Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin

Chia sẻ: Tần Mộc Phong | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:302

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin được thực hiện với mục tiêu nhằm tổng hợp được trên 40 dẫn xuất mới của indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin được thu nhận từ cây chàm mèo Strobilanthes cusia; đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro của các dẫn xuất mới tạo ra. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN TRỌNG DÂN TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT CỦA INDIRUBIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - Năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN TRỌNG DÂN TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC DẪN XUẤT CỦA INDIRUBIN Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9 44 01 17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Lưu Văn Chính 2. TS. Tô Đạo Cường Hà Nội - Năm 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng có ai công bố trong các công trình nghiên cứu trước đây. Toàn bộ các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ. NGHIÊN CỨU SINH Nguyễn Trọng Dân
LỜI CẢM ƠN Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lưu Văn Chính, TS. Tô Đạo Cường - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện Luận án này. Em xin chân thành cảm ơn GS, TS. Nguyễn Mạnh Cường đã cung cấp chất đầu indirubin quý giá và góp ý rất nhiều cho Luận án của em. Em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô, cán bộ Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại Học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong Chương trình đào tạo. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể các cán bộ Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Lãnh đạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học và công nghệ, Hội đồng khoa học, Bộ phận quản lý đào tạo và các phòng ban đã giúp đỡ, tạo điều kiên thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại cơ sở. Tôi cũng xin cảm ơn Lãnh đạo, Chỉ huy Trung tâm Nhiệt đới Việt -Nga, Phân viện Công nghệ Sinh học, Chi nhánh Phía Nam và tập thể phòng Sinh hóa đã cho phép, tạo điều kiện về thời gian, thiết bị nghiên cứu, động viên tinh thần cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đã hết lòng ủng hộ tôi về cả tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập và thực hiện Luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Luận án Nguyễn Trọng Dân
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography: Sắc ký cột Các phương pháp phổ HM-RS(ESI) Hight resolution Mass Spectroscopy(electrospay ionization): Phổ khối lượng phân giải cao (ion hóa phun mù điện tử) UV Ultraviolet spectroscopy: Phổ tử ngoại 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 DEPT Distortioless Enhancement by Polarisation Tranfer: Phổ DEPT COSY Correlation Spectroscopy: Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân 1H- 1H HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation: Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation: Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy: Phổ tương tác đồng hạt nhân 1H-1H qua không gian s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet qui: quintet m: multiplet dd: double doublet br:broad Các chữ viết tắt khác IC50 Inhibitory concentration of 50% of cell proliferation: Nồng độ tác dụng ức chế 50% sự tăng sinh của tế bào LD50 Lethal dose of 50%: Liều gây chết 50% trên tổng số đối tượng thử nghiệm MIC Minimmum inhibitory concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu Tonc Nhiệt độ nóng chảy Hep-G2 Human Hepatocellular carcinoma: Dòng tế bào ung thư biểu mô gan -1-
LU-1 Lung cancer: Dòng tế bào ung thư phổi SW480 Dòng tế bào ung thư đại tràng HL-60 Dòng tế bào ung thư máu HEK-293 Dòng tế bào thường thận CDKs Cyclin-dependent kinases: Các kinase phụ thuộc cyclin GSK-3β Glycogen synthase kinase-3β: kinase-3β tổng hợp glycogen HIV Human immunodeficiency virus: Virus gây suy giảm miễn dịch ở người CML Chronic myeloid leukemia: Bạch cầu dòng tủy mãn tính APL Acute promyelocytic leukemia: Bạch cầu tiền tủy bào cấp tính PML-RARα Promyelocytic leukemia retinoic acid receptor alpha: Thụ thể acid retionic alpha bệnh bạch cầu tiền tủy bào AhR Aryl hydrocarbon receptor: Thụ thể Aryl hydrocarbon TNFα Tumor necrosis factor alpha: Yếu tố hoại tử khối u alpha ROS Reactive oxygen species: Các tiểu phần oxy hoạt động TRAIL TNF-𝛼-related apoptosis-inducing ligand: Protein hoạt động như một phối tử gây ra quá trình tự chết theo chương trình của tế bào PLCγ2 Phospholipase Cγ2: Enzyme quan trọng trong việc kích hoạt các tế bào sau khi thắt chặt thụ thể NF-κB Nuclear factor-kappaB: Yếu tố nhân κB VSMC Vascular smooth muscle cell: Tế bào cơ trơn mạch máu COX Cyclooxygenase: Enzyme xúc tác cho sự chuyển đổi axít arachidonic thành prostaglandin GPVI Glycoprotein VI: Glycoprotein màng tiểu cầu, đóng một vai trò quan trọng trong việc kích hoạt và kết tụ collagen của tiểu cầu TNCB 2,4,6-trinitro-l-chlorobenzene DMAP Dimethylaminopyridine PFPTFA Pentafluorophenyl trifluoracetate BTEAB: (1-butyl)triethylammonium bromide LPS Lipopolysaccharide: Phân tử được cấu tạo gồm lipid và polysaccharide EGFR Epidermal growth factor receptor: Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì -2-
STAT Signal transducer and activator of transcription: Bộ chuyển đổi tín hiệu và chất kích hoạt phiên mã PI3-K Phosphoinositide 3-kinase: Enzyme liên quan đến các chức năng của tế bào như tăng trưởng, tăng sinh, biệt hóa MAPK Mitogen-activated protein kinase: Protein kinase hoạt hóa phân bào VEGF Vascular endothelial growth factor: Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu NCI National Cancer Institute: Viện ung thư Hoa kỳ DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid GP Glycogen phosphorylase AA Arachidonic acid ATP Adenosin triphosphat ADP Adenosin diphosphat DMSO Dimethyl sulfoxide DMF Dimethylformamide EtOH Ethanol MeOH Methanol EtOAc Ethyl acetate TCA Trichloroacetic acid -3-
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của indirubin 1 ..............................................................3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của một số đồng phân của indirubin .............................3 Hình 1.3. Cấu trúc và hiệu suất tạo thành các indirubin N-glycoside khác nhau .......8 Hình 1.4. Các đích tác dụng trong vòng đời tế bào của indirubin và dẫn xuất .........13 Hình 1.5. Các cơ chế tác động chính của các dẫn xuất indirubin đối với quá trình gây chết tế bào ...........................................................................................................16 Hình 1.6. Các dẫn xuất indirubin E564, E728 và E804 ...........................................17 Hình 1.7. Vùng liên kết ATP của enzyme GSK-3β ..................................................33 Hình 2.1. Các phối tử mẫu đã được chứng minh ức chế enzyme GSK-3β ...............40 Hình 4.1. Một phần phổ 1 H-NMR của hợp chất 42f ...........................................65 Hình 4.2. Một pshần phổ COSY của hợp chất 42f ..............................................66 Hình 4.3. Một phần phổ COSY của hợp chất 42f ................................................66 Hình 4.4. Phổ DEPT 135 của hợp chất 42f ..........................................................66 Hình 4.5. Một phần phổ HMBC của hợp chất 42f ..............................................67 Hình 4.6. Một phần phổ NOESY của hợp chất 42f .............................................68 Hình 4.7. Phổ HR-MS(ESI) của hợp chất 42f ......................................................68 Hình 4.8. Công thức cấu tạo của hợp chất (42f) ..................................................69 Hình 4.9. Một phần phổ COSY của hợp chất 43f ....................................................75 Hình 4.10. Một phần phổ HSQC của hợp chất 43f ..................................................75 Hình 4.11. Một phần phổ HMBC của hợp chất 43f .................................................76 Hình 4.12. Phổ HR-MS(ESI) của hợp chất 43f ...................................................76 Hình 4.13. Công thức cấu tạo của hợp chất 43f ..................................................77 Hình 4.14. Một phần phổ 1H-NMR của hợp chất 44 ................................................83 Hình 4.15. Một phần phổ HMBC của hợp chất 44 ...................................................84 Hình 4.16. Phổ HR-MS(ESI) của hợp chất 44 ..........................................................85 Hình 4.17. Công thức cấu tạo của hợp chất 44 .........................................................85 Hình 4.18. Một phần phổ 1H-NMR của hợp chất 45f ...............................................85 Hình 4.19. Một phần phổ HMBC của hợp chất 45f ..................................................86 Hình 4.20. Phổ HR-MS(ESI) của hợp chất 45f ....................................................87 Hình 4.21. Công thức cấu tạo của hợp chất 45f ..................................................87 Hình 4.22. Phổ 1H-NMR của hợp chất 53a .............................................................94 -4-
Hình 4.23. Một phần phổ 1H-NMR của hợp chất 53a ............................................94 Hình 4.24. Một phần phổ HMBC của hợp chất 53a ...............................................95 Hình 4.25. Phổ HR-MS(ESI) của hợp chất 53a ...................................................95 Hình 4.26. Công thức cấu tạo của hợp chất 53a ..................................................95 Hình 4.27. Cấu trúc đơn tinh thể của hợp chất 55 .............................................102 Hình 4.28. Phổ 1H-NMR của hợp chất 56a ...........................................................104 Hình 4.29. Một phần phổ 1H-NMR của hợp chất 56a ..........................................104 Hình 4.30. Một phần phổ HMBC của hợp chất 56a ...............................................105 Hình 4.31. Phổ HR-MS(ESI) của hợp chất 56a ......................................................106 Hình 4.32. Công thức cấu tạo của hợp chất 56a .....................................................106 Hình 4.33. Một phần phổ HMBC của hợp chất 56n ...............................................112 Hình 4.34. Phổ HR-MS(ESI) của hợp chất 56n......................................................113 Hình 4.35. Công thức cấu tạo của hợp chất 56n .....................................................113 Hình 4.36. Mối tương quan giữa năng lượng dock và năng lượng tự do liên kết thực nghiệm trên mô hình bốn dòng tế bào ung thư (A) HepG2; (B) LU-1; (C) SW480; (D) HL-60................................................................................................................122 Hình 4.37. Liên kết hydrogen giữa các chất với các amino axit của enzyme GSK- 3β (PDB ID: 1Q41). (A) Indirubin 1; (B) Indirubin-3′-oxime 25; (C) CHIR-98014; (D) Bio-acetoxime ...................................................................................................123 -5-
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các tệp dữ liệu cần thiết cho các bước docking phân tử ..........................41 Bảng 3.1. Cấu trúc của các thiol 41a-41i ..................................................................42 Bảng 4.1. Các dữ liệu phổ 1 H-NMR của dãy 42a-42i.........................................69 13 Bảng 4.2. Các dữ liệu phổ C-NMR của dãy 42a-42i .......................................72 Bảng 4.3. Các dữ liệu phổ 1 H-NMR của dãy 43a-43i.........................................77 13 Bảng 4.4. Các dữ liệu phổ C-NMR của dãy 43a-43i .......................................81 Bảng 4.5. Các dữ liệu phổ 1 H-NMR của dãy 45a-45h .......................................87 13 Bảng 4.6. Các dữ liệu phổ C-NMR của dãy 45a-45h ......................................90 Bảng 4.7. Các dữ liệu phổ 1 H-NMR của dãy 53a-53l.........................................96 13 Bảng 4.8. Các dữ liệu phổ C-NMR của dãy 53a-53l .....................................100 Bảng 4.9. Các dữ liệu phổ 1 H-NMR của dãy 56a-56l.......................................106 13 Bảng 4.10. Các dữ liệu phổ C-NMR của dãy 56a-56l ...................................110 Bảng 4.11. Các dữ liệu phổ 1 H-NMR của dãy 56m-56p ..................................114 13 Bảng 4.12. Các dữ liệu phổ C-NMR của dãy 56m-56p .................................114 Bảng 4.13. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 42a-42i và các chất đối chứng dương ..............................................115 Bảng 4.14. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 43a-43i và các chất đối chứng dương ..............................................116 Bảng 4.15. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 45a-45h và các chất đối chứng dương ..............................................117 Bảng 4.16. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 53a-53l và các chất đối chứng dương ...............................................118 Bảng 4.17. Hoạt tính gây độc và chống tăng sinh tế bào in vitro các dẫn xuất mới của indirubin 54, 55, 56a-56p và các chất đối chứng dương ..................................119 Bảng 4.18. Năng lượng dock và giá trị hằng số ức chế dự đoán của các chất ........121 Bảng 4.19. Liên kết hydro giữa các chất với các amino axit của enzyme GSK-3β124 Bảng 4.20. Thông số dược động học và dự đoán độc tính của các hợp chất nghiên cứu ...........................................................................................................................126 -6-
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Tổng hợp indirubin từ isatin và indoxyl ....................................................5 Sơ đồ 1.2. Tổng hợp indirubin theo Rusell và Kaupp .................................................5 Sơ đồ 1.3. Tổng hợp indirubin bằng cách khử isatin 6 bởi KBH4 ..............................6 Sơ đồ 1.4. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 11 ....................................................6 Sơ đồ 1.5. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin 12 bằng cách khử hóa các dẫn xuất của isatin 9 bởi KBH4..................................................................................................7 Sơ đồ 1.6. Tổng hợp N-(2,3,4-Tri-O-acetyl-α,β-L-rhamnopyranosyl)isatin (16α,β) ..7 Sơ đồ 1.7. Tổng hợp N-(β-L-rhamnopyranosyl)indirubin ..........................................7 Sơ đồ 1.8. Tổng hợp dẫn xuất của indirubin ức chế mạnh enzyme histone deacetylase ..................................................................................................................8 Sơ đồ 1.9. Tổng hợp các dẫn xuất indirubin 25, 26, 27, 28 ........................................9 Sơ đồ 1.10. Tổng hợp các dẫn xuất indirubin 29, 30, 31, 32, 33 ................................9 Sơ đồ 1.11. Tổng hợp N-1-acetyl indirubin ..............................................................10 Sơ đồ 1.12. Tổng hợp các dẫn xuất N-1-alkyl indirubin ...........................................10 Sơ đồ 1.13. Tổng hợp dẫn xuất diacetyl indirubin ....................................................10 Sơ đồ 1.14. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin ở R ..............................................11 Sơ đồ 1.15. Tổng hợp dẫn xuất indirubin ở Rʹ ..........................................................11 Sơ đồ 1.16. Tổng hợp dẫn xuất 5ʹ-aminoindirubin ....................................................12 Sơ đồ 2.1. Các dẫn xuất mới của indirubin được tổng hợp trong luận án ..................35 Sơ đồ 2.2. Cơ chế phản ứng Click cộng đóng vòng alkyne-azide Huisgen ..............37 Sơ đồ 3.1. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime)..........................................................................................42 Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các tổ hợp của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) ...............................................................................45 Sơ đồ 3.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết propan-2-ol (chuyển hóa ở N-1) ...47 -7-
Sơ đồ 3.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) ...................................................................................................................................50 Sơ đồ 3.5. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) .....................57 Sơ đồ 3.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) ..................................60 -8-
MỤC LỤC MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1 1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3 1.1. Giới thiệu về indirubin và một số đồng phân .................................................................. 3 1.2. Thu nhận, tổng hợp indirubin ........................................................................................... 4 1.2.1. Thu nhận indirubin từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia .... 4 1.2.2. Tổng hợp indirubin từ nguyên liệu hóa học .............................................. 5 1.3. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin ............................................................................... 6 1.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin từ các dẫn xuất của isatin và indoxyl acetate. ................................................................................................................. 6 1.3.2. Tổng hợp các dẫn xuất của indirubin từ indirubin và dẫn xuất ................ 8 1.4. Hoạt tính sinh học của indirubin và dẫn xuất ................................................................ 12 1.4.1. Hoạt tính chống ung thư .......................................................................... 12 1.4.2. Hoạt tính chống kết tập tiểu cầu .............................................................. 21 1.4.3. Hoạt tính kháng viêm ............................................................................... 22 1.4.4. Hoạt tính chống vẩy nến .......................................................................... 23 1.4.5. Hoạt tính kháng virus .............................................................................. 24 1.4.6. Hoạt tính chống oxy hóa .......................................................................... 26 1.4.7. Hoạt tính kháng nấm ............................................................................... 26 1.5. Khái quát về các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin ..... 27 1.5.1. Giới thiệu về các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6- mercaptopurin .................................................................................................... 27 1.5.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin ................................................................................................ 28 1.6. Khái quát về chalcone...................................................................................................... 29 1.6.1. Giới thiệu chung về chalcone .................................................................. 29 1.6.2. Hoạt tính sinh học của chalcone ............................................................. 30 1.7. Giới thiệu về mô phỏng tương tác phân tử (molecular docking) ................................ 31 1.8. Enzyme glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) ......................................................... 32 2. CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 34 2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................. 35 2.3. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu .......................................................................................... 37 2.3.1. Hóa chất, dung môi, dòng tế bào nghiên cứu .......................................... 37 2.3.2. Thiết bị dùng cho nghiên cứu .................................................................. 38 2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học...................................................................... 38 2.4.1. Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp (hoạt tính gây độc tế bào) ........................................................... 38 -9-
2.4.2. Phương pháp xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy dạng hỗn dịch (hoạt tính chống tăng sinh) ........................................................ 39 2.5. Chuẩn bị các phối tử và protein ...................................................................................... 39 2.6. Mô phỏng tương tác sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 .......................................... 40 3. CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 42 3.1. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4- thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) .............................................................................................................................. 42 3.1.1. Tổng hợp indirubin-3ʹ-oxime 25 và indirubin-3′-[O-(3-bromoprop-1- yl)oxime] 26 ....................................................................................................... 43 3.1.2. Tổng hợp các hợp chất 1,3,4-oxadiazole; 1,3,4-thiadiazole ................... 43 3.1.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen từ chất trung gian chìa khóa 26 ....................................................................................................... 43 3.2. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4- thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) ....................................................................................................................... 45 3.2.1. Tổng hợp indirubin- 3ʹ-(O-oxiran-2-ylmethyl)oxime 27 ......................... 45 3.2.2. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen từ chất trung gian chìa khóa 27............................................................................................... 46 3.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4- thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở N-1) ........... 47 3.3.1. Tổng hợp (2ʹZ)-1- (oxiran-2-ylmethyl)indirubin 44 ................................ 47 3.3.2.Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen từ chất trung gian chìa khóa 44............................................................................................... 48 3.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) .......................... 49 3.4.1.Tổng hợp các 4-(2-azidoethoxy)-2-hydroxychalcone 51a-51l ................. 50 3.4.2. Tổng hợp chất trung gian chìa khóa indirubin-3ʹ-[O-(prop-2-ynyl)oxime] 52 ....................................................................................................................... 54 3.4.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole từ chất trung gian chìa khóa 52 ............... 55 3.5. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) ................................................... 57 3.5.1. Tổng hợp chất trung gian (2ʹZ)-1-(prop-2-ynyl)indirubin 54.................. 57 3.5.2. Tổng hợp chất trung gian chìa khóa (2ʹZ, 3ʹE)-1-(prop-2-ynyl)indirubin- 3ʹ-oxime 55 ......................................................................................................... 58 - 10 -
3.5.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole từ chất trung gian chìa khóa 55 ............... 58 3.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) .................................................................... 60 3.7. Thử nghiệm hoạt tính sinh học các dẫn xuất mới của indirubin ................................. 61 3.7.1. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ...................................................... 61 3.7.2. Thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh .................................................... 62 4. CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 64 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin ..................................................................... 64 4.1.1. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết trimethylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) ................................................................................... 64 4.1.2. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ-oxime) ...................................................................... 73 4.1.3. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurine qua liên kết 2-ol-1,3-propylen (chuyển hóa ở vị trí N-1) ........................................................................................................ 82 4.1.4. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở nhóm hydroxyl của C-3ʹ- oxime)................................................................................................................. 91 4.1.5. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất hydroxychalcone qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) ........... 101 4.1.6. Tổng hợp các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất amine qua liên kết methylen 1,2,3-triazole (chuyển hóa ở vị trí C-3ʹ và N-1) ............................... 111 4.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro các dẫn xuất mới của indirubin ............. 115 4.2.1. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 42a-42i ......................................................................................................................... 115 4.2.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 43a-43i ......................................................................................................................... 116 4.2.3. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 45a- 45h ................................................................................................................... 117 4.2.4. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 53a-53l ......................................................................................................................... 118 4.2.5. Đánh giá hoạt tính chống ung thư các dẫn xuất mới của indirubin 56a- 56p ................................................................................................................... 119 4.3. Mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống ung thư của các chất .................. 121 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 128 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ............................................. 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 131 - 11 -
MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên được tạo thành từ quá trình sinh tổng hợp trong thực động vật, vi sinh vật thường có các hoạt tính sinh học rất đặc biệt, chọn lọc, dễ dung nạp vào cơ thể và ít tác dụng phụ. Vì thế, nhiều chất trong số chúng đã được sử dụng rộng rãi trong thực tế để làm thuốc điều trị bệnh như: ung thư, nhiễm khuẩn… mà tác dụng điều trị các bệnh này được quyết định bởi cấu trúc hóa học của chúng. Cấu trúc hóa học của các hợp chất thiên nhiên thường rất phức tạp mà bằng con đường tổng hợp toàn phần sẽ không kinh tế vì phải qua nhiều bước phản ứng, hiệu suất thấp, chi phí xử lý môi trường cao, thời gian phản ứng dài. Do đó, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có từ thiên nhiên để tổng hợp, phân lập các chất dẫn đường, sau đó chuyển hóa chúng thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học tốt hơn chất dẫn đường đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Gần đây, các nhà khoa học đã khám phá nhiều hoạt tính sinh học của hợp chất indirubin và dẫn xuất, một bisindole alkaloid có thể được thu nhận với lượng lớn từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia có nhiều ở Việt Nam hoặc bằng phản ứng giữa isatin và indoxyl acetate. Hoạt chất này và dẫn xuất của nó thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quí như gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư, có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, tác dụng kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa, kháng nấm, chống vảy nến với cơ chế rõ ràng, đến thời điểm hiện tại các công bố về các hoạt tính này vẫn đang tiếp tục. Tuy nhiên, để ứng dụng hợp chất này vào thực tế vẫn còn khó khăn do độ tan kém trong nước, một số công trình đã và đang nghiên cứu sử dụng hướng thứ nhất để cải thiện độ tan của indirubin, theo hướng thứ hai một số dẫn xuất cũng đã được tổng hợp tuy nhiên các công bố vẫn chưa nhiều. Theo hướng này, đề tài của luận án đề cập tới tổng hợp một số dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất dị vòng chứa S, N, O; các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine, sau đó đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro, giải thích hoạt tính để bổ sung các dữ liệu về hóa học và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn trong việc tìm kiếm các thuốc mới để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng từ nguồn nguyên liệu thực vật sẵn có trong nước. Vì thế, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn xuất của indirubin”. 1
Mục tiêu của luận án: - Tổng hợp được trên 40 dẫn xuất mới của indirubin xuất phát từ nguyên liệu đầu indirubin được thu nhận từ cây chàm mèo Strobilanthes cusia. - Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro của các dẫn xuất mới tạo ra. Nội dung của luận án: 1. Tổng hợp các dẫn xuất mới của indirubin là các tổ hợp lai của indirubin với các hợp chất 1,3,4-oxadiazole, 1,3,4-thiadiazole, 6-mercaptopurin, các hợp chất hydroxychalcone và các hợp chất amine; 2. Xác định cấu trúc của các dẫn xuất mới tổng hợp được bằng các phương pháp phổ hiện đại; 3. Đánh giá hoạt tính chống ung thư in vitro ( ung thư đại tràng SW480, ung thư phổi LU-1, ung thư gan HepG2, ung thư máu HL-60 ) của các dẫn xuất mới tổng hợp được; 4. Nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống ung thư của một số dẫn xuất mới tổng hợp được sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6. 2
1. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về indirubin và một số đồng phân Indirubin là một bisindole alkaloid có màu đỏ thẫm có công thức phân tử là C16H10N2O2 (M = 262 g/mol), tên IUPAC: (3Z)-3-(3-oxo-1,3-dihydro-2H-indol-2- ylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one, nhiệt độ nóng chảy 356,2÷357,8 oC, hợp chất này không tan trong nước, tan ít trong methanol, ethanol, tan nhiều hơn trong acetone, DMSO, DMF. Phổ UV-VIS của nó trong dung môi 1,1,2,2-tetrachloroethane có các cực đại ở 291, 356 và 540 nm [1]. Indirubin có công thức cấu tạo như Hình 1.1. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của indirubin 1 Phân tử indirubin có một liên kết hydro nội phân tử được hình thành giữa nguyên tử H-1ʹ với nguyên tử O của nhóm C=O ở C-2 và liên kết này được chứng minh qua nhiễu xạ tia X đơn tinh thể [2]. Nhóm tác giả cũng chỉ ra sự liên hợp giữa các phân tử indirubin với nhau, đây cũng là một trong những lý do kém tan của indirubin. Indirubin 1 và một số đồng phân của nó như indigotin 2 màu xanh, indigo 3 màu xanh, isoindirubin 4 màu đỏ, isoindigo 5 màu nâu được tìm thấy trong lá của cây Isatis tinctoria [3] (Hình 1.2). Hình 1.2. Công thức cấu tạo của một số đồng phân của indirubin 3
Từ bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc tên là Danggui Longhui Wan để điều trị bệnh ung thư bạch cầu Leukemia, gồm 11 thảo dược khác nhau. Năm 1966 các nhà khoa học thuộc Viện Huyết học, Viện Dược khoa Trung Quốc đã xác nhận tác dụng này nằm trong một vị thuốc có tên Thanh Đại [4]. Thanh Đại là bột màu xanh đen được làm từ lá của một số cây như: Strobilanthes cusia (Nees.) O. Kuntze - chàm mèo (Acanthaceae), Polygonum tinctorium (Polygonaceae) ở Nhật Bản, Isatis indigotica (Brassicaceae), Indigofera suffrutticosa (Fabaceae) và Indigofera tinctoria L.- chàm lá nhỏ (Fabaceae). Bột chàm chứa hàm lượng lớn indigotin 2, một phẩm nhuộm tự nhiên màu chàm xanh. Những nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng chúng có chứa indirubin 1 và hoạt tính chống ung thư bạch cầu của bột chàm là do hoạt tính indirubin mà có. Năm 1999, các nhà khoa học Đức đã công bố indirubin và các dẫn xuất có tác dụng ức chế enzyme kinase phụ thuộc cyclin (CDK) [4]. Các enzyme CDK, một họ kinase protein được hoạt hóa bởi cyclin, có chức năng điều khiển chu trình tế bào thông qua việc gắn các nhóm photphat vào cơ chất protein (quá trình phosphoryl hóa) kiểm soát các quá trình này trong tế bào. Các CDK còn tham gia vào việc điều khiển các quá trình phiên mã, xử lý mRNA và quá trình tự chết của tế bào. Các CDK photphoryl hóa các protein ở các đoạn chứa các aminoaxit Serin và Threonin thuộc vùng vị trí hoạt động. Cho tới nay đã có 9 CDKs (cdk1-9) và khoảng trên 16 cyclin gắn kết đã được xác định và đang từng bước được làm rõ mối liên quan đến các bệnh khác nhau như ung thư, tiểu đường, Alzheimer’s, thần kinh… Indirubin và dẫn xuất của nó là các chất có hoạt tính sinh học cao, chúng ức chế các enzyme CDK1, CDK2, GSK-3β [5, 6], qua đó tác động đến chu trình hình thành và phát triển của tế bào ung thư, bởi vậy chúng là các đối tượng nhận được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. 1.2. Thu nhận, tổng hợp indirubin 1.2.1. Thu nhận indirubin từ nguyên liệu cây chàm mèo Strobilanthes cusia Indirubin 1 có thể được thu nhận từ lá chàm mèo Strobilanthes cusia theo quy trình của Nguyễn Mạnh Cường và cộng sự [7]. Lá chàm mèo được thái nhỏ, để lên men 3 ngày sau đó lọc rồi kiềm hóa, tách lấy bột chàm. Bột chàm thu được chiếm 0,75% lượng mẫu tươi, nhiều hơn so với lượng bột chàm nhận được khi tiến hành theo quy trình trong dân gian, hàm lượng indirubin cũng cao hơn so với hàm lượng 4
indirubin trong bột chàm theo quy trình trong dân gian. Indirubin được phân tách bằng sắc ký cột silicagel (cỡ hạt 0,063÷0,4 mm) hệ dung môi rửa giải n- hexan/dichloromethan tăng dần độ phân cực. Ngoài ra, một lượng lớn indirubin có thể thu được bằng phản ứng của dịch chiết nước giàu indican từ lá chàm mèo với isatin trong môi trường kiềm theo phương pháp của chính nhóm tác giả [8]. 1.2.2. Tổng hợp indirubin từ nguyên liệu hóa học Indirubin được Baeyer tổng hợp từ khá sớm bằng phản ứng ngưng tụ giữa isatin 6 và indoxyl 7 sử dụng dung môi ethanol, xúc tác Na2CO3 (Sơ đồ 1.1) [9]. Tuy nhiên, indoxyl 7 là chất trung gian khó tổng hợp và không bền, dễ bị dime hóa để tạo thành indigotin 2. Để khắc phục nhược điểm này, năm 1969, Rusell và Kaupp cải tiến phương pháp tổng hợp của Baeyer bằng cách thay indoxyl 7 bằng indoxyl acetate 8 bền hơn, thay dung môi ethanol bằng methanol (Sơ đồ 1.2), cũng giống như nghiên cứu của Bayer các tác giả không công bố hiệu suất của phản ứng [10]. Hiện nay phương pháp này được sử dụng khá phổ biến để điều chế indirubin và hầu hết các dẫn xuất của nó. Sơ đồ 1.1. Tổng hợp indirubin từ isatin và indoxyl Sơ đồ 1.2. Tổng hợp indirubin theo Rusell và Kaupp Năm 2017, Cuiling Wang và cộng sự công bố qui trình tổng hợp indirubin 1 giai đoạn bằng cách khử isatin 6 bởi tác nhân KBH4 trong dung môi methanol. Phản ứng tiến hành trong không khí ở nhiệt độ hồi lưu với tỷ lệ mol của isatin/KBH4 là 2/1. Phương pháp này dễ thực hiện và cho hiệu suất tạo thành sản phẩm indirubin cao (90,8%) (Sơ đồ 1.3) [11]. 5