dòng pha động thích hợp.

2.4.5. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn và dữ liệu chất chuẩn

Để khẳng định hợp chất tinh khiết thu đƣợc đạt yêu cầu của một chất chuẩn,

cần kiểm tra độ tinh khiết của nó bằng các phƣơng pháp sau:

- Sắc kí lớp mỏng (TLC): Một chất đƣợc coi là tinh khiết khi trên bản mỏng

silicgel chỉ có mặt một vết duy nhất của chất và không có các vết phụ hoặc các vết

phụ không đáng kể [5], [5].

- Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC): Từ sắc đồ HPLC thu đƣợc, xác định tỷ lệ

phần trăm diện tích pic của chất tinh khiết với tổng diện tích tất cả các pic. Tỷ lệ

này đƣợc tính toán tự động trên hệ thiết bị và phải đạt trên 95 % [3], [48], [92].

Khi đã khẳng rằng, chất tính khiết thu đƣợc là chất chuẩn, cần thiết lập các dữ

liệu kèm theo của một chất chuẩn và so sánh chúng với dữ liệu chất chuẩn đã công

bố trƣớc đây [3], bao gồm:

- Dữ liệu phổ H1-NMR, phổ C13-NMR;

- Dữ liệu phổ UV-Vis, phổ MS.

- Ngoài ra, cần có thêm thông tin về đặc trƣng hóa – lý khác nhƣ: Điểm chảy,

điểm sôi, góc quay phân cực…

2.4.6. Phƣơng pháp phân tích các HCTN

Trong nghiên cứu luận án, các phƣơng pháp phân tích sau đây đƣợc sử dụng

để phân tích các HCTN trong các mẫu nghiên cứu. Chất chuẩn cho phân tích định

tính và định lƣợng là các chất chuẩn thu đƣợc ở trên.

- Phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD: Hai phƣơng pháp này đƣợc áp

30

dụng để phân tích đồng thời các chất hợp chất phân lập đƣợc: Hợp chất phyllanthin,

hypophyllanthin phần lập từ cây Diệp hạ châu; Hợp chất tanshinone I,

cryptotanshinone và tanshinone IIA phân lập từ cây Đan sâm và hợp chất

eurycomanone phân lập từ cây Mật nhân. Song, trƣớc khi phân tích, cần khảo sát để

tìm đƣợc các điều kiện thí nghiệm thích hợp về thành phần pha động (hay dung môi

rửa giải), tốc độ dòng pha động, áp suất và nhiệt độ cột. Các điều kiện thích hợp của

detector MS/MS đƣợc chọn tự động nhờ phần mềm cài đặt sẵn trong máy. Điều

kiện thích hợp của detector DAD là bƣớc sóng mà ở đó độ hấp thụ quang của các

chất phân tích đủ lớn. Từ các sắc đồ thu đƣợc, tiến hành định tính dựa vào thời gian

lƣu (so sánh với thời gian lƣu trên sắc đồ của chất chuẩn), định lƣợng theo phƣơng

pháp đƣờng chuẩn.

- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân định lượng (qNMR) và phương pháp

HPLC-PDA/MALD-TOF-MS: Trƣớc hết, áp dụng phƣơng pháp qNMR để xác định

các phân đoạn giàu nhóm hợp chất acetogenin trong mẫu (mẫu ở đây là các phân

đoạn chiết tách từ cây Mãng cầu xiêm bằng các dung môi khác - mẫu AMF1,

AMF2, AMF3, AMF4); Tiếp theo, chọn mẫu giàu acetogenin đem phân tích bằng

phƣơng pháp HPLC-PDA/MALD-TOF-MS, trong đó, PDA cho phép nhận biết các

pic xuất hiện ở những thời gian lƣu nào (mỗi pic chứa một nhóm các chất), tiếp theo

các nhóm chất ứng với các pic đó đƣợc đƣa qua MALD-TOF-MS để định tính các

chất có mặt trong mỗi nhóm. Song, trƣớc khi phân tích, cần khảo sát để tìm các điều

kiện sắc ký thích hợp nhƣ thành phần và tốc độ dòng pha động, áp suất và nhiệt độ

cột. Từ dữ liệu phổ MS thu đƣợc, tiến hành phân tích định tính (dựa vào mảnh đặc

trƣng, thƣờng là mảnh phân tử); định lƣợng bằng phƣơng pháp đƣờng thêm chuẩn.

- Phương pháp GC-MS: Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng để phân tích các

hợp chất trong các mẫu tinh dầu chiết tách từ các bộ phận khác nhau của cây Riềng

đuôi nhọn (RDN-La, RDN-Than, RDN-Re, RDN-Hoa, RDN-Qua). Từ dữ liệu phổ

MS, tiến hành định tính dựa vào mảnh đặc trƣng và bán định lƣợng dựa vào tỷ lệ

phần trăm diện tích pic của chất so với tổng diện tích tất cả các pic.

- Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu – phương pháp khối lượng [4] :

Hàm lƣợng tinh dầu X (%) (tính theo khối lƣợng khô) trong các bộ phận khác

31

nhau của cây Riềng đuôi nhọn đƣợc tính theo công thức sau:

X (%)  (a  0,9)  100/b (khi tỉ trọng của tinh dầu, d < 1) (2.1)

X (%)  (a 100)/b (khi tỉ trọng của tinh dầu, d > 1) (2.2)

Trong đó, a: thể tích của tinh dầu (mL); b: khối lƣợng của mẫu (g).

Nơi thực hiện: Trung tâm Thực hành – Thí nghiệm – Trƣờng Đại học Vinh

và Khoa Dƣợc – Đại học Y khoa Trung Quốc – Đài Loan.

2.4.7. Phƣơng pháp đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích

Độ tin cậy của một phƣơng pháp phân tích bất kỳ đƣợc đánh giá qua các yếu

tố dƣới đây.

(i) Tính ổn định của hệ thống phân tích sắc ký [28], [69], [88]:

Trong phƣơng pháp phân tích sắc ký (HPLC và GC), một trong những yêu cầu

đầu tiên để kiểm soát chất lƣợng (quality control) của phƣơng pháp là hệ thống thiết

bị phải có độ ổn định (stability) tốt khi chạy (run) dung dịch chuẩn của chất phân

tích lặp lại ít nhất 6 lần (n  6). Độ ổn định của hệ thống thiết bị đƣợc xem là tốt khi

thỏa mãn các điều kiện sau:

- Hệ số đối xứng (hệ số thể hiện độ phân giải giữa pic liền kề với píc của chất

phân tích) phải ≥ 1,5;

- Số đĩa lý thuyết (thể hiện khả năng tách của phƣơng pháp ) phải ≥ 2000;

- Độ lặp lại của thời gian lƣu và diện tích pic (thể hiện qua độ lệch chuẩn tƣơng

đối / RSD) phải ≤ 2,0 % (n  6). Trƣờng hợp RSD > 2 %, phải có lý giải phù hợp.

(ii) Khoảng tuyến tính [28], [69], [88]:

Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp đối với một chất phân tích xác định là

khoảng nồng độ của chất mà trong đó, có tƣơng quan tuyến tính giữa tín hiệu đo (y)

và nồng độ (x). Để thiết lập phƣơng trình hồi quy tuyến tính (y  a  bx), cần áp

dụng phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu để tính a và b. Phép hồi quy đƣợc đánh giá qua hệ số xác định R2, sai số chuẩn của y (Sy), hệ số a và b và phân tích phƣơng sai

(ANOVA) dùng F-test: Chỉ khi phƣơng sai hồi quy lớn hơn so với phƣơng sai dƣ,

tức là mức ý nghĩa thống kê (p) tính toán đƣợc nhỏ hơn 0,05, thì phép hồi quy mới

có giá trị.

32

(iii) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng:

Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp phân tích (LOD / Limit of Detection) là

nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có thể xác định đƣợc một cách tin cậy.

LOD thể hiện khả năng định tính của phƣơng pháp phân tích, tức là có thể phân biệt

đƣợc mẫu chứa chất phân tích với mẫu trắng.

Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp

còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 3-4 lần. Xác

định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), trong đó S là chiều

cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng nền.

Nhiễu đƣờng nền đƣợc tính về hai phía của đƣờng nền và tốt nhất là tính

nhiễu lân cận hai bên của píc, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của

píc tại nửa chiều cao. LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-

3 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng thƣờng lấy S/N =3 [28].

Giới hạn định lƣợng (LOQ / Limit of Quantitation) là thông số thể hiện khả

năng định lƣợng của phƣơng pháp phân tích. LOQ đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ

nhất trên một đƣờng chuẩn tin cậy và nó đƣợc tính toán từ LOD [88]:

LOQ  (3 - 4)  LOD

(2.3)

(iv) Độ lặp lại (repeatability):

Độ lặp lại (hay độ chụm) thể hiện độ lệch của mỗi kết quả đo riêng lẻ (xi) so

với kết quả trung bình (xTB). Nó phản ánh sai số ngẫu nhiên của phƣơng pháp phân

tích và đƣợc đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) [105]:

(2.4)

RSD (%) = S*100/xTB (S là độ lệch chuẩn)

Phƣơng pháp phân tích đạt đƣợc độ lặp lại tốt (hay thỏa mãn yêu cầu) khi

RSD ≤ ½ RSDHorwitz, với RSDHorwitz là độ lệch chuẩn tƣơng đối tính theo hàm

Horwitz [68]:

(2.5)

RSDHorwitz  2(1  0,5log10C) ; với C đƣợc biểu diễn bằng phân số

Cũng có thể đánh giá độ lặp lại qua so sánh với mức quy định của AOAC

(Hiệp hội các Nhà khoa học Phân tích Hoa Kỳ) [41], [88]: RSD thu đƣợc phải nhỏ

hơn so với quy định của AOAC và RSD phụ thuộc vào nồng độ (C) chất phân tích.

33

(v) Độ đúng:

Độ đúng (accuracy/trueness) của phƣơng pháp phân tích là độ gần của kết quả

đo với giá trị thực của nó [105]. Độ đúng của một phƣơng pháp đƣợc đánh giá theo

hai 3 cách [105]: (i) Phân tích mẫu vật liệu so sánh đƣợc cấp chứng chỉ (CRM) (hay

gọi tắt là mẫu chuẩn); (ii) Phân tích mẫu thực tế đƣợc thêm chuẩn (spiked sample) và

(iii) So sánh phƣơng pháp đang dùng với một phƣơng pháp chuẩn nào đó. Trong

nghiên cứu của luận án, độ đúng đƣợc đánh giá theo cách (ii).

Theo cách này, trƣớc hết phân tích một phần mẫu thực tế, đƣợc kết quả x1.

Tiếp theo, thêm chuẩn chất cần phân tích vào phần mẫu đó (nồng độ thêm chuẩn là

xo; dung dịch chuẩn đƣợc pha chế từ chất chuẩn hay hóa chất tinh khiết ở phòng thí

nghiệm), rồi tiến hành phân tích mẫu đã thêm chuẩn, đƣợc kết quả x2. Từ đó, tính

độ thu hồi (recorvery, viết tắt là Rev) theo công thức:

(2.6)

Rev(%) = (x2 – x1)*100/xo

Phƣơng pháp phân tích đƣợc xem là đạt đƣợc độ đúng tốt khi tuân thủ quy

định của AOAC về Rev (Rev phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích trong mẫu)

[88]: Khi phân tích những nồng độ cỡ 100 ppb – 1 ppm, 10 ppb và 1 ppb, nếu đạt

đƣợc Rev tƣơng ứng trong khoảng 80 – 110 %, 60 – 115 % và 40 – 120 % là

phƣơng pháp đạt đƣợc độ đúng tốt.

2.4.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Microsoft-Excel với công cụ Data Analysis để phân tích

thống kê các số liệu: tính toán các đại lƣợng thống kê mô tả (trung bình số học, độ

lệch chuẩn, biên giới tin cậy 95%); phân tích hồi quy tuyến tính…

34

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT

THIÊN NHIÊN

Tiến hành thí nghiệm chiết tách/phân lập các HCTN từ các loài cây khảo sát

bằng các phƣơng pháp TLC, sắc ký cột, tinh chế sơ bộ nhƣ đã đề cập ở mục 2.3.2,

kết hợp với khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố đến quá trình tách chiết (dung môi,

nhiệt độ…) nhằm xây dựng đƣợc quy trình tách chiết các HCTN quan tâm từ các

loài cây đó.

3.1.1. Chiết tách các HCTN từ cây Diệp hạ châu và đặc trƣng cấu trúc

3.1.1.1. Chiết tách các HCTN

Mẫu cây Diệp hạ châu (đã đồng hóa) đƣợc ngâm chiết siêu âm có gia nhiệt với methanol ở 50 0C trong 3 h (lặp lại 3 lần). Dịch chiết thu đƣợc đƣợc lọc qua màng

lọc rồi tiến hành cô quay chân không áp suất thấp thu đƣợc cao chiết methanol ban

đầu (502 g). Phân bố cao methanol trong nƣớc, sau đó chiết lỏng/lỏng lần lƣợt với

hexan, cloroform và n-butanol. Dịch chiết thu đƣợc đƣợc lọc qua màng lọc rồi tiến

hành cô quay chân không áp suất thấp thu đƣợc các cao chiết lần lƣợt là 124g, 255 g

và 95 g.

Tiếp theo, các phần cao chiết đó (cao hexan, cloroform và n-butanol) đƣợc

tách bằng phƣơng pháp TLC và HPLC. Kết quả cho thấy, cao cloroform chứa nhiều

chất nhất và các chất tách ra khỏi nhau khá tốt và do vậy, cao cloroform đƣợc chọn

để khảo sát quá trình tách bằng sắc ký cột tiếp theo. Song, trƣớc khi tiến hành sắc

ký cột, cần khảo sát bằng phƣơng pháp TLC để lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho

quá trình tách tiếp.

Kết quả khảo sát bằng phƣơng pháp TLC đối với các hệ dung môi khác nhau:

hệ hexan : acetone (v/v  50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 0:1) và hệ dung môi

cloroform : metanol (v/v  100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1), cho thấy, hệ

dung môi cloroform : metanol là thích hợp, vì nó cho phép tách các chất tốt hơn. Hệ

dung môi này đƣợc chọn cho giai đoạn sắc ký cột tiếp theo.

Tiến trình chiết tách bằng sắc ký cột:

- Cao cloroform (255 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel (chiều

35

dài 100 cm, đƣờng kính 10 cm, khối lƣợng silicagel 500 g) với hệ dung môi rửa giải

chloroform : methanol (sử dụng chế độ gradien dung môi theo thứ tự 100:1, 50:1,

30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v), thu dịch rửa giải vào 100 lọ. Tiến hành TLC tất

cả các lọ đó để nhận biết các phân đoạn có thành phần nhƣ nhau và gộp các phân

đoạn nhƣ nhau lại, cuối cùng thu đƣợc 10 phân đoạn chính (từ H-1 đến H-10).

- Tiếp theo, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-4 ở điều kiện: cột silica gel (dài

 đƣờng kính trong  300 mm  30 mm) với 1.500 mL pha động (hệ dung môi

cloroform: metanol 10:1, 5:1 (v/v); sau đó, thực hiện sắc ký cột pha đảo C18 (400

mm × 20 mm) với 500 mL pha động MeOH:H2O 8:1 (v/v), thu đƣợc hợp chất, đƣợc

ký hiệu là PU-1 (229 mg). Mặt khác, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-5 ở điều

kiện: cột silica gel (300 mm × 30 mm) với 1000 mL pha động cloroform : metanol

9:1, 5/1 (v/v) và tiếp theo là sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với hệ pha

động MeOH-H2O (5:1 v/v, 500 mL) thu đƣợc PU-2 (312 mg). Tiến hành sắc ký cột

tƣơng tự với một số phân đoạn khác cũng đã phân lập đƣợc các hợp chất khác

nhƣng khối lƣợng nhỏ hơn nên ở đây chỉ tập trung vào nghiên cứu đặc trƣng cấu

trúc và tinh chế 2 hợp chất PU-1 và PU-2.

Quy trình chiết tách/phân lập các HCTN từ cây Diệp hạ châu đƣợc nêu ở

hình 3.1.

36

Diệp hạ châu (5,0 kg)

Ngâm chiết với methanol (3 x 1,5 L)

Cao methanol (502 g)

Chiết lần lƣợt với cloroform, butanol

Cao cloroform (255 g) Cao butanol (95 g) Cao dịch nƣớc (90 g)

CC, Silica gel, CHCl3:MeOH 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v

H-1 H-2 H-3 H-4 (15g) H-5 (27,5 g) H-6

( ( ( 8,6 g) g) CC, Silica gel g) CHCl3:MeOH (10:1) 8,6 g) (g) C18 CHCl3:MeOH (8,6 g) (5:1) (g) C18 CHCl3:MeOH (8,6 g) (4:1) ( H-9 (g) (8,6 g) H-7 ( CC, Silica gel (g) CHCl3:MeOH (8:1) (8,6 ( g) H-8 (g) (8,6 g) H-10 (g) (8,6 g) 8,6 g) Hypophyllanthin (229 mg) 8,6 Phyllanthin (212 mg) g)

HPLC điều chế, MeOH:H2O (7:3)

Sơ đồ 3.1: Phân lập các hợp chất từ cây Diệp hạ châu

37

Tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0%); Sử dụng làm chất chuẩn phân tích

3.1.1.2. Đặc trưng cấu trúc của các HCTN

Mục đích của nghiên cứu này là nhằm xác định xem – hợp chất PU-1 và PU-

2 là hợp chất gì dựa trên đặc trƣng cấu trúc và phổ của chúng. Tiến hành phân tích

mẫu (hợp chất PU-1 và PU-2) bằng các phƣơng pháp NMR, MS và UV-Vis, thu

đƣợc kết quả ở bảng 3.1 và 3.2. Các đặc trƣng hóa – lý khác của 2 hợp chất đo cũng

đƣợc xác định. Việc khẳng định công thức cấu tạo của chất là dựa vào đặc trƣng

cấu trúc (phổ NMR), phổ MS, phổ UV và so sánh với các kết quả đã công bố

trƣớc đây. Kết quả cho thấy:

(i) Hợp chất PU-1: Dạng tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy 128 – 130 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bƣớc sóng

230 và 280 nm (phụ lục A5); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z  (phụ lục 453,3 [M+Na]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C24H30O7

A1). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.1 và phụ lục A2-A5. Các kết quả thu đƣợc

cho phép khẳng định rằng, hợp chất PU-1 là hypophyllanthin với công thức cấu

tạo đƣợc nêu ở hình 3.1. Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [52],

Hợp chất hypophyllanthin cũng đã đƣợc công bố là đƣợc phân lập từ cây

Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria và nó có hoạt tính kháng virut viêm

gan B mạnh [7], [95], [102].

[101], [102].

Hình 3.1. Công thức cấu tạo của hypophyllanthin

38

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của PU-1 và so sánh với công bố ở tài liệu [101](*)

Thứ tự C δH* δH

δC 131,7 δC* 131,8 1

6,31 (1H, s) 106,7 δ 6,45 (1H, s) 106,5 2

141,7 142,1 3

132,8 133,3 4

146,5 147,0 5

114,5 115,1 6

33,3 2,79 (1H, dd, J = 32,7 2,78 (2H, dd, 16.0, 4.5 Hz) 7

15.9, 5.4 Hz) 2,71 (2H, dd, 15.9, 2,61 (1H, dd, J = 15.5, 11.0 Hz)

10.8 Hz)

35,9 1,85 (1H, m) 36,6 1,94 (1H, m) 8

75,5 74,7 3,18 (1H, dd, J = 9.5, 6.2 3,41 (1H, dd, J = 9

Hz) 3,27 (1H, dd, J = 9.5, 4.2 9.6, 4.2 Hz) 3,36 (1H, dd, J =

Hz) 9.6, 6.2 Hz)

56,4 3,85 (3H, s) 56,1 3,78 (3H, s)

101,1 100,6 3-OCH3 O-CH2-O

5,63 (1H, d, J = 1.4 Hz) 5,69 (1H, d, J = 1.4 Hz) 5,71 (1H, d, J = 1.4 Hz)

5,71 (1H, d, J = 1.4 Hz)

58,9 3,31 (3H, s) 58,3 3,25 (3H, s)

137,9 138,1 9- OCH3 1’

111,9 6,65 (1H, d, J = 2.0 112,1 6,63 (1H, d, J = 2.0 Hz) 2’

Hz)

148,3 148,6 3’

147,0 147,1 4’

110,7 111,6 6,80 (1H, d, J = 8.0 Hz) 5’

6,72 (1H, d, J = 8.0 Hz)

120,4 119,9 6’

6,62 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz) 6,65 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz)

41,9 4,07 (1H, d, J = 7.8 41,1 3,95 (1H, d, J = 7.5 Hz) 7’

Hz)

45,4 1,87 (1H, m) 1,77 (1H, m) 44,7 8’

39

71,8 3,22 (1H, dd, J = 3,16 (1H, dd, J = 9.5, 3.5 71,6 9’

9.6, 3.5 Hz) 3,34 (1H, dd, J = Hz) 3,29 (1H, dd, J = 9.5, 1.0

9.6, 1.0 Hz) Hz)

55,4 55,8 3,78 (3H, s) 3,67 (3H, s)

55,9 3,82 (3H, s) 3,70 (3H, s) 55,5

*, C

3,29 (3H, s) 3,21 (3H, s) 58,9 58,4

3’-OCH3 4’- OCH3 9’- OCH3 (*) H, C và H *: Tƣơng ứng là độ dịch chuyển hóa học (đối với H và C) thu đƣợc từ nghiên cứu này và đã đƣợc công bố ở tài liệu [101]; Trong đó, H đƣợc đo ở 500 MHz * đƣợc đo ở 300 MHz trong CDCl3; C đƣợc đo ở 100 Hz trong trong dung môi DMSO; H

* đƣợc đo ở 75,6 MHz trong CDCl3.

DMSO; C

(ii) Hợp chất PU-2: Dạng tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy 94 - 96oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bƣớc sóng 230 và 280 nm (phụ lục A10); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z = 419 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C24H34O6 (phụ lục A6). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.2 và phụ lục A8, A9. Các kết quả thu đƣợc

cho phép khẳng định rằng, hợp chất PU-2 là phyllanthin với công thức cấu tạo

đƣợc nêu ở hình 3.2. Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [52],

Hợp chất phyllanthin cũng đã đƣợc công bố là đƣợc phân lập từ cây

Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria và nó có hoạt tính kháng virut viêm

gan B mạnh [7], [95], [102].

[101], [102].

Hình 3.2. Công thức cấu tạo của phyllanthin

40

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của PU-2 và so sánh với công bố ở tài liệu [101](*)

δH δH* [101]

Thƣ tự C 1 2 δC* [101] 133,6 112,2 δC 133,7 112,3 6,63 (1H, br s)

148,7 147,1 111,0 3 4 5 148,8 147,3 111,2 6,76 (1H, d, J = 8.0 Hz)

121,0 6 121,3 6,65 (1H, br d, J = 8.0 Hz)

34,9 7 34,7 2,64 (1H, m)

40,8 72,8 8 9 40,9 72,7 2,05 (1H, m) 3,31 (1H, m)

3,82 (3H, s) 3,87 (3H, s) 3,31 (3H, s)

55,9 55,7 57,8 133,6 112,2 3-OCH3 4- OCH3 (9- OCH3). 1’ 2’ 55,8 55,7 58,9 133,7 112,3 6,63 (1H, br s)

148,7 147,1 111,0 3’ 4’ 5’ 148,8 147,3 111,2 6,76 (1H, d, J = 8.0 Hz)

121,0 6’ 121,3 6,65 (1H, br d, J = 8.0 Hz)

34,9 7’ 34,7 2,64 (1H, m)

40,8 72,8 8’ 9’ 40,9 72,7 2,05 (1H, m) 3,31 (1H, m)

*: Tƣơng ứng là độ dịch chuyển hóa học (đối với H và C) thu đƣợc từ

55,9 55,7 57,8 6,59 (1H, d, J =1.8 Hz) 6,73 (1H, d, J = 8.1 Hz) 6,61 (1H, dd, J = 8.1, 1.8 Hz) 2,66 (1H, dd, J = 13.8, 7.5 Hz) 2.01 (1H, m) 3,25 (1H, dd, J = 13.8, 7.8 Hz) 3,78 (3H, s) 3,82 (3H, s) 3,27 (3H, s) 6,59 (1H, d, J = 1.8 Hz) 6,73 (1H, d, J = 8.1 Hz) 6,61 (1H, dd, J = 8.1, 1.8 Hz) 2,66 (1H, dd, J = 13.8, 7.5 Hz) 2,01 (1H, m) 3,28 (1H, dd, J = 13.8, 5.4 Hz) 3,78 (3H, s) 3,82 (3H, s) 3,27 (3H, s) 55,8 55,7 58,9 3,82 (3H, s) 3,87 (3H, s) 3,31 (3H, s)

*, C

41

3’-OCH3 4’- OCH3 9’- OCH3 (*) H, C và H

nghiên cứu này và đã đƣợc công bố ở tài liệu [101]; Trong đó, H đƣợc đo ở 500 MHz * đƣợc đo ở 300 MHz trong CDCl3; C đƣợc đo ở 100 Hz trong trong dung môi CDCl3; H

* đƣợc đo ở 75,6 MHz trong CDCl3

+ Nhƣ vậy, có thể khẳng định phần cao chiết cloroform từ cây Diệp hạ châu có

chứa hợp chất hypophyllanthin và hợp chất phyllanthin. Tuy vậy, để thu đƣợc

HCTN có độ tính khiết cao hơn, cần tiếp tục tinh chế chúng bằng phƣơng pháp sắc

ký lỏng điều chế (HPLC điều chế).

CDCl3; C

3.1.2. Chiết tách các HCTN từ cây Đan sâm và đặc trƣng cấu trúc

3.1.2.1. Chiết tách các HCTN

Mẫu rễ cây Đan sâm (đã đồng hóa) đƣợc ngâm chiết siêu âm có gia nhiệt với

dung môi ethanol 80% 3 lần (mỗi lần 1500 mL) sử dụng thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt ở 40oC trong 4 giờ. Các dịch chiết ethanol thu đƣợc đƣợc lọc qua giấy lọc,

gom lại và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm cho 488 g cao chiết tổng ethanol.

Hòa tan cao chiết thu đƣợc trong nƣớc cất (500 mL) và chiết phân bố bằng hexan,

etyl axetat và butanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL). Các dịch chiết phân

đoạn đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc phân đoạn tƣơng ứng

hexan (54,4 g), etyl axetat (105,6 g) và butanol (68,8 g).

Tiếp theo, các phần cao chiết đó (hexan, etyl axetat và butanol) đƣợc tách

bằng phƣơng pháp TLC và HPLC. Kết quả cho thấy, cao hexan chứa nhiều chất

nhất và các chất tách ra khỏi nhau khá tốt và do vậy, cao hexan đƣợc chọn để khảo

sát quá trình tách bằng sắc ký cột tiếp theo. Song, trƣớc khi tiến hành sắc ký cột,

cần khảo sát bằng phƣơng pháp TLC để lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho quá

trình tách tiếp.

Kết quả khảo sát bằng phƣơng pháp TLC đối với các hệ dung môi khác nhau:

hệ hexan : acetone (v/v  50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 0:1), hệ dung môi

cloroform : metanol (v/v  100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1) và hệ dung

môi hexan : etyl axetat (v/v  20:1, 10: 1, 5:1, 2:1) cho thấy, hệ dung môi hexan :

etyl axetat là thích hợp, vì nó cho phép tách các chất tốt hơn. Hệ dung môi này đƣợc

chọn cho giai đoạn sắc ký cột tiếp theo.

42

Tiến trình chiết tách bằng sắc ký cột:

- Cao hexan (54,4 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel (chiều dài

300 mm, đƣờng kính 50 mm, khối lƣợng silicagel 500 g) với 2500 mL hệ dung môi

rửa giải hexan : etyl axetat (5:1 v/v), thu dịch rửa giải vào 80 lọ. Tiến hành TLC tất

cả các lọ đó để nhận biết các phân đoạn có thành phần nhƣ nhau và gộp các phân

đoạn nhƣ nhau lại, cuối cùng thu đƣợc 7 phân đoạn chính (từ H-1 đến H-7).

- Tiếp theo, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-2 (5,3 g) ở điều kiện: cột silica

gel (dài  đƣờng kính trong  300 mm  30 mm) với 1.500 mL pha động (hệ dung

môi Hexan:CH2Cl2 (1:1 v/v); sau đó, thực hiện sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm ×

20 mm) với 500 mL pha động MeOH:H2O 4:1 (v/v), thu đƣợc hợp chất, đƣợc ký

hiệu là SM-1 (275 mg). Mặt khác, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-6 (1,5 g) ở điều

kiện: cột sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm × 20 mm) với 400 mL hệ pha động

MeOH:H2O (4:1 v/v,) thu đƣợc SM-2 (245 mg). Cuối cùng, tiến hành sắc ký cột

phân đoạn H-4 (2,7 g) ở điều kiện: cột sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm × 20 mm)

với 450 mL hệ pha động MeOH:H2O (4:1 v/v,) kết hợp tinh chế bằng kết tinh lại

trong methanol thu đƣợc SM-3 (231 mg). Tiến hành sắc ký cột tƣơng tự với một số

phân đoạn khác cũng đã phân lập đƣợc các hợp chất khác nhƣng khối lƣợng nhỏ

hơn nên ở đây chỉ tập trung vào nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc và tinh chế 3 hợp

chất SM-1, SM-2 và SM-3.

Tiến hành sắc ký cột tƣơng tự với một số phân đoạn khác và cao chiết khác

cũng đã phân lập đƣợc các hợp chất khác nhƣng khối lƣợng nhỏ hơn nên nghiên

cứu này tập trung vào nghiên cứu làm sạch 3 hợp chất SM-1, SM-2 và SM-3.

Quy trình phân lập các HCTN từ cây Đan sâm đƣợc nêu ở sơ đồ 3.2.

43

Rễ cây Đan sâm (2,0 Kg)

Ngâm chiết với ethanol (3 x 1,5 L)

Cao ethanol (488 g)

Chiết lần lƣợt với Hexane, Ethyl acetat, Butanol

Cao hexane (54,4 g) Cao butanol (68,8 g) Cao dịch nƣớc (40 g) Cao ethyl acetat (105,6 g) CC, Silica gel, Hex:EtOAc (20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1 v:v)

H-1 H-2 (5,3 g) H-3 H-4 (2,7 g) H-5

(g) (8,6 (g) hex:acetone (5:1) (8,6 CC, C18 MeOH:H2O (4:1) (8,6 CC, Silica gel g) hex:CH2Cl2 (1:1) (g) CC, C18 MeOH:H2O (8,6 (4:1) H-6 (1,5 g) (g) (8,6 g) H-7 CC, Silica gel (g) hex:EtOAc (4:1) (8,6 g) (g) CC, C18 MeOH:H2O (8,6 (3:1) g) g) g) g)

Tanshinon IIA (275 mg)

HPLC điều chế MeOH:H2O (7:3)

Tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0%), Sử dụng làm chất chuẩn phân tích

Sơ đồ 3.2. Phân lập các hợp chất từ rễ cây Đan sâm

44

(13mg) (1g) Tanshinon I (231 mg) (1g) Cryptotanshinon (245 mg) (1g)

3.1.2.2. Đặc trưng cấu trúc của các HCTN

Mục đích của nghiên cứu này là nhằm xác định xem – hợp chất SM-1, SM-2

và SM-3 là hợp chất gì dựa trên đặc trƣng cấu trúc và phổ của chúng. Tiến hành

phân tích mẫu (hợp chất SM-1, SM-2 và SM-3) bằng các phƣơng pháp NMR, MS

và UV-Vis, thu đƣợc kết quả ở bảng 3.3 và 3.4. Các đặc trƣng hóa – lý khác của 3

hợp chất đó cũng đƣợc xác định. Việc khẳng định công thức cấu tạo của chất là

dựa vào đặc trƣng cấu trúc (phổ NMR), phổ MS, phổ UV và so sánh với các kết

quả đã công bố trƣớc đây. Kết quả cho thấy:

(i) Hợp chất SM-1:: Dạng bột màu đỏ;

= 90o (c 1,0, CHCl3); Nhiệt độ nóng chảy 182 – 183 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở

bƣớc sóng 220 và 270 nm (phụ lục A18); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z  297 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C19H20O3 (hình

3.17, phụ lục A19). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.3 và phụ lục A16, A17. Các

kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng, hợp chất SM-1 là cryptotanshinone

với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.3. Công thức cấu tạo này cũng phù hợp

với công bố ở [27], [82].

Hình 3.3. Công thức cấu tạo của cryptotanshinone

45

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của SM-1 và so sánh với công bố ở tài liệu [27], [82]

(*)

δH(*)

δH

STT 1

δC(*) 29,6

3,22 (1H, t, J = 5.1 Hz)

δC 29,7

19,0

1,80 (1H, m)

2

19,1

37,8

1,66 (1H, m)

3

37,8

3,40 (1H, m) 3,13 (1H, m) 1,76 (1H, m) 1,68 (1H, m) 2,16 (1H, m) 1,74 (1H, m)

34,8 143,6 132,5 122,5 128,4 126,2 152,3 184,0 175,7 118,3 170,8 81,4

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

34,9 143,7 132,6 7,75 (1H, d, J = 8.0 Hz) 122,5 7,46 (1H, d, J = 7.6 Hz) 128,4 126,3 152,4 184,3 175,7 118,3 170,8 81,5

7,64 (1H, d, J = 8.1 Hz) 7,49 (1H, d, J = 8.1 Hz) 4,37 (1H, dd, J = 9.3, 6.0 Hz) 4,89 (1H, t, J = 9.6 Hz) 3,60 (1H, m)

16

34,6

34,6

3,49 (1H, dd, J = 9.6, 6.4 Hz) 4,89 (1H, J = 9.6 Hz) 4,35 (1H, dd, J = 9.2, 6.4 Hz) 1,24 (3H, d, J = 6.8 Hz) 1,30 (3H, s) 1,32 (3H, s)

18,8 31,9 31,9

1,36 (3H, d, J = 6.6 Hz) 1,31 (3H, s) 1,31 (3H, s)

18,9 31,9 32,0 *: Tƣơng ứng là độ dịch chuyển hóa học (đối với H và C) thu đƣợc từ

17 18 19 (*) H, C và H

*, C

nghiên cứu này và đã đƣợc công bố ở tài liệu [27], [82]; Trong đó, H đƣợc đo ở 400 MHz * đƣợc đo ở 500 MHz trong CDCl3; C đƣợc đo ở 100 Hz trong trong dung môi CD3OD; H

* đƣợc đo ở 125 MHz trong CDCl3.

CD3OD; C

(ii) Hợp chất SM-2: Dạng bột màu đỏ; Nhiệt độ nóng chảy 202 – 204 oC;

Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bƣớc sóng 225 và 270 nm (phụ lục A22); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z = 295 [M+H]+

và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C19H18O3 (hình 3.18 và phụ lục A23).

46

Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.4. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định

rằng, hợp chất SM-2 là tanshinon IIA với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.4.

Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [18], [27], [82].

Hình 3.4. Công thức cấu tạo của tanshinon IIA Bảng 3. 4 Dữ liệu phổ NMR của SM-2 và so sánh với công bố ở tài liệu [27], [82](*)

δC STT δC(*) δH(*) δH

29,9 3,19 (2H, t, J = 6.5 Hz) 3,19 (2H, t, J = 6.4 Hz) 1 29,9

19,2 1,79 (2H, m) 1,79 (2H, m) 2 19,1

37,9 1,66 (2H, m) 1,66 (2H, m) 3 37,9

34,7 4 34,7

150,2 5 150,1

133,5 7,63 (1H, d, J = 8.0 Hz) 7,63 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6 133,5

120,3 7,55 (1H, d, J = 8.0 Hz) 7,56 (1H, d, J = 8.0 Hz) 7 119,9

127,5 8 127,5

126,5 9 126,5

144,5 10 144,5

183,7 11 183,7

175,8 12 176,0

121,2 13 121,2

161,8 14 161,7

141,3 7,22 (1H, d, J = 1.0 Hz) 7,23 (1H, d, J = 1.2 Hz) 15 141,3

120,3 16 120,3

8,8 2,26 (3H, s) 2,27 (3H, d, J = 1.2 Hz) 17 8,8

31,8 1,31 (6H, s) 1,31 (3H, s) 18 31,8

H , H*, C , C*: Nhƣ mô tả ở bảng 3.3

47

31,8 1,31 (6H, s) 1,31 (3H, s) 19 31,8

(iii) Hợp chất SM-3: Dạng bột màu đỏ; Nhiệt độ nóng chảy 232-234 oC;

Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bƣớc sóng 250 nm (phụ lục A14); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z = 277 [M+H]+ và mảnh

này phù hợp với công thức phân tử C18H12O3 (phụ lục A11). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.5 và phụ lục A12, A13. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng,

hợp chất SM-3 là tanshinon I với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.5. Công

thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [18], [27], [82].

Hình 3.5. Công thức cấu tạo của Tanshinon I Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của SM-3 và so sánh với công bố ở tài liệu [27], [82](*)

δC(*) δH(*) δH

STT 1 2 δC 9,26 (1H, d, J = 9.0 Hz) 124,7 7,56 (1H, dd, J = 9.0, 7.0 Hz) 130,7 124,8 130,7

48

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 128,4 135,2 133,7 133,0 118,8 129,7 123,3 132,8 183,6 175,8 121,8 161,3 142,1 120,6 7,36 (1H, d, J = 7.0 Hz) 8,32 (1H, d, J = 9.0 Hz) 7,83 (1H, d, J = 9.0 Hz) 7,31 (1H, d, J = 0.5 Hz) 128,4 135,2 133,7 133,0 118,7 129,7 123,2 132,8 183,6 175,7 121,8 161,3 142,0 120,5 9,26 (1H, d, J = 9.2 Hz) 7,54 (1H, dd, J = 9.2, 7.2 Hz) 7,35 (1H, d, J = 7.2 Hz) 8,31 (1H, d, J = 8.8 Hz) 7,82 (1H, d, J = 8.8 Hz) 7,30 (1H, br s)

H , H*, C , C*: Nhƣ mô tả ở bảng 3.3

+ Nhƣ vậy, có thể khẳng định phần cao chiết hexan từ cây Đan sâm có chứa

hợp chất cryptotanshinone, tanshinon IIA và hợp chất tanshinon I. Tuy vậy, để thu

đƣợc HCTN có độ tính khiết cao hơn, cần tiếp tục tinh chế chúng bằng phƣơng

pháp sắc ký lỏng điều chế (HPLC điều chế).

17 18 8,8 19,9 2,30 (3H, d, J = 1.0 Hz) 2,70 (3H, s) 8,8 19,9 2,29 (3H, d, J = 1.2 Hz) 2,71 (3H, s)

3.1.3. Chiết tách các HCTN từ cây Mật nhân và đặc trƣng cấu trúc

3.1.3.1. Chiết tách các HCTN

Mẫu rễ cây Mật nhân E. longifolia (đã đồng hóa) đƣợc ngâm chiết siêu âm có gia nhiệt với dung môi ethanol 95 % (4 x 1500 mL) ở 40oC trong 4 giờ. Các dịch

chiết ethanol thu đƣợc đƣợc lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dƣới áp

suất giảm cho 62,5 g cao chiết tổng ethanol. Cao chiết đƣợc hòa tan trong nƣớc cất

(500 mL) và chiết phân bố lần lƣợt với EtOAc và BuOH (3 x 500 mL). Các dịch

chiết phân đoạn đƣợc cất loại dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc các phân

đoạn tƣơng ứng EtOAc (16,0 g) và BuOH (19,0 g).

Tiếp theo, các phần cao chiết đó (etyl axetat và butanol) đƣợc tách bằng

phƣơng pháp TLC và HPLC. Kết quả cho thấy, cao etyl axetat chứa nhiều chất nhất

và các chất tách ra khỏi nhau khá tốt và do vậy, cao etyl axetat đƣợc chọn để khảo

sát quá trình tách bằng sắc ký cột tiếp theo. Song, trƣớc khi tiến hành sắc ký cột,

cần khảo sát bằng phƣơng pháp TLC để lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho quá

trình tách tiếp.

Kết quả khảo sát bằng phƣơng pháp TLC đối với các hệ dung môi khác nhau:

hệ hexan : acetone (v/v  50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 0:1), và hệ dung môi

cloroform : metanol (v/v  100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1) cho thấy, hệ

dung môi CHCl3:MeOH là thích hợp, vì nó cho phép tách các chất tốt hơn. Hệ dung

môi này đƣợc chọn cho giai đoạn sắc ký cột tiếp theo.

Tiến trình chiết tách bằng sắc ký cột:

- Cao EtOAc (16,0 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel (chiều dài

300 mm, đƣờng kính 50 mm, khối lƣợng silicagel 500 g) với 2500 mL hệ dung môi

49

rửa giải CHCl3-MeOH (15:1 v/v), thu dịch rửa giải vào 70 lọ. Tiến hành TLC tất cả

các lọ đó để nhận biết các phân đoạn có thành phần nhƣ nhau và gộp các phân đoạn

nhƣ nhau lại, cuối cùng thu đƣợc 7 phân đoạn chính (từ E-1 đến E-7).

- Tiếp theo, tiến hành sắc ký cột phân đoạn E5 (2,1 g) ở điều kiện: sắc ký cột

pha đảo C18 (400 mm × 20 mm) với 500 mL pha động MeOH:H2O 1:2 (v/v), sau

đó kết tinh lại bằng MeOH thu đƣợc hợp chất, đƣợc ký hiệu là EL-1 (235 mg). Tiến

hành sắc ký cột tƣơng tự với một số phân đoạn khác cũng đã phân lập đƣợc các hợp

chất khác nhƣng khối lƣợng nhỏ hơn nên ở đây chỉ tập trung vào nghiên cứu đặc

trƣng cấu trúc và tinh chế hợp chất EL-1.

Quy trình chiết tách/phân lập các HCTN từ cây Mật nhân đƣợc nêu ở sơ đồ

3.3.

50

Rễ cây Mật nhân (2 Kg)

Ngâm chiết với ethanol (3 x 1,5 L)

Chiết lần lƣợt với Ethyl acetat, Butanol

Cao ethanol (62,5 g)

Cao ethyl acetat (16,0 g) Cao butanol (19,0 g) Cao dịch nƣớc (12 g)

E-1 CC, Silica gel, CHCl3:H2O (20:1, 15:1, 10:1, 5:1) Hexane:EtOAc (5:1) E-2 E-3 E-4 E-5 (2,1 g)

(8,6 g) (g) (8, (g) (8,6 (g) (8,6 (g) (8,6 E-6 CC, C18 (g) MeOH:H2O (2:1) (8,6 g) E-7 (g) (8,6 g) 6 g) g) g)

HPLC điều chế, MeOH:H2O (1:1)

g) Eurycomanone (235 mg) (1g)

Sơ đồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ rễ cây Mật nhân

51

Tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0%); Sử dụng làm chất chuẩn phân tích

3.1.3.2. Đặc trưng cấu trúc của các HCTN

Mục đích của nghiên cứu này là nhằm xác định xem – hợp chất EL-1 là hợp chất

gì dựa trên đặc trƣng cấu trúc và phổ của nó. Tiến hành phân tích mẫu (hợp chất EL-1)

bằng các phƣơng pháp NMR, MS và UV-Vis, thu đƣợc kết quả ở bảng 3.3 và 3.4. Các

đặc trƣng hóa – lý khác của 3 hợp chất đó cũng đƣợc xác định. Việc khẳng định công

thức cấu tạo của chất là dựa vào đặc trƣng cấu trúc (phổ NMR), phổ MS, phổ UV và so

sánh với các kết quả đã công bố trƣớc đây. Kết quả cho thấy:

Hợp chất EL-1: Dạng bột màu trắng;

+26 (c 0,30, MeOH); Nhiệt độ nóng

chảy 254 - 255 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bƣớc sóng

255 và 360 nm (phụ lục A27); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z  409,1 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C20H24O4 (phụ lục A24). Dữ liệu

phổ NMR nêu ở bảng 3.6 và phụ lục A25, A26. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng

định rằng, hợp chất EL-1 là eurycomanone với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.6.

Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [81].

Hình 3.6. Công thức cấu tạo của Eurycomanone Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của EL-1 và so sánh với công bố ở tài liệu [81] (*)

δC δH δH*[81]

δC*[81] 84,8 4,53 (1H, s) 84,3 4,56 (1H, s) 1

198,8 2 197,9

3 126,4 6,06 (1H, brs) 125,9 6,01 (1H, s)

165,2 4 162,9

42,8 5 42,6 3,26 (1H, brd, J = 12.6 Hz) 3,02 (1H, s)

26,1 6 26,1

52

2,33 (1H, td, J = 2.4, 14.4 Hz) 2,03 (1H, ddd, J = 2.4, 13.3, 2,30 (1H, m) 2,10 (1H, m)

14.4 Hz)

72,1 7 5,26 (1H, t, J = 2.4 Hz) 4,77 (1H, s) 71,7

53,0 8 53,1

48,1 9 3,82 (1H, s) 3,95 (1H, s) 48,0

46,3 10 46,5

109,9 11 109,2

81,4 12 4,81 (1H, s) 80,8 4,92 (1H, s)

148,3 13 146,1

79,7 14 79,3

76,3 15 5,66 (1H, d, J = 1.5 Hz) 5,68 (1H, s) 77,1

174,3 16 174,5

22,8 18 22,9

10,7 19 10,1 1,80 (3H, brs) 1,98 (3H, s)

68,1 20 68,0 4,02 (1H, d, J = 8.8 Hz) 3,84 (1H, d, J = 9.6 Hz)

4,55 (1H, d, J = 8.8 Hz) 3,68 (1H, d, J = 9.6 Hz)

121,5 21 119,8

H , H*, C , C*: Nhƣ mô tả ở bảng 3.3

+ Nhƣ vậy, có thể khẳng định phần cao chiết etyl axetat từ cây Mật nhân có chứa

hợp chất eurycomanone. Tuy vậy, để thu đƣợc HCTN có độ tính khiết cao hơn, cần tiếp

tục tinh chế chúng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng điều chế (HPLC điều chế).

6,12 (1H, d, J = 1.5 Hz) 5,67 (1H, s) 5,50 (1H, s) 5,39 (1H, s)

3.2. TINH CHẾ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN ĐỂ TẠO RA CHẤT CHUẨN

Trong hóa học phân tích, để định tính và định lƣợng, nhất thiết phải có sẵn chất

chuẩn đáp ứng các yêu cầu của quốc gia hoặc quốc tế. Để điều chế các chất chuẩn, có thể

sử dụng tổng hợp hóa học hoặc chiết tách chất có mặt từ các cây thuốc (hay thảo dƣợc).

Song, cho dù vậy, thách thức lớn nhất là phải tính chế sao cho thu đƣợc chất có độ tinh

khiết cao để thỏa mãn làm chất chuẩn. Các chất chuẩn thƣờng có giá thành cao, đặc biệt

là các hợp chất hữu cơ và chúng chỉ đƣợc một số hãng ở các quốc gia phát triển trên thế

giới sản xuất, nên các phòng thí nghiệm (PTN) khó chủ động trong phân tích. Để chủ

động cho nghiên cứu về các HCTN trong điều kiện PTN ở nƣớc ta, nghiên cứu này tập

trung

tinh chế sao cho

thu đƣợc các chất chuẩn phyllanthin,

tanshinone I,

cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone có độ tính khiết thỏa mãn yêu cầu,

tức là phải đạt trên 95 % [3], [23].

53

3.2.1. Chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin

Từ hợp chất PU-1 (hypophyllanthin, 229 mg) và PU-2 (phyllanthin, 312 mg) chiết

tách đƣợc từ cây Diệp hạ châu ở trên, tiến hành tinh chế tiếp theo bằng phƣơng pháp sắc ký

lỏng điều chế để thu đƣợc chất chuẩn có độ tinh khiết > 99,0 %.

- Trình tự tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế:

+ Sử dụng hệ thiết bị sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System) với

pha tĩnh và đặc điểm cột tách đã nêu ở bảng 2.1; Mẫu (hợp chất PU-1) đƣợc hòa tan

trong hệ dung môi MeOH-H2O 70:30 (v/v); Thể tích tiêm mẫu 100 μL; Pha động

MeOH : nƣớc 70:30 (v/v) đi qua cột trong thời gian 5 phút với tốc độ dòng 15,0

mL/phút.

+ Chạy sắc ký điều chế ở điều kiện trên lặp đi lặp lại nhiều lần và thu toàn bộ

dịch rửa giải; Đem cô bay hơi dung môi trong thiết bị cô quay chân không ở áp suất

thấp để thu đƣợc chất chuẩn (chất tinh khiết). Số lần chạy lặp lại đƣợc xác định là số

lần sao cho thu đƣợc khối lƣợng chất lớn nhất.

- Xác định độ tính khiết của chất: Chất tinh khiết thu đƣợc ở trên đƣợc đƣa vào hệ

thiết bị UPLC-DAD với các điều kiện sắc ký tƣơng tự nhƣ đối với sắc ký điều chế ở trên.

Độ tinh khiết của chất đƣợc đánh giá qua tỷ lệ giữa diện tích pic của chất và tổng diện

tích của tất cả các pic.

Kết quả cho thấy, độ tinh khiết của hypophyllanthin và phyllanthin tƣơng ứng là

99,8% và 99,5 % và nhƣ vậy, chúng hoàn toàn thỏa mãn làm chất chuẩn (sắc đồ đối với

hypophyllanthin và phyllanthin đƣợc nêu ở hình 3.7 và hình 3.8). Có thể thấy rằng, các

chất chuẩn thu đƣợc có độ tinh khiết tƣơng đƣơng các chất chuẩn đang bán trên thị

trƣờng thế giới. Dữ liệu về độ tinh khiết đƣợc nêu ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin*

Tạp chất 1

Tạp chất 2

Chất chính

Độ tinh khiết

Hợp chất

TB (%)

S

S

S

tR

tR

tR

Hypophyllanthin

1.95

9,302

2,93

99,8

Phyllanthin

7,976 6,889 2433,43

6,36

9,251

10,75

99,5

6,902 8,001 3403,76

54

*tR: thời gian lƣu của các chất, S: diện tích của pic, TB: giá trị trung bình

hypophyllanthin

(a)

(b)

Hình 3.7. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin:

(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)

Phyllanthin

(a)

(b)

Hình 3.8. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của phyllanthin:

(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)

3.2.2. Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA

- Mô tả: Từ phân đoạn H2 (5,3 g), kết hợp chạy sắc ký cột silica gel (30 mm × 300 mm) với hệ pha động Hex-CH2Cl2 (1:1 v/v, 1500 mL) và sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (4:1 v/v, 500 mL) thu đƣợc tanshinon IIA (bột màu đỏ, 275 mg). Tƣơng tự, hợp chất cryptotanshinon (bột màu đỏ cam, 245 mg) đƣợc phân lập từ phân đoạn H6 (1,5 g) bằng sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với pha động MeOH-H2O (3:1 v/v, 400 mL). Cuối cùng, từ phân đoạn H4 (2,7 g) bằng sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với pha động MeOH-H2O (4:1 v/v, 450 mL) kết hợp tinh chế bằng kết tinh lại trong methanol thu đƣợc tanshinon I (bột màu nâu đỏ, 231 mg). Các

hợp chất này đƣợc tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0 %) bằng hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System), pha tĩnh cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x 21,2 mm, 5,0 μm), pha động: MeOH (A) – nƣớc (B) trong thời gian 5 phút với tỉ lệ 7:3 v/v, tốc độ dòng 20,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 100,0 μL; dung môi pha mẫu: MeOH-H2O (7:3 v/v).

- Mẫu sau khi đã tinh chế đƣợc chạy UPLC-DAD: Tiến hành sắc ký theo chƣơng

trình trên, phân tích các píc phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ và tính độ tinh khiết. Phân tích định tính chất dựa vào thời gian lƣu (so sánh với thời gian lƣu của chất chuẩn). Xác định

55

độ tinh khiết của HCTN bằng cách so sánh diện tích pic của chất với tổng diện tích pic

của tất cả các chất có mặt trong mẫu (ở cùng điều kiện sắc ký hay trên cùng sắc đồ):

Độ tinh khiết của chất (%)  Diện tích pic của chất * 100/tổng diện tích các pic

trên sắc đồ.

Từ sắc đồ thu đƣợc, xác định đƣợc độ tính khiết của hợp chất tanshinone I là

99,8%, hợp chất cryptotanshinone 99,5 %, hợp chất tanshinone IIA là 99,6%, phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu (hình 3.9-3.11 và bảng 3.8). Các píc phụ

(tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi píc chất phân tích.

Bảng 3.8. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn tanshinone I, cryptotashinone và

tanshinone IIA

Hợp chất

Tạp chất 1 tR S 1,46 5,10 Tanshinone I 2,68 Cryptotashinone 5,17 3,81 Tanshinone IIA 8,69

Tạp chất 2 S tR 2,51 8,62 3,73 7,84 4,66 12,79

Chất chính S tR 7,78 1971,19 8,65 1275,13 15,19 2108,23

Độ tinh khiết TB (%) 99,8 99,5 99,6

*tR: thời gian lƣu của các chất, S: diện tích của pic, TB: giá trị trung bình

Tanshinone I

(b)

(a)

Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone I:

(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)

(a)

Cryptotanshinone

(b)

Hình 3.10. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của cryptotanshinone:

(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)

56

Tanshinone IIA

(a)

(b)

Hình 3.11. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone IIA (a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)

Nhƣ vậy, với quá trình tinh sạch bằng sắc ký lỏng điều chế ở trên, đã tạo ra đƣợc

chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA.

3.2.3. Chất chuẩn eurycomanone

- Mô tả: Từ phân đoạn E5 (2,1 g), tiến hành sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:2 v/v) sau đó kết tinh lại bằng MeOH thu đƣợc eurycomanone (bột trắng, 235 mg). Hợp chất này đƣợc tinh sạch (độ tinh khiết > 99,5

%) bằng hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System) pha tĩnh cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x 21,2 mm, 5,0 μm), pha động: MeOH (A) – nƣớc (B) trong thời gian 5 phút với tỉ lệ 50:50 v/v, tốc độ dòng 15,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 100,0 μL; dung môi pha mẫu: MeOH-H2O (50:50 v/v).

- Mẫu sau khi đã tinh chế đƣợc chạy UPLC-DAD: Tiến hành sắc ký theo chƣơng

trình trên, phân tích các píc phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ và tính độ tinh khiết bằng hệ

thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) Agilent 1290. Phân tích định tính chất

dựa vào thời gian lƣu (so sánh với thời gian lƣu của chất chuẩn). Xác định độ tinh khiết

của HCTN bằng cách so sánh diện tích pic của chất với tổng diện tích pic của tất cả các chất có mặt trong mẫu (ở cùng điều kiện sắc ký hay trên cùng sắc đồ):

Độ tinh khiết của chất (%)  Diện tích pic của chất * 100/tổng diện tích các pic

trên sắc đồ.

Từ sắc đồ thu đƣợc, xác định đƣợc độ tính khiết của chất eurycomanone là 99,4%, phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu (hình 3.12 và bảng 3.9). Các

píc phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi píc chất phân tích.

Bảng 3.9. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn eurycomanone

Hợp chất

Eurycomanone

Tạp chất 1 S tR 3,51 0,97

Tạp chất 2 S tR 7,59 1,22

Chất chính S tR 1,46 1839,25

Độ tinh khiết TB (%) 99,4

*tR: thời gian lƣu của các chất, S: diện tích của pic, TB: giá trị trung bình

57

Eurycomanone

(a)

(b)

Hình 3.12. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất eurycomanone:

(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)

Nhƣ vậy, với quá trình tinh sạch bằng sắc ký lỏng điều chế ở trên, đã tạo ra đƣợc

chất chuẩn eurycomanone.

3.3. QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC

Để phân tích các HCTN trong các mẫu khác nhau (cây thuốc, thực phẩm chức

năng…), ngƣời ta dùng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ UV-Vis , HPLC ghép nối với

detector UV… Do sự phát triển nhanh chóng của các phƣơng pháp phân tích hiện đại,

nên trong những năm gần đây, phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép nối với detector khối phổ

(LC-MS/MS) hoặc phƣơng pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối với detetctor mảng

diot (UPLC-DAD) đƣợc ƣu tiên sử dụng hơn, do chúng có khả năng tách và phân tích

đồng thời nhiều chất trong mẫu một cách tin cậy. Trong nghiên cứu này, cả 2 phƣơng

pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD đƣợc sử dụng để phân tích các HCTN trong các mẫu

nghiên cứu.

Để áp dụng thành công 2 phƣơng pháp trên, trƣớc hết cần khảo sát ảnh hƣởng của

các yếu tố đến phép phân tích để tìm đƣợc các điều kiện sắc ký thích hợp, bao gồm:

thành phần pha động (hệ dung môi, pH dung dịch đệm), tốc độ dòng pha động, nhiệt độ

cột... Các điều kiện thích hợp tìm đƣợc sẽ đƣợc dùng chung cho cả 2 phƣơng pháp sắc ký lỏng LC-MS/MS và UPLC-DAD.

Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin:

Trên cơ sở khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến phép phân tích LC-MS/MS nhƣ: thành phần pha động (hệ dung môi, pH dung dịch đệm), nhiệt độ cột, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, thời gian phân tích…) kết hợp với tham khảo các kết quả đã

công bố trong các tài liệu [63], [102], đã xây dựng đƣợc quy trình phân tích đồng thời

hypophyllanthin và phyllanthin trong mẫu khác nhau (cây Diệp hạ châu và thực phẩm

58

chức năng bào chế từ cây đó) nêu ở hình 3.15. Độ tin cậy của quy trình (hay phƣơng

pháp) phân tích đã đƣợc khẳng định qua độ ổn định của hệ thống thiết bị, độ đặc hiệu,

độ lặp lại (đối với dung dịch chuẩn), khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), độ lặp lại và độ đúng khi phân tích mẫu thực tế. Các thông tin về độ tin cậy của quy trình

phân tích đƣợc trình bày ở mục 3.4 và 3.5.

Để xác định các mảnh ion định tính, định lƣợng ta dựa vào phổ ESI-MS chạy với

các điều kiện trên hệ thống LC-MS/MS và chọn ra các ion có tín hiệu cao, đặc trƣng và

ổn định. Ở đây với hypophyllanthin ta chọn mảnh ion mẹ là 261.0 và mảnh ion con là

231.0 (hình 3.13). Đối với phyllanthin ta lựa chọn mảnh ion mẹ là 436.0 và mảnh ion con là 151.0 (hình 3.14).

Hình 3.13. Phổ ESI-MS của hợp chất hypophyllanthin

Hình 3.14. Phổ ESI-MS của hợp chất phyllanthin

59

Mẫu đầu (3-5 g) Đã nghiền nhỏ

+ 20 mL MeOH, siêu âm, 400C, 2h, lặp lại 3 lần, lọc thu đƣợc dung dịch mẫu.

Chuẩn bị

mẫu cho

phân tích

Lọc qua màng lọc 0,22µm  mẫu cho phân tích.

Dịch chiết  cô quay chân không  định mức 100 mL (MeOH:H2O 60:40 (v/v)). Lấy 0,1 mL dung dịch mẫu định mức lên 10 mL bằng MeOH:H2O 60:40 (đối với mẫu thực phẩm chức năng chạy LC-MS/MS).

Điều kiện LC: - Cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm); - MeOH – nƣớc chứa 10 mM ammonium acetate và 0,1 % HCOOH theo tỉ lệ 60:40 v/v; - Tốc độ dòng: 0,3 ml/min; - Thể tích tiêm mẫu: 1,0 μl; - Nhiệt độ buồng cột: 35 oC; - Thời gian phân tích 10 phút.

1 µL (10 µL) mẫu đƣợc tiêm vào hệ thống LC-MS/MS (UPLC-DAD) với các điều kiện thích hợp.

Điều kiện MS: - Nguồn ion hóa ESI, loại ion dƣơng; - Nhiệt độ nguồn ion hóa là 300oC; - Chế độ chạy MRM; - Phyllanthin: ion sơ cấp m/z 436,0 - ion thứ cấp m/z 151,0; - Hypophyllanthin: ion sơ cấp m/z 261,0 - ion thứ cấp m/z 231,0. Điều kiện DAD: - Bƣớc sóng 230 nm

Sắc ký đồ LC-MS/MS, UPLC-DAD và các bảng kết quả

Định tính: dựa vào thời gian lƣu và mảnh đặc trƣng Định lƣợng: Dựa vào phƣơng trình hồi quy tuyến tính y = a + bx ta tính

đƣợc nồng độ của chất phân tích đối với LC-MS/MS ta có Cng/mL = (y-a)/b

(ng/mL). Tiếp theo, hàm lƣợng của chất phân tích đƣợc tính quy về mg/g: Cmg/g = Cng/mL*100*D/m/106. Đối với UPLC-DAD ta có Cµg/mL = (y-a)/b

Kết quả

(µg/mL) Tiếp theo, hàm lƣợng của chất phân tích đƣợc tính quy về mg/g: Cmg/g = Cµg/mL*100*D/m/103 với D là hệ số pha loãng, m là khối lƣợng (g) mẫu phân tích, 100 là thể tích (mL) bình định mức mẫu phân tích, 106, 103

tƣơng ứng là hệ số chuyển đổi từ ng và µg sang mg.

Hình 3.15. Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD (áp dụng cho mẫu cây Diệp hạ châu và thực phẩm chức năng bào chế từ nó)

60

Quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA:

Trên cơ sở khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến phép phân tích LC-MS/MS, UPLC-

DAD nhƣ: thành phần pha động (hệ dung môi, pH dung dịch đêm), nhiệt độ cột, tốc độ

dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, thời gian phân tích…) kết hợp với tham khảo các kết

quả đã công bố trong các tài liệu [93], đã xây dựng đƣợc quy trình phân tích đồng thời

tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong mẫu cây Đan sâm) nêu ở hình

3.19. Độ tin cậy của quy trình (hay phƣơng pháp) phân tích đã đƣợc khẳng định qua độ

ổn định của hệ thống thiết bị, độ đặc hiệu, độ lặp lại (đối với dung dịch chuẩn), khoảng

tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), độ lặp lại và độ đúng khi phân tích mẫu thực tế.

Các thông tin về độ tin cậy của quy trình phân tích đƣợch trình bày ở mục 3.4 và 3.5.

Do có khả năng tách và nhận biết các mảnh qua phổ MS hai lần tốt hơn, nên

phƣơng pháp LC-MS/MS cho phép phân tích đồng thời 3 hợp chất trên. Cho đến nay, ở

nƣớc ta chƣa có nghiên cứu nào theo hƣớng này. Trên thế giới đã có một số công bố về

phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA bằng phƣơng pháp

LC-MS/MS.

Phƣơng pháp UPLC-DAD cũng đã đƣợc sử dụng để phân tích đồng thời tanshinone

I, cryptotanshinone, tanshinone IIA trong mẫu cây Đan sâm thu hái ở các vùng dƣợc liệu

khác nhau của Việt Nam. Song, so với phƣơng pháp LC-MS/MS, phƣơng pháp UPLC-

DAD đạt đƣợc LOD kém hơn, độ lặp lại và độ đúng cũng kém hơn và do vậy, có thể cho

rằng, phƣơng pháp LC-MS/MS là sự lựa chọn tốt nhất cho phân tích đồng thời

tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA.

Để xác định các mảnh ion định tính, định lƣợng ta dựa vào phổ ESI-MS chạy với

các điều kiện trên hệ thống LC-MS/MS và chọn ra các ion có tín hiệu cao, đặc trƣng và

ổn định. Ở đây với tanshinone I ion sơ cấp m/z 277,2; ion thứ cấp m/z 248,9 (hình 3.16). Đối với cryptotanshinone ion sơ cấp m/z 296,8; ion thứ cấp m/z 253,9 (hình 3.17) và đối với tanshinone IIA ion sơ cấp m/z 295,0; ion thứ cấp m/z 248,8 (hình 3.18). Với chế độ chạy MRM chúng ta lựa chọn ở các khoảng thời gian lƣu của các chất thu nhận tín hiệu các ion sơ cấp, thứ cấp tƣơng ứng với lựa chọn trên để tín hiệu đƣợc chọn lọc, hệ thống thiết bị sử dụng đỡ bị nhiễm bẩn.

61

Hình 3.16. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone I

Hình 3.17. Phổ ESI-MS của hợp chất cryptotanshinone

Hình 3.18. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone IIA

62

Mẫu đầu (m g), đã nghiền nhỏ m = 0,3-0,5g cho LC-MS/MS, m = 2-4 g cho UPLC-DAD

+ 20 mL MeOH, siêu âm, 400C, 2h, lặp lại 3 lần, lọc thu đƣợc dung dịch mẫu

Chuẩn bị

mẫu cho

phân tích

Lọc qua màng lọc 0,22 µm  mẫu cho phân tích.

Dịch chiết  cô quay chân không  định mức 100 mL (MeOH:H2O 70:30 (v/v)). Lấy 1 mL dung dịch mẫu định mức lên 10 mL bằng MeOH:H2O 70:30 (v/v).

Điều kiện LC: - Cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm); - Pha động: MeOH:H2O chứa 10 mM ammonium acetate và 0,1 % HCOOH 68:32 (v/v) ; - Tốc độ dòng: 0,25 ml/min; - Thể tích tiêm mẫu: 1,0 μl; - Nhiệt độ buồng cột: 35 oC; - Thời gian phân tích 20 phút.

1 µL (10 µL) mẫu đƣợc tiêm vào hệ thống LC-MS/MS (UPLC-DAD) với các điều kiện thích hợp.

Điều kiện MS: - Nguồn ion hóa ESI, loại ion dƣơng; - Nhiệt độ nguồn ion hóa là 300oC; - Chế độ chạy MRM; - Tanshinone I ion sơ cấp m/z 277,2; ion thứ cấp m/z 248,9; - Cryptotanshinone ion sơ cấp m/z 296,8; ion thứ cấp m/z 253,9; -Tanshinone IIA ion sơ cấp m/z 295,0; ion thứ cấp m/z 248,8. Điều kiện DAD: - Bƣớc sóng 270 nm.

Sắc ký đồ LC-MS/MS, UPLC-DAD và các bảng kết quả

Định tính: dựa vào thời gian lƣu và mảnh đặc trƣng Định lƣợng: Dựa vào phƣơng trình hồi quy tuyến tính y = a + bx ta tính

đƣợc nồng độ của chất phân tích đối với LC-MS/MS ta có Cng/mL = (y-

Kết quả

a)/b (ng/mL). Tiếp theo, hàm lƣợng của chất phân tích đƣợc tính quy về mg/g: Cmg/g = Cng/mL*100*D/m/106. Đối với UPLC-DAD ta có Cµg/mL =

(y-a)/b (µg/mL) Tiếp theo, hàm lƣợng của chất phân tích đƣợc tính quy về mg/g: Cmg/g = Cµg/mL*100*D/m/103 với D là hệ số pha loãng, m là

khối lƣợng (g) mẫu phân tích, 100 là thể tích (mL) bình định mức mẫu phân tích, 106, 103 tƣơng ứng là hệ số chuyển đổi từ ng và µg sang mg.

Hình 3.19. Quy trình phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA bằng phƣơng pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD

63

Quy trình phân tích hợp chất eurycomanone

Tƣơng tự với quy trình khảo sát trên cũng đã đƣa ra đƣợc quy trình phân tích

eurycomanone trong mẫu cây Mật nhân bằng phƣơng pháp LC-MS/MS:

Mẫu đầu (3-5 g) Đã nghiền nhỏ

+ 20 mL MeOH, siêu âm, 400C, 2h, lặp lại 3 lần, lọc thu đƣợc dung dịch mẫu.

Chuẩn bị

mẫu cho

phân tích

Lọc qua màng lọc 0,22 µm  mẫu cho phân tích.

Dịch chiết  cô quay chân không  định mức 100 mL (MeOH:H2O 60:40 (v/v)). Lấy 1 mL dung dịch mẫu định mức lên 10 mL bằng MeOH:H2O 60:40 (v/v).

Điều kiện LC: - Cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm); - Pha động: ACN – nƣớc chứa 0,1 % HCOOH với tỉ lệ tăng từ 15 % đến 60 % A - Tốc độ dòng: 0,3 ml/min; - Thể tích tiêm mẫu: 1,0 μl; - Nhiệt độ buồng cột: 35 oC; - Thời gian phân tích 5 phút.

Điều kiện MS: - Nguồn ion hóa ESI, loại ion dƣơng; - Nhiệt độ nguồn ion hóa là 300oC; - Chế độ chạy MRM; - Eurycomanone ion sơ cấp m/z 409,1 và ion thứ cấp m/z 391,0.

1 µL mẫu đƣợc tiêm vào hệ thống LC- MS/MS với các điều kiện thích hợp.

Sắc ký đồ LC-MS/MS và các bảng kết quả

Định tính: dựa vào thời gian lƣu và mảnh đặc trƣng Định lƣợng: Dựa vào phƣơng trình hồi quy tuyến tính y = a + bx ta

tính đƣợc nồng độ của chất phân tích đối với LC-MS/MS ta có

Kết quả

Cµg/mL = (y-a)/b (µg/mL). Tiếp theo, hàm lƣợng của chất phân tích đƣợc tính quy về mg/g: Cmg/g = Cµg/mL*100*D/m/103. với D là hệ số

pha loãng, m là khối lƣợng (g) mẫu phân tích, 100 là thể tích (mL) bình định mức mẫu phân tích, 103 là hệ số chuyển đổi từ µg sang

mg.

Hình 3.20. Quy trình phân tích eurycomanone bằng phƣơng pháp LC-MS/MS

64

Các ion sơ cấp và thứ cấp của eurycomanone cũng đƣợc xác định tƣơng tự ta thu đƣợc là ion sơ cấp m/z 409,1 và ion thứ cấp m/z 391,0 (hình 3.21).

Hình 3.21. Phổ ESI-MS của hợp chất eurycomanone

3.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Khi nghiên cứu xây dựng quy trình (hay phƣơng pháp) phân tích nói chung và quy

trình phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký nói riêng, bắt buộc phải đánh giá độ tin cậy của

phƣơng pháp qua các yếu tố (hay thông số) thể hiện năng lực của phƣơng pháp phân tích

nhƣ:

(i) Độ ổn định của hệ thống thiết bị, độ đặc thù, độ lặp lại, khoảng tuyến tính khi

sử dụng dung dịch chuẩn trong PTN;

(ii) Mặt khác, khi áp dụng phƣơng pháp phân tích vào thực tế, cần đánh giá độ tin

cậy của phƣơng pháp qua LOD, độ lặp lại và độ đúng khi phân tích mẫu thực tế.

Các yếu tố ở (i) sẽ đƣợc đề cập dƣới đây, còn các yếu tố ở (ii) đƣợc cập ở mục 3.6

– áp dụng thực tế.

3.4.1. Tính ổn định của hệ thống thiết bị

- Đối với phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin:

Thực hiện chạy sắc ký lặp lại 6 lần (n  6) trên hệ thiết bị (LC-MS/MS và

65

UPLC-DAD) đối với dung dịch chuẩn chứa hypophyllanthin và phyllanthin, rồi xác

định thời gian lƣu (t), diện tích pic (S), hệ số đối xứng (A) và số đĩa lý thuyết (D) từ các

sắc đồ thu đƣợc. Kết quả cho thấy, độ ổn định của hệ thống thiết bị rất tốt (bảng 3.10):

Các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2 % và nhƣ vậy, đáp ứng độ tin cậy khi phân tích đồng

thời hypophyllanthin và phyllanthin.

Đối với phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA

Tiến hành theo cách tƣơng tự nhƣ khi xác định độ ổn định của hệ thống thiết bị

trong phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, thu đƣợc các kết quả ở bảng

3.11. Các kết quả ở bảng 3.11 cho thấy, độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS và

UPLC-DAD cũng đạt đƣợc độ ổn định tốt với các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2 % (n  6) khi

phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA. Riêng độ lặp lại đối

với số đĩa lý thuyết là 3,5 % (lớn hơn so với yêu cầu), song không đáng kế, nên vẫn

chấp nhận đƣợc.

66

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và

phyllanthin (n  6) (*)

Hypophyllanthin Phyllanthin Thí nghiệm t S a D t S a D

7,976 1 6,902 262,6327 0,98 40535 300,7612 1,01 44016

7,997 2 6,889 263,1130 1,01 40649 301,1024 0,99 44750

3 6,903 262,3435 1,02 40673 8,001 300,5615 0,99 49994

8,003 4 6,887 261,9856 1,01 40569 301,2019 1,02 49913

7,999 5 6,901 260,9899 0,98 40684 302,0199 0,98 51015

7,989 6 6,890 264,1241 0,99 40595 299,9845 1,03 50179

7,994 TB 6,90 262,5315 0,99 40617 300,9386 1,00 50144

(*) t: thời gian lƣu (phút); S: diện tích pic (mAu.s); a: hệ số đối xứng; D: số đĩa lý thuyết (đĩa); TB: Trung bình số học; RSD: Độ lệch chuẩn

0,1 RSD (%) 0,1 0,3 1,8 0,2 0,2 1,6 1,0

67

tƣơng đối; RSD (%)  S100/TB, trong đó, S là độ lệch chuẩn; Các điều kiện thí nghiệm: Nhƣ đề cập ở mục 3.3.

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone

và tanshinone IIA (n  6) (*)

Tanshinone I Cryptotanshinone Tanshinone IIA TN t S D t S D t S a a D A

7,782 380,1 34535 8,66 367,7 30535 15,10 600,6 0,99 1,01 50016 0,98 1

7,785 379,9 32649 8,65 368,1 30649 15,18 599,2 1,02 0,99 49750 1,01 2

7,782 378,5 30673 8,62 367,5 30673 15,19 601,3 1,00 0,99 49994 1,02 3

7,785 381,2 36569 8,64 366,6 30569 15,19 598,9 1,01 1,02 49913 1,01 4

7,792 380,5 30684 8,63 367,9 30684 15,19 599,8 0,98 0,98 51015 0,98 5

7,846 379,6 33595 8,69 368,5 30595 15,19 603,8 0,98 1,03 50179 0,99 6

0,99 1,00 50144 TB 7,795 379,97 33950 8,65 367,7 30617 15,17 600,6 0,99

(*) t, S, a, D, TB và RSD: Nhƣ ở bảng 3.10; Các điều kiện thí nghiệm: Nhƣ đề cập ở mục 3.3.

68

1,6 1,6 1,0 RSD (%) 0,3 0,2 3,5 0,3 0,2 0,2 0,2 0,3 1,8

Đối với phân tích eurycomanone:

Các kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân

tích eurycomanone (trong dung dịch chuẩn) ở bảng 3.12 cho thấy, hệ thống thiết

bị đạt đƣợc độ ổn định tốt với các giá trị RSD đều nhỏ hơn 2 % (n  6). Riêng đối

với độ lặp lại của hệ số đối xừng và số đĩa lý thuyết tƣơng ứng là 4,9 và 5,0 %

(lớn hơn so với yêu cầu), song không đáng kế và mức độ ảnh hƣởng của 2 yếu tố

này lên phƣơng pháp không nhiều, nên vẫn chấp nhận đƣợc.

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân

tích Eurycomanone (n  6) (*)

Eurycomanone TN t S a D

1,456 1,454 1,457 1,456 1,455 1,454 1,455 280,1 279,9 278,5 281,2 280,5 279,6 279,97 0,95 1,02 1,05 1,04 0,96 0,94 0,99 24535 24649 23673 26569 24684 23595 24284 1 2 3 4 5 6 TB

(*) t, S, a, D, TB và RSD: Nhƣ ở bảng 3.10; Các điều kiện thí nghiệm: Nhƣ đề cập ở mục 3.3

0,1 0,3 4,9 5,0 RSD (%)

3.4.2. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp phân tích

Tiến hành khảo sát độ đặc hiệu của phƣơng pháp LC-MS/MS khi phân tích

đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin (2 chất chuẩn), hoặc phân tích đồng thời

tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA (3 chất chuẩn), hoặc phân tích

eurycomanone (1 chất chuẩn) bằng cách ghi sắc đồ mẫu trắng (là dung môi) và

dung dịch chuẩn tƣơng ứng (chứa 2 hoặc 3 hoặc 1 chất chuẩn) và xác định thời

gian lƣu của các chất phân tích.

Kết quả cho thấy, đối với cả 3 trƣờng hợp (dung dịch chứa 2 hoặc 3 hoặc 1

chất chuẩn tƣơng ứng), pic của mẫu trắng không xuất hiện ở thời gian lƣu của chất

phân tích: Thời gian lƣu (tR) của hypophyllanthin và phyllanthin tƣơng ứng là

69

7,042 phút và 8,088 phút (hình 3.22); Thời gian lƣu (tR) của tanshinone I,

cryptotanshinone và tanshinone IIA tƣơng ứng là 7,78 phút, 8,65 phút và 15,17

phút (Hình 3.23); Thời gian lƣu (tR) của eurycomanone là 1,456 phút (Hình 3.24).

Nhƣ vậy, có thể khẳng định rằng, phƣơng pháp LC-MS/MS đạt đƣợc độ

đặc hiệu cao đối với cả 3 trƣờng hợp – phân tích đồng thời 2 chất, 3 chất và 1 chất.

Hypophyllanthin

(a)

Phyllanthin

(b)

Phyllanthin

(c)

Hypophyllanthin

Hình 3.22. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) hypophyllanthin,

ứng với các nồng độ khác nhau (b) phyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau và

(c) hypophyllanthin và phyllanthin

70

Cryptotanshinone

(a)

Tanshinone IIA

(b)

Tanshinone I

(c)

Tanshinone I

(d)

Tanshinone IIA

Cryptotanshinone

Hình 3.23. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) tanshinone I, ứng

với các nồng độ khác nhau; (b) cryptotanshinone, ứng với các nồng độ khác nhau;

(c) tanshinone IIA, ứng với các nồng độ khác nhau; và (d) tanshinone I,

cryptotanshinone và tanshinone IIA.

71

Eurycomanone

Hình 3.24. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: eurycomanone, ứng

với các nồng độ khác nhau

3.4.3. Khoảng tuyến tính

- Đối với hypophyllanthin và phyllanthin:

+ Chuẩn gốc hypophyllanthin:

Cân chính xác 7,5 mg pha trong bình định mức 10ml bằng dung môi MeOH

Merk chúng ta thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 750 µg/mL, lƣu giữ ở điều kiện 0-40C.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 30000 ng/mL, 15000

ng/mL, 7500 ng/mL, 3000 ng/mL, 1500 ng/mL, 375 ng/mL, 7,5 ng/mL đƣợc sử

dụng để thiết lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp LC-MS/MS.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 100 µg/mL, 50

µg/mL, 25 µg/mL, 10 µg/mL, 5 µg/mL, 1 µg/mL, 0,5 µg/mL đƣợc sử dụng để thiết

lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp UPLC-DAD.

+ Chuẩn gốc phyllanthin

Cân chính xác 6,0 mg pha trong bình định mức 10ml bằng dung môi MeOH

Merk chúng ta thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 600 µg/mL, lƣu giữ ở điều kiện 0-40C.

72

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 12000 ng/mL, 6000

ng/mL, 3000 ng/mL, 1200 ng/mL, 150 ng/mL, 75 ng/mL, 6 ng/mL đƣợc sử dụng để

thiết lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp LC-MS/MS.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 120 µg/mL, 60

µg/mL, 30 µg/mL, 12 µg/mL, 6 µg/mL, 1,2 µg/mL, 0,6 µg/mL đƣợc sử dụng để

thiết lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp UPLC-DAD.

Tiến hành chạy LC-MS/MS và UPLC-DAD đối với các dung dịch chuẩn

chứa đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin với nồng độ đã chọn để xây dựng

đƣờng chuẩn ở các điều kiện thí nghiệm thích hợp (nhƣ nêu ở mục 3.3), thu đƣợc

các sắc đồ. Xác định diện tích pic của mỗi chất (y) và áp dụng phƣơng pháp bình

phƣơng tối thiểu để thiết lập các phƣơng trình hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ

thuộc giữa y và nồng độ chất phân tích (C). Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng

độ (đối với phƣơng pháp LC-MS/MS) và (đối với phƣơng pháp UPLC-DAD), giữa y và C có tƣơng quan tuyến tính tốt với hệ số xác định R 2 > 0,999 và mức ý

nghĩa thống kê (p) < 0,0001. Phƣơng trình hồi quy tuyến tính đối với mỗi chất

trong phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD nhƣ sau (các đƣờng hồi quy tuyến

tính đƣợc nêu ở hình 3.25 – 3.27):

+ Đối với phƣơng pháp LC-MS/MS: y = 11,251*Chypophyllanthin – 405,977; R2 = 0,9995; p < 0,0001; y = 22,151*Cphyllanthin – 1308,984 ; R2 = 0,9991; p < 0,0001;

+ Đối với phƣơng pháp UPLC-DAD: y = 28.04*Chypophyllanthin - 11.063 ; R2 = 0.9996; p < 0.0001);

R2 = 0.9995; p < 0.0001

y = 9.3425*Cphyllanthin + 5.3558

73

Hình 3.25. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phƣơng pháp

LC-MS/MS

Hình 3.26. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phƣơng pháp LC-

MS/MS

Hình 3.27. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với (a) hypophyllanthin và (b) phyllanthin

trong phƣơng pháp UPLC-DAD

Các phƣơng trình (hay đƣờng) hồi quy tuyến tính ở trên cũng đƣợc dùng

làm phƣơng trình đƣờng chuẩn (hay đƣờng chuẩn) để định lƣợng các chất khi

phân tích mẫu thực tế.

74

- Đối với tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA:

+ Chuẩn gốc tanshinone I

Cân chính xác 4,9 mg pha trong bình định mức 10ml bằng dung môi MeOH

Merk chúng ta thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 490 µg/mL, lƣu giữ ở điều kiện 0-40C.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 30625 ng/mL, 12250

ng/mL, 6125 ng/mL, 1225 ng/mL, 61,25 ng/mL, 6,125 ng/mL đƣợc sử dụng để thiết

lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp LC-MS/MS.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 61,25 µg/mL, 30,625

µg/mL, 12,25 µg/mL, 6,125 µg/mL, 3,0625 µg/mL đƣợc sử dụng để thiết lập đƣờng

chuẩn cho phƣơng pháp UPLC-DAD.

+ Chuẩn gốc cryptotashinone

Cân chính xác 7,5 mg pha trong bình định mức 10ml bằng dung môi MeOH

Merk chúng ta thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 750 µg/mL, lƣu giữ ở điều kiện 0-40C.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 31250 ng/mL, 12500

ng/mL, 6250 ng/mL, 1250 ng/mL, 62,5 ng/mL, 3,125 ng/mL đƣợc sử dụng để thiết

lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp LC-MS/MS.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 62,5 µg/mL, 31,25

µg/mL, 12,5 µg/mL, 6,25 µg/mL, 3,125 µg/mL đƣợc sử dụng để thiết lập đƣờng

chuẩn cho phƣơng pháp UPLC-DAD.

+ Chuẩn gốc tanshinone IIA

Cân chính xác 7,0 mg pha trong bình định mức 10,0 ml bằng dung môi

MeOH Merk chúng ta thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 700 µg/mL, lƣu giữ ở điều kiện 0-40C.

75

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 43750 ng/mL, 17500

ng/mL, 8750 ng/mL, 175 ng/mL, 17,5 ng/mL, 4,375 ng/mL đƣợc sử dụng để thiết

lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp LC-MS/MS.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 87,5 µg/mL, 43,750

µg/mL, 17,5 µg/mL, 8,75 µg/mL, 4,375 µg/mL đƣợc sử dụng để thiết lập đƣờng

chuẩn cho phƣơng pháp UPLC-DAD.

Kết quả khảo sát trong khoảng nồng độ đã chọn, mỗi chất trong dung dịch

chuẩn hỗn hợp tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA trong phƣơng pháp

LC-MS/MS và UPLC-DAD cho thấy, giữa y (diện tích pic của chất) và nồng độ chất (C) có tƣơng quan tuyến tính tốt với R2 > 0,999 và p < 0,0001. Các phƣơng

trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc nhƣ sau (các đƣờng hồi quy tuyên tính đƣợc nêu ở

hình 3.28 – 3.31):

LC-MS/MS: y = - 781.061 + 15.643*Ctanshinone I, R2 = 0.999; p < 0.0001 y = - 96.429 + 2.276*Ccryptotanshinone, R2 = 0.999; p < 0.0001 y = - 135.941 + 4.162*Ctanshinone IIA, R2 = 0.999; p < 0.0001 UPLC-DAD: y = 13.926*Ctanshinone I - 26.414, R2 = 0.998; p < 0.0001 y = 13.284*Ctanshinone IIA - 0.1893, R2 = 0.999; p < 0.0001 y = 11.709*Ccryptotanshinone - 3.8616, R2 = 0.999; p < 0.0001

Hình 3.28. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I trong phƣơng pháp LC-

MS/MS

76

Hình 3.29. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với cryptotanshinone trong phƣơng pháp

LC-MS/MS

Hình 3.30. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone IIA trong phƣơng pháp

LC-MS/MS

77

Hình 3.31. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với (a) tanshinone I (b) cryptotanshinone

và (c) tanshinone IIA trong phƣơng pháp UPLC-DAD

Đối với eurycomanone:

Chuẩn gốc eurycomanone:

Cân chính xác 5,5 mg pha trong bình định mức 10ml bằng dung môi MeOH

Merk chúng ta thu đƣợc dung dịch chuẩn gốc nồng độ 550 µg/mL, lƣu giữ ở điều kiện 0-40C.

Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha chế sử dụng trong ngày bằng cách

pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng MeOH ta thu đƣợc gồm 13,75 µg/mL, 5,5

µg/mL, 2,75 µg/mL, 1,375 µg/mL, 0,55 µg/mL, 0,011 µg/mL đƣợc sử dụng để thiết

lập đƣờng chuẩn cho phƣơng pháp LC-MS/MS.

Kết quả khảo sát trong khoảng nồng độ mỗi chất 0,01-15 µg/mL trong dung

dịch chuẩn eurycomanone trong phƣơng pháp LC-MS/MS cho thấy, giữa y (diện tích pic của chất) và nồng độ chất (C) có tƣơng quan tuyến tính tốt với R2 > 0,999

và p < 0,0001. Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc nhƣ sau (đƣờng hồi quy

tuyên tính đƣợc nêu ở hình 3.32):

R2 = 0.999; p<0.0001

y = 1262.961*Ceurycomanone + 15.631;

Hình 3.32. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với eurycomanone trong phƣơng pháp

LC-MS/MS

78

3.5. ÁP DỤNG THỰC TẾ

Các kết quả đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích ở trên là cần

thiết, nhƣng mới khẳng định đối với dung dịch chuẩn của chất phân tích. Song, để

khẳng định khả năng áp dụng một phƣơng pháp phân tích bất kỳ vào thực tế, trƣớc

hết bắt buộc phải hiệu lực hóa (hay kiểm soát chất lƣợng) của nó qua các đại lƣợng

thống kê (khi phân tích mẫu thực tế có nền mẫu/matrix xác định) nhƣ: độ lặp lại

(hay độ chụm), độ đúng và LOD (giới hạn phát hiện của phƣơng pháp phân tích).

Độ lặp lại trong nội bộ PTN (repeatability) đƣợc đánh giá qua độ lệch chuẩn tƣơng

đối (RSD) và so sánh với RSD tính theo phƣơng trình Horwitz [105] (ký hiệu là

RSDH). Độ đúng đƣợc đánh giá qua phân tích mẫu thêm chuẩn (spiked sample). Chỉ

khi một phƣơng pháp phân tích vừa đạt đƣợc độ đúng tốt và độ lặp lại tốt, mới đƣợc

xem là đạt đƣợc độ chính xác (accurate) cao. LOD đƣợc xác định theo phƣơng pháp

xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu S/N.

3.5.1. Kiểm soát chất lƣợng của phƣơng pháp phân tích

3.5.1.1. Độ lặp lại

- Độ lặp lại của phương pháp đối với hypophyllanthin và phyllanthin

Để kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi phân

tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, tiến hành phân tích mẫu lặp lại 3 lần,

(n  3) theo quy trình nêu ở mục 3.3. Mặt khác, để so sánh với phƣơng pháp LC-

MS/MS, phƣơng pháp UPLC-DAD cũng đƣợc áp dụng để phân tích các mẫu thuốc

trên. Chi tiết về chuẩn bị mẫu cho phân tích theo các phƣơng pháp trên đƣợc nêu ở

mục 3.3. Các kết quả phân tích đƣợc tính theo nồng độ chất trong dung dịch mẫu

(µg/mL).

Các kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, cả 2 phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-

DAD đều đạt đƣợc độ lặp lại tốt đối với cả 2 chất trong tất cả các mẫu: Các giá trị

RSD đều < ½ RSDH [107] (các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C12 đến C17.

Song, cũng cần thấy rằng, phƣơng pháp LC-MS/MS đạt đƣợc độ lặp lại tốt hơn so

với phƣơng pháp UPLC-DAD: Đối với cả hypophyllanthin và phyllanthin, phƣơng

pháp LC-MS/MS đều đạt đƣợc RSD nhỏ hơn so với phƣơng pháp UPLC-DAD.

79

Bảng 3.13. Kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi

phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích Eurycomanone(*)

RSD (%) / ½ RSDH (%); n  3 Chất phân tích Mẫu LC-MS/MS UPLC-DAD

DHC-VX 0,02 / 3,8 1,1 / 2,0

DHC-DH 1,0 / 3,9 0,8 / 1,9

DHC-PNC 1,0 / 3,9 0,8 / 1,9 Hypophyllanthin DHC-PV 0,04 / 3,4 0,7 / 1,9

DHC-DD5 0,05 / 4,3 1,7 / 2,1

DHC-KH 0,01 / 3,0 0,2 / 1,8

DHC-VX 0,02 / 3,4 2,8 / 3,4

DHC-DH 0,03 / 4,0 3,2 / 4,0

DHC-PNC 0,01 / 3,2 1,2 / 3,2 Phyllanthin DHC-PV 0,01 / 2,8 1,0 / 2,8

DHC-DD5 1,1 / 4,1 2,6 / 4,1

DHC-KH 0,01 / 2,6 0,6 / 2,6

Vũng Tàu 0,01 / 2,6

Đăk Nông 0,01 / 3,7

Hòa Bình 0,01 / 2,9 Eurycomanone Nghệ An 0,01 / 3,4

Bắc Giang 0,01 / 2,4

(*) Chi tiết về các mẫu đƣợc nêu ở 2.1, 2.2; Các giá trị đứng trƣớc/sau trong bảng tƣơng

Hà Giang 0,01 / 2,9

- Độ lặp lại của phương pháp đối với tanshinone I, cryptotanshinone và

tanshinone IIA:

Phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong

mỗi mẫu bằng 2 phƣơng pháp (LC-MS/MS và UPLC-DAD) và mỗi mẫu đƣợc phân

phân tích lặp lại 3 lần (n  3). Từ đó, tính RSD của mỗi phƣơng pháp đối với mỗi

chất, thu đƣợc các kết quả ở bảng 3.14 (các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C18

đến C23. Các kết quả cũng cho thấy, cả 2 phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

80

ứng là RSD và ½ RSDH. ĐKTN: Nhƣ nêu ở mục 3.3

đều đạt đƣợc độ lặp lại tốt đối với cả 3 chất trong tất cả các mẫu: Các giá trị RSD đều

< ½ RSDH. Mặt khác, phƣơng pháp LC-MS/MS đạt đƣợc độ lại rất tốt (đối với cả 3

chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA), tốt hơn so với phƣơng pháp

UPLC-DAD, do nó có RSD nhỏ hơn đáng kể (đối với tất cả các mẫu).

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các PP LC-MS/MS và UPLC-DAD

RSD (%) / ½ RSDH (%); n  3 Chất phân tích Mẫu LC-MS/MS UPLC-DAD

Sapa 0,01 / 2,5 0,5 / 2,5

Lâm Đồng 0,01 / 2,3 0,2 / 2,3

Hà Giang 0,01 / 2,3 0,4 / 2,3 Tanshinone I Mộc Châu 0,01 / 2,4 1,1 / 2,4

Quảng Tây 0,01 / 2,6 1,3 / 2,6

Mƣờng Lống 0,01 / 2,7 1,2 / 2,7

Sapa 0,01 / 2,0 0,3 / 2,0

Lâm Đồng 0,01 / 2,0 0,3 / 2,0

Hà Giang 0,01 / 1,9 0,5 / 1,9 Tanshinone IIA Mộc Châu 0,01 / 2,1 0,6 / 2,1

Quảng Tây 0,11 / 2,2 0,6 / 2,2

Mƣờng Lống 0,01 / 2,3 0,8 / 2,3

Sapa 0,01 / 2,2 0,4 / 2,2

Lâm Đồng 0,01 /2,1 0,2 / 2,1

Hà Giang 0,01/ 2,2 0,5 / 2,2 Cryptotanshinone Mộc Châu 0,01 / 2,3 0,5 / 2,3

Quảng Tây 0,01 / 2,4 0,4 / 2,4

(*) Chi tiết về các mẫu đƣợc nêu ở bảng 2.2; Các giá trị đứng trƣớc/sau trong bảng tƣơng

Mƣờng Lống 0,01 / 2,3 0,8 / 2,3

- Độ lặp lại của phương pháp đối với eurycomanone:

Theo cách tƣơng tự nhƣ đối với phân tích đồng thời hypophyllanthin và

phyllanthin, và phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone

IIA ở trên, độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS khi phân tích eurycomanone

81

ứng là RSD và ½ RSDH. ĐKTN: Nhƣ nêu ở mục 3.3.

trong các mẫu cũng đƣợc đánh giá qua RSD (n  3) và so sánh với ½ RSDH.

Các kết quả cho thấy, phƣơng pháp LC-MS/MS đạt đƣợc độ lặp tốt khi phân

tích eurycomanone trong tất cả các mẫu: Các giá trị RSD đều < ½ RSDH (bảng 3.13;

các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C24. Đối với tất cả các mẫu, phƣơng pháp

LC-MS/MS đều đạt đƣợc độ lại rất tốt đối với eurycomanone với RSD  0,01 % (n 

3).

3.5.1.2. Độ đúng

Các kết quả kiểm tra độ lặp lại ở trên cho thấy, phƣơng pháp LC-MS/MS đạt

đƣợc độ lặp lại rất tốt và do vậy, ở đây chỉ kiểm tra độ đúng của nó, mà không kiểm

tra độ lặp lại của phƣơng pháp UPLC-DAD.

- Độ đúng của phương pháp phân tích hypophyllanthin và phyllanthin:

Độ đúng đƣợc đánh giá qua độ thu hồi (Rev) khi phân tích mẫu thực tế đƣợc

thêm chuẩn. Tiến hành kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS ở 3 mức

thêm chuẩn vào mẫu thực tế: Mức 1, mức 2 và mức 3 – ứng với 3 mức nồng độ chất

thêm chuẩn vào mẫu thƣc tế - cỡ ½, tƣơng đƣơng và gấp đôi so với nồng độ chất

trong mẫu thực tế. Ở mỗi mức thêm chuẩn, tiến hành phân tích lặp lại 3 lần, rồi tính

độ thu hồi (Rev) trung bình đối với cả 3 mức. Các kết quả ở bảng 3.15 cho thấy (các

kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C27 và C28), phƣơng pháp LC-MS/MS đạt đƣợc

độ đúng tốt đối với cả hypophyllanthin và phyllanthin trong tất cả các mẫu với Rev

trung bình  95 – 103 %. Các độ thu hồi đó hoàn toàn thỏa mãn yêu cầu của

AOAC về độ đúng của một phƣơng pháp phân tích [68], [88], [105].

82

Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với

hypophyllanthin và phyllanthin(*)

Rev (%)

Chất phân tích Mẫu Rev trung Mức 1 Mức 2 Mức 3 bình (%)

DHC-VX 97/95/96 98/98/100 99/100/100 95 - 100

DHC-DH 97/95/95 99/98/99 100/99/99 95 - 100

DHC-PNC 96/97/97 98/98/100 99/99/100 96 - 100 Phyllanthin DHC-PV 95/101/99 98/101/100 99/99/100 95 - 101

DHC-DD5 97/102/96 99/99/100 99/100/100 97 - 102

DHC-KH 95/97/99 99/100/100 99/99/100 95 - 100

DHC-VX 97/97/98 97/95/99 99/99/100 95 - 100

DHC-DH 95/99/103 98/100/99 99/101/100 95 - 103

DHC-PNC 96/96/101 100/97/99 99/99/100 96 - 101 Hypophyllanthin DHC-PV 97/103/97 99/99/101 99/99/100 97 - 103

DHC-DD5 96/95/101 96/102/100 99/99/100 95 - 102

DHC-KH 94/96/101 97/101/97 99/100/99 94 - 101

Vũng Tàu 97/99/100 99/98/101 101/100/99 97 - 101

Đắk Nông 99/97/99 99/99/100 100/99/100 97 - 100

Hòa Bình 98/99/99 99/98/99 98/101/100 98 - 101 Eurycomanone Nghệ An 97/99/101 99/98/100 100/99/102 97 - 102

Bắc Giang 99/98/99 100/99/101 99/101/99 98 - 101

(*) Chi tiết về các mẫu đƣợc nêu ở bảng 2.1, 2.2; Các giá trị Rev trong bảng lần lƣợt là các giá trị

Rev xác định lặp lại lần 1/2/3. ĐKTN: Nhƣ ở mục 3.3.

- Độ đúng của phương pháp phân tích tanshinone I, cryptotanshinone và

tanshinone IIA:

Theo cách tƣơng tự trên, độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với

tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA cũng đƣợc kiểm tra bằng cách

phân tích mẫu thực tế đƣợc thêm chuẩn – thêm 3 mức (cỡ ½, tƣơng đƣơng và gấp

đôi so với nồng độ chất trong mẫu thực tế), rồi tính Rev và Rev trung bình đối với

83

Hà Giang 99/98/98 99/98/100 98/99/101 98 - 101

cả 3 mức. Kết quả ở bảng 3.16 cho thấy (các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục

C29, C30, C31), phƣơng pháp cũng đạt đƣợc độ đúng tốt đối với cả 3 chất

tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong tất cả các mẫu với Rev trung

bình 96 – 104 %, thỏa mãn về độ đúng của một phƣơng pháp phân tích theo yêu cầu

cảu AOAC [88], [68], [105].

Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA(*)

Rev(%) Rev

trung Chất PT Mẫu Mức 1 Mức 2 Mức 3 bình

(%)

Sapa 100/98/103 102/98/103 103/100/97 97 - 103

Lâm Đồng 95/96/97 102/98/99 102/101/96 96 - 102

Hà Giang 96/98/97 102/100/98 98/102/97 96 - 102 Tanshinone I Mộc Châu 96/98/97 103/101/98 99/103/102 96 - 103

Quảng Tây 98/96/96 102/100/98 98/100/101 96 - 102

Mƣờng Lống 98/97/97 101/99/100 103/99/101 97 - 103

Sapa 97/100/97 102/97/100 98/102/97 97 - 102

Lâm Đồng 97/98/97 98/103/98 99/101/97 97 - 103

Hà Giang 96/103/98 99/103/99 97/101/97 96 - 103 Cryptotanshinone Mộc Châu 97/103/101 98/101/103 98/96/102 97 - 103

Quảng Tây 97/99/96 103/101/98 104/101/97 96 - 104

Mƣờng Lống 97/97/96 101/97/102 98/100/101 96 - 102

Sapa 98/97/98 102/97/98 100/102/100 97 - 102

Lâm Đồng 97/98/99 100/97/97 98/100/101 97 - 101

Hà Giang 98/96/99 101/97/101 101/99/102 97 - 102 Tanshinone IIA Mộc Châu 98/97/98 101/97/102 99/100/102 97 - 102

Quảng Tây 96/96/97 102/98/97 99/101/102 96 - 102

(*) Chi tiết về các mẫu đƣợc nêu ở bảng 2.2; Các giá trị Rev trong bảng lần lƣợt là các giá trị Rev

xác định lặp lại lần 1/2/3. ĐKTN: Nhƣ ở mục 3.3.

84

Mƣờng Lống 96/98/99 99/102/98 99/98/101 96 - 102

- Độ đúng của phương pháp phân tích eurycomanone:

Kết quả kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với

eurycomanone theo cách tƣơng tự nhƣ trên cho thấy, phƣơng pháp cũng đạt đƣợc

độ đúng tốt đối với eurycomanone trong tất cả các mẫu với Rev trung bình 97 – 102

% (bảng 3.15; các các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C32).

Cuối cùng, các kết quả kiểm tra độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS và

UPLC-DAD, và kiểm tra độ đúng của phƣơng pháp LC-MS/MS cho phép khẳng

định rằng, hoàn toàn có thể áp dụng chúng để phân tích đồng thời các HCTN hoặc

phân tích riêng eurycomanone trong các mẫu thực tế, bao gồm: các mẫu cây thuốc

(Diệp hạ châu, Đan Sâm, Mật Nhân) và các mẫu thực phẩm chức năng đƣợc bào

chế từ cây Diệp hạ châu. Mặt khác, các kết quả kiểm tra độ lặp và độ đúng cũng

cho phép khẳng định – các chất chuẩn điều chế đƣợc hoàn toàn có thể sử dụng

trong phân tích định tính và định lƣợng các HCTN quan tâm bằng phƣơng pháp

LC-MS/MS, UPLC-DAD và có thể cả cá phƣơng pháp phân tích khác.

3.5.1.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Có nhiều cách xác định giá trị LOD và LOQ. Ở đây chúng tôi tiến hành phân

tích mẫu thực ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số

lần phân tích lặp lại 3-4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to

noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đƣờng

nền. Nhiễu đƣờng nền đƣợc tính về hai phía của đƣờng nền và tốt nhất là tính nhiễu

lân cận hai bên của píc, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của píc tại

nửa chiều cao. LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần

nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng thƣờng lấy S/N =3.

Giới hạn định lƣợng (LOQ / Limit of Quantitation) là thông số thể hiện khả

năng định lƣợng của phƣơng pháp phân tích. LOQ đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất trên một đƣờng chuẩn tin cậy và nó đƣợc tính toán từ LOD [88]:

LOQ  (3 - 4)  LOD

Đối với cả 2 phƣơng pháp đó, phƣơng pháp đƣờng chuẩn đều đƣợc dùng để định lƣợng. Để xác định LOD của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với các chất phân tích, lựa chọn một mẫu ngẫu nhiên trong toàn bộ lô mẫu:

- Khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin: Chọn mẫu DHC-

VX (mẫu thực phẩm chức năng); và mẫu lá Diệp hạ châu (mẫu cây).

- Khi phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA:

85

Chọn mẫu Đan sâm Sapa (cây Đan Sâm thu hái ở Sapa);

- Khi phân tích eurycomanone: Chọn mẫu Mật nhân Bắc Giang (cây Mật

nhân thu hái ở Bắc Giang).

Các kết quả xác định LOD của phƣơng pháp LC-MS/MS đối với 06 chất

phân tích cho thấy phƣơng pháp đạt đƣợc LOD khá thấp (hay đạt đƣợc độ nhạy cao). Từ LOD, tính toán đƣợc LOQ.

- Đối với hypophyllanthin và phyllanthin: LOD tƣơng ứng là 0,1 và 0,15

ppb (ứng với các giá trị LOQ là 0,3 và 0,5 ppb) (bảng 3.17 và phụ lục B1, B2);

Bảng 3.17. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất hypophyllanthin, phyllanthin và eurycomanone

Hợp chất Nồng độ (ng/mL) S/N

hypophyllanthin 0,1 5/1,3

phyllanthin 0,15 200/50

eurycomanone 0,1 0,32/0,09

- Đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA: LOD tƣơng ứng là

0,39, 0,4 và 0,35 ppb (ứng với các giá trị LOQ là 1,3, 1,4 và 1,2 ppb) (bảng 3.18 và

phụ lục B3, B4, B5);

Bảng 3.18. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất tanshinone I,

cryptotanshinone và tanshinone IIA

Hợp chất Nồng độ (ng/mL) S/N

tanshinone I 0,39 95/20

cryptotanshinone 0,4 95/35

tanshinone IIA 0,35 90/22

- Đối với eurycomanone: LOD  0,1 ppb (ứng với LOQ  0,4 ppb) (bảng

3.17 và phụ lục B6).

Với các giá trị LOD và LOQ đó, phƣơng pháp LC-MS/MS hoàn toàn có thể

phân tích trực tiếp những hàm lƣợng/nồng độ cỡ  1 ppb trong mẫu hay nói cách

khác, phƣơng pháp cho phép phân tích những lƣợng vết (< ppm) chất phân tích

trong các mẫu khảo sát.

3.5.2. Hàm lƣợng các HCTN trong các mẫu thực tế Áp dụng phƣơng pháp LC-MS/MS để phân tích các HCTN trong các mẫu thực tế (mẫu cây thuốc và mẫu thực phẩm chức năng) quan tâm theo các quy trình phân tích đã xây dựng đƣợc (sử dụng các điều kiện thí nghiệm thích hợp đã tìm đƣợc): Xác định đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin (quy trình phân tích ở hình 3.15); Xác định đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA (quy trình phân tích ở hình 3.19); Xác định eurycomanone (quy trình phân tích ở

hình 3.20).

86

(i) Hàm lượng hypophyllanthin và phyllanthin trong cây Diệp hạ châu và

thực phẩm chức năng:

Kết quả ở bảng 3.19 cho thấy (sắc đồ đối với mẫu DHC-VX đƣợc nêu ở

hình 3.33):

- Đối với cây Diệp hạ châu: Hàm lƣợng hypophyllanthin dao động trong khoảng 0,0029 đến 0,2748 mg/g và phyllanthin dao động trong khoảng 0,0039 đến

0,0439 mg/g (phụ lục B7).

- Đối với các mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu: Hàm

lƣợng hypophyllanthin dao động trong khoảng 0,0599 đến 0,6602 mg/g và phyllanthin dao động trong khoảng 0,0805 đến 1,9056 mg/g (phụ lục B8). Đáng

tiếc rằng, hiện nay, trên nhãn các loại thực phẩm chức năng đó, không có thông tin

gì về hàm lƣợng HCTN hypophyllanthin và phyllanthin. Mặt khác, ở nƣớc ta hiện

nay, cũng chƣa có công bố nào về hàm lƣợng hypophyllanthin và phyllanthin

trong các loại thực phẩm chức năng đang lƣu hành trên thị trƣờng. Do vậy, theo

chủ quan của chúng tôi, các kết quả thu đƣợc ở dây có giá trị tham khảo tốt cho

ngành y-dƣợc ở nƣớc ta.

Bảng 3.19 cũng cho thấy, cả 2 phƣơng LC-MS/MS và UPLC-DAD đều cho

kết quả hàm lƣợng hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu nhƣ nhau. Điều

này cũng cho phép khẳng định rằng, mặc dù đạt đƣợc độ lặp lại kém hơn, nhƣng

phƣơng pháp UPLC-DAD vẫn đạt đƣợc độ đúng tốt khi so với phƣơng pháp LC-

MS/MS (nếu chấp nhận rằng, phƣơng pháp LC-MS/MS là phƣơng pháp chuẩn).

Nhƣ vậy, ngoài phƣơng pháp LC-MS/MS, có thể chọn phƣơng pháp UPLC-DAD

(phƣơng pháp có chi phí thiết bị rẻ hơn) để phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin trong các loại mẫu cây Diệp hạ châu và thực phẩm chức năng đƣợc

bào chế từ nó.

Phyllanthin

Hypophyllanthin

Hình 3.33. Sắc đồ của mẫu DHC-VX

87

Bảng 3.19. Hàm lƣợng (mg/g) hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu(*)

LC-MS/MS UPLC-DAD Mẫu Hypophyllanthin Phyllanthin Hypophyllanthin Phyllanthin

DHC-VX 0,1364 ± 0,0003 0,3249 ± 0,0005 0,135 ± 0,002 0,321 ± 0,009

DHC-DH 0,0607 ± 0,0002 0,1044 ± 0,0003 0,059 ± 0,001 0,096 ± 0,003

DHC-PNC 0,1197 ± 0,0012 0,4952 ± 0,0003 0,119 ± 0,001 0,420 ± 0,005

DHC-PV 0,3007 ± 0,0012 1,1547 ± 0,0006 0,299 ± 0,002 1,149 ± 0,012

DHC-DD5 0,0599 ± 0,0003 0,0805 ± 0,0009 0,059 ± 0,001 0,079 ± 0,002

DHC-KH 0,6602 ± 0,0008 1,9056 ± 0,0006 0,660 ± 0,001 1,901 ± 0,011

Lá 0,2748 ± 0,0004 0,0439 ± 0,0004 - -

Thân 0,0167 ± 0,0004 0,0051 ± 0,0003 - -

(*) Các kết quả trong bảng là trung bình số học (mg/g) ± độ lệch chuẩn (mg/g);

88

Rễ 0,0029 ± 0,0002 0,0039 ± 0,0002 - -

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Hình 3.34. Sắc đồ của mẫu lá Diệp hạ châu

(ii) Hàm lượng tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong

cây Đan Sâm:

Kết quả ở bảng 3.20 cho thấy (sắc đồ đối với mẫu DS-Sapa đƣợc nêu ở

hình 3.35):

- Đối với cây Đan sâm: Hàm lƣợng lƣợng tanshinone I dao động trong

khoảng 1,2717 đến 4,4286 mg/g; hàm lƣợng cryptotanshinone dao động trong

khoảng 2,8630 đến 8,1589 mg/g và hàm lƣợng tanshinone IIA dao động trong

khoảng 3,8278 đến 13,0252 mg/g khối lƣợng khô (ppm) (phụ lục B9). Các kết quả

cũng cho thấy rằng ở các vùng dƣợc liệu khác nhau, hàm lƣợng các chất cũng

khác nhau, trong đó dƣợc liệu ở Lâm Đồng hàm lƣợng các chất cao đồng đều

nhau. Dƣợc liệu Đan sâm ở vùng núi phía Bắc có chất lƣợng khá tốt. Do vậy, theo

chủ quan của chúng tôi, các kết quả thu đƣợc ở dây có giá trị tham khảo tốt cho

ngành y-dƣợc ở nƣớc ta.

Tanshinone I

Tanshinone IIA

Cryptotanshinone

Hình 3.35. Sắc đồ của mẫu Đan sâm ở Sapa

89

Bảng 3.20. Hàm lƣợng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone trong các mẫu cây Đan sâm(*)

LC-MS/MS UPLC-DAD Mẫu

Tanshinone I Tanshinone IIA Cryptotanshinone Tanshinone I Tanshinone IIA Cryptotanshinone

Sa Pa 2,4613 ± 0,0007 9,1889 ± 0,0002 4,6549 ± 0,0006 2,45 ± 0,01 9,18 ± 0,03 4,65 ± 0,02

Lâm Đồng 4,4286 ± 0,0009 9,8970 ± 0,0035 8,1589 ± 0,0006 4,43 ± 0,01 9,88 ± 0,03 8,14 ± 0,02

Hà Giang 3,5345 ± 0,0011 13,0252 ± 0,0004 5,2017 ± 0,0015 3,53 ± 0,02 12,99 ± 0,06 5,19 ± 0,03

Mộc Châu 2,8852 ± 0,0009 8,3844 ± 0,0006 4,1723 ± 0,0005 2,88 ± 0,03 8,39 ± 0,05 4,16 ± 0,02

Quảng Tây 1,5559 ± 0,0013 4,7958 ± 0,0007 2,8630 ± 0,0008 1,56 ± 0,02 4,78 ± 0,03 2,85 ± 0,01

Mƣờng Lống 1,2717 ± 0,0013 3,8278 ± 0,0003 1,26 ± 0,02 3,81 ± 0,03 3,88 ± 0,03

90

3,8956 ± 0,0012 (*) Các kết quả trong bảng là trung bình số học (mg/g) ± độ lệch chuẩn (mg/g);

Bảng 3.20 cũng cho thấy, cả 2 phƣơng LC-MS/MS và UPLC-DAD đều cho

kết quả hàm lƣợng lƣợng tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong

các mẫu nhƣ nhau. Điều này cũng cho phép khẳng định rằng, mặc dù đạt đƣợc độ

lặp lại kém hơn, nhƣng phƣơng pháp UPLC-DAD vẫn đạt đƣợc độ đúng tốt khi so

với phƣơng pháp LC-MS/MS (nếu chấp nhận rằng, phƣơng pháp LC-MS/MS là

phƣơng pháp chuẩn). Nhƣ vậy, ngoài phƣơng pháp LC-MS/MS, có thể chọn

phƣơng pháp UPLC-DAD (phƣơng pháp có chi phí thiết bị rẻ hơn) để phân tích

đồng thời những tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong mẫu Đan

sâm và các thực phẩm chức năng, thuốc bào chế từ cây Đan sâm.

(iii) Hàm lượng eurycomanone trong cây Mật nhân:

Kết quả ở bảng 3.21 cho thấy (sắc đồ đối với Mật nhân đƣợc nêu ở hình

3.36 ) đối với cây Mật nhân hàm lƣợng eurycomanone dao động trong khoảng

tôi, các kết quả thu đƣợc ở đây có giá trị tham khảo tốt cho ngành y-dƣợc ở nƣớc

ta.

0,1716 – 3,1336 mg/g khối lƣợng khô (phụ lục B10). Theo chủ quan của chúng

Bảng 3.21. Hàm lƣợng (mg/g) eurycomanone trong cây Mật nhân ở các địa phƣơng khác nhau(*)

Vũng Tàu Đắk Nông Hòa Bình Nghệ An Bắc Giang Hà Giang Mẫu

(*) Các kết quả trong bảng là trung bình số học (mg/g) ± độ lệch chuẩn (mg/g);

Eurycomanone

Eurycomanone

(b)

(a)

1,8533 ± 0,1716 ± 0,8015 ± 0,2739 ± 3,1336 ± 0,9291 ± C 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0005 0,0001

Hình 3.36. Sắc đồ của (a) mẫu Mật nhân ở Hà Giang; (b) mẫu Mật nhân ở Bắc Giang

91

3.6. CÁC HỢP CHẤT ACETOGENIN CHIẾT TÁCH TỪ LÁ CÂY MÃNG

CẦU XIÊM

Cây mãng cầu xiêm (Annona muricata) – một loài cây có mặt ở nhiều quốc

gia trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam – đã đƣợc thừa nhận là chứa nhiều HCTN có

giá trị, trong đó đáng quan tâm nhất là nhóm các hợp chất acetogenin, đƣợc ghi

nhận là có khả năng chống ung thƣ [89], [98]. Song, do nhóm hợp chất đó vừa có số

lƣợng phong phú lại có cấu trúc tƣơng tự nhau, giống các chất béo, nên rất khó chiết

tách/phân lập riêng và xác định cấu trúc của chúng. Một vài nghiên cứu trên thế giới

đã tập trung nghiên cứu chiết tách nhóm các hợp chất đó và phân tích cấu trúc các

chất trong nhóm [98], [59]. Ở nƣớc ta, chƣa có nhiều nghiên cứu theo hƣớng này.

Ngƣời ta cho rằng, để kết hợp đồng thời – chiết tách, phân tích cấu trúc và định tính

nhóm các hợp chất acetogenin rất khó khi sử dụng các phƣơng pháp nhƣ HPLC-

UV, LC-MS… – Và vì vậy cần thiết phải sử dụng các phƣơng pháp phân tích hiện

đại kết hợp nhƣ qNMR, HRMS… [46], [90].

Để góp phần cung cấp thông tin về các HCTN - nhóm các hợp chất

acetogenin - chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm (thu hái ở Nghệ An) và phân tích

cấu trúc của chúng, nghiên cứu này sẽ sử dụng phƣơng pháp phân tích hiện đại

qNMR kết hợp với HPLC-PDA-HRMS (sắc ký lỏng ghép nối với detector mảng

diot quang và khối phổ phân giải cao) để phân tích cấu trúc và định tính các hợp

chất acetogenin trong dịch chiết phân đoạn từ là cây Mãng cầu xiêm.

92

100 mL EtOH

Cao chiết

Bột lá Mãng cầu xiêm

(25 g)

Trích ly một bậc gián đoạn; Lọc; Cô loại dung môi.

Trích ly nhiều bậc, ngƣợc chiều để loại béo và lipid; lọc; Cô loại dung môi.

Mẫu dạng siro

Phân bố vào nƣớc; chiết lỏng lỏng lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (hexan, cloroform, etyl axetat, butanol); Lọc; Cô loại dung môi thu dc cao chiết tƣơng ứng.

AMF-3

AMF-3

AMF-1

AMF-4

qNMR

- 400 MHz; - Thời gian quét là 10 lần trong 7 phút; - Chiều rộng phổ là 6002,4 Hz;

- Chiều rộng của xung là 6,3 ms; - Tín hiệu đặc trƣng trên phổ 1H-NMR tại (δH 8,66).

Chọn mẫu chứa tín hiệu của các acetogenin để phân tích tiếp.

HPLC-PDA-HRMS

- Cột RP-18 (250 mm x 4,6 mm, 5 micron); - Nhiệt độ cột ở 300C; - Pha động MeOH:H2O 90:10 (v/v); - Tốc độ dòng là 1,0 ml/phút - Bƣớc sóng phát hiện tại 220 nm; - Phổ khối lƣợng MALDI-TOF HRMS.

Định tính dựa vào thời gian lƣu và các mảnh phổ phân tử phân giải cao

định

Phân tích lƣợng bằng qNMR

- Pha dãy các nồng độ chất chuẩn annonacin (4-OH acetogenin) và squamocin (không chứa 4-OH acetogenin); - Xây dựng đƣờng thêm chuẩn; - Phân tích mẫu thực; - Xử lý kết quả.

Hình 3.37. Quy trình phân tích định tính, định lƣợng các hợp chất

acetogenin từ dịch chiết của cây Mãng cầu xiêm

93

Sử dụng quy trình chiết phân đoạn lá cây Mãng cầu xiêm bằng các dung môi

khác nhau (nhƣ nêu ở hình 3.37): Trƣớc hết, chiết bằng ethanol (chiết lỏng – rắn có

trợ giúp của siêu âm); Tiếp theo chiết phần cao ethanol theo kiểu chiết phân đoạn

lần lƣợt bằng các dung môi khác nhau (n-hexane, ethylacetate, chlorofoorm và

butanol), thu đƣợc các phân đoạn (ở dạng cao chiết) tƣơng ứng là AMF1, AMF2,

AMF3 và AMF4. Tiếp theo, hòa tan mỗi phần cao đó vào dung môi CD3OD và đƣa

vào hệ thiết bị qNMR để nhận biết phần cao nào chứa nhiều nhóm acetogenin, dựa

vào các tín hiệu đặc trƣng của phổ qNMR. Từ kết quả này, đã xác định đƣợc - phân

đoạn cao chiết AMF3 là phân đoạn chứa nhiều (hay giàu) acetogenin nhất. Tiếp

theo, phân đoạn này đƣợc hòa tan vào dung môi MeOH và đƣa vào hệ thiết bị

HPLC-PDA-HRMS để phân tích định tính các hợp chất acetogenin, dựa vào các đặc

trƣng phổ khối phân giải cao của chúng.

3.6.1. Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin

Kết quả phân tích phân đoạn AMF3 bằng phƣơng pháp qNMR (1H-NMR

500 MHz trong dung môi CDCl3) cho thấy (hình 3.38, phụ lục B11, B12, B13): Tín

hiệu tại độ dịch chuyển hóa học δH  0,85 và 1,2 - 1,6 là ứng với một nhóm methyl

cuối mạch và các nhóm methylene trong chuỗi dài; Tín hiệu của vòng (lacton) α, β

và γ chƣa bão hòa xuất hiện tại δH  6,96/7,17 (1H, H-33/35) và 5,09/5,10 (1H, H-

34/36); Đồng thời, cũng xuất hiện tín hiệu của vòng mono-THF ứng với hai nhóm

hydroxyl nằm bên sƣờn tại δH  3,76/3,81 và 3,37/3,44. Các tín hiệu trên là đặc

trƣng cho nhóm acetogenin và chúng cũng phù hợp với kết quả đã đƣợc công bố ở

[46], [59], [90].

Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz trong dung môi CDCl3) đối với

các phân đoạn AMF-1, AMF-2 và AMF-4 cho thấy, không xuất hiện các tín hiệu

đặc trƣng của nhóm acetogenin và nhƣ vậy, các phân đoạn đó chủ yếu giàu các axit béo (phổ 1H-NMR của các phân đoạn AMF-1, AMF-2 và AMF-4 không đƣa ra ở

đây). Điều này cũng chứng tỏ rằng, quy trình chiết phân đoạn nói trên đã cho phép

thu đƣợc phân đoạn AMF3 (cao ethylacetate) giàu acetogenin.

94

Hình 3.38. Phổ 1H-NMR của phân đoạn AMF-3 trong dung môi CDCl3.

3.6.2. Định tính các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3

Kết quả phân tích qNMR đã cho phép khẳng định rằng, phân đoạn AMF3 là

phân đoạn giàu các hợp chất acetogenin. Song, vấn đề đặt là phân đoạn đó chứa chủ

yếu những acetogenin nào. Để trả lời điều này, phân đoạn AFM3 (hòa tan trong

dung môi MeOH) đƣợc đƣa vào phân tích trên hệ thống thiết bị HPLC-PDA-HRMS

(detector HRMS kiểu MALDI-TOF) với các điều kiện thí nghiệm thích hợp đƣợc

tham khảo từ các công bố trƣớc đây [46], [90]. Các kết quả thu đƣợc ở các hình

3.31 - 3.34 cho thấy, trên sắc đồ xuất hiện các pic ở các thời gian lƣu (tR) lần lƣợt là

12,19; 12,86; 18,94; 20,40; 23,28; 24,38 và 25,19 phút.

Tiếp theo, các phần chất ứng với các pic đó đƣợc tự động đƣa vào bộ phận

MADLI-TOF-HRMS, sẽ thu đƣợc các phổ khối phân giải cao tƣơng ứng. Từ các

phổ này, chọn ra các phổ có các mảnh đặc trƣng để nhận biết các hợp chất

acetogenin có mặt trong phân đoạn AMF-3 (hình 3.39, 3.40 và phụ lục B14, B15).

Từ các mảnh đặc trƣng có tỷ số (m/z) trong khoảng 100-1000 trên phổ

MADLI-TOF-HRMS, xác định đƣợc các hợp chất acetogenin chính trong phân

đoạn AMF3 (chiết tách từ lá của cây Mãng cầu xiêm). Việc nhận biết (hay định

95

tính) các hợp chất nhóm acetogenin là dựa vào thƣ viện phổ (cài đặt sẵn trong máy)

và kết hợp so sánh với các công bố trƣớc đây [46], [59], [89], [90]. Các chất chính

trong nhóm acetogenin trong phân đoạn AMF3 gồm các chất: Annonacin (m/z 

597,47); cis-annomonacin (m/z, 625,50); annocatacin A (m/z 579,46); Cohibin A

(m/z, 549,48); cis-corossolone (m/z, 579,46); muricin A (m/z, 597,47); muricin B

(m/z, 597,47); muricin C (m/z, 597,47); muricin D (m/z, 569,44), muricin E (m/z,

569,44), muricin F (m/z, 595,46), muricin G (m/z, 595,46).

Hình 3.39. Sắc đồ HPLC-PDA đối với phân đoạn AMF-3.

96

Hình 3.40. Phổ MALDI-TOF-HRMS của các hợp chất acetogenin trong phân đoạn

AMF-3

3.6.3. Định lƣợng các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3

Do rất khó tách riêng từng chất thuộc nhóm acetogenin, nên thông thƣờng

ngƣời ta chỉ định lƣợng tổng các chất chứa 4-OH và tổng các chất không chứa 4-

OH trong nhóm các hợp chất acetogenin.

Sử dụng phƣơng pháp qNMR với các điều kiện: tần số sóng 400 MHz, thời

gian quét - 10 lần trong 7 phút, bề rộng phổ 6002,4 Hz và bề rộng xung 6,3 ms, để

định lƣợng tổng các chất chứa 4-OH và tổng các chất không chứa 4-OH (non-4-

OH) trong phân đoạn AMF3 (chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm). Để định lƣợng,

sử dụng chất chuẩn tƣơng ứng là dung dịch chuẩn hồn hợp annonacin 4-OH (viết tắt

là annonacin) và squamocin non-4-OH (viết tắt là squamocin) đƣợc pha trong dung

môi chloroform-D1. Tiến hành định lƣợng annonacin và squamocin trong 10 mg

mẫu (10 mg phân đoạn AMF3 hòa tan trong 0,6 mL chloroform-D1) theo phƣơng

pháp thêm chuẩn. Tín hiệu đo hay diện tích pic (để thiết lập đƣờng thêm chuẩn)

đƣợc chọn ở độ dịch chuyển hóa học δH  8,66. Phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn và

LOD, LOQ của phƣơng pháp phân tích đƣợc nêu ở bảng 3.22.

97

Bảng 3.22. Phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn và LOD, LOQ của phƣơng pháp phân tích (*)

Chất phân

Phƣơng trình đƣờng

LOD

LOQ

R2

tích

thêm chuẩn

(mg/mL)

(mg/mL)

Annonacin

y= 3,4705x + 1,1743

0,9925

0,05

0,14

Squamocin

y= 3,575x + 0,209

0,9997

0,06

0,17

(*) y và x: Tƣơng ứng là tín hiệu đo trên trục tung (diện tích pic) và nồng độ chất phân tích;

LOD (giới hiện phát hiện của phƣơng pháp phân tích) ở đây đƣợc xác định dựa vào hồi

quy tuyến tính, tức là LOD  3Sy/b; Trong đó, Sy và b tƣơng ứng là sai số chuẩn của tín

Kết quả phân tích cho thấy: Hàm lƣợng của tổng các chất chứa 4-OH trong

mẫu (10 mg phân đoạn AMF3) là 2,88 mg và tổng các chất không chứa 4-OH là

1,77 mg. Nhƣ vậy, tổng hàm lƣợng các hoạt chất nhóm acetogenin có HTSH trong

mẫu là 46%.

Cuối cùng, cũng cần thấy rằng, tuy các kết quả thu đƣợc ở trên chỉ là đối với

một mẫu lá cây Mãng cầu xiêm (thu hái ở Nghệ An), nên tính đại diện còn hạn chế.

Song, nghiên cứu này đã góp phần cung cấp những thông tin ban đầu về các HCTN

nhóm acetogenin chiết tách đƣợc từ lá cây Mãng cầu xiêm ở nƣớc ta và là tiền đề

cho các nghiên cứu tiếp theo. Mặt khác, nghiên cứu này cũng cho phép khẳng định

rằng, việc sử dụng hệ thống thiết bị kết hợp qNMR và HPLC-PDA-HRMS là cần

thiết khi cần định tính và định lƣợng những hỗn hợp chất phức tạp, có đặc tính hóa

– lý tƣơng tự nhau nhƣ nhóm các hợp chất acetogenin.

hiệu đo trên trục tung và độ dốc của đƣờng hồi quy tuyến tính [88].

3.7. HÀM LƢỢNG TINH DẦU CHIẾT TÁCH TỪ CÂY RIỀNG ĐUÔI NHỌN

Để mở rộng danh sách các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học (viết tắt

là HCTN) có nguồn gốc thảo dƣợc nhằm đa dạng hóa khả năng ứng dụng chúng cho

các lĩnh vực khác nhau, các nhà khoa học đã và đang nỗ lực tìm kiếm các loài cây

mới chứa các HCTN có giá trị. Gần đây, cây Riềng đuôi nhọn (A. macroura), thuộc

chi Riềng (Alpinia), họ Gừng (Zingiberaceae) lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở vƣờn

quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An [14]. Những nghiên cứu về các loài cây cùng họ

nhƣ tinh dầu cây A. calcarata có khả năng chống oxy hóa gốc tự do trong kháng

nấm trên cây trồng [42], [43]. Tinh dầu quả của loài A. maclurei có khả năng kháng

98

lại tụ cầu khuẩn [113]. Từ tinh dầu rễ của loài A. pinnaensis ở Việt Nam đƣợc Văn

Ngọc Hƣớng và cộng sự công bố có khả năng kháng vi sinh vật kiểm định [33]...

Theo logic, cây Riềng đuôi nhọn cũng sẽ có những đặc điểm tƣơng tự. Song, cho

đến nay, ở nƣớc ta chƣa có nghiên cứu chi tiết nào về loài cây này. Mặt khác, đối

với các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi nhƣ tinh dầu và các chất có mặt trong tinh dầu

(mono-terpen, sesquiterpen…), để tách, định tính và định lƣợng chúng, phƣơng

pháp GC-MS (sắc ký khí ghép nối detector khối phổ) đƣợc xem là lựa chọn thích

hợp nhất.

Để đóng góp tích cực vào những nghiên cứu chiết tách và định tính, định

lƣợng các HCTN trong các loài thảo dƣợc quý ở nƣớc ta, nghiên cứu này tập trung

vào định tính và bán định lƣợng các HCTN có mặt trong các bộ phận của cây Riềng

đuôi nhọn (rễ, thân, lá, hoa, quả). Mẫu cây đại diện đƣợc thu hái ở vƣờn quốc gia

Pù Mát, tỉnh Nghệ An và chi tiết đƣợc nêu ở hình 2.2. Để chiết tách tinh dầu từ các

bộ phận của cây, kỹ thuật chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc – một trong những kỹ thuật

phổ biến chuyên dùng để chiết tách tinh dầu – cũng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

này.

Mẫu tinh dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn, sau khi loại bỏ nƣớc, đƣợc làm khô bằng Na2SO4 và bảo quản ở nhiệt độ 0 – 4 oC và đây đƣợc

xem là mẫu đầu cho phân tích. Lấy ra 0,5 L mẫu, hòa tan trong 0,5 mL n-hexane,

rồi tiêm 1 L dung dịch đó vào hệ thống thiết bị GC-MS với các điều kiện thí

nghiệm lựa chọn nhƣ đã nêu ở hình 3.41. Định tính các chất trong mẫu dựa vào thƣ

viện phổ đã đƣợc cài đặt sẵn trong thiết bị. Bán định lƣợng dựa vào phần trăm (%)

diện tích pic của chất phân tích so với tổng diện tích của tất cả các pic. Tiến hành

phân tích bằng GC-MS lặp lại 3 lần, rồi lấy giá trị trung bình.

Kết quả xác định tính chất cảm quan, thành phần hóa học (định tính) và hàm

lƣợng các chất (hay cấu tử) trong tinh dầu ở các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn

đƣợc nêu ở Bảng 3.23 cho thấy:

- Tinh dầu thu đƣợc từ các bộ phận của cây có màu vàng nhạt, nhẹ hơn nƣớc,

mùi thơm nhẹ và dễ chịu;

- Hàm lƣợng tinh dầu trong các bộ phân của cây (theo thứ tự tăng dần): thân

99

(0,15 %) < quả (0,18 %) < lá (0,21 %) < rễ (0,24 %) < hoa (0,30 % tính theo khối

lƣợng tƣơi).

lôi

Loại nƣớc bằng Na2SO4; Ly tâm

Chƣng cất cuốn hơi nƣớc

Tinh dầu tinh

Tinh dầu thô

Mẫu tƣơi (2-3 kg)

0,1µL pha trong 0,5 mL hexan

Mẫu phân tích

Tiêm 1µL

GC-MS

- GC-MS 6890N; -Cột sắc ký HP-5MS với chiều dài 30 m, đƣờng kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25 m - Khí mang H2; - Nhiệt độ buồng bơm mẫu 250 oC; - Nhiệt độ detectơ 260 oC; - Chƣơng trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: 60 oC (2 phút), tăng 4oC/phút cho đến 220 oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút.

Kết quả

- Định tính dựa vào các chỉ số RI (Retention Indices), và thƣ viện phổ có sẵn (NIST-08, NIST-17, NIST-18 và Wiley 9th Version); - Bán định lƣợng dựa vào % các diện tích hoặc chiều cao của píc so với tổng diện tích hoặc chiều cao tổng các pic.

Hình 3.41. Quy trình phân tích định tính, bán định lƣợng các hợp chất trong tinh

dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn

- Thành phần tinh dầu thu đƣợc từ thân chứa 32 cấu tử (chiếm 93,6 % tổng

hàm lƣợng tinh dầu). Trong đó, chứa nhiều nhất là các hợp chất (nhóm)

monoterpene hydrocarbon (71,9 %), tiếp theo là các dẫn xuất chứa oxy của

monoterpene (13,6 %); Thành các cấu tử (theo thứ tự hàm lƣợng giảm dần) nhƣ sau:

γ-terpinene (16,9 %) > β-pinene (16,4 %) > 1,8-cineole (11,2 %) > α-terpinene (9,4

%) > α-Pinene (8,4 %) > α-phellandrene (5,9 %); Các cấu tử còn lại có hàm lƣợng <

5 %;

- Tinh dầu thu đƣợc từ quả chứa 42 cấu tử (chiếm 93,5% tổng hàm lƣợng tinh

dầu) và cũng chứa nhiều nhất là nhóm monoterpene hydrocarbon (35,9 %), tiếp theo

là nhóm sesquiterpene hydrocarbon (30,5 %) và các dẫn xuất chứa oxy của

monoterpenes (18,0%); Trong đó, các cấu tử chính là β- caryophyllene (18,1%) > β-

100

pinene (11,1 %) và 1,8- cineole (11,1 %) > caryophyllene oxide (7,1 %) > γ-

terpinene (5,9 %), α-pinene (5,8 %) > bornyl acetate (5,0%). Các cấu tử còn lại có

hàm lƣợng < 5 %;

- Tinh dầu thu đƣợc từ lá cây chứa 33 cấu tử (chiếm 95,2% tổng hàm lƣợng

tinh dầu), gồm các cấu tử (xếp theo thứ tự giảm dần) nhƣ sau: linalool (25,6%) > δ-

cadinen (20,4%); Các cấu tử khác có hàm lƣợng nhỏ hơn 5 %;

- Thành phần tinh dầu thu đƣợc từ rễ chứa 46 cấu tử (chiếm 92,0 % tổng hàm

lƣợng tinh dầu). Trong đó, chứa nhiều nhất là nhóm monoterpene hydrocarbon

(56,3 %) > các dẫn xuất chứa oxy của monoterpene (21,7 %) > các sesquiterpene

hydrocarbon (10,7 %); Thành phần các cấu tử (theo thứ tự hàm lƣợng giảm dần)

nhƣ sau: γ-terpinene (13,9 %) > β- pinene (12,5 %) > 1,8-cineole (8,7 %) > α-

terpinene (8,5 %) > fenchyl acetate (7,8 %) > α-pinene (6,5%); Các cấu tử còn lại

có hàm lƣợng < 5 %;

- Thành phần tinh dầu thu đƣợc từ hoa chứa 16 cấu tử (chiếm 97,7% tổng hàm

lƣợng tinh dầu), trong đó chứa nhiều nhất vẫn là nhóm monoterpene hydrocarbon

(44,8 %), tiếp theo là các dẫn xuất chứa oxy của monoterpene (22,9 %) và

sesquiterpene hydrocarbon (18,2 %); Trong đó, các cấu tử chính là β- caryophyllene

(12,6 %) > sabinene (9,0 %) > β-pinene (8,8 %) > γ-terpinene (7,9 %) > bornyl

acetate (7,2%). Các cấu tử còn lại có hàm lƣợng < 5 %;

Kết quả trên cho thấy, trong tinh dầu thu đƣợc, thành phần các cấu tử trong các bộ

phận của cây Riềng đuôi nhọn tuy có khác nhau, nhƣng có đặc điểm chung - chứa

nhiều nhất là nhóm monoterpene hydrocarbon với hàm lƣợng dao động trong

khoảng rộng 35,9 – 71,9 %, tiếp theo là nhóm dẫn xuất chứa oxy của monoterpene

(13,6 – 27,2 %) và nhóm sespuiterpene hydrocabon (5,4 – 30,5 %); Các nhóm còn

lại có hàm lƣợng < 10 %.

Tuy các kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu này mới chỉ trên một đối tƣợng

mẫu (cây Riềng đuôi nhọn ở Vƣờn quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An), nhƣng là

những thông tin đầu tiên ở nƣớc ta về hàm lƣợng tinh dầu, thành phần hóa học và

bán định lƣợng của các cấu tử trong tinh dầu chiết tách từ các bộ phận khác nhau

của cây. Những thông tin thu đƣợc cũng là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về

101

tinh dầu trong loài thảo dƣợc có giá trị này.

Bảng 3.23. Hàm lƣợng (%) các cấu tử và các nhóm hợp chất có mặt trong tinh dầu chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn(*)

Hợp chất RI* MI Lá Thân Rễ Quả Hoa RI

α-Thujene 930 921 f 2,0 1,6 1,9 0,4 0,6

α-Pinene 939 932 g 8,4 7,8 6,5 5,8 4,5

Camphene 953 946 f 2,1 1,2 2,9 1,3 0,8

Sabinene 976 969 g - - - - 9,0

β-Pinene 980 976 g 11,4 16,4 12,5 11,1 8,8

β-Myrcene 990 988 g 1,6 1,3 1,4 1,3 1,1

α-Phellandrene 1006 1004 g 5,9 8,5 1,9 3,7 1,5

δ-3-Carene 1011 1008 f - - 0,2 - -

α-Terpinene 1017 1014 g 9,4 6,4 8,5 3,2 4,7

o-Cymene 1024 1022 f 3,8 4,5 2,1 1,2 0,6

β-Phellandrene 1028 f - - - - 3,4

1,8-Cineole 1034 1032 17,7 11,2 g 8,7 11,1 5,5

(E)-β-Ocimene 1052 1044 0,6 1,0 f 0,7 0,6 0,6

γ-Terpinene 1061 1054 13,3 16,9 13,9 f 5,9 7,9

cis-Sabinene hydrate 1073 1065 f - 0,1 - - -

α-Terpinolene 1090 1089 f 4,4 3,3 3,7 1,4 1,3

Linalool 1100 1095 f 0,3 1,6 0,4 - 0,5

Nonanal 1106 1100 f - - - 0,3 -

Fenchyl alcohol 1120 1118 f - 0,1 0,1 - -

allo-Ocimene 1128 1128 f - - 0,1 - -

Camphor 1145 1141 f - 0,1 0,2 0,1 0,3

Borneol 1167 1167 f 0,1 0,5 0,5 0,1 -

Terpinen-4-ol 1177 1177 f 1,1 5,9 2,3 0,6 4,4

α-Terpineol 1189 1187 f 0,1 0,7 0,2 0,3 1,5

Myrtenal 1207 1195 f - - 0,1 - -

trans-Piperitol 1209 1207 f - 0,2 - - -

102

Fenchyl acetate 1222 1229 f 0,1 - 0,3 7,8 0,3

Hợp chất RI RI* MI Lá Thân Rễ Quả Hoa

4-Phenyl-2-butanol 1241 1243 2,2 f - - - -

Geraniol 1253 1249 f - - 0,4 0,3 3,5

Bornyl acetate 1289 1287 0,2 0,3 g 1,0 5,0 7,2

Bicycloelemene 1327 1337 f - - 0,5 - 1,5

Neryl acetate 1362 1359 f - - - 0,1 -

α-Copaene 1377 1374 0,1 0,2 0,7 f 0,2 0,5

Geranyl acetate 1381 1379 f - - - 0,1 -

β-Elemene 1391 1389 f 1,7 1,3 0,8 3,4 0,7

α-Gurjunene 1412 1409 f 1,1 1,0 1,5 1,2 -

β-Caryophyllene 1419 1417 g 18,6 12,6 1,4 2,4 2,3

Widdrene 1431 1432 f - - - - 0,7

γ-Elemene 1437 1434 f 0,1 0,4 0,3 - 3,6

α-Guaiene 1440 1437 f 0,4 - - - 1,8

Aromadendrene 1441 1439 f 0,2 - 0,1 0,3 0,6

α-Humulene 1454 1452 f 0,2 0,5 0,8 3,1 1,0

- - 0,4 - - Selina-4(15),7(11)-diene 1475 1470 g

γ-Gurjunene 1477 1475 f - - - 0,1 1,0

γ-Muurolene 1480 1478 f - - - 0,2 -

Germacrene D 1485 1484 f 0,2 - 0,6 0,5 3,3

α-Amorphene 1485 1485 f - - 0,2 0,2 -

β-Selinene 1486 1488 f 0,4 - 0,6 1,1 -

α -Selinene f 0,7 - - - 1493 1498 0,3

Bicyclogermacrene 1500 1500 g - - 0,9 0,7 0,9

α-Muurolene 1500 1500 f - - 0,1 - -

β-Bisabolene 1506 1505 f - - 0,1 - -

(E,E)-α-Farnesene 1508 1507 g - - - 0,1 -

δ-Cadinene 1525 1522 f 0,2 0,4 0,7 0,5 -

(E)-Nerolidol 1563 1561 f 0,2 0,3 0,8 0,3 -

Spathulenol 1578 1577 f - - 0,3 - 0,7

103

g 0,6 7,1 0,7 Caryophyllene oxide 1583 1581 0,3 0,4

Hợp chất RI RI* MI Lá Thân Rễ Quả Hoa

1646 1640 f - - 1,0 - - τ-Muurolol

1654 1652 f - 0,2 - 0,8 - α-Cadinol

1718 1722 f - - 0,4 0,5 0,4 (E,E)-Farnesol

2125 2119 g - - 0,2 0,1 - Phytol

Tổng cộng 95,2 93,6 92,0 93,5 97,7

Các hợp chất monoterpen 59,9 71,9 56,3 35,9 44,8

Các dẫn xuất chứa oxy của monoterpen 27,2 13,6 21,7 18,0 22,9

5,4 7,2 10,7 30,5 28,2 Các hợp chất sesquiterpen

0,5 0,9 3,1 8,7 1,8 Các dẫn xuất chứa oxy của sesquiterpen

- - 0,2 0,1 - Các hợp chất diterpen

(*) Các chất (cấu tử) trong bảng đƣợc liệt kê theo thứ tự rửa giải ra khỏi cột sắc ký HP- 5MS; RI: Chỉ số lƣu (retention indices) trên cột sắc ký HP-5MS; RI*: Chỉ số lƣu tham khảo (có sẵn trong hệ thiết bị); MI (mode of identification): Kiểu định danh/định tính

2,2 - - 0,3 - Các hợp chất khác

(nhận biết); f: Kiểu định danh dựa vào phổ khối và chỉ số lƣu trên cột sắc ký; g: Kiểu định danh dựa vào phổ khối, chỉ số lƣu trên cột sắc ký và chất đi kèm (authentic compound)

104

đƣợc tiềm vào cột cùng với mẫu; Dấu gạch ngang (-) là không có thông tin.

KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu đƣợc, luận án đi đến những kết luận chính sau:

1) Trên cơ sở khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố đến quá trình tách bằng các

phƣơng pháp khác nhau (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, sắc ký điều chế), đã tìm đƣợc

điều kiện thích hợp để phân lập các hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin từ cây

Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone

IIA từ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) và eurycomanone từ cây Mật nhân

(Eurycoma longifolia J.) với độ tinh khiết đạt đƣợc trên 95 % đối với mỗi chất. Cấu

trúc của các hợp chất đó đã đƣợc khẳng định qua các dữ liệu phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và phổ khối lƣợng (ESI-

MS).

2) Đã tìm đƣợc các điều kiện thích hợp cho phƣơng pháp sắc ký lỏng điều chế

để tinh chế 06 hợp chất trên và đạt đƣợc độ tinh khiết trên 99 % đối với mỗi chất và

do vậy, đã lần đầu tiên ở nƣớc ta đã tạo ra các hóa chất thỏa mãn điều kiện làm chất

chuẩn cho phân tích định tính và định lƣợng.

3) Đã xây dựng đƣợc quy trình phân tích đồng thời phyllanthin và

hypophyllanthin trong các mẫu cây Diệp hạ châu và thực phẩm chức năng đƣợc bào

chế từ cây đó; Xác định đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA

trong các mẫu cây Đan sâm và xác định eurycomanone trong cây Mật nhân bằng

phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD với các điều kiện thí nghiệm thích hợp và

sử dụng các chất chuẩn tạo ra đƣợc ở trên. Phƣơng pháp LC-MS/MS đạt đƣợc độ lặp

lại tốt đối với tất cả 06 chất với RSD < 2 % (n  3). Phƣơng pháp LC-MS/MS đạt

đƣợc độ đúng tốt với độ thu hồi trung bình 95 - 104 %, độ nhạy cao (hay LOD thấp, khoảng 0,1 - 0,5 ppb) và khoảng tuyến tính đủ rộng (0,005 – 50 ppm) với R2 > 0,999

và p < 0,001 đối với tất cả 06 chất. Phƣơng pháp UPLC-DAD tuy có độ lặp lại kém

hơn phƣơng pháp LC-MS/MS, nhƣng cũng có thể sử dụng để phân tích định lƣợng

06 chất với kết quả thu đƣợc không khác với phƣơng pháp LC-MS/MS (p > 0,05).

4) Sử dụng kỹ thuật chiết phân đoạn bằng các dung môi khác nhau, kết hợp

với hệ thống thiết bị phối hợp qNMR và HPLC-PDA-HRMS đã cho phép nhận biết

phân đoạn chiết etylacetate (AMF-3) từ cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata

105

(Soursop)) là phân đoạn giàu nhóm hợp chất acetogenin và đã phân tích định tính

các hợp chất (thuộc nhóm acetogenin) có hoạt tính sinh học trong phân đoạn đó.

Mặt khác, với phƣơng pháp qNMR đã định lƣợng tổng nhóm acetogenin chứa 4-OH

và tổng nhóm acetogenin khong chứa 4-OH. Tổng hàm lƣợng hai nhóm acetogenin

đó chiếm 46 % của phân đoạn AMF3.

5) Bằng kĩ thuật chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc kết hợp với phƣơng pháp khối

lƣợng, đã xác định đƣợc hàm lƣợng tinh dầu chiết tách từ các bộ phận (lá, thân, rễ,

hoa, quả) của cây Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K. Schum. Sử dụng phƣơng

pháp GC-MS, lần đầu tiên trên thế giới, đã định tính và bán định lƣợng các hợp chất

có mặt trong tinh dầu thu đƣợc từ các bộ phận của cây. Tuy thành phần các cấu tử

trong tinh dầu ở các bộ phận của cây khác nhau, nhƣng chiếm nhiều nhất là nhóm

monoterpene hydrocarbon với hàm lƣợng 35,9 – 71,9 %, tiếp theo là nhóm dẫn xuất

chứa oxy của monoterpene (13,6 – 27,2 %) và nhóm sespuiterpene hydrocabon (5,4

– 30,5 %); các nhóm còn lại có hàm lƣợng < 10 %. Các kết quả này là tiền đề tốt

cho các nghiên cứu tiếp theo về các hợp chất có hoạt tính sinh học có mặt trong loài

cây dƣợc liệu quý này.

106

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA

LUẬN ÁN

Tạp chí trong nước

1. Đoàn Mạnh Dũng, Đặng Thị Ngần, Nguyễn Thị Huệ, Lê Quốc Hùng, Nguyễn

Hữu Tùng, Nguyễn Đình Luyện, Trần Đình Thắng (2019), Phân lập và xác định

hàm lƣợng tanshinon I, cryptotanshinon, tanshinon IIA trong dƣợc liệu cây Đan

sâm (Salvia miltiorrhiza B.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC-DAD), Tạp chí

Khoa học và Công nghệ các trường Khoa học Kĩ thuật, 137, 100-105.

2. Đoàn Mạnh Dũng, Nguyễn Ngọc Tuấn, Hoàng Văn Trung, Nguyễn Hữu Tùng,

Nguyễn Đình Luyện (2019), Phân lập và xác định hàm lƣợng phyllanthin,

hypophyllanthin trong một số chế phẩm từ cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria

L.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC-DAD), Tạp chí Phân tích Hóa, Lý và

Sinh học, Tập 24, số 2, 37-42.

3. Đoàn Mạnh Dũng, Nguyễn Ngọc Tuấn, Hoàng Văn Trung, Nguyễn Hữu Tùng,

Nguyễn Đình Luyện, Trần Đình Thắng (2019), Xác định hàm lƣợng phyllanthin,

hypophyllanthin trong các mẫu thuốc từ cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L,)

bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS), Tạp chí Phân tích Hóa, Lý và

Sinh học, Tập 24, số 2, 140-146.

4. Đoàn Mạnh Dũng, Hoàng Văn Trung, Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Hữu Tùng

(2018), Phân lập và phân tích hàm lƣợng eurycomanone trong cây mật nhân

(Eurycoma longifolia) ở Việt Nam bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS –

Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, Tập 127, số 1B, 153-162.

5. Đoàn Mạnh Dũng, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Đình Luyện (2018), Phân tích

hàm lƣợng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus

urinaria L,) bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS), Tạp chí Khoa học

trường Đại học Khoa học – Đại học Huế, Tập 13, số 2, 13-24.

6. Nguyễn Huy Hùng, Đoàn Mạnh Dũng, Đinh Thị Trƣờng Giang, Yang - Chang

Wu, Trần Đình Thắng (2015), Định tính, định lƣợng và thử nghiệm hoạt tính sinh

học các Acetogenin của dịch chiết Etanol từ lá Mãng cầu xiêm (Annona muricata)

107

bằng phƣơng pháp HPLC-PDA, qNMR, MALDI-TOP MS, Tạp chí Hóa học,

53(6e1,2): 232-236.

Tạp chí Quốc tế

7. Le T. Huong, Do N. Dai, Mai V. Chung, Doan M. Dung & Isiaka A. Ogunwande

(2017), Constituents of essential oils from the leaf, stem, root, fruit and flower of

Alpinia macroura K. Schum, Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas

Medicinales y Aromáticas, 16(1), 26 - 33 (SCIE).

8. Đoàn Mạnh Dũng và cộng sự, Simultaneous quantitative analyses of tanshinone

IIA, cryptotanshinone, and tanshinone I in danshen (Salvia miltiorrhiza) cultivated

in Vietnam using LC-MS/MS, Indian Journal of Natural Products and Resources

(IJNPR), (Đang phản biện).

108

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

[1]. Bộ Khoa học và Công nghệ (2010), Nghiên cứu chiết tách, tinh chế một số

hợp chất tự nhiên đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẩn phục vụ kiểm

nghiệm dược liệu, Báo cáo kết quả nghiệm thu đề tài khoa học cấp nhà nƣớc.

[2]. Bộ Y tế (2006), Dược học cổ truyền, NXB Y học, Hà Nội.

[3]. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội.

[4]. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam II, NXB Y học, Hà Nội.

[5]. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội.

[6]. Chevallier A. (2012), Dược thảo toàn thư, NXB Tổng hợp thành phố Hồ Chí

Minh, Tp. Hồ Chí Minh.

[7]. Đỗ Huy Bích, Bùi Xuân Chƣơng, Đặng Quang Chung, Nguyễn Thƣợng

Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm

Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và

động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

[8]. Đỗ Ngọc Đài (2011), Tài nguyên cây thuốc họ Na (Annonaceae) ở Việt

Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 49(3A), pp. 39-52.

[9]. Đỗ Ngọc Đài, Trần Minh Hợi (2012), Tính đa dạng họ Na (Annonaceae) ở

Bắc Trung Bộ, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50(3B), pp. 254-263.

[10]. Đỗ Tất Lợi (2013), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức,

Hà Nội.

[11]. Do Thi Ha, Le Thị Loan, Nguyễn Minh Khởi, Tran Thi Phuong (2019), Xây

dựng phƣơng pháp định lƣợng tanshinon IIA trong dƣợc liệu đan sâm trồng ở

Việt Nam bằng HPLC-DAD, , Tạp chí dược liệu, 1, pp. 1.

[12]. Lã Đình Mỡi, Lƣu Đàm Cƣ, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị

Phƣơng Thảo, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2001), Tài nguyên thực vật

có tinh dầu ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

[13]. Lê Quốc Hùng, Nguyễn Vũ Minh, Khuất Bá Linh, Nguyễn Hữu Tùng,

Phƣơng Thiện Thƣơng (2018), Xây dựng quy trình định tính, định lƣợng

109

đồng thời tanshinone-I, tanshinone-IIA và cryptotanshone trong dƣợc liệu rễ

Đan sâm,, Tạp chí y học quân sự, 1, pp. 1.

[14]. Lê Thị Hƣơng (2015), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, thành phần hóa

học tinh dầu của một số loài trong chi Riềng (Alpinia Roxb.) và Sa nhân

(Amomum Roxb.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae Lindl.) ở Bắc Trung Bộ,

Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Hà Nội.

[15]. Lê Văn Truyền (2010), Một số vấn đề về chiến lƣợc nghiên cứu thuốc từ

dƣợc liệu, Tạp chí dược học, 413, pp. 2-4, 46-51.

[16]. Lữ Thị Kim Chi, Nguyen Ngoc Vinh (2012), Phân lập và thiết lập chất chuẩn

phyllanthin từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thon),

Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp HCM, 1, pp. 1.

[17]. Nguyễn Đức Hạnh, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Phạm Ngọc Thạc, Nguyễn Dân

Phúc, Nguyễn Phƣơng Nam (2020), Xây dựng và thẩm định quy trình định

lƣợng eurycomanon trong dƣợc liệu Mật nhân bằng phƣơng pháp HPLC-UV,

Tạp chí Dược liệu, 25(2), pp. 104 - 111.

[18]. Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Thanh Hải, Vũ Đức Lợi, Bùi Thanh Tùng,

Nguyễn Tiến Vững, Bùi Hồng Cƣờng (2016), Một số hợp chất phân lập từ rễ

cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào

Cai, Tạp chí Dược học, 56(4), pp. 43-47.

[19]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB

Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Tp. Hồ Chí Minh.

[20]. Nguyễn Quyết Tiến, Đặng Ngọc Quang, Trƣơng Thị Thanh Nga, Phạm Thị

Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Quảng An (2017), Giáo trình Hóa

học các hợp chất thiên nhiên, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà

Nội.

[21]. Nguyễn Quyết Tiến, Trƣơng Thị Thanh Nga, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn

Ngọc Tuấn, Nguyễn Quảng An ( 2017), Giáo trình Hóa học các hợp chất tự

nhiên, Hà Nội.

[22]. Nguyễn Tiến Bân (2000), Họ na (Annonaceae), Thực vật chí Việt Nam,

Flora of Vietnam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

110

[23]. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá

học cây thuốc, NXB Y học, Hà Nội.

[24]. Phạm Hoàng Hộ (1992), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Hà Nội.

[25]. Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách, NXB Bách

khoa Hà Nội, Hà Nội.

[26]. Phan Kế Lộc (2001), Thực vật bậc cao - Trong Danh lục các loài thực vật

Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

[27]. Phƣơng Thiện Thƣơng, Nguyễn Thị Kim An, Nguyễn Minh Khởi, Fumiaki

Ito (2013), Các tanshinon phân lập từ rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza

Bunge) di thực và trồng ở Việt Nam, Tạp chí Dược học, 53(1), pp. 44-47.

[28]. Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học. In: Thẩm

định phương pháp trong phân tích Hóa học và Vi sinh vật, Viện Kiểm

nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, Hà Nội.

[29]. Trần Đình Thắng (2016), Giáo trình Hợp chất Thiên nhiên, Nhà xuất bản

Đại học Vinh, Nghệ An.

[30]. Trần Thu Huyền, Chử Đức Thành, Vũ Tuấn Anh, Bùi Thị Bích Vân, Chử

Văn Mến (2018), Định lƣợng phyllanthin trong diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus L.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector

huỳnh quang, Tạp chí y dược học quân sự, 3, pp.

[31]. Trần Thu Huyền C. Đ. T., Vũ Tuấn Anh, Bùi Thị Bích Vân, Chử Văn Mến,

(2018), Định lƣợng phyllanthin trong diệp hạ châu đắng (Phyllanthus

amarus L.) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng detector huỳnh quang,

Tạp chí Y học Quân sự, 3, pp. 26-31.

[32]. Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2006), Bài giảng Dược liệu Tập I, Trƣờng

Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội.

[33]. Văn Ngọc Hƣớng, Vũ Minh Trang (2003), Thành phần hóa học và hoạt tính

kháng vi sinh vật của tinh dầu thân rễ Riềng pinnan (Alpinia pinnanensis

T.L. & Senjen), Tạp chí Dược học, 43(11), pp. 13-15.

111

[34]. Viện dƣợc liệu (2011), Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng

phyllanthin trong Diệp hạ châu và các sản phẩm có chứa Diệp hạ châu, Tạp

chí Dược liệu, 16, pp.

[35]. Viện Dƣợc liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB

Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

[36]. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội.

[37]. Abdullah F., Subramanian P., Ibrahim H., Abdul M. S., Lee G. S., Hong S.

L. (2015), Chemical composition, antifeedant, repellent, and toxicity

activities of the rhizomes of galangal, Alpinia galanga against Asian

subterranean termites, Coptotermes gestroi and Coptotermes curvignathus

(Isoptera: Rhinotermitidae), J. Insect Sci, 16(15), pp. 175.

[38]. Abeer F. A. R., Imad H. H., Mohanad J. K. (2017), A review: uses of gas

chromatography-mass spectrometry (GC-MS) technique for analysis of

bioactive natural compounds of some plants, International Journal of

Toxicological and Pharmacological Research, 9(1), pp. 81-85.

[39]. Albert K. (1995), On-line use of NMR detection in separation chemistry, J.

Chromatogr. A., 703(1-2), pp. 123-147.

[40]. Albert K. (2003), On-line LC-NMR and related techniques, John Wiley &

Sons.

[41]. AOAC International (1993), AOAC Peer-verified Methods Program: Manual

on Policies and Procedures, Association of Official Analytical Chemists.

[42]. Arambewela L. S. R., Arawwawala L. D. A. M., Athauda N. (2010),

Antioxidant and antifungal activities of essential oil of Alpinia calcarata

Roscoe rhizomes, Journal of Ayurveda integrative medicine, 1(3), pp. 199-

202.

[43]. Awang K., Ibrahim H., Rosmy S. D., Mohtar M., Mat Ali R., Azah M. A. N.

(2011), Chemical constituents and antimicrobial activity of the leaf and

rhizome oils of Alpinia pahangensis Ridl., an endemic wild ginger from

peninsular Malaysia, Chemistry biodiversity, 8(4), pp. 668-673.

112

[44]. Bao Q. W. (2010), Salvia miltiorrhiza: Chemical and pharmacological

review of a medicinal plant, J Med Plants Res, 4(25), pp. 2813-2820.

[45]. Bhat R., Karim A. A. (2010), Tongkat Ali (Eurycoma longifolia Jack): a

review on its ethnobotany and pharmacological importance, Fitoterapia,

81(7), pp. 669-679.

[46]. Bonneau N., Cynober T., Jullian J. C., Champy P. (2017), 1H qNMR

quantification of Annonaceous acetogenins in crude extracts of Annona

muricata L. Fruit Pulp, Phytochemical Analysis: An International Journal of

Plant Chemical Biochemical Techniques, 28(4), pp. 251-256.

[47]. Bringmann G., Messer K., Wohlfarth M., Kraus J., Dumbuya K., Rückert M.

(1999), HPLC−CD on-line coupling in combination with HPLC−NMR and

HPLC−MS/MS for the determination of the full absolute stereostructure of

new metabolites in plant extracts, Analytical Chemistry, 71(14), pp. 2678-

2686.

[48]. Britain G., "British Pharmacopoeia 2011", (Stationery Office, 2010).

[49]. Buchwald W., Kedzia B., Baraniak M. (2007), Microbiological study of

extracts of Salvia miltiorrhiza Bunge roots, Herba Polonica, 53(4), pp. 63-

68.

[50]. Calixto J. B., Santos A. R. S., Filho V. C., Yunes R. A. (1998), A review of

the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and

therapeutic potential, Medicinal research reviews, 18(4), pp. 225-258.

[51]. Champy P., Guérineau V., Laprévote O. (2009), MALDI-TOF MS profiling

of annonaceous acetogenins in Annona muricata products for human

consumption, Molecules, 14(12), pp. 5235-5246.

[52]. Chang C. C., Lien Y. C., Liu K. C., Lee S. S. (2003), Lignans from

Phyllanthus urinaria, Phytochemistry, 63(7), pp. 825-833.

[53]. Chang Q., Sun L., Zhao R. H., Chow M. S. S., Zuo Z. (2008), Simultaneous

determination of ten active components in traditional Chinese medicinal

products containing both Gegen (Pueraria lobata) and Danshen (Salvia

miltiorrhiza) by high‐performance liquid chromatography, Phytochemical

113

Analysis: An International Journal of Plant Chemical Biochemical

Techniques, 19(4), pp. 368-375.

[54]. Chen J., Lee F. S. C., Li L., Yang B., Wang X. (2007), Standardized extracts

of Chinese medicinal herbs: case study of Danshen (Salvia miltiorrhiza

Bunge), Journal of Food Drug Analysis, 15(4), pp. 347-364.

[55]. Chen W., Lu Y., Chen G., Huang S. (2013), Molecular evidence of

cryptotanshinone for treatment and prevention of human cancer, Anti-Cancer

Agents in Medicinal Chemistry, 13(7), pp. 979-987.

[56]. Choo C. Y., Chan K. L. (2002), High performance liquid chromatography

analysis of canthinone alkaloids from Eurycoma longifolia, Planta Medica,

68(04), pp. 382-384.

[57]. Chun Y. S., Qian L. M., Rahman K., Ting H., Lu P. Q. (2015), Salvia

miltiorrhiza: traditional medicinal uses, chemistry, and pharmacology,

Chinese journal of natural medicines, 13(3), pp. 163-182.

[58]. Committee on Asean

reference

substances,

"Guidelines

for

the

establishment, handling, storage and use of Asean reference substances," in

Committee on Asean reference substances (Thai Lan, 2005), pp. 2-12.

[59]. Coria T. A. V., Montalvo G. E., Yahia E. M., Obledo V. E. N. (2018),

Annona muricata: A comprehensive review on its traditional medicinal uses,

phytochemicals, pharmacological activities, mechanisms of action and

toxicity, Arabian Journal of Chemistry, 11(5), pp. 662-691.

[60]. Dai H., Wang M., Li X., Wang L., Li Y., Xue M. (2008), Structural

elucidation of in vitro and in vivo metabolites of cryptotanshinone by

HPLC–DAD–ESI–MSn, Journal of pharmaceutical biomedical analysis,

48(3), pp. 885-896.

[61]. Dhalwal K., Biradar Y. S., Rajani M. (2006), High-performance thin-layer

chromatography densitometric method for simultaneous quantitation of

phyllanthin, hypophyllanthin, gallic acid, and ellagic acid in Phyllanthus

amarus, J AOAC Int, 89(3), pp. 619-623.

114

[62]. Du G., Xiao M., Yu S., Wang M., Xie Y., Sang S. (2018), Phyllanthus

urinaria: a potential phytopharmacological source of natural medicine, Int J

Clin Exp Med, 11(7), pp. 6509-6520.

[63]. Fan H., Zhang W., Wang J., Lv M., Zhang P., Zhang Z., Xu F. (2015),

HPLC–MS/MS method for

the determination of four

lignans from

Phyllanthus urinaria L. in rat plasma and its application, Bioanalysis, 7(6),

pp. 701-712.

[64]. Geethangili M., Ding S. T. (2018), A Review of the Phytochemistry and

Pharmacology of Phyllanthus urinaria L., Frontiers in pharmacology, 9, pp.

[65]. Gu M., Zhang G., Su Z., Ouyang F. (2004), Identification of major active

constituents in the fingerprint of Salvia miltiorrhiza Bunge developed by

high-speed counter-current chromatography, Journal of Chromatography A,

1041(1-2), pp. 239-243.

[66]. Habsah M., Amran M., Mackeen M. M., Lajis N. H., Kikuzaki H., Nakatani

N., Rahman A. A., Ali A. M. (2000), Screening of Zingiberaceae extracts for

antimicrobial and antioxidant activities, Journal of ethnopharmacology,

72(3), pp. 403-410.

[67]. Hanh N. D., Sinchaipanid N., Mitrevej A. (2014), Physicochemical

characterization of phyllanthin from Phyllanthus amarus Schum. et Thonn,

Drug Dev Ind Pharm, 40(6), pp. 793-802.

[68]. Horwitz W. (2002), AOAC guidelines for single laboratory validation of

chemical methods for dietary supplements and botanicals, Gaithersburg,

MD, USA: AOAC International, pp. 12-19.

[69]. Huber L. (2010), Validation of Analytical Methods, Agilent Technologies

Printed in Germany, pp. 5990-5140EN.

[70]. Huong T. T., Thin D. B., Chau D. T. M., Thoan D. T. (2018), Diversity of

Zingiberaceae family in Pu Mat national park, Nghe An province, VNU

Journal of Science: Natural Sciences Technology, 34(1), pp.1

[71]. Ibrahim H., Sivasothy Y., Syamsir D. R., Nagoor N. H., Jamil N., Awang K.

(2014), Essential oil composition and antimicrobial activities of two closely

115

related species, Alpinia mutica Roxb. and Alpinia latilabris Ridl., from

Peninsular Malaysia, The Scientific World Journal, 2014, pp.

[72]. Jinno K. (2001), Basics and applications of hyphenated-detection system in

HPLC: Part III—hyphenated techniques in HPLC, Pharm. Stage, 1, pp. 110-

131.

[73]. Jinno K. (2001), Basics and applications of hyphenated-detection system in

HPLC: Part II—detection systems in HPLC, Pharm. Stage, 1, pp. 74–80.

[74]. Jinno K. (2001), Basics and applications of hyphenated-detection system in

HPLC: Part I—Basics and applications in HPLC, Pharm. Stage pp. 81–94.

[75]. Jirovetz L., Buchbauer G., Shafi M. P., Leela N. K. (2003), Analysis of the

essential oils of the leaves, stems, rhizomes and roots of the medicinal plant

Alpinia galanga from southern India, ACTA PHARMACEUTICA-ZAGREB,

53(2), pp. 73-82.

[76]. Jusoh S., Sirat H. M., Ahmad F. (2013), Essential oils of Alpinia rafflesiana

and their antimicrobial activities, Natural product communications, 8(9), pp.

1317-1320.

[77]. Kishikawa N., Yamanouchi A., El‐Maghrabey M. H., Ohyama K., Kuroda

N. (2018), Determination of Tanshinones in Danshen (Salvia miltiorrhiza) by

High‐Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection

after pre‐Column Derivatisation, Phytochemical Analysis: An International

Journal of Plant Chemical Biochemical Techniques, 29(1), pp. 112-117.

[78]. Kress W. J., Prince L. M., Williams K. J. (2002), The phylogeny and a new

classification of the gingers (Zingiberaceae): evidence from molecular data,

American Journal of Botany, 89(10), pp. 1682-1696.

[79]. Krithika R., Mohankumar R., Verma R. J., Shrivastav P. S., Mohamad I. L.,

Gunasekaran P., Narasimhan S. (2009), Isolation, characterization and

antioxidative effect of phyllanthin against CCl4-induced toxicity in HepG2

cell line, Chem Biol Interact, 181(3), pp. 351-358.

116

[80]. Lahrita L., Hirosawa R., Kato E., Kawabata J. (2017), Isolation and lipolytic

activity of eurycomanone and its epoxy derivative from Eurycoma longifolia,

Bioorganic Medicinal Chemistry, 25(17), pp. 4829-4834.

[81]. Lahrita L., Hirosawa R., Kato E., Kawabata J. (2017), Isolation and lipolytic

activity of eurycomanone and its epoxy derivative from Eurycoma longifolia,

Bioorg Med Chem, 25(17), pp. 4829-4834.

[82]. Lee S. Y., Choi D. Y., Woo E. R. (2005), Inhibition of osteoclast

differentiation by tanshinones from the root ofsalvia miltiorrhiza bunge,

Archives of pharmacal research, 28(8), pp. 909-913.

[83]. Lindon J. C., Nicholson J. K., Sidelmann U. G., Wilson I. D. (1997), Directly

coupled HPLC-NMR and its application to drug metabolism, Drug

metabolism reviews, 29(3), pp. 705-746.

[84]. Liu A. H., Lin Y. H., Yang M., Sun J. H., Guo H., Guo D. A. (2006), High-

performance liquid chromatographic determination of tanshinones in the

roots of Salvia miltiorrhiza and related traditional Chinese medicinal

preparations, Cardiovascular diseases, 5, pp. 9.

[85]. Lu Y., Foo L. Y. (2002), Polyphenolics of Salvia a review, Phytochemistry,

59(2), pp. 117-140.

[86]. Luo H., Kong W., Hu Y., Chen P., Wu X., Wan L., Yang M. (2015), Quality

evaluation of Salvia miltiorrhiza Bge. by ultra high performance liquid

chromatography with photodiode array detection and chemical fingerprinting

coupled with chemometric analysis, Journal of separation science, 38(9), pp.

1544-1551.

[87]. Mao X., Wu L. F., Guo H. L., Chen W. J., Cui Y. P., Qi Q., Li S., Liang W.

Y., Yang G. H., Shao Y. Y. (2016), The genus Phyllanthus: an

ethnopharmacological, phytochemical,

and pharmacological

review,

Evidence-Based Complementary Alternative Medicine, 2016, pp.

[88]. Miller J., Miller J. C. (2018), Statistics and chemometrics for analytical

chemistry, Pearson education.

117

[89]. Moghadamtousi S. Z., Fadaeinasab M., Nikzad S., Mohan G., Ali H. M.,

Kadir H. A. (2015), Annona muricata (Annonaceae): a review of its

traditional uses, isolated acetogenins and biological activities, International

journal of molecular sciences, 16(7), pp. 15625-15658.

[90]. Moraes I. V. M. d., Ribeiro P. R. V., Schmidt F. L., Canuto K. M., Zocolo G.

J., Brito E. S. d., Luo R., Richards K. M., Tran K., Smith R. E. (2016),

UPLC–QTOF–MS and NMR analyses of graviola (Annona muricata) leaves,

Revista Brasileira de Farmacognosia, 26(2), pp. 174-179.

[91]. Niessen W. M. A. (1999), Liquid chromatography - mass spectrometry,

Dekker, New York.

[92]. Organization U. N. I. D., Handa S. S., Khanuja S. P. S., Longo G., Rakesh D.

D. (2008), Extraction technologies for medicinal and aromatic plants, Earth,

Environmental and Marine Sciences and Technologies.

[93]. Park E. J., Ji H. Y., Kim N. J., Song W. Y., Kim Y. H., Kim Y. C., Sohn D.

H., Lee H. S. (2008), Simultaneous determination of tanshinone I,

dihydrotanshinone I, tanshinone IIA and cryptotanshinone in rat plasma by

liquid chromatography–tandem mass spectrometry: application

to a

pharmacokinetic study of a standardized fraction of Salvia miltiorrhiza,

PF2401‐SF, Biomedical Chromatography, 22(5), pp. 548-555.

[94]. Pinto A. C. D. Q., Cordeiro M. C. R., Andrade S. R. M. D., Ferreira F. R.,

Filgueiras H. A. D. C., Alves R. E., Kinpara D. I. (2005), Annona species

University of Southampton, UK.

[95]. Rady I., Bloch M. B., Chamcheu R. C. N., Banang Mbeumi S., Anwar M. R.,

Mohamed H., Babatunde A. S., Kuiate J. R., Noubissi F. K., El Sayed K. A.

(2018), Anticancer properties of Graviola

(Annona muricata): a

comprehensive mechanistic review, Oxidative medicine cellular longevity,

2018, pp.1

[96]. Rehman S. U., Choe K., Yoo H. H. (2016), Review on a traditional herbal

medicine, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): its traditional uses,

118

chemistry, evidence-based pharmacology and toxicology, Molecules, 21(3),

pp. 331.

[97]. Rehman S. U., Choi M. S., Han Y. M., Kim I. S., Kim S. H., Piao X. L., Yoo

H. H. (2017), Determination of eurycomanone in rat plasma using

hydrophilic interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry

for pharmacokinetic study, Biomedical Chromatography, 31(4), pp. e3831.

[98]. Rupprecht J. K., Hui Y. H., McLaughlin J. L. (1990), Annonaceous

acetogenins: a review, Journal of natural products, 53(2), pp. 237-278.

[99]. Sirat H. M., Jani N. A. (2013), Chemical constituents of the leaf of Alpinia

mutica Roxb, Natural product research, 27(16), pp. 1468-1470.

[100]. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Victica D.

(1991), New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents, Eur J

Cancer, 27, pp. 1162-1168.

[101]. Somanabandhu A., Nitayangkura S., Mahidol C., Ruchirawat S.,

Likhitwitayawuid K., Shieh H. L., Chai H., Pezzuto J. M., Cordell G. A. (1993), 1H- and 13C-NMR assignments of phyllanthin and hypophyllanthin:

lignans that enhance cytotoxic responses with cultured multidrug-resistant

cells, J Nat Prod, 56(2), pp. 233-239.

[102]. Srivastava V., Singh M., Malasoni R., Shanker K., Verma R. K., Gupta M.

M., Gupta A. K., Khanuja S. P. S. (2008), Separation and quantification of

lignans in Phyllanthus species by a simple chiral densitometric method,

Journal of separation science, 31(1), pp. 47-55.

[103]. Sung H. J., Choi S. M., Yoon Y., An K. S. (1999), Tanshinone IIA, an

ingredient of Salvia miltiorrhiza BUNGE, induces apoptosis in human

leukemia cell lines through the activation of caspase-3, Experimental

molecular medicine, 31(4), pp. 174-178.

[104]. Tan L. T. (2016), Review of GC/MS: A Practical User’s Guide, 79(10), pp.

2763.

119

[105]. Taverniers I., De Loose M., Van Bockstaele E. (2004), Trends in quality in

the analytical laboratory. II. Analytical method validation and quality

assurance, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 23(8), pp. 535-552.

[106]. Teh C. H., Abdulghani M., Morita H., Shiro M., Hussin A. H., Chan K. L.

(2011), Comparative x‐ray and conformational analysis of a new crystal of

13α, 21-dihydroeurycomanone with eurycomanone

from eurycoma

longifolia and their anti-estrogenic activity using the uterotrophic assay,

Planta medica, 77(02), pp. 128-132.

[107]. Thompson M., Lowthian P. J. (1995), A Horwitz-like function describes

precision in a proficiency test, Analyst, 120(2), pp. 271-272.

[108]. Tidgewell K. J. (2016), Review of Natural Products Chemistry: Sources,

Separations, and Structures, 79(10), pp. 2762–2762.

[109]. Waksmundzka H. M., Sherma J., Kowalska T. (2008), Thin layer

chromatography in phytochemistry, CRC Press.

[110]. Wang C. Y., Lee S. S. (2005), Analysis and identification of lignans in

Phyllanthus urinaria by HPLC-SPE-NMR, Phytochem Anal, 16(2), pp. 120-

126.

[111]. Wilson I. D., Brinkman U. A. T. (2003), Hyphenation and hypernation: the

practice and prospects of multiple hyphenation, Journal of Chromatography

A, 1000(1-2), pp. 325-356.

[112]. Wu W., Li Y., Jiao Z., Zhang L., Wang X., Qin R. (2019), Phyllanthin and

hypophyllanthin from Phyllanthus amarus ameliorates immune-inflammatory

response in ovalbumin-induced asthma: role of IgE, Nrf2, iNOs, TNF-alpha,

and IL's, Immunopharmacol Immunotoxicol, 41(1), pp. 55-67.

[113]. Xiao W. L., Song X. P., Chen G. Y., Chen W. H., Liu H., Gao G., Han C. R.

(2015), Chemical composition and antibacterial activity of volatile oil from

fruits of Alpinia maclurei, China Journal of Experimental Traditional

Medical Formulae, 21(7), pp. 47-50.

[114]. Yang Y. Y., Wu Z. Y., Zhang H., Yin S. J., Xia F. B., Zhang Q., Wan J. B.,

Gao J. L., Yang F. Q. (2020), LC–MS-based multivariate statistical analysis

120

for the screening of potential thrombin/factor Xa inhibitors from Radix

Salvia miltiorrhiza, Chinese medicine, 15, pp. 1-13.

[115]. Yusoff M. M., Ibrahim H., Hamid N. A. (2011), Chemical characterization

and antimicrobial activity of rhizome essential oils of very closely allied

Zingiberaceae species endemic to Borneo: Alpinia ligulata K. Schum. and

Alpinia nieuwenhuizii Val, Chemistry biodiversity, 8(5), pp. 916-923.

[116]. Zhang J., He Y., Cui M., Li L., Yu H., Zhang G., Guo D. (2005), Metabolic

studies on the total phenolic acids from the roots of Salvia miltiorrhiza in

rats, Biomedical Chromatography, 19(1), pp. 51-59.

[117]. Zhao Y., Chen B., Yao S. (2005), Simultaneous determination of abietane-

type diterpenes, flavonolignans and phenolic compounds in compound

preparations of Silybum marianum and Salvia miltiorrhiza by HPLC-DAD-

ESI MS, Journal of pharmaceutical biomedical analysis, 38(3), pp. 564-570.

[118]. Zhou L., Zuo Z., Chow M. S. S. (2005), Danshen: an overview of its

chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use, The Journal of

Clinical Pharmacology, 45(12), pp. 1345-1359.

121

PHỤ LỤC

A. Phụ lục phổ các hợp chất phân lập đƣợc

1. Phụ lục phổ của hợp chất hypophyllanthin

2. Phụ lục phổ của hợp chất phyllanthin

3. Phụ lục phổ của hợp chất tanshinone I

4. Phụ lục phổ của hợp chất cryptotanshinone

5. Phụ lục phổ của hợp chất tanshinone IIA

6. Phụ lục phổ của hợp chất eurycomanone

B. Phụ lục phổ của các mẫu phân tích

C. Phụ lục đƣờng chuẩn của các chất chuẩn phân tích

122

Phụ lục A1. Phổ MS của hợp chất hypophyllanthin

123

Phụ lục A2. Phổ 1H-NMR của hợp chất hypophyllanthin

Phụ lục A3. Phổ 1H-NMR của hợp chất hypophyllanthin

124

Phụ lục A4. Phổ 13C-NMR của hợp chất hypophyllanthin

Phụ lục A5. Phổ UV-Vis của hợp chất hypophyllanthin

125

Phụ lục A6. Phổ MS của hợp chất phyllanthin

Phụ lục A7. Sơ đồ phân mảnh của phyllanthin

126

Phụ lục A8. Phổ 1H-NMR của hợp chất phyllanthin

Phụ lục A9. Phổ 13C-NMR của hợp chất phyllanthin

127

Phụ lục A10. Phổ UV-Vis của hợp chất phyllanthin

128

Phụ lục A11. Phổ MS của hợp chất tanshinone I

129

Phụ lục A12. Phổ 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) của hợp chất tanshinone I

130

Phụ lục A13. Phổ 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) của hợp chất tanshinone I

Phụ lục A14. Phổ UV-Vis của hợp chất tanshinon I

Phụ lục A15. Phân mảnh của tanshinone I

Phụ lục A16. Phổ UV-Vis của hợp chất cryptotanshinone

131

Phụ lục A17. Sơ đồ phân mảnh của cryptotanshinone

132

Phụ lục A18. Phổ 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) của hợp chất cryptotanshinone

133

Phụ lục A19. Phổ 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) của hợp chất cryptotanshinone

134

Phụ lục A20. Phổ 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) của hợp chất tanshinone IIA

135

Phụ lục A21. Phổ 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) của hợp chất tanshinone IIA

Phụ lục A22. Phổ UV-Vis của hợp chất tanshinon IIA

Phụ lục A23. Sơ đồ phân mảnh của tanshinone IIA

136

Phụ lục A24. Phổ UV-Vis của eurycomanone

137

Phụ lục A25. Phổ MS của hợp chất eurycomanone

138

Phụ lục A26. Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) của hợp chất eurycomanone

139

Phụ lục A27. Phổ 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất eurycomanone

B. Phụ lục sắc đồ của các mẫu phân tích

Hypophyllanthin

Phụ lục B1. Sắc ký đồ mẫu DHC-VX xác định giá trị LOD của hợp chất hypophyllanthin

Phyllanthin

đối với phƣơng pháp LC-MS/MS

Phụ lục B2. Sắc ký đồ mẫu DHC-VX xác định giá trị LOD của hợp chất phyllanthin đối

tanshinone I

với phƣơng pháp LC-MS/MS

Phụ lục B3. Sắc ký đồ mẫu DS-SP xác định giá trị LOD của hợp chất tanshinone I đối với

140

phƣơng pháp LC-MS/MS

cryptotanshinone

Phụ lục B4. Sắc ký đồ mẫu DS-SP xác định giá trị LOD của hợp chất cryptotanshinone đối với phƣơng pháp LC-MS/MS

tanshinone IIA

eurycomanone

Phụ lục B5. Sắc ký đồ mẫu DS-SP xác định giá trị LOD của hợp chất tanshinone IIA đối với phƣơng pháp LC-MS/MS

141

Phụ lục B6. Sắc ký đồ mẫu MN-BG xác định giá trị LOD của hợp chất eurycomanone đối với phƣơng pháp LC-MS/MS

Mẫu thân cây Diệp hạ châu

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Mẫu rễ cây Diệp hạ châu

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Phyllanthin

Mẫu DHC-DH

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Mẫu DHC-PNC

Hypophyllanthin

142

Phụ lục B7. Sắc đồ phân tích của các mẫu cây Diệp hạ châu

Phyllanthin

Mẫu DHC-PV

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Mẫu DHC-DD5

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Mẫu DHC-KH

Hypophyllanthin

tanshinone I

Mẫu DS-LD

tanshinone IIA

cryptotanshinone

143

Phụ lục B8. Sắc đồ phân tích của mẫu thực phẩm chức năng từ cây Diệp hạ châu

tanshinone I

Mẫu DS-HG

tanshinone IIA

cryptotanshinone

tanshinone I

Mẫu DS-MC

tanshinone IIA

cryptotanshinone

tanshinone I

Mẫu DS-QT

tanshinone IIA

cryptotanshinone

tanshinone I

Mẫu DS-ML

cryptotanshinone

tanshinone IIA

144

Phụ lục B9. Sắc đồ phân tích mẫu Đan sâm

eurycomanone

eurycomanone

Mẫu MN-NA

Mẫu MN-HB

eurycomanone

eurycomanone

Mẫu MN-DN

Mẫu MN-VT

Phụ lục B10. Sắc đồ phân tích của các mẫu Mật nhân

145

Phụ lục B11. Phổ 1H-NMR của AMF-1

Phụ lục B12. Phổ 1H-NMR của AMF-2

Phụ lục B13. Phổ 1H-NMR của AMF-4

146

Phụ lục B14. Sắc ký đồ HPLC của AMF-3 (mở rộng)

147

Phụ lục B15. AMF-3 chiết xuất sắc ký ion (extracted ion chromatogram- EIC)

C. Phụ lục đƣờng chuẩn của các chất chuẩn phân tích

Phụ lục C1. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phƣơng pháp LC- MS/MS

Phụ lục C2. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phƣơng pháp LC- MS/MS

148

Phụ lục C3. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phƣơng pháp UPLC-DAD

Phụ lục C4. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phƣơng pháp UPLC- DAD

Phụ lục C5. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I trong phƣơng pháp LC-

MS/MS

Phụ lục C6. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với cryptotashinone trong phƣơng pháp

149

LC-MS/MS

Phụ lục C7. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone IIA

trong phƣơng pháp LC-MS/MS

Phụ lục C8. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I

trong phƣơng pháp UPLC-DAD

Phụ lục C9. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với cryptotanshinone

150

trong phƣơng pháp UPLC-DAD

Phụ lục C10. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với tanshinone IIA

trong phƣơng pháp UPLC-DAD

Phụ lục C11. Đƣờng hồi quy tuyến tính đối với eurycomanone

trong phƣơng pháp LC-MS/MS

Phụ lục C12. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi xác định Hypophyllanthin và Phyllanthin trong mẫu thuốc DHC-VX(*)

Mẫu DHC-VX Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,0499 0,0498 0,0500 1,225 1,234 1,252

Hàm lƣợng 0,1365 0,1361 0,1367 0,134 0,135 0,137 (mg/g) Hypophyllanthin TB+S (mg/g) 0,1364±0,0003 0,135 ± 0,002

0,2 1,1 RSD(%)

3,8 2,0 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 0,1186 0,1190 0,1188 2,852 2,925 3,016

Hàm lƣợng 0,3244 0,3254 0.3249 0,312 0,320 0,330 Phyllanthin (mg/g)

TB+S (mg/g) 0,3249±0,0005 0,321 ± 0,009

151

RSD(%) 0,2 2,8

(*) TB, S và RSD: Trung bình số học, độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tƣơng đối; RSDH:

3,4 3,4 1/2RSDH(%)

Độ lệch chuẩn tƣơng đối tính theo phƣơng trình Horwitz;Giá trị t và p tính đƣợc từ các kết

quả của hai phƣơng pháp khi phân tích mẫu. ĐKTN: Nhƣ mô tả ở phần thực nghiệm

Phụ lục C13. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

khi xác định Hypophyllanthin và Phyllanthin trong mẫu thuốc DHC-DH

Mẫu DHC-DH Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,0264 0,0263 0,0265 0,631 0,653 0,642

Hàm lƣợng 0,0607 0,0605 0,0609 0,058 0,06 0,059 (mg/g) Hypophyllanthin TB+S (mg/g) 0,0607±0,0002 0,059 ± 0,001

RSD(%) 1,7 0,3

2,1 4,3 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 0,0453 0,0454 0,0456 1.034 1,012 1,078

Hàm lƣợng 0,1041 0,1043 0,1047 0,095 0,093 0,099 (mg/g) Phyllanthin TB+S (mg/g) 0,1044±0,0003 0,096 ± 0,003

RSD(%) 3,2 0,3

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

4,0 4,0 1/2RSDH(%)

Phụ lục C14. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

khi xác định Hypophyllanthin và Phyllanthin trong mẫu thuốc DHC-PNC

Mẫu DHC-PNC Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

152

C (μg/mL) 0,0473 0,0481 0,0472 1,171 1,191 1,181 Hypophyllanthin Hàm lƣợng 0,1191 0,1211 0,1189 0,118 0,12 0,119

(mg/g)

TB+S (mg/g) 0,1197±0,0012 0,119 ± 0,001

RSD(%) 0,8 1,0

1,9 3,9 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 0,1648 0,1649 0,1646 4,117 4,216 4,157

Hàm lƣợng 0,4153 0,4155 0,4149 0,415 0,425 0,419 (mg/g) Phyllanthin TB+S (mg/g) 0,4152±0,0003 0,420 ± 0,005

RSD(%) 1,2 0,1

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

3,2 3,2 1/2RSDH(%)

Phụ lục C15. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-

DAD khi xác định Hypophyllanthin và Phyllanthin trong mẫu thuốc DHC-PV

Mẫu DHC-PV Thông số/

Chất LC-MS/MS UPLC-DAD Đại lƣợng

thống kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,1249 0,1256 0,1258 3,098 3,139 3,129

Hàm lƣợng 0,2993 0,3011 0,3016 0,297 0,301 0,300 (mg/g) Hypophyllanthin TB+S (mg/g) 0,3007±0,0012 0,299 ± 0,002

RSD(%) 0,7 0,4

1,9 3,4 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 0,4817 0,4820 0,4816 11,984 12,109 11,869

Hàm lƣợng 1,1545 1,1554 1,1543 1,149 1,161 1,138 (mg/g) Phyllanthin TB+S (mg/g) 1,1547±0,0006 1,149 ± 0,012

RSD(%) 1,0 0,1

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

153

2,8 2,8 1/2RSDH(%)

Phụ lục C16. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-

DAD khi xác định Hypophyllanthin và Phyllanthin trong mẫu thuốc DHC-DD5

Mẫu DHC-DD5 Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,0245 0,0243 0,0244 0,610 0,600 0,590

Hàm lƣợng 0,0602 0,0596 0,0599 0,06 0,059 0,058 (mg/g) Hypophyllanthin TB+S (mg/g) 0,0599±0,0003 0,059 ± 0,001

0,5 RSD(%) 1,7

4,3 2,1 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 0,0326 0,0325 0,0332 0,783 0,824 0,814

Hàm lƣợng 0,0801 0,0799 0,0815 0,077 0,081 0,080 (mg/g) Phyllanthin TB+S (mg/g) 0,0805±0,0009 0,079 ± 0,002

1,1 RSD(%) 2,6

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

4,1 4,1 1/2RSDH(%)

Phụ lục C17. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

khi xác định Hypophyllanthin và Phyllanthin trong mẫu thuốc DHC-KH

Mẫu DHC-KH Thông số/

Chất LC-MS/MS UPLC-DAD Đại lƣợng

thống kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,4904 0,4899 0,4910 12,295 12,258 12,239

Hàm lƣợng 0,6602 0,6594 0,6609 0,662 0,66 0,659 (mg/g) Hypophyllanthin TB+S (mg/g) 0,6602±0,0008 0,660 ± 0,001

RSD(%) 0,1 0,2

154

3,0 1,8 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,4158 1,4160 1,4151 35,305 35,510 35,101

Hàm lƣợng 1,9058 1,9061 1,9049 1,901 1,912 1,890 (mg/g) Phyllanthin TB+S (mg/g) 1,9056±0,0006 1,901 ± 0,011

RSD(%) 0,1 0,6

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

2,6 2,6 1/2RSDH(%)

Phụ lục C18. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-

DAD khi xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA và Cryptotanshinone trong mẫu Sapa

Mẫu Sapa Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,7997 0,8000 0,8001

Hàm lƣợng 2,4606 2,4614 2,4619 2,44 2,46 2,46 (mg/g) Tanshinone I TB+S (mg/g) 2,4613±0,0007 2,45±0,01

0,5 RSD(%) 0,03

2,5 2,47 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 2,9863 2,9865 2,9865

Hàm lƣợng 9,1887 9,1889 9,1891 9,21 9,15 9,18 (mg/g) Tanshinone IIA TB+S (mg/g) 9,1889±0,0002 9,18±0,03

0,3 RSD(%) 0,002

2,0 2,03 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,5126 1,5128 1,5130

Hàm lƣợng 4,6543 4,6549 4,6555 4,63 4,66 4,67 (mg/g) Cryptotanshinone TB+S (mg/g) 4,6549±0,0006 4,65±0,02

0,4 RSD(%) 0,01

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

155

2,2 2,24 1/2RSDH(%)

Phụ lục C19. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

khi xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA và Cryptotanshinone trong mẫu Lâm Đồng

Mẫu Lâm Đồng Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 1,4218 1,4212 1,4217

Hàm lƣợng 4,4293 4,4275 4,4289 4,43 4,42 4,44 (mg/g) Tanshinone I TB+S (mg/g) 4,4286±0,0009 4,43±0,01

0,2 RSD(%) 0,02

2,3 2,26 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 3,1757 3,1775 3,1775

Hàm lƣợng 9,893 9,8991 9,8989 9,88 9,86 9,91 (mg/g) Tanshinone IIA TB+S (mg/g) 9,8970±0,0035 9,88±0,03

0,3 RSD(%) 0,035

2,0 2,0 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 2,6190 2,6188 2,6192

Hàm lƣợng 8,1590 8,1583 8,1595 8,13 8,16 8,14 (mg/g) Cryptotanshinone TB+S (mg/g) 8,1589±0,0006 8,14±0,02

0,2 RSD(%) 0,01

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

2,1 2,06 1/2RSDH(%)

Phụ lục C20. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

khi xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA và Cryptotanshinone trong mẫu Hà Giang

Mẫu Hà Giang Thông số/

Đại lƣợng Chất LC-MS/MS UPLC-DAD

thống kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

156

Tanshinone I C (μg/mL) 1,0996 1,0989 1,0991

Hàm lƣợng 3,5357 3,5335 3,5342 3,51 3,54 3,53 (mg/g)

TB+S (mg/g) 3,5345±0,0011 3,53±0,02

RSD(%) 0,03 0,4

2,34 2,3 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 4,0510 4,0507 4,0507

Hàm lƣợng 13,0257 13,0251 13,0249 12,97 12,95 13,06 (mg/g) Tanshinone IIA TB+S (mg/g) 13,0252±0,0004 12,99±0,06

RSD(%) 0,003 0,5

1,92 1,9 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,6173 1,6178 1,6182

Hàm lƣợng 5,2002 5,2019 5,2031 5,14 5,19 5,21 (mg/g) Cryptotanshinone TB+S (mg/g) 5,2017±0,0015 5,19±0,03

RSD(%) 0,03 0,5

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

2,21 2,2 1/2RSDH(%)

Phụ lục C21. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi

xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA và Cryptotanshinone trong mẫu Mộc Châu

Mẫu Mộc Châu Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,8887 0,8884 0,8889

Hàm lƣợng 2,8853 2,8843 2,8861 2,85 2,91 2,87 (mg/g) Tanshinone I TB+S (mg/g) 2,8852±0,0009 2,88±0,03

RSD(%) 0,03 1,1

2,41 2,4 1/2RSDH(%)

157

Tanshinone IIA C (μg/mL) 2,5823 2,5826 2,5826

Hàm lƣợng 8,3841 8,3839 8,3851 8,35 8,45 8,38 (mg/g)

TB+S (mg/g) 8,3844±0,0006 8,39±0,05

RSD(%) 0,6 0,008

2,1 2,05 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,2853 1,2849 1,2850

Hàm lƣợng 4,1729 4,1719 4,1722 4,18 4,14 4,16 (mg/g) Cryptotanshinone TB+S (mg/g) 4,1723±0,0005 4,16±0,02

RSD(%) 0,5 0,01

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

2,3 2,28 1/2RSDH(%)

Phụ lục C22. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

khi xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA và Cryptotanshinone trong mẫu Quảng Tây

Mẫu Quảng Tây Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,4978 0,4984 0,4976

Hàm lƣợng 1,5555 1,5574 1,5549 1,56 1,54 1,58 (mg/g) Tanshinone I TB+S (mg/g) 1,5559±0,0013 1,56±0,02

RSD(%) 1,3 0,08

2,6 2,65 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,5347 1,5348 1,5348

Hàm lƣợng 4,7958 4,7951 4,7964 4,75 4,79 4,81 (mg/g) Tanshinone IIA TB+S (mg/g) 4,7958±0,0007 4,78±0,03

RSD(%) 0,6 0,014

2,2 2,23 1/2RSDH(%)

158

Cryptotanshinone C (μg/mL) 0,9164 0,9159 0,9163

Hàm lƣợng 2,8636 2,8621 2,8634 2,86 2,84 2,86 (mg/g)

TB+S (mg/g) 2,8630±0,0008 2,85±0,01

RSD(%) 0,03 0,4

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

2,41 2,4 1/2RSDH(%)

Phụ lục C23. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các phƣơng pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD

khi xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA và Cryptotanshinone trong mẫu Mƣờng Lống

Mẫu Mƣờng Lống Thông số/ Đại

Chất lƣợng thống LC-MS/MS UPLC-DAD

kê L1 L2 L3 L1 L2 L3

C (μg/mL) 0,4080 0,4080 0,4087

Hàm lƣợng 1,2711 1,2709 1,2732 1,28 1,26 1,25 (mg/g) Tanshinone I TB+S (mg/g) 1,2717±0,0013 1,26±0,02

1,2 RSD(%) 0,10

2,7 2,73 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,2288 1,2286 1,2286

Hàm lƣợng 3,8279 3,8281 3,8275 3,84 3,78 3,81 (mg/g) Tanshinone IIA TB+S (mg/g) 3,8278±0,0003 3,81±0,03

0,8 RSD(%) 0,008

2,3 2,31 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,2509 1,2501 1,2505

Hàm lƣợng 3,8969 3,8945 3,8955 3,85 3,91 3,89 (mg/g) Cryptotanshinone TB+S (mg/g) 3,8956±0,0012 3,88±0,03

0,8 RSD(%) 0,03

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

159

2,3 2,30 1/2RSDH(%)

Phụ lục C24. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp LC-MS/MS khi xác định

Eurycomanone trong các mẫu

Eurycomanone Thông số/ Đại lƣợng Ký hiệu mẫu thống kê L1 L2 L3

C (μg/mL) 2,8706 2,8708 2,8706

Hàm lƣợng (mg/g) 1,8533 1,8534 1,8533

Vũng Tàu TB+S (mg/g) 1,8533±0,0001

RSD(%) 0,002

2,6 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 0,2623 0,2624 0,2622

Hàm lƣợng (mg/g) 0,1716 0,1716 0,1715

Đăk Nông TB+S (mg/g) 0,1716±0,0001

0,035 RSD(%)

3,7 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 1,2352 1,2354 1,2351

Hàm lƣợng (mg/g) 0,8015 0,8016 0,8014

Hòa Bình 0,8015±0,0001 TB+S (mg/g)

0,003 RSD(%)

2,9 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 0,4201 0,4199 0,4202

Hàm lƣợng (mg/g) 0,2739 0,2738 0,2740

Nghệ An 0,2739±0,0001 TB+S (mg/g)

0,008 RSD(%)

3,4 1/2RSDH(%)

C (μg/mL) 4,7814 4,7822 4,7806

Hàm lƣợng (mg/g) 3,1336 3,1341 3,1331

Bắc Giang 3,1336±0,0005 TB+S (mg/g)

0,014 RSD(%)

2,4 1/2RSDH(%)

160

Hà Giang C (μg/mL) 1,3939 1,3937 1,3940

Hàm lƣợng (mg/g) 0,9292 0,9291 0,9292

TB+S (mg/g) 0,9291±0,0001

RSD(%) 0,009

(*) TB, S và RSD: giống bảng 3.4

2,9 1/2RSDH(%)

Phụ lục C25. Kết quả phân tích hàm lƣợng phyllanthin

Hàm lƣợng phyllanthin đo đƣợc, mg/g ½ RSDH (%) Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± S RSD(%)

0,0439 0,0050 0,0436 0,0048 0,0443 0,0054 0,0439±0,0004 0,0051±0,0003 0,8 6,0 Lá Thân 4,5 6,3

0,0039 0,0037 0,0041 0,0039±0,0002 5,1 Rễ 6,5

Phụ lục C26. Kết quả phân tích hàm lƣợng hypophyllanthin

Hàm lƣợng hypophyllanthin đo đƣợc, mg/g ½ RSDH (%) Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ± SD RSD(%)

Lá 0,2748 0,2744 0,2751 0,2748±0,0004 0,1 3,4

161

Thân Rễ 0,0166 0,0029 0,0163 0,0030 0,0171 0,0027 0,0167±0,0004 0,0029±0,0002 2,4 5,3 5,2 6,8

Phụ lục C27. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp xác định phyllanthin trong mẫu thuốc nghiên cứu

0.03 0.15 1.5 Mẫu RevTB (%) Cx(ug/mL) Thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3

0,1186 0,1190 0,1188 0,1186 0,1190 0,1188 0,1186 0,1190 0,1188

C0(ug/mL) C(ug/mL) DHC-VX 0,1477 0,1475 0,1476 0,2656 0,2672 0,2691 1,6141 1,6191 1,6182 95-100

Rev(%) 97 95 96 98 98 100 99 100 100

0,0453 0,0454 0,0456 0,0453 0,0454 0,0456 0,0453 0,0454 0,0456

C0(ug/mL) C(ug/mL) DHC-DH 0,0745 0,0739 0,0743 0,1949 0,1938 0,1944 1,5456 1,5428 1,5451 95-100

Rev(%) 97 95 95 99 98 99 100 99 99

0,1648 0,1649 0,1646 0,1648 0,1649 0,1646 0,1648 0,1649 0,1646 DHC- C0(ug/mL) C(ug/mL) 0,1935 0,1941 0,1939 0,3132 0,3132 0,3151 1,6639 1,6643 1,6653 96-100 PNC Rev(%) 96 97 97 98 98 100 99 99 100

0,4817 0,4820 0,4816 0,4817 0,4820 0,4816 0,4817 0,4820 0,4816

C0(ug/mL) C(ug/mL) DHC-PV 0,5102 0,5123 0,5115 0,6301 0,6335 0,6322 1,9787 1,9811 1,9845 95-101

Rev(%) 95 101 99 98 101 100 99 99 100

0,0326 0,0325 0,0332 0,0326 0,0325 0,0332 0,0326 0,0325 0,0332 DHC- C0(ug/mL) C(ug/mL) 0,0618 0,0632 0,0620 0,1811 0,1821 0,1835 1,5311 1,5329 1,5342 96-102 DD5 Rev(%) 97 102 96 99 99 100 99 100 100

1,4158 1,4160 1,4151 1,4158 1,4160 1,4151 1,4158 1,4160 1,4151

C0(ug/mL) C(ug/mL) DHC-KH 1,4445 1,4451 1,4449 1,5652 1,5664 1,5661 2,9144 2,9139 2,9164 95-100

Rev(%) 100 100 100 99 99 97 99 95

99 (*) Cx: Nồng độ chất chuẩn thêm vào; Co: Nồng độ chất trong mẫu (µg / mL); C: Nồng độ mẫu sau khi thêm chuẩn; Rev: Độ thu hồi;

162

RevTB: Độ thu hồi trung bình (n = 9); Điều kiện thí nghiệm giống nhƣ mục 3.3.

Phụ lục C28. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp xác định hypophyllanthin trong mẫu thuốc nghiên cứu

RevTB 0.01 0.05 0.5 Cx(ug/mL) Mẫu (%) Thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3

0,0499 0,0498 0,05 0,0499 0,0498 0,05 0,0499 0,0498 0,05 95-100 DHC-VX 0,0596 0,0595 0,0598 0,0988 0,0976 0,0998 0,5487 0,5479 0,5522 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 97 97 98 97 95 99 99 99 100

0,0264 0,0263 0,0265 0,0264 0,0263 0,0265 0,0264 0,0263 0,0265 95-103 DHC-DH 0,0359 0,0362 0,0368 0,0756 0,0767 0,0761 0,5272 0,5265 0,5269 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 95 99 103 98 100 99 100 100 100

0,0473 0,0481 0,0472 0,0473 0,0481 0,0472 0,0473 0,0481 0,0472 DHC- 96-101 0,0569 0,0577 0,0573 0,0974 0,0969 0,0971 0,5456 0,5468 0,5475 C0(ug/mL) C(ug/mL) PNC Rev(%) 96 96 101 100 97 99 99 99 100

0,1249 0,1256 0,1258 0,1249 0,1256 0,1258 0,1249 0,1256 0,1258 97-103 DHC-PV 0,1346 0,1359 0,1355 0,1746 0,1751 0,1763 0,6232 0,6244 0,626 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 97 103 97 99 99 101 99 99 100

0,0245 0,0243 0,0244 0,0245 0,0243 0,0244 0,0245 0,0243 0,0244 DHC- 95-102 0,0341 0,0338 0,0345 0,0727 0,0755 0,0746 0,5222 0,5219 0,5268 C0(ug/mL) C(ug/mL) DD5 Rev(%) 96 95 101 96 102 100 99 99 100

0,4904 0,4899 0,491 0,4904 0,4899 0,491 0,4904 0,4899 0,491 94-101 DHC-KH 0,4998 0,4995 0,5011 0,5392 0,5408 0,5397 0,989 0,9867 0,9901 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 94 96 101 97 101 97 99 99 99

163

(*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22.

Phụ lục C29. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp xác định tanshinone I*

RevTB 0.3 1.0 2.0 Cx(ug/mL) Mẫu (%) Thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3

0,7997 0,8000 0,8001 0,7997 0,8000 0,8001 0,7997 0,8000 0,8001 97-103 Sapa 1,1012 1,0941 1,1109 1,8211 1,7809 1,8321 2,8751 2,8112 2,7501 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 100 98 103 102 98 103 103 100 97

1,4218 1,4212 1,4217 1,4218 1,4212 1,4217 1,4218 1,4212 1,4217 Lâm 95-102 1,7092 1,7094 1,7139 2,4511 2,4059 2,4121 3,4751 3,4512 3,3501 C0(ug/mL) C(ug/mL) Đồng Rev(%) 95 96 97 102 98 99 102 101 96

1,0996 1,0989 1,0991 1,0996 1,0989 1,0991 1,0996 1,0989 1,0991 96-102 Hà Giang 1,3892 1,3941 1,3909 2,1211 2,1059 2,0821 3,0751 3,1512 3,0501 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 96 98 97 102 100 98 98 102 97

0,8887 0,8884 0,8889 0,8887 0,8884 0,8889 0,8887 0,8884 0,8889 Mộc 96-103 1,1792 1,1841 1,1809 1,9211 1,9059 1,8721 2,8751 2,9512 2,9301 C0(ug/mL) C(ug/mL) Châu Rev(%) 96 98 97 103 101 98 99 103 102

0,4978 0,4984 0,4976 0,4978 0,4984 0,4976 0,4978 0,4984 0,4976 96-102 Guangxi 0,7921 0,7892 0,7879 1,5211 1,5059 1,4872 2,4751 2,5121 2,5301 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 98 96 96 102 100 98 98 100 101

0,4080 0,4080 0,4087 0,4080 0,4080 0,4087 0,4080 0,4080 0,4087 Mƣờng 97-103 0,7201 0,6992 0,7009 1,4211 1,4059 1,4172 2,4751 2,3901 2,4331 C0(ug/mL) C(ug/mL) Lống 101 99 100 103 99 101 Rev(%) 97 98

164

97 (*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22.

Phụ lục C30. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp xác định cryptotanshinone

0,5 1,5 3,0 Mẫu RevTB (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Cx(ug/mL) Thí nghiệm

1,5126 1,5128 1,5130 1,5126 1,5128 1,5130 1,5126 1,5128 1,5130

2,0021 2,0173 1,9992 3,0511 2,9759 3,0172 4,4751 4,5901 4,4331 97-102 C0(ug/mL) C(ug/mL) Sapa

Rev(%) 97 100 97 102 97 100 98 102 97

2,6190 2,6188 2,6192 2,6190 2,6188 2,6192 2,6190 2,6188 2,6192

Lâm Đồng 97-101 3,1071 3,1133 3,1072 4,0913 4,1705 4,1004 5,5955 5,6514 5,5331 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 97 98 97 98 103 98 99 101 97

1,6173 1,6178 1,6182 1,6173 1,6178 1,6182 1,6173 1,6178 1,6182

Hà Giang 2,1017 2,1343 2,1127 3,1023 3,1695 3,1064 4,5458 4,6574 4,5371 96-103 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 96 103 98 99 103 99 97 101 97

1,2853 1,2849 1,2850 1,2853 1,2849 1,2850 1,2853 1,2849 1,2850

Mộc Châu 1,7722 1,8034 1,7912 2,7628 2,7865 2,8336 4,2544 4,1697 4,3712 96-103 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 97 103 101 98 101 103 98 96 102

0,9164 0,9159 0,9163 0,9164 0,9159 0,9163 0,9164 0,9159 0,9163

Guangxi 1,4042 1,4139 1,3996 2,4682 2,4405 2,3963 4,0374 3,9677 3,8379 96-103 C0(ug/mL) C(ug/mL)

Rev(%) 97 99 96 103 101 98 104 101 97

1,2509 1,2501 1,2505 1,2509 1,2501 1,2505 1,2509 1,2501 1,2505 Mƣờng 96-102 1,7394 1,7391 1,7350 2,7692 2,7185 2,7936 4,2037 4,2647 4,3097 C0(ug/mL) C(ug/mL) Lống Rev(%) 97 97 96 101 97 102 98 100 101

165

(*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22.

Phụ lục C31. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp xác định tanshinone IIA

RevTB 3,0 6,0 1,0 Cx(ug/mL) Mẫu (%) Thí nghiệm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3

2,9863 2,9865 2,9865 2,9863 2,9865 2,9865 2,9863 2,9865 2,9865 97-

C0(ug/mL) C(ug/mL) 3,9754 3,9639 3,9753 6,0692 5,9155 5,9376 9,0203 9,1264 9,0309 Sapa 102 Rev(%) 98 97 98 102 97 98 100 102 100

3,1757 3,1775 3,1775 3,1757 3,1775 3,1775 3,1757 3,1775 3,1775 97- Lâm C0(ug/mL) C(ug/mL) 4,1504 4,1603 4,1735 6,1959 6,1135 6,0937 9,1020 9,2264 9,2430 101 Đồng Rev(%) 97 98 99 100 97 97 98 100 101

4,0510 4,0507 4,0507 4,0510 4,0507 4,0507 4,0510 4,0507 4,0507 96-

C0(ug/mL) C(ug/mL) Hà Giang 5,0314 5,0196 5,0435 7,0915 6,9853 7,1032 10,1202 10,0296 10,2243 102 Rev(%) 98 96 99 101 97 101 101 99 102

2,5823 2,5826 2,5826 2,5823 2,5826 2,5826 2,5823 2,5826 2,5826 97- Mộc C0(ug/mL) C(ug/mL) 3,5641 3,5609 3,5705 5,6191 5,4985 5,6503 8,5247 8,6297 8,7224 102 Châu Rev(%) 98 97 98 101 97 102 99 100 102

1,5347 1,5348 1,5348 1,5347 1,5348 1,5348 1,5347 1,5348 1,5348 96-

C0(ug/mL) C(ug/mL) Guangxi 2,4991 2,4965 2,5071 4,6019 4,4968 4,4543 7,5284 7,6029 7,7022 102 Rev(%) 96 96 97 102 98 97 99 101 102

1,2288 1,2286 1,2286 1,2288 1,2286 1,2286 1,2288 1,2286 1,2286 96- Mƣờng C0(ug/mL) C(ug/mL) 2,1909 2,2096 2,2237 4,2192 4,2968 4,1904 7,2148 7,1672 7,3012 102 Lống 99 102 98 99 98 101 Rev(%) 98 96

166

99 (*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22.

Phụ lục C32. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp xác định eurycomanone trong mẫu nghiên cứu

0,5 1,0 2,0 Mẫu RevTB (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Cx(ug/mL) Thí nghiệm

2,8706 2,8708 2,8706 2,8706 2,8708 2,8706 2,8706 2,8708 2,8706 97- C0(ug/mL) C(ug/mL) Vũng Tàu 3,3682 3,3688 3,3713 3,8701 3,8684 3,8689 4,8712 4,8721 4,8701 101 Rev(%) 97 99 100 99 98 101 101 100 99

0,2623 0,2624 0,2622 0,2623 0,2624 0,2622 0,2623 0,2624 0,2622 97- Đắk C0(ug/mL) C(ug/mL) 0,7588 0,7611 0,7601 1,2604 1,2612 1,2626 2,2634 2,2615 2,2623 100 Nông Rev(%) 99 97 99 99 100 100 99 99 100

1,2352 1,2354 1,2351 1,2352 1,2354 1,2351 1,2352 1,2354 1,2351 98- C0(ug/mL) C(ug/mL) Hòa Bình 1,7308 1,7312 1,7302 2,2304 2,2307 2,2310 3,2354 3,2356 3,2360 101 Rev(%) 98 99 99 99 98 98 101 100 100

0,4201 0,4199 0,4202 0,4201 0,4199 0,4202 0,4201 0,4199 0,4202 97- C0(ug/mL) C(ug/mL) Nghệ An 0,9178 0,9182 0,9174 1,4187 1,4185 1,4179 2,4211 2,4215 2,4221 102 Rev(%) 97 99 101 99 98 100 100 99 102

4,7814 4,7822 4,7806 4,7814 4,7822 4,7806 4,7814 4,7822 4,7806 98- Bắc C0(ug/mL) C(ug/mL) 5,2764 5,277 5,2771 5,7822 5,7812 5,7816 6,7804 6,781 6,7801 101 Giang Rev(%) 99 98 99 100 99 101 99 101 99

1,3939 1,3937 1,394 1,3939 1,3937 1,394 1,3939 1,3937 1,394 98- C0(ug/mL) C(ug/mL) Hà Giang 1,8891 1,8879 1,8885 2,3917 2,392 2,3924 3,3929 3,3931 3,3921 101 Rev(%) 99 98 98 99 98 100 98 99 101

167

(*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22.