Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

…………***…………

NGUYỄN NGỌC HIẾU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI

THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

…………***…………

NGUYỄN NGỌC HIẾU

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI

THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Dương Ngọc Tú 2. PGS.TS. Dương Anh Tuấn

HÀ NỘI, NĂM 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn

khoa học của TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn. Các

kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Nguyễn Ngọc Hiếu

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Dương Ngọc

Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn, những người Thầy đã hướng dẫn tận tình,

chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới GS. VS. Châu Văn Minh và TS.

Nguyễn Văn Lạng, đã giới thiệu, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và

Công nghệ, Viện Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp CNC,

Ban Quản lý Khu CNC Hòa Lạc đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi

cho tôi trong thời gian làm luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Sinh dược, các Thầy,

Cô và bạn bè đồng nghiệp tại Viện Hóa học (đặc biệt là PGS. TS. Nguyễn Thị

Hoàng Anh, các bạn Đức, Thủy, Minh, Hiền, Dung...), các đồng nghiệp tại

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Vi sinh vật và Công

nghệ sinh học đã tận tình truyền thụ kiến thức, cùng phối hợp cũng như giúp

đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành các nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian

thực hiện luận án này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn

cổ vũ, luôn là nguồn động viên to lớn cho tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2019

Tác giả luận án

Nguyễn Ngọc Hiếu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

MỤC LỤC......................................................................................................... ii

DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi

DANH MỤC BẢNG......................................................................................viii

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... ix

DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................ x

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 5

1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật........... 5

1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học7

1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật ........................ 9

1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu............................................................... 9

1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh .................................................. 12

1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở

Việt Nam ......................................................................................................... 13

1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh

học thế hệ mới ................................................................................................. 14

1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật .......................................................... 14

1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh

thực vật ............................................................................................................ 15

1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia

oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa

L.) .................................................................................................................... 23

1.5.1. Thực vật học.......................................................................................... 23

1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học............................................ 26

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 33

2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 33

iii

2.1.1. Mẫu thực vật.......................................................................................... 33

2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa

học, lập hồ sơ lưu trữ....................................................................................... 34

2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật............................................. 35

2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật ............................. 35

2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự gene vùng ITS .......... 35

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu ......................... 37

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 37

2.2.2. Sắc ký cột (CC) ..................................................................................... 37

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................... 38

2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch

chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm................................... 39

2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và

chất sạch trong phòng thí nghiệm ................................................................... 39

2.3.2. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân đoạn

chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm ......................................................... 41

2.4. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm nội sinh từ thực vật .................. 42

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 44

3.1. Thực nghiệm phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật ....................... 45

3.1.1. Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................. 45

3.1.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana) ............... 51

3.1.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L) ................. 55

3.2. Thực nghiệm phân lập thành phần hóa học từ thực vật và nấm nội sinh

thực vật ............................................................................................................ 56

3.2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana) ............ 56

3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) ................ 62

3.2.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa) ................... 63

3.2.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.)................ 65

3.2.5. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Ngâu ta (nấm M.

hawaiiensis)..................................................................................................... 68

3.2.6. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây nghệ vàng (nấm F.

oxysporum) ...................................................................................................... 70

3.2.7. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (nấm F. solani)73

3.3. Thử hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các mẫu dịch chiết, phân đoạn và

chất sạch .......................................................................................................... 74

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 76

4.1. Kết quả phân lập thực vật và định danh các chủng nấm nội sinh thực vật76

4.2. Kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm của các dịch chiết

tổng, phân đoạn dịch chiết tổng và chất sạch thực vật, nấm nội sinh thực vật77

4.3. Kết quả nghiên cứu các thành phần hóa học của thực vật và nấm nội sinh

thực vật ............................................................................................................ 81

4.3.1. Thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A.

oligophylla) ..................................................................................................... 81

4.3.2. Thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................... 90

4.3.3. Thành phần hóa học của cây Trầu không (Piper betle L.).................... 92

4.3.4. Thành phần hóa học nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu .......... 94

4.3.5. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng ........ 97

4.3.6. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. sonani của Trầu không............ 102

4.4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học

thực vật và nấm nội sinh thực vật ................................................................. 104

4.4.1. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây

Ngâu và nấm nội sinh cây Ngâu ................................................................... 104

4.4.2. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây

Nghệ vàng và nấm nội sinh cây Nghệ vàng.................................................. 105

4.4.3. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây

Trầu không và nấm nội sinh cây Trầu không................................................ 106

KẾT LUẬN ................................................................................................... 107

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................... 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 111

DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tiếng Anh

Diễn giải

Carbon-13 nuclear

Phổ cộng hưởng từ hạt

13C-NMR

magnetic

nhân cacbon 13

resonance spectroscopy

Proton nuclear magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt

1H-NMR

resonance spectroscopy

nhân proton

Column chromatography

Sắc kí cột

Phổ tương tác 2 chiều

Correlation spectroscopy

COSY

đồng hạt nhân 1H-1H

Distortionless

DEPT

enhancement by

Phổ DEPT

polarisation transfer

Dimethyl sulfoxide

DMSO

Electron spray ionization

Phổ khối lượng ion hóa

ESI-MS

mass spectra

phun mù điện tử

Heteronuclear mutiple

Phổ tương tác dị hạt nhân

HMBC

bond connectivity

qua nhiều liên kết

High resolution

Phổ khối lượng phân giải

HR-ESI-MS

electronspray

cao phun mù điện tử

ionization mass spectrum

Phổ tương tác dị hạt nhân

HSQC

Heteronuclear single-

qua 1 liên kết

quantum coherence

NOESY

Nuclear overhauser effect

Phổ NOESY

Spectroscopy

Infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại

Inhibitory concentration at

Nồng độ ức chế 50% đối

IC50

50%

tượng thử nghiệm

RP18

Reserve phase C-18

Silica gel pha đảo RP-18

Thin layer

TLC

Sắc ký lớp mỏng

chromatography

TMS

Tetramethylsilane

Tetramethyl silan

Polymerase Chain

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PCR

Reaction

DNA, Deoxyribonucleic

ADN

Vật chất di truyền

Acid

ITS

Internal transcribed spacer

Môi trường nuôi cấy

PDA

Potato dextrose agar

khuẩn nấm gồm khoai tây,

đường, agar

Môi trường nuôi cấy

MEA

Malt extract Agar

khuẩn nấm gồm mạch nha

và agar

rRNA

Ribosomal RNA

RNA ribosome

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptetra litura) của các

mẫu dịch chiết cây ngâu.................................................................................. 77

Bảng 4.2.2. Hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea của các mẫu dịch chiết thực

vật .................................................................................................................... 78

Bảng 4.2.3. Hoạt tính ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết F. oxysporum80

Bảng 4.2.4. Khả năng ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết nấm nội sinh

thực vật ............................................................................................................ 81

Bảng 4.3.1.1 Dữ liệu NMR của hợp chất 7 (CDCl3)...................................... 90

Bảng 4.3.4.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 13 và 14................................ 96

Bảng 4.3.5.1. Kết quả GC-MS các chất 15-26................................................ 97

Bảng 4.3.5.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 28 và 29................................ 100 Bảng 4.3.5.3 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 30................................ 102 Bảng 4.3.6.1 Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 31............................... 104

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta................................................................................... 24

Hình 1.5.2. Cây Gội ổi .................................................................................... 24

Hình 1.5.3. Cây Trầu không............................................................................ 25

Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng............................................................................. 26

Hình 2.1. Các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật

Hình 3.1. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani ......... 45

Hình 3.2. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium sp. .............. 46

Hình 3.3. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Trichoderma atroviride 47

Hình 3.4. Cây phân loại của chủng Trichoderma atroviride .......................... 48

Hình 3.5. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Fusarium oxysporum ... 49

Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum............................ 51

Hình 3.7. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. gloeosporioides ..... 52

Hình 3.8. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. crassipes................ 52

Hình 3.9. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng M. hawaiiensis ........... 53

Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis................. 54

Hình 3.11. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Colletotrichum sp..... 55

Hình 3.12. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani ....... 56

Hình 3.3.1. Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính trừ sâu trong phòng ........ 75

thí nghiệm........................................................................................................ 75

Hình 3.3.2. Một số hình ảnh thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng nấm tại

phòng thí nghiệm............................................................................................. 75

Hình 4.2.1. Khả năng ức ché nấm của tinh chất curcumin ............................. 79

Hình 4.2.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của các

cặn chiết F. oxysporum ................................................................................... 80

Hình 4.3.5.1. Phổ sắc ký GC-MS của các chất 15-26.................................... 98

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta............................... 57

Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi .................................. 62

Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng................................. 64

Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không.......................... 66

Sơ đồ 3.2.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất từ nấm nội sinh cây ngâu ...................... 68

Sơ đồ 3.2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng............ 71

Sơ đồ 3.2.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không....... 74

MỞ ĐẦU

Chất lượng cuộc sống của con người ngày càng nâng cao, đòi hỏi các

sản phẩm nông nghiệp và môi trường an toàn. Tuy nhiên để giữ vững năng

suất, chất lượng nông sản, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, người ta lại phải

sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật, chủ yếu là các loại thuốc hóa học độc

hại, và cứ như vậy vòng luẩn quẩn tăng sản lượng, tăng đầu vào, nguy cơ sản

phẩm không an toàn và ô nhiễm môi trường lại tiếp tục diễn ra. Vì vậy việc

tìm kiếm các giải pháp phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ sản phẩm nông nghiệp dễ

sử dụng hơn, có hiệu lực trừ dịch hại cao hơn và thân thiện hơn với môi sinh

và môi trường đang được đặt ra với toàn thể nhân loại chúng ta.

Từ những thập niên cuối của thế kỷ XX, đầu thế kỷ XXI, các biện pháp

sinh học (biological control) bảo vệ sản xuất nông nghiệp ngày càng phát huy

tác dụng và dần được xác định là hướng biện pháp chủ đạo trong quản lý dịch

hại tổng hợp trong thời gian tới. Ưu điểm nổi bật nhất của các biện pháp sinh

học (ví dụ, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học) là hầu như không

độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh

học trong tự nhiên, ít gây tình trạng bùng phát dịch hại. Bên cạnh đó, thuốc

bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (thuốc BVTVSH, bio-pesticide) còn

mau phân hủy trong tự nhiên, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời

gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ

sạch cao và thời gian bảo quản, sử dụng ngắn như các loại rau củ, hoa quả…

Thêm nữa, các nguyên liệu để tạo thuốc BVTVSH thường có sẵn và rất phổ

biến ở mọi nơi, mọi lúc. Chi phí sản xuất thuốc BVTVSH thấp hơn so với

thuốc BVTV hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang

lại hiệu quả cao. Với những lợi ích mang lại, thuốc BVTVSH sẽ giúp người

nông dân “thân thiện” hơn với cánh đồng của mình để có thể thụ hưởng lợi

ích kinh tế lâu dài từ chính “người bạn” này.

Nấm nội sinh thực vật (nấm NSTV, Plant endophytic fungi) là những vi

sinh vật sống trong tế bào thực vật mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực

nào tới cây chủ. Nấm NSTV cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông

qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormones, tổng hợp

siderophores, cố định đạm hay qua hỗ trợ phytoremediation...[1]. Chúng được

xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn

chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh. Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một

số yếu tố bất lợi như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều hoạt chất được sinh

ra từ nấm NSTV cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả

năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô

thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng các hoạt chất quý

giá này do chính cây sản xuất, do nấm NSTV sản xuất hay là kết quả của mối

quan hệ tương sinh của các nấm NSTV có ích trong mô thực vật và cây chủ

sinh ra. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất biến dưỡng của nấm

NSTV không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn có khả

năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh

cho người và động vật. Vì vậy, nấm NSTV hiện đang được nghiên cứu sâu và

rộng trên thế giới và được coi như là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá

hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm. Kết quả thống kê gần đây, với

ước lượng 51% số hợp chất có hoạt tính được phân lập từ các chủng nấm

NSTV là hợp chất mới, đã cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng vô

cùng to lớn của nấm NSTV. Các hợp chất do nấm NSTV sản sinh ra là con

đường quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế, nông nghiệp vì

giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc (xanthones, anthraquinones,

pestalotheols, octadrides, dihydroxyanthones, pyrenocine, steroids...) với rất

nhiều hoạt tính mới [2,3]. Điều quan trọng nữa là nếu có thể khai thác được

nguồn nguyên liệu từ nấm NSTV sẽ tránh được việc khai thác cạn kiệt nguồn

tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các

loài thực vật quý hiếm, gây hậu quả xấu tới môi trường tự nhiên.

Việt Nam vẫn nổi tiếng thế giới về tiềm năng đa dạng sinh học cac loài

thực vật, với trên 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể các loài nấm, tảo,

rêu. rất nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam. Những công bố liên tục trong

những năm gần đây của các đoàn khảo sát, chuyên gia Việt Nam và quốc tế

về việc phát hiện các loài động thực vật mới tại Việt Nam càng khẳng định

giá trị tiềm ẩn vô tận của nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá này.

Từ kho tàng kinh nghiệm dân gian, chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm

trong việc nghiên cứu, tìm tòi, phát hiện và kết hợp tài tình các nguyên liệu

thực vật đa dạng thành các bài thuốc dân gian hết sức quý giá, vô cùng đặc

sắc, có hiệu quả đặc biệt trong việc chữa bệnh, năng cao sức khỏe con người,

bảo vệ mùa màng, diệt trừ sâu bệnh, côn trùng, động vật gây hại..... Với trình

độ phát triển khoa học công nghệ hiện nay, cần thiết phải tiếp tục tim tòi,

nghiên cứu, chọn lọc kinh nghiệm dân gian, khai thác nguồn tài nguyên thiên

nhiên kết hợp với sự hỗ trợ của công nghệ, thiết bị hiện đại để tạo ra các sản

phẩm mới, đưa giá trị sử dụng nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam lên tầm

cao mới, có giá trị hơn, hiệu quả hơn, được đánh giá cao cả về hàm lượng

khoa học công nghệ cũng như giá trị sử dụng.

Triển khai tiếp chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Hóa học (Viện

Hàn lâm KH&CN Việt Nam) và Viện Sinh dược và Công nghệ sinh học (Đại

học Tổng hợp Heirich-Heine Duesseldorf, CHLB Đức) về việc nghiên cứu hệ

thực vật Việt Nam để sàng lọc, phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính

sinh học, có tiềm năng sử dụng để chế tạo chế phẩm trừ sâu và nấm bệnh hại

cây trồng, cũng như mở rộng sang hướng đối tượng nghiên cứu còn rất mới

trên Thế giới cũng như tại Việt Nam là nấm nội sinh thực vật, chúng tôi đề

xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh

học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật” trên

bốn (04) loài thực vật Việt Nam bao gồm Ngâu ta (Aglaia duperreana

Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.), Nghệ

vàng (Curcuma longa L.) và ba (03) chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Ngâu

ta, nghệ vàng và trầu không.

Đề tài nghiên cứu có tính khoa học, tính thực tiễn và tính thời sự, được

thực hiện với mục tiêu là sàng lọc, phát hiện, chiết xuất, xác định cấu trúc các

chất có tiềm năng sử dụng làm thuốc trừ sâu và nấm bệnh hại cây. Các nội

dung nghiên cứu của Luận án bao gồm:

- Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn

loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây..

- Phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu

trúc các hợp chất hữu cơ thành phần.

- Thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các chiết phẩm và

cachợp chất hữu cơ thành phần.

- Hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm

NSTV như là một hướng đi mới nhanh hơn và hiệu quả hơn, một nguồn

tài nguyên vô tận mới để phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh

học có giá trị cao tại Việt Nam.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật

Theo nghiên cứu của nhà côn trùng học Xô viết N. N. Melnikov, có

trên 68.000 loài côn trùng có hại cho con người, động vật và thực vật. Số

lượng chủng vi sinh vật (nấm bệnh) có hại cũng không ít hơn. Các số liệu

thống kê cho thấy côn trùng và vi sinh vật có hại đã gây thiệt hại rất lớn cho

sản xuất nông nghiệp, với ước tính khoảng 1/3 tổng sản lượng lương thực

toàn cầu đã bị mất hàng năm do côn trùng và nấm bệnh, và thực tế nếu côn

trùng và nấm bệnh gây hại đã không được nghiên cứu và khống chế một cách

hệ thống thì mức độ thiệt hại còn lớn hơn rất nhiều (ước tính tới 37% tổng sản

lượn khoai tây, 22% tổng sản lượng cải bắp, 10% tổng sản lượng táo và 9%

sản lượng tổng đào quả toàn cầu sẽ bị hư hại) [1].

Tại Trung quốc, có 1.648 loại tác nhân có hại cho mùa màng, trong đó

có 724 loại nhân tố thực vật có hại, 838 loại côn trùng, mối mọt, 64 loại cỏ

dại và 22 loài gặm nhấm. Nếu không sử dụng thuốc BVTV, tổng sản lượng

hoa quả, rau màu và ngũ cốc sẽ bị mất tương ứng lần lượt là 78%, 54% và

32%. Sử dụng thuốc BVTV tại Trung Quốc đã góp phần giúp nước này thu

được thêm 89,44 triệu tấn ngũ cốc, 1,65 triệu tấn bông, 2,53 triệu tấn hạt lấy

dầu và 78 triệu tấn rau màu [2].

Theo đánh giá của Viện Lúa quốc tế (IRRI), côn trùng và nấm bệnh gây

thiệt hại khoảng 37% tổng sản lượng lúa thu hoạch hàng năm trên toàn cầu.

Một trong những trường hợp nấm gây bênh nổi tiếng nhất, thiệt hại

nghiêm trọng nhất trong lịch sử trồng trợt thế giới là bệnh Panama do chủng

nấm Fusarium cubense gây ra trên cây chuối. Bệnh Panama đã gần như xóa

sổ ngành nông nghiệp trồng chuối tại Châu Mỹ La tinh những năm đầu thế kỷ

20. Những căn bệnh mới do nấm gây ra tiếp tục đe dọa xóa sổ ngành công

nghiệp trồng chuối trị giá 11 tỷ USD trên toàn cầu [3].

Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã tạo thêm được 1/3 tổng

sản lượng nông sản toàn cầu. Nếu không có thuốc BVTV, sản lượng hoa

quả, rau màu và ngũ cốc toàn cầu có thể bị thiệt hại tới 78%, 54% và

32% [4].

Tại Mỹ, cứ 1 USD bỏ ra cho thuốc BVTV sẽ thu về 4 USD sản lượng

thu hoạch. Như vậy, với mức chi phí trung bình hàng năm đạt 10 tỷ USD cho

thuốc BVTV, nông dân Mỹ đã thu được thêm 40 tỷ USD nông sản đã có thể

bị mất bởi sâu bệnh.

Nhờ sử dụng thuốc BVTV để ngăn chặn, tiêu diệt côn trùng, sâu bệnh

hại mùa màng, các nước đang phát triển đã có thể sản xuất và xuất khẩu sản

lượng lương thực, nông sản nhiều hơn bao giờ hết. Diện tích sản xuất nông

nghiệp không ngừng được mở rộng, tới tận khu vực Amazon để trồng ngũ cốc

đến rừng nhiệt đới Indonexia để trồng cọ dầu. Theo công bố của FAO, cứ

tăng thêm 1% sản lượng lương thực là tương ứng với sự tăng thêm 1,8%

lượng sử dụng thuốc BVTV [4].

Theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO), thuốc

BVTV là bất kỳ hợp chất hoặc hỗn hợp dùng để ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc

khổng chế các nhân tố gây hại (như các vector gây hại cho người và động vật,

các loại động thực vật không mong muốn) trong quá trình sản xuất, chế biến,

bảo quản, vận chuyển và buôn bán lương thực, sản phẩm nông nghiệp, gỗ và

đồ gỗ, thức ăn chăn nuôi hoặc các chất dùng để tiêu diệt côn trùng, nhện, vật

gây hại trên và trong cơ thể động vật. Nó còn bao gồm các chất điều hòa sinh

trưởng thực vật, chất gây rụng lá, chất gây mất nước hay làm quả chín chậm.

Nó cũng bao gồm các chất được sử dụng trước và sau khi thu hoạch nông sản

để ngăn ngừa sự suy giảm chất lượng sản phẩm trong quá trình bảo quản và

vận chuyển [1, 3].

Thuốc BVTV có thể phân loại dựa vào vật đích tác dụng (thuốc diệt cỏ,

diệt côn trùng, trừ nấm, trừ động vật gặm nhấm, trừ chấy rận), dựa vào cấu

trúc hóa học (hữu cơ, vô cơ, tổng hợp) hoặc có nguồn gốc sinh học

(biopesticide), hay trạng thái vật lý (dạng rắn, lỏng, khí hóa lỏng, thuốc xông)

[2, 5].

Thuốc diệt côn trùng hóa học (chemical insecticides) có một số nhóm

thuốc (dựa theo tên của nhóm gốc có hoạt tính trừ bệnh) tiêu biểu như

organochlorine, organophosphate, carbamate,... Nhóm thuốc BVTV có nguồn

gốc sinh học (biopesticide) bao gồm các loại thuốc có nguyên liệu gốc tự

nhiên từ vi sinh vật, thực vật hay khoáng tự nhiên, hiện đang có xu hướng

phát triển nhanh chóng, gồm có các nhóm pyrethroid, rotenoid, nicotinoid,

strychnine, scilliroside.

Ngoài ra, thuốc BVTV có thể được phân loại thành loại dễ phân hủy

bởi vi sinh vật thành các chất ít gây hại hơn hoặc thuộc loại bền vững, khó

phân hủy, tồn tại nhiều năm, tích lũy trong các chuỗi thức ăn, gây độc cho cả

hệ sinh thái [2].

Hiện nay, trung bình hàng năm Thế giới tiêu thụ khoảng 3,5 tỷ kg thuốc

BVTV hóa học từ giai đoạn gieo trồng đến khi thu hoạch, bảo quản, trong đó

75% tổng tiêu thụ là tại các quốc gia đã phát triển, nhưng nhu cầu tiêu thụ tại

các nước đang phát triển đang không ngừng tăng mạnh [5].

1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh

học

Thực tế phải đối mặt với những vấn đề nguy hiểm, nan giải bới việc sử

dụng thuốc BVTV hóa học hiện nay đã đặt Thế giới vào bài toán phải sử dụng

thuốc BVTV hợp lý và hiệu quả hơn nữa, được kiểm soát chặt chẽ hơn nữa

cũng như hối thúc giới khoa học phải tìm kiếm, thay thế thuốc BVTV hóa học

bằng các biện pháp canh tác, các thế hệ thuốc BVTV mới an toàn hơn.

Các thế hệ thuốc BVTV trong tương lai sẽ phải có những đặc tính thiết

yếu như (1) có hoạt tính sinh học và hiệu lực diệt trừ sâu bệnh cao hơn nữa,

để có thể hạn chế tối đa liều lượng thuốc cần sử dụng, giảm thiểu tối đa ô

nhiễm môi trường. (2) Không mang độc tính (non toxic); (3) Không gây ô

nhiễm, thân thiện môi trường.

Theo định nghĩa của Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), thuốc

BVTV có nguồn gốc sinh học (Bio-pesticide) là các loại thuốc phòng trừ dịch

hại có nguồn gốc nguyên liệu tự nhiên (như thực vật, động vật, vi khuẩn, vi

rút, nấm và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng). Khái niệm này bao hàm

cả các chất sinh ra bởi gene được cấy vào đối tượng cây cần bảo vệ (cây

chuyển gene- GMO) nhằm tạo các kháng thể có khả năng phòng trừ dịch hại.

Thuốc BVTV sinh học (BVTVSH) hội tụ nhiều đặc tính phù hợp để có

thể thay thế thuốc BVTV hóa học, đã được giới khoa học toàn cầu tập trung

nghiên cứu, khám phá, sản xuất và sử dụng để khống chế, tiêu diệt, xua đuổi

các loại cỏ dại, bệnh dịch do côn trùng, nấm bênh gây ra.

So với thuốc BVTV hóa học, thuốc BVTVSH có các đặc tính ưu việt

sau: (1) có hiệu lực tiêu diệt sâu bệnh gây hại nhưng an toàn với con người và

động vật, không gây ô nhiễm, không tồn dư hóa chất; (2) có tính lựa chọn vật

chủ đích cao, an toàn cho các loài sinh vật có lợi, sinh vật thiên địch tự nhiên;

(3) từ nguyên liệu đến chất hoạt hóa đều là sản phẩm tự nhiên, do đó có thể

sản xuất bền vững, ổn định; (4) có thể hiệu chỉnh để nâng cao chất lượng sản

phẩm bằng công nghệ lên men, công nghệ snh học; (5) Hiếm khi xảy ra hiện

tượng kháng thuốc [7].

Trên thế giới hiện đã có hàng trăm nghìn loại thuốc BVTVSH được

thương mại hóa và sử dụng [8]. Mexico, Mỹ và Canada đang là nhóm quốc

gia sử dụng thuốc BVTVSH dẫn đầu, chiếm tới 44% tổng tiêu thụ toàn cầu,

tiếp theo lần lượt là Châu Âu, Châu Á, Châu Đại dương, Mỹ La tinh và

Châu Phi lần lượt chiếm 20%, 13%, 11%, 9% và 3% [9].

Tại Trung quốc, từ những năm 1990 đến nay, nền công nghiệp thuốc

BVTVSH có tốc độ tăng trưởng rất nhanh, trung bình từ 10% đến 20%/năm

với hàng nghìn loại sản phẩm được đăng ký bảo hộ, sản xuất và thương mại

[10].

Năm 2006, tổng tiêu thụ thuốc BVTVSH tại Trung Quốc đạt 145.000 tấn,

trong đó các loại thuốc Bt là 2%, các loại kháng sinh nông nghiệp là 9% và

thuốc trừ sâu thảo mộc là 5%. Dự kiến trong tương lai gần, tại Trung Quốc,

BVTVSH sẽ thay thế cho 20% tổng tiêu thụ thuốc BVTV hóa học [11].

Tất nhiên, mặc dù có rất nhiều lợi ích như đã neue trên, thuốc BVTVSH

vẫn tồn tại nhiều hạn chế cần khắc phục như thời gian phản ứng chậm, giá

thành cao, nhanh bị phân hủy, đã làm hạn chế tiềm năng phát triển và ứng

dụng thuốc. Cần thiết phải có thêm các giải pháp để cải thiện hình thức sản

phẩm và hạ giá thành sản xuất thuốc BVTVSH trong thời gian tới.

1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật

1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu

Từ xa xưa, nông dân ở nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng một số

loài thực vật chứa chất độc để trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng

và gia súc bằng cách phun lên cây hay dùng nước chiết để tắm cho gia súc.

Trên thế giới có khoảng 2000 loài cây có chất độc, trong đó có 10-12

loài cây được dùng phổ biến. Ở Việt Nam, đã phát hiện khoảng 335 loài cây

độc, gần 40 loài cây độc có khả năng trừ sâu (trong đó có 10 loài có khả năng

diệt sâu tốt) [12].

Những hợp chất trừ sâu thảo mộc thông dụng như rotenon và rotenoit,

arteminisinin, azadirachtin, cnidiadin, matrine, pyrethrin và nicotin đều là

những loại ancaloit, este, glucozit v.v... có trong một số bộ phận của một số

loài cây. Hàm lượng chất độc phụ thuộc loài cây, bộ phận cây, điều kiện sống

và thời gian thu hái chúng. Nói chung, các chất này rất dễ bị phân huỷ dưới

tác động của oxy hoá, ánh sáng (đặc biệt các tia cực tím), ẩm độ , nhiệt độ và

pH môi trường, nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường. Nhưng cũng

vì đặc tính này, nên điều kiện thu hái, bảo quản và kỹ thuật chế biến ảnh

hưởng nhiều đến chất lượng của sản phẩm [13].

Thuốc trừ sâu thảo mộc diệt côn trùng bằng con đường tiếp xúc, vị độc

hoặc xông hơi. Phổ tác động thường không rộng. Một số loại còn có khả năng

diệt cả nhện hại cây. Sau khi xâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ

thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng [13].

Trừ nicotin ( thuốc rất độc với động vật máu nóng, có thể gây ung thư,

nên đã bị cấm ở nhiều nước, trong đó có Việt nam) (Ryania và Sabadilla, ),

các thuốc thảo mộc nói chung ít độc đối với người và động vật máu nóng, các

sinh vật có ích và động vật hoang dã. Do thuốc trừ sâu thảo mộc nhanh bị

phân huỷ, nên chúng không tích luỹ trong cơ thể sinh vật, trong môi trường

và không gây hiện tượng sâu chống thuốc.

Thuốc thảo mộc rất an toàn đối với thực vật, thậm chí trong một số

trường hợp chúng còn kích thích cây phát triển.

Do việc thu hái bảo quản khó khăn, giá thành đắt, nên trong một thời

gian dài, các thuốc trừ sâu thảo mộc đã bị các thuốc trừ sâu hoá học lấn át.

Ngày nay, với yêu cầu bảo vệ môi trường ngày càng được nâng cao, cộng với

kỹ thuật gia công được phát triển, nên nhiều thuốc trừ sâu thảo mộc được

dùng trở lại, đã đem lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần bảo vệ môi trường.

Nhiều chất mới được phát hiện dùng làm thuốc trừ sâu như tinh dàu chàm,

tinh dàu bạch đàn, tinh dầu tỏi v.v... [13].

Một số hoạt chất thảo mộc được dùng làm thuốc trừ sâu thảo

mộc hiện nay như[13]:

Pyrethrin: có trong hoa cây cúc sát trùng Chrysanthemun

leucanthemun và các cây Chrysanthemun khác. Tác động mạnh đến côn

trùng bằng con đường tiếp xúc; tác động yếu hơn đến các loài nhện, bằng

cách bịt kênh vận chuyển ion Na+ , kéo dài giai đoạn mở, vì thế, côn trùng bị

quật ngã và chết nhanh. Thuốc được dùng trừ côn trùng và nhện trên rau, chè,

nhiều cây trồng, cây cảnh; côn trùng ký sinh trên gia súc và động vật trong

nhà. Có độ độc rất thấp với người, động vật máu nóng và môi trường. Ngày

nay, bắt chước các pyrethrin tự nhiên, người ta đã tổng hợp ra vài chục hợp

chất pyrethroid khác, trở thành một nhóm thuốc trừ sâu lớn, có nhiều ưu điểm

hơn pyrethrin tự nhiên.

Rotenon và các rotenoid: là các alkaloid có trong rễ, thân lá, hạt của

một số loài cây thuộc họ Papilionaceae ( đặc biệt có nhiêu trong rễ cây Derris

spp., nhất là Derris eleptica).

Rotenon và các rotenoid tác động đến côn trùng (rệp muội, bọ trĩ, ngài,

các bọ cánh cứng) và nhện bằng con đường tiếp xúc mạnh và vị độc. Ngoài ra

còn dùng để trừ kiến lửa, muỗi ở đầm lầy; trừ ve bét, dòi ký sinh trên động

vật; trừ côn trùng trong nhà và trừ cá dữ trong ruộng nuôi tôm. Triệu chứng

trúng độc thể hiện nhanh. Thuốc ít độc với động vật có vú ngoại trừ thuốc

xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp và nhiễm độc máu. Rotenon và các rotenoit

ít độc với các động vật khác, nhưng rất độc với cá. Ở Đồng bằng sông Cửu

Long rễ cây Derris elleptica được băm nhỏ rải xuống ruộng để trừ cá dữ

trong ruộng nuôi tôm rất hiệu quả và an toàn.

Azadirachtin: là một trong 4 chất chính có tác dụng diệt sâu của dịch

chiết hạt (chủ yếu) và lá cây neem, một loài cây có nguồn gốc ở Ân độ,

Myanma, sau được trồng ở Tây Phi. Ở Việt nam, cây neem cũng mọc rải rác

trong toàn quốc; đặc biệt mọc thành rừng hàng trăm ha ở Nam Trung bộ.

Dịch chiết cây neem được dùng rộng rãi ở Ân độ, Trung quốc và nhiêu quốc

gia khác.

Cấu trúc của Azadirachtin tương tự ecdyson ( một homon lột xác của

côn trùng); có thể là chất đối kháng của ecdyson, ngăn cản quá trình lột xác

của côn trùng qua các tác động: làm giảm hay ức chế hoàn toàn khả năng sinh

sản, hoặc làm giảm khả năng trứng nở; rút ngắn thời gian sống của trưởng

thành, ngăn con cái đẻ trứng, trực tiếp diệt trứng; gây ngán cho ấu trùng,

trưởng thành; làm sâu non không biến thái, tác động tới sự lột xác giữa các

tuổi sâu. Ngoài ra Azadirachtin còn có tác dụng gây ngán và xua đuổi. Bên

cạnh tác dụng diệt côn trùng, Azadirachtin còn diệt được cả tuyến trùng và trừ

nấm. Thuốc hầu như không độc với cá, động vật thuỷ sinh; ong mật, chim và

động vật hoang dã khác.

Matrine: hoạt chất có hiệu lực diệt sâu mạnh nhất trong dịch chiết cây

khổ sâm. Matrine có phổ tác động rộng, diệt được nhiêu loài côn trùng chích

hút và miệng nhai ; ngòai ra còn diệt được cả nhện hại cây. Matrine gây độc

bằng cách làm tê liệt hệ thần kinh trung ương, bịt lỗ thở côn trùng làm cho

côn trùng không hô hấp được và bị chết nhanh chóng. Ngoài ra, nhờ tác động

gây ngán và xua đuổi, nên thuốc có hiệu lực dài. Matrine không có tác dụng

nội hấp và xông hơi. Thuốc ít gây độc với người, động vật máu nóng và các

loài sinh vật khác. Bị phân huỷ nhanh trong môi trường.

Arteminisinin: Có khoảng 0.3 - 0.5% trong thân lá khô của cây thanh

hao hoa vàng (Artemisia annua L.). Arteminisinin được dùng chủ yếu trừ

bệnh sốt rét cho người. Gần đây Arteminisinin được dùng để trừ sâu tơ, sâu

xanh, sâu khoang hại rau; rầy xanh hại chè; rệp muội , bọ trĩ hại cam chanh.

Thuốc hầu như không ảnh hưởng đến cá và động vật thuỷ sinh; ong mật, chim

và động vật hoang dã. Không gây độc cho cây.

Cnidiadin: Thuốc có phổ tác động rộng, trừ được nhiêu loài sâu hại

thuộc bộ cánh phấn và nhện đỏ. Triệu chứng ngộ độc thể hiện nhanh. Thuốc ít

độc với người và động vật máu nóng cũng như các loài sinh vật khác.

Eucalyptol: Có trong cây bạch đàn. Phổ tác động rất rộng; trừ được

nhiêu loài sâu và nhện. Thuốc ít gây độc với người, động vật máu nóng và các

loài sinh vật khác. Bị phân huỷ nhanh trong môi trường.

1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh

Đã có rất nhiều hợp chất nguồn gốc thảo mộc được dùng để trừ bệnh

hại cây trồng, an toàn với cây trồng, con người, môi sinh và môi trường [13].

Các hợp chất có hiệu lực kìm hãm sợi nấm phát triển, không để lây lan,

trừ nhiều loài nấm và vi khuẩn hại lúa, rau và nhiều loại cây trồng khác như

Acide acrylic và Acide ginkgoic.

Các tổ hợp dầu thực vật có tác dụng trừ nấm tiếp xúc như Eugenol ( có

trong dầu đinh hương Syzygium aromaticum; dầu quế Cinnamomum spp. và

hương nhu Ocimum spp.) để trừ bệnh khô vằn hại lúa; giả sương mai và phấn

trắng hại dưa chuột, sương mai cà chua; đốm nâu, đốm xám hại chè; phấn

trắng hại hoa hồng.

TP-Zep (dầu màng tang, dầu xả, dầu hồng, dầu hương nhu, dầu chanh)

được dùng để trừ mốc sương cà chua; đốm nâu, đốm xám, thối búp chè; phấn

trắng, đốm đen hoa hồng; đạo ôn, bạc lá lúa; nấm muội đen Capnodium sp.

hại nhãn [13].

1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở

Việt Nam

Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2009,

có 344 sản phẩm được đăng ký vào danh mục các loại thuốc BVTVSH lưu

hành tại Việt Nam, trong đó có 221 sản phẩm thuốc trừ sâu và 66 sản phẩm

thuốc trừ nấm. Số lượng thuốc BVTVSH được đăng ký gia tăng rất nhanh,

nếu năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm, nay đã gấp hơn 150 lần. Tuy vậy, dù số

lượng các thuốc BVTVSH tăng nhanh nhưng tổng doanh thu hàng năm chỉ

chiếm dưới 5% tổng doanh thu các loại thuốc BVTV nói chung. Nghĩa là hiện

nay dù thuốc BVTVSH tốt, an toàn môi trường nhưng người nông dân lại ít

sử dụng.

Tuy vậy, số loại chế phẩm sinh học (CPSH) dùng cho sản xuất phân

bón hữu cơ sinh học, phân bón vi sinh, hiện nay rất đa dạng về chủng loại và

số lượng ở Việt Nam. Theo số liệu của Cục Trồng trọt, tính đến tháng 8/2012,

Việt Nam đã có 1.694 các loại phân hữu cơ. Tuy nhiên chỉ có một số ít sản

phẩm có chất lượng và uy tín, còn lại không thể kiểm soát được chất lượng

hay chất lượng không đảm bảo. Điều này đã làm giảm lòng tin của nhà nông

vào loại sản phẩm này, làm thiệt thòi cho người sản xuất CPSH nghiêm túc,

ảnh hưởng đến xu hướng khuyến khích sử dụng CPSH, nhất là việc dùng

phân bón hữu cơ cho cây trồng.

Tiềm năng sử dụng các CPSH trong nông nghiệp rất lớn, là hướng đi

đúng đắn, hướng tới nền nông nghiệp hữu cơ, sinh thái bền vững và thân thiện

với môi trường. Có thể kế đến một số loại thuốc BVTVSH hiện có tại Việt

Nam như:

 Sản phẩm từ cây neem: VINEEM 1500 EC (Chiết xuất từ nhân hạt

neem (azadirachta indica A.Juss) chứa azadirachtin), Neemaza,

Neemcide 3000 SP, Neem Cake, trừ nấm, côn trùng trong đất và rễ cây

trồng rất tốt.

 Hoạt chất rotenone được chiết xuất từ hai giống cây họ đậu là derris

elliptica benth và derris trifoliate, dùng để diệt rầy.

 Chế phẩm Đầu trâu Bihopper (hoạt chất retonone) đóng vai trò diệt

tuyến trùng và chế phẩm Olicide (oligo - sacarit) đóng vai trò tăng sức

đề kháng bệnh cây trồng.

1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV

sinh học thế hệ mới

1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật

Nấm nội sinh thực vật (Endophytes, Endophytic fungi) là những vi sinh

vật sống ở mô sâu thực vật nhưng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi

cho cây [14, 15]. Endophytes cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông

qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormone [16], tổng hợp

siderophores [17], cố định đạm [18], hay qua hỗ trợ phytoremediation [19].

Endophytes có thể được truyền từ một thế hệ kế tiếp thông qua các mô của vật

chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật [20]. Nghiên cứu đã cho thấy rằng các sản

phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn endophytic có chống vi khuẩn, chống ung

thư, chống oxy hóa, chống tiểu đường, ức chế miễn dịch, chống huyết khối,

chống viêm và chống bệnh Alzheimer và một số bệnh khác [21].

Giữa nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tương

sinh, nấm nội sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến

hóa của cây. Sự tương tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá

trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi

sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng nấm nội sinh hữu ích. Chúng được

xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn

chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [22,23].

Nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ.

Ở một số loài cây cỏ có nấm nội sinh sống, người ta nhận thấy chúng có khả

năng gia tăng sức chịu đựng khô hạn hoặc chịu được độc tính của nhôm trong

nguồn nước, trong môi trường sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số

yếu tố bất lợi cho kí chủ như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm

tự nhiên được sinh ra từ nấm nội sinh cũng đã được quan sát, theo dõi và

được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh

khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra

rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối

quan hệ tương sinh của các nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ

sinh ra [21].

1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội

sinh thực vật

 Trên thế giới:

Nếu năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20

năm sau, năm 1975 đã tìm ra được 5.000 chất kháng sinh. Đến nay đã biết

được hơn 13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên [19].

Từ những năm 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên được phân lập

từ cây Taxus brevifolia, nấm này sản xuất paclitaxel - chất ức chế các thoi

phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tương tự như

paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Một số nhà khoa

học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ và

tìm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất được sử dụng hiệu quả nhất trong

điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) do nấm nội sinh tổng hợp. Chi

thông đỏ (Taxus) luôn là một nguồn giàu nấm nội sinh [24,25, 26].

Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hàng trăm loài

nấm nội sinh từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói

các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát

hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau và với cây chủ. Những nấm

đã được biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis

microspora. Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, người ta

cũng đã phát hiện được sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập

từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp.,

Pestalotiopsis sp. và Truncatella sp. [24,25, 26].

Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn

nội sinh Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 được phân lập từ cây

Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi

khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M. tuberculosis đa kháng và một số

vi khuẩn kháng thuốc khác. Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 phát triển

trong lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh

kakadumicin và echinomycin đều cho tác động kháng P. falciparum với

LD50=7-10ng/ml [27, 28, 29].

Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng nấm nội sinh cũng được công

nhận là nguồn phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học. Một vật

chủ có thể phân lập được rất nhiều các chủng nấm nội sinh khác nhau [30].

Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng nấm nội sinh

Cryptospriopsis quercina được phân lập từ cây Tripterigeum wilfordii, nấm

này có thể sản xuất cryptocandin và cryptocin. Trong đó, cryptocandin kháng

một số nấm gây bệnh cho người như Candida albicans, Trichophyton sp. và

chống một số nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis

cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số nấm gây

bệnh thực vật [93]. Cùng năm 2003, Taechowisan và cộng sự đã nghiên cứu

về endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia

galanga [28, 29].

Năm 2005, Raviraja đã phân lập được mười tám loài nấm nội sinh được

phân lập từ vỏ cây, thân và lá phân đoạn của năm loài cây thuốc ở Tây Ghats

của Ấn Độ: Curvularia clavata, C. lunata, C. Pallescens, Fusarium

oxysporum... Nấm nội sinh đã được tìm thấy nhiều nhất trong các đoạn lá, chứ

không phải là phân khúc thân cây và vỏ cây. Phần lớn các loài nấm nội sinh

đã được tìm thấy trong cây Callicarpa tomentosa thuộc chi Tử châu, họ Hoa

môi (11 loài), trong khi cây Lobelia nicotinifolia thuộc phân họ Lỗ bình, họ

Hoa chuông (5 loài) [31].

Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra nấm Acremonium (2F09P03B) từ

Huperzia serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức

chế enzyme acetylcholinesterase, và được dùng trong điều trị bệnh

Alzheimer [32].

Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập được Fusarium solani từ

Camptotheca acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9-

methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung

thư [33].

Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về

endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa). Các chất dinh dưỡng trong thân

rễ của cây nghệ là môi trường sống đa dạng cho các nhóm vi khuẩn khác

nhau. Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có thể thúc đẩy tăng trưởng. Trong

nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp. được phân lập từ thân

rễ củ nghệ và cả hai chủng đã được tìm thấy có khả năng để sản xuất Indole 3

acetic acid qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - high-

performance liquid chromatography) [17].

Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện nấm nội sinh Fusarium

oxysporum phân lập từ cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B

dùng để điều trị bệnh tim mạch [10].

Năm 2014, Lena Hammerschmidt và cộng sự của Viện Sinh dược và

Công nghệ Sinh học, Đại học Heinrich-Heine, Duesseldorf, Cộng hòa Liên

bang Đức phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các dịch chiết của

nấm nội ký sinh Acremonium strictum Gams, phân lập từ cây Đước đôi

(Rhizophora apiculata Blume) thu hái tại Việt Nam. Trong đó có 5 dẫn xuất

polyketide mới 60-hydroxypestalotiopsone C (1), acropyrone (2),

bicytosporone D (3), waol acid (4), và pestalotiopene C (5) và 7 hợp chất đã

biết (6-12). Các hợp chất 6, 7 và 9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ

trung bình đối với hai dòng tế bào ung thư ở người là ung thư biểu mô buồng

trứng nhạy cảm với cisplatin (A2780) và dòng kháng cisplatin (A2780 CisR),

trong khi chỉ có chất 9 biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với

Staphylococcus aureus với giá trị MIC 14,3 µM [25].

Có thể liệt kê các hoạt tính sinh dược từ sản phẩm thứ cấp khi lên men

nấm nội sinh:

Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh

nấm nội sinh phân lập từ cây ngập mặn ở một số vùng địa lý khác nhau có thể

tổng hợp được các chất gây độc và tiêu diệt tế bào ung thư. Cyclic

depsipeptides bionectriamides A-C được tách chiết từ chủng Bionectria

ochroleuca được phân lập từ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) ở Hải

Nam, Trung Quốc [10].

Tiêu diệt vi sinh vật: Các hợp chất mới có tính diệt khuẩn do nấm nội

sinh sản xuất có thể sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, giúp khắc phục hiện

tượng nhờn thuốc của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Các nhà khoa học đã tìm

thấy nhiều hợp chất có nguồn gốc từ nấm nội sinh có khả năng tiêu diệt một

dải rộng các loài vi khuẩn gây bệnh. Fusarium incarnatum được phân lập từ

cây Cúc tần (Pluchea indica) ở đảo Hải Nam, Trung Quốc có khả năng sinh

ra equisetin [4].

Chất chống oxi hóa: Chất chống oxi hóa thường được tìm thấy ở các

cây dược liệu, rau và hoa quả. Chất chống oxi hóa thường được xem như các

tác nhân giúp phòng tránh và chữa trị bệnh như ung thư, bệnh tim, tăng

huyết áp, tiểu đường, run chân tay và mất trí nhớ, lão hóa… Thành phần

phenol từ nấm nội sinh có tác dụng chống oxi hóa cao. Loài nấm Phomopsis

amygdale phân lập từ cây ngập mặn ở Karankadu (Ấn Độ), và Trichoderma

được tìm thấy trong lá cây ngập mặn Aegiceras corniculatum có thể sinh ra

các chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. Nấm nội sinh Alternaria sp. R6

phân lập từ rễ cây ngập mặn loài Myoporum bontioides A có khả năng tiết ra

các chất chuyển hóa resverratrodehydes A&C chống các gốc tự do

ABTS&DPPH [34].

Ức chế α-glucosidase: Các chất ức chế α-glucosidase có thể làm giảm

sự hấp thụ carbohydrate từ bữa ăn và ngăn chặn tăng đường huyết sau khi ăn.

Các chất này có thể được sử dụng để điều trị tiểu đường, béo phì. Hai chất

mới được tìm thấy từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum phân lập từ loài

cây ngập mặn Kandelia candel ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc (6’-O-

desmethylterphenyllin, 3-hydroxy-6’-O-desmethylterphenyllin) có hoạt tính

ức chế α-glycosidase rất mạnh, và có hiệu quả cao hơn cả chất đối chứng

dương genistein. Hợp chất 07H239 từ nấm Xylaria sp. BL321 có hoạt tính ức

chế α-glucosidase khi thử ở nồng độ cao. Ngoài ra, các chất chuyển hóa của

vermistatin, 6-demethylpenisimplicissin và 2-epihydroxyldihydrovermistatin

từ nấm nội sinh Penicillium sp. HN29-3B1 (phân lập từ cây Cerbera

manghas) cũng biểu hiện hoạt tính kháng cao [25].

Ức chế acetylcholinesterase: Chất ức chế acetylcholinesterase (AChE)

hiện sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Alzheimer. Tuy nhiên, hiện vẫn

chưa tìm được loại chất AChE có tác dụng mạnh, lâu dài mà ít tác dụng phụ

nhất. Sporothrin A từ nấm nội sinh Sporothrix sp. có biểu hiện ức chế AChE

rất mạnh. Hai terphenyls từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum (ZH4-E2)

cũng có hoạt tính ức chế AchE. Ngoài ra, họ đang nghiên cứu các hợp chất do

nấm nội sinh của cây ngập mặn sản sinh ra, chủng Penicillium sp. sk5GW1L

và Penicillium sp. sk14JW2P, có tác dụng ức chế AChE như arigsugacin I,

arigsugacin F và territrem B [25].

Hoạt tính chống viêm: Hợp chất chống viêm không chứa steroid rất cần

thiết trong điều trị các bệnh viêm. Nấm nội sinh Irpex hydnoides, Aspergillus

flavus, Schizophyllum commune, Neurospora crassa, Hypocrea lixii,

Pestalotiopsis microspora, Aspergillus oryzae và Meyerozyma guilliermondi

phân lập từ cây ngặp mặn có thể sản sinh ra các chất chống viêm có hoạt tính

tương đương thuốc Indomethacin [25].

Tiêu diệt vi khuẩn lao mycobacteria: vi khuẩn Lao phổi đang trở nên rất

nguy hiểm khi xuất hiện các dạng vi khuẩn kháng thuốc, do đó việc tìm ra các

chất mới thay thế trở thành vấn đề cấp bách. Nấm nội sinh Fusarium sp. DZ-

27 phân lập từ thân cây Kandelia candel (Hải Nam, TQ) có thể sinh ra axit

fusaric. Các thử nghiệm chống vi khuẩn lao cho thấy rằng hỗn hợp axit

fusaric với muối cadmium và muối đồng của nó thể hiện hoạt tính tiêu diệt rất

cao hai chủng vi khuẩn lao Mycobacterium bovis BCG và M.tuberculosis

H37Rv [7]. Nấm nội sinh Nigrospora sp. phân lập từ cây Bruguiera

sexangula có thể sản sinh anthraquinones có tác dụng phòng bệnh cao chống

lại rhino virus [35].

Nhiều nấm nội sinh trong cây đã được phân lập, chúng có khả năng sản

sinh những chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng

nấm, kiềm hãm khối u, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.

Fusarium sp. là nấm phân lập từ cây Selaginella pallescens, được thu

nhập từ vùng Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất được

một pentaketide mới là CR 377 cho tác dụng mạnh trên C. albicans [24].

Pestralotiopisis microspora thường gặp ở rừng mưa nhiệt đới, sản xuất

nhiều chất có tác dụng sinh học, một trong những chất này là axit ambuic có

tác dụng kháng nấm. Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã

được phân lập từ các nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất

các kháng sinh kháng nấm.

Muscodor albus là nấm được phân lập từ cành của cây Quế

(Cinnamomum zeylanicum), nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức

chế vi khuẩn và nấm. Thành phần chính của những hợp chất này đã được xác

định cấu trúc hóa học bằng sắc ký khí ghép với khối phổ (GC-MS), từ đó

được tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp được có hiệu quả kháng khuẩn,

kháng nấm, không độc với người [36].

Nodulisporium sp. được phân lập từ cây Bontia daphnoides sản xuất

hợp chất nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh,

nhặng [30].

 Ở Việt Nam:

Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nước đã phân lập được 6 chủng

nấm nội sinh từ vỏ cây thông đỏ. Đây là loài thực vật đặc hữu có ở Việt Nam,

từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng như một vị thuốc. Trong đó đáng chú ý là

chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai. có mặt ở tất cả các mẫu

vỏ của cây thông đỏ được lấy mẫu. Chúng phù hợp nhất với hình thái chủng

nấm Pestalotiopsis sp. được tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ ở Mỹ và được các

nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bản mỏng

cùng với chất taxol chuẩn [6].

Năm 2005, Lê Mai Hương cùng các cộng sự của mình đã phân lập,

sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên

Tử, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chủng nấm nội sinh trong đó

có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính

kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính

kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm

(chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập). Từ 32 chủng có hoạt tính, bằng

phương pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn được 9 chủng có hoạt tính

mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 có hoạt tính cao nhất,

kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum [20].

Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về nấm nội sinh

trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella

Lour.) thu được chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất

ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vi sinh vật, độc

tế bào, chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính

kháng S.aureus với MIC=25mg/ml. Chất ergosterol peroxid biểu hiện hoạt

tính độc tế bào mạnh với cả 3 dòng tế bào thử là ung thư gan, ung thư màng

tử cung và ung thư màng tim [37].

Năm 2009, Phạm Quang Thu và cộng sự cũng đã nghiên cứu vi sinh

vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các

dòng Keo tai tượng khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế. Phân lập được 8

chủng vi khuẩn nội sinh và 13 chủng nấm nội sinh từ 35 dòng Keo tai tuợng

khảo nghiệm tại Thừa Thiên Huế, trong đó có 15 chủng gồm vi khuẩn và

nấm nội sinh trên tổng số 21 chủng có hoạt tính ức chế nấm Ceratocystis sp.

ở mức độ mạnh và rất mạnh và chỉ có 8 trên tổng số 21 chủng ức chế nấm

Corticium salmonicolor ở mức dộ mạnh và rất mạnh [38].

Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga và cộng sự sàng lọc các chủng nấm nội

sinh thực vật trên cây ngũ sắc (Lanata camara L.) thu được chủng

Pseudeurotium NS-T1 kháng C. albicans, trên cây mã đề (Plantago major L.)

thu được chủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng C.

albicans và MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu được chủng

Trichoderma TT-L1 kháng C. albicans và MRSA; trầu (Piper betle L.) thu

được chủng Fusarium TR-T1 kháng C. Albicans [16].

Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc Viện Hóa học các Hợp chất Thiên

nhiên đã phân lập được rất nhiều nấm nội sinh, nhiều nhất ở lá (50 chủng),

thân (43 chủng), cành (39 chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng).

Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết 68 chủng nấm nội sinh, kết quả có 17

mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung thư như mẫu chiết

của các chủng SHT4, SHT6, SHT9…Bằng phương pháp phân loại hình thái

và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma

aureoviride SHT06; Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101

và Gongroniella butleri SHT106. Hợp chất SHT46.1 thể hiện hoạt tính gây

độc dòng tế bào ung thư cơ vân với giá trị IC50 là 4,19 μg/ml. Hợp chất SHT

101.1 biểu hiện khả năng kháng mạnh vi khuẩn S. aureus với MIC là 25

μg/ml. Hợp chất SHT 101.2 có hoạt tính gây độc 2 dòng tế bào ung thư phổi

và ung thư cơ vân với giá trị IC50 tương ứng là 4,0 và 3,06 μg/ml. Kết quả

thực nghiệm cho thấy các chủng nấm lựa chọn đều có khả năng ức chế sâu

bệnh với tỉ lệ tương đối cao, từ 11,4-31,4% so với đối chứng [6].

Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã phát hiện ra môi trường nuôi

cấy thích hợp cho nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum được phân lập trên

Thông đỏ (Taxus wallichiana) tại vùng Lạc Dương, Lâm Đồng và lượng taxol

sinh ra ở môi trường nuôi cấy là 250,98 mg/kg khối lượng khô [26].

1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia

oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma

longa L.)

1.5.1. Thực vật học

 Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre):

Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta (nguồn internet)

Đặc điểm thực vật: Cây nhỡ có thể cao 4-7m. Lá kép lông chim lẻ. Hoa

mọc thành chùm ở kẽ lá, nhỏ màu vàng, rất thơm. Quả hạch màu đỏ. Hạt có

áo hạt.

Phân bố: Cây được trồng khắp nơi làm cảnh và lấy hoa để ướp chè.

Công dụng: Ngoài công dụng dùng ướp chè cho thơm, hoa và lá ngâu

dùng chữa sốt, vàng da, hen suyễn. Lá tươi dùng nấu tắm ghẻ.

 Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.):

Hình 1.5.2. Cây Gội ổi (nguồn internet)

Đặc điểm thực vật: Cây gỗ lớn, cao 20 - 25m. Lá kép lông chim lẻ. Hoa

có đường kính khoảng 2mm. Quả gần hình cầu, màu nâu hay vàng, chia 2 ô;

mỗi ô chứa 1 hạt có áo hạt trắng hay nâu.

Phân bố: Loài phân bố ở Việt Nam, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia và

Philippin. Ở Việt Nam có gặp tại Đồng Nai, An Giang và Kiên Giang.

Công dụng: Gỗ được sử dụng trong xây dựng và đóng đồ đạc thông

thường.

 Cây Trầu không (Piper betle L.) họ Hồ tiêu (Piperaceae):

Hình 1.5.3. Cây Trầu không (nguồn internet)

Đặc điểm thực vật: Cây nhỡ leo nhẵn. Lá có cuống có bẹ, phiến hình

trái xoan. Hoa khác gốc, mọc thành bông. Quả mọng lồi, tròn, có những lông

mềm ở đỉnh.

Phân bố: Cây gốc ở Malaixia, được trồng rộng rãi để lấy lá ăn trầu. Lá

thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô, có khi tán bột, dùng dần.

Công dụng: Vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm; có tác dụng trung

hành khí, khư phong tán hàn, tiêu thũng chỉ thống, hoá đàm, chống ngứa.

Trầu không được xem như là thuốc làm săn da, làm chất kích thích, làm chất

lợi nước bọt và xem như có tác dụng dự phòng chống bệnh lỵ và sốt rét.

 Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.):

Đặc điểm thực vật: cao khoảng 70 cm. Thân rễ (thường gọi củ Nghệ)

hình trụ hay hình bầu dục, phân nhánh, có màu vàng tươi. Lá đơn, mọc từ

thân rễ. Bẹ lá hình lòng máng, dài 18- 28 cm, ôm sát vào nhau tạo thành một

thân khí sinh giả có màu xanh.

Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng (nguồn internet)

Phân bố: Gốc ở Ấn Độ, được trồng phổ biến tại Việt Nam, lấy thân rễ

làm gia vị và làm thuốc.

Công dụng: Nghệ có vị đắng, cay, mùi thơm hắc, tính ấm; có tác dụng

hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Người ta cũng biết được là curcumin có

tác dụng tiêu mủ, lên da non, tác dụng thông mật, làm tăng sự bài tiết mật của

tế bào gan, phá cholesterol trong máu. Tinh dầu Nghệ có tác dụng diệt nấm

ngoài da và cũng như curcumin có tác dụng kháng khuẩn.

1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

1.5.2.1. Cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre)

Năm 2007, Bo-Jun Xie và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất:

agladupol A–E (đánh số từ 1–5 trong hình dưới đây) [39].

Năm 2012, nghiên cứu của Heng Zhang và cộng sự đã cho biết dịch

chiết methanol của cành lá Aglaia duperreana có hoạt tính tiêu diệt ốc bươu

vàng Pomacea canaliculata với giá trị LC50 33.4 μg/mL. Trong đó, cặn chiết

ehyl acetate (LC50 53.6 μg/mL) thể hiện hoạt tính cao hơn các cặn chiết còn

lại. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của cặn chiết này, nhóm tác

giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất, đánh số thứ tự trong

hình minh họa dưới đây: (20R)-3β-hydroxy-lup-28,29-dioic acid (số 6),

betulinic acid (số 7), 24(R),25-dihydroxydammar-20-en-3-one (số 8), ursolic

acid (số 9), obtusilin (số 10), (24R)-cycloartane-3α,24,25-triol (số 11),

cabraleone (số 12), ocotillone (số 13), shoreic acid (số 14), 3-hydroxy-4',5,7-

trimethoxyflavone (số 15), 2,3-dihydro-5-hydroxy-4',7-dimethoxyflavone (số

16), naringenin trimethyl ether (số 17), (2R,3R)-(+)-4',5,7-

trimethoxydihydroflavonol (số 18), (+)-eudesmin (số 19), (+)-odorine (số 20)

và (+)-odorinol (số 21). Naringenin trimethyl ether biểu hiện hoạt tính đáng

kể với giá trị LC50 là 3.9 μg /mL, cao hơn so với chất đối chứng saponin ở trà

xanh (LC50 = 4.5 μg/mL) [40].

1.5.2.2. Cây Gội ổi (Aglaia oligophylla)

Năm 2003, Gerhard Bringmann và cộng sự đã phân lập được 4 hợp

chất: rocaglamide (số 22), 6-demethoxy-6,7-methylendioxyrocaglamide (số

23), 6-demethoxy-10-hydroxy-11-methoxy-6,7-methylendioxyrocaglamide

(số 24) và cyclorocaglamide (số 25). Trong đó hợp chất 3 có tác dụng ức chế

ấu trùng bướm đêm Spodoptera littoralis với giá trị LC50 bằng 2,5 ppm [41]

Năm 2006, Nantiya Joycharat và cộng sự đã phân lập, xác định cấu trúc

của 10 hợp chất từ lá Aglaia oligophylla gồm dipterocarpol (số 26), ocotillone

(số 27), cabraleone (số 28), ocotillol (số 29), 20(S),24(S)-dihydroxydammar-

25-en-3-one (số 30), rocaglaol (số 31), odorine (số 32), 20-epi-odorine (số

33), 20S,25-epoxy-24R-hydroxy-3-dammaranone (số 34), 20S,25-epoxy-24R-

hydroxydammarane-3α-ol (số 35) [42].

Năm 2016 Yunie Y. và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc hóa

học của 4 hợp chất từ thân loài Aglaia oligophylla, gồm 2 hợp chất steroid:

stigmasterol (số 36) và β-sitosterol (số 37); 2 hợp chất triterpenoid:

oligophyllic acid (số 38) và foveolin B (số 39):

Bên cạnh đó, ngoài dược lý đặc hiệu làm thuốc trừ sâu, chống viêm và

chống ung thư, Trong xét nghiệm CUPRAC (Cupric giảm năng lực chống

oxy hóa), dịch chiết ethyl acetate của thân cây thể hiện khả năng giảm mạnh

nhất với giá trị 1543 mg đương lượng Trolox/g và dịch chiết methanol cho

thấy khả năng chống oxy hóa giảm mạnh nhất với giá trị 1059 mg đương

lượng Trolox/g. [43].

1.5.2.3. Cây Trầu không (Piper betle L.)

Năm 2013, trong nghiên cứu của D. Pradhan và cộng sự đã cho biết

thành phần hóa học cây Trầu không (Piper betle L.) rất phong phú và đa dạng

với nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm. Một số hợp chất Terpenoid gồm:

1, 8-cineole, cadinene, camphene, caryophyllene, limonene, pinene,

chavibetol (số 40), ally pyrocatechol (số 41), carvacrol, safrole, chavibetol

acetate (số 42), eugenol (số 43) và piperitol (số 44) là các dẫn xuất phenol

chính được xác định trong lá Trầu không. Trong đó, eugenol có hoạt tính

chống nấm mạnh.

Các hợp chất flavonoid: quercetin (số 45), luteolin (số 46), các hợp chất

alkaloid: cepharadione A (số 47), aristololactame (Α-II) (số 48) và

cepharadione (số 49). Ngoài ra còn có một số hợp chất khác: ursonic acid (số

50), ellagic acid (số 51),…

Lá trầu không như chất chống oxy hóa tự nhiên, có tương quan với hoạt

tính sinh hoc khác như bảo vệ gan, trị đái tháo đường, chống viêm, chống đột

quỵ và chống ung thư. Bên cạnh đó, lá có phổ rộng kháng khuẩn, chống lại

nhiều vi khuẩn khác nhau bao gồm Bacillus cereus, Enterococcus faecalis,

Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus,

Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Salmonella Enteritidis, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes,

Enterococcus faecium, Actinomycetes viscosus, Streptococcus sanguis,

Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia. Hơn nữa, lá có tác dụng

chống nấm và chống độc, hoạt động chống lại mầm bệnh gây bệnh thương

hàn, dịch tả, bệnh lao,... Nhai lá trầu tăng tiết nước bọt làm tăng enzyme

peroxidase, lysozyme và kháng thể để chống lại sự phát triển của vi khuẩn

trong khoang miệng. Lá trầu có hoạt tính chống ung thư chất gây ung thư

thuốc lá do sự hiện diện của hydroxychavicol và axit chlorogen. Hai hợp chất

sau này tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình

thường. Nhai lá trầu kết quả hành động tim mạch bằng cách tăng tốc

catecholamine từ vỏ thượng thận đóng góp để tăng sức chịu đựng của cơ tim,

nhịp tim, huyết áp và thần kinh giao cảm. Nó cũng có tác dụng ức chế tiểu

cầu. Do đó, lá trầu có lợi cho rối loạn tim mạch khác nhau như xung huyết

suy tim, bệnh mạch vành, cấp tính nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch [44]

1.5.2.4. Cây Nghệ vàng (Curcuma longa)

Năm 2017, Ting Yuan và cộng sự của mình đã phân lập được 6 hợp

chất: turmerone Q (số 52), bisacurone A (số 53), bisacurone (số 54),

bisacurone B (số 55), 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(4-hydroxyphenyl)-

penta-(1E,4E)-1,4-dien-3-one (số 56), cyclocurcumin (số 57) và 1,7-bis(4-

hydroxy-phenyl)-3-hydroxy-1,3-heptadien-5-one (số 58). Hợp chất số 57 và

số 58 cho thấy hoạt tính ức chế đáng kể về sản xuất NO gây ra bởi

lipopolysacarit (LPS) trong các đại thực bào.

Cùng năm này, Kamran Ashraf và Sadia Sultan đã phân lập và xác định

cấu trúc của 3 hợp chất: curcumin (số 59), demethoxycurcumin (số 60),

bisdemethoxycurcumin (số 61)

Sự ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan HepG2 của curcumin (IC50

41,69 µg/mL) hiệu quả hơn nhiều so với chiết xuất methanolic (IC50 196,12

µg/mL). Bột nghệ khi uống với sữa đun sôi rất hữu ích trong việc chữa bệnh

ho và các bệnh liên quan đến đường hô hấp, và bột nghệ rang là một thành

phần được sử dụng như thuốc chống động kinh cho trẻ em. Củ nghệ cũng

được sử dụng trong điều trị các bệnh về răng miệng, rối loạn tiêu hóa như khó

tiêu và axit, khó tiêu, đầy hơi, loét, chống oxy hóa, chống đông cũng như làm

giảm bớt tác dụng gây ảo giác của hashish và các thuốc hướng tâm thần khác.

Trong thực phẩm và sản xuất, curcumin hiện đang được sử dụng trong nước

hoa và như một chất tạo màu vàng tự nhiên, cũng như một phụ gia thực phẩm

được phê duyệt cho hương vị khác nhau các loại cà ri và mù tạt [45].

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Mẫu thực vật

Vỏ cây Ngâu ta thu tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), vào

tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh

thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam) xác định tên khoa học Aglaia duperreana Pierre, họ Xoan (Meliaceae)

số tiêu bản AD1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Lá cây Gội ổi thu tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), vào

tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh

thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam) xác định tên khoa học Aglaia oligophylla Miq., họ Xoan (Meliaceae) số

tiêu bản AO1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Lá cây Trầu không thu tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh (Vĩnh

Phúc), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào

(Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Piper betle L., họ Hồ tiêu (Piperaceae)

số tiêu bản PB1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Củ rễ cây Nghệ vàng thu tại Trạm đa dạng sinh học Mê Linh (Vĩnh

Phúc), vào tháng 12 năm 2012 và được chuyên gia thực vật Nguyễn Kim Đào

(Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học Curcuma longa L., họ Gừng

(Zingiberaceae), số tiêu bản CL1212 lưu tại Phòng Sinh dược, Viện Hóa học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên

khoa học lập hồ sơ lưu trữ.

Chuẩn bị dụng cụ: Dụng cụ chuẩn bị cần có: túi lưới, báo cũ, dây buộc,

túi nilon loại nhỏ, eteket, bút viết kính, khung gỗ ép mẫu, dao cắt chặt mẫu,

dao kéo cắt dây và cành mẫu nhỏ, rổ nhửa, máy ảnh,…

Tiến hành thu hái thực vật ngoài thực địa: Mẫu thực vật có thể lấy lá,

vỏ, rễ, củ. Số lượng mẫu lấy từ 0,5 – 1 kg. Các mẫu thực vật thu được mô tả

sơ bộ và ghi chép đầy tình trạng cây (tên cây, mầu sắc, hoa quả). Tại địa điểm

lấy mẫu, tiến hành thu hái sơ bộ các bộ phận khác nhau của cây để chung vào

1 túi lưới kèm theo 1 eteket đánh mã số loài. Mẫu thực vật được đánh mã số

trên eteket và chụp ảnh mẫu cùng với mã số tương ứng làm tài liệu lưu trữ.

Ảnh chụp cần thể hiện được các đặc điểm nhận dạng của loài thực vật: dạng

thân cành, cách mọc lá, đặc điểm hoa hoa và quả,... Mẫu thực vật cần tách

riêng 1 mẫu tiêu bản dùng để xác định chính xác danh tính của loài thực vật.

Mẫu tiêu bản bao gồm 1 lượng nhỏ tất cả các bộ phận loài thực vật đã thu hái.

Các mẫu tiêu bản được gắn theo 1 eteket đánh mã số tương ứng của loài thực

vật thu hái rồi cho chung trong 1 túi lưới.

Xử lý mẫu thực vật, xác định tên khoa học của loài sau khi thu hái: Sau

khi thu hái, mẫu thực vật được xử lý từng bộ phận, được tách riêng hay gộp

chung thành 1 mẫu tùy thuộc vào khối lượng mẫu được nhiều hay ít, cành và

thân được chặt nhỏ (kích thước 5 – 10 mm). Mẫu tiêu bản sau khi được đưa

về cơ quan tại nơi thu mẫu cần được ép mẫu bằng khung ép mẫu và giấy báo:

các mẫu tiêu bản được ngăn cách nhau bởi các lớp báo. Các lớp báo này có

tác dụng ngăn cách và hút hơi nước từ mẫu tiêu bản tránh thối hỏng mẫu.

Chuyên gia thực vật dựa vào mẫu tiêu bản và đặc điểm cây được ghi chép

ngoài thực địa để xác định tên khoa học của các mẫu thực vật. Mẫu thực vật

được băm nhỏ và làm khô sơ bộ tại cơ quan nơi lấy mẫu tránh làm thối hỏng

các mẫu thực vật chứa lượng nước nhiều sau đó mang về phòng sấy, mỗi mẫu

được cho vào 1 rổ nhựa có ký hiệu mẫu đã phân loại và xếp gọn gàng, sấy

khô rồi chuyển vào kho chứa mẫu thực vật.

2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật

Các mẫu thực vật đều được xử lý chung như sau: Mẫu được ngâm chiết

3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50 oC thu được cặn cô metanol.

Cặn cô metanol được thêm nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ

phân cực tăng dần n-hexan, diclometan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi

thu được cặn dịch n-hexan, diclometan, etyl axetat và metanol tương ứng.

2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật

Các mẫu nấm nội sinh thực vật đều được xử lý chung như sau: Các

nấm nội sinh phân lập trong các mẫu thực vật đã định danh sau đó mang đi

nuôi cấy với lượng lớn. Sau khi nuôi cấy nấm trong 35 ngày, các sợi nấm đã

phát triển kín môi trường gạo sẽ tiến hành diệt nấm bằng tia UV trong box

cấy. Nấm được ngâm chiết trong dung môi hữu cơ. Sau khoảng 12h tiến hành

chắt lọc dung môi ngâm chiết bằng giấy lọc thu dịch chiết nấm. Quá trình

ngâm chiết được làm 3 lần và cô quay thu được cặn chiết. Cặn chiết được

chiết phân lớp với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan,

diclometan, etyl axetat, methanol và nước. Sau khi đuổi dung môi thu được

cặn dịch n-hexan, etyl axetat và metanol tương ứng

2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự vùng ITS

Tách chiết ADN tổng số: phương pháp sử dụng CTAB của J. Doyle và

L. Doyle (1987)

Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 20 μl: Đệm chứa 2 mM

MgCl2, 0,25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (Thermo

Scientific), 0,2 μM mồi và khoảng 30 ng khuôn mẫu ADN và nước cất dùng

cho PCR.

Chương trình chạy PCR: Các phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 940C (5 phút), 35 chu kỳ [940C (1 phút), 590C (45s), 720C (50s)] và kết thúc ở 720C (5 phút). Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản

phẩm PCR được bổ sung 4 μl thuốc nhuộm rồi tiến hành điện di.

Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen:

- Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống

eppendorf 2 ml. Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3:1.

- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn.

- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ

13.000 vòng/phút trong 1 phút.

- Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000

vòng/phút trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa.

- Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau

đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút.

- Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5 ml sạch.

- Để hòa tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH = 7-8,5) vào giữa màng của cột

QIAquick và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, thu lượng

ADN tinh sạch.

Phương pháp giải trình tự: Sản phẩm PCR vùng ITS sau khi tinh sạch

được đọc trình tự tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc

gia Hà Nội. Kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự tương đồng

trên NCBI. Sau đó các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương

trình MEGA v6.0 và CLC v8.02 để tạo cây phát sinh loài.

Kết quả phân tích các sản phẩm khuếch đại: Sau khi thực hiện phản

ứng PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1/ITS4 và được điện di trên

gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích thước khoảng 750 bp. Sau khi

khuếch đại sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thôi gel bằng việc sử dụng cột

QIAquick Spin Columns (USA) nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu.

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu

Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của mẫu nghiên cứu được

thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như sắc ký lớp mỏng

(TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột thường (CC) với pha

tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là YMC RP 18

(Merck) và sắc ký ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck).

2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần được thực hiện trên bản

mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (0,25 mm; Merck) và RP-18 F254S

(0,25 mm; Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm

và 365 nm Các hợp chất được phát hiện trên đèn tử ngoại ở các bước sóng

254nm và 366 nm hoặc được phun thuốc thử anisaldehyde rồi nung nóng ở 110 oC.

Công thức: Anisaldehyde/H2SO4 (DAB 10)

Anisaldehyde: 5 ml

Glacial Acetic Acid: 100 ml

Methanol: 85 ml

Các thành phần được trộn lẫn rồi sau đó mới thêm 5 ml acid sunfuric

đặc, để nguội từ từ sau đó bảo quản vào chai thuỷ tinh có mầu giữ trong tủ

lạnh để sử dụng.

2.2.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063

mm (230 - 400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu là loại phân tích,

công nghiệp.

Sắc ký cột ray phân tử với pha tĩnh là sephadex LH-20.

Sắc ký cột pha đảo sử dụng loại YMC RP-18 có cỡ hạt là 30-50 μm

(Fujisilica Chemical Ltd.).

Sắc ký lỏng hiệu năng cao-điều chế (HPLC-Preparative): Các cột điều

chế (125 x 4 mm, i.d.) đã được nhồi sẵn với eurospher C-18 (Knauer, Berlin,

Germany) hoặc Dynmax (250 x 21.4 mm, L.ID). Lượng mẫu được đưa lên

cột tuỳ thuộc vào kích thước của cột. Đối với loại cột nhỏ, 3 mg mẫu được

hoà tan trong 1ml dung môi hoặc hệ dung môi bắt đầu chạy theo chương trình

định trước rồi bơm lên cột. Với loại cột to, lượng mẫu đưa lên cột có thể tích

20 mg. Các hệ dung môi thường được sử dụng là hỗn hợp dung môi methanol

hoặc acetonitrile và nước siêu lọc (nanopure) có dùng đệm hoặc không dùng

đệm với 0,1 % TFA, và tỉ lệ dòng là 5 ml/phút. Các hợp chất được phát hiện

trên UV-VIS diode array detector.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao - phân tích (HPLC): Đối với kỹ thuật HPLC

phân tích, hiệu năng phân tách đạt được dựa trên việc xử dụng bơm áp suất

cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký. Kỹ thuật phân tích HPLC được

sử dụng để nhận dạng các peak từ các dịch chiết hay các phân đoạn. Các

thành phần khác nhau trong hỗn hợp được đưa qua cột với các tốc độ dòng

tùy theo sự phân bố giữa dung môi pha động và pha tĩnh. Hệ dung môi được

dùng dưới dạng gradient là MeOH: Nước (nanopure) có sử dụng đệm pH=2

bằng acid phosphoric với sự tăng dần của MeOH đến 100 % trong thời gian

45 phút. Các hợp chất được phát hiện bằng UV-VIS diode array detector.

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được sử dụng các

thiết bị hiện đại. Các thiết bị và phương pháp sử dụng gồm:

Điểm nóng chảy (mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler

micro-hotstage của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

Phổ khối lượng (MS): Phổ khối (phun mù điện tử) ESI-MS được đo

trên máy Agilent 1200 TRAP. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo

trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): Phổ NMR đo trên máy Bruckker

avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân

được sử dụng:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và

NOESY.

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi DMSO-d6, CD3OD và

CDCl3. Lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo

nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo.

2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của

dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm[24]

2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân

đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm[24]

 Chuẩn bị thí nghiệm:

Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm: dịch chiết các mẫu cần thử, lá thầu dầu

sâu khoang (Spodoptetra litura), đĩa petri, các dụng cụ khác: đũa gỗ,

pipetman, bông…

Cân 10 mg dịch chiết cho vào lọ penecillin, sau đó cho vào mỗi ống

10 ml cồn hoặc aceton. Chạy siêu âm trong 10 phút để dịch chiết tan hoàn

toàn trong dung môi. Kiểm tra bằng mắt thường độ tan của các chất trước

khi đưa vào thí nghiệm. Đối với chất sạch, cân 5 mg hòa tan trong 5 ml cồn

hoặc axeton.

Lá thầu dầu được thu hái về đem rửa sạch, lau khô, bỏ cuống gân. Cắt

thành hình tròn đường kính 6 cm. Mỗi đĩa petri cần 2 lá.

Sâu khoang: thí nghiệm được thử bằng sâu khoang ở độ tuổi 1,5-2 tuổi,

chọn mỗi đĩa 10 con sâu đồng đều lứa tuổi để đưa vào thí nghiệm.

 Tiến hành thí nghiệm:

Dùng pipetman hút lượng chất được định lượng rồi tia đều lên lá thầu

dầu, tán đều lên 2 mặt lá. Hong khô tự nhiên cho cồn (hoặc axeton) bay hơi

hết rồi đặt vào đĩa petri có lót giấy thấm, sau đó dùng đũa gỗ gắp thả 10 con

sâu vào mỗi đĩa thí nghiệm. Cho 0,5 ml nước cất thấm vào bông và giấy thấm

để tạo độ ẩm.

Sau 24h kiểm tra số sâu sống.

Sau 48h kiểm tra số sâu và thay lá mới không phun thuốc.

Sau 72h cân xác định khối lượng sâu sống sót.

Phương pháp tính toán và xử lý số liệu theo công thức Abbott:

Tỷ lệ sâu sống được tính theo công thức:

Tỷ lệ sâu chết tính theo công thức:

Tỷ lệ sâu tăng trưởng tính theo công thức:

Hoạt lực trừ sâu tính theo công thức:

Trong đó:

Ef (%): hiệu lực

Ca: Số sâu sống của mẫu đối chứng

Ta: Số sâu sống của mẫu thí nghiệm

2.3.2. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân

đoạn chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm[24]

 Chuẩn bị thí nghiệm:

Chủng nấm gây bệnh thối xám Botrytis cinera đã được phân lập và làm

sạch. Môi trường Malt extract: 17 g, Agar: 17 g, Getamicin: 0,2 g, H2O: 1 l.

Dịch chiết thực vật , kháng sinh Nystatin, H2O. Dụng cụ thí nghệm: Bình tam

giác, giấy bạc, đĩa petri, box cấy, que cấy, đũa thủy tinh, đèn cồn, nồi hấp khử

trùng, cồn 70 %, bình xịt cồn.

 Tiến hành thí nghiệm:

Cân 10mg dịch chiết tổng; 7,5mg phân đoạn dịch chiết; hoặc 5mg chất

sạch cho vào các ống eppendorf đã được khử trùng rồi thêm 2 ml cồn (có thể

bổ xung metanol hoặc axeton giúp dịch chiết hòa tan tốt hơn). Siêu âm mẫu

trong 20 phút, hòa tan hoàn toàn dịch chiết vào dung môi. Các mẫu dịch chiết

được hòa tan cần khử trùng mẫu bằng tia UV trong box cấy.

Mẫu đối chứng dương là mẫu được thay dịch chiết thực vật bằng

kháng sinh Nystatin với nồng độ 200 ppm. Mẫu đối chứng âm là mẫu chỉ

có môi trường thạch. Mẫu đối chứng dung môi là mẫu được hòa 2 ml cồn

vào 10 ml thạch.

Môi trường được hấp khử trùng, để nguội 50 - 60 oC rồi đổ đều vào

trong các đĩa petri, cùng lúc đó đổ dịch chiết vào đĩa thạch vừa đổ. Dùng đĩa

thủy tinh khuấy đều dịch chiết vào môi trường thạch rồi để nguội. Mỗi đĩa

thạch được đổ khoảng 10 ml thạch nên nồng độ dịch chiết tổng là 1000 ppm,

phân đoạn dịch chiết là 750 ppm, chất sạch là 500 ppm.

Chủng nấm gây bệnh được làm sạch để làm nguyên liệu. Dùng que cấy

đục thạch tròn có đường kính 4mm rồi cấy chấm điểm vào tâm đĩa thạch đã đổ dịch chiết. Nuôi chủng nấm Botrytis cinera ở 25 oC, thời gian 5 - 6 ngày.

Khi nấm đối chứng âm đã mọc kín đĩa thạch ta sẽ kết thúc thí nghiệm

và tiến hành đo đường kính tản nấm ở các mẫu thí nghiệm. Đánh giá khả năng

ức chế theo công thức:

C - T

KNƯC % = ———— x 100

Trong đó:

KNƯC %: Khả năng ức chế của dịch chiết với nấm

T: Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm

C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng (âm)

2.4. Phương pháp phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ thực vật [24]

Bước 1: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và dụng cụ thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy: Agar: 15 g, malt extract: 15 g, chloramphenicol:

0,2 g, nước cất:1l. Môi trường được đem đi khử trùng ở 121 ᴼC trong 20 phút.

Sau khi khử trùng xong lấy ra cho vào tủ cấy đã lau sạch bằng cồn, bật đèn

UV 15 phút. Môi trường nguội đến 50 ᴼC - 60 ᴼC xoay nhẹ cho nó phân tán

đều, rót ra đĩa petri.

Bước 2: Chuẩn bị mẫu thực vật tươi trước khi cấy mẫu

Mẫu thực vật được lấy toàn bộ thân, lá, củ và rễ. Rửa sạch mẫu dưới

vòi nước. Nếu lấy mẫu ở xa cần bảo quản mẫu trong thùng đá. Xịt cồn toàn

bộ mẫu và tách riêng từng bộ phận: lá, thân, củ, rễ. Cắt mẫu nhỏ để khử trùng

mẫu: ngâm trong cốc cồn 70 % khoảng 2 phút. Vớt mẫu sang cốc nước thanh

trùng, rồi chuyển mẫu sang giấy thấm để loại hết dung môi và nước. Sau đó

đặt mẫu lên đĩa petri thanh trùng.

Bước 3: Phân lập nấm từ mẫu thực vật và theo dõi thí nghiệm

Kiểm tra độ sạch của mẫu thực vật dùng để phân lập nấm bằng cách:

Quệt hoặc lăn mẫu đã khử trùng lên trên bề mặt thạch (đối chứng. Dùng panh

và dao sắc cắt nhỏ, cắt lát các mẫu nghệ rồi tiến hành đặt mẫu đã cắt lên bề

mặt đĩa thạch. Mỗi đĩa khoảng 4 - 5 mẫu cắt. Các mẫu đối chứng và mẫu thí

nghiệm được bọc kín bằng paraffin. Tiến hành nuôi mẫu trong điều kiện: 22 - 25 oC. Sau 48h có thể kiểm tra mẫu thí nghiệm. Nếu mẫu đối chứng không

có gì chứng tỏ khử trùng mẫu đã sạch, mẫu đối chứng có dấu hiệu nấm phát

triển chứng tỏ khử trùng mẫu chưa sạch cần tiến hành lại thí nghiệm với loại

mẫu này.

Bước 4: Cấy chuyển – làm sạch các chủng nấm đã mọc

Khi xuất hiện các sợi nấm mọc trên đĩa thạch cần tiến hành cấy chuyển

luôn, tránh hiện tượng mọc lẫn nhau của 2 hay nhiều chủng nấm. Sử dụng que

cấy đầu tròn gạt nhẹ qua các sợi nấm và cấy sang đĩa thạch mới theo hình cửa

xếp. Cấy chuyển nhiều lần đến khi chủng nấm được sạch, tiến hành xác định

tên họ của chủng nấm và mức độ nguy hiểm của chúng rồi mới tiến hành sinh

khối lượng lớn.

Bước 5: Sinh khối nấm

Nấm được sinh khối trong môi trường gạo. Cân 200 g gạo cho vào bình

1 lit, thêm nước cất rồi tiến hành khử trùng trong 1h. Sau đó để nguội trong tủ

cấy và khử trùng UV. Mẫu nấm được chọn để sinh khối được cắt từng miếng

nhỏ rồi cho vào bình gạo đã nguội. Để mẫu sinh khối phát triển từ 5 - 6 tuần ở

nhiệt độ thích hợp cho đến khi mẫu nấm mọc kín bình gạo.

Xử lý sơ bộ mẫu

Khử trùng mẫu

Tiến hành phân lập

Mẫu đối chứng

Nấm mọc lên từ một

Một nấm sạch đã

mẫu thực vật

phân lập được

Sinh khối nấm

Ngâm chiết dung môi

Thu dịch chiết mẫu

nấm NSTV

Hình 2.1. Các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Thực nghiệm phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật

3.1.1. Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.)

Bốn (04) chủng nấm nội sinh đã được phân lập từ mẫu rễ và củ nghệ

vàng, được định danh bằng nghiên cứu hình thái bào tử nấm và PCR giải trình

tự vùng ITS là Fusarium solani, Fusarium sp., Trichoderma atroviride và

Fusarium oxysporum (được ký hiệu lần lươt là Ng1, Ng2, C2 và B1). Kết quả

phân loại và định danh chủng nấm nội sinh được phối hợp thực hiện cùng

nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Dương Văn Hợp tại Viện Vi sinh vật và Công

nghệ sinh học (IMBT), Đại học Quốc gia Hà Nội.

3.1.1.1. Chủng nấm Fusarium solani

Nguồn gốc phân lập: củ nghệ

Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm khí sinh phát triển và có màu

trắng. Có sinh bào tử.

Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thước đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên

môi trường PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt

trái không màu.

Hình 3.1. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani

Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần

đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 2 loại bào tử trần: Bào tử lớn hình

quả chuối, hình chiếc thuyền, kích thước 20-25 x 4,5-7 µm. Bào tử nhỏ hình

hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thước 3-5 x 7-10 µm. Ngoài ra còn có bào tử

nghỉ dạng chlamydospore.

3.1.1.2. Chủng nấm Fusarium sp.

Nguồn gốc phân lập: củ nghệ

Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm kị khí phát triển mạnh màu

trắng sữa. Sinh bào tử màu vàng

Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thước đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên

môi trường PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt

trái không màu.

Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần

đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 1 loại bào tử trần: Bào tử nhỏ ít,

hình hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thước 3,5-4,5 x 8-15 µm. Có bào tử

nghỉ dạng chlamydospore.

Hình 3.2. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium sp.

3.1.1.3. Chủng nấm Trichoderma atroviride

Nguồn gốc phân lập: rễ cây nghệ.

Đặng điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi khí sinh phát triển mạnh, có

màu trắng. Bào tử có màu vàng, khi già chuyển sang màu xanh.

Khuẩn lạc: Trên môi trường MEA khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 7

ngày nuôi cấy đạt kích thước 3-4 cm. Khi còn non khuẩn lạc có dạng sợi bông

màu trắng, sau khoảng 4 ngày bề mặt khuẩn lạc xuất hiện các đám bao tử màu

xanh lục, dạng bột trên bề mặt.

Cơ quan sinh sản: Sợi nấm dinh dưỡng có vách ngăn, nhẵn, phân

nhánh. Cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều lần, không màu, nhẵn. Nhánh

mọc càng dài khi càng xa đỉnh, nhánh mọc thẳng đứng với nhánh chính. Thể

bình (tế bào sinh bào tử) dạng phialo, mọc thành vòng quanh cuống chính, 2-4

thể bình, thể bình ở đỉnh dài hơn ở vị trí khác, kích thước (5-7,2) × (2-3,8)

µm. Bào tử hình trứng ngắn, vách nhẵn, kích thước (3-4,7) × (2,5-3,6) µm.

Hình 3.3. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Trichoderma

atroviride

Kết quả PCR trình tự vùng ITS của chủng Trichoderma atroviride như

Bảng 3.1. Trình tự vùng ITS của chủng Trichoderma atroviride

CCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCAC

GCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGG

ACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTT

ACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAAC

GGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA

TAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA

CGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGC

GTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGAC

CTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGC

GGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCAC

CGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAA

ATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT

ATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCCAGTA

ACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCCT

AGGGTCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTTGGTGAGGTGCCG

CCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCGCAGAGGGTGAGAGCCCCGT

CTGGCTGGCCACCGAGCCTCTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGT

AGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGG

Kết quả blast trình tự vùng ITS thu được với ngân hàng dữ liệu cho

thấy trình tự vùng ITS của chủng nghiên cứu tương đồng 100% với trình tự

vùng ITS của Trichoderma atroviride AF055212.

Vị trí phân loại của chủng Trichoderma atroviride được thể hiện tại

0.05

hình 3.4.

T. pseudocandidum

H. aureoviridis Z48819 AY737757

chromospermum

50 AY737774 83 DQ023302

H. avellanea DQ020000 T. Trichoderma sp.

100

T. chlorosporum AY737762 T. ceramicum AY737764

AF275330

T. cinnamomeum AY737759 T. harzianum AF057600 T. guizhouense DQ018116 T. atrobrunneum T. citrinoviride Z82905 H. schweinitzii H. citrina AF400254 X93957

100

T. brevicompactum DQ000635 T.asperellum AJ230669

T.atroviride AF055212 C2 Nectria cinnabarina HM534894

(C2: chủng nấm nội sinh củ Nghệ vàng được nghiên cứu)

Hình 3.4. Cây phân loại của chủng Trichoderma atroviride

3.1.1.4. Chủng nấm Fusarium oxysporum

Nguồn gốc phân lập: củ cây nghệ.

Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm phát triển mạnh và ăn đều từ

tâm ra xung quanh. Sợi khí sinh phát triển tốt. Sợi nấm ban đầu có màu trắng

sau đó chuyển sang màu tím đỏ.

Khuẩn lạc: Trên môi trường MEA khuẩn lạc có màu trắng hơi ngả

hồng, dạng sợi bông xốp. Mặt sau khuẩn lạc có màu hồng nhạt.

Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần

đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, bào tử trần hình bầu dục, hình quả

chuối..., kích thước 2,5 – 4,5 × 6 – 9 (15– 20) µm.

Hình 3.5. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Fusarium oxysporum

Kết quả PCR trình tự vùng ITS của chủng Fusarium oxysporum như tại

bảng 3.2.

Bảng 3.2. Trình tự vùng ITS của chủng Fusarium oxysporum

CCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGC

CCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAA

ACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAA

TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA

AGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT

CAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGT

ATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAA

GCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAA

ATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAA

ACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCC

AACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTG

AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGG

GATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAAT

TTGAAATCTGGCTCTCGGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAT

ACTTTTGATGCGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCC

ATAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTTGGATGCCAAATCTCTGT

AAAGTTCCTTCAACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTA

AATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGA

CCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACT

TTGAAAAGAGAGTTAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGA

AGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTT

CTCCCCAGTGCACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCC

CGGGGGATAAAGGCGGCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGT

GTTATAGCCCACCGTGTAATACCCTGGGGGGG

Kết quả blast trình tự vùng ITS thu được với ngân hàng dữ liệu cho

thấy trình tự vùng ITS của chủng nghiên cứu tương đồng 100% so với trình tự

rRNA vùng ITS của Fusarium oxysporum KR094464.

Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum được thể hiện tại

hình 3.6.

0.02

Fusarium subglutinans JX960431

Fusarium sacchari EF453121

Fusarium verticillioides AB587012

Gibberella moniliformis GQ16884

90 90

100

Gibberella moniliformis GQ168842

Gibberella circinata FJ744110

Fusarium verticillioides FJ867932

Fusarium oxysporum KR094464

100

Nectria cinnabarina HM534894

(B1: chủng nấm nội sinh củ Nghệ vàng được nghiên cứu)

Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum

Chủng nấm Fusarium oxysporum được sử dụng để nuôi cấy lượng lớn

và tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau.

3.1.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana)

Ba (03) chủng nấm nội sinh, được phân lập từ lá ngâu ta (Aglaia

duppereana), đã được xác định tên là Colletotrichum gloeosporioides,

Colletotrichum crassipes và Microdiplodia hawaiiensis.

Một chủng nấm nội sinh, được phân lập từ cành ngâu ta (Aglaia

duppereana), cũng đã được xác định tên là Colletotrichum gloeosporioides,

trùng với một chủng nấm được phân lập từ lá ngâu.

Kết quả định danh các chủng nấm nội sinh được xác định bằng phương

pháp nghiên cứu hình thái bào tử nấm và chạy PCR giải trình tự gene vùng

ITS, sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4. Thí nghiệm được phối hợp thực hiện

cùng nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Dương Văn Hợp tại Viện Vi sinh vật và

Công nghệ sinh học (IMBT), Đại học Quốc gia Hà Nội

3.1.2.1. Chủng nấm Colletotrichum gloeosporioides

Nguồn gốc phân lập: lá cây ngâu

Trên môi trường nuôi cấy, sợi nấm phát triển mỏng mảnh, trên bề mặt

khuẩc lạc xuất hiện những đĩa bào tử bọc, có nhiều sợi cứng, lúc còn non có

màu hồng, già chuyển sang màu đen, bào tử phát tán ra khỏi đĩa, hình trụ, 1 tế

bào, kích thước 2,3- 3,5 x 4-5 µm.

Hình 3.7. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. gloeosporioides

3.1.2.2. Chủng nấm Colletotrichum crassipes

Nguồn gốc phân lập: lá cây ngâu

Trên môi trường nuôi cấy, sợi nấm phát triển mỏng mảnh. Khuẩn lạc

màu trắng, khi về già (sau 3-4 tuần nuôi cấy) trên bề mặt khuẩc lạc xuất hiện

những đĩa bào tử bọc, màu đen, bào tử phát tán ra khỏi đĩa, hình trụ, 1-2 tế

bào, kích thước 4-5 x 5-8 µm.

Hình 3.8. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. crassipes

3.1.2.3. Chủng nấm Microdiplodia hawaiiensis

Nguồn gốc phân lập: lá cây ngâu

Hình 3.9. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng M. hawaiiensis

Kết quả PCR trình tự vùng ITS của chủng Microdiplodia hawaiiensis

như tại bảng 3.3.

Bảng 3.3. Trình tự vùng ITS của chủng M. hawaiiensis

TTCGGACTGGCTCGAGGAGGTTGGCAACGACCACCTCAA

GCCGGAAAGTTGTACAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAA

GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT

ATCTATTTTAACGGTGTTGGTTGCGGCCTCCGGGGGTAACTCC

CCCGGGTGGTAGAGGTAACACTCGCACGCTCCACATGCCTTAA

TCCTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGTGGGGCAAC

CTGCCGTTGGAACCCATCAAAAACCCTTTTTTGCATCTAGCATT

ACCTGTTCCGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGA

TCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT

AAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG

AACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTT

CGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGT

CTGTCCCGCCTCTGCGCGCGGACTCGCCCCAAATTCATTGGCA

GCGGTCCTTGCCCCTCTCGCGCAGCACATTGCGCTTCTCGAGG

GGCGCGGCCCGCGTCCACGAAGCAAACATTACCGTCTTTGACC

TCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA

AGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGC

GAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTCTCTTT

GGGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGCATTGGC

GGCGGTCTAAGTTCCTTGGAACAGGACATCGCAGAGGGTGAG

AATCCCGTACGTGGGCGCCTGCCTTTGCCGTGTAAAGCTCCTT

CGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGAGGT

AAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGC

Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis được thể hiện tại

hình 3.10.

Ngâu

(Ngâu: chủng nấm nội sinh lá Ngâu được nghiên cứu)

Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis

Chủng nấm Microdiplodia hawaiiensis được sử dụng để nuôi cấy lượng

lớn và tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau.

3.1.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L)

Hai (02) chủng nấm nội sinh đã được phân lập từ lá cây trầu không. Kết

quả phân loại bằng nghiên cứu hình thái bào tử nấm đã xác định hai chủng

nấm nội sinh là Colletotrichum sp. và Fusarium solani. Công việc định danh

chủng nấm nội sinh được phối hợp thực hiện cùng nhóm nghiên cứu của PGS.

TS. Dương Văn Hợp tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (IMBT), Đại

học Quốc gia Hà Nội.

3.1.3.1. Chủng nấm Colletotrichum sp.

Nguồn gốc phân lập: lá cây trầu không

Trên môi trường nuôi cấy, sợi nấm phát triển mỏng mảnh, thưa thớt,

trên bề mặt khuẩc lạc xuất hiện những đĩa bào tử trần, ở giữa màu đen, không

mang bào tử. Đĩa phần mép ngoài khuẩn lạc có màu hồng, có mang bào tử

hình trụ, hình thuốc con nhộng, 1- 2 tế bào, kích thước 4-5 x 12-15µm. Không

có bào tử nghỉ dạng chlamydospore.

Hình 3.11. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Colletotrichum sp.

3.1.3.2. Chủng nấm Fusarium solani

Nguồn gốc phân lập: lá cây trầu không

Đặc điểm sinh trưởng, phát triển: Sợi nấm khí sinh phát triển và có màu

trắng. Có sinh bào tử.

Khuẩn lạc: phát triển nhanh, kích thước đạt 60-80 mm sau 7 ngày trên

môi trường PDA, sợi nấm không màu, khuẩn lạc màu trắng, dạng nhung. Mặt

trái không màu.

Cơ quan sinh sản: Cuống sinh bào tử đơn độc hoặc phân nhánh, phần

đỉnh sinh ra nhiều bào tử dạng thể bình, có 2 loại bào tử trần: Bào tử lớn hình

quả chuối, hình chiếc thuyền, kích thước 20-25 x 4,5-7 µm. Bào tử nhỏ hình

hạt đậu hoặc hình quả thận, kích thước 3-5 x 7-10 µm. Ngoài ra còn có bào tử

nghỉ dạng chlamydospore.

Hình 3.12. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani

Chủng nấm Fusarium solani được sử dụng để sinh khối lượng lớn và

tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau.

3.2. Thực nghiệm phân lập các thành phần hóa học từ thực vật và nấm

nội sinh thực vật

3.2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana)

3.2.1.1. Xử lý mẫu thực vật

Mẫu vỏ cây Ngâu ta khô (3kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong

thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 115g cặn cô metanol. Cặn cô metanol

được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan và

etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan (25g), etyl

axetat (20g) và metanol (65g) tương ứng.

3.2.1.2. Phân lập các hợp chất từ cặn etyl axetat vỏ cây Ngâu ta

Cặn etyl axetat (AD.E, 20g) được phân tách bằng sắc ký cột VLC với

hệ dung môi rửa giải gradien n-hexan:EtOAc:MeOH (hệ dung môi 4:2:1 đến

0:1:1) thu được 8 phân đoạn ký hiệu từ ADE1 đến ADE8.

Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta

AD.E (20g)

n-hexan-EtOAc-MeOH (4:2:1 đến 0:1:1)

LC, Silicagel, gradient

ADE1-2

ADE4-8

ADE3 3,99g

CH2Cl2-MeOH (100:0 đến 0:100)

ADE3.1 1,29g

ADE3.1.4 - 3.1.7 412mg

HPLC, MeOH-H2O 3:7

(5) 1.9mg

(6) 10mg

(2) 3.8mg

(3) 2.1mg

(4) 7.2mg

(1) 3.9mg

Tiến hành chạy cột sắc ký cột phân đoạn ADE3 (5,4 g) trên silica gel

(40-63µm) với hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH (từ 100:0 đến 0:100) thu

được 9 phân đoạn, ký hiệu là ADE3.1-ADE3.9.

Phân đoạn từ ADE3.1 (1,29 g) tiến hành chạy cột CC với dung môi

CH2Cl2:isopropanol thu được 9 phân đoạn (ADE3.1.1 đến ADE3.1.9).

Gom các phân đoạn ADE3.1.4-ADE3.1.7 (412mg) tiến hành chạy cột

sephadex với dung môi methanol, thu được 36 phân đoạn nhỏ. Sử dụng TLC

và HPLC gom các ống 1-36 thu được 6 chất sạch thu được dưới dạng bột màu

trắng vô định hình. Quy trình phân tách các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta

(Aglaia dupperreana Pierre) được miêu tả trên sơ đồ 3.2.1.

 Hợp chất 1:

Hợp chất 1 (3,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia

D-90.5 (c, 0.25, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

UV (MeOH) λmax 219.7 và 273.0 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 561,1 (M+H)+,

1H-NMR (MeOD): δ ppm 4,95 (d, J = 6.9 Hz, H-1), 4,11 (dd, J = 6.9

528,4 (M+Na)+

Hz, 13,8 Hz , H-2), 4,36 (d, J =13,8 Hz, H-3), 6,30 (d, J =1,9Hz, H-5), 6,17

(d, J =1,9 Hz, H-7), 7,12 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,64 (d, J=8,8 Hz, H-3’), 6,64

(d, J =8,8 Hz, H-5’), 7,12 (d, J = 8,8 Hz, H-6’), 6,86 (m, H-2”), 6,98 (m, H-

3”), 6,98 (m, H-4”), 6,98 (m, H-5”), 6,86 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,84 (s,

OCH3

H3CO

CON(CH3)2

2´´

6´

2´

5´´

4´

OCH3 Cấu trúc hợp chất 1

OMe-8), 3,66 (s, OMe-4’), 3,34 (s) & 2,86 (s) NMe.

 Hợp chất 2:

Hợp chất 2 (3,8 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia

D-80 (c, 0.45, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

Dữ kiện phổ hợp chất 2.

UV (MeOH) λmax 209 và 279 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 564,1 (M+H)+,

1H-NMR (MeOD): δ ppm 6,03 (d, J = 5,0 Hz, H1), 4,29 (dd, J = 5,0

586,4 (M+Na)+

Hz, 14,5 Hz , H2), 4,29 (d, J =14,5 Hz, H3), 6,26 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,11(d, J

=1,9 Hz, H7), 6,78 (d, J=1,9 Hz, H-2’), 6,62 (d, J =8,2 Hz, H-5’), 6,70 (d, J =

6,9 Hz, H-6’), 7,02 (m, H-2”), 6,98 (m, H-3”), 6,98 (m, H-4”), 6,98 (m, H-

5”), 7,02 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,73 (s, OMe-8), 3,71 (s, OMe-4’), 3,37

(s) & 2,79 (s) NMe, 1,81 (s, OCOCH3)

OCH3

OCOCH3

H3CO

CON(CH3)2

2´´

6´

2´

5´´

4´

OCH3

Cấu trúc hóa học của hợp chất 2

 Hợp chất 3:

Hợp chất 3 (2,1 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia

D-55,0 (c, 0.45, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

Dữ kiện phổ hợp chất 3.

UV (MeOH) λmax 210 và 272,5 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 534,1 (M+H)+,

1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,99 (d, J = 6,3 Hz, H1), 3,94 (dd, J = 5,9

556,4 (M+Na)+

Hz, 14,5 Hz , H2), 4,19 (d, J =14,5 Hz, H3), 6,26 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,12 (d,

J =1,9 Hz, H7), 7,17 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,61 (d, J =8,8 Hz, H-3’), 6,61 (d, J

= 8,8 Hz, H-5’), 7,17 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,91 (m, H-2’), 7,00 (m, H-3”),

7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H-5”), 6,91 (m, H-6”), 3,74 (s, OMe-6), 3,81 (s,

OMe-8), 3,65 (s, OMe-4’), 2,57 (s, NMe), 1,84 (s, OCOCH3) .

Cấu trúc hóa học của hợp chất 3

 Hợp chất 4

Hợp chất 4 (7,2 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (A. dupperreana)

D-110,0 (c, 0.45, CHCl3).

dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

Cấu trúc hóa học của hợp chất 4

Phổ UV (MeOH) λmax 210,4 và 272,6 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 548,2 (M+H)+,

1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,95 (m, H1), 4,21 (m, H2), 4,21 (m, H3), 6,18 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,03 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,08 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,54 (d, J =8,8 Hz, H-3’), 6,54 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 7,08 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,80 (m, H-2”), 6,92 (m, H-3”), 6,92 (m, H-4”), 6,92 (m, H-5”), 6,80 (m, H- 6”), 3,64 (s, OMe-6), 3,72 (s, OMe-8), 3,56 (s, OMe-4’), 3,27 (s) & 2,69 (s) NMe, 1,71 (s, OCOCH3) .

570,4 (M+Na)+

 Hợp chất 5:

Hợp chất 5 (1,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia D-41,1 (c, 0.22, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20 Phổ UV (MeOH) λmax 211,3 và 278,7 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 509,0 (M+H)+,

1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,00 (d, J =5,7 Hz, H1), 3,96 (dd, J =5,7 Hz & 13,9 Hz, H2), 4,21 (d, J = 13,9, H3), 6,27 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,15 (d, J =1,9 Hz, H7), 6,70 (d, J=1,9 Hz, H-2’), 6,64 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 6,64 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,91 (m, H-2”), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H-

531,2 (M+Na)+

5”), 6,91 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,82 (s, OMe-8), 3,67 (s, OMe-4’), 3,61 (s, OCOCH3) .

Cấu trúc hóa hoc của hợp chất 5

 Hợp chất 6

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20 Hợp chất 6 (10 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia D-125 (c, 0.48, CHCl3).

UV (MeOH) λmax 212,8 và 272,3 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 457,10 (M+H)+,

1H-NMR (MeOD): δ ppm 4,69 (d, J =5,5 Hz, H1), 2,80 (ddd, J =6,3 Hz & 13,5 Hz, 14, 0 Hz, H-2α), 2,06 (ddd, J =1,1 Hz & 6,2 Hz, 11,8 Hz, H-2β) 3,89 (dd, J = 13,5 & 14,0 Hz, H3), 6,28 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,17 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,10 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,61 (d, J = 8,8 Hz, H-3’), 6,61 (d, J=8,8 Hz, H-5’), 7,10 (d, J = 8,8 Hz, H-6’), 7,00 (m, H-2”), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H-5”), 7,00 (m, H-6”), 3,87 (s, OMe-6), 3,85 (s, OMe-8), 3,81 (s, OMe-4’).

890,9 (2M+Na)+

Cấu trúc hóa hoc của hợp chất 6

3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) 3.2.2.1. Xử lý mẫu thực vật

Mẫu lá cây Aglaia oligophylla (3kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 100g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n- hexan, diclometan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n- hexan (20g), diclometan (3.6g), etyl axetat (18g) và metanol (55g) tương ứng.

3.2.2.2. Phân lập các hợp chất từ cặn diclometan lá cây Gội ổi

Cặn chiết diclomethan của lá gội ổi (AO.D, 3.6 g) được tiến hành tách

với cột VLC silicagel 60 thu được 7 phân đoạn (AOD1 đến AOD7). Phân

đoạn OAD3 được tiếp tục chạy CC sử dụng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH

(10:1) thu được 3 phân đoạn (OAD3.1 đến OAD3.3). Hợp chất 7 thu được

bằng chạy HPLC điều chế phân đoạn OAD3.2, detector λ=210 nm với hệ

dung môi MeOH:H2O (3:7).

Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi

AO.D (3.6g)

CH2Cl2-MeOH (20:1 đến 2:1)

LC, Silicagel, gradient

AOD3 0.6g

CH2Cl2-MeOH (100:0 đến 0:100)

AOD3.2 15mg

HPLC, MeOH-H2O (3:7)

(7) 3.3mg

 Hợp chất 7 (chất mới)

Hợp chất 7 (3,3 mg) được phân lập từ lá cây gội ổi (Aglaia oligophylla

D-50,5 (c, 0.45, CHCl3).

Muq.) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

UV (MeOH) λmax 210,4 và 271,1 nm.

Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 528,1650 (M+Na)+

tương ứng với C28H27NO8Na.

Dữ liệu phổ của hợp chất 7 xem bảng 4.3.1.1

Cấu trúc hóa học của hợp chất 7

3.2.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa)

3.2.3.1. Xử lý mẫu thực vật

Củ nghệ vàng sau khi sấy khô được nghiền mịn, chiết với dung môi

ethyl acetate, loại dung môi sau đó cất lôi cuốn hơi nước thu được tinh dầu.

3.2.3.2. Phân lập các hợp chất

Tinh dầu nghệ (TDN, 30.8g) được phân tách trên sắc ký cột silica gel

với hệ dung môi gradient n-hexan-ethyl acetate thu được 12 phân đoạn. Phân

đoạn 3 được tinh chế lại bằng sephadex LH20 với dung môi rửa giải MeOH

thu được hợp chất 8 (2.8mg).

Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng

Bột Nghệ vàng

Cất lôi quấn hơi nước

Bã

TDN 30.8g

Chiết bằng EtOH

Cặn EtOH

TDN1.3 1,79g

PTLC

(9) 12.3mg

(8) 2.8mg

Phần cặn nghệ sau khi chưng cất lôi cuốn hơi nước lấy tinh dầu được tiến hành chiết 3 lần với dung môi ethyl acetat hoặc cồn thực phẩm 960. Dịch

chiết được cô chân không cho đến khi chỉ còn là dịch đặc thì được để ở nhiệt

độ phòng để kết tủa curcuminoid. Sau 24 giờ tiến hành lọc được curcuminoit

bán tinh. Curcuminoid thô được loại sáp bằng cồn lạnh sau đó tiến hành tinh chế trong cồn (hòa tan curcumin bán tinh có khuấy trong cồn thực phẩm 960 ở

nhiệt độ sôi), để nguội tới nhiệt độ phòng qua đêm để kết tinh curcuminoid.

Hỗn hợp Curcuminoid kết tinh được lọc chân không thu được sản phẩm

curcuminoit tinh. Curcumin tinh (chất 9, 12.3mg) được tinh chế bằng phương

pháp sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan:metanol (98 : 2).

 Hợp chất 8:

Hợp chất 8 thu đươc dưới dang dầu, không màu, UV 234-235nm. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), δH ppm 1,23 (d, 3H, J = 7 Hz, 15-CH3); 1,84

(brs, 3H, 12-CH3); 2,1 (s, 3H, 13-CH3); 2,3 (s, 3H, 4-CH3); 2,61 (m, 1H, H-);

2,69 (m, 1H, H-8); 3,28 (m, 1H, H-7); 6,02 (s, 1H, =CH-C=0, H-10); 7,1 (m,

4H, H-2,3,5,6).

13C-NMR: (CDCl3, 125MHz) δC ppm 20,6 (C-12); 20,9 (C-15); 21,9 (C-14); 27,6 (C-13); 35,2 (C-7); 52,68 (C-8); 124,0 (C-10); 126,6 (C-2,C-6);

129,09 (C-3, C-5); 135,5 (C-4); 143,6 (C-1); 155,0 (C-11); 199,8 (C-9).

Cấu trúc hóa học của ợp chất 8

 Hợp chất 9:

Curcumin tinh chất (hợp chất 9) được tinh chế bằng phương pháp sắc

ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan : metanol (98 : 2). Dữ liệu

cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy đây là hỗn hợp 50:50 của hai cấu dạng enol

H O

O H

và xeton của curcumin.

E n o l

H O

O H

K e t o

Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 (hai cấu dạng của curcumin)

3.2.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.)

3.2.4.1. Xử lý mẫu thực vật

Mẫu lá Trầu không khô (5kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong

thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 240g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan và

etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan (55g), etyl

axetat (50g) và metanol (130g) tương ứng.

3.2.4.2. Phân lập các hợp chất từ cặn n-hexan lá Trầu không

Cặn chiết n-hexan (TKH, 50g) được phân tách bằng sắc ký cột silica

gel (63-100µm) với hệ dung môi rửa giải gradien n-hexan-etyl axetat (từ

100:0 đến 1:1) thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ TKH1 đến TKH10.

Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không

TKH (50g)

LC, Silicagel, gradient

n-hexan-etyl axetat (0 đến 50% etyl axetat)

TKH4 1.2 g

TKH7 15mg

TKH6 3,99g

TKH4.1

TKH4.2

TKH4.3

TKH6.1

TKH6.2

TKH6.3

(12) 11.2mg

TKH4.4 15mg

TKH6.4 0.797g

(10) 10mg

(11) 150mg

Tiến hành chạy cột sắc ký cột phân đoạn TKH4 (1.2g) trên silica gel

(40-63µm) với hệ dung môi gradien n-hexan-etyl axetat (từ 100:0 đến 80:20)

thu được 4 phân đoạn, ký hiệu là TKH4.1-TKH4.4. Phân đoạn TKH4.4 (15

mg) được tinh chế bằng bản mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexan-etyl

axetat 95:5 thu được chất sạch 10 (10mg).

Phân đoạn TKH6 (3.99g) được tinh chế tiếp trên cột silica gel với hệ

dung môi gradien n-hexan-etyl axetat (từ 95:5 đến 75:25) thu được 4 nhóm

phân đoạn, ký hiệu là TKH6.1-TKH6.4. Phân đoạn TKH6.4 (0,797 g) được

phân tách lặp lại trên cột CC thu được chất sạch 11 (150 mg).

15mg của phân đoạn TKH7 được tinh chế bằng phương pháp điều chế bản

mỏng với hệ dung môi là n-hexan-etyl axetat (4:1) thu được chất sạch 12

(11,2 mg). Quy trình tách chiết các hợp chất từ cây Trầu không được mô tải

tại sơ đồ 3.2.4.

 Hợp chất 10:

Hợp chất 10 thu được dưới dạng lỏng, màu vàng nhạt. 1H-NMR

(CDCl3) δH ppm 3,28 (d, J= 6,5 Hz; 2H, H-7), 3,83 (s, 3H, H-2-OCH3), 5,03

(m, 2H, H-9), 5,93 (m, 1H, H-8), 6,65 (dd, J= 2; 8,5 Hz, 1H, H-3), 6,75 (brs,

1H, H-5), 6,77 (d, J= 2 Hz, 1H, H-6).

Cấu trúc hợp chất 10

 Hợp chất 11:

Hợp chất 11 thu được dưới dạng lỏng, không màu, nhiệt độ nóng chảy 16oC. Phổ 1H-NMR: (CDCl3) (δH ppm) 3,3 (d, J= 6,5, 2H, H-7); 5,05 (m, 2H, H-9); 5,93 (m, 1H, H-8); 6,77 (m, 2H, H-2,6); 7,04 (m, 2H, H-3,5). 13C-NMR:

(CDCl3, 125MHz, δC ppm) 39,5 (C-7); 115,2 (C-9); 115,4 (C-2,6); 129,6 (C-

3,5); 132,2 (C-4); 137,8 (C-8); 153,9 (C-1).

Cấu trúc hợp chất 11

 Hợp chất 12:

Hợp chất 12 thu được dưới dạng lỏng, không màu, nhiệt độ sôi 48°C. Phổ 1H-NMR: (CDCl3) (δ ppm) 2,05 (2H, d, J= 6,7 Hz, , H-7); 5,03 (m, 1H,

H-9cis); 5,06 (m, 1H, H-9trans); 5,48 (1-OH); 5,53 (2-OH); 5,90 (m, 1H, -

CH=); 6,62 (dd, J = 2,0 và 8,1Hz, 1H, H-5); 6,70 (d, J = 2,0Hz, 1H, H-6);

6,78 (d, J = 8,1Hz, 1H, H-3).

Cấu trúc hợp chất 12

3.2.5. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Ngâu ta (nấm M.

hawaiiensis)

3.2.5.1. Xử lý mẫu

Nấm ngâu (AF) (2,8g)

AFE1

AFE2

AFE3

AFE4

AFE3(1-9)

AFE3(35-46)

AFE3(10-34) (16,2 mg)

AFE3(47-67) (35,0 mg)

Sơ đồ 3.2.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất từ nấm nội sinh cây ngâu

(13) 16,2mg (14) 35,0mg

Nấm Microdiplodia hawaiiensis được phân lập từ vỏ cây ngâu ta trên

môi trường thạch. Sau đó được đem nuôi cấy trong môi trường gạo ở ba bình

mỗi bình 300g gạo tẻ. Khi nấm đủ độ phát triển (6 tuần), môi trường gạo có

chứa nấm được đem chiết với dung môi etyl axetat sau đó cô quay thu được

cặn chiết etyl axetat (2,8g).

3.2.5.2. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat nấm Ngâu

Cặn chiết được phân tách trên cột sắc ký hấp phụ silica gel với hệ dung

môi gradient n-hexan:ethyl acetate (từ 1:0 tới 0:1) thu được 5 phân đoạn.

Phân đoạn số 3 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký hấp phụ silica gel và

hệ dung môi gradient n-hexan:etyl axetat (từ 9:1 tới 0:1) thu được 2 chất sạch

ký hiệu là chất 13 (16,2mg) và 14 (35,0mg). Quy trình phân lập được miêu tả

trong sơ đồ 3.2.5.

 Hợp chất 13:

Hợp chất 13 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,87

(dm: n-hexan-ethyl acetate 3:1), điểm nóng chảy = 171,6 0C.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 13 xem Bảng 4.3.4.1

Cấu trúc hóa học của hợp chất 13

 Hợp chất 14:

Hợp chất 14 thu được dưới dạng tinh thể dạng vảy hình vuông màu

trắng, Rf = 0,33 (dm: n-hexan-ethyl acetate 3:1), điểm nóng chảy 189,6 0C.

Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 14 xem Bảng 4.3.4.1

Cấu trúc hóa học của hợp chất 14

3.2.6. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây nghệ vàng (nấm F.

oxysporum)

3.2.6.1. Xử lý mẫu

Nấm F. oxysporum được phân lập từ cây Nghệ vàng trên môi trường

thạch. Sau đó được đem nuôi cấy trong môi trường gạo ở ba bình mỗi bình

300g gạo tẻ. Khi nấm đủ độ phát triển (6 tuần), môi trường gạo có chứa nấm

được đem chiết với dung môi metanol sau đó cô quay thu được cặn chiết

metanol (10,2g).

3.2.6.2. Phân lâp các hợp chất từ cặn chiết methanol nấm cây Nghệ vàng

Cặn chiết MeOH (NB1M, 10.2g) được phân tách trên cột hấp phụ silica

gel với hệ dung môi n-hexan:aceton (từ 1:0 đến 0:1) thu được 11 phân đoạn

(NB1M1-NB1M11). Phân đoạn NB1M4 (1.1g) chứa nhiều dầu nên được

chạy GC-MS và thu được công thức hóa học của 12 loại acid ký hiệu các chất

15-26. Phân đoạn số NB1M6 (0.7g) tiếp tục được phân tách trên cột silica gel

với hệ dung môi n-hexan:etyl axetat (từ 1:0 đến 0:1) thu được 3 phân đoạn

nhỏ (NB1M6.1-NB1M6.3). Phân đoạn NB1M6.1 và NB1M6.2 được tinh chế

lại qua cột sephadex LH20 với dung môi rửa giải MeOH thu được 2 hợp chất

27 (18mg) và 28 (5.1mg). Phân đoạn NB1M6.3 được tách lại trên cột pha đảo

RP-18 với dung môi rửa giải MeOH-H2O 3-7 thu được hợp chất 29 (6.5mg).

Phân đoạn số NB1M8 được rửa bằng aceton thu được tinh thể dạng bột tan

trong MeOH nóng thu chất 30 (6.6mg). Quy trình tách chiết các chất 15-30

được mô tả trong sơ đồ 3.2.6.

Nấm Nghệ vàng (NB1) (MeOH, 10,2g)

n-hexan:aceton (từ 1:0 đến 0:1)

NB1M4 1.1g

NB1M8 0.2

NB1M6 0.7g

GCMS

n-hexan:aceton (1:0-0:1)

Sơ đồ 3.2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng

NB1M6.1

NB1M6.2

NB1M6.3

Sephadex LH20

RP-18

(15-26) (30) 6.6mg

(27) 18mg (28) 5,1mg (29) 6.5mg

 Các hợp chất từ 15-26:

Các hợp chất từ 15 đến 26 được xác định bằng phương pháp kỹ thuật

sắc ký ghép khối phổ (GC/MS, Gas Chromatography Mass Spectometry) tại

Viện Hợp chất thiên nhiên. Kết quả GC/MS các chất 15-26 được mô tả trong

bảng 4.3.5.1

 Hợp chất 27:

Hợp chất 27 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng chảy là 132-133 OC. Rf = 0,26 (hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton

9:1).

Cấu trúc hóa học của hợp chất 27

 Hợp chất 28:

Hợp chất 28 thu được dưới dạng vô định hình màu trắng. Rf = 0,34 (hệ

dung môi triển khai diclometan:metanol (9:1).

Dữ liệu phổ của 28 xem bảng 4.3.5.2

Cấu trúc hóa học hợp chất 28

 Hợp chất 29;

Hợp chất 29 thu được dưới dạng vô định hình màu trắng. Rf = 0,33 (hệ

dung môi triển khai diclometan:metanol (9:1).

Dữ liệu phổ của 29 xem bảng 4.3.5.2

Cấu trúc hóa học của hợp chất 29

 Hợp chất 30:

Hợp chất 30 thu được dưới dạng bột màu trắng tan trong methanol nóng, nhiệt nóng chảy là 221-224oC, Rf = 0.61 trong hệ dung môi diclometan- methanol 9:1.

Dữ liệu phổ của 30 xem bảng 4.3.5.3

Cấu trúc hóa học của hợp chất 30

3.2.7. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (nấm F.

solani)

3.2.7.1. Xử lý mẫu

Nấm Fusarium solani (NTK) phân lập từ lá trầu không được nuôi cấy

trên môi trường gạo trong bình thủy tinh. Sau khi sinh khối được ngâm chiết

với dung môi etyl axetate. Dịch chiết thu được cô quay loại dung môi thu

được cặn chiết etyl axetate (NTKE, 17g).

3.2.7.2. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (F. solani)

Cặn chiết etyl axetate (NTKE, 17g) được chạy trên cột silicagel hệ

dung môi rửa giải diclometan:metanol (20:1-1:1) thu được 15 phân đoạn

(NTK1-NTK15). Tinh chế phân đoạn NTK3 (0.3g) qua cột sephadex LH20

vớ dung môi rửa giải MeOH thu được chất 31 (7.1mg). Quy trình tách chiết

được mô tả trong sơ đồ 3.2.7

Sơ đồ 3.2.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không

NTKE (17g)

CH2Cl2-MeOH (20:1 đến 10:1)

LC, Silicagel, gradient

NTK3 0.3g

Sephadex LH20

(31) 7.1mg

 Hợp chất 31:

Hợp chất 31 (7.1mg), là tinh thể hình kim màu trắng, nhiệt độ nóng

chảy mp 168-169°C.

Dữ liệu phổ của Hợp chất 31 xem bảng 4.3.6.1

Cấu trúc hóa học của hợp chất 31

3.3. Thử hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các mẫu dịch chiết, phân

đoạn và chất sạch

Đã tiến hành thử hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptetra litura) và nấm

gây bệnh thối xám (Botrytis cinerea) đối với cặn chiết tổng các mẫu thực vật

và nấm nội sinh thực vật ở nồng độ 1000 ppm.

Hình 3.3.1. Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính trừ sâu trong phòng

thí nghiệm

Hình 3.3.2. Một số hình ảnh thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng nấm tại

phòng thí nghiệm

Đối chứng Mẫu không có hoạt tính

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả phân lập thực vật và định danh các chủng nấm nội sinh

thực vật

- Hai loài thuộc chi Ngâu là cây Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre) và

cây Gội ối (Aglaia oligophylla Muq.), 1 loài thuộc chi Hồ tiêu là Trầu không

(Piper betle L.) và một loài thuộc chi nghệ là Nghệ vàng (Curcuma longa L.)

được thu hái. Danh pháp các mẫu thực vật này được định tên bởi nhà thực vật

học: Nguyễn Kim Đào (Viện Sinh thái Tài nguyên và Sinh vật, Viện Hàn lâm

KH&CN Việt Nam).

- Bốn (04) chủng nấm nội sinh đã được phân lập từ mẫu rễ và củ nghệ

vàng, được định danh bằng nghiên cứu hình thái bào tử nấm và PCR giải trình

tự gene vùng ITS là Fusarium solani, Fusarium sp., Trichoderma atroviride

và Fusarium oxysporum (Tên gọi ký hiệu lần lươt là Ng1, Ng2, C2 và B1).

Chủng nấm Fusarium oxysporum được sử dụng để nuôi cấy lượng lớn

và tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau.

- Ba chủng nấm nội sinh, được phân lập từ vỏ ngâu (Aglaia

duppereana), đã được xác định tên là Colletotrichum gloeosporioides,

Colletotrichum crassipes và Microdiplodia hawaiiensis.

Kết quả định danh các chủng nấm nội sinh được xác định bằng phương

pháp nghiên cứu hình thái bào tử nấm và chạy PCR giải trình tự gene vùng

ITS, sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4.

Chủng nấm Microdiplodia hawaiiensis được sử dụng để nuôi cấy lượng

lớn và tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau.

- Hai (02) chủng nấm nội sinh đã được phân lập từ lá cây trầu không.

Kết quả phân loại bằng nghiên cứu hình thái bào tử nấm đã xác định hai

chủng nấm nội sinh là Colletotrichum sp. và Fusarium solani.

Chủng nấm Fusarium solani được sử dụng để huôi cấy lượng lớn và

tách chiết dịch chiết tổng cho các thí nghiệm tiếp sau.

Kết quả phân loại và định danh các chủng nấm nội sinh được phối hợp

thực hiện cùng nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Dương Văn Hợp tại Viện Vi

sinh vật và Công nghệ sinh học (IMBT), Đại học Quốc gia Hà Nội.

4.2. Kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm của các dịch

chiết tổng, phân đoạn dịch chiết tổng và chất sạch thực vật, nấm nội sinh

thực vật

Các mẫu dịch chiết thực vật và dịch chiết nấm nội sinh đã được khảo

sát hoạt tính trừ sâu khoang trong phòng thí nghiệm. Các thí nghiệm thử

nghiệm sàng lọc hoạt tính trừ sâu của các dịch chiết được thử nghiệm tại

Phòng Sinh dược – Viện Hóa học.

Kết quả cho thấy ba (03) mẫu dịch chiết cây Ngâu Aglaia duperreana

(lá ngâu, vỏ ngâu, hoa ngâu) có hoạt tính trừ sâu ở nồng độ 1000 ppm, trong

đó 02 mẫu gây chết 100 % sâu sau 24 giờ (gồm dịch chiết vỏ ngâu và lá ngâu)

và 01 mẫu gây chết 40% sâu sau 48h (dịch chiết hoa ngâu) (bảng 4.2.1).

Vì vậy, ưu tiên lựa chọn mẫu vỏ ngâu và lá ngâu có hoạt tính trừ sâu

khoang cao cho những nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất ở khối

lượng lớn để gia công chế phẩm.

Bảng 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptetra

Sau 24h

Sau 48h

Mẫu

KL Sâu

KL sâu TB

Sống Chết Sống Chết

Tỷ lệ sâu sống

Mức tăng trưởng

Ef1 (%) Sau 24h 0 0

10 10 0 0 8

1 Đ/c trắng 2 Đ/c cồn 6 Lá ngâu 7 Vỏ ngâu 49 Hoa ngâu

100.00 94.26 0.00 0.00 61.52

1 0.94 0 0 0.31

100 100 0 0 80

0 0 10 10 2

10 10 0 0 6

0 0 10 10 4

Ef2 (%) Sau 48h 0 0 100 100 100 100 40 20

5 4.72 0 0 0.92 Ghi chú: DC; Đối chứng, KL= khối lượng, TB = trung bình Đề tài cũng đã tiến hành thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng nấm gây

litura) của các mẫu dịch chiết cây ngâu

bệnh thối xám Botrytis cinerea của các mẫu dịch chiết thực vật ở nồng độ

1000 ppm. Kết quả thử nghiệm thu được cho thấy mẫu dịch chiết củ nghệ

vàng có hoạt tính ức chế 100% nấm bệnh. Kết quả kháng nấm bệnh của các

mẫu dịch chiết thực vật và chất phân lập có hoạt tính tại bảng 4.2,2

Bảng 4.2.2. Hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea của các mẫu dịch chiết

Tên mẫu ĐK1 ĐK2 TB KNUC

Đ/c âm

(mm) (mm) (mm) (%)

Dịch chiết củ Nghệ

80 0.00 80 80

Phần chiết Tinh dầu nghệ

0 100.00 0 0

(ar-tumeron)

Dịch chiết lá Trầu không 11

38 52.08 38 38

Phần chiết TKH4

85.63 11.5 12

(eugenol)

Curcumin

4 95.00 4 4

0 100.00 0 0

Ghi chú: ĐK1, ĐK2: đường kính 1,2, TB: đường kính trung bình,

KNUC: khả năng ức chế.

Khả năng ức chế của tinh chất Curcumin đối với chủng nấm Botrytis

cinera là rất tốt. Nồng độ 750ppm đã có khả năng ức chế 100 %, nồng độ 500

ppm có khả năng ức chế 88,75 %. Khi giảm nồng độ xuống 150 ppm,

curcumin cũng có khả năng ức chế lên tới xấp xỉ 25 %. Đối chứng dương, là

kháng sinh Nystatin, ức chế 100%. Tuy nhiên, khả năng ức chế nấm gây bệnh

của ar-tumeron (chất 8) chỉ đạt ngưỡng 52,08%. Từ đó có thể cho kết luận khả

năng ức chế nấm Botrytis cinera của dịch chiết củ Nghệ chủ yếu là curcumin.

Hình 4.2.1. Khả năng ức ché nấm của tinh chất curcumin

Ở cả 3 nồng độ 1000, 750, 500 (ppm), phân đoạn dịch chiết n-hexan

trầu không (TKH) thể hiện khả năng kháng nấm Botrytis cinera lần lượt

tương ứng là 69,88 %; 59,38 % và 43,63 %. Kết quả khảo sát riêng phần chiết

TKH4 (eugenol) lại thể hiện khả năng kháng nấm Botrytis cinera đạt ngưỡng

95%. Đối chứng dương là kháng sinh Plumbagin, ức chế 100%. Kết quả cho

kết luận hợp chất Eugenol có khả năng ức chế mạnh đối với nấm Botrytis

cinera.

Dịch chiết của các chủng nấm nội sinh thực vật đã cho thấy không có

hoạt tích ức chế sinh trưởng của sâu khoang, kể cả dịch chiết chủng nấm nội

sinh cây ngâu Microdiplodia hawaiiensis.

Các cặn chiết (cặn H2O, cặn MeOH và cặn n-hexan) nấm nội sinh cây

nghệ Fusarium oxysporum được tiến hành thử hoạt tính ức chế nấm Botrytis

cinera ở nồng độ 1000 ppm. Kết quả thử hoạt tính của các cặn chiết được mô

tả trong bảng 4.2.3.

Bảng 4.2.3. Hoạt tính ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết F.

Trung

Đĩa 1

Đĩa 2

Đĩa 3

Hoạt

Mẫu

bình

tính %

ĐK1 ĐK2

(mm)

Đ/c âm

80.00

oxysporum

0.00

NB1W

59.33

25.83

NB1H

80.00

0.00

NB1M

35.5

34.83

56.46

Dịch chiết

53,5

tổng

Như vậy có thể thấy cặn chiết MeOH có khả năng ức chế sự phát triển

của chủng nấm Botrytis cinera gây bệnh thối xám trên rau quả là tương đối

cao (56.46%). Cặn chiết nước cũng có hoạt tính nhưng vẫn còn tương đối

thấp (25,83 %). Cặn chiết n-hexan không có hoạt tính ức chế sự phát triển của

chủng nấm Botrytis cinera. Như vậy, chủng nấm F. oxysporum chứa các chất

có hoạt tính ức chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera trong cặn

chiết MeOH, các chất hòa tan trong dung môi n-hexan không có hoạt tính ức

chế sự phát triển của chủng nấm Botrytis cinera.

Hình 4.2.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của

các cặn chiết F. oxysporum

Khả năng ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết, phân đoạn dịch chiết

của các chủng nấm nội sinh thực vật được tổng hợp trong bảng 4.2.4.

Bảng 4.2.4. Khả năng ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết nấm nội

sinh thực vật

Đ/c âm

ĐK1 ĐK2 TB KNUC Tên mẫu (mm) (mm) (mm) (%)

Dịch chiết Nấm nghệ

80 80 0.00 80

Phần chiết Nấm nghệ

38 36 53,5 37

(MeOH)

Dịch chiết Nấm ngâu

35 34 35,5 56.46

Dịch chiết Nấm trầu không

38 36 53.75 37

Curcumin

0 0 100.00 0

Từ các kết quả khảo nghiệm này, chúng tôi có thể xác định được nhóm

đối tượng cần thiết để tập trung nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học.

Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học được trình bày như sau đây.

4.3. Kết quả nghiên cứu các thành phần hóa học của thực vật và nấm nội

ký sinh thực vật

4.3.1. Thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A.

oligophylla)

Từ cặn dịch chiết etyl axetat vỏ cây Ngâu 6 hợp chất đã được phân lập

và xác định cấu trúc hóa học, gồm flavonoid-cinnamic acid amide:

rocaglamide A (1), rocaglamide I (2), rocaglamide W (3), rocaglamide AB

(4), rocaglamide J (5), và rocaglaol (6). Từ cặn dịch chiết diclometan lá cây

Gội ổi đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học của rocaglamide AY (7)

(chất mới). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ UV, MS, 1H-NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố

trước đây đối với các hợp chất đã biết.

4.3.1.1. Hợp chất 1 (Rocaglamide A)

Hợp chất 1 (3,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu (Aglaia

D-90.5 (c, 0.25, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

UV (MeOH) của 1 cho biết λmax 219.7 và 273.0 nm. Phổ khối ESIMS positive cho pic ion giả phân tử m/z 561.1 [M+H]+, m/z 528.4 [M+Na]+ tương ứng với công thức phân tử C29H31NO7.

Phổ 1H-NMR cho thấy sự có mặt của 3 nhóm methoxy dạng singlet

cộng hưởng tại δH 3,81 (OCH3-8), 3,84 (OCH3-6) và 3,66 (OCH3-4’), 2 nhóm

proton metyl của H-5 và H-7 thuộc vòng A được quan sát dạng doublet-meta

tại δH 6,30 và 6,17 có hằng số tương tác spin là 1,9 Hz.

Hai tín hiệu dạng singlet của nhóm N-CH3 được quan sát tại 3,34 và

2,86 ppm. Tín hiệu cộng hưởng rất đặc trưng của hệ spin AA’BB’ của vòng B

xuất hiện tại vùng trường thấp ở δ = 7,12 và 6,64 ppm đã chỉ ra rằng vòng B

đã được thế dạng para, tương ứng cho hai cặp proton H-2’/H-6’ và H-3’/H-5’.

Hệ spin thứ hai của nhóm thế mono phenyl, vòng C được quan sát tại δH 6,86

ppm (m, H-2”/H-6”) và tại 6,98 ppm (m, H-3”/4”/5”). Thêm vào đó, sự xuất

hiện của hệ spin thứ tư của vòng cyclopentan được quan sát tại δH 4,95 ppm

(d, 6,9), 4,36 (d, 13,8 ) và 4,11 (dd, 6,9 &13,8Hz) là của các proton H1α, H2α

và H3β.

Dữ liệu NMR 1H-NMR của hợp chất 1 thu được bằng cách sử dụng

cùng một dung môi được sử dụng cho Rocaglamide A [65]. Do đó, kết quả giống hệt nhau mà không cần thêm các phổ khác. Phân tích dữ liệu phổ 1H-

NMR, MS, UV của 1 kết hợp với so sánh với dữ liệu phổ và hằng số vật lý

trong tài liệu tham khảo [65] hợp chất 1 được xác định là hợp chất

Rocaglamide A. Có cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 1(Rocaglamide A)

4.3.1.2. Hợp chất 2 (Rocaglamide I)

Hợp chất 2 (3,8 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu (Aglaia

D-80 (c, 0.45, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

Phổ UV (MeOH) của 2 cho biết λmax 209 và 279 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 564,1 (M+H)+, 586,4 (M+Na)+ tương ứng với

công thức phân tử C31H33NO9.

Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 cho thấy có hai tín hiệu cộng hưởng

doublet của proton H-5 và H-7 thuộc vòng A ở vị trí meta có hằng số tương

tác spin là 1,9 Hz tại δH 6,26 ppm và 6,11 ppm. Thêm vào đó là tín hiệu của

nhóm metyl xuất hiện tại trường cao tại δH 1,81 ppm đã chỉ ra sự có mặt của

nhóm acetoxy tại C-1. Điều này dẫn đến sự chuyển dịch độ chuyển dịch hóa

học của proton H-1 tới 6,03 ppm. Ngoài ra 2 proton dãy béo H-2 và H-3 cũng

được quan sát thấy trên phổ có tín hiệu cổng hưởng dạng overlap tại δH 4,29 ppm. Phổ 1H-NMR đã chứng minh rằng 1 nhóm hydroxyl tại C-3’ gây ra hiệu

ứng chắn của các proto thơm tại vòng B theo một thứ tự sau đây: H-2’> H-

6’>H-5’. Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại C-3’ làm thay đổi tính chất của vòng B và do vậy trên phổ 1H-NMR sẽ không còn tín hiệu cộng hưởng rất đặc

trưng của hệ AA’BB’ do thế para tại vòng B và chuyển thành hệ ABC. Nhóm

thế tại vị trí này cũng làm thay đổi vị trí của độ dịch chuyển hóa học của 3

nhóm methoxyl: Tại δH 3,73 (OCH3-8), 3,81 (OCH3-6) và tại δH 3,71 (OCH3-

4’). Hai nhóm N-CH3 xuất hiện tại δH 3,34 ppm và 2,86 ppm dưới dạng

singlet.

Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, MS, UV của 2 kết hợp với so sánh với

dữ liệu phổ và hằng số vật lý trong tài liệu tham khảo [65] hợp chất 2 được

xác định là hợp chất Rocaglamide I. Cấu trúc hóa học của 2 như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 2(Rocaglamide I)

4.3.1.3. Hợp chất 3 (Rocaglamide W)

Hợp chất 3 (2,1 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu (Aglaia

D-55,0 (c, 0.45, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

Phổ UV (MeOH) của 3 cho biết λmax 210 và 272,5 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 534,1 (M+H)+, 556,4 (M+Na)+ tương ứng với

công thức phân tử C30H31NO8.

Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 và phổ của hợp chất 3 cho thấy mất một

tín hiệu của nhóm N-Me tại δH 3,34 ppm điều đó có thể giải thích rằng nhóm

CONHCH3 đã thế tại vị trí C-2, thay vì nhóm CON(CH3)2 trong trường hợp

của hợp của hợp chất 2. Hai proton H-5 và H-7 của vòng A cũng được quan

sát dưới dạng meta doublet với J= 1,9 Hz tại δH 6,26 và 6,12 ppm. Hệ tương

tác spin rất đặc trưng AA’BB’ cũng được quan sát tại δH 6,61 (d, J=8,8Hz) và

7,17 (d, J=8,8Hz) đặc trưng cho thế para của vòng B. Tương tự với hợp chất

2, nhóm acetyl tại C-1 cộng hưởng tại δH 1,84 (s). Điều này làm cho độ

chuyển dịch hóa học của H-1 dịch chuyển về vùng trường thấp tại δH 5,99 (d,

6,3), hai proton methyl cộng hưởng tại δH 3,94 (dd, J=5,9 & 14,5Hz) và 4,19

(d, J=14,5Hz) tương ứng cho H-2 và H-3. Giá trị J=14,5Hz chỉ ra tương tác

axial-axial giữa H-2 và H-3. Trong khi hằng số tương tác J=5,9 Hz đặc trưng

cho tương tác axial-equatorial giữa H-2 và H-1.

Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, MS, UV của 3 kết hợp với so sánh với

dữ liệu phổ và hằng số vật lý trong tài liệu tham khảo [65] hợp chất 3 được

xác định là hợp chất Rocaglamide W, với cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (Rocaglamide W)

4.3.1.4. Hợp chất 4 (Rocaglamide AB)

Hợp chất 4 (7,2 mg) thu được dưới dạng vô định hình màu trắng,

[α]20 D-110,0 (c, 0.45, CHCl3). Phổ UV (MeOH) cho biết λmax 210,4 và 272,6 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 548,2 (M+H)+, 570,4 (M+Na)+ tương ứng với công thức phân tử C31H33NO8. Khối lượng phân tử của hợp chất 4 nhỏ hơn hợp chất 2 là 14 đvc. Phổ 1H-NMR của hợp chất 4

cho tín hiệu rất đặc trưng của hệ spin AA’BB’ của vòng B giống như ở hợp

chất 1 và 3. Hai cặp proton H-2’/H-6’ và H-3’/H-5’ cho các tín hiệu ở δH 7,08 ppm (2H, d, J=8.8Hz) 6,54 ppm (2H, d, J=8,8Hz). Thêm vào đó phổ 1H-NMR

cho tín hiệu của 2 nhóm N-Me single tại δH 3,27 và 2,69 ppm cũng giống như

với hợp chất 1. Mặt khác, sự axetyl hóa tại C-1 gây ra sự dịch chuyển độ hóa

học của H-1 ở trường thấp tại δH 5,95 (m) và sự xen phủ của proton H-2 và H-

3 tại δH 4,21 (m) cũng giống như ở hợp chất 2 và 3. Hai proton ở vị trí meta

dạng doublet của H-5 và H-7 tại vòng A cộng hưởng tại δH 6,18 và 6,03 ppm.

Năm proton khác của vòng C thế mono được quan sát thấy tại δH 6,92 và 6,80

ppm, giống như các hợp chất Rocaglamide tương tự. Ba nhóm methoxyl dưới

dạng singlet được quan sát tại δH 3,64, 3,72 và 3,56 ppm tương ứng cho các

nhóm OCH3-6, OCH3-8, OCH3-4’.

Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, MS, UV của 4 kết hợp với so sánh với

dữ liệu phổ và hằng số vật lý trong tài liệu tham khảo [65] hợp chất 4 được

nhận dạng là rocaglamide AB với cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 (Rocaglamide AB)

4.3.1.5. Hợp chất 5 (Rocaglamide J)

Hợp chất 5 (1,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu (Aglaia

D-41,1 (c, 0.22, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

Phổ UV (MeOH) cho biết λmax 211,3 và 278,7 nm. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS (positive mode) cho m/z 509,0 (M+H)+, 531,2 (M+Na)+ tương ứng

với công thức phân tử C28H28NO9.

Trên phổ 1H-NMR của 5, hai proton meta H-5 và H-7 của vòng A cộng

hưởng tại δH 6,27 ppm (d, J=1,9Hz) và 6,15 ppm (d, J=1.9 Hz). Nhóm

hydroxyl tại C-3’ đã thay đổi hệ spin đặc trưng AA’BB’ của vòng B ở các

hợp chất rocglamide thành hệ spin ABC như ở hợp chất 2. Nhóm thế này đã

gây ra sự thay đổi về độ chuyển dịch hóa học giữa 3 nhóm methoxyl: OCH3-6

tại δH 3,81 ppm, OCH3-8 tại δH 3,82 ppm và OCH3-4’ tại δH 3,67 ppm. Ba

proton H-1, H-2 và H-3 cộng hưởng tại δH 5,0 ppm (d, J=5,7 Hz), 3,96 ppm

(dd, J=5,7 & 13,9 Hz) và δH 4,21 ppm (d, J=13,9 Hz). Thêm vào đó, nhóm

methoxyl dưới dạng singlet thuộc phần axetat tại C-2 xuất hiện tín hiệu cộng

hưởng tại δH 3,61 (s). 5 proton thơm của vòng C được quan sát tại δH 6,91-

7,00 ppm, cũng giống như ở các hợp 2, 3 và 4.

Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, MS, UV của 5 kết hợp với so sánh với

dữ liệu phổ và hằng số vật lý trong tài liệu tham khảo [65] hợp chất 5 được

nhận dạng là rocaglamide J với cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 (Rocaglamide J)

4.3.1.6. Hợp chất 6 (Rocaglaol)

Hợp chất 6 (10mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu (Aglaia

D-125 (c, 0.48, CHCl3).

dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

Phổ UV (MeOH) của 6 cho biết λmax 212,8 và 272,3 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 457,10 (M+H)+, 890,9 (2M+Na)+

tương ứng với công thức phân tử C26H26NO6.

Phổ 1H-NMR của hợp chất 6 cho thấy 2 proton meta H-5 và H-7 của

vòng A cộng hưởng tại δH 6,28 ppm (d, J=1,9 Hz) và tại δH 6,17 (d, J=1,9Hz).

Hệ spin rất đặc trưng AA’BB’ của vòng B được quan sát tại δH 7,10 (2H, d,

J=8,8Hz) và tại δH 6,61 (2H, d, J=8,8 Hz). Ba nhóm methoxyl dưới dạng

singlet có tín hiệu cộng hưởng tại δH 3,87 (OMe-6), tại δH 3,85 (Ome-8) và tại

δH 3,81 (Ome-4’). So sánh với hợp chất 1, hợp chất 6 có sự thay đổi tại vùng

aliphatic. Sự cộng hưởng của proton metylen xuất hiện dưới dạng cặp tương

tác geminal đa vạch (m) tại δH 2,06 ppm (ddd, J=1,1, 6,2 & 11,8 Hz) và 2,80

ppm (ddd, J=6,2, 11,8 & 14,0 Hz), cả hai proton này cũng thể hiện tương tác

vicinal với nhóm metyl bao quanh bởi nhóm phenyl và nhóm hydroxyl tại δH

3,89 và 4,69 ppm. Do vậy các tín hiệu của metylen có sự liên kết giữa các

proton metyl. Tín hiệu của nhóm metylen xuất hiện tại δH 2,06 và 2,80 ppm

của H-2α và H-2β đã được lý giải với hằng số tương tác spin khá nhỏ (J=1,5

Hz) ở dạng equatorial-equatorial và hằng số tương tác lớn (14,0 Hz) dạng

axial-axial tương ứng cho H-1β và H-3α.

Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, MS, UV của 6 kết hợp với so sánh với

dữ liệu phổ và hằng số vật lý trong tài liệu tham khảo [65] hợp chất 6được

nhận dạng là rocaglaol với cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 (Rocaglaol)

4.3.1.7. Hợp chất 7 (Rocaglamide AY)- chất mới

Hợp chất 7 (3,3 mg) được phân lập từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla

D-50,5 (c, 0.45, CHCl3). Phổ

Muq.) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20

UV (MeOH) của 7 cho biết λmax 210,4 và 271,1 nm. Phổ khối phân giải cao

HRESI-MS cho peak ion giả phân tử ở m/z = 528,1650 [M + Na]+ , tương ứng

với công thức phân tử C28H27NO8.

Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 7 gần giống phổ của chất

rocaglamide J (hợp chất 5) với tín hiệu của 3 nhóm methoxy ở δH 3,90 (8-

OMe); 3,84 (6-OMe) và 3,71 (4’-OMe), cùng với hai tín hiệu proton thơm

tương tác meta ở δH 6,15 và 6,26 (mỗi tín hiệu d, J=1,9Hz), 5 proton của vòng

thơm bị thế 1 lần tại δH 6,99 – 7,12 ppm và nhóm axetat (δC 57,5 và

170,0ppm). Sự khác biệt của hợp chất 7 so với hợp chất 5 được thể hiện ở hai

điểm. Thứ nhất là nhóm hydroxy ở C-1 trong hợp chất 5 đã được chuyển

thành nhóm thế C-1-oxime trong phân tử, điều này được chứng minh qua sự

dịch chuyển về phía trường thấp của C-1 (δC 153,0 ppm) so với hợp chất 5.

Thứ hai là xuất hiện tín hiệu đặc trưng cho hệ spin AA’BB’ của vòng B tại δH

7,13 (2H, d, J= 8,8Hz) và 6,71 (2H, d, J= 8,8Hz), điều này chứng tỏ nhóm thế

hydroxy đã không tồn tại trong hợp chất 7. Phân tích phổ 2D-NMR của chất 7

kết hợp so sánh với tài liệu dẫn đến kết luận cấu trúc của nó là dẫn xuất C-3’-

demethoxy của rocaglamide T [48,66]. Đây là chất mới và được đặt tên là

rocaglamide AY.

Cấu trúc hóa học của hợp chất 7(rocaglamide AY)

Vị trí

HMBC

COSY

δC (ppm)

δH (ppm)J(Hz)

*δC (ppm) 153,0 57,0 57,1

1 2 3

153,0 57,1 57,2

3,80 (d,13,5) 3,67 (d,13,5)

3 2

3,8b, 9, 1” 2,3a, 9, 1’, 1”,2”/6”

6,26 (d,1,9)

4a,6,7,8a

6,15 (d,1,9)

5,6,8,8a

7,13 (d,8,8) 6,71 (d,8,8)

3a 2’,6’,4’,1”

3’/5’ 2’/6’

6,71 (d,8,8) 7,13 (d, 8,8)

2’/6’,4’,1” 3a

2’/6’ 3’/5’

3”/5” 1”,2”/6”

6,99 (m) 7,12 (m) 7,12 (m)

3”/5” 2”/6”, 4” 3”/5”

105,1 160,0 88,9 164,0 93,0 158,3 107,7 115,0 125,6 113,1 127,8 158,8 126,8 125,6 134,8 127,7 127,8 127,8 170,0

3,90 (s) 3,84 (s) 3,71 (s)

105,7 161,3 89,9 165,3 93,8 160,3 110,0 117,0 128,7 113,2 149,3 149,5 11,5 121,4 136,7 129,4 128,7 128,0 171,7 56,1 56,3 56,3 57,5

8 6 4’ 9 (C=O)

3ª 4ª 5 6 7 8 8ª 8b 1’ 2’b 3’c 4’ 5’c 6’b 1” 2”/6” 3”/5” 4” 9 (CO) 8-OCH3 6-OCH3 4’-OCH3 COOCH3

*δC: Dữ liệu phổ 13C-NMR của rocaglamide T đo trong CDCl3[66]

Bảng 4.3.1.1 Dữ liệu NMR của hợp chất 7 (CDCl3)

4.3.2. Thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.)

Từ cặn dịch chiết diclometan củ Nghệ vàng 2 hợp chất đã được phân

lập và xác định cấu trúc hóa học gồm ar-turmerone (8) và curcumin (9). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết.

4.3.2.1. Hợp chất 8 (Ar-turmerone)

Phổ 1H và 13C-NMR của chất 8 cho thấy phân tử có chứa một vòng thơm thế ở vị trí 1 và 4, thể hiện qua tín hiệu của 4 proton thơm ở δH = 7,1 (m,

4H, H-2,3,5,6) và 6 carbon thơm, gồm có 4 CH và 2 carbon bậc 4; 4 nhóm

methyl gồm ba nhóm bậc ba [δH = 1,84; 2,1 và 2,3 (mỗi tín hiệu 3H, s)], một nhóm bậc hai [δH = 1,23 (3H, d, J = 7Hz), H-15CH3]. Bên cạnh đó phổ NMR còn chỉ ra sự có mặt của một nhóm xeton ở δC = 199,8 (C-9); 1 olefinic proton ở δH 6,02 (H-10) và 3 aliphatic proton cộng hưởng trong vùng từ 2,61 đến 3,28ppm. Các số liệu phổ đã phân tích trên đây hoàn toàn phù hợp với số liệu

của Ar-turmerone trong tài liệu tham khảo [146]. Nghiên cứu gần đây cho biết

hợp chất này thể hiện hoạt tính xua đuổi hai loại côn trùng Sitophilus zeamais

và Spodoptera frugiperda [146].

Cấu trúc hóa học hợp chất 8 (Ar-turmerone)

4.3.2.2. Hợp chất 9 (Curcumin)

Curcumin tinh chất (hợp chất 9) được tinh chế bằng phương pháp sắc

ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan : metanol (98 : 2). Dữ liệu

cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy đây là hỗn hợp 50:50 của hai cấu dạng enol

và xeton của curcumin.

Enol

Keto

Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 (hai cấu dạng của curcumin)

4.3.3. Thành phần hóa học của cây Trầu không (Piper betle L.)

Từ cặn dịch chiết diclometan lá Trầu không 3 hợp chất đã được phân

lập và xác định cấu trúc hóa học gồm eugenol (10), chavicol (11), 4-

allylpyrocatechol (12). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã

công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết.

4.3.3.1. Hợp chất 10 (Eugenol)

Trên phổ 1H-NMR của chất 10 cho thấy tín hiệu của 3 proton thơm của

một vòng thơm bị thế 3 lần ở δH 6,65 (dd, J= 2; 8,5 Hz, 1H, H-3), 6,75 (brs,

1H, H-5), 6,77 (d, J= 2 Hz, 1H, H-6) và các tín hiệu của nhóm allyl: 3 olefinic

proton ở δH 5,03 (H-9); 5,93 (H-8) và một nhóm methylen ở 3,28 (H-7).

Ngoài ra còn có nhóm metyl gắn với vòng thơm ở 3,83 (s, 3H, H-2-OCH3). Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR kết hợp với so sánh dữ liệu phổ chất tham

khảo [147] cho phép khẳng định hợp chất 10 có tên là eugenol.

Cấu trúc hóa học của hợp chất 10 (eugenol)

4.3.3.2. Hợp chất 11 (Chavicol)

Tín hiệu của 11 proton được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR của hợp

chất 11. Trong đó có 3 proton thơm của một vòng thơm bị thế 2 lần ở vị trí

ortho δH 6,77 (m, 2H, H-2,6); 7,04 (m, 2H, H-3,5) và các tín hiệu của nhóm

allyl: 3 olefinic proton ở δH 5,05 (m, 2H, H-9); 5,93 (m, 1H, H-8) và một nhóm methylen tại δH 3,3 (d, J= 6,5, 2H, H-7). Phổ 13C-NMR của 11 cho biết

trong phân tử có tổng 9 cacbon, trong đó có 2 nhóm metylen tại δC 39,5 (C-7)

và 115,2 (C-9) , 5 nhóm metin tại δC 115,4 (C-2,6); 129,6 (C-3,5) và 137,8 (C-

8), 2 cacbon bậc 4 tại δC 132,2 (C-4) và 153,9 (C-1), có 1 cacbon bậc 4 đính với oxi tại δC 153,9 (C-1). Phân tích dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR kết hợp với

so sánh dữ liệu phổ chất tham khảo [148] cho phép khẳng định hợp chất 11 có

tên là chavicol có cấu trúc hóa học dưới đây.

Cấu trúc hóa học của hợp chất 11 (chavicol)

4.3.3.3. Hợp chất 12 (4-allylpyrocatechol)

Tín hiệu của 8 proton được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR của chất

12. Trong đó có 3 proton thơm của một vòng thơm tại δH 6,62 (dd, J = 2,0 và

8,1Hz, 1H, H-5); 6,70 (d, J= 2,0Hz, 1H, H-6); 6,78 (d, J= 8,1Hz, 1H, H-3) và

các tín hiệu của nhóm allyl: 3 olefinic proton ở δH 5,03 (m, 1H, H-9cis); 5,06

(m, 1H, H-9trans); và 5,90 (m, 1H, H-8) và một nhóm methylen tại δH 2,05

(2H, d, J= 6,7 Hz, H-7). Ngoài ra, phổ còn cho thấy tín hiệu của 2 nhóm

hydroxy tại δH 5,48 (1-OH); 5,53 (2-OH) (br s, mỗi tín hiệu 1H).

Các số liệu phổ của 12 hoàn toàn trùng khớp với chất 4-

allylpyrocatechol trong tài liệu tham khảo [148].

Cấu trúc hóa học của hợp chất 12 (4-Allylpyrocatechol)

4.3.4. Thành phần hóa học nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu

Từ cặn dịch chiết diclometan nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu,

2 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học gồm Scopararane C

(13) và Diaporthein B (14). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu

đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết.

4.3.4.1. Hợp chất 13 (Scopararane C)

Hợp chất 13 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,87

(hệ dung môi n-hexan-ethyl acetate 3:1), điểm nóng chảy 171,6 0C.

Phổ 1H NMR của chất 13 cho thấy tín hiệu của 4 olefinic proton cộng

hưởng tại δH 7,04 (1H, d, J=1,5Hz, H-14); 5,87 (1H, dd, J=17,5; 10,5Hz, H-

15a) và 5,05 (1H, dd, J=11,0; 0,5Hz, H-15b); 5,11 (1H, dd, J=17,5; 0,5Hz,

H-16) của hai nối đôi, một nối đôi bị thế một lần và một nối đôi bị thế 3 lần; 4

nhóm metyl dưới dạng singlet tại δH 1,20 (s, 6H, H-17,20); 1,29; 1,40 (mỗi

tín hiệu 3H, s, H-18,19) và 10 aliphatic proton cộng hưởng trong vùng từ 1,4 đến 2,0 ppm. Phổ 13C NMR của hợp chất 13 cho tín hiệu của 20 cacbon, trong

đó có 4 nhóm CH3, 6 nhóm CH2, 2 nhóm CH và 8 carbon bậc 4. Bên cạnh các tín hiệu phù hợp với phổ 1H, phổ 13C NMR còn cho thấy sự có mặt của 1

nhóm carbonyl (δC 181,6, C-7), 1 nối đôi bị thế 4 lần tại δC 142,7 (C-5), trong

đó có tín hiệu dịch về phía trường thấp ở δC 144,4 (C-6) chứng tỏ có nhóm thế

hydroxy gắn ở nối đôi và một carbon aliphatic có liên kết với oxy thể hiện ở

tín hiệu δC 74,1 (C-9). Dữ liệu phổ NMR của 13 xem bảng 4.3.4.1. Các số liệu phổ 1H và 13C NMR phân tích trên đây kết hợp so sánh với số liệu trong tài

liệu tham khảo [149] cho phép khẳng định hợp chất 13 có tên gọi Scopararane

C. Cấu trúc hóa học như sau.

Cấu trúc hóa học của hợp chất 13 (Scopararane C)

4.3.4.2. Hợp chất 14 (Diaporthein B)

Chất 14 thu được dưới dạng tinh thể dạng vảy hình vuông màu trắng, Rf

= 0,33 (dm: n-hexan-ethyl acetate 3:1), đnc. 189,6 0C.

Phổ khối ESI-MS cho peak ion phân tử ở m/z 363 [M – H]-. Kết hợp với phân tích sơ bộ số liệu phổ MS, phổ 1H và 13C NMR, có thể khẳng định

14 là một diterpen với công thức phân tử C20H28O6.

Phổ 1H và 13C NMR của 14 gần tương tự như của chất 13 chỉ khác ở ba

điểm sau: Điểm thứ nhất là tín hiệu của nhóm methyl C-20 tại δH 1,20 trong

chất 14 được thay thế bởi tín hiệu của nhóm oxy-methylen tại δH 3,71 và 4,14

(mỗi tín hiệu d, J= 10,0Hz, H-20). Điểm khác biệt thứ hai là sự biến mất tín

hiệu của 2 carbon olefinic và xuất hiện 2 carbon bậc 4 aliphatic có gắn với

oxy ở δC 81,9 (C-5) và 104,1(C-6) trong chất 14. Tín hiệu dịch chuyển về phía

trường thấp ở 104,1ppm (C-6) do là do có liên kết với 2 nguyên tử oxy. Hai

sự khác biệt này có thể giải thích do việc tạo liên kết ete giữa C-20 và C-6. Ba

là, phổ của chất 14 còn thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm oxy-methin ở δH 4,03

(1H, dd, H-11) và δC 67,7(C-11).

Phân tích dữ liệu phổ 1D-NMR, MS, của 14 kết hợp với so sánh với dữ

liệu phổ trong tài liệu tham khảo [150] hợp chất 14 được nhận dạng là

diaporthein B với cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 14 (Diaporthein B)

Vị trí C

Bảng 4.3.4.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 13 và 14

13 13 1,53 (m); 2,0 (m) 1,66 (m) 1,45 (m); 1,56 (m)

1H-NMR (CDCl3) (δ ppm) 14 1,97 (m); 2,04 (m) 30,06 1,63 (m); 1,68 (m) 17,7 1,27 (m); 1,60 (m) 41,4 35,4

13C-NMR (CDCl3) (δ ppm) 14 25,2 17,7 37,5 37,3

13C-NMR (CDCl3) (δ ppm) 14* 25.2 17.6 37.5 37.3

1 2 3 4

142,7

81,9

142.8

81.9

144,4

104,1

144.4

104.1

181,6

196,3

181.6

196.2

133,7

134,7

133.7

34.7

76,2

74,1

74.1

76.2

51,1

45,1

45.1

51.1

67,7

25,2

25.2

67.7

1,59 (m); 1,8 (m)

29,6

81,92

29.5

39.9

1,94 (m); 1,97 (m)

4,03 (dd) 1,75 (m) 2,07 (m)

40.1 150.4 144.1

38,7 6,81 (d; 2) 147,8 5,82 (dd, 17,5; 11) 112,5

40,01 150,5 144,0

38.8 147.9 145.4

13 14 15

145,4

113,1

112.6

113.1

5,1 (m)

23,3

25,97

23.3

25.9

7,04, (d; 1,5) 5,87 (dd, 17,5; 10,5) 5,05 (dd; 11,0; 0,5); 5,11 (dd; 17,5; 0,5) 1,20 (s)

1,22 (s)

30,6

26,97

30.1

26.9

1,40 (s)

1,19 (s)

26,9

23,73

26.9

23.7

1,29 (s)

29,4

68,66

29.4

68.6

1,20 (s)

-OH 6,72 (s)

1,44 (s) 3,71 (d, J=10,0); 4,14 (d, J=10,0) 4,97 (s)

13* 30.6 17.7 41.1 35.4

13*: Scopararane C đo trong CDCl3; 1H-NMR (500 MHz); 13C-NMR (125 MHz) [149]. 14*: Diaporthein B đo trong CDCl3; 1H-NMR (500 MHz); 13C-NMR (125 MHz) [150].

4.3.5. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng

Từ cặn dịch chiết metanol nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng,

các hợp chất 15-26 được nhận dạng bằng phương pháp kỹ thuật sắc ký ghép

khối phổ (GC/MS ) và 4 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa

học gồm β-sitosterol (27), 4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A (28),

(4S,4aR,9aR)-4a-carbomethoxy-1,4,4a,9a-tetrahydro-4,8-dihydroxy-6

methylxanthone)(29) và (24R)-methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol (30).

Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trước đây đối với

các hợp chất đã biết.

4.3.5.1. Các hợp chất từ 15 đến 26

Các hợp chất từ 15 đến 26 được nhận dạng bằng phương pháp kỹ thuật

sắc ký ghép khối phổ (GC/MS, Gas Chromatography Mass Spectometry). Kết

quả GC/MS các chất 15-26 được mô tả trong bảng 4.3.5.1.

Fatty acids 14: 0 15:0 16:1n-7 16: 0 17: 0 18: 2(n-6) 18:1(n-9) 18:1(n-7) 18: 0 20:0 22:0 24:0

Tên khoa học Tetradecanoic acid Pentadecanoic acid 9-hexadecenoic acid Hexadecanoic acid Heptadecanoci acid Octadecadienoic acid Octadecenoic acid Octadecenoic acid Octadecanoic acid Eicosanoic acid Docosanoic acid Tetracosanoic acid

Hàm lượng % 0.93 0.20 2.55 29.04 2.82 27.98 28.63 0.27 6.9 0.34 0.17 0.17

Bảng 4.3.5.1. Kết quả GC-MS các chất 15-26

TT Time 15 10.39 16 13.57 17 16.46 18 17.22 19 19.69 20 24.07 21 24.28 22 24.49 23 25.34 24 33.75 25 41.92 26 49.68

Hình 4.3.5.1. Phổ sắc ký GC-MS của các chất 15-26

4.3.5.2. Hợp chất 27 (β-sitosterol)

Hợp chất 27 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy là 132-133 OC, Rf = 0,26 (hệ dung môi triển khai n-hexan-axeton

9:1). Sau đó sử dụng sắc ký TLC với chất chuẩn β-sitosterol và đã xác định

hợp chất 27 là β-sitosterol, với cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 27 (β-sitosterol)

4.3.5.3. Hợp chất 28 (4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A)

Phổ 1H NMR của chất 28 cho tín hiệu của 4 olefinic proton ở H 5.88

(H-3), 6.06 (H-2), 6.29 (H-5) và 6.38 (H-7); một proton hydroxy methin ở H

4.67 (d, J=5Hz, H-4), ba aliphatic proton ở H 2.67 (H-1a), 2.76 (H-1b) và

3.64 (H-9a). Ngoài ra, tín hiệu của một nhóm methyl gắn với vòng thơm (H

2.28 s, 3H, 6-CH3), một nhóm hydroxyl có liên kết cầu hydro nội phân tử (H

11.52 s, 1H, 8-OH), một nhóm methoxy (H 3.64 s, 3H, H-9a) cũng được quan sát thấy trên phổ 1H NMR. Trên phổ 13C-NMR, hợp chất 28 còn cho các

tín hiệu của nhóm xeton ở C 197.7 (C-9), một nhóm carboxy ở C 168.4

(COOCH3) cùng với 5 carbon bậc 4 ở C 85.2 (C-4a), 105.1 (C-8a), 149.9 (C-

6), 157.6 (C-10a), 161.4 (C-8). Các số liệu phổ phân tích trên đây của hợp

chất 28 hoàn toàn trùng khớp với số liệu của hợp chất (4R,4aS,9aR)-1,9a-

dihydronidulalin A trong tài liệu tham khảo [151]. Do vậy, hợp chất 28 được

xác định là 4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A. Số liệu phổ của hợp chất

28 được thể hiện trong bảng 4.3.5.2 với cấu trúc hóa học như sau:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 28 (4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A)

4.3.5.4. Hợp chất 29 (4S,4aR, 9aR)-4a-carbomethoxy-1,4,4a,9a-tetrahydro-

4,8-dihydroxy- 6-methylxanthone)

Phổ NMR của hợp chất 29 rất tương tự như phổ của hợp chất 28, đây

cũng là dẫn xuất 4a-carbomethoxy-4,8-dihydroxy-6-methylxanthone. Sự khác

biệt thể hiện ở độ dịch chuyển về phía trường thấp (C 3,18ppm) của C-4 và

dịch chuyển về phía trường cao (C 2,51ppm) của C-4a so với hợp chất 28.

Điều này cho phép dự đoán hợp chất 29 là đồng phân quang học của chất 28.

Cấu trúc của 29 được xác định là (4S,4aR, 9aR)-4a-carbomethoxy-1,4,4a,9a-

tetrahydro-4,8-dihydroxy- 6-methylxanthone khi so sánh số liệu phổ của nó

với tài liệu tham khảo [151]. Số liệu phổ của hợp chất 29 được thể hiện trong

bảng 4.3.5.2.

Cấu trúc hóa học của hợp chất 29 (4S,4aR, 9aR)-4a-carbomethoxy-

1,4,4a,9a-tetrahydro-4,8-dihydroxy- 6-methylxanthone

STT

Bảng 4.3.5.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 28 và 29

1H

Hợp chất 28 13C

13C-28* 1H

Hợp chất 29 13C

13C-29*

2.67 m, 1H

25.6

24.5, CH2 24.5

25.6, CH2

2.76 m, 1H

6.06 m, 1H

132.6, CH 132.6

5.96 m, 1H

127.5, CH 127.4

5.88 m, 1H

123.7, CH 123.7

5.79 m, 1H

127.3, CH 127.3

4.67 d, 5, 1H 66.1, CH 66.0

4.62 m, 1H

69.3, CH

69.3

85.2, C

85.2

82.7, C

82.7

6.29 s, 1H

108.1, CH 108.0

6.43 s, 1H

108.4, CH 108.4

149.9, C

149.8

151.1, C

151.1

6.38 s, 1H

111.2, CH 111.2

6.49 s, 1H

111.1, CH 111.1

161.4, C

161.3

162.5, C

162.5

105.1, C

105.1

103.6, C

103.6

197.7, C

197.7

197.1, C

197.1

3.64 m, 1H

40.3, CH 40.3

3.34 dd

45.2, CH

45.2

(7&11), 1H

10a

157.6, C

157.6

159.0, C

159.0

6-CH3

2.28 s, 3H

2.36 s, 3H

22.6

22.4, CH3 22.4

22.6, CH3

OH-8

11.52 s, 1H

40.3

11.34 s, 1H

168.4, C

168.3

170.7, C

170.7

COOCH3 -

3.77 s, 3H

53.4, CH3

52.9 CH3

COOCH3 3.64 s, 3H 52.9 53.4 28*: 4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A đo trong CDCl3; 13C-NMR (125 MHz) [151].

29*:(4S,4aR,9aR)-4a-carbomethoxy-1,4,4a,9a-tetrahydro-4,8-dihydroxy-6methylxanthone đo trong CDCl3; 13C-NMR (125 MHz) [151].

4.3.5.5. Hợp chất 30 (24R-methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol)

Hợp chất 30 thu được dưới dạng bột màu trắng tan trong methanol nóng, nhiệt nóng chảy là 221-224oC, Rf = 0.61 (hệ dung môi diclometan-

methanol 9:1).

100

Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 6 nhóm methyl, bao gồm hai tín

hiệu đơn (singlet) tại δH 0.91 (H-18); 0.54 (H-19) và bốn tín hiệu kép

(doublet) ở δH = 0.99 (J= 6.5Hz, H-30); 0.88 (J= 7.0 Hz, H-28); δH = 0.81 (J =

6.5Hz, H-27) và δH = 0.80 (d, J= 6.5Hz, H-26). Ngoài ra, sự có mặt của hai

nối đôi thể hiện qua ba tín hiệu, gồm có hai proton ở vị trí trans của một nối

đôi bị thế 2 lần tại δH 5.23 (dd, 1H, J=7.5 & 15.5Hz, H-23); 5.17 (dd, 1H, J=8

& 15.5Hz, H-22) và một proton của nối đôi bị thế ba lần tại δH = 5.08 (1H, m,

H-7); tín hiệu của ba nhóm hydroxyl ở δH 4.48 (1H, d, J=5.5Hz, H-29), 4.22

(1H, d, J=5.5Hz, H-30) và 3.58 (1H, s, H-31); tín hiệu của hai nhóm methin

có gắn với nhóm hydroxyl ở δH 3.76 (1H, m, H-3), 3.37 (1H, s, H-6) và 20

aliphatic proton trong vùng từ 1.2 đến 2.0ppm cũng được quan sát thấy trong phổ 1H-NMR. Phổ 13C-NMR cho thấy phân tử chất 30 có 28 nguyên tử cacbon, hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ 1H-NMR, bao gồm hai nối đôi ở δC

139.6 (C-8), 135.3 (C-22), 131.3 (C-23) và 119.4 (C-7); ba cacbon có gắn với

oxy ở δC 74.4 (C-5), 72.1 (C-6), 65.9 (C-3); 6 nhóm methyl ở δC 12.0 (C-19),

17.2 (C-28), 17.6 (C18), 19.4 (C-26), 19.7 (C-27), 20.9 (C-20) và 15 cacbon

cộng hưởng trong vùng từ 21.30 đến 55.30 ppm. Phân tích các dữ liệu phổ

1D-NMR cho phép dự đoán hợp chất 30 là một sterol dạng

trihydroxyergostane. Cấu trúc của hợp chất 30 được kết luận là (24R)-

methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol khi so sánh với tài liệu [18]. Hợp

chất này đã được phân lập trước đây từ một loài san hô mềm Sinularia sp.

Cấu trúc hóa học của hợp chất 30 như sau:

Cấu trúc hóa học của chất 30 (24-methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol)

101

STT 1H (DMSO)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

43.1 33.4 19.8 20.2 17.8

Bảng 4.3.5.3 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 30

13C* (DMSO) 32.6 1.6 m & 1.2 m 33.9 1.4 m & 1.3m, 1H 67.6 3.76 m, 1H 41.9 1.9 m & 1.4 m 76.1 - 74.2 3.37 m, 1H 120.4 5.08 m, 1H 141.6 - 43.8 1.92m, 1H 38.1 - 22.4 1.42 m 39.9 1.95 m & 1.23 m 43.8 - 55.3 1.80 m 23.5 1.48 m & 1.3 m 28.5 1.7 m & 1.2 m 56.2 1.25 m 18.8 0.91 s, 3H 12.5 0.54 s, 3H 21.5 0.99 d (6.5 , 3H) 40.8 2.0 m 5.17 dd, 1H, 8 & 15.5 136.2 5.23 dd, 1H 7.5 & 15.5 132.1 1.82 m, 1H 1.4 m, 1H 0.80 d (6.5, 3H) 0.81 d (6.5, 3H) 0.88 d (7.0, 3H) 4.48 d (5.5, 1H) OH 4.22 d (5.5, 1H) OH 3.58 s, 1H OH

30*: 4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A đo trong CDCl3; 13C-NMR (125 MHz) [18].

Hợp chất 30 (1H-NMR: 500Hz và 13C-NMR: 125 MHz) 13C (DMSO) 31.1 CH2 32.4 CH2 65.9 CH 40.0 CH2 74.4 C 72.1 CH 119.4 CH 139.6 C 42.2 CH 36.6 C 21.3 CH2 39.0 CH2 42.9 C 54.1 CH 22.5 CH2 27.6 CH2 55.3 CH 17.6 CH3 12.0 CH3 20.9 CH3 39.9 CH 135.3 CH 131.3 CH 41.9 CH 32.4 CH 19.4 CH3 19.7 CH3 17.2 CH3

4.3.6. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. sonani của Trầu không

Từ cặn dịch chiết etyl axetat nấm nội ký sinh F. sonani của Trầu không

đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ergosterol (31). Cấu trúc hóa học của hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ 1H- , 13C-NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trước đây.

102

Hợp chất 31 (Ergosterol):

Hợp chất 31 (7.1mg), là tinh thể hình kim màu, nhiệt độ nóng chảy

168-169°C.

Phổ 13C-NMR cho biết trong phân tử hợp chất 31 có tổng 28 cacbon,

bao gồm 6 nhóm metyl, 7 nhóm metylen, 11 nhóm metine và 4 cacbon bậc

bốn.

Số liệu phổ NMR của hợp chất 31 cho phép dự đoán đây là chất khung

sterol, thể hiện qua tín hiệu đặc trưng của một nhóm hydroxy metin tại H

3.69 (1H, m, H-3), C 70.4 (C-3), 5 nhóm metyl, bao gồm 2 tín hiệu singlet ở

H 0.61 (H-18), 0.92 (H-19) và 3 tín hiệu doublet ở H 0.88 (H-27), 0.97 (H-

28) và 1.09 (H-26) cùng nhiều aliphatic proton cộng hưởng trong vùng từ khoảng 1.2 đến 2.5ppm. Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR của hợp chất 31 còn cho

thấy sự có mặt của ba nối đôi, thể hiện qua tín hiệu của 4 olefinic proton ở H

5.25 (2H, -H-22,23), 5.43 (1H, H-7) và 5.62 (1H, H-6) và 6 olefinic carbon ở

C 116.3 (C-7), 119.6 (C-6), 132.0 (C-23), 135.5 (C-22), 139.8 (C-5) và 141.3

(C-8). So sánh số liệu phổ của hợp chất 31 với tài liệu tham khảo [152] có thể

kết luận hợp chất 31 có tên gọi là ergosterol. Sinh tổng hợp ergosterol có thể

ức chế các loại nấm gây bệnh, vi sinh vật gây bệnh, làm hóa chất sản xuất các

loại thuốc chữa bệnh trong nông nghiệp và có khả năng gây độc tế bào. Số

liệu phổ NMR của hợp chất 31 được trình bày như bảng 4.3.6.1. Cấu trúc hóa

học của hợp chất 31:

Cấu trúc hóa học của hợp chất 31 (Ergosterol)

103

Vị trí C H (ppm)

3.69 (m)

5.62 (dd, 2.4, 5.4) 5.43 (dd, 2.4, 5.4)

0.61 (s) 0.92 (s)

1.01 (d, 6.6) 5.20 (dd, 7.8, 15.0) 5.20 (dd, 7.8, 15.0)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

1.09 (d, 6.6) 0.88 (d, 6.6) 0.97 (d, 6.6)

Bảng 4.3.6.1 Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 31

C (ppm) 31* 38.4 32.0 70.4 40.8 139.8 119.6 116.3 141.3 46.2 37.0 21.1 39.1 42.8 54.6 23.0 28.3 55.7 12.0 17.6 40.4 21.1 135,6 132.0 42.8 33.1 19.6 19.9 16.2 C (ppm) DEPT CH2 38.4 CH2 32.0 CH 70.4 CH2 40.8 C 139.8 CH 119.6 CH 116.3 C 141.3 CH 46.2 C 37.0 CH2 21.1 CH2 39.1 C 42.8 CH 54.6 CH2 23.0 CH2 28.3 CH 55.7 CH3 12.0 CH3 17.6 CH 40.4 CH3 21.1 CH 135,6 CH 132.0 CH 42.8 CH 33.1 CH3 19.6 CH3 19.9 CH3 16.3 31*: Ergosterol đo trong CDCl3; 1H-NMR (500 MHz); 13C-NMR (125 MHz) [152].

4.4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh

học thực vật và nấm nội sinh thực vật

4.4.1. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học

cây Ngâu và nấm nội sinh cây Ngâu

Kết quả phân lập và xác định cấu trúc của vỏ cây Ngâu đã thu được 6

hợp chất rocaglamide là rocaglamide A, rocaglamide I, rocaglamide W,

104

rocaglamide AB, rocaglamide J và rocaglaol. Kết quả phân lập và xác định

cấu trúc của nấm nội sinh cây Ngâu (nấm Ngâu) thu được 2 hợp chất là

scopararane C và diaporthein B.

Sáu hợp chất rocaglamide nêu trên lần đầu tiên được phân lập từ vỏ cây

Ngâu. Kết quả thu được cho thấy có sự tương đồng với các kết quả phân lập

các hợp chất từ các loài thuộc chi Aglaia.

Thành phần hóa học các hợp chất phân lập từ cây Ngâu và nấm Ngâu là

hoàn toàn khác nhau. Sự khác biệt này cũng một phần nào lý giải kết quả

khảo nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết vỏ Ngâu ức chế sinh

trưởng sâu khoang, tuy nhiên dịch chiết nấm Ngâu không thể hiện khả năng

ức chế này.

4.4.2. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học

cây Nghệ vàng và nấm nội sinh cây Nghệ vàng

Kết quả phân lập củ Nghệ vàng đã thu được 2 hợp chất là ar-turmerone

và curcumin (cả 2 cấu dạng enol và keto). Kết quả phân lập nấm nội sinh cây

nghệ vàng (nấm Nghệ) thu được 16 hợp chất bao gồm 12 hợp chất có trong

tinh dầu, β-sitosterol, (4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A, (4S,4aR, 9aR)-

4a-carbomethoxy-1,4,4a,9a-tetrahydro-4,8-dihydroxy-6-methylxanthone và

(24R)-methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol.

Kết quả phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng tương đồng với các

nghiên cứu trước đây, các hợp chất có trong tinh dầu Nghệ vàng chủ yếu

thuộc nhóm sesquiterpene và monoterpene (pinen, limonene, tecpinen,

curcumene, cumene, caryophyllen, linalool, camphen, turmerone, ar-

turmerone, curlone, cymene, sesquiphellandrene...).

Khả năng ức chế B. cinera của tinh chất curcumin cũng đã được nhiều

nhóm nghiên cứu khảo nghiệm và cho kết quả tốt. Trong khảo sát của chúng

tôi cho kết luận, curcumin đóng vai trò chính tạo nên khả năng ức chế nấm

bệnh của củ nghệ vàng.

105

Thành phần hóa học các hợp chất tự nhiên giữa củ Nghệ vàng và nấm

Nghệ là rất khác nhau. Tuy nhiên cả dịch chiết củ Nghệ và dịch chiết nấm

Nghệ đều cho thấy khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm B. cinera. Điều

này khẳng định hướng nghiên cứu và sử dụng nấm nội ký sinh thực vật để

điều chế hợp chất thay thế hợp chất từ thực vật từ củ Nghệ vàng là hoàn toàn

khả thi và có tính thực tế.

Hợp chất 30 (24R-methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol) đã được

phân lập trước đây từ một loài san hô mềm Sinularia sp., chúng tôi đã phân

lập được từ chủng nấm nội ký sinh cây nghệ vàng (F. oxysporum).

4.4.3. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học

cây Trầu không và nấm nội sinh cây Trầu không

Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học của lá cây Trầu không

đã thu được 3 hợp chất là eugenol, chavicol và 4-allylpyrocatechol. Kết quả

phân lập và xác định cấu trúc hóa học nấm nội sinh cây Trầu không (nấm

Trầu không) thu được 01 hợp chất là ergosterol.

Kết quả phân lập được các hợp chất từ lá Trầu không cho thấy sự

phù hợp với các kết quả đã công bố. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo

sát thấy dịch chiết lá Trầu không có khả năng ức chế mạnh nấm B. cimera

(85,63%), trong đó khả năng ức chế nấm bệnh của hợp chất eugenol có trong

lá trầu không là rất mạnh (95%).

Các hợp chất phân lập được từ Trầu không và nấm Trầu không là khác

nhau. Dịch chiết nấm Trầu không còn có khả năng ức chế B. cinera cao hơn

dịch chiết tổng Trầu không (100% so với 85,63%).Kết quả này đặt ra những

câu hỏi lý thú về mối quan hệ cộng sinh, hỗ trợ của nấm nội sinh thực vật với

cây chủ. Đồng thời cũng củng cố thêm tiềm năng tìm kiếm các hoạt chất hóa

học có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh thực vật để sử dụng thay thế cho

chiết tách nguyên liệu thực vật là hoàn toàn khả thi và thực tế.

106

KẾT LUẬN

Từ những kết quả đã được trình bày ở trên, luận án rút ra một số kết

luận chính như sau:

1. Lần đầu tiên ở Việt Nam, mối liên quan giữa thực vật và nấm nội sinh

thực vật trên các loài Ngâu, Nghệ vàng và Trầu không về thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học đã được nghiên cứu một cách có hệ thống. Đã phát hiện

có những khác biệt giữa thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chiết

phẩm thực vật và nấm nội sinh. Điều này khẳng định mối quan hệ cộng sinh,

hỗ trợ giữa cây chủ và nấm nội sinh, cũng như tiềm năng tìm kiếm từ nấm nội

sinh thực vật các hoạt chất thay thế để sản xuất chế phẩm sinh học.

2. Tổng số có 19 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc (bao

gồm: 7 hợp chất từ cây Ngâu ta (A. duperreana Pierre) và cây Gội ổi (A.

oligophylla Miq.) gồm 6 hợp chất đã biết rocaglamide A, I, W, AB, J,

rocaglaol và 1 hợp chất mới rocaglamide AY; 2 hợp chất đã biết ar-tumeron,

curcumin từ cây Nghệ vàng (C. longa L.); 3 hợp chất đã biết eugenol,

chavicol, 4-Allylpyrocatechol từ cây Trầu không (P. betle L.); 2 hợp chất đã

biết scopararane C, diaporthein B từ nấm nội sinh cây Ngâu (M. hawaiiensis);

4 hợp chất đã biết β-sitosterol, 4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A, 4S,4aR,

9aR)-4a-carbomethoxy-1,4,4a,9a-tetrahydro-4,8-dihydroxy- 6-

methylxanthone, (24R)-methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol từ nấm nội

sinh cây Nghệ vàng (F. oxysporum); và ergosterol từ nấm nội sinh cây Trầu

không (F. solani)) và đã nhận dạng 12 acid béo từ nấm nội sinh cây Nghệ

vàng (F. oxysporum) bằng GC-MS.

3. Tổng số có 9 chủng nấm nội ký sinh thực vật đã được phân lập và

định danh. Đây là những công bố đầu tiên về khu hệ các chủng nấm nội sinh

trên cây ngâu ta, nghệ vàng và trầu không Việt Nam.

107

4. Các phần chiết cành lá và vỏ cây Ngâu ta thể hiện hoạt tính 100% ức

chế sinh trưởng sâu khoang (Spodoptetra litura). Các phần chiết nghệ vàng,

nấm nội sinh nghệ vàng, nấm nội sinh trầu không và tinh chất curcumin ức

chế 100% sinh trưởng nấm gây bệnh thối xám (Botrytis cinera). Lần đầu tiên

cây nghệ vàng và tinh chất curcumin được nghiên cứu một cách hệ thống để

sử dụng làm nguyên liệu gia công chế phẩm thuốc trừ nấm sinh học..

108

KIẾN NGHỊ

Các kết quả nghiên cứu của luận án trên 7 loài thực vật và nấm nội sinh

thực vật đã phân lập và xác định nhiều hợp chất có cấu trúc lý thú và có hoạt

tính ức chế mạnh đối với sâu và nấm bệnh hai cây trồng. Trong thời gian tới,

hoá thực vật và hoạt tính sinh học của chúng cần được tiếp tục nghiên cứu sâu

rộng hơn nhằm khám phá các cấu trúc hóa học và hoạt tính mới, làm sáng tỏ

cơ chế tác dụng cũng như mối quan hệ cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học

của các hoạt chất. Với những chất có hoạt tính tốt cần định hướng ứng dụng

vào cuộc sống.

109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

Bài báo khoa học

1. (2013), Nghiên cứu chế tạo chế phẩm Funbv trừ nấm Botrytis cinerea

gây hại trên cây trồng từ dịch chiết củ nghệ vàng (Curcuma longa). Hóa

học và Ứng dụng, 3(19), 29-32. ISSN 1859-4069

2. (2013). Nghiên cứu khả năng ức chế nấm Botrytis cinerea gây bệnh

thối xám trên cây rau quả từ củ nghệ vàng (Curcuma longa) của Việt

Nam. Hóa học và Ứng dụng, 5(21), 10-13. ISSN 1859-4069

3. (2014) New rocaglamide derivatives from Vietnamese Aglaia species.

Natural Product Communications, 9 (6). pp. 833-834. ISSN 1934-

578X

4. (2014). Nghiên cứu hiệu quả phòng trừ nấm gây hại rau quả của chế

phẩm FUNBV tại Mê Linh, Hà Nội. Tạp chí hóa học T.52(6A) 93-97.

ISSN 0866-7144

5. (2016) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính của nấm nội sinh phân

lập từ cây nghệ vàng. Tạp chí hóa học, 54(3) 382-386. ISSN 0866-7144

Poster

1. (2015). Study on ability of Funbv botanical product to control

fungal diseases on vegetables in Me Linh, Hanoi. The fourth youth

scientific Conference, Institute of Chemistry, VAST, Feb. 4th

2. (2016). Stuty on structure of endophytic fungi substances isolated

from medical Vietnamese plants. Molecular biology and its

applications in health and food/feed production in South-East Asia,

IPMB Alumni Meeting, Sep. 18–21, Can Tho University.

110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Melnikov (1972), Chemistry of pesticides.

2. Buss E.A, and Park-Brown S.G (2002). Natural Products for Insect Pest

Management, ENY-350, Institute of Food and Agricultural Sciences,

University of Florida.

3. Dewick P.M (2003). A Biosynthetic Approach. Medicinal Natural

Products, Second Edition, Willey.

4. Cloyd R.A (2004). Natural Indeed: Are Natural Insecticides Safer and

Better Than Conventional Insecticides. Pesticide review 17(3),121-125.

5. Duke S.O (1990). Natural pesticides from plants, 511-517.

6. http://www.vast.ac.vn/tin-tuc-su-kien/tin-khoa-hoc/trong-nuoc/1457-

nghien-cuu-khu-he-nam-noi-ky-sinh-trong-cac-cay-thong.

7. Yang, X. N., Jin, Y. S., Zhu, P., and Chen, H. S. (2010), Amide from

Uvaria microcarpa, Chem. Nat. Compd., 46 (2), 324–326.

8. Xu, Q. M., Zou, Z. M., Xu, L. Z., and Yang, S. L. (2005), New

polyoxygenated cyclohexenes from Uvaria kweichowensis and their

antitumour activities, Chem. Pharm. Bull., 53 (7), 826–828.

9. Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N., (2008),

“Bacterial endophytes: recent developments and applications”, FEMS

Microbiol Lett, 278, 1–9.

10. Cui Y., Yi D., Bai X., Sun B., Zhao Y., Zhang Y., (2012), “Ginkgolide

B produced endophytic fungus (Fusarium oxysporum) isolated from

Ginkgo biloba”, Fitoterapia, 83, 913–920.

11. Zhang, C. R., Wu, Y., and Yue, J. M. (2010), Polyoxygenated seco-

cyclohexene derivatives from Uvaria tonkinensis var. subglabra, Chin J

Nat Med, 8 (2), 84–87.

111

12. Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản,

Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Thu Hường, Châu Văn Minh và Phan

Văn Kiệm (2007), Họ Na (Annonaceae) ở Việt Nam - Nguồn hoạt chất

sinh học phong phú và đầy tiềm năng, Hội nghị khoa học toàn quốc về

Sinh thái và Tài nguyên sinh vật lần thứ II, 78–83.

13. Bộ Y tế (2007), Thực vật dược, NXB Giáo dục, Hà Nội, 186–187.

14. Carroll G.C., Tudzynski P, (1997), “Fungal phytohormones in

pathogenic and mutualistic associations”, The Mycota V: plant

relationships part A. Berlin: SpringerVerlag, 167–184.

15. Castillo U.F., Strobel G.A., Ford E.J., Hess W.M., Porter H., Jensen

J.B., Albert H., Robison R., Condron M.A.M., Teplow D.B.,Stevens

D., Yaver D.,(2002) “Munumbicins, wide spectrum antibiotics

produced by Streptomyces (NRRL 30562) endophytic on Kennedia

nigriscans” Microbiology 148, 2675–2685.

16. Nguyễn Đinh Nga (2010), Sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật kháng

Candida albicans, Tạp chí Y – Dược học quân sự. 4, 17-24.

17. Aswathy A. J., Jasim B., Jyothis M., Radhakrishnan E.K., (2012),

“Identification of two strains of Paenibacillus sp. as indole 3 acetic

acid-producing rhizome-associated endophytic bacteria from Curcuma

longa”, School of Biosciences, Mahatma Gandhi University,

Priyadarshini Hills, Kottayam, Kerala, India, 686 – 560.

18. Editorial Board of Chinese Yearbook on Agriculture, 2007

19. Carroll G., (1988), “Fungal endophytes in stems and leaves: from

latent pathogen to mutualistic symbiont”, Ecol, 69, 2-9.

20. Lê Mai Hương và cộng sự, (2005), Phân lập và sàng lọc hoạt tính

kháng nấm, kháng khuẩn các chủng nấm nội sinh thực vật phân lập từ

một số vườn thuốc phía Bắc Việt Nam, Tạp chí dược học (352), trang

20-23.

112

21. Amrita Vishwa Vidyapeetham (2015), “Pharmacollogical profile of

mangrove endophytes – a review”, International Journal of Pharmacy

and Pharmaceutical Sciences Vol 7, Issue 1, 6-15.

22. Bokel M, Cramer R, Gutzeit H, Reeb S, and KrausW (2000),

Tetranortriterpenenoids relate to nimbin and nimbolide from

Azadirachta indica A. Juss(Meliaceae). Tetrahedron, 46, 775-780.

23. Dettrakul S, Kittakoop P, Isaka M, Nopichai S, Suyarnsestakorn C,

Tanticharoen M and Thebtaranonth Y (2003). Anticobacterial pimarane

diterpenes from the Fungus diaporthe. Bioorg Med Chem Lett., 13(7),

1253-1255.

24. Kjer J., Debbab A., Amal H.A. & Proksch P., (2010), “Methods for

isolation of marine-derived endophytic fungi and their bioactive

secondary products”, Nature protocols , vol.5, no.3, 479–490.

25. Lena Hammerschmidt, Abdessamad Debbab, Tu Duong Ngoc, Victor

Wray, Catalina Perèz Hemphil,WenHan Lin, Heike Broetz-Oesterhelt,

Matthias U. Kassacke, and Peter Proksch (2014). Polyketides from the

mangrove-derived endophytic fungus Acremonium strictum.

Tetrahedron Letters, 55 (24), 3463–3468.

26. Đàm Sao Mai, Võ Trung Âu, (2014), “Nghiên cứu phân lập và xác lập

môi trường nuôi cấy phân lập vi nấm cộng sinh phân lập từ cây thông

đỏ tại vùng Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng”, Tạp chí Sinh học, 36(1se), 84-

89.

27. Strobel G. A., Stierle A., Stierle D. & Hess W. M., (1993),

“Taxomyces andreanaea proposed new taxon for a bulbilliferous

hyphomycete associated with Pacific yew”, Mycotaxon, 47, 71–80.

28. Strobel G. and Daisy B., (2003), “Bioprospecting for microbial

endophytes and their natural products”, Microbiol Mol Biol Rev, 67(4),

491–502.

113

29. Strobel G., (2006), “Muscodor albus and its biological promise”, J Ind

Microbiol Biotechnol”, 33(7), 514-522.

30. Tan R., Zou W. X., (2001), “Endophytes: a rich source of functional

metabolites”, Nat Prod Rep, 18(4), 448-459.

31. Raviraja N.S., (2005), “Fungal endophytes in five medicinal plant

species from Kudremukh Range, Western Ghats of India”, J Basic

Microbiol, 45(3), 230-235.

32. Li W., Zhou J., Lin Z., Hu Z., (2007), “Study on fermentation

condition for production of huperzine A from endophytic fungus

2F09P03B of Huperzia serrata” Chinese Medicinal Biotechnology, 2,

254-259.

33. Kusari S., Zühlke S., Spiteller M., (2009), “An endophytic fungus

from Camptotheca acuminata that produces camptothecin and

analogues”, J Nat Prod, 72(1), 2-7.

34. Hammerschmidt L. & cộng sự (2014), “Polyketides from the

mangrove-derived endophytic fungus Acremonium strictum”,

Tetrahedron Letters, 55, 2463 - 3468.

35. O’Sullivan D. J., O’Gara F., (1992), “Traits of fluorescent

Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens”,

Microbiol Rev, 56, 662–676.

36. Richardson A. E., Barea J. M., McNeill A.M., Prigent-Combaret C..

(2009), “Acquisition of phosphorus and nitrogen in the rhizosphere and

plant growth promotion by microorganisms”, Plant Soil, 321, 305–339.

37. Trần Thị Như Hằng và cộng sự, (2009), Xác định cấu trúc và thử hoạt

tính sinh học của ergosterol perxod phân lập từ chủng nấm

Trichoderma konilangbra nội sinh trên cây Khổ sâm (Croton

tonkinensis Gapnep), Tạp chí dược học (400), trang 60-65.

114

38. Phạm Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Xuân Hưng, Nguyễn

Văn Nam, (2012), “Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa

học có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở các dòng Keo tai tượng khảo

nghiệm tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, số 2,

2243-2252.

39. Bo-Jun Xie, Sheng-Ping Yang, Hua-Dong Chen, and Jian-Min Yue,

Agladupols A–E, triterpenoids from Aglaia duperreana, J. Nat. Prod.

2007, 70, 1532–1535.

40. Heng Zhang, Han-Hong Xu, Zhi-Jun Song, Lin-Yan Chen, Hao-Ju

Wen (2012), Molluscicidal activity of Aglaia duperreana and the

constituents of its twigs and leaves, Fitoterapia, 83 1081–1086.

41. Gerhard Bringmann, Kim Messer, Michael Dreyer, Rainer Ebel,

Bambang W. Nugroho, Victor Wray, and Peter Proksch (2003),

Cyclorocaglamide, the First Bridged Cyclopentatetrahydrobenzofuran,

and a Related “Open Chain” Rocaglamide Derivative from Aglaia

oligophylla, J. Nat. Prod., 66, 80-85.

42. Nantiya Joycharat, Harald Greger, Otmar Hofer, Ekarin Saifah (2008),

Flavaglines and triterpenes as chemical markers of Aglaia oligophylla,

Biochemical Systematics and Ecology, 36 584–587.

43. Yunie Yeap Soon Yu, Nur Kartinee Kassim, Khalid Hamid Musa and

Aminah Abdullah, Measurement of Antioxidant Activity and Structural

Elucidation of Chemical Constituents from Aglaia oligophylla Miq.,

International Proceedings of Chemical, Biological and Environmental

Engineering, Vol 95 (2016), 1-7.

44. D. Pradhan, Dr. K. A. Suri, Dr. D. K. Pradhan and P. Biswasroy,

Golden Heart of the Nature: Piper betle L., Journal of Pharmacognosy

and Phytochemistry, Vol. 1 No. 6 2013, 147-167.

115

45. Ting Yuan, Cuiyun Zhang, Chongyue Qiu, Guiyang Xia, Fei Wang,

Bin Lin, Hua Li & Lixia Chen (2017), Chemical constituents from

Curcuma longa L. and their inhibitory effects of nitric oxide

production, Natural Product Research, 32:16, 1887-1892.

46.Fumito Ishibashi, Chutamas Satasook, Murray B. Ismant và G. H. Neil

Towers(1993). Insecticidal lH-cyclopentatetrahydro[b]benzofurans

from Aglaia odorata. Phytochemistry, 32, 307-310.

47. Hammerschmidt L. & cộng sự (2014), “Polyketides from the

mangrove-derived endophytic fungus Acremonium strictum”,

Tetrahedron Letters, 55, 2463 - 3468.

48. Hiort J, Bohnenstengel F.I, Nugroho B.W, Schneider C, Wray V, Witte

L, Hung P.D, Kiet L.C, and Proksch P (1999). New insecticidal

rocaglamide derivatives from the roots of Aglaia duperreana. Journal

of Natural Products, 62, 1632–1635.

49. Hisham A, Kumar G.Y, Y. Fujimoto and Hara N (1995). Salacianone

and Salacianol two Triterpenes from Salacia beddomei.

Phytochemistry, 40 (4):1227-1231.

50. Hoi-Scon Lee, Wook-Kyun Shin, Cheol Song, Kwang-Yun Cho, and

Young-Joon Ahn (2001). Insecticidal Activities of ar-turmerone

Identified in Curcuma longa Rhizome against Nilaparvata lugens

(Homoptera: Delphacidae) and Plutella xylostella (Lepidoptera:

Yponomeutidae). Journal of Asia-Pacific Entomology, 4(2), 181–185.

51. http://www.vast.ac.vn/tin-tuc-su-kien/tin-khoa-hoc/trong-nuoc/1457-

nghien-cuu-khu-he-nam-noi-ky-sinh-trong-cac-cay-thong>, xem ngày

1/5/2015.

52. Huang H., Feng X., Xiao Z., Liu L., Li H., Ma L., Lu Y., Ju J., She Z.,

Lin Y., (2011), “Azaphilones and p-terphenyls from the mangrove

116

endophytic fungus Penicillium chermesinum (ZH4-E2) isolated from

the South China Sea”, J Nat Prod, 74(5), 997-1002.

53. Joel E.L., Bhimba B.V., (2011) “In vitro anti-inflammatory activity of

mangrove associated fungi”, J Pharm Res, 4(9), 2900-2901.

54. John G.O., Gregory L.H., Otto D.H., Michael A.G., và cộng sự,

(1997), “Nodulisporic Acid A, a Novel and Potent Insecticide from a

NodulisporiumSp. Isolation, Structure Determination, and Chemical

Transformations”, J. Am. Chem. Soc, 119, 8809-8816.

55. Kjer J., Debbab A., Amal H.A. & Proksch P., (2010), “Methods for

isolation of marine-derived endophytic fungi and their bioactive

secondary products”, Nature protocols , vol.5, no.3, 479–490.

56. Kobayashi M., Krishna M., Anjaneyulu V,“Isolation of 24-

methylenecholestane-1α, 3β, 5 α, 6 β, 16β - pentol from Sinularia sp. of

soft coral”, Marine sterols. XXIV, Chem. Pharm. Bull., 40, 2845–2846.

57. Kusari S., Zühlke S., Spiteller M., (2009), “An endophytic fungus from

Camptotheca acuminata that produces camptothecin and analogues”, J

Nat Prod, 72(1), 2-7.

58. Le.V.T (2002). Integrated Pest Management (IPM) and green farming

in rural poverty alleviation on Vietnam, 110-114.

59. Lena Hammerschmidt, Abdessamad Debbab, Tu Duong Ngoc, Victor

Wray, Catalina Perèz Hemphil,WenHan Lin, Heike Broetz-Oesterhelt,

Matthias U. Kassacke, and Peter Proksch (2014). Polyketides from the

mangrove-derived endophytic fungus Acremonium strictum.

Tetrahedron Letters, 55 (24), 3463–3468.

60. Ley S.V, Denholm A.A, and Wood A (1993). The chemistry of

azadirachtin. Nat Prod Rep, 109-157.

61. Li W., Zhou J., Lin Z., Hu Z., (2007), “Study on fermentation

condition for production of huperzine A from endophytic fungus

117

2F09P03B of Huperzia serrata” Chinese Medicinal Biotechnology, 2,

254-259.

62. Luu Duc Huy, R. Caple, C. Kamperdick, Nguyen Thi Diep, R. Karim

(2008), Isomeranzin against herpes simplex virus in vitro from

Clausena heptaphylla (Roxb.) W.&Arn.: Isolation, structure and

biological assay. Journal of Chemistry, 42 (1), 115 – 120.

63. Melnikov (1972), Chemistry of pesticides.

64. Nanao Hayashi, Kuo-Hsiung Lee, Iris H. Hall, Andrew T. Mcphail

and Huan-Chang Huang (1982). Structure and stereochemistry of (-

)-odorinol, an antileukemic diamide from Aglaia odorata.

Phytochemisrry, 21 (9), 2371-2373.

65. Ngoc Tu Duong, RuAngelie Edrada-Ebel, Rainer Ebel, Wenhan Lin,

Anh Tuan Duong, Xuan Quy Dang, Ngoc Hieu Nguyen and Peter

Proksch (2013), New Rocaglamide derivatives from Vietnamese Aglaia

species, Natural Product Communications, 8, 1-2.

66. Nugroho B.W, Edrada R.A, Wray V, Witte L, Bringmann G, Gehling

M, and Proksch P (1999). An insecticidal rocaglamide derivative and

related compounds from Aglaia odorata (Meliaceae). Phytochemistry,

51, 367-376.

67. O’Sullivan D. J., O’Gara F., (1992), “Traits of fluorescent

Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens”,

Microbiol Rev, 56, 662–676.

68. Quang, D. N., and Bach, D. D. (2008), Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-

one from Vietnamese Xylaria sp. possessing inhibitory activity of nitric

oxide production, Nat Prod Res, 22 (10), 901–906.

69. Raviraja N.S., (2005), “Fungal endophytes in five medicinal plant

species from Kudremukh Range, Western Ghats of India”, J Basic

Microbiol, 45(3), 230-235.

118

70. Raynaud, S., Fourneau, C., HocQuemiller, R., Sévenet, T., Hadi, H. A.,

and Cavé, A. (1997), Acetogenins from the bark of Uvaria pauci-

ovulata, Phytochemistry, 46 (2), 321–326.

71. Richardson A. E., Barea J. M., McNeill A.M., Prigent-Combaret C..

(2009), “Acquisition of phosphorus and nitrogen in the rhizosphere and

plant growth promotion by microorganisms”, Plant Soil, 321, 305–339.

72. Ridley H.N (1992). The Flora of the Malay Peninsula, Reeve and Co.:

London.

73. Roslund, M. U., Tähtinen, P., Niemitz, M. and Sjöholm, R. (2008), Complete assignments of the 1H and 13C chemical shifts and JH,H

coupling constants in NMR spectra of D-glucopyranose and all D-

glucopyranosyl-D-glucopyranosides, Carbohydr. Res., 343 (1), 101–

112.

74. Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N., (2008),

“Bacterial endophytes: recent developments and applications”, FEMS

Microbiol Lett, 278, 1–9.

75. Said, S. A. (2011), Two new special flavones from Uvaria accuminata,

Nat Prod Res, 25 (10), 987–994.

76. Sánchez-Medina, A, Peña-Rodríguez, L. M., May-Pat, F., Karagianis,

G., Waterman, P. G., Mallet, A. I. and Habtemariam, S. (2010),

Identification of sakurasosaponin as a cytotoxic principle from

Jacquinia flammea, Natural Product Communications 5(3), 365–368.

77. Schulte, G. R. and Ganem, B. (1982), Studies on highly oxidized

cyclohexanes. Structure and absolute configuration assignments.,

Tetrahedron Lett., 23 (42), 4299-4302.

78. Schulte, G. R., Ganem, B., Chantrapromma, K., Kodpuud, M., and

Sudsuansri, K. (1982), The structure of ferrudiol, a highly oxidized

constituent of Uvaria ferruginea, Tetrahedron Lett., 23 (3), 289–292.

119

79. Schulte, G. R., Kodpinid, M., Thebtaranonth, C., and

Thebtaranonth, Y. (1982), Studies on highly oxidized cyclohexanes.

Constitution of a new key metabolic intermediate., Tetrahedron

Lett., 23 (42), 4303–4304.

80. Sean F. B. and Clardy J., (2000) “CR377, a new pentaketide

antifungal agent isolated from an endophytic fungus”, J. Nat.

Prod., 63 (10), 1447–1448.

81. Seangphakdee, P., Pompimon, W., Meepowpan, P., Panthong, A.,

Chiranthanut, N., Banjerdpongchai, R., Wudtiwai, B., Nuntasaen, N.,

and Pitchuanchom, S. (2013), Anti-inflammatory and anticancer

activities of ()-zeylenol from stems of Uvaria grandiflora,

ScienceAsia, 39, 610–614.

82. Shibuya, H., Takeda, Y., Zhang, R., Tanitame, A., Tsai, Y. and

Kitagawa, I. (1992), Indonesian medicinal plants. IV. On the

constituents of the bark of Fagara rhetza (Rutaceae). (2). Lignan

glycosides and two apioglucosides, Chem. Pharm. Bull, 40 (10), 2639–

2646.

83. Shing, T. K. M., and Tam, E. K. W. (1998), Enantiospecific syntheses

of (+)-crotepoxide, (+)-boesenoxide, (+)-β-senepoxide, (+)-pipoxide

acetate, (−)-iso-crotepoxide, (−)-senepoxide, and (−)-tingtanoxide from

(−)-quinic acid, J. Org. Chem., 63 (5), 1547–1554.

84. Shukla S. T., Habbu P. V., Kulkarni V. H., Jagadish K. S., Pandey A.

R., Sutariya V. N., (2014), “Endophytic microbes: a novel source for

biologically/pharmacologically active secondary metabolites”, Asian J

Pharmacol Toxicol, 2(3), 1-16.

85. Sigh, J., Dhar, K. L., and Atal, C. K. (1970), Studies on the genus

Piper--X. Structure of pipoxide. A new cyclohexene epoxide from P.

hookeri Linn, Tetrahedron, 26, 4403–4406.

120

86. Sohly, H. N. E., Lasswell, W. L. Jr., and Hufford, C. D. (1979), Two new C-benzylated flavanones from Uvaria chamae and 13C-NMR

analysis of flavanone methyl ethers, J. Nat. Prod., 42 (3), 264–270.

87. Song Y., Wang J., Huang H., Ma L. và cộng sự, (2012), “Four

eremophilane sesquiterpenes from the mangrove endophytic fungus

Xylaria sp. BL321”, Mar Drugs, 10(2), 340–348.

88. Soumyaditya Mula, Debashish Banerjee, Birija S. P (2008).Inhibitory

property of the Piper betel phenolicsagainst photosensitization-

induced biological damages. Bioorganic & Medicinal Chemistry 16,

2932–2938.

89. So-Young Park, Ji-Youn Lim, Wonsik Jeong, Seong Su Hong, Young

Taek Yang, Bang Yeon Hwang, Dongho Lee (2010). C-

methylflavonoids isolated from Callistemon lanceolatus protect PC12

cells against Abeta-induced toxicity. Planta Medica, 6 (9), 863-868

90. Stevenson, P. C., Veitch, N. C., and Simmonds, M. S. J. (2007),

Polyoxygenated cyclohexane derivatives and other constituents from

Kaempferia rotunda L., Phytochemistry, 68, 1579–1586.

91. Stierle A., Strobel G. A. & Stierle D., (1993), “Taxol and taxane

production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific

yew”, Science, 260, 214–216.

92. Strobel G. A., Stierle A., Stierle D. & Hess W. M.,

(1993), “Taxomyces andreanaea proposed new taxon for a

bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific

yew”, Mycotaxon, 47, 71–80.

93. Strobel G. and Daisy B., (2003), “Bioprospecting for microbial

endophytes and their natural products”, Microbiol Mol Biol Rev,

67(4), 491–502.

121

94. Strobel G., (2006), “Muscodor albus and its biological promise”, J

Ind Microbiol Biotechnol”, 33(7), 514-522.

95. Sumathykutty, M. A., and Madhusudana Rao, J. (1991), 8-

Hentriacontanol and other constituents from Piper attenuatum,

Phytochemistry, 30, 2075–2076.

96. Sun, H., Zhang, J., Ye, Y., Pan, J., and Shen, Y. (2003), Cytotoxic

pentacyclic triterpenoids from the rhizome of Astilbe chinensis, Helv.

Chim. Acta, 86, 2414–2423.

97. Taechowisan T., Lumyong S., (2003), "Activity of endophyte

actinomycetes from roots of Zingiber oficinale and Alpinia galang

against phytopathogenic fungi", Annals of Microbiology, 53 (3), 291

– 298.

98. Takeda, Y., Shimizu, H., Masuda, T., Hirata, E., Shinzato, T., Bando,

M. and Otsuka, H. (2004), Lasianthionosides A–C, megastigmane

glucosides from leaves of Lasianthus fordii, Phytochemistry, 65 (4),

485–489.

99. Takeuchi, Y., Cheng, Q., Shi, Q. W., Sugiyama, T., and Oritani, T.

(2001), Four polyoxygenated cyclohexenes from the Chinese tree,

Uvaria purpurea, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (6), 1395–1398.

100. Takeuchi, Y., Wenshi, Q., Sugiyama, T., and Oritani, T. (2002),

Polyoxygenated cyclohexenes from the Chinese tree, Uvaria purpurea,

Biosci. Biotechnol. Biochem., 66 (3), 537–542.

101. Talapatra, S. K., Basu, D., Chattopadhyay, P., and Talapatra, B. (1988),

Aristololactams of Goniothalamus sesquipedalis wall. Revised structures

of the 2-oxygenated aristololactams, Phytochemistry, 27, 903–906.

102. Tan R., Zou W. X., (2001), “Endophytes: a rich source of functional

metabolites”, Nat Prod Rep, 18(4), 448-459.

122

103. Tanaka, T., Nakashima, T., Ueda, T., Tomii, K., and Kouno, I. (2007),

Facile discrimination of aldose enantiomers by reversed-phase HPLC,

Chem. Pharm. Bull., 55 (6), 899–901.

104. Tang, S.W., Sukari, M. A., Rahmani, M., Lajis, N. H., and Ali, A.M.

(2011), A new abietene diterpene and other constituents from

Kaempferia angustifolia Rosc., Molecules, 16, 3018–3028.

105. Thang, T. D., Kuo, P. C., Hwang, T. L., Yang, M. L., Ngoc, N. T. B.,

Han, T. T. N, Lin, C. W. and Wu, T. S. (2013), Triterpenoids and

steroids from Ganoderma mastoporum and their inhibitory effects on

superoxide anion generation and elastase release, Molecules, 18, 14285–

14292.

106. Thang, T. D., Luu, H. V., Tuan, N. N., Hung, N. H., Dai, D. N. and

Ogunwande, I. A. (2014), Constituents of essential oils from the leaves

and stem barks of Uvaria rufa and Uvaria cordata (Annonaceae) from

Vietnam, J Essent Oil Bear Pl, 17 (3), 427–434.

107. Thuy, T. T., Sung, T. V., Frank, K., and Wessjohann, L. (2008),

Triterpenes from the roots of Codonopsis pilosula, Journal of Chemistry,

46 (4), 515–520.

108. Tip-pyang, S., Payakarintarungkul, K., Sichaem, J., and

Phuwapraisirisan, P. (2011), Chemical constituents from the roots of

Uvaria rufa, Chem. Nat. Compd., 47 (3), 474–476.

109. Tiwalade, A. A., Li, X. X., Qu, L., Chen, Y., Wang, T. and Zhang, Y.

(2015), Chemical constituents from Rwandan plant Rosmarinus

officinalis L. (I), Journal of Tropical and Subtropical Botany, 23 (3),

310–316.

110. Tong, T., WenSen, C., Qian, Y., ZhuJun, Y., and Yulin, W. (1998), The

isolation and structure of microcarpacin B, Chin. J. Org. Chem., 18 (3),

219–223.

123

111. Tú. N. D, Tuấn.A.D, Minh.D.L, Công.D.T, Quý.X.D, Hiếu.N.N,

Quyết.D.D, Hiện.D.V, Thanh.T.V.D. (2013). Nghiên cứu chế tạo chế

phẩm Funbv trừ nấm Botrytis cinera gây hại trên cây trồng từ dịch chiết

củ nghệ vàng (Curcumin longa). Tạpchí: Hóa học& Ứng Dụng – ISSN

1859-4069; 3,29-32,48.

112. Tudla, F. A., Aguinaldo, A. M., Krohn, K., Hussain, H., and Macabeo,

A. P. G. (2007), Highly oxygenated cyclohexene metabolites from

Uvaria rufa, Biochem. Syst. Ecol., 35, 45–47.

113. Varghese, A. E. (2013), A comparative phytochemical analysis and

screening of antimicrobial activities of three different extracts of leaves

of Uvaria narum (Dunal) Wall. and their HPTLC analysis, International

Journal of Advanced Research in Pharmaceutical and Bio Sciences, 3

(3), 32–40.

114. Wagner de Souza Tavaresa, Silvia de Sousa Freitasb, Geisel Hudson

Grazziottib, Leila Maria Leal Parentec, Luciano Morais Liãod, José Cola

Zanuncioe (2013). Ar-turmerone from Curcuma longa (Zingiberaceae)

rhizomes and effects on Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae)

and Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae). Industrial Crops

and Products, 46, 158–164.

115. Wang J., Daniel G. Cox, Ding W., Huang G., Lin Y. and Li C.,

(2014), “Three New Resveratrol Derivatives from the Mangrove

endophytic fungus Alternaria sp”, Mar. Drugs, 12(5), 2840-2850.

116. Wang, S., Chen, R. Y., Yu, S. S., and Yu, D. Q. (2003), Uvamalols D–

G: Novel polyoxygenated seco-cyclohexenes from the roots of Uvaria

macrophylla, J Asian Nat Prod Res, 5 (1), 17–23.

117. Wang, S., Zhang, P. C., Chen, R. Y., Dai, S. J., Yu, S. S., and Yu, D. Q.

(2005), Four new compounds from the roots of Uvaria macrophylla, J

Asian Nat Prod Res, 7 (5), 687–694.

124

118. Wang, S., Zhang, P. C., Chen, R. Y., Wang, Y. H., He, W. Y., and Yu,

D. Q. (2002), A novel dihydroflavone from the roots of Uvaria

macrophylla, Chin. Chem. Lett., 13 (9), 857–858.

119. Ware G.W, and Whitacre D.M (2004). An introduction to insecticides

(4th edition) extracted from The Pesticide Book, 6th ed, Published by

MeisterPro Information Resources A division of Meister Media

Worldwide Willoughby, Willoughby, Ohio.

120. Waterman, P. G., and Mohammad, I. (1984), Chemistry of the

Annonaceae. Structures of uvarindoles A-D, four new benzylated indole

alkaloids from Uvaria angolensis, J. Chem. Soc., Chem. Commun.,

1280–1281.

121. Weenen, H., Nkunya, M. H. H., and Mgani, Q. A. (1991), Tanzanene, a

spiro benzopyranyl sesquiterpene from Uvaria tanzaniae Verdc., J. Org.

Chem., 56, 5865–5867.

122. Weenen, H., Nkunya, M. H. H., Fadl, A. A. E., Harkema, S., and

Zwanenburg, B. (1990), Lucidene, a bis(benzopyranyl) sesquiterpene

from Uvaria lucida ssp. lucida, J. Org. Chem., 55, 5107–5109.

123. Wensen, C., Zhujun, Y., and Yulin, W. (1997), Studies on annonaceous

acetogenins from Uvaria microcarpa seeds. I. The isolation and structure

of microcarpacin, Acta Chim. Sinica, 55 (7), 723–728.

124. Xia X. (2012). Pimarane diterpenes from the fungus Epicoccum sp.

HS-1 associated with Apostichopus japonicas. Bioorg Med Chem

Lett.,22(8), 3017-3019.

125. Xu, and Jing (2010). Secondary metabolites from the endophytic

fungus Pestalotiopsis sp. JCM2A4 and its microbe-host relationship with

the mangrove plant Rhizophora mucronata; Ph.D. Thesis. Heinrich-

Heine University, Duesseldorf.

125

126. Xu, Q. M., Liu, Y. L., Zhao, B. H., Xu, L. Z., Yang, S. L., and Chen, S.

H. (2007), Amides from the stems of Uvaria kweichowensis, Yao Xue

Xue Bao, 42 (4), 405–407.

127. Xu, Q. M., Liu, Y. L., Zou, Z. M., Yang, S. L., and Xu, L. Z. (2009),

Two new polyoxygenated cyclohexenes from Uvaria kweichowensis, J

Asian Nat Prod Res, 11 (1), 24–28.

128. Xu, Q. M., Zou, Z. M., Xu, L. Z., and Yang, S. L. (2005), New

polyoxygenated cyclohexenes from Uvaria kweichowensis and their

antitumour activities, Chem. Pharm. Bull., 53 (7), 826–828.

129. Yang, X. N., Jin, Y. S., Zhu, P., and Chen, H. S. (2010), Amide from

Uvaria microcarpa, Chem. Nat. Compd., 46 (2), 324–326.

130. Yonghong, L., Zhongmei, Z., Jian, G., Lizhen, X., Min, Z., and Shilin,

Y. (2000), Five polyoxygenated cyclohexenes from Uvaria grandiflora,

J. Chin. Pharm. Sci., 9 (4), 170–173.

131. Yoshinari, K., Sashida, Y., and Shimomura, H. (1989), Two new lignan

xylosides from the barks of Prunus ssiori and Prunus padus, Chem.

Pharm. Bull., 37 (12), 3301–3303.

132. Yu, D. L., Guo, L., Liao, Y. H., Xu, L. Z., and Yang, S. L. (1999),

Uvarilactam, a new lactam from Uvaria microcarpa, Acta Botanica

Sinica, 411 (10), 1104–1107.

133. Yun We, and Yoichiro Ito (2006). Preparative isolation of imperatorin,

oxypeucedanin and isoimperatorin from traditional Chinese herb “bai

zhi” Angelica dahurica using multidimensional high-speed counter-

current chromatography. Journal of Chromatography A, 1115, 112–117.

134. Zhang, C. R., Wu, Y., and Yue, J. M. (2010), Polyoxygenated seco-

cyclohexene derivatives from Uvaria tonkinensis var. subglabra, Chin J

Nat Med, 8 (2), 84–87.

126

135. Zhang, C. R., Yang, S. P., Liao, S. G., Wu, Y., and Yue, J. M. (2006),

Polyoxygenated cyclohexene derivatives from Uvariarufa, Helv. Chim.

Acta, 89, 1408–1416.

136. Zhang, H. L., and Chen, R. Y. (2001), A new flavone from the roots of

Uvaria macrophylla, Chin. Chem. Lett., 12 (9), 791–792.

137. Zhang, H. L., Wang, S., Chen, R. Y., and Yu, D. Q. (2002), Studies on

chemical constituents of Uvaria macrophylla, Yao Xue Xue Bao, 37 (2),

124–127.

138. Zhao, Q., Liu, J., Wang, F., Liu, G., Wang, G. and Zhang, K. (2009),

Ligans from branch of Hypericum petiolulatum, Zhongguo Zhong Yao

Za Zhi., 34 (11), 1373–1376.

139. Zhao, W. M, Qin, G. W., Yang, R. Z., Jiang, T. Y., Li, W. X., Scott, L.,

and Snyder, J. K. (1996), Tonkinenin A. A new polyoxygenated

cyclohexane derivative from Uvaria tonkinensis, Tetrahedron, 52 (38),

12373–12380.

140. Zhou, G. X., Chen, R. Y., and Yu, D. Q. (1999), New polyoxygenated

cyclohexenes from Uvaria calamistrata, J Asian Nat Prod Res, 1 (3),

227–238.

141. Zhou, G. X., Chen, R. Y., and Yu, D. Q. (2011), Uvacalols I, J and K:

New polyoxygenated cyclohexenes with all trans relative configurations

from the roots of Uvaria calamistrata Hance, Nat Prod Res, 25 (2), 161–

168.

142. Zhou, G. X., Chen, R. Y., Zhang, Y. J., and Yu, D. Q. (2000), New

annonaceous acetogenins from the roots of Uvaria calamistrata, J. Nat.

Prod., 63, 1201–1204.

143. Zhou, G. X., Zhang, Y. J., Chen, R. Y., and Yu, D. Q. (2010), Three

polyoxygenated cyclohexenes from Uvaria calamistrata, J Asian Nat

Prod Res, 12 (8), 696–701.

127

144. Zhou, G. X., Zhang, Y., Chen, R. Y., and Yu, D. Q. (2008),

Calamistrins H and I, two linear annonaceous acetogenins from the roots

of Uvaria calamistrata Hance, Heterocycles, 75 (4), 933–937.

145. Zhou, G. X., Zhou, L. E., Chen, R. Y., and Yu, D. Q. (1999),

Calamistrins A and B, two new cytotoxic monotetrahydrofuran

annonaceous acetogenins from Uvaria calamistrata, J. Nat. Prod., 62,

261–26.

146. Karimian, H., Arya, A., Fadaeinasab, M., Razavi, M., Hajrezaei, M.,

Karim Khan, (2017), Kelussia odoratissima Mozaff. activates intrinsic

pathway of apoptosis in breast cancer cells associated with S phase cell

cycle arrest via involvement of P21/p27 in vitro and in vivo. Drug

Design, Development and Therapy,. Volume11, 337–350.

147. Thirukumaran, P., Shakila Parveen, A., & Sarojadevi, M.

(2014), Synthesis and Copolymerization of Fully Biobased

Benzoxazines from Renewable Resources. ACS Sustainable Chemistry

& Engineering, 2(12), 2790–2801.

148. Yuko Yoshizawa, Satoru Kawaii, Masatoshi Kanauchi, Manami Chida

& Junya Mizutani (1993) Chavicol and Related Compounds as

Nematocides, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 57(9), 1572-

1574.

149. Sun, L., Li, D., Tao, M., Chen, Y., Dan, F., & Zhang, W.

(2012). Scopararanes C–G: New Oxygenated Pimarane Diterpenes from

the Marine Sediment-Derived Fungus Eutypella scoparia FS26. Marine

Drugs, 10(12), 539–550.

150. Suppamit Dettrakul, Prasat Kittakoop, Masahiko Isaka, Sombat

Nopichai, Chotika Suyarnsestakorn, Morakot Tanticharoen and

Yodhathai Thebtaranonth, (2003), Antimycobacterial Pimarane

128

Diterpenes from the Fungus Diaporthe Sp., Bioorganic & Medicinal

Chemistry Letters, 13 1253–1255.

151. Fujimoto, H., Asai, T., Kim, Y.-P., & Ishibashi, M. (2006). Nine

Constituents Including Six Xanthone-Related Compounds Isolated from

Two Ascomycetes, Gelasinospora santi-florii and Emericella

quadrilineata, Found in a Screening Study Focused on

Immunomodulatory Activity. Chemical & Pharmaceutical Bulletin,

54(4), 550–553.

152.Toh Choon, Sariah M, Siti Mariam (2012). Ergosterol from the

soilborne fungus Ganoderma boninense, J Basic Microbiol, 52 (5), 608-

612.

153.Hoàng Đình Dũng (2010). Khảo sát thành phần hóa học của cây ngâu

rất thơm (Aglaia odoratissima Bl.) và vỏ cây bứa Delpy (Garcinia

delpyana Pierre). Luận văn Thạc sỹ Hóa học.

154.Hoàng Việt Dũng (2014). Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần

hóa học và tác dụng ức chế enzyme acetylcholinesterase của hai loài

Piper thomsonii (C.DC.) Hook.f.var. thomsonii và Piper hymenophyllum

Miq., Họ Hồ tiêu (Piperqceae). Luận án Tiến sĩ Dược học.

155. Phạm Thế Chính, Phạm Thị Thắm và Nguyễn Hồng Phong (2009).

Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong lá trầu (Piper betle

L.). Tạp chí khoa học và công nghệ, 96(08): 69-73.

156. Abraham, R. J., Gottschalck, H., Paulsen, H., and Thomas, W. A.

(1965), The proton magnetic resonance spectra and conformations of

cyclic compounds. Part II. The p.m.r. spectra of the conduritols, J. Chem.

Soc., 6268–6277.

157. Achenbach, H., Hohn, M., Waibel, R., Nkunya, M. H. H., Jonker, S.

A., and Muhie, S. (1997), Oxygenated pyrenes, their potential

129

biosynthetic precursor and benzylated dihydroflavones from two African

Uvaria species, Phytochemistry, 44 (2), 359–364.

158. Dobler R.M (2002). Total syntheis and SAR investigation of

Rocaglamide,10th IUPAC.

159.Akendenguea, B., Roblot, F., Loiseau, P. M., Bories, C., Milama, E. N.,

Laurens, A., and Hocquemiller, R. (2002), Klaivanolide, an antiprotozoal

lactone from Uvaria klaineana, Phytochemistry, 59, 885–888.

130

Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

Chủ đề:

Đồ án môn Sinh học

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI

THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI

THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT

Ký hiệu

Tiếng Anh

Diễn giải

Ngâu

AD.E (20g)

ADE1-2

ADE4-8

ADE3 3,99g

ADE3.1 1,29g

ADE3.1.4 - 3.1.7 412mg

(5) 1.9mg

(6) 10mg

(2) 3.8mg

(3) 2.1mg

(4) 7.2mg

(1) 3.9mg

AO.D (3.6g)

AOD3 0.6g

AOD3.2 15mg

(7) 3.3mg

Bột Nghệ vàng

Bã

TDN 30.8g

Cặn EtOH

TDN1.3 1,79g

(9) 12.3mg

(8) 2.8mg

E n o l

K e t o

TKH (50g)

TKH4 1.2 g

TKH7 15mg

TKH6 3,99g

TKH4.1

TKH4.2

TKH4.3

TKH6.1

TKH6.2

TKH6.3

(12) 11.2mg

TKH4.4 15mg

TKH6.4 0.797g

(10) 10mg

(11) 150mg

NTKE (17g)

NTK3 0.3g

(31) 7.1mg

0.00

25.83

0.00

56.46

53,5

Enol

Keto

13

13 1,53 (m); 2,0 (m) 1,66 (m) 1,45 (m); 1,56 (m)

1H-NMR (CDCl3) (δ ppm) 14 1,97 (m); 2,04 (m) 30,06 1,63 (m); 1,68 (m) 17,7 1,27 (m); 1,60 (m) 41,4 35,4

13C-NMR (CDCl3) (δ ppm) 14 25,2 17,7 37,5 37,3

13C-NMR (CDCl3) (δ ppm) 14* 25.2 17.6 37.5 37.3

TT Time 15 10.39 16 13.57 17 16.46 18 17.22 19 19.69 20 24.07 21 24.28 22 24.49 23 25.34 24 33.75 25 41.92 26 49.68

1H

Hợp chất 28 13C

13C-28* 1H

Hợp chất 29 13C

13C-29*

Tài liệu liên quan

Bài tiểu luận: Cơ sở Hóa sinh

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu trồng thử nghiệm cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) nuôi cấy mô tại xã Lăng, huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Giáo dục ý thức bảo vệ sự đa dạng sinh học cho học sinh lớp 3

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Xây dựng và sử dụng sơ đồ tư duy trong giảng dạy phần Sinh thái học sách giáo khoa Sinh học 12 cơ bản