Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Khảo sát nguồn nguyên liệu, nghiên cứu nâng cao hiệu suất tách chiết và chất lượng rutin từ nụ hoa hoè Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---------------------- NGUYỄN THỊ THU HUYỀN KHẢO SÁT NGUỒN NGUYÊN LIỆU, NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT VÀ CHẤT LƯỢNG RUTIN TỪ NỤ HOA HOÈ VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÀ NỘI 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---------------------- NGUYỄN THỊ THU HUYỀN KHẢO SÁT NGUỒN NGUYÊN LIỆU, NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU SUẤT TÁCH CHIẾT VÀ CHẤT LƯỢNG RUTIN TỪ NỤ HOA HOÈ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Quá trình và Thiết bị Công nghệ Hóa học Mã số: 62.52.77.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS PHẠM VĂN THIÊM 2. GS.TSKH PHAN ĐÌNH CHÂU

HÀ NỘI 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2010

Người cam đoan

Nguyễn Thị Thu Huyền

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, động viên và giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.

Tôi xin bày tỏ lời chân thành cảm ơn tới GS.TS Phạm Văn Thiêm và GS.TSKH Phan Đình Châu, những người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Quá trình Thiết bị & Công nghệ hoá học; Bộ môn Hóa dược & Bảo vệ Thực vật; Viện Đào tạo sau Đại học của Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội đã luôn quan tâm, giúp đỡ cũng như đóng góp ý kiến giúp tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại Trung tâm Giáo dục và Phát triển Sắc ký; Trung tâm Công nghệ Vật liệu và Môi trường - Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội đã hết lòng quan tâm, tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành xuất sắc nhiệm vụ được giao. Cảm ơn sự phối hợp và giúp đỡ của PTN Vilas 335, PTN Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Môi trường - Viện khoa học và Công nghệ Môi trường (ĐH Bách Khoa Hà Nội), PTN Hóa vật liệu (ĐH Khoa học tự nhiên), Phòng nghiên cứu cấu trúc (Viện hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã giúp tôi đo một số phổ và đánh giá kết quả nghiên cứu của luận án. Cuối cùng xin cảm ơn tất cả các em sinh viên đã cùng tôi làm việc trong thời gian qua. Sự quan tâm của các em là nguồn động lực lớn lao giúp tôi vượt qua mọi khó khăn và luôn hướng về phía trước. Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2010

NGƯỜI CẢM ƠN

Nguyễn Thị Thu Huyền

KÝ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT

Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

UV-VIS 1H-NMR 13C-NMR Cộng hưởng từ proton Cộng hưởng từ hạt nhân 13C

HPLC Sắc ký lỏng cao áp

pre- HPLC Sắc ký lỏng điều chế

GC-MS Sắc ký khí - khối phổ

SK Sắc ký

SKC Sắc ký cột

KLK Khối lượng khô

KLT Khối lượng tươi

DM Dung môi

CK Chân không

SPME Vi chiết pha rắn

PTN Phòng thí nghiệm

MKL Mất khối lượng

PP Phương pháp

TL Trọng lượng

KT Kết tinh

TCDĐ Tiêu chuẩn dược điển

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

HIV Virut suy giảm miễn dịch ở người, gây bệnh AIDS

ADP Ađenôzin điphosphat

Các dung dịch A, B, G (chỉ số 1,2 chỉ cấp độ pha ddA, ddA1, ddA2,

loãng) ddB1, ddG, ddG1

Diện tích peak rutin thu được từ phân tích HPLC Speak

Sai số lớn nhất SSmax

THF Tetra hydrofuran

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TOÁN HỌC

Lượng rutin phân hủy, lượng rutin thô trích ly được, kg q1, q0

qlt, qtn F

Lượng rutin trích ly được tính theo lý thuyết, thực nghiệm, kg Bề mặt tiếp xúc pha, m2 Hằng số khí (0,0821 atm/mol.độ), số Avogadro (6,023.1023) R, NA

Độ nhớt của dung môi η

Bán kính tiêu chuẩn khuếch tán r

Hệ số cấp khối từ pha rắn vào pha lỏng β

Bề dày tiểu phân vật liệu Hệ số khuếch tán nội, khuếch tán phân tử, m2/h Dn, D

Chiều dày lớp biên khuếch tán δ

Số phương sai n

Số lần lặp m

Giá trị đo được tại lần lặp thứ u

Phương sai chung

Phương sai tái sinh chung yu s2 s2

Số bậc tự do của mẫu fi

Số bậc do của phương sai chung fts

Sai số thí nghiệm (sai số tái sinh) sts

∧

Giá trị thực nghiệm yi

Giá trị tính từ hàm hồi quy lý thuyết

t(p,f2) Tiêu chuẩn Student tra bảng ở mức có nghĩa p và bậc tự do lặp f2

Độ lệch chuẩn của phân bố b Sb

Số thực nghiệm lặp tại tâm

m 0 ay Giá trị của thực nghiệm lặp thứ a

)

F p f ( , 1

Giá trị trung bình cộng của các thực nghiệm lặp

Chuẩn số fisher (mức có nghĩa p, bậc tự do dư f1 = N-l, bậc tự do

lặp f2 = m-1)

Số hệ số có nghĩa trong mô tả thống kê l

Ktl

Thời gian cần trích ly được 63,212% lượng rutin tối đa Hằng số tốc độ quá trình trích ly, kg/m2phút Hằng số tốc độ quá trình phân hủy, kg/m2phút Kph

K Lượng rutin tối đa trích ly được, kg

Tỷ lệ dung môi/pha rắn, kg/kg hoặc ml/g Kv

Hàm lượng rutin ban đầu trong nụ hòe, % Diện tích bề mặt riêng pha trắn, m2.kg-1 K2

Hằng số cân bằng, kg hạt hòe xay (hoặc nghiền)/kg dung môi Kcb

m Khối lượng hạt hòe xay (hoặc nghiền), kg

Q Tổng lượng rutin chứa trong hạt hòe xay (hoặc nghiền), kg

τ, t Thời gian trích ly (phút), thời gian bảo quản (năm)

Thành phần tạp chất trong nụ nguyên liệu, % X1

Thành phần nụ hòe không đạt quy cách, % X2

Thành phần ẩm trong hòe xay (nghiền), % A

σi

Phân bố theo kích thước của tập hợp hạt, % Khối lượng riêng của hạt hòe xay (hoặc nghiền), kg/m3 ρh

Cpha, Ctính Nồng độ rutin pha và nồng độ tính được qua phân tích HPLC

d Đường kính hạt hòe xay (hoặc nghiền), cm

p Khối lượng quercetin thu được (g)

Khối lượng mẫu cực đại M1

Hằng số k1,k2

Bán kính cột r1

L Chiều dài cột

Hệ số phân bố K1

0ρ

Khối lượng riêng chất nhồi

Diện tích bề mặt chất hấp thụ As

Đường kính hạt nhồi dP

Diện tích peak Speak

Khối lượng cắn chiết khô, g mcắn

Khối lượng quercetin tạo thành, g

mQ kh Khối lượng bột nụ khô tuyệt đối, g

rut.

Khối lượng rutin thu được sau tinh chế, g m0 mtc

Khối lượng dung môi, kg mdm

Thể tích dung môi, ml Vdm

Độ hấp thụ của rutin tại bước sóng 362nm A362,5

Diện tích peak thu được qua phân tích HPLC Speak

^ Y

Hàm mục tiêu (hiệu suất trích ly rutin)

Biến thực của thời gian trích ly rutin (phút) z1

Biến thực, biến mã của tỷ lệ lỏng/rắn (ml/g) z2

Biến thực, biến mã của vận tốc khuấy (vòng/phút) z3

Z1, Z2 Độ trở kháng âm môi trường 1,2

Biến mã của thời gian trích ly rutin x1

Biến mã của tỷ lệ lỏng/rắn x2

Biến mã của vận tốc khuấy x3

Htn (Hlt) Hiệu suất trích ly rutin từ thực nghiệm (tính theo lý thuyết), %

Hiệu suất trích ly rutin tối đa

Htd HTC Hiệu suất tinh chế rutin, %

HLth (HLt) Hàm lượng rutin thô (tinh), % Thể tích thiết bị phản ứng, m3 Năng suất thiết bị trong 24h, m3 N

∆t Độ chênh lệch thời gian, năm

∆HTC Độ chênh lệch hiệu suất tinh chế

R Hệ số phản xạ của sóng siêu âm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tiêu chuẩn dược điển rutin của Đức, Mỹ, Liên Xô, Việt Nam ................ 45

Bảng 3.1: Thành phần tạp và độ ẩm trong các mẫu hòe ........................................... 60

Bảng 3.2: Phân bố dạng nụ trong mỗi mẫu nghiên cứu ............................................ 60 Bảng 3.3: Phân bố kích thước trong mỗi tập hợp hạt hoè xay1,2 (nghiền) ................ 61 Bảng 3.4: Khối lượng riêng của hạt hòe xay1,2 (nghiền) ướt .................................... 62

Bảng 3.5: Các cấu tử định tính được trong phần chiết clorofoc ............................... 64

Bảng 3.6: Các cấu tử định tính được trong phần chiết n-hexan ............................... 64

Bảng 3.7: Các cấu tử định tính được trong phần chiết metanol ............................... 65

Bảng 3.8: Các nhóm chất đã phát hiện trong nụ hòe khô ......................................... 66

Bảng 3.9: Thành phần tinh dầu nụ và hoa hòe .......................................................... 68

Bảng 3.10: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP TL) ............................ 72

Bảng 3.11: Độ hấp thụ của dung dịch rutin chuẩn .................................................... 74

Bảng 3.12: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP UV-VIS) .................... 76

Bảng 3.13: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP HPLC) ....................... 77

Bảng 3.14: Tổng kết thành phần rutin trong nụ hoè theo ba phương pháp ............... 79 Bảng 3.15: Phương sai theo kết quả phân tích trọng lượng* .................................... 81 Bảng 3.16: Phương sai theo kết quả phân tích UV-VIS* .......................................... 82 Bảng 3.17: Phương sai theo kết quả phân tích HPLC* ............................................. 83

Bảng 3.18: Thành phần rutin trong các dạng nụ hoè ................................................ 84

Bảng 3.19: Độ giảm rutin trong nụ hòe theo thời gian bảo quản ............................. 85

Bảng 3.20: Điều kiện khảo sát quá trình trích ly rutin bằng nước ............................ 87 Bảng 3.21: Kết quả ảnh hưởng của Kv, τ và T0 đến quá trình trích ly ...................... 87

Bảng 3.22: Kết quả trích ly rutin bằng nước và dung dịch kiềm (NaOH, pH = 8) ... 90

Bảng 3.23: Kết quả trích ly rutin dưới tác động của sóng vi ba và siêu âm ............. 91

Bảng 3.24: Khảo sát ảnh hưởng của CNaOH, τngâm, pH đến quá trình trích ly ............ 93

Bảng 3.25: Kết quả trích ly rutin bằng NaOH tại điều kiện tối ưu ........................... 97

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ borax đến quá trình trích ly rutin .................... 97

Bảng 3.27: Kết quả xác định pH cho dung môi và pha trích .................................... 99

Bảng 3.28: Ảnh hưởng pH đến lượng rutin kết tủa ................................................ 101

Bảng 3.29: Ảnh hưởng thời gian trích ly đến lượng rutin ...................................... 101

Bảng 3.30. Kết quả phân tích kim loại xác định Na, B, Ca trong rutin .................. 103

Bảng 3.31: Kết quả trích ly rutin trong cồn (có/không siêu âm) ............................ 104

Bảng 3.32: Kết quả trích ly trong các dung môi dùng siêu âm .............................. 106

Bảng 3.33: Kết quả tổng kết các quá trình trích ly rutin (Kv = 20) ........................ 108

Bảng 3.34: Kế hoạch thực nghiệm bậc một hai mức tối ưu ................................... 109

Bảng 3.35: Kết quả quy hoạch thực nghiệm trích ly rutin có khuấy trộn ............... 110

Bảng 3.36: Kết quả trích ly rutin sử dụng siêu âm và khuấy trộn .......................... 112

Bảng 3.37: Ảnh hưởng của độ mịn nguyên liệu đến quá trình trích ly rutin .......... 113

Bảng 3.38. Kết quả tính toán Kv (với mHòe = 0,01kg) ............................................. 114

Bảng 3.39: Kết quả trích ly rutin khi Kv thay đổi ................................................... 114

Bảng 3.40: Hiệu suất trích ly và hàm lượng rutin ở tần số 25kHz và 30kHz ......... 115

Bảng 3.41: Kết quả quá trình trích ly rutin ở Kv=15,836kg/kg .............................. 117

Bảng 3.42: Kết quả kiểm chứng mô hình ở Kv = 11,877kg/kg ............................... 118

Bảng 3.43: Diện tích bề mặt riêng của tập hợp hạt theo phân bố (i=1÷6) .............. 119

Bảng 3.44: Ảnh hưởng của Kv đến quá trình trích ly rutin ở 30kHz ...................... 120

Bảng 3.45: Lượng rutin trích ly theo thực nghiệm và mô hình .............................. 122 Bảng 3.46: KX và TX của mô hình trích ly hạt xay2 ở 35Hz, 30kHz, 25kHz .......... 122 Bảng 3.47: Các thông số và mô hình trích ly siêu âm hạt hòe xay2 ....................... 123 Bảng 3.48: Các thông số và mô hình trích ly hạt nghiền, xay1,2 ở 25kHz .............. 125

Bảng 3.49: Các thông số mô hình trích ly rutin khuấy trộn và trong lò vi sóng .... 128

Bảng 3.50: Kế hoạch nghiên cứu tinh chế rutin theo mục tiêu ............................... 130

Bảng 3.51: Kết quả tinh chế rutin trong các dung môi ........................................... 130

Bảng 3.52: Kết quả tinh chế rutin trong hệ các dung môi ...................................... 131

Bảng 3.53: Kết quả phân tích các dung môi sau rửa giải trên cột .......................... 133

Bảng 3.54: Kết quả tinh chế rutin trên sắc ký cột ................................................... 133

Bảng 3.55: Kết quả cắt phân đoạn theo peak rutin ................................................ 137

Bảng 3.56: Hàm lượng rutin ở các phân đoạn sau cắt peak .................................... 137

Bảng 3.57: Kết quả điều chế rutin phân đoạn thứ 3 ............................................... 138

Bảng 3.58: Một số thông số của rutin sản phẩm trước và sau tinh chế .................. 139 Bảng 3.59: Kết quả giải phổ 1H-NRM ( MeOD, 500MHz) của rutin .................... 140 Bảng 3.60: Kết quả giải phổ 13C-NRM, 2D-HMQC, 2D-HMBC của rutin ........... 141

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Sophora japonica L. .......................................................................... 18

Hình 1.2: Phân bố nồng độ trong các pha của quá trình chuyển khối rắn- lỏng ....... 30

Hình 1.3: Sự thay đổi nồng độ rutin gần bề mặt hạt ................................................. 31

Hình 1.4: Xác định tốc độ quá trình trích ly rắn - lỏng............................................. 31

Hình 1.5: Sự thay đổi tốc độ kết tinh (m) theo thời gian (t) ..................................... 34

Hình 1.6: Độ hoà tan tương đối của rutin trong nước ............................................... 38

Hình 1.7: Độ hoà tan tương đối của rutin trong dung dịch etanol ............................ 38

Hình 3.1: Phổ UV-VIS cắn Soxhlet (ở trên) và phổ rutin chuẩn (0,075mg/ml) ....... 73

Hình 3.2: Phổ 3D của dung dịch rutin chuẩn (HPLC) .............................................. 73

Hình 3.3: Đường chuẩn rutin trên máy UV-VIS ...................................................... 74

Hình 3.4: Đường chuẩn và số liệu đường chuẩn rutin phân tích trên HPLC............ 75

Hình 3.5: Quan hệ giữa Kv và lượng rutin thu được ................................................. 88

Hình 3.6: Quan hệ giữa thời gian trích ly và lượng rutin ......................................... 88

Hình 3.7: Quan hệ giữa nhiệt độ trích ly và lượng rutin .......................................... 89 Hình 3.8: Hiệu suất trích ly rutin bằng nước và kiềm (NaOH, pH = 8) ở 1260C ... 90

Hình 3.9: Ảnh hưởng của sóng siêu âm và sóng vi ba đến qtn .................................. 92

Hình 3.10: Ảnh hưởng của τ ngâm trích đến lượng rutin trích ly ............................ 94

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến lượng rutin trích ly ........................ 94

Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến lượng rutin trích ly ............................................ 95

Hình 3.13: Ảnh hưởng của pH (1÷6) đến hàm lượng rutin thô ................................ 95

Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ borax đến lượng rutin trích ly ................................ 98

Hình 3.15: Ảnh hưởng thời gian trích đến lượng rutin trích ly ............................. 102

Hình 3.16: Kết quả trích ly rutin bằng cồn (không/ có siêu âm) ............................ 105

Hình 3.17: Thời gian và lượng rutin trích ly (không/có siêu âm) ........................... 105

Hình 3.18: Trích ly siêu âm rutin trong một số dung môi ..................................... 106

Hình 3.19: Ảnh hưởng của siêu âm và khuấy trộn đến quá trình trích ly ............... 113

Hình 3.20: Đồ thị qtn và qlt ở Kv = 15,836kg/kg, 30kHz (SSmax = 8,3%) ............... 117

Hình 3.21: Kiểm chứng mô hình ở Kv = 11,877 kg/kg, 30kHz ( SSmax = 4,4%) .... 118

Hình 3.22: Ảnh hưởng của Kv đến quá trình trích ly siêu âm ở 30kHz .................. 120

Hình 3.23: Đồ thị của qtn và qlt theo thời gian ở các Kv (30kHz) ........................... 120

Hình 3.24: Đồ thị q = f(ln(t)) ở Kv=15,836 (kg/kg) tại 35kHz, 25kHz, 30kHz ...... 121

Hình 3.25: Đồ thị so sánh qtn và qlt ở Kv = 15,836kg/kg, 35kHz (SSmax = 4,5%) .. 124

Hình 3.26: Đồ thị so sánh qtn và qlt ở Kv = 15,836kg/kg, 25kHz (SSmax = 6,7%) .. 124

Hình 3.27: Sắc ký đồ rutin trước (a) và sau (b) đánh dấu cắt phân đoạn .............. 136

Hình 3.28: Sắc ký đồ của rutin sau tinh chế trên pre-HPLC lần thứ 1 ................... 138

Hình 3.29: Sắc ký đồ của rutin sau tinh chế trên pre-HPLC lần thứ 2 ................... 138

Hình 3.30: Công thức cấu tạo của rutin sản phẩm theo kết quả giải phổ ............... 142

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Quy trình nghiên cứu chung .................................................................... 57

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ công nghệ trích ly rutin bằng nước vôi - borax ........................... 102

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ khối tính toán tối ưu quá trình trích ly rutin ................................ 109

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ công nghệ tinh chế rutin .............................................................. 131

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục A: Phổ và kết quả định lượng rutin trong nụ hoè ....................................... 155

Phụ lục B: Phổ GC-MS phân tích thành phần nụ hòe ............................................ 163

Phụ lục C: Phổ và đồ thị phần trích ly rutin ........................................................... 165

Phụ lục D: Phần mềm quy hoạch thực nghiệm ...................................................... 168

Phụ lục E: Phần tinh chế rutin ................................................................................ 178

Phụ lục F: Phổ phân tích cấu trúc và kim loại của rutin ......................................... 183

Phụ lục G: Thiết bị sử dụng, nguyên liệu và sản phẩm .......................................... 199

MỤC LỤC

KÝ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TOÁN HỌC ............................................................... 6

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... 9

DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... 11

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ....................................................................................... 12

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC .................................................................................. 12

MỤC LỤC ................................................................................................................. 13

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 17

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 18

1.1. Nụ hòe, rutin trong khoa học và đời sống .......................................................... 18

1.1.1. Cây hòe ở Việt Nam và trên thế giới .............................................................. 18

1.1.1.1. Thành phần và ứng dụng của cây hòe trong đời sống con người ........ 20

1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nụ hòe ............................................ 21

1.1.2. Rutin và các nghiên cứu đánh giá ................................................................... 24

1.1.2.1. Giới thiệu chung về rutin ..................................................................... 24

1.1.2.2. Tầm quan trọng của rutin trong nền y dược cổ truyền và hiện đại ..... 26

1.1.2.3. Nguồn nguyên liệu sản xuất rutin ........................................................ 28

1.2. Trích ly, tinh chế và thực trạng sản xuất rutin ................................................... 30

1.2.1. Cơ chế quá trình trích ly và tinh chế rutin ...................................................... 30

1.2.1.1. Trích ly rutin khỏi nguyên liệu ............................................................ 30

1.2.1.2. Tách rutin khỏi pha trích ..................................................................... 34

1.2.1.3. Tinh chế rutin ...................................................................................... 34

1.2.2. Tổng kết các quá trình trích ly, tinh chế rutin cơ bản ..................................... 35

1.2.2.1. Sơ lược kết quả của các nghiên cứu .................................................... 35

1.2.2.2. Các phương pháp trích ly rutin ............................................................ 37

1.2.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ rutin ở Việt Nam .......................... 39

1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất rutin ............................................... 39

1.2.3.2. Tình hình tinh chế và tiêu thụ rutin ..................................................... 41

1.2.3.3. Nhận định chung về thực trạng sản xuất rutin ở Việt Nam ................. 43

1.3. Yêu cầu chất lượng và phương pháp đánh giá rutin .......................................... 43

1.3.1. Tiêu chuẩn dược điển quy định cho rutin ....................................................... 43

1.3.2. Các phương pháp định tính, định lượng rutin ................................................. 46

1.3.2.1. Đinh tính rutin ..................................................................................... 46

1.3.2.2. Định lượng rutin .................................................................................. 46

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU .......................................................................................................................... 49

2.1. Nguyên vật liệu, dụng cụ ................................................................................... 49

2.1.1. Vật liệu, dung môi, hóa chất chính sử dụng .................................................... 49

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ chính ................................................................................ 49

2.1.3. Thu thập nguyên liệu nghiên cứu .................................................................... 50

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 51

2.2.1. Đánh giá nụ hòe nguyên liệu ........................................................................... 51

2.2.2. Nghiên cứu quá trình trích ly rutin .................................................................. 52

2.2.3. Nghiên quá trình tinh chế rutin chất lượng cao ............................................... 56

2.2.4. Đánh giá chất lượng rutin sản phẩm ............................................................... 56

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 57

3.1. Đánh giá trữ lượng và chất lượng nụ hòe Việt Nam .......................................... 58

3.1.1. Điều tra cơ bản về trữ lượng nụ hòe ............................................................... 58

3.1.2. Đánh giá một số thông số chính của hệ mẫu nghiên cứu ............................... 59

3.1.2.1. Xác định tạp chất, độ ẩm và nụ không đạt quy cách .......................... 59

3.1.2.2. Xác định phân bố của tập hợp hạt hoè sau xay, nghiền ...................... 60 3.1.2.3. Xác định khối lượng riêng của hạt hòe xay1,2 (nghiền) ướt ................ 61

3.1.3. Nghiên cứu thành phần hóa học nụ hòe Việt Nam ......................................... 62

3.1.3.1. Định tính một số nhóm chất trong nụ hoè khô .................................... 62

3.1.3.2. Xác định thành phần tinh dầu nụ và hoa hoè ...................................... 67

3.1.4. Đánh giá thành phần rutin trong nụ hòe Việt Nam ......................................... 71

3.1.4.1. Định lượng rutin trong nụ hòe ở các vùng trồng chính ....................... 71

3.1.4.2. Đánh giá các phương pháp phân tích hàm lượng rutin ....................... 81

3.1.4.3. Định lượng rutin trong một số dạng nụ ............................................... 84

3.1.4.4. Định lượng rutin trong nụ hòe theo thời gian bảo quản ...................... 85

3.2. Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin chất lượng cao .......................................... 85

3.2.1. Nghiên cứu khảo sát các dung môi trích ly rutin ............................................ 86

3.2.1.1. Trích ly rutin bằng dung môi nước ...................................................... 86

3.2.1.2. Trích ly rutin bằng dung dịch NaOH ở nhiệt độ thường ..................... 92

3.2.1.3. Trích ly rutin dùng nước vôi trong kết hợp với Borax ........................ 97

3.2.1.4. Nghiên cứu quá trình trích ly rutin trong dung môi etanol ............... 104

3.2.1.5. So sánh quá trình trích ly rutin siêu âm trong các dung môi ............. 105

3.2.2. Lựa chọn dung môi và công nghệ trích ly .................................................... 107

3.2.3. Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin có trợ giúp khuấy trộn ......................... 108

3.2.3.1. Tối ưu hóa quá trình trích ly rutin ..................................................... 108

3.2.3.2. Áp dụng tìm điều kiện tối ưu quá trình trích ly rutin có khuấy trộn . 110

3.2.4. Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin có trợ giúp siêu âm.............................. 111

3.2.4.1. So sánh quá trình trích ly rutin siêu âm và khuấy trộn ...................... 112

3.2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly siêu âm ......................... 113

3.2.5. Xây dựng mô hình động học và xác định các thông số của mô hình cho quá

trình trích ly rutin ................................................................................................ 116

3.2.5.1. Mô hình động học của quá trình trích ly siêu âm rutin ..................... 116

3.2.5.2. Mô hình động học quá trình trích ly rutin có trợ giúp của sóng vi ba

(lò vi sóng) và khuấy trộn ............................................................................... 126

3.3. Nghiên cứu công nghệ tinh chế rutin ............................................................... 128

3.3.1. Nghiên cứu tinh chế rutin bằng phương pháp kết tinh lại ............................. 130

3.3.2. Tinh chế bằng sắc ký cột ............................................................................... 132

3.3.3. Tinh chế rutin bằng sắc ký lỏng điều chế ...................................................... 134

3.3.3.1. Tính toán thông số quá trình điều chế ............................................... 134

3.3.3.2. Xác định điều kiện điều chế trên thiết bị Pre-HPLC 1100 ................ 135

3.3.3.3. Kết quả điều chế rutin trên hệ thống điều chế Pre-HPLC 1100 ........ 136

3.3.4. Đánh giá chất lượng rutin sau các quá trình tinh chế .................................... 139

3.3.4.1. Đánh giá nguyên liệu và các sản phẩm ............................................. 139

3.3.4.2. Phân tích cấu trúc rutin sản phẩm ..................................................... 139

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 143

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................. 144

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 146

PHỤ LỤC ................................................................................................................ 155

MỞ ĐẦU

Rutin là một dược chất có giá trị được sử dụng rộng rãi trong y học. Ngoài khả

năng phục hồi sự vỡ mao mạch tới 88%, rutin còn là một chất chống oxy hóa hiệu

quả được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh như bệnh tế bào hình liềm, viêm khớp,

xơ gan, u hắc tố, ... [64, 69]. Do có nhiều ứng dụng nên rutin không những được

quan tâm nghiên cứu sản xuất mà còn được nghiên cứu chuyển hóa thành nhiều

dược phẩm giá trị khác như polyrutin, troxerutin, quercetin, melin sulfat, phức

rutin-kim loại,... Từ năm 1947 đến 1950, rutin đã được sản xuất trên quy mô công

nghiệp ở nhiều quốc gia như Nhật, Mỹ, Úc,... từ các nguồn thực vật chính là nụ

hòe, kiều mạch, lá bạch đàn Australia, lá chè xanh,... [9]. Sở hữu một hàm lượng

rutin (34 - 44%) [7], nụ hòe Việt Nam là một trong những nguồn nguyên liệu giá trị

nhất trên thế giới. Tuy nhiên do hạn chế về công nghệ và ý thức về nguồn tài

nguyên còn chậm, từ năm 1962 vấn đề trích ly rutin trong nụ hòe mới được quan

tâm đến nhưng kết quả đạt được còn chưa rõ ràng [2, 3, 4]. Đến năm 1995 đã có dự

án sản xuất rutin và từ năm 2004 công nghệ sản xuất rutin đã được chào bán trên

mạng internet [15, 41, 44]. Cho đến nay, nhiều doanh nghiệp đã công bố sản xuất và

bán rutin như BV Pharma, Vimedimex, Đạt Doan, Quế Hòe, Nhật Cường (Thái

Bình),... [10]. Tuy nhiên thực tế cho thấy rutin sản xuất trong nước hầu như chỉ đạt

chất lượng thô (< 95%), phần lớn cả nụ hòe và rutin thô được đưa sang Trung Quốc

qua các con đường tiểu ngạch với giá thành rẻ. Như vậy từ một nguồn tài nguyên

sẵn có nhưng chưa có phương thức khai thác hiệu quả dẫn đến hiệu quả kinh tế rất

thấp. Thực trạng đó là ở vấn đề công nghệ hay chính sách? Do những hiệu quả kinh

tế mang lại nên từ năm 2006 cây hòe cũng như rutin đã được Đảng và nhà nước

quan tâm thích đáng. Vì thế vấn đề mà nhiều nhà sản xuất rutin Việt Nam đang

vướng mắc chính là công nghệ. Nhằm khắc phục tình trạng trên cũng như góp phần

sản xuất ra rutin phục vụ cho nhu cầu làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất

khẩu, luận án đặt vấn đề "Khảo sát nguồn nguyên liệu, nghiên cứu nâng cao hiệu

suất tách chiết và chất lượng rutin từ nụ hoa hoè Việt Nam".

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Nụ hòe, rutin trong khoa học và đời sống

1.1.1. Cây hòe ở Việt Nam và trên thế giới

Cây hòe thuộc thực vật họ đậu Fabaceae (Papilionceae). Hòe có nguồn gốc từ

Trung Quốc, Triều Tiên và phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới như Đông Á, Đông

Nam Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên,

Việt Nam); Trung Á (Capcadơ, bán đảo Crưm)

và một số nước châu Âu (Anh, Hungary,…). Ở

Việt Nam, chi Sophora L. có ba loài chủ yếu là:

hòe lông (Sophora tomentosa L. (Silverbrush))

có hoa màu vàng xám, phân bố rộng rãi ở các

vùng ven bờ biển (trên bãi cát các đảo từ Hình 1.1: Cây Sophora japonica

Quảng Ninh đến tận Côn Đảo - Vũng Tàu và

Phú Quốc - Kiên Giang; hòe Bắc Việt Nam (Sophora tonkinensis Gagnep.) có lá và

thân mang lông mềm, tràng hoa màu vàng, thường mọc trong các núi đá vôi và trên

sườn đồi phía Bắc (phân bố từ Quảng Ninh, Ninh Bình tới Quảng Nam, Đà Nẵng)

[8, 9, 11, 39] và loài có giá trị kinh tế nhất là hòe (Sophora japonica L.) có nụ hoa

màu trắng hay vàng xanh nhạt, thuộc loại lưỡng tính phân bố ở Bắc, Trung Bộ và

Tây Nguyên (hình 1.1) [35, 51].

Hòe là thực vật rễ cọc có khả năng thích nghi mạnh, ưa đất sâu mát, thành phần

cơ giới trung bình, ít chua, thoát nước; mọc tốt trên đất phù sa, đất bazan, đất bồi tụ

chân đồi, đất pha cát, đất thịt (trừ đất cát ven biển miền Trung và đất chua mặn);

thích hợp khí hậu nhiều vùng nhất là từ Nam Tây Nguyên tới vùng núi phía Bắc

[11, 38, 49]. Ở nước ta cây hòe mọc hoang hay được trồng (trong vườn, trên bờ

ruộng cao, bờ mương máng, bờ sông) để làm thuốc, làm cảnh từ lâu đời ở các tỉnh

phía Bắc như Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải

Phòng, Ninh Bình, Hà Nam, Nam Định, Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Phú Thọ,

Vĩnh Phúc [11, 35, 51]. Từ năm 1976 việc trồng hoè được triển khai vào các tỉnh

miền Trung (Thanh Hoá, Nghệ An) và Tây Nguyên (Đắk lắk, Gia Lai, Kon Tum,

Lâm Đồng, Đồng Nai, Đắk Nông, Bình Phước,…). Ở Tây Nguyên, trước đây cây

hòe chỉ được trồng ngoài bờ lô chắn gió nhưng hiệu quả của việc trồng xen lẫn với

cà phê khiến cho mô hình này đang phát triển mạnh [38, 51]. Ở Nghệ An, hòe là cây

xoá đói giảm nghèo, phát triển mạnh trong 10 năm gần đây nhưng không thuộc loại

cây chủ lực, chủ yếu được trồng tự phát. Ở Quỳnh Lưu, dọc theo quốc lộ 1A (từ khu

công nghiệp Hoàng Mai trở vào), từ xã Mai Hùng, Quỳnh Lộc, Quỳnh Lập, Quỳnh

Dị,... đến cả trại phong Quỳnh Lập đâu đâu cũng rợp bóng cây hòe [24]. Hiện nay

hoè là một trong 14 loài cây lâm nghiệp được ưu tiên phát triển ở 10 tỉnh Đồng

Bằng Sông Hồng, là một trong 21 cây bản địa chủ yếu được dùng làm cây che bóng

trong trồng rừng theo phương thức nông lâm kết hợp.

Hòe được trồng và nhân giống bằng cách gieo hạt ươm cây con (cây con rễ trần

hoặc có bầu), ghép mắt, chiết cành hay tách rễ từ cây mẹ. Phương pháp ghép mắt

được đánh giá tốt nhất vì hệ số nhân giống cao [49]. Hiện nay số lượng hòe được

trồng trên toàn quốc tương đối lớn nhưng cây con vẫn chỉ được ươm chủ yếu ở

vườn ươm Cúc Phương (500cây/năm), Thanh Hoá (50000cây/năm) với nguồn cung

cấp hạt từ một số gia đình ở Phú Thọ, Hà Nội, Thanh Hoá, Ninh Bình, Nghệ An,

Nam Định và một số tỉnh khác [35].

Có hai loại hoè với sản lượng nụ và hàm lượng rutin khác nhau. Hòe tẻ (hòe đực)

là loại cây cao, mọc thẳng đứng, phân ít cành, nụ bé, sản lượng thấp, hoa ra ít, màu

sẫm hơn, cuống dài, bông nhỏ, thưa thớt không đều, nở thành nhiều đợt. Hòe nếp

(hòe cái) là loại cây phát triển nhanh, phân nhiều cành vít ngang, quả mập, cho sản

lượng nụ cao, hoa to, nhiều, đều, có màu nhạt, cuống ngắn, nở rộ, tập trung vào

tháng 6-7-8. Hòe nếp cho năng suất cao gấp ba lần hòe tẻ với thành phần rutin

chiếm 44% KLK trong khi hòe tẻ chỉ có 40,6% KLK [7, 35, 51]. Việc tuyển chọn

và nhân giống ảnh hưởng lớn đến chất lượng cây (ra ít hay nhiều nụ, nụ đều hay

không đều). Theo kinh nghiệm, nên chọn giống hòe thấp cây, sinh trưởng khỏe,

chùm nụ gọn, ngắn, chẽ đều và ra tập trung vào hai vụ chính: vụ xuân (ra nụ tháng

3, thu hái vào tháng 5), vụ thu (ra tháng 8, thu hái trong tháng 10) [11, 35].

1.1.1.1. Thành phần và ứng dụng của cây hòe trong đời sống con người

Hòe là một trong ba loài của chi Sophora L. ở Châu Á được dùng làm thuốc trị

bệnh theo dược học cổ truyền Trung Quốc, Việt Nam và Nhật Bản; được sử dụng

làm phẩm màu để nhuộm tơ; làm thuốc điều hoà sinh trưởng Lacasoto 4SP cho lúa,

ngô, khoai, sắn, ... [35]. Từ đời Lê, Kim, Minh, Thanh, Đường, Tống, hòe luôn là

một trong những vị thuốc không thể thiếu được trong các bài thuốc y học cổ truyền.

Tuy nhiên việc sử dụng hòe để điều trị chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian. Các kết

quả nghiên cứu về thành phần hóa học trong từng bộ phận cây hòe gần đây mới giải

thích được các nguồn gốc dược học này [11].

- Lá hoè bao gồm 19% protein, 3,5% lipit, alcaloit cytisin,... được dùng để trị tà khí,

động kinh, bệnh kinh sự của trẻ em, bệnh ghẻ ngứa mụn nhọt, phát ban do máu

nóng, bệnh răng, khó đẻ, trị nghiện nặng.

- Vỏ quả chứa 10-10,5% flavonoit [85], được dùng để hoàn trị năm bệnh trĩ nặng,

hoàn phong đại tiện ra máu.

- Hạt hoè gồm có flavonoit (1,75%), alkaloit loại quinolizidin (0,04%), protein

(17,2-23%), dầu béo (6,9-12,1%), khoáng chất (Ca, P, K), axit linoleic, chất nhầy và

một loại tinh bột có thể ăn được. Hạt hoè được dùng trị bệnh mắt nóng mờ tối, trị

nóng cao tâm phiền, dùng trong nghi thức tôn giáo của thổ dân (tạo ảo giác do chứa

cytosin) [8, 11, 85].

- Nhựa hoè dùng để trị các loại phong hoá sinh ra đờm rãi, tạng can bị phong, gân

mạch co rút, cấm khẩu, trị phong nhiệt gây điếc.

- Gỗ hoè có 8 isoflavonoit và nhiều thành phần khác [82, 84]. Cành hoè được dùng

chữa ngứa, đại phong, liệt, thấp khớp, vết thương bọ cạp cắn, bệnh mắt đỏ, lậu, trĩ.

- Vỏ cây hoè chứa lectin (1% KLT) với nhóm con là glycoprotein và peptit chính là

glycopeptit [43]. Rễ hoè chứa các flavonoit, (D,L)-maackian, anhydropisatin,

pterocarpan, sophoja ponicin,... Vỏ cây, vỏ rễ hoè được dùng để chữa lở loét, nứt

rữa, chữa phong cam trĩ, đại tiện ra máu, phá huyết. Tác dụng chống co thắt của hòe

bì tố gấp năm lần rutin, được dùng trị xơ mỡ động mạch, giảm colesterol trong

máu, gan và cửa động mạch, chống loét, làm trương lực cơ trơn đại tràng, phế quản.

+ Nụ hoa hòe là cách gọi dân gian chung và vẫn tồn tại trong một số tài liệu để chỉ

nụ hòe (mọc thành chùm ở đầu cành). Nụ hoè (Flos sophora immaturut) và hoa hoè

(Flos sophora) có thể sử dụng cùng nhau nhưng thành phần hóa học của chúng rất

khác nhau, hoa là bộ phận ít có giá trị hơn (rutin chiếm 3,6% KLK). Trong nụ hòe,

mười bốn flavonoit đã được tìm thấy trong đó rutin chiếm 34-44% KLK của nụ (tùy

theo dạng nụ) [13, 14]. Một số thành phần khác đã được tìm thấy là: quercetin,

kaempferol, genistein, bertulin, sophoradiol, sophorin A, B và C [11, 16, 22];

isorhamnetin-3-rutinosit, kaempferol-3-rutinosit [65]; luteolin 7-O-β-D-glucosit

[60]; kaempferol-sophorosit; sophorol; D-maackiain glucosit; DL-maackiain;

sophoricosit; isoflavon glycosit; biochanin; gluco; axit glucuronic; alkaloit; saponin;

triterpenoit saponin; sophorasit A; puerol A, B; kaikasaponin I, -III; anhydropisatin;

irisolidon; biochanin A; lectin; quinolizidin alkaloit; azukisaponin I,-II,-V;

soyasaponin I,-III; kaikasaponin I,-III; axit octadecatrienoic; axit myristic; axit

lauric; axit tetradecenoic; axit palmitic; axit hexadecenoic; axit stearic; axit

octadecadienoic; betulin; isorhamnetin; axit dodecenoic; axit tetradecadieoic, axit

arachidic và β-sitosterol [8, 11, 20, 37, 60]. Nụ hoè có tác dụng hạ nhiệt, mát huyết,

cầm máu, sáng mắt, bổ não, giảm tính thẩm thấu của mao quản, hạ huyết áp nên

dùng để trị xuất huyết, chảy máu cam, ho ra máu, băng huyết, trĩ chảy máu; xuất

huyết cấp tính do viêm thận, xích bạch lỵ, cao huyết áp; phòng ngừa đứt mạch máu

não, trị tràng phong tạng độc ra máu, kích thích niêm mạc ruột sinh chất tiết dịch

giảm tiêu chảy, thích hợp cho bệnh nhân cao huyết áp giai đoạn đầu và sau tai biến

mạch máu não [51].

Ngày nay, do sự phát triển của y dược học cổ truyền cũng như hiện đại, nhiều

loại dược liệu với các tính năng công dụng ưu việt mới đã được tìm thấy. Đi đôi với

nó là thói quen sử dụng các dạng thuốc bào chế đặc trị. Giá trị dược học của các bộ

phận cây hòe bị rơi vào quên lãng, chỉ có nụ hòe được nhắc tới và sử dụng.

1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nụ hòe

Trong số các bộ phận của cây hòe, nụ là bộ phận có giá trị kinh tế nhất. Giá trị

kinh tế cũng như dược học của nụ hòe là nhờ chứa rutin với hàm lượng từ 34 - 44%

KLK [11, 13, 14, 15, 35].

* Thu hoạch, sơ chế và bảo quản: hòe trồng sau 2-3 năm đầu thì cho nụ bói, từ

năm thứ 4 -5 trở đi thì cho nụ thương phẩm với khối lượng khoảng 8 -10kg nụ

khô/cây. Năng suất thu hoạch nụ tăng dần theo độ tuổi, cao nhất khi cây ở độ tuổi

10-25 rồi giảm dần sau đó [38]. Tần suất thu hoạch nụ từ 7-10 ngày/lần, chủ yếu từ

tháng 5-9 âm lịch, rộ nhất vào tháng 7-8. Có nơi hòe được thu hái theo vụ: vụ mùa

vào tháng 4-9 (năng suất cao nhưng hàm lượng rutin thấp); vụ chiêm vào tháng 10-1

(năng suất thấp nhưng hàm lượng rutin cao hơn vụ mùa) [11, 35]. Tỷ lệ tươi/khô

trung bình sau khi thu hoạch trung bình đối với ngày nắng là 3/1 và ngày mưa là

3,2/1 [38]. Thời điểm thu hoạch rất quan trọng: thu hoạch sớm nụ hòe nhỏ sẽ ảnh

hưởng đến năng suất; thu hoạch muộn quá (nụ nở thành hoa) lượng rutin giảm [9,

14]. Theo các tài liệu, cần thu hoạch khi nụ to đều, chùm có một vài nụ nở, chuyển

từ màu xanh sang màu nõn chuối [49] hay khi tỷ lệ nở khoảng 5% [7, 38]. Khi đó

nụ đồng đều và hàm lượng rutin đạt cao nhất. Sau khi thu hoạch, nụ hòe được vò,

loại bỏ lá, cuống và làm khô (phơi, sấy sao). Để đảm bảo nụ hòe đạt TCDĐ cũng

như làm nguyên liệu trích ly rutin, khâu sơ chế rất quan trọng [8]. Nếu thu hoạch

gặp trời mưa, nụ dễ bị thiu nhớt, phải rửa sạch để ráo nước, san mỏng và sấy. Khi

sao nụ hòe phải dùng chảo hoặc chậu nhôm, đảo đều đến khi kiểm tra nụ bằng tay

thấy nóng rát thì sao tiếp 8-10 phút, sau đó ủ 2-3h mới đem phơi. Phương pháp này

nụ mau khô và có màu sắc đẹp. Kiểm tra nụ hòe khô bằng cách miết nụ trên hai đầu

ngón tay, vỡ vụn là được. Nhìn chung nụ hòe phải đảm bảo khô, có mùi thơm, màu

vàng chanh, không ẩm mốc, không bị cháy, không lẫn lộn cuống lá, tạp chất, độ ẩm tối đa 11-12% [49]. Theo TC DĐVN III, nụ hòe khô (600C, 6h) phải có hàm lượng

rutin ≥ 20%, tỷ lệ hoa đã nở ≤ 10%, hoa sẫm màu ≤ 1%, các bộ phận khác của cây ≤

2%, độ ẩm ≤ 12%, tạp chất ≤ 1%, tro toàn phần ≤ 10%, không nấm mốc [8].

Các phương pháp sơ chế và bảo quản có ảnh hưởng đến thành phần hóa học nụ

hòe và do đó ảnh hưởng đến chất lượng cũng như công dụng của nó. Kết quả nghiên

cứu của Viện Dược liệu Trung Hoa Bắc Kinh đã chỉ ra: nụ hòe dạng tươi, sao và

thiêu thành than đều có tác dụng tăng cường lượng fibrinogen; dạng chiết giúp tăng

số đếm tiểu cầu; dạng sao vàng có hoạt tính cầm máu mạnh nhất. Do đó nụ hòe

thường được bào chế theo phương pháp hỏa chế thành các dạng khô giòn, xém hoặc cháy thành than cho các mục đích trị bệnh trong đông y. Nhiệt độ sấy từ 80-1200C hàm lượng rutin tăng nhanh, quercetin ít biến đổi; từ 140-1800C rutin giảm nhẹ, quercetin tăng nhẹ; từ 200-2200C rutin giảm mạnh, quercetin tăng mạnh [5]. Hàm

lượng rutin qua chế biến thay đổi rất lớn: dạng sống đạt khoảng 34,7%, dạng sao

vàng đạt 28,9%, dạng sao cháy đạt 18,5% [31]. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thay

đổi màu, hàm lượng quercetin, rutin và tỷ lệ phần trăm khô/tươi cũng như sự phụ

thuộc của độ bền rutin vào nhiệt độ, pH cũng được xem xét cụ thể [5, 28, 31, 45].

Theo thời gian bảo quản, nụ hòe được chế biến ở điều kiện tự nhiên sẽ giảm 6-11%

rutin, quercetin tăng xấp xỉ 0,1% (sau 2 năm) [30]. Một số nghiên cứu gần đây đã đi

vào nghiên cứu tốc độ giảm chất lượng, cách sơ chế cũng như tác dụng của nhiệt

đến sự biến đổi flavonoit trong nụ hoè [5, 30, 31, 45]. Phương pháp sơ chế được

đánh giá có độ giảm hàm lượng rutin thấp là ngâm nụ hòe tươi trong muối ăn 7,5%

trong 15 - 20 phút, rửa sạch, vẩy ly tâm rồi sao vàng [30, 31].

* Sự khác nhau về thành phần: Do ứng dụng rất lớn trong y học, một số nghiên

cứu đã đi vào nghiên cứu thành phần hóa học nụ hoè nhằm làm rõ nguồn gốc dược

học cũng như tìm ra các hoạt chất có giá trị. Nhiều hợp chất đã được phát hiện, phân

lập và xác định cấu trúc [11]. Theo nhiều nghiên cứu khác nhau, một số thành phần

hóa học của nụ hòe đã được tìm thấy (xem mục 1.1.1.1). Theo các tài liệu khác

nhau, mức độ giảm của rutin từ dạng nụ sang hoa cũng không thống nhất. Nếu như

hàm lượng rutin trong nụ là 34 - 44% KLK và trong hoa là 3,6% KLK [13, 14] thì

độ giảm rutin từ trạng thái nụ sang hoa xấp xỉ 89,41 - 91,82%. Tuy nhiên theo tài

liệu [7] thì mức độ giảm hàm lượng rutin công bố là 40%. Nhìn chung, cho đến nay

vẫn chưa có một nghiên cứu nào mang tính chất hệ thống về thành phần hóa học

cũng như mức độ giảm của rutin trong nụ hòe Việt Nam.

* Khai thác và sử dụng: nguồn gốc dược học của nụ hòe được giải thích chủ yếu

dựa vào rutin và do đó các ứng dụng của nó cũng trên cơ sở dược tính của hoạt chất

này. Ngày nay, nụ hòe không chỉ được sử dụng trong y học cổ truyền (thuốc bắc)

mà còn được sử dụng chế biến thành trà (Trà hoa Hòe - rutin Vĩnh Tiến), làm phẩm

màu thực phẩm, làm mỹ phẩm,... [74]. Tuy nhiên lượng sử dụng cho mục đích này

không đáng kể so với việc sử dụng làm nguyên liệu trích ly rutin. Xuất phát từ lợi

nhuận do rutin mang lại, việc trồng hòe ở Việt Nam đang được khôi phục và phát

triển để thu hoạch nụ sản xuất rutin [14].

1.1.2. Rutin và các nghiên cứu đánh giá

6, 1,

1 O

1.1.2.1. Giới thiệu chung về rutin

Rutin là một dược chất, một euflavonoit thuộc

5 OH

nhóm flavon được Veyss phân lập đầu tiên từ cây

cửu lý hương (Ruta graveolen) vào năm 1842

[9]. Năm 1904 được Schnidt xác định công thức

hóa học, năm 1944 được phân lập từ kiều mạch,

năm 1953 được tìm thấy trong gần 150 cây và

cho đến năm 1962 rutin mới được tổng hợp [7].

Rutin có tên khoa học là 3,3’,4’,5,7-pentahyroxyflavon-3-rutinosit ngoài ra còn

nhiều tên khác như eldrin, oxerutin, quercetin-3- rhamnoglucosit, quercetin-3-

Cấu tạo phân tử rutosit, rutosis, sclerutin, sophorin, quecetin-3-O-β-rutinosit.

rutin gồm hai phần, phần aglycon là quercetin (quercetol) thuộc nhóm flavonol và

phần đường là rutinosit (6-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosit) [7, 8].

Công thức phân tử là C27H30O16 [8].

23 = -39,430 (pyridin).

* Tính chất vật lý: Rutin có dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt hay vàng hơi

lục, để ra ánh sáng chuyển thành màu sẫm, không mùi. Rutin rất dễ hydrat hóa, tinh thể ngậm 3 phân tử nước có điểm chảy là 177-1780C [51] và trở thành dạng khan sau 12h sấy ở 1100C (áp suất 10mm Hg) [63]. Rutin khan hút ẩm rất mạnh, chuyển 23 = +13,820 (etanol) và αD sang màu nâu tại 1250C với αD

Độ tan của rutin trong các dung môi rất khác nhau: 1g rutin hòa tan trong khoảng

10.000ml nước lạnh, 100ml nước sôi, 7ml metanol sôi, 650ml etanol lạnh và 60ml

etanol nóng [17]. Rutin không tan trong clorofoc, cacbon disulfit, cacbon

tetraclorua, ete, benzen, ete dầu hỏa; dễ tan trong etyl axeton; tan nhiều trong

pyridin, dung dịch kiềm; tan ít trong rượu, axeton và etyl axetat. Dung dịch rutin

1cm là 345 và 265 [8, 7, 20, 51, 57].

trong etanol (96%) có hai cực đại hấp thụ trong vùng tử ngoại ở 362,7 và 257,7mµ với mật độ quang tương ứng E1%

* Tính chất hóa học: Sự có mặt các nhóm hydroxyl của phenolic, nhóm cacbonyl

và vòng benzen làm rutin khá hoạt động. Tính chất hóa học của rutin phụ thuộc vào

vị trí các nhóm hydroxyl và hệ nối đôi liên hợp trong phân tử [2].

+ Tính chất axit: rutin là một flavonoit có tính axit yếu (pKa = 9,98) nên dễ phản

ứng với dung dịch kiềm tạo muối tan trong nước, dung dịch có màu vàng thêm axit

vào có thể kết tủa [14]. Trong dung dịch kiềm rutin rất ít bị ảnh hưởng nhưng khi

kiềm đặc, nhiệt độ cao, cấu trúc rutin bị phá vỡ (vòng cromon bị phá), tùy theo mức

độ mà có thể tạo thành dẫn chất axit thơm và dẫn chất phenol.

+ Phản ứng của nhóm hydroxyl: do có nhóm -OH của phenolic và -OH của ancol

trong phần đường nên rutin dễ dàng tham gia phản ứng axyl hóa. Rutin trong dung

dịch kiềm có mặt Na2SO2O4 sẽ chuyển thành luteolin [63].

+ Phản ứng mở vòng của furanol: Sự có mặt nhiều nhóm -OH trong phân tử làm

rutin trở nên nhạy cảm hơn với các phản ứng oxy hóa và bẻ gãy vòng.

+ Phản ứng vòng thơm: rutin và flavonoit nói chung thường có phản ứng với các

hợp chất diazo tạo các sản phẩm có màu đặc trưng. Phản ứng này được sử dụng để

phát hiện flavonoit trên sắc ký, thuốc thử thường là amin thơm như p-nitroamin,

benzidin, axit sulfanilic.

+ Phản ứng của nhóm cacbonyl: rutin và một số flavonoit khác có nhóm cacbonyl

ở vị trí C4 và có nối đôi C2 = C3 nên có phản ứng Shinoda (xianidin). Đây là phản

ứng khử có sự tham gia của kim loại như sắt, kẽm, magie và axit clohydric cho sản

phẩm có màu đặc trưng: với magie cho dung dịch có màu đỏ, với dung dịch sắt (III)

clorua sẽ xuất hiện màu nâu hơi lục [8].

+ Phản ứng thủy phân: rutin là một flavonol glycosit có glycon là quercetin, phần

đường là α-D-gluco và L-rhamno nên có tính chất của disacarit. Khi rutin thủy phân

α D - glucose

tạo thành quercetin và hai phân tử đường monosacarit - phản ứng (1) [7, 14].

Mg/HCl H+

L - rhamnose

C6H10O4-O-C6H11O4

(1)

1.1.2.2. Tầm quan trọng của rutin trong nền y dược cổ truyền và hiện đại

Tại một cuộc họp của Tổ chức y tế xã hội Mỹ ở Chicago vào năm 1950, nếu như

công bố về sự phát tia bức xạ của bom nguyên tử với khả năng hủy diệt hàng loạt đã

mang đến bóng đêm của nỗi sợ hãi thì công bố về khả năng phục hồi sự vỡ mao

mạch trong cơ thể người đạt tới 88% của rutin lại đem đến niềm hy vọng cho sự

sống. Cho đến ngày nay, trải qua 6 thập kỷ- vai trò dược học của rutin ngày càng

sáng tỏ và được ứng dụng trên rất nhiều phương diện. Rutin được biết đến là một

loại dược chất (vitamin P) có tác dụng:

- Giảm sự phá huỷ của adrenalin trong cơ thể, tăng khả năng đàn hồi, giảm chứng

giòn, tính thấm của mao mạch, ngăn protein của máu thấm qua mô mao mạch.

- Ngăn ngừa sự chảy máu có định kỳ, ngăn cản sự đông máu bất thường qua ức chế

enzym photphodieteraza.

- Hỗ trợ dinh dưỡng tới những mao quản trong mắt, giảm áp lực nội nhãn bệnh nhân

glaucoma bằng cách tăng cường toàn vẹn cấu trúc collagen của mắt (60mg/ngày).

- Chống dị ứng bằng cách ngăn cản sự giải phóng của histamin từ các dưỡng bào (là

các tế bào lớn trong mô liên kết có nhiều hạt bào tương thô chứa nhiều chất như:

histamin, heparin (các chất được giải phóng khi bị viêm hay dị ứng).

- Làm mất tác dụng của chất độc trong các vết thương nên được dùng để giảm tính

nhạy cảm, đau nhức của vết thương; ngăn cản sự viêm nhiễm và thúc đẩy sự lành

lặn của da; cản trở sự hình thành enzym 5-lipoxygenaza từ hệ enzym lipoxygenaza

(là những chất xúc tác sản sinh ra các chất độc lipoxin).

- Ức chế các chủng vi khuẩn gram dương (không có tác dụng đối với các chủng vi

khuẩn gram âm), kìm hãm các loại virut, vi khuẩn có hại; chống eczema trên người

và chuột nhắt; ức chế sự kết tụ tiểu cầu, ức chế men khử andoza (bảo vệ tim); ngăn

cản tích trữ sorbitol trong tế bào (chất nguy cơ gây bệnh võng mạc và bệnh thần

kinh); ức chế viêm khớp, giảm kích thước không thông thường và ngăn chặn sự mất

sóng R trong các con chuột mất cảm giác (thắt động mạch vành), làm giảm tỷ lệ tử

vong khi chuột bị chiếu xạ,… [64].

- Trị bệnh sốt mùa hè, bệnh trĩ, giãn tĩnh mạch, bệnh mụn rộp miệng, bệnh xơ gan,

sự căng thẳng, can xi huyết thanh thấp, bệnh rối loạn vận động,…

Ngày nay, y học hiện đại đã xác định gốc tự do là nguyên nhân gây nên 90% các

loại bệnh của con người. Chúng được sinh ra trong tế bào (cạnh axit

đêoxiribônuclêic) và gây ra những ảnh hưởng nguy hại như biến dị, hủy hoại tế bào,

thúc đẩy ung thư, tăng nhanh lão hóa. Rutin là một chất có khả năng chống oxy hóa,

có nhóm OH ở vị trí octo nên dễ bị oxy hóa thành các semiquinon dưới tác dụng

của enzym polyphenoloxidaza và preroxidaza trong tế bào. Semiquinon (rutin dạng

oxy hóa) là các gốc tự do bền vững có thể nhận điện tử hoặc proton từ những chất

cho khác để trở lại dạng hydroquinon (rutin dạng khử). Các dạng này có khả năng

phản ứng với gốc tự do hoạt động để triệt tiêu chúng hoặc để tạo ra các gốc tự do

polyphenoloxidaza (hoặc peroxidaza)

kém hoạt động bền vững - phản ứng (2).

hydroquin

semiquinon

O2 (hoặc H2O2)+ rutin (khử) rutin (oxy hóa) (2)

Rutin được sử dụng trong các phác đồ điều trị ức chế các bệnh do các gốc tự do

gây ra theo cách: chống oxy-hóa phenolic, tạo chelat với các ion kim loại, phản ứng với các gốc tự do hoạt động (HO., ROO.) để kìm hãm quá trình oxy hóa dây chuyền,

tương tác với enzym để giảm các quá trình oxy hóa trong cơ thể sống nhằm bảo vệ

axit đêoxiribônuclêic khỏi các hư hại do hóa chất độc gây ra. Rutin đã làm giảm

71% sự di căn của u hắc tố ở phổi chuột, dùng trong ngăn ngừa và trị bệnh tế bào

hình liềm trong người [40, 64, 69].

Đa phần rutin được bào chế ở dạng viên nén (0,02g) theo TCDĐ năm 2006 [8]

hay viên bao phim dạng đơn hoặc phối hợp như: phối hợp với vitamin C (làm tăng

cường tác dụng của vitamin C); với vincamin (chữa chứng rối loạn tâm thần, cải

thiện trí nhớ, thần kinh giác quan ở người già); với axit ascorbic tạo viên bao

đường, với cevit rutin (trị trĩ, viêm -giãn tĩnh mạch); với nicotinamit (trị thực tổn

suy tĩnh - bạch mạch, trĩ); với trypsin, bromelain (trị sưng xương khớp).

Dù mang hoạt tính rất có giá trị nhưng ứng dụng của rutin bị hạn chế vì rutin tan

rất kém trong nước lạnh. Do vậy rutin còn được sử dụng như một sản phẩm trung

gian để điều chế ra nhiều loại dược chất có độ tan tốt hơn cũng như nhiều tính năng

ưu việt hơn như quercetin có tác dụng ức chế các chất xúc tiến u và sự tăng trưởng

của một số dòng tế bào ung thư như ung thư dạ dày, ung thư máu, ung thư bọng đái,

ung thư vú và hai dòng tế bào ung thư mạnh dễ di căn và kháng thuốc ( HT-1080 -

một loại tế bào u xơ ác tính trên mô liên kết và 26-L5 – một loại tế bào ung thư ruột

kết) [21, 32, 33, 40]; polyrutin có khối lượng phân tử vài nghìn nhưng hòa tan dễ

dàng trong nước, có khả năng dọn gốc tự do và ức chế quá trình oxy hoá tốt hơn

rutin [68]; troxerutin tan tốt trong nước được dùng để trị hội chứng giãn viêm loét

tĩnh mạch; trị đau cơ và chứng phù; natri rutin sulfat có hoạt tính chống lại một số

HIV-1 [61]; rutin poly(H-) sulfate có hoạt tính ức chế hoạt động phần bù trong

huyết thanh máu; melin sulfat có tác dụng trị HIV và nhiều loại phức rutin-kim loại,

phức quercetin-kim loại có khả năng chống oxy hóa cao [62, 83], ...

1.1.2.3. Nguồn nguyên liệu sản xuất rutin

Xuất phát từ các ứng dụng rất giá trị của rutin trong y học, rutin đã được tìm

kiếm trong thực vật và nghiên cứu tổng hợp. Kết quả của các nghiên cứu cho thấy

rutin có mặt trong gần 150 cây (từ 77 loài của 34 họ thực vật và 70 loài khác của 28

họ thực vật ở dạng vết) như quả mơ, hạt lúa mạch đen, anh đào, vỏ táo, vỏ quả và

quả (cam, chanh, quít, bưởi chùm, vôi), lõi hạt tiêu xanh, chè đen, cà chua, lá chè,

thuốc lá; các sản phẩm từ ong như ong phấn hoa; các đồ uống như rượu vang đỏ;

các loại ngũ cốc nghiền như kiều mạch, mạch ba góc; các loại rau củ như thì là, tỏi

củ; trong một số cây thuốc (loại cỏ dại có hoa trắng nhỏ), cây táo gai, cây mận, bạch

đàn, cây bạc hà, củ mài, cây thuốc lá,... [42, 51]. Ở Việt Nam rutin còn được phát

hiện từ cây ngưu tất (1995) [47], cây hy thiêm (2002) [42], cây ban (2006) [48]

và vỏ thân cây vọng cách (2008) [26].

Mặc dù tồn tại rất nhiều trong các nguồn thức ăn hàng ngày nhưng để đáp ứng

nhu cầu bào chế thuốc, rutin cần phải được sản xuất với khối lượng lớn. Ở Pháp mỗi

năm sản xuất khoảng 10 tấn rutin vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu [7]. Ở Hungari yêu

cầu của nhà máy Alkaloida khoảng 3 tấn rutin/năm để sản xuất viên rutin C. Gần

đây nhu cầu sử dụng rutin ngày càng tăng theo nhu cầu về dược phẩm, đặc biệt khi

một số dược phẩm quan trọng chữa bệnh phổ biến hiện nay lại được điều chế từ

rutin như quercetin, troxerutin, các dạng phối hợp của rutin với vitamin C (hay

vincamin, axit ascorbic, nicotinamit, trypsin, bromelain) [21, 56, 72].

Do có hàm lượng tương đối cao trong một số thực vật nên vấn đề tổng hợp rutin

được xem nhẹ, rutin chủ yếu được trích ly từ các thực vật và mang nguồn gốc tự

nhiên. Tùy theo hệ thực vật ở mỗi quốc gia, nguyên liệu trích ly rutin rất khác nhau:

đi từ lá chè xanh, nụ hòe (Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp, Hungari), kiều

mạch (Nhật) [66], hạt kiều mạch nảy mầm (Hàn Quốc) [67, 71]; bạch đàn (Anh,

Pháp, Mỹ); mạch ba góc (Anh, Nhật, Pháp, Nga, Ba lan) [7]. Với hàm lượng rutin:

cây hy thiêm (0,0185%) [42], nụ hoè Việt Nam (34-44%) [13, 14, 15], hòe Hungari

(12%) [14], mạch ba góc châu Âu (2-3%), lúa mạch ba góc Việt Nam (5-8%) [7]

hay 6%, lá cây táo ta (1,5%) [7], lá chè xanh (1%), cửu lý hương (Ruta graveolens

L.) (2%), kiều mạch (5-8,5%) [42] (kiều mạch thường (Fagopyrum esculentum

Moench.) (4%); kiều mạch đỏ tartary (Fagopyrum tataricum L.) (6%)), bạch đàn (3-

4%) [51] (bạch đàn Australia (Eucalyptus macrorrhyncha F. Muell.)) (10-19%)

[7],…. thì nụ hòe, kiều mạch, bạch đàn là ba nguồn nguyên liệu chính được sử dụng

để trích ly rutin. Trong cây hòe Việt Nam, rutin có ở hầu hết các bộ phận: nụ chưa

nở (44%), nụ vừa nở (34%), hoa đã nở (14,2%), lá cây (3,6-4,4%), vỏ quả (3,3-

4,3%), hạt (0,5%) [7,14,51]. Do chứa hàm lượng rutin cao nhất, nụ hòe Việt Nam là

một trong những nguồn nguyên liệu để trích ly rutin tốt nhất thế giới.

1.2. Trích ly, tinh chế và thực trạng sản xuất rutin

1.2.1. Cơ chế quá trình trích ly và tinh chế rutin

Nụ hòe được chia nhỏ bằng các phương pháp (nghiền, xay, ...). Tương ứng với

mỗi phương pháp chia nhỏ sẽ có các tập hợp hạt hòe xay, tập hợp hạt hòe nghiền,...

và trong mỗi tập hợp hạt đó sẽ có vô số các hạt hòe.

1.2.1.1. Trích ly rutin khỏi nguyên liệu

Đây là một quá trình chuyển khối rắn lỏng (hình 1.2). Trong giai đoạn này, dung

môi tiếp xúc với nguyên liệu, hòa tan và vận chuyển rutin vào dung môi. Do sự có

mặt của màng tế bào, màng nguyên sinh chất và nhiều thành phần khác nên khi hạt

hòe tiếp xúc với dung môi thường có hiện tượng hòa tan, khuếch tán, thẩm thấu và

thẩm tích. Dung môi thâm nhập vào

trong tế bào nguyên liệu qua các mao

quản (thời gian thấm phụ thuộc vào

đường kính, chiều dài mao quản, áp

lực không khí, dung môi); hòa tan rutin

(rutin được thấm ướt và hoà tan, có thể

tác động nhờ một số yếu tố như nhiệt

độ, pH, ...); khuếch tán rutin từ hạt hòe

vào dung môi, gồm: khuếch tán nội Hình 1.2: Phân bố nồng độ trong các pha

(chuyển rutin trong hạt hòe ra lớp dịch của quá trình chuyển khối rắn- lỏng [4]

chiết ở mặt ngoài hạt), khuếch tán chất

tan từ bề mặt hạt đến các lớp tiếp theo xa hơn (chủ yếu là khuếch tán phân tử),

khuếch tán đối lưu chuyển rutin theo dòng chuyển động của dịch chiết (điều kiện

thủy động là yếu tố quan trọng nhất).

Động lực quá trình trích ly rutin là sự chênh lệch nồng độ rutin trên bề mặt hạt

hòe với nồng độ trung bình của nó trong dịch chiết C0. Thông thường sự cân bằng

đạt được rất nhanh gần bề mặt hạt tức là thế hoá của rutin trong dung dịch bằng thế

hoá của rutin ở trong hạt hòe. Nồng độ trên bề mặt giới hạn rắn - lỏng có thể coi là

CF (

)

= β

nồng độ bão hoà Cbh, động lực của quá trình là Cbh–C0. Vận tốc của quá trình trích

bh C −

dq d τ

ly rutin được tính: (1.1)

Hình 1.4: Xác định tốc độ quá trình trích Hình 1.3: Sự thay đổi nồng độ rutin gần

ly rắn - lỏng [4] bề mặt hạt [4]

Hình 1.3 phản ánh sự thay đổi nồng độ rutin lớn nhất là ở lớp giới hạn khuếch

tán (gần bề mặt hạt hòe) có chiều dày δ, là khu vực khuếch tán phân tử.

dq d τ

bh − δ

(1.2)

D δ

(1.3) Từ công thức (1.1 và 1.2) ta có

Hệ số cấp khối β tỷ lệ nghịch với chiều dày của lớp biên khuếch tán (δ), giá trị δ

phụ thuộc vào chế độ thuỷ động ở khu vực bao quanh hạt hòe. Như vậy, sự chuyển

động tương đối của dung môi so với hạt hòe càng tăng thì δ càng bé, β càng lớn,

lượng rutin trích ly được càng nhiều. Ngoài ta khi nhiệt độ tăng thì tốc độ của quá

trình hoà tan rutin trong một số dung môi cũng tăng do Cbh tăng, độ nhớt của dung

dịch giảm, D tăng, lượng rutin trích ly được càng nhiều.

Khác với quá trình hòa tan thông thường, quá trình trích ly rutin thực hiện trong

các mao quản của hạt hòe nên bề mặt tiếp xúc pha chuyển dần vào trong, vận tốc

C (

)

trích ly sẽ giảm nhanh, đến một lúc nào đó khuấy trộn thường không có ảnh hưởng

bh C −

DF h ±

dq = d δτ

CFK

(

−

đến tốc độ của toàn bộ quá trình (hình 1.4): (1.4)

) tC 0

(1.5) Tổng lượng rutin trích ly được là

2 l nD

⎤ δ l + ⎥ D β ⎦

⎡ ⎢ ⎣

(1.6) Hệ số Ktl trong trường hợp chung:

Trong một số trường hợp điển hình:

- Dung môi di chuyển với tốc độ nhỏ: hiệu suất trích ly chịu tác động của cả ba giai

đoạn (biểu thức Ktl có mẫu số 3 số hạng).

- Dung môi di chuyển với tốc độ lớn (khuấy trộn mức độ cao như siêu âm): sự

chuyển chất coi như tức thời, hệ số khuếch tán đối lưu β rất lớn, bề dày lớp khuếch

tán trên bề mặt hạt rất nhỏ (bỏ qua hai số hạng sau của mẫu số trong (1.6)). Ktl sẽ do

nD 2 l

các yếu tố thuộc về khuếch tán trong lỗ xốp hạt quyết định:

- Dung môi không có sự di chuyển (chiết ngâm): hiệu suất trích ly được quyết định

bởi khuếch tán phân tử và khuếch tán trong các lỗ xốp của hạt hòe [4].

* Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly rutin

Theo [4, 9], tốc độ của quá trình trích ly phụ thuộc nhiều yếu tố như hình dạng,

kích thước, thành phần, cấu trúc dược liệu (mao quản), tính chất hoá lý, chế độ thuỷ

động dung môi, kiểu thiết bị, phương pháp chiết, tỷ lệ rắn/lỏng, ...

- Đặc điểm nguyên liệu và rutin: Trong thực vật, rutin được phân bố trong cấu trúc

tế vi tế bào, ở thành mao quản hoặc phân tán trên các bề mặt hay trong dạng liên kết

với thành phần khác trong tế bào. Do cấu trúc và thành phần hóa học tế bào thực vật

phức tạp (gồm có màng tế bào, màng nguyên sinh chất, các nhóm chất như (alkaloit,

glycosit, vitamin), tinh dầu nhựa, chất béo, pectin, chất nhầy, tinh bột, các chất

màu,….nên quá trình trích ly rutin cũng bị cản trở. Để loại bỏ bớt các ảnh hưởng,

cần phải xử lý nguyên liệu trước khi trích ly (dùng HCl loãng).

- Độ mịn nguyên liệu: nụ hòe cần được xay hoặc nghiền để đưa về kích thước nhỏ

hơn (các hạt hòe). Nếu kích thước nguyên liệu càng giảm, tốc độ quá trình trích ly

càng tăng do tăng bề mặt tiếp xúc pha và giảm đoạn đường khuyếch tán bên trong

nguyên liệu (hệ số khuếch tán tăng). Tuy nhiên khi nguyên liệu quá nhỏ thì tế bào

(có tính thẩm tích) bị dập nát, tạo điều kiện cho tạp chất hòa tan vào dung môi.

- Dung môi trích ly: chọn dung môi (nồng độ dung môi) là yếu tố then chốt trong

trích ly rutin bởi nó không chỉ ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế, hiệu quả kỹ thuật

của quá trình mà còn ảnh hưởng đến đặc tính của tạp chất, phương pháp tinh chế

cũng như ảnh hưởng tới môi trường, sức khỏe con người. Cần chọn dung môi có độ

nhớt thấp, hòa tan chọn lọc rutin, trơ về mặt hóa học, nhiệt độ sôi thấp, không gây

cháy nổ, rẻ tiền, ít độc hại. Nếu trích ly rutin bằng dung môi kiềm, ngoài nồng độ

kiềm thì độ pH của quá trình axit hóa sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng hòa tan, phân

hủy hay kết tủa rutin.

- Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (Kv): có ảnh hưởng lớn đến tốc độ khuếch tán cũng

như mức tan của rutin. Trong một khoảng nào đó, Kv tăng sẽ làm tăng tốc độ

khuếch tán và khả năng hòa tan rutin nhưng lại làm tăng tạp chất, do đó làm tăng

chi phí tách rutin khỏi pha trích.

- Nhiệt độ: với một số dung môi trích ly, nhiệt độ tăng làm cho độ nhớt của dung

môi giảm, tạo sự khuếch tán đối lưu liên tục và tăng khả năng tan của rutin. Tuy

nhiên tác động của nhiệt độ chỉ được sử dụng trong một giới hạn nhất định vì khi

tăng nhiệt sẽ dẫn đến sự phân hủy của rutin hay một số tạp chất, tăng mức độ hòa

tan của tạp chất, tăng chi phí năng lượng và đặc biệt sẽ rất nguy hiểm với dung môi

trích ly dễ bay hơi, dễ cháy nổ. Nếu trích ly rutin bằng nước thì yếu tố nhiệt độ rất

quan trọng.

- Thời gian trích ly: cần phù hợp, kéo dài sẽ tạo điều kiện tạp chất khuếch tán vào

pha trích nhiều hơn. Thời gian trích ly phụ thuộc vào độ mịn nguyên liệu, dung môi,

nhiệt độ và phương pháp, công nghệ trích ly.

- Điều kiện thủy động của dung môi: công thức (1.4) cho thấy chế độ thủy động của

dung môi đặc biệt quan trọng. Sự chênh lệch nồng độ là động lực chính của quá

trình khuếch tán nên phải di chuyển hỗn hợp trích ly để tạo ra sự chênh lệch nồng

độ ở bề mặt phân cách pha. Một số tác động có thể sử dụng như dùng áp suất cao,

khuấy trộn, sóng siêu âm, sóng viba hay sử dụng thiết bị có dao động mạch nhịp.

+ Khuấy trộn: làm tăng động lực khuếch tán. Tuỳ theo giai đoạn trích ly mà

khuấy trộn ảnh hưởng khác nhau đến quá trình khuếch tán trong của nguyên liệu.

+ Sóng viba (bước sóng khoảng 30cm (tần số 1GHz) - 1cm (tần số 30GHz)):

Sóng viba được ứng dụng trong lò vi sóng với các dao động của trường điện từ tần

số 2450 MHz. Tần số này có thể làm nóng hiệu quả nước lỏng (nấu chín thức ăn từ

bên trong) nhưng không hiệu quả với chất béo, đường và nước đá. Có thể dùng lò vi

sóng làm thiết bị trích ly với dung môi phù hợp là nước.

+ Sóng siêu âm (tần số 16kHz -10MHz): có khả năng tạo ra các tác động hóa lý

thông qua các hiện tượng sủi bong bóng. Sử dụng sóng siêu âm trong trích ly không

những rút ngắn được thời gian mà còn làm tăng hiệu suất trích ly [70].

1.2.1.2. Tách rutin khỏi pha trích

Phương pháp tách rutin khỏi pha trích chủ yếu dựa trên các hiện tượng kết tinh,

kết tủa rutin, đưa rutin từ dạng hòa tan về trạng thái rắn rồi thực hiện tách pha. Dựa

vào đặc tính của rutin và dung môi trích ly có thể tiến hành theo các cách sau: - Với dung môi trích ly là nước ở nhiệt độ cao (≥ 1000C): pha trích được làm lạnh

và rutin sẽ kết tủa nằm dưới đáy thiết bị chứa nên chỉ cần lọc thu rutin thô.

- Với dung môi trích ly là etanol lạnh: có thể nâng nhiệt độ pha trích (vì rutin tan tốt

trong etanol lạnh nhưng tan kém trong etanol nóng). Tuy nhiên phương pháp

thường được dùng để tách rutin hòa tan trong các dung môi nhóm rượu (metanol,

etanol,...) là cho bay hơi dung môi (cất dung môi). Trong quá trình cất dung môi,

khi dung môi bay hơi một phần thì dung dịch

dễ đạt trạng thái quá bão hòa nên hiện tượng

kết tinh rutin sẽ xảy ra.

- Với dung môi trích ly là kiềm (natrihydroxyt,

nước vôi,...): do rutin tan trong môi trường

kiềm và kết tủa trong môi trường axit nên thay

đổi pH pha trích sẽ làm rutin kết tủa (axit hóa

Hình 1.5: Sự thay đổi tốc độ kết pha trích).

tinh (m) theo thời gian (t) [4] 1.2.1.3. Tinh chế rutin 1- khi quá bão hòa mạnh; 2-khi

Tinh chế rutin được thực hiện theo nhiều quá bão hòa

phương pháp khác nhau. Phương pháp truyền

thống được thực hiện chủ yếu là hòa tan và kết tinh lại rutin nhiều lần trong nhiều

loại dung môi khác nhau. Trong các quá trình kết tinh này, vận tốc kết tinh đầu tiên

bằng 0 (giai đoạn tạo mầm) sau đó đạt cực đại trong thời gian ngắn rồi lại giảm dần

đến 0 (hình 1.5). Dung môi thích hợp được lựa chọn là các dung môi có độ hoà tan

rutin tăng khá nhanh theo nhiệt độ hoặc có khả năng hoà tan nhiều tạp chất để quá

trình tinh chế hiệu quả. Ngoài ra còn có thể dùng phương pháp chiết lại trong dung

môi hữu cơ hay dùng chất hấp phụ trơ có bộ khung xốp bề mặt riêng lớn như

silicagel, nhôm hoạt tính, đất chiết, celit, cacbon hoạt tính để hấp phụ các chất màu

và loại những tạp chất có cấu trúc cồng kềnh hơn rutin.

1.2.2. Tổng kết các quá trình trích ly, tinh chế rutin cơ bản

1.2.2.1. Sơ lược kết quả của các nghiên cứu

Do phát hiện được khả năng phục hồi thành mạch đặc biệt của rutin, nghiên cứu

trích ly rutin (từ kiều mạch) đã trở thành một cơn sốt trong giới khoa học Châu Âu

mà kết quả của nó là hoàng loạt các Patent sáng chế về công nghệ trích ly rutin [56,

79, 86], lọc rutin và tinh chế rutin từ kiều mạch đã ra đời, tập trung nhiều nhất vào

những năm 1946-1953 [79]. Trong các nghiên cứu này, cải tiến công nghệ thường

tập trung vào loại nhựa, chất béo khỏi dịch chiết ngay từ giai đoạn trích ly.

* Về trích ly rutin: Các dung môi được sử dụng chủ yếu là nước sôi, etanol,

propanol, axeton, metyl etyl xeton, hay hỗn hợp các dung môi. Thí dụ như trích ly

rutin từ hạt kiều mạch nảy mầm có thể dùng etanol (30-80%), axit acetic (3-15%) (hoặc hỗn hợp của chúng) với tỷ lệ lỏng/rắn = 5/10, ở 50-800C trong 1-3h; từ lá kiều mạch dùng nước sôi; từ lá, thân mạch ba góc dùng etanol 70% ở 800C [7]. Rutin

trong pha trích được tách ra bằng cách cất dung môi hoặc kết tủa rutin. Etanol 95%

có thể thêm vào khi cất chân không để protein và chất keo đông tụ, lọc bỏ phần

đông tụ, hóa hơi dịch lọc để loại cồn sau đó. Sản phẩm thô có thể được hòa tan và

kết tinh lại trong cồn, ethyl benzol,... Silicagel có thể được dùng như chất trợ lọc để

loại nhựa và chất béo hay hấp phụ sắc tố màu đỏ fagopyrin (fagopyrin có trong rutin

thô trích ly từ mạch ba góc) [7]. Tạp chất trước khi trích ly có thể loại bằng

clorofoc, axit clohydric loãng, axit sulfuric loãng và dùng FeCl3 5% để xác định dấu

hiệu chiết kiệt rutin [5].

Quá trình trích ly rutin có thể được cải tiến bằng cách thêm vào pha trích một phân đoạn hydrocacbon (phân đoạn khoáng spirit có nhiệt độ sôi 160-1900C, dung

môi thơm, phân đoạn naphta) dễ bay hơi có nhiệt độ sôi cao hơn dung môi trích để

loại nhựa thực vật, clorophyl. Cất pha trích trên điểm sôi của dung môi để thu hồi

dung môi; làm lạnh phần cặn để thu rutin tinh hơn với hiệu suất đạt tới 90-95%. Cải

tiến này đã loại bỏ sự nguy hiểm của vùng quá nhiệt trong quá trình cất dung môi

nhờ hydrocacbon làm chất lỏng đệm và kết hợp thực hiện tách, làm sạch các tạp chất

dầu trong rutin.

* Về tinh chế rutin: quá trình tinh chế rutin được nhiều nhà khoa học quan tâm. Từ

năm 1947-1955 đã có trên 10 patent (chủ yếu ở châu Âu) công bố bản quyền

phương pháp tinh chế rutin. Với đặc thù nguyên liệu chính là kiều mạch nên các

công trình này chỉ tập trung vào tinh chế rutin thô trích ly từ kiều mạch. Ở Việt

Nam, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào vấn đề chiết xuất rutin từ nụ hòe,

phần tinh chế rutin chỉ được đề cập đến. Phương pháp hòa tan và kết tinh lại trong

nước và một số dung môi như etanol, metanol, diclometan, nước sôi, clorofoc,

axeton thường được sử dụng, thí dụ như hòa tan rutin trong metanol sôi và kết tủa

bằng dung dịch kiềm,... [14]. Theo tài liệu [23] thì kết tinh lại rutin trong etanol

80% có thể đạt hiệu suất tinh chế tới 76,63%.

Tùy thuộc vào nguyên liệu và dung môi trích ly mà rutin thô có những tạp chất

khác nhau, quá trình tinh chế do đó cũng khác nhau.

+ Ảnh hưởng của nguyên liệu: Chất lượng của nguyên liệu không những ảnh hưởng

đến thành phần của dịch chiết mà còn ảnh hưởng đến hàm lượng rutin. Do sự khác

nhau về thành phần hóa học của nguyên liệu nên đi từ mỗi nguyên liệu khác nhau,

rutin thô sẽ có thành phần tạp khác nhau cả về lượng lẫn chất. Để đưa ra phương

pháp tinh chế rutin phù hợp, phải dựa vào đặc điểm của tạp chất trong các sản phẩm

này. Thí dụ trong kiều mạch, ngoài rutin còn có 12-15% protein, amino axit, chất

béo, khoáng (sắt, phốt pho, đồng, kẽm), vitamin B1, B2,... do đó rutin thô trích ly từ

kiều mạch sẽ mang các tạp chất trên. Trong số các tạp chất đó thì sắt, phức sắt và

phức đồng là những chất khó tách nhất, không thể loại được bằng các quá trình vật

lý, chiết, dùng chất hấp phụ hay kết tinh. Để xử lý chúng phải hòa tan rutin trong nước sôi rồi làm lạnh đến 700C, axit hóa dung dịch tới pH = 2,6 và duy trì ở 700C

trong 1giờ sau đó mới làm lạnh, lọc thu rutin tinh hơn. Đối với rutin chiết từ nụ hòe,

do thành phần hóa học nụ hòe rất phức tạp bao gồm các flavonoit, các chất béo,

clorophyl, axit béo, diệp lục, kim loại nặng, … nên tạp chất trong rutin thô cũng rất

đa dạng (xem mục 1.1.1.1). Đặc biệt là các flavonoit như quercetin, isoquercetin,

kaemperol 3- rutinosit,... là các chất có lợi trong dược phẩm nhưng chúng lại là

những tạp chất rất khó tách khỏi rutin thô do sự tương đồng về cấu trúc, tính chất

hóa lý với rutin.

+ Ảnh hưởng của dung môi trích ly rutin: do khả năng hòa tan chọn lọc của mỗi

dung môi trích ly khác nhau mà rutin thô cũng mang những tạp chất khác nhau. Từ

nguyên liệu nụ hòe, rutin thô chiết bằng nước sẽ lẫn nhiều chất như pectin, pectat...

do đó bị xạm, keo dính và hàm lượng thấp, sản phẩm có màu xanh lục. Nếu dùng

dung môi trích ly là kiềm, rutin thô sẽ lẫn nhiều tạp chất mang tính bazơ, sản phẩm

có màu vàng sậm. Nếu dùng dung môi trích ly là các dung môi hữu cơ, rutin thô lẫn

nhiều clorophyl, sắc tố, chất béo. Như vậy, để khắc phục clorophyl trong rutin thô,

có thể dùng tetracloruacacbon; để loại diệp lục và chất béo hoà tan khi chiết bằng

cồn, rutin thường được tinh chế bằng ete và kết tinh lại trong nước [7].

1.2.2.2. Các phương pháp trích ly rutin

Rutin là một hoạt chất có khung flavol, phân tử lượng lớn nên quá trình trích ly

thường sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan, tách rutin ra khỏi nguyên liệu. Khả

năng tan của rutin trong dung môi là vấn đề then chốt của quá trình trích ly rutin và

tách rutin ra khỏi pha trích. Mức tan của rutin trong dung môi nước và etanol theo

nhiệt độ đã được tìm thấy (hình 1.6 và hình 1.7).

Ba loại dung môi chiết chính đã được đề xuất và lựa chọn để trích ly rutin là

ở nhiệt độ sôi

ở nhiệt độ thường

Nhiệt độ (0C) Etanol %(v/v)

Hình 1.6: Độ hoà tan tương đối của Hình 1.7: Độ hoà tan tương đối của

rutin trong nước [17] rutin trong dung dịch etanol [17]

nước, kiềm và rượu. Dựa vào dung môi, quá trình trích rutin từ nụ Hòe có thể

tạm thời phân ra làm ba phương pháp chính sau:

* Phương pháp nước: dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong nước theo nhiệt độ

(hình 1.6): tan nhiều trong nước ≥ 1000C và ít tan trong nước lạnh nên nước được

dùng làm dung môi trích ly cũng như tinh chế rutin.

+ Ưu điểm: Dung môi là nước nên không độc, rẻ tiền, an toàn, không gây cháy nổ;

sản phẩm không bị lẫn diệp lục, tỷ lệ clorophyl tan lẫn ít (< 0,004 %) [14].

+ Nhược điểm: đòi hỏi lượng nước sôi lớn, đun nấu trên thiết bị cồng kềnh; hiệu suất

trích ly thấp; rutin lẫn nhiều chất khác như pectin, pectat... [14] do đó bị xạm, keo

dính, màu xanh lục và chỉ đạt chất lượng thô.

Phương pháp này được sử dụng phổ biến ở Anh, Mỹ, Úc. Nguyễn Văn Đàn và

cộng sự dùng phương pháp này để trích rutin từ mạch ba góc năm 1989 [7]. Trong

báo cáo dự án sản xuất rutin năm 1995 cũng sử dụng nước quá nhiệt để trích ly rutin

từ nụ hoè [7, 17, 75].

* Phương pháp kiềm: rutin là một glucozit có các nhóm – OH tự do của phenolic

(đặc biệt là nhóm OH ở vị trí 7) nên dễ tan trong môi trường kiềm. Các loại dung

dịch kiềm sử dụng để trích ly rutin là natrihydroxit, amoniac, natri cacbonat, nước

vôi, ... Pha trích có thể được axit hoá bằng axit để rutin thô kết tủa hoặc tách ra bằng

dung môi hữu cơ ở môi trường axit [7].

+ Ưu điểm: Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền; tiết kiệm nhiên liệu, năng lượng; trang thiết

bị đơn giản.

+ Nhược điểm: Với dung dịch kiềm rutin rất ít bị ảnh hưởng nhưng ở điều kiện

dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì cấu trúc rutin dễ bị phá vỡ. Quá trình axit

hoá cho rutin kết tủa phải khống chế độ pH thích hợp để tránh phân huỷ rutin thành

quercetin và rutin chưa kết tủa hết trong pha trích.

Phương pháp này được áp dụng ở Rumani, Hungari. Bộ môn Công nghiệp Dược

- ĐH Dược Hà Nội cũng sử dụng phương pháp này trong nghiên cứu trích ly rutin ở

quy mô PTN [7, 39].

* Phương pháp dùng dung môi hữu cơ khác: theo tài liệu [23], dung dịch axit

axetic 1% trong nước trích ly được rutin với hiệu suất 25,4%. Hầu hết các dung môi

hữu cơ có khả năng hoà tan rutin như axeton, etyl axeton, pyridin,… đặc biệt là

nhóm rượu như etanol, metanol, iso-propanol đã được sử dụng để trích ly rutin.

Rutin tan trong metanol và etanol theo nhiệt độ (hình 1.7) nên hai dung môi này

được sử dụng làm dung môi trích ly chính [7, 17, 39, 63].

+ Ưu điểm: dung môi có tính chọn lọc nên hàm lượng rutin sản phẩm và hiệu suất

trích ly cao.

+ Nhược điểm: dung môi đắt tiền và độc hại; nếu dùng metanol, etanol, propanol thì

tốn kém thêm trong công đoạn cất dung môi. Sản phẩm thô lẫn nhiều clorophyl, sắc

tố và chất béo [14].

Ở Đức, Mỹ, Việt Nam thường sử dụng etanol để trích ly rutin [27, 39].

1.2.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ rutin ở Việt Nam

1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất rutin

Do nụ hòe có từ lâu đời và sẵn có ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu trích ly

rutin được tiến hành trên cơ sở nụ hoè, các nghiên cứu từ nguyên liệu khác chỉ mang

tính chất công bố phát hiện [16, 42, 47, 48]. Năm 1962, xí nghiệp dược phẩm TW 2

đã đưa quy trình trích ly rutin vào sản xuất công nghiệp nhưng rutin chỉ được sử

dụng trong nước làm thuốc chữa bệnh và làm phẩm màu cao viên. Trong giai đoạn

1965-1975, rutin sản phẩm của Viện dược liệu đã được sử dụng làm thuốc tim mạch;

đã có quy trình trích ly rutin từ nụ hoè đạt TCDĐ Đức (DAB7) (hiệu suất 24%) được

chuyển giao trong nước. Đến năm 1989, nghiên cứu trích ly rutin vẫn tiến hành ở

nhiều nơi như trường ĐH dược Hà Nội, Viện dược liệu, xí nghiệp Hoá dược. Một vài

cơ sở công bố đã sản xuất rutin là xí nghiệp dược phẩm TW2, xí nghiệp liên hợp

dược Thái Bình, Xí nghiệp hoá dược, Viện khoa học Việt Nam, Công ty dược liệu

TW 1. Đề tài “Nghiên cứu phương pháp chiết xuất rutin đạt tiêu chuẩn xuất khẩu từ

hoa hoè” cũng đã được triển khai [39]. Phương pháp trích ly rutin được đề cập trong

thời gian này vẫn là dùng nước sôi, kiềm và cồn (dùng etanol, metanol). Theo kết

quả công bố thì dùng etanol 95% trong 15 phút chiết được trên 65% rutin và sau 1h

chiết được 85-95% rutin [7]. Cho đến năm 1995, dự án “Nghiên cứu triển khai công

nghệ sản xuất thử rutin chất lượng cao” đã nghiên cứu trích ly rutin bằng nước qua xử lý. Dây chuyền sản xuất rutin chất lượng cao (ở nhiệt độ >1000C, áp suất 1-5at)

quy mô pilot 3000kg rutin/năm đã được lắp đặt với hiệu suất trích ly công bố là >

80%, rutin đạt 95% (quercetin < 2%) với chất lượng tương đương TCDĐ Hà Lan NF

XI, Đức DAB VII và Nhật JP VII [17, 75].

Từ năm 1997-2003, vấn đề lựa chọn dung môi trích ly vẫn được quan tâm nhiều

hơn là nghiên cứu tìm các giải pháp công nghệ [39]. Dường như mong muốn tìm ra

một hệ dung môi tốt hơn cho quá trình trích ly rutin từ nụ hòe của các nhà khoa học

Việt Nam vẫn không dừng lại. Các nghiên cứu khảo sát trên nhiều hệ dung môi như etanol (60%, 95%), amonihydroxit (20%), natrihydroxit (0,15÷30%), nước (1000C, 1200C), dung dịch natricacbonat 1%, axit axetic, metanol (50%, 70%, 80%, 90%) và

etanol (50%, 70%, 80%, 90%) vẫn được công bố [13, 14, 27]. Nhận định chung vẫn

vẫn là: etanol, metanol trích ly rutin tốt nhất (etanol 80% cho hiệu suất trích ly 29-

29,5% [27]); natrihydroxit 20% là dung môi tốt hơn các kiềm khác [13, 14];...

Trong những năm gần đây, qua các phương tiện truyền thông, nhiều doanh nghiệp

công bố chính thức sản xuất rutin như BV Pharma có công suất chiết 20 tấn

rutin/năm (hàm lượng 98,0%), có cả công nghệ bào chế viên rutin bao đường

(GMP); vimedimex có khả năng cung cấp rutin > 50 tấn/năm. Bên cạnh các doanh

nghiệp nhà nước, các công ty cổ phẩn với quy mô lớn, dây chuyền sản xuất hiện đại

thì tồn tại không ít các doanh nghiệp tư nhân với công suất trích ly rutin không nhỏ.

Thí dụ như ở Thái Bình có Công ty chế biến nông sản Đạt Doan (công suất 5000tấn

hòe/năm), Quế Hòe (công suất 1200-3000tấn/năm), Nhật Cường (công suất 5-6000

tấn/năm). Hàng năm, các cơ sở này đã đóng góp cho thị trường rutin thô Việt Nam-

Trung Quốc một khối lượng sản phẩm rất đáng kể [10]. Không chỉ dừng lại ở đấy, sự

phát triển của cây hòe và rutin vẫn còn ở phía trước: một trong 9 dự án của Thái Bình

sắp tới là xây dựng nhà máy chiết xuất rutin từ nụ hoè công suất 300 tấn/năm với

100% vốn nước ngoài (trị giá 2triệu USD); hoàn thiện quy trình sản xuất rutin và

rutin hòa tan là một trong những mục tiêu mà nhà máy chiết tách dược liệu và bán

tổng hợp của tổng Công ty Hóa chất Việt Nam đang xây dựng [10]. Để có được sự

quan tâm chú trọng đầu tư phát triển như vậy thì tiềm năng và những lợi nhuận thực

tế từ việc trồng hòe, sản xuất rutin đã được xem xét, đánh giá và nhìn nhận.

Tuy nhiên, theo kết quả điều tra chính thức một số cơ sở sản xuất rutin tại Thái

Bình tháng 7/2010 cho thấy nhiều bất cập. Một vài cơ sở sản xuất rutin tư nhân đã

đóng cửa, trào lưu sản xuất và bán rutin thô ồ ạt sang Trung Quốc trong mùa vụ này

đã được thay bằng việc bán nụ hòe. Việc thu mua nụ hòe với mức giá cao, lượng lớn

của Trung Quốc đã đưa đến các hiện tượng đầu cơ, đẩy giá thành nguyên liệu biến

động theo từng ngày (từ 120-180.000 đồng/kg hòe). Sản xuất rutin bị đóng băng do

giá thành nguyên liệu cũng như rutin quá cao và bất ổn (rutin thô < 95% có giá 450-

550.000 đồng/kg). Sản phẩm sản xuất ra rất khó bán nhưng quan trọng hơn là bạn

hàng tiêu thụ chính (Trung Quốc) lại cắt giảm mức thu mua rutin. Như vậy, từ

nguyên liệu đến sản phẩm, nụ hòe và rutin Việt Nam đang bị thị trường Trung Quốc

chi phối gắt gao. Bên thềm hội nhập WTO, rutin Việt Nam cũng chỉ là một sản phẩm

nằm thoi thóp như bao mặt hàng nông sản và chế phẩm khác.

1.2.3.2. Tình hình tinh chế và tiêu thụ rutin

Tinh chế rutin đạt tiêu chuẩn dược phẩm là vấn đề mà hầu hết các cơ sở sản xuất

rutin bị vướng mắc. Từ năm 1995 cho đến năm 2000, không có công bố nào về kết

quả nghiên cứu tinh chế rutin. Tuy nhiên việc rao bán công nghệ sản xuất rutin (mã

VN2442 738 đạt TCVN hay VN03TMSH0231 với công suất 40 kg sản phẩm/ca đạt

TCDĐ Đức DAB VIII, NF 11) đã xuất hiện trên Website Sở khoa học và Công nghệ

tỉnh Tuyên Quang, Techmart Việt Nam [41, 44]. Bí quyết về tinh chế rutin vẫn nằm

trong bức màn bí mật. Đến năm 2005, đã có công bố kết quả tinh chế rutin bằng

metanol, natrihydroxit nhưng sau đó hầu như rutin vẫn không được tinh chế trong

nước mà được đưa sang Trung Quốc qua đường tiểu ngạch ở dạng thô [18].

Một thực tế không thể phủ nhận là rutin sản xuất tại Việt Nam phần lớn không đủ

chất lượng để cạnh tranh làm bạn hàng với những nhà sản xuất dược phẩm tiềm năng

như Ấn độ, Anh, Bỉ nên phần lớn rutin thô được bán sang Trung Quốc, Nhật Bản.

Trước tình hình đó, câu hỏi “tại sao” là điều mỗi chúng ta phải trăn trở. Phải chăng

đó là sự hạn chế về mặt công nghệ, Việt Nam vẫn chưa tìm được một công nghệ tinh

chế rutin phù hợp?

Do chưa đạt tiêu chuẩn dược phẩm nên rutin Việt Nam chỉ có giá trị của một bán

thành phẩm (190.000 - 200.000 đồng/kg, giá ở thời điểm tháng 4/2009). Trong khi

đó rutin ở mức độ tinh hơn được nhập lại Việt Nam với giá thành rất cao (rutin 95%

nhập từ Brazil là 1.000.000 đồng/kg; rutin 99,0% nhập từ Đức có giá 150000

đồng/0,5g). Thực tế mức tăng giá “siêu cao” này chính từ các kênh phân phối trung

gian chứ chưa hẳn do giá thành công nghệ tinh chế. Theo tính toán của các chuyên

gia, nếu các dược chất của Việt Nam được sản xuất và bào chế trong nước thì giá

thành chỉ bằng 30-50% giá các sản phẩm có chất lượng tương đương nhập ngoại [6].

Do đó, nếu như việc tinh chế rutin hàm lượng từ 95-98% được tiến hành trong nước,

người tiêu dùng Việt Nam sẽ là người được hưởng lợi từ nhiều khía cạnh: không

phải trả thuế nhập khẩu, giảm chi phí vận chuyển, giảm thời gian đặt mua hàng,...

Bên cạnh đó với nguồn lao động dồi dào thì giá thành xuất xưởng của rutin tinh sản

xuất trong nước cũng thấp hơn rất nhiều so với sản phẩm nhập ngoại. Rutin Việt

Nam không còn là một sản phẩm thô mà trở thành một mặt hàng dược phẩm với ứng

dụng cao hơn, hiệu quả kinh tế hơn. Nó sẽ không chỉ được sử dụng làm thuốc mà còn

sử dụng cho nhiều mục đích khác như làm chất chuẩn hay chế phẩm trung gian để

bào chế các dược chất giá trị dùng trong phòng chống ung thư như: quercetin,

melilsulfat (trị HIV), troxerutin (trị chứng giãn, viêm loét tĩnh mạch), O-(β-

hydroxyetyl)-rutosit (trị sự kết tụ tiểu cầu và tế bào đỏ), .... Như vậy vô hình dung

việc đưa ra một công nghệ tinh chế rutin phù hợp không chỉ nâng cao giá trị kinh tế,

kỹ thuật cho sản phẩm mà còn góp phần thúc đẩy việc trồng hòe, sản xuất rutin; giải

quyết công ăn việc làm cho một lực lượng lao động đang dư thừa đồng thời góp phần

thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghiệp hóa dược trong thời kỳ hội nhập, công

nghiệp hóa hiện đại hóa hiện nay.

1.2.3.3. Nhận định chung về thực trạng sản xuất rutin ở Việt Nam

Xuất phát từ một sản phẩm nông sản truyền thống là nụ hòe, sản xuất rutin ở Việt

Nam đã và đang phát triển tuy nhiên còn nhiều vấn đề bất cập:

- Tồn tại nhiều nhà sản xuất với đầu tư quy mô khá chênh lệch.

- Rutin không được tinh chế trong nước mà chủ yếu được bán ở dạng bán thành

phẩm (dạng thô hàm lượng < 95%) sang Trung Quốc.

- Sử dụng nhiều công nghệ trích ly khác nhau và chất lượng sản phẩm không đồng

đều. Một số cơ sở sản xuất không đảm bảo được vấn đề môi trường.

- Chưa có công nghệ tinh chế phù hợp để nâng hàm lượng rutin lên 98%, đạt TCDĐ.

Như vậy, từ một nguồn tài nguyên sẵn có nhưng phương thức khai thác, chế biến

chưa hiệu quả dẫn đến hiệu quả kinh tế thấp. Nếu không được quan tâm thích đáng,

rutin cũng trở thành một sản phẩm có số phận bế tắc - “nửa chìm nửa nổi” như bao

sản phẩm khác ở Việt Nam. Để khắc phục tình hình đó, cần phải có chiến lược đầu

tư lâu dài và bài bản: từ việc quy hoạch phát triển vùng nguyên liệu (vùng trồng hòe)

đến khâu thu hái bảo quản nguyên liệu cũng như nghiên cứu trích ly và tinh chế rutin

đạt chất lượng dược phẩm (98%) phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất

khẩu. Hơn nữa, việc đầu tư xây dựng các cơ sở nghiên cứu chuyển hóa và bào chế

rutin thành các dược phẩm có giá trị khác cũng là điều cần được quan tâm.

1.3. Yêu cầu chất lượng và phương pháp đánh giá rutin

1.3.1. Tiêu chuẩn dược điển quy định cho rutin

Theo TCDĐ, chỉ tiêu quy định chính cho rutin là hàm lượng rutin và quercetin.

Hàm lượng rutin yêu cầu đạt (95-101,5% với TC Liên xô và Mỹ; 98,5-102% với

Đức; ≥ 97% với Việt Nam), hàm lượng quercetin (≤ 5% với TC Liên xô, Việt Nam,

Mỹ; ≤ 2% đối với Đức) [8, 54, 78]. Ngoài ra còn một số chỉ tiêu quy định khác như

mất khối lượng do làm khô, tro sulfat, tro toàn phần, kim loại nặng, chlorophyl, sắc

tố đỏ, sắc tố tan trong ete, isoquercetin, kaemperol 3-rutinosit,… [8]. Các TCDĐ

(Đức, Mỹ, Liên Xô, Việt Nam) về rutin được trình bày trong bảng 1.1. Ngoài các

chỉ tiêu trong bảng 1.1, ra một số Dược điển còn quy định thêm các chỉ tiêu về:

- Độ trong: Hoà tan 0,1g mẫu thử trong 6ml, dung dịch phải trong (TC Liên xô).

- Độ trong và màu sắc của dung dịch: Nếu hòa tan 0,10g mẫu thử trong: 5ml etanol,

dung dịch thu được phải trong và có màu vàng; trong 5ml dung dịch natri hydroxyt

2% dung dịch thu được phải trong và có màu vàng da cam (TCVN)

- Acaloit: Dùng 2 - 3ml dung dịch cồn bão hoà mẫu thử, thêm 2 - 3ml dung dịch

axit picric bão hoà phải không có kết tủa (TC Liên xô)

- Diệp lục và sắc tố đỏ: Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thu được không được

có các cực đại hấp thụ ở bước sóng khoảng 590 và 655nm (TCVN)

- Các sắc tố tan trong ete: Lấy 0,020g chế phẩm, thêm 10ml ete, đun cách thủy

dưới ống sinh hàn ngược trong 30 phút, lớp ete phải không màu (TCVN)

Nhìn chung, rutin sản phẩm phải đáp ứng được các chỉ tiêu trên bảng 1.1 mới đạt

tiêu chuẩn dược phẩm. Trong sản xuất, tùy theo nguyên liệu cũng như dung môi

trích ly mà một số chỉ tiêu phụ cũng rất cần được lưu ý trong khâu tinh chế. Thí dụ

rutin trích ly từ mạch ba góc thì chỉ tiêu sắc tố màu đỏ cần được quan tâm, rutin

trích ly từ kiều mạch thì hàm lượng kim loại nặng (sắt, đồng, kẽm,..) phải được chú

trọng, rutin trích ly bằng các dung môi vô cơ thì hàm lượng kim loại cũng như các

muối cần được xem xét.

Bảng 1.1: Tiêu chuẩn dược điển rutin của Đức, Mỹ, Liên Xô, Việt Nam

STT Chỉ tiêu

Tiêu chuẩn Việt Nam 5,5 ÷ 9,0% Tiêu chuẩn Đức 5 ÷ 8,5% Tiêu chuẩn Mỹ ≥ 5,5% và ≤ 9% 1 Mất khối lượng do làm

khô

2 ≤ 0,1% - Tro sulfat

4 Tiêu chuẩn Liên xô ≥ 6% và ≤ 9% (lượng mẫu thử 0,5g, sấy ở 1350C) < 0,1% (lượng mẫu thử 0,5g) ≥ 95% KLK (PP UV)

< 0,3% (lượng mẫu 0,5 g) ≥ 97% và ≤ 102% (KLK) Hàm lượng rutin

≥ 98,5% và ≤ 102% KLK (UV, TBAH); ≥ 95% (PP HPLC)

Sắc tố đỏ

≤ 5,0% ≤ 0,001% - - - 9 Hàm lượng quercetin 5 Kim loại nặng 6 Hàm lượng clorofin 7 8 ≤ 2,0% (HPLC) ≤ 0,001% ≤ 0,004% ≤ 0,004% - ≥ 95% và ≤ 101,5% KLK (PP UV). ≤ 5% - ≤ 0,004% ≤ 0,004% -

Clorofin và các sắc tố tan trong ete

Tro toàn phần

- ≤ 2,0% (HPLC) ≤ 2,0% (HPLC) ≤ 0,5% - - ≤ 5,0% - - - Lắc hỗn hợp (0,1g mẫu thử + 5ml ete), ete phải không mầu - - - - - - 3 10 Hàm lượng isoquercetin 11 Hàm lượng kaemperol

3- rutinoside

Chú ý: -: không quy định

1.3.2. Các phương pháp định tính, định lượng rutin

1.3.2.1. Đinh tính rutin

Trong các quá trình trích ly gián đoạn, kiểm tra định tính nhanh rutin trong dịch

chiết hay bã chiết rất cần thiết để quyết định kết thúc quá trình. Một số phương pháp

định tính chứng tỏ vẫn còn rutin là:

- Khi cho dung dịch NaOH 0,1N vào dịch chiết, màu vàng sẽ tăng lên;

- Nhỏ thêm vài giọt HCl đậm đặc và một ít bột magiê, sau vài phút dịch chiết sẽ

xuất hiện màu hồng đến đỏ;

- Thêm một ít axit HCl 25% và bột kẽm vào, dịch chiết chuyển sang màu đỏ;

- Thêm vài giọt FeCl3 3-5%, dịch chiết sẽ có màu nâu hơi lục,.. [5].

Ngoài ra có thể định tính rutin bằng: so sánh phổ hấp thụ dịch chiết với phổ rutin

chuẩn ở cùng điều kiện; định tính rutin bằng sắc ký giấy hay sắc ký lớp mỏng (chất

hấp phụ silicagel, hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm) với hệ dung môi

triển khai: benzen – AtOAC (3:1); CHCl3 – MeOH (15:1); benzen - axeton (9:1);

toluen - axeton (19:1); CHCl3 – CH3COOH (9:1); MeOH 80% (v/v) [8].

1.3.2.2. Định lượng rutin

Để định lượng rutin trong nguyên liệu, rutin phải được trích ly hoàn toàn sau đó

đánh giá rutin từ dịch chiết. Chiết Soxhlet trong metanol là phương pháp chiết kiệt

rutin tốt nhất [45].

Định lượng rutin trong các dịch chiết, rutin thô, rutin tinh cũng như các chế phẩm

dược được tiến hành theo phương pháp trọng lượng, đo độ hấp thụ hay so màu [1,

29, 39]. Có thể chia thành bốn phương pháp sau:

* Phương pháp trọng lượng: đây là phương pháp cổ điển đơn giản được công bố

trong dược điển các nước như Việt Nam, Tây Đức DAB8, Hungari, I, II [2].

Nguyên tắc chung là chuyển hóa rutin thành quercetin rồi tính hàm lượng rutin theo

lượng cân của quercetin tạo thành. Có thể thủy phân rutin trong H2SO4 loãng (theo

DĐVN I) hoặc HCl (theo DĐ Hungari IV) [7, 14]. Theo tài liệu [7] thì phương pháp

này chỉ ứng dụng khi nguyên liệu giàu rutin và dịch chiết ít tạp chất nhưng kết luận

của tài liệu [29] thì phương pháp này chỉ có thể áp dụng để định lượng rutin trong

mẫu rutin tinh khiết (DĐ VN, DĐ Hungari, DĐ Đức DAB).

* Phương pháp đo màu: căn cứ vào sự tạo màu của rutin với kiềm hay một số thuốc

thử khác như amonimolipdat, phản ứng cyanidin,... rồi tiến hành đo mật độ quang

sau khi đạt cường độ màu cực đại trên máy đo quang ở bước sóng 500nm, đối chiếu

kết quả với mẫu rutin chuẩn [7, 45]. Phương pháp này đã được dùng để định lượng

rutin trong nụ hòe [5, 7, 45] và trong các dạng thuốc [39].

* Phương pháp quang phổ: căn cứ vào đo độ hấp thụ cực đại của dung dịch rutin

trong etanol ở hai bước sóng λmax= 362,5nm và λmax= 258nm để định lượng rutin [5,

8]. Có thể áp dụng theo TCDĐ VN, TCDĐ Liên xô X hoặc NFXI. Phương pháp này

đã được áp dụng để đánh giá rutin sản phẩm và trong các dạng thuốc [23]. Một số tác

giả đã cải tiến thay cồn tuyệt đối bằng cồn 95% để phân tích rutin trong các dạng

thuốc bằng phương pháp quang phổ [23] hoặc chuyển rutin về quercetin rồi định

lượng trên máy quang phổ [8]. Phương pháp này có thể áp dụng để định lượng rutin

trong các mẫu có độ tinh khiết khác nhau, có thể phục vụ cho kiểm tra các công đoạn

sản xuất và tinh chế rutin [29].

* Phương pháp sắc ký [1, 19, 45]: Có thể định lượng rutin bằng sắc ký bản mỏng

Silicagel với hệ dung môi khai triển n-BuOH - AcOH - H2O (4:1:5), hiện màu bằng

đèn UV hoặc hơi amoniac. Phổ biến nhất vẫn là định lượng rutin bằng sắc ký lỏng

cao áp (HPLC). Phương pháp HPLC hiện đại ngày nay đã được dùng để định lượng

chính xác rutin trong các dịch chiết (cây xấu hổ, cây thuốc lá, nụ hoè), rutin sản

phẩm hay trong các chế phẩm dược [2, 45]. Những năm 1990, rutin trong nụ Hòe ở

Việt Nam đã được định lượng trên cột nhồi, pha động metanol hay etanol, detector UV (λ = 362,5nm), tốc độ dòng 1ml/phút [1, 2]. Sau đó sử dụng cột LichrosorbR

RP-18 10 µm, 250 x 4mm, pha động CH3OH/0,4%CH3COOH (60:40, v/v), detector UV tại λ=254nm, tốc độ dòng 1,0ml/phút; nhiệt độ 20-230C. Với điều kiện trên,

thời gian lưu của rutin là 7,2 phút [3, 16, 42]. Rutin còn được định lượng trên cột

Appolo RP18 (250 x 4 mm, 5μm), pha động metanol-nước (48: 52), detector UV tại

λ=258nm, tốc độ dòng 1ml/phút [29]. Trong một số nghiên cứu đã công bố loại

dung môi pha động tốt nhất cho phân tích rutin là dung môi trung tính và sử dụng

metanol - H2O (48:52) [29], khi sử dụng pha động có tính axit kết quả thu được

không ổn định [45]. Tuy nhiên trong nhiều công bố của các nhà khoa học khác, sử

dụng kỹ thuật HPLC hay LC-MS thì hầu như pha động phải có tính axit [67, 73].

Nhìn chung đã có một số nghiên cứu so sánh đánh giá rutin theo bốn phương pháp

trên theo các TCDĐ Việt Nam (tập I), Tây Đức (DAB8), Hungari (I, II), Liên Xô (X)

và Mỹ (NF XI) [2, 29]. Phương pháp phổ tử ngoại và phương pháp so màu đánh giá

rutin, quercetin trong một số thuốc được chỉ ra là có kết quả xấp xỉ nhau [23].

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, dụng cụ

2.1.1. Vật liệu, dung môi, hóa chất chính sử dụng

- Các chất hấp phụ silicagel 0,063-0,2mm, florisil 100-200 U.S.mesh (Merck).

- Dung môi phân tích (Merck) và dung môi công nghiệp: metanol, THF, etanol,

axeton, axetonitril, n-hexan, clorofoc, dietyl ete, etyl axetat.

- Hóa chất: HCl 36%, natrihydroxit, Borax, nước vôi trong (Ca(OH)2 bão hòa),…

- Chất chuẩn: rutin 99%; quercetin 98% của Dr. Ehrentorfer GmbH (Đức).

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ chính

- Hàm lượng rutin được đánh giá trên hệ thống sắc ký HPLC với detector UV của

Merck-Hitachi (DAD-7000, cột RP18 (250mm x 4,6mm, 5μm) tại PTN hóa vật liệu

(trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội); HPLC SPD-M10A vp của

Shimadzu-Nhật (cột Eclipse XDB-C18 (150mm x 4,6mm, 5μm); cột SupelcoTM

LC-18 (150mm x 4,6mm, 5μm); cột Zorbax SB C18 (250mm x 3,0mm, 5μm); máy

quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến UV -1650 PC (Shimadzu, Nhật) tại PTN Vilas

335, ĐH Bách Khoa Hà Nội.

- Xác định thành phần được tiến hành trên hệ thống GC-MS 2010, Shimazu- Nhật

(cột DB-5MS 30m x 0,25mm x 0,5μm, khí mang Heli).

- Tinh chế rutin được thực hiện trên hệ thống Pre-HPLC HP1100 (Agilent, Mỹ),

cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (212mm x 150mm, 5μm).

- Quá trình trích ly đã sử dụng các thiết bị chính như bể rửa siêu âm model TPC-280

(30kHz, công suất âm 400Weff/800Wpeak, kích thước trong L x W x D = 50,5x30x20

(cm), Telsonic, Swiss); đầu phát sóng siêu âm có tần số 25kHz có công suất âm

400Weff/800Wpeak (I5GE039 – 139 ART 901786100) được đặt trong bể tự tạo có

kích thước như trên; bể rửa siêu âm LC 60H (35kHz, công suất âm

300Weff/600Wpeak, kích thước L x W x D = 30 x 15,1 x 15 (cm) của hãng Elma,

Đức); lò vi sóng (Sharp R-228H) công suất tối đa 800W; máy khuấy Keurostar, Ika-

Werker có điều khiển tốc độ. Các thiết bị trên đặt tại PTN Vilas 335 và Bộ môn Quá

trình Thiết bị và Công nghệ hóa học- ĐH Bách Khoa Hà Nội. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT, phổ HMQC và phổ

HMBC của rutin được ghi trên máy Avance 500 MHz, Bruker, Đức tại Phòng

nghiên cứu cấu trúc, Viện hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phân

tích kim loại trong rutin được thực hiện trên máy ICP-MS, Elan-DRCe, Perkin

Elmer tại PTN Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Môi trường - Viện khoa học và

Công nghệ Môi trường - Đại học Bách Khoa Hà Nội.

- Ngoài ra còn một số thiết bị, dụng cụ khác đã được sử dụng trong nghiên cứu như: cân phân tích 10-4 ( XT 220A, Prescisa, Thuỵ sĩ); máy sàng rung (RX-812, W.S.

Tyler, Mỹ); máy khuấy từ (Guo-Hua, 85B-2, Trung Quốc); máy cất quay chân

không (RE440BW, Yamato, Nhật); tủ sấy chân không (1445-2, Shellab, Mỹ); hệ

thống chiết Soxhlet (Gerhard, Đức); thiết bị Clevenger (Đức); vải lọc 180 (120)

đường/mm; cột nhồi; .....

Phần lớn các nghiên cứu của luận án được tiến hành trên các trang thiết bị tại

PTN Vilas 335, ĐH Bách Khoa Hà Nội.

2.1.3. Thu thập nguyên liệu nghiên cứu

Các mẫu nghiên cứu được lấy ở tám vùng trồng hòe đại diện cho các khu vực:

đồng bằng sông Hồng (Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nội), Đông Bắc (Thái Nguyên,

Móng Cái), Tây Bắc (Hòa Bình), Bắc Trung Bộ (Nghệ An), Tây Nguyên (Đăk lăk).

Ký hiệu các mẫu thu thập từ các vùng tương ứng như sau: Hưng Yên là HY; Thái

Bình là TB; Hà Nội là HN; Thái Nguyên là TN; Móng Cái là MC; Hòa Bình là HB;

Nghệ An là NA; Đăk lăk- K’bang là ĐL-KB; Đăk lăk- Eaka là ĐL-EA. Với mục

đích khảo sát vùng nguyên liệu nên các mẫu được lấy một cách đại trà, thu thập tại

các điểm thu mua tại mỗi vùng, không đại diện cho một cây hòe, một giống hòe nào

mà chỉ mang tính chất đại diện cho vùng trồng.

+ Hoa và nụ hòe tươi được thu thập ở Hòa Bình và Hưng Yên vào tháng 12/2008.

+ Các mẫu nụ hòe khô được thu thập tại:

- Thôn Nguyên Xá, An Hiệp, Thái Bình vào 26/07/2004. Mô tả: nụ nhỏ, chắc,

không đều hạt, màu vàng nhạt.

- Xuân Hùng, Quỳnh Lưu, Nghệ An vào 8-11/07/2004 ở hai dạng: phơi tự nhiên và sao (ký hiệu: *). Mô tả: nụ to, mẫm, đều hạt nhưng xốp nhẹ, màu vàng xanh. - Một số nơi khác: Đăk lăk (K’Bang và E’Kar), Thái Nguyên, Móng Cái, Hà Nội,

Hòa Bình, Hưng Yên vào 5-20/07/2004. Mô tả: nụ to, không chắc bằng hòe Thái

bình nhưng không xốp như hòe Nghệ An.

Các mẫu nụ khô sau khi thu thập được phơi lại và bảo quản trong bao nilon ở

điều kiện thoáng mát.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Đánh giá nụ hòe nguyên liệu

Các mẫu nụ hòe khô sau khi thu thập được xử lý sơ bộ bằng cách sàng lọc loại bỏ

tạp chất (đất, đá, hoa và nụ sắp nở, các bộ phận khác), đưa về cùng một phân bố

kích thước hạt; xác định thành phần ẩm; xác định phân bố tập hợp hạt qua các phương pháp chia nhỏ là nghiền và xay1,2 (1 và 2 chỉ cấp độ nụ hòe xay nhỏ); xác

định khối lượng riêng ướt của hạt hòe.

- Nghiên cứu thành phần dễ bay hơi trong nụ hoè bằng phân tích GC-MS: chiết

thành phần nụ hòe TB khô trong ba loại dung môi (n-hexan, metanol, chlorofoc) và

cất phân đoạn tinh dầu của nụ và hoa hòe HB, HY. Để phân tích các dịch chiết và

tinh dầu này, hệ thống khối phổ được vận hành ở chế độ 70eV, khí mang Helium

99,999% với tốc độ dòng 1,5 ml/phút, nhiệt độ nguồn ion và interface đặt tương ứng 2000C và 2800C. Căn cứ vào phổ của các hợp chất thu được và phổ chuẩn

trong 5 thư viện của GC-MS 2010, thành phần dễ bay hơi của mỗi dịch chiết sẽ

được định tính.

- Đánh giá hàm lượng rutin trong nụ hòe nguyên liệu: hàm lượng rutin được tính

bằng phần trăm khối lượng rutin trong mẫu thử khô: Các mẫu nụ hoè ở các vùng

trồng được chiết kiệt rutin bằng phương pháp Soxhlet [16, 45]; Hàm lượng rutin

trong dịch chiết được đánh giá theo ba phương pháp: phương pháp trọng lượng,

phương pháp quang phổ [8, 53] và phương pháp sắc ký lỏng [2, 16, 19, 55].

- Đánh giá kết quả và phương pháp phân tích rutin [25]:

m i

∑

m i

⎞ ⎟⎟ ⎠

⎛ ⎜⎜ ⎝

−

+ Giá trị phương sai được tính theo công thức (2.1):

2 i

2 u

∑

1 = m

1 −

1 =

⎤ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎦

⎡ ⎢ ⎢ ⎢ ⎢ ⎢ ⎣

, i= n,1 (2.1)

+ Số bậc tự do của mẫu: fi = m-1 (2.2)

+ Số bậc do của phương sai chung: (2.3)

∑

1i =

2 i

∑ 1 i ==

2 ts

+ Phương sai tái sinh chung được tính: (2.4)

2 max

Tuy nhiên với bậc tự do như nhau (kích thước của các thí nghiệm lặp như nhau),

2 is

s = n ∑

1 =

theo tiêu chuẩn Cochran ta có: (2.5)

2 i

= mn

( −

Phân bố G phụ thuộc vào số phương sai và số bậc tự do. Nếu G < G0,095 (n,f) thì sự sai khác giữa các phương sai là ngẫu nhiên và phương sai tái sinh được tính theo

2 ts

f ts

∑ 1 i == n

với (2.6) công thức:

s = ts

2 ts

(2.7) Như vậy sai số thí nghiệm (sai số tái sinh) sẽ là:

2.2.2. Nghiên cứu quá trình trích ly rutin

Cơ sở khoa học của việc lựa chọn dung môi trích ly: Nhìn chung độ hòa tan

của flavonoit tùy thuộc vào số nhóm hydroxyl và các nhóm thế khác của chúng. Số

nhóm này cũng như vị trí của chúng rất khác nhau giữa các flavonoit vì vậy mà mỗi

flavonoit phù hợp với một dung môi trích ly riêng. Đối với các flavon và flavonol

có nhiều nhóm –OH (các biflavon, auron, chalcon và glycozit) đều là chất phân cực

mạnh nên có thể trích ly bằng cồn, nước hoặc hỗn hợp các dung môi này (thường là

dung dịch etanol, metanol 80% hoặc 60%). Dùng nước nóng làm dung môi trích ly

tốt với các polyglycozit và các antoxyanin (với antoxyanin nên cho lượng nhỏ dung

dịch axit HCl vào nước nóng vì chúng khá bền vững ở nhiệt độ). Do có các nhóm -

OH phenol nên các flavonoit tan được trong kiềm, dung dịch kiềm loãng có thể làm

dung môi trích ly, flavonoit được tách khỏi pha trích bằng axit hóa. Trên cơ sở đó

quá trình trích ly được nghiên cứu như sau:

+ Khảo sát quá trình trích ly rutin trong một số dung môi (nước, etanol, metanol,

kiềm, nước vôi-borax), ở trạng thái tĩnh (ngâm trích) và có sự trợ giúp của sóng vi

ba, siêu âm, khuấy trộn. Với mỗi nghiên cứu, xác định các yếu tố ảnh hưởng chính,

khảo sát lần lượt từng yếu tố trong một khoảng giá trị phù hợp (yếu tố nghiên cứu

thì thay đổi, các yếu tố còn lại được cố định) để tìm điểm tối ưu trong khoảng đó.

+ Đề xuất lựa chọn dung môi trích rutin.

+ Nghiên cứu động học của quá trình trích ly trong dung môi đã lựa chọn với sự trợ

giúp của siêu âm và khuấy trộn. Đánh giá ảnh hưởng của các thông số chính như Kv, τ, T0,...đến hiệu suất trích ly rutin và độ tinh khiết của rutin thô [70, 81].

Để có thể xây dựng một mô hình trích ly rutin từ nụ hòe có sự trợ giúp của siêu

âm hay khuấy trộn mang tính tổng quát trong khi không có đầy đủ các thông số hóa

lý của quá trình, đặc biệt là thông số về tốc độ chuyển khối thì quá trình sẽ được xây

dựng như sau:

(cid:57) Đối với mô hình trích ly có khuấy trộn: xác định phạm vi biến đổi của các

thông số nghiên cứu; xây dựng mô hình toán học nghiên cứu động học của quá trình

trích ly rutin [3, 36, 46, 50]; viết phần mềm ứng dụng bằng ngôn ngữ Matlab để giải

bài toán trích ly rutin [52]; đưa ra phương trình hồi quy thực nghiệm tương hợp với

bức tranh thực nghiệm.

(cid:57) Đối với mô hình trích ly có trợ giúp siêu âm: Sử dụng lý thuyết trích ly rắn

lỏng để xây dựng phương trình vi phân động học quá trình trích ly rutin; giải

phương trình này bằng phương pháp giải tích để thu được nghiệm phụ thuộc vào

các thông số hóa lý chưa biết của quá trình; từ số liệu thực nghiệm xác định các

thông số của mô hình để tìm ra mô hình động học quá trình trích ly rutin [34, 52].

Các giả thiết trong quá trình trích ly :

- Nhiệt độ không đổi, khối lượng pha rắn không đổi, lượng dung môi thay đổi

không đáng kể trong quá trình trích ly.

- Diện tích tiếp xúc pha không đổi bằng diện tích bề mặt pha rắn

- Tốc độ khuếch tán trong đủ lớn

- Cấu tử không tạo liên kết hóa học với bề mặt pha rắn

- Quá trình diễn ra trong vùng khuếch tán, nồng độ rutin trong dung dịch đồng đều

do hiệu quả của khuấy trộn cơ học, của sóng siêu âm.

Mô hình mô tả quá trình trích ly có sự trợ giúp của khuấy trộn

∧ y

,...,

)

- Xây dựng phương trình hồi quy thực nghiệm của hàm nhiều biến:

xxfb ( i

∑+

(2.8)

∧ y

...

Hàm mục tiêu nhiều biến có thể khai triển thành chuỗi Taylor và có dạng sau:

2 j

xb jj

xb j

∑

, uj

1 =

xxb ju 1 =

1, =

(2.9)

Để xác định các hệ số b ta sử dụng phương pháp bình phương cực tiểu:

∧ y

min

−

= ∑

⎛ ⎜ ⎝

2 ⎞ →⎟ ⎠

∂Ψ

(

)

b ... k

(2.10)

= (*) (2.11)

b b , 0 1 b i

Tức là thỏa mãn điều kiện:

x 12

x 1

y 1

x 11 x

Viết dưới dạng ma trận:

22 .

21 . x

2 . x

. .

2 . y

⎡ ⎢ ⎢ ⎢ ⎢ ⎣

⎤ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎦

⎡ ⎢ ⎢ ⎢ ⎢ ⎣

⎤ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎦

f f

x x

) )

; (2.12)

)

. . . .

( ( . x (

)

b 0 b 1 . b k

f x ( 1 f x ( 1 . f x ( 1

f x ( 2 f x ( 2 . f x ( 2

⎡ ⎢ ⎢ ⎢ ⎢ ⎣

⎤ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎦

⎡ 1 ⎢ 1 ⎢ ⎢ . ⎢ 1 ⎢ ⎣

⎤ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎦

; (2.13)

F F B .

T F Y .

Ký hiệu FT là ma trận chuyển vị của F, thay vào (*) ta được:

= −

T F F .

T F Y .

⎡ = ⎣

⎤ ⎦

(2.14)

(2.15)

Phương trình trên cho phép xác định các hệ phương trình hồi quy thực nghiệm.

- Kiểm định tính có nghĩa của hệ số hồi quy theo tiêu chuẩn Student:

t p f ( ,

)

0,5

(2.16)

2 S 1l N

⎛ = ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎠

Độ lệch chuẩn của phân bố b: (2.17)

−

0 a

2 S l 1

(

)

1 − ∑ 1

= 1

(2.18) Phương sai lặp:

- Kiểm tra sự tương hợp của mô tả theo tiêu chuẩn Fisher nhờ điều kiện:

≤

)

F p f ( , 1

f 2

2 duS 2 S 1

(2.19)

−

(

)

2 du

y i

ˆ y i

1 − ∑ N l

(2.20) - Phương sai dư:

Mô hình mô tả quá trình trích ly có sự trợ giúp của sóng siêu âm

Mẫu và dung môi được đưa vào các bình tối màu, đặt các bình này trong bể siêu

âm đã được đổ đầy 2/3 nước. Bật công tắc bể, thực hiện quá trình trích ly dưới tác

động của siêu âm ở các thời gian khác nhau. Quá trình cũng được tiến hành trên các

thiết bị siêu âm có công suất âm và tần số khác nhau.

Theo lý thuyết, trong thời gian trích ly có khả năng xảy ra đồng thời 2 quá trình:

trích ly và phân huỷ rutin.

+ Quá trình phân huỷ rutin: Động học quá trình phân huỷ theo cơ chế gốc:

phCK

1 V

dq dt

(2.21)

+ Quá trình trích ly rutin: theo [4], phương trình truyền chất của quá trình trích ly

∗

CFK

(

)

−

dq dt

(2.22) rutin có dạng:

tlK

Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình thể hiện ở hằng số tốc độ

mKQ 1=

Tổng lượng rutin ban đầu tỷ lệ với khối lượng nụ hòe: (2.23)

(2.24)

mKF 2=

Diện tích tiếp xúc pha tỷ lệ với khối lượng nụ hòe:

=∗

Do hàm lượng rutin trong pha rắn không cao, nồng độ cân bằng tỷ lệ với hàm lượng

qQ 1− m

rutin: (2.25)

q V

qq 1− vmK

Nồng độ rutin trong pha lỏng: (2.26)

Thay vào phương trình (2.21) và (2.22), ta có mô hình toán mô tả động học của

1 K

dq 1 dt

qq 1 mK v

⎞ ⎟⎟ ⎠

quá trình trích ly có sự trợ giúp của sóng siêu âm và có xét đến quá trình phân hủy.

−

q 1

dq dt

KK + cb v mK v

1 mK v

⎛ − ⎜⎜ ⎝ ⎡ KKmKK ⎢ ⎣

⎤ ⎥ ⎦

⎧ ⎪ ⎪ ⎨ ⎪ ⎪ ⎩

(2.27)

Trong đó m, Kv đã biết và các tham số Kcb, K1, Ktl, K2, Kph sẽ được xác định

bằng thực nghiệm [34].

2.2.3. Nghiên quá trình tinh chế rutin chất lượng cao

- Nghiên cứu tinh chế rutin bằng phương pháp kết tinh lại: kết tinh lại trong một

dung môi hoặc hỗn hợp dung môi.

- Nghiên cứu tinh chế rutin bằng phương pháp sắc ký cột.

- Nghiên cứu tinh chế rutin bằng sắc ký lỏng điều chế (Pre-HPLC) [76].

2.2.4. Đánh giá chất lượng rutin sản phẩm

- Đánh giá một số chỉ tiêu chính: hàm lượng rutin, hàm lượng quercetin, tro sulfat,...

- Phân tích cấu trúc sản phẩm: dùng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Đo 1H-NMR để nhận biết proton, 13C-NMR để nhận biết cacbon, phổ DEPT để phân

loại CH, CH2, CH3, phổ HMQC để nhận biết các liên kết gần C-H, phổ HMBC để

nhận biết các liên kết xa C-...-H.

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Để đi vào nghiên cứu nụ hòe cũng như quá trình trích ly rutin, một quy trình chung thiết lập cho phần nghiên cứu thực nghiệm

Nụ hoè, bỏ tạp, phân cấp, xay, sấy

10g, xử lý HCl 0,2% (50ml)

Chiết Soxhlet (5g, metanol,

Chiết siêu âm (5g, metanol, n-hexan, clorofoc, 2h,35kHz)

Kiểm tra bằng NaOH

DM pH (V2 ml)

DM chiết (V ml)

Bình chiết (pH, T0, τ, Kv, Ci,… )

Bỏ bã

Dịch chiết

Bỏ bã

Dịch chiết

Bỏ bã

SPME

DM pH (V1 ml)

Lọc lấy dịch chiết

Thu hồi dm (cất CK)

Cắn chiết

Loại bớt DM (cất CK)

Kết tủa rutin (pH, T0 hay cất DM)

Đánh giá rutin (TL, UV, HPLC)

Rutin thô

GC-MS

Tinh chế

được trình bày trên sơ đồ 3.1.

Rutin tinh

3.1.1 3.1.2

3.1.3

Đánh giá rutin

Sơ đồ 3.1: Quy trình nghiên cứu chung

3.1. Đánh giá trữ lượng và chất lượng nụ hòe Việt Nam

3.1.1. Điều tra cơ bản về trữ lượng nụ hòe

Ở Việt Nam có ba vùng trồng hòe chính là Thái Bình, Nghệ An và Tây Nguyên.

Theo số liệu thống kê năm 2002, Thái Bình có diện tích đất trồng hòe > 5.000ha

(chiếm 5,2% diện tích đất nông nghiệp) với sản lượng hoè khô đạt > 4.500tấn/năm

[10]. Ở Nghệ An, hòe là cây xoá đói giảm nghèo trong nhiều năm qua. Kết quả

chuyến khảo sát ngày 8÷10/7/2004 tại Xuân Hùng (Quỳnh Lưu) cho thấy trên

đường Hoàng Mai có tới năm 5 đại lý thu mua nụ hòe (chủ yếu đưa sang Trung

Quốc) với khối lượng khoảng 150-200 tấn/vụ/năm/đại lý [24]. Chương trình trồng

mới 2 triệu cây hòe ở Quỳnh Lưu năm 2005 đã mang lại sản lượng hòe khô ước tính

> 3.333tấn/2triệu cây/năm [24]. Ở Tây Nguyên, xuất phát từ lợi nhuận thực tế của

việc trồng xen hòe vào cà phê (với 600 cây hòe trong > 2ha cà phê có thể thu hoạch

1tấn hoè khô/năm trong khi cà phê vẫn đạt năng suất 5tấn/ha) thì từ năm 2006, mô

hình trồng hòe kết hợp với cà phê (1 hòe, 1 cà phê) đã và đang được phổ biến trên

mảnh đất đỏ bazan này [38].

Cho đến nay chưa có một con số thống kê chính xác sản lượng nụ hòe trên toàn

quốc. Theo [17], năm 1995 nhu cầu thị trường quốc tế cần 2.000-3.000 tấn hòe

nhưng Việt Nam mới chỉ đáp ứng được vài chục tấn hòe/năm. So với thời điểm trên,

khi dược liệu Việt Nam không có lối thoát bị phá bỏ (số hộ trồng cây thuốc vùng

trồng truyền thống từ 70-80% giảm còn 20-25% [10]), cây hòe đã được trồng khôi

phục và phát triển hơn rất nhiều ở hiện tại. Với năng suất hòe khô trung bình

1tấn/ha/năm thì sản lượng hòe khô bình quân trong nước ước tính khoảng

15.000tấn/năm. Trước những năm 2003, hòe khô Việt Nam hầu hết được đưa qua

Trung quốc. Trong một vài năm gần đây, một phần sản lượng đã được sử dụng để

trích ly rutin đã làm tăng giá bán nụ hòe lên 30-50%. Do nhu cầu tiêu thụ thay đổi

nên giá hòe khô không ổn định. Năm 2005, nụ hoè khô có giá 25.000-

30.000đồng/kg, có thời điểm lên tới 40.000đồng/kg [24], có năm lên tới 60.000-

70.000đồng/kg [49] và giá tại thời điểm giữa tháng 7/2010 là 120.000-180.000

đồng/kg. Nhờ sự quan tâm và phát triển cây hòe kịp thời của người nông dân cũng

như nhà nước hiện tại, trong tương lai gần nụ hòe khô hoàn toàn có thể trở thành

một mặt hàng nông sản xuất khẩu thiết yếu như gạo hiện nay. Tuy nhiên hướng tăng

cường phát triển sản xuất rutin chất lượng cao và ứng dụng rutin để bào chế các chế

phẩm dược mới là lối thoát thực sự cho cây hòe Việt Nam.

3.1.2. Đánh giá một số thông số chính của hệ mẫu nghiên cứu

3.1.2.1. Xác định tạp chất, độ ẩm và nụ không đạt quy cách

* Xác định tạp chất và nụ không đạt quy cách [8]: tạp chất bao gồm bụi đất, cành,

bộ phận khác của cây,…; nụ không đạt quy cách gồm nụ sắp nở và hoa. Cân 10g

nụ hoè dàn mỏng trên tờ giấy, chọn tách riêng và cân phần tạp chất, hạt không đạt

100

m i 10

i=1,2 (3.1) quy cách mi rồi tính tỷ lệ:

100.

* Xác định độ ẩm [8]: Lấy 5g nụ hòe xay2 vào chén sứ (có nút mài và đã sấy khô đến KL không đổi ở 100–1050C). Sấy mẫu trong điều kiện chân không ở 100– 1050C trong 4h, để mẫu nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Lặp lại quá trình sấy đến

1m − 5

(3.2) khối lượng không đổi thì dừng, xác định m1 rồi tính:

Kết quả đánh giá tạp chất (X1), độ ẩm (A) và các loại nụ không đạt quy cách (nụ

sắp nở và hoa) (X2) trong 12 mẫu nụ hòe được trình bày trong bảng 3.1.

Kết quả cho thấy độ ẩm, hàm lượng tạp chất, nụ sắp nở và hoa của các mẫu thu

thập ngẫu nhiên này không giống nhau. Hòe Nghệ An có hàm lượng tạp chất thấp

nhất (< 2%). Hòe Thái Bình có hàm lượng các tạp chất cao nhất (2,90%), độ ẩm

trong mẫu cũng chưa đạt tiêu chuẩn dược điển (< 12%). Để loại bớt các sai số đến

kết quả nghiên cứu thì:

- Tạp chất, nụ sắp nở và hoa được loại khỏi các mẫu;

- Các kết quả được tính toán theo khối lượng khô (KLK);

- Xác định phân bố chung các nụ (theo kích thước) trong 10g nụ ngẫu nhiên (trình

bày trong bảng 3.2) sau đó đưa các mẫu nghiên cứu về phân bố này.

Bảng 3.1: Thành phần tạp và độ ẩm trong các mẫu hòe

TT Mẫu X1 (%) X2 (%) A (%)

1 ĐL-KB 2,12 4,20 9,95

2 ĐL-EK 2,43 5,90 9,93

1,83 5,00 9,66

3 NA 4 NA* 1,72 5,08 9,56

5 TN 2,05 4,20 10,35

6 TB 2,90 5,10 12,34

7 3,53 4,98 13,98 TB2,5

8 5,32 5,13 17,12 TB3,5

9 HB 2,29 6,10 13,59

10 HY 2,25 4,00 9,16

11 MC 2,07 5,20 11,61

*: dạng sao

12 HN 2,37 5,50 6,20

Bảng 3.2: Phân bố dạng nụ trong mỗi mẫu nghiên cứu

Dạng nụ Nụ tấm (< 1mm) Nụ nhỡ (1mm) Nụ TB (1,5mm) Nụ to (>2mm)

Khối lượng (g) 0,06 8,273 0,536 1,131

Tỷ lệ (%) 0,6 82,73 5,36 11,31

3.1.2.2. Xác định phân bố của tập hợp hạt hoè sau xay, nghiền

Cân 10g mỗi mẫu nụ hòe TB, chia nhỏ bằng các phương pháp nghiền, xay. Mẫu

nụ hòe được nghiền trên máy nghiền thô được gọi là mẫu nghiền, mẫu nụ được xay trên máy xay 1 lần gọi là hòe xay1, mẫu nụ sau khi xay lần 1 được xay lại trên máy thêm 1 lần nữa gọi là hòe xay2. Đưa mỗi mẫu nghiền, xay1,2 này vào một ống hình

trụ tròn, rung lắc nhiều lần, xác định chiều cao và bán kính của khối hạt. Mỗi mẫu

hạt được phân cấp (dùng máy sàng rung RX-812, W.S.Tyler, Mỹ) qua các sàng có

100

kích thước 0,08; 0,1; 0,15; 0,3; 1mm để xác định các mi [8]. Tỷ lệ vụn nát của bột

% =σ i

m i 10

nụ được tính theo công thức: (3.3)

Xác định được khối lượng riêng của hạt hòe xay1,2 (hoặc nghiền) rất cần thiết cho

quá trình trích ly do đó thể tích khối của 10g hạt hòe xay khô (hoặc nghiền) cũng

được xác định. Kết quả sự phân bố kích thước bột liệu của mỗi loại hạt hòe nghiền, xay1, xay2 và thể tích khối của chúng được trình bày trên bảng 3.3.

Bảng 3.3: Phân bố kích thước trong mỗi tập hợp hạt hoè xay1,2 (nghiền)

0,08- 0,1- 0,15- h.10-3 r.10-3 Tập hợp di.10-3 0,3-1 >1 <0,08 0,1 0,15 0,3 (m) (m) (m) Vkh (m3) hạt

0,023 1,246 2,462 4,144 2,075 0,050 mi (g) Nghiền 24 14 14,771 0,23 12,46 24,62 41,44 20,75 0,5 σi (%)

0 0,059 0,270 0,799 4,799 4,074 mi (g) Xay1 41 14 25,233 0 0,59 2,70 7,99 47,99 40,74 σi (%)

1 và 2 chỉ cấp độ xay nhỏ nụ hòe

0 1,011 1,148 2,103 5,362 0,376 mi (g) Xay2 27 14 16,617 0 10,11 11,48 21,03 53,62 3,76 σi (%)

Theo kết quả đánh giá được thì kích thước hạt của tập hợp hạt nghiền < tập hợp hạt xay2 < tập hợp hạt xay1. Sự khác nhau về phân bố kích thước ở các tập hợp hạt

này rất lớn, ảnh hưởng của sự khác biệt này sẽ được tính toán đến trong trích ly.

Trong thể tích của khối hạt tìm được trên bảng 3.3 bao gồm cả thể tích rỗng giữa

các hạt vật liệu, nếu tính khối lượng riêng hạt khô trên số liệu này sẽ có sai số lớn.

Bên cạnh đó, trong quá trình trích ly rutin thì nguyên liệu được ngâm trong dung

môi nên khối lượng riêng sử dụng để tính toán các quá trình trích ly phải là khối

lượng riêng hạt nguyên liệu ướt.

3.1.2.3. Xác định khối lượng riêng của hạt hòe xay1,2 (nghiền) ướt

Lấy V0 (ml) dung môi vào ống trụ tròn chia vạch, cho vào m0 (g) hạt hòe xay2. Để các hạt hòe xay1 ngấm no dung môi, xác định thể tích tăng thêm V1(ml). Lọc hút

chân không mẫu để thu hồi V2 (ml) dung môi. Cân phần hạt ướt sau lọc được m1

g .(

1 ) =−

m 1 V

−

V 1

(3.4)

(g). Khối lượng riêng hạt hòe xay2 ướt là: Lặp lại thí nghiệm với mẫu hạt hòe nghiền và xay1, kết quả của các thí nghiệm

trình bày trên bảng 3.4.

Bảng 3.4: Khối lượng riêng của hạt hòe xay1,2 (nghiền) ướt

Các giá trị m0 m1 V0(ml) V1(ml) V2(ml) ρ (g/ml) ρh (kg/m3)

Hạt nghiền 10,0073 16,863 59 7,5 50,5 1,142

1141 10,0047 19,083 60 7,5 51,0 1,157

Hạt xay1 Hạt xay2 10,0064 18,279 60 7,5 52,5 1,124

Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy khối lượng riêng trung bình của hạt hòe xay1, 2

(nghiền) ướt xác định được là 1141 kg/m3.

3.1.3. Nghiên cứu thành phần hóa học nụ hòe Việt Nam

Theo một số công bố, 14 flavonoit và nhiều thành phần khác trong nụ hòe đã

được phát hiện và phân lập (mục 1.1.1.1). Trong luận án này, nghiên cứu thành

phần hóa học nụ hòe vẫn được tiến hành nhằm mục đích tìm kiếm các hợp chất mới

chưa được đề cập đến trong phân đoạn dễ bay hơi của nụ hòe và tìm kiếm các thông

tin tác động đến quá trình trích ly cũng như tinh chế rutin. Quá trình nghiên cứu

được tiến hành theo phần 3.1.1 - sơ đồ 3.1. Hệ thống GC-MS 2010 (cột DB-5MS

30m x 0,25mm, 0,5μm) được dùng để định tính một số thành phần dễ bay hơi trong

dịch chiết. Điều kiện hoạt động của thiết bị là: nhiệt độ injector, nguồn ion và interface lần lượt là 2500C, 2000C và 2800C; tỷ lệ chia dòng 3:1; tốc độ scan 1666

(0,5giây) bắt các mảnh phổ trong khoảng 40 đến 800m/z.

3.1.3.1. Định tính một số nhóm chất trong nụ hoè khô

Lấy ba mẫu (5g) hòe xay2 TB vào ba bình tam giác, thêm vào mỗi mẫu 40ml một

loại dung môi (clorofoc, metanol, n-hexan). Chiết siêu âm trên máy LC 60H trong

2h. Dịch chiết được cất quay chân không, làm sạch trên cột SPME (silicagel,

florisil). Lấy 1µl dịch chiết đã làm sạch pha trong 250µl metanol (đối với dịch chiết

metanol và clorofoc) hoặc n-hexan (đối với dịch chiết n-hexan) rồi phân tích trên

máy GC-MS 2010. Chương trình nhiệt độ được cài đặt cho máy để phân tích dịch chiết n-hexan là: 500C (5phút), tăng 100C/phút tới 2400C (3phút), tăng 100C/phút tới 2800C (5phút); Chương trình nhiệt độ phân tích dịch chiết metanol và clorofoc

là: 500C (1phút), tăng 150C/phút tới 650C (3phút), tăng 100C/phút tới 2100C (6phút), tăng 150C/phút tới 2800C (10phút). Thực nghiệm được tiến hành lặp lại

trên nhiều mẫu, số lượng cấu tử phát hiện nhiều nhưng chưa đánh giá được hiệu

suất trích ly của từng cấu tử. Ở quá trình làm sạch cũng chưa đánh giá được hiệu

suất thu hồi của từng cấu tử nên việc định lượng thành phần dịch chiết không thực

hiện được. Kết quả định tính các mẫu dịch chiết được trình bày trong bảng 3.5÷3.7.

Kết quả cho thấy 81 hợp chất dễ bay hơi đã được phát hiện với 4 cấu tử được tìm

thấy trong cả hai dịch chiết là 1-dodecanol; hexadecanoic axit, metyl este; hexanal;

propanoic axit, 2-metyl-, metyl este. Trong dịch chiết bằng metanol đã phát hiện

được 33 cấu tử với 8 flavonoit. Trong 8 flavonoit phát hiện được thì 4 flavonoit là

isorhamnetin; quercetin; 3',7-di-O-metylquercetin và retusin đã được công bố. Một

số hợp chất có giá trị khác còn tìm thấy trong phần chiết này như: lincomycin (một

loại kháng sinh thuộc nhóm lincosamit tác dụng với hầu hết các vi khuẩn gram

dương có thể trị các nhiễm khuẩn đường hô hấp da, mô mềm); 5,6,7,7a-tetrahydro-

4,4,7a-trimetyl-2(4H)-benzofuranon (chất tăng cường mùi trong thực phẩm);

morphinan (là cấu trúc cơ bản thuộc nhóm thuốc an thần); levoglucosan (dễ dàng

thủy phân thành gluco với axit trong nhiều tổ chức vi hữu cơ); maltol (dùng tạo

hương vị); inositol (chất quan trọng của màng tế bào liên quan đến nhiều quá trình

như chỉ đạo hệ thần kinh, kiểm soát nồng độ canxi, làm tan chất béo); melamin (có

trong mô thực vật từ cyromazin). Trong dịch chiết clorofoc tìm thấy 21 cấu tử trong

đó có 2 cấu tử đã được phát hiện từ dịch chiết metanol và gần một nửa số cấu tử tìm

thấy là các terpen trong đó có một số monoterpen và monoterpenoit giá trị như β-

myrcen, l-limonen, dl- menthon và 1,8-cineol. Trong dịch chiết n-hexan đã phát

hiện được 23 cấu tử trong đó có 2 cấu tử đã được phát hiện từ dịch chiết metanol và

10 aldehyt. Đã tìm thấy cấu tử tegafur, đó là một cấu tử của tegafur-uracil khi

chuyển hóa trở thành 5-FU dùng trong xử lý nhiều căn bệnh ung thư trong phần

chiết này. Các thành phần phát hiện từ ba dịch chiết nụ hòe TB trên phần nào giải

thích nguồn gốc dược học (mát huyết, giải độc, an thần, tăng cường thành mạch,...)

của nụ hòe trong các bài thuốc đông y.

Bảng 3.5: Các cấu tử định tính được trong phần chiết clorofoc

Thành phần dịch chiết clorofoc

1 4-oxo-pentanoic axit [levulinic axit] 12 (-)-β-pinen

2 phenyletyl alcohol 13 β-myrcen

14 p-cymen 3

4 5 glyxin, N-axetyl-N-(trifluoroaxetyl)-, metyl este 2-metyl-6-nitropyridin pyrrolidin 15 l-limonen 16 1,8-cineol

6 5,5-dimetyl-2,4-oxazolidindion 17 γ-terpinen

7 propanoic axit, 2-metyl-, metyl este 18 dl-menthon

8 butanoic axit, metyl este 19 l-menthol

9 butanoic axit, etyl este 20 anethol

10 hexadecanoic axit, metyl este 21 8-heptadecen

11 α-pinen

Bảng 3.6: Các cấu tử định tính được trong phần chiết n-hexan

Thành phần dịch chiết n-hexan

1 2-metyl-2-propyl-1,3-propandiol 13 1-heptanal

2 2-etyl-1,3-hexandiol 14 2-heptanal

3 6-bromhexyl trimetylsilyl ete 15 1-octanal

4 16 2-octenal

17 1-nonanal 5 6-clohexyl trimetylsilyl ete 5-flo-1-(tetrahydro-2-furanyl)- 2,4(1H,3H)- pyrimidindion [tegafur]

6 1-piperidinpropannitril 18 decanal

7 3-penten-2-on, semicarbazon 19 tran-2-decenal

8 2,5-dihydro-1H-pyrrol 20 1-undecanal

9 4-amino-2,2,6,6-tetrametyl-1-piperidinyloxy 21 2-undecenal

10 2-pentylfuran 22 1-heptadecen

11 1-dodecanol 23 γ-stearolacton

12 hexanal

Bảng 3.7: Các cấu tử định tính được trong phần chiết metanol

Thành phần dịch chiết metanol

1 hexanal 22

2 quercetin 23

3 butanoic axit 24

4 L-glutamic axit 25

5 hexadecanoic axit 26

6 octadecadienoic axit 27 trietylen glycol diaxetat 2,5-dimetyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon [furaneol] 3’- metoxy 3,4’,5,7- tetrahydroxy flavon [isorhamnetin]* 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-metyl-4-H- pyran-4-on 5,6,7,7-tetrahydro-4,4,7a-trimetyl-2(4H)- benzofuranon phenol, 2-metoxy-4-(1-propenyl)-, axetat [isoeugenol axetat]

7 vanillic axit 28 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavanon

8 2-butanol 29 3’,7- dimetoxy-3,4’,5-trihydroxyflavon

9 xantosin 30 3,3’-dimetoxy-4’,5,7-trihydroxyflavon

10 1-butanol 31 3’,4’,7-trimetoxy-3,5-dihydroxyflavon

11 32 linolenic axit metyl este

12 1-dodecanol inositol 13 14 phytol 3,7- dimetoxy -3’,4’,5-trihydroxy flavon [3',7-Di-O-metylquercetin] 33 9,12-octadecadienoic axit (Z,Z)- 34 hexadecanoic axit, metyl este 35 8,11-octadecadienoic axit, metyl este

15 maltol 36

16 3-allylguaiacol 37 3,3’,4’,7-tetrametoxy-5-hydroxyflavon [retusin] 9,12-octadecadienoic axit (Z,Z)-, metyl este

17 heneicosan 38 propanoic axit, 2-metyl-, metyl este

18 nonan 39 benzoic axit, 3,5-dihydroxy-, metyl este

19 40 5- hydroxymetylfurfural

20 morphinan 41 1,3,5-triazin-2,4,6-triamin [melamin] 1,6-anhydro-β-D-glucopyranose [levoglucosan]

*: tên được in nghiêng trong [] là tên thường gọi khác của hợp chất

21 lincomycin

Bảng 3.8: Các nhóm chất đã phát hiện trong nụ hòe khô

STT Nhóm

1 Axit

2 Este

3 Ete Tên chất butanoic axit; L-glutamic axit; hexadecanoic axit; octadecadienoic axit; vanillic axit; 9,12-octadecadienoic axit (Z,Z)-; levulinic axit; hexadecanoic axit, metyl este; 8,11-octadecadienoic axit, metyl este; linolenic axit metyl este; 9,12-octadecadienoic axit (Z,Z)-, metyl este; propanoic axit, 2-metyl-, metyl este; benzoic axit, 3,5- dihydroxy-, metyl este; butanoic axit, etyl este; butanoic axit, metyl este; glycin, N-axetyl-N-(trifluoroaxetyl)-, metyl este; 6-bromhexyl trimetylsilyl ete; 6-clohexyl trimetylsilyl ete;

4 Flavonoit

quercetin; 3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavanon; 3’- metoxy 3,4’,5,7- tetrahydroxy flavon; 3,7- dimetoxy -3’,4’,5-trihydroxy flavon; 3’,7- 3,3’-dimetoxy-4’,5,7- dimetoxy-3,4’,5-trihydroxyflavon; trihydroxyflavon; 3’,4’,7-trimetoxy-3,5-dihydroxyflavon; 3,3’,4’,7- tetrametoxy-5-hydroxyflavon;

5 6 Alkan Anken

7 Alcol

8 Aldehyt

9 Đường

10 Terpen

11 Amin

5-flo-1-(tetrahydro-2-furanyl)-

12 Khác

2-metoxy-4-(1-propenyl)-, phenol,

nonan; heneicosan; 8-heptadecen; 1-heptadecen; 1-butanol; 2-butanol; 1-dodecanol; inositol; 2-metyl-2-propyl-1,3- propandiol; 2-etyl-1,3-hexandiol; phenyletyl alcohol hexanal; 2-undecenal; 1-undecanal; trans-2-decenal; decanal; 1- nonanal; 2-octenal; 1-octanal; 2-heptanal; 1-heptanal; 5- hydroxymetylfurfural; 1,6-anhydro-β-D-glucopyrano; maltol; γ-stearolacton α-pinen; (-)-β-pinen; β-myrcen; p-cymen; l-limonen; 1,8-cineol; γ- terpinen; dl-menthon; l-menthol; anethol; phytol; 3-allylguaiacol; 1,3,5-triazin-2,4,6-triamin; 3-penten-2-on, 1-piperidinpropannitril; 2-pentylfuran; semicarbazon; 2,5-dihydro-1H-pyrrol; 4-amino-2,2,6,6-tetrametyl- 1-piperidinyloxy; 2,4(1H,3H)- pyrimidindion; 5,5-dimetyl-2,4-oxazolidindion; pyrrolidin; 2-metyl- 6-nitropyridin; morphinan; xantosin; 2,5-dimetyl-4-hydroxy-3(2H)- furanon; trietylen glycol diaxetat; 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6- 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimetyl-2(4H)- metyl-4-H-pyran-4-on; benzofuranon; axetat; lincomycin;

Các thành phần này được tổng kết chia thành các nhóm chất trên bảng 3.8. Kết

quả cho thấy:

- Trong dịch chiết có mặt một số chất cơ bản cấu tạo nên tế bào thực vật cũng được

sinh ra như quá trình trao đổi chất sinh hóa như: phenyletyl alcohol; phytol;

xanthosin (một nucleotit). Tuy nhiên cũng rất khó giải thích về sự tồn tại của một số

hợp chất như: glycin, N-axetyl-N-(trifloaxetyl)-,metyl este; 2-metyl-6- nitropyridin;

5,5-dimetyl-2,4-oxazolidindion; 4-amino-2,2,6,6-tetrametyl-1-piperidinyloxy; 2,5-

dihydro-1H-pyrrol; 1-piperidinpropannitril; 6-clohexyl trimetylsilyl ete; 6-

bromhexyl trimetylsilyl ete; 2-etyl-1,3-hexandiol; 2-metyl-2-propyl-1,3-propandiol

đã được phát hiện trong nghiên cứu này. Để giải thích sự có mặt này, chỉ có thể giả

định rằng chúng tồn tại trong thực vật theo lẽ tự nhiên hoặc là kết quả của một số

quá trình thoái biến trong thực vật hoặc do tác động của các quá trình khác như quá

trình phơi khô, nghiền, chiết, làm sạch trên cột, ..

- Do có phân tử lượng lớn và có phần đường dễ bị phân hủy thành quercetin nên

rutin không phát hiện được bằng phương pháp GC-MS. Trong ba loại dịch chiết,

phần chiết bằng metanol phát hiện được nhiều cấu tử nhất, đặc biệt là các flavonoit.

Nếu sử dụng metanol làm dung môi trích ly thì ngoài rutin, trong pha trích sẽ có

mặt các flavonoit và nhiều cấu tử không mong muốn khác.

- Trong các thành phần phát hiện được, một số cấu tử trong các nhóm chất

flavonoit, đường, axit, este đã được công bố trong các nghiên cứu thành phần hóa

học nụ hòe. Tuy nhiên nhiều cấu tử phát hiện thấy trong nghiên cứu này chưa được

công bố trong tài liệu nào, đặc biệt là các terpen. Để có những thông tin rõ hơn về

các thành phần này, thực nghiệm tiếp sẽ đề cập việc tách chiết các terpen trong nụ

hoa hòe và định tên các hợp chất đó.

3.1.3.2. Xác định thành phần tinh dầu nụ và hoa hoè

Lấy 2kg mỗi mẫu nụ và hoa hòe tươi (HY, HB), xay giập rồi đưa vào bình cất.

Thêm vào 3,5l nước rồi cất cuốn hơi nước trong thiết bị kiểu Clevenger liên tục trong 8h. Các mẫu tinh dầu thu được có màu trắng trong. Tính hiệu suất ở 250C,

hàm lượng tinh dầu trong mẫu hoa và nụ của hòe HB và HY được tìm thấy là tương

đương nhau, xấp xỉ 0,01% (hoa) và 0,02% (nụ) (KLK).

Tinh dầu nụ hoa hòe được loại nước bằng Na2SO4 khan, bảo quản trong lọ tối

màu và giữ trong tủ lạnh. Lấy 1μl mỗi mẫu tinh dầu pha trong 1,5ml n-hexan sau đó

lấy 0,5μl dung dịch pha loãng tiêm vào máy GC-MS 2010. Chương trình nhiệt độ lò cột được cài đặt là: 700C (2 phút), tăng 70C/phút (15 phút) tới 2300C. Thành phần

của tinh dầu nụ và hoa phát hiện được bằng GC-MS trình bày trong bảng 3.9.

Bảng 3.9: Thành phần tinh dầu nụ và hoa hòe

Thành phầnc (%) Độ Nụ Hoa tương RIa Các cấu tửb STT RT Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 tự (HY) (HB) (HY) (HB)

1,40 - 2,08 1,39 96 1. 2,07 688 2-pentanon

- - 0,17 0,30 97 2. 2,24 - metyl butyrat

0,66 0,27 - - 96 3. 2,72 - 3-hexanon

0,98 0,36 - - 97 4. 2,76 - 2-hexanon

0,39 0,14 - - 96 5. 2,85 797 3-hexanol

0,46 0,23 - - 97 6. 2,88 873 2-hexanol

0,08 1,00 1,09 - 96 7. 6,72 1030 l-limonen

0,50 0,19 0,35 - 97 8. 8,29 1104 nonanal

0,25 0,45 - - 95 9. 14,23 1379 α-copaen

0,23 0,41 - - 96 10. 14,48 1393 β-elemen

1438 caryophyllen 26,84 9,08 25,17 44,61 98 11. 15,16

5,77 2,37 6,05 10,96 98 12. 15,86 1455 α – humulen

0,23 0,36 - - 96 13. 16,47 1500 pentadecan

0,13 0,26 - - 94 14. 16,98 1520 δ-cadinen

0,33 - - - 93 15. 17,60 1539 nerolidol

1573 (-)-caryophyllen oxit 1,47 5,89 9,96 17,45 96 16. 18,25

Thành phầnc (%) Độ Nụ Hoa tương RIa Các cấu tửb STT RT Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 tự (HY) (HB) (HY) (HB)

1602 humulen epoxit II 17. 18,75 95 1,28 1,59 2,90 -

1615 tetradecanal 18. 19,71 93 0,45 0,59 0,44 -

1672 8-heptadecen 10,62 6,39 4,81 7,05 19. 20,35 96

1752 phenanthren - 0,23 0,38 20. 21,77 93 -

1843 farnesyl axetat - 0,20 0,32 21. 22,21 98 -

1845 hexahydrofarnesyl axeton 0,33 0,97 0,32 0,38 22. 22,35 97

1901 palmitic axit, metyl este 1,16 0,46 23. 23,63 95 - 0,50

24. 24,01 94 1944 isophytol 0,3 0,25 - -

25. 24,77 96 2000 eicosan - - 0,19 0,13

26. 26,55 97 2128 phytol 5,99 15,37 10,81 5,72

27. 28,19 96 2200 docosan 1,32 2,71 0,70 1,67

28. 30,54 97 2301 tricosan 6,25 17,83 10,01 0,63

29. 37,70 96 2598 hexacosan - 19,57 6,20 -

Các hydrocacbon monoterpen 0 0,08 1,00 1,09

Các hydrocarbon sesquiterpen 32,61 11,45 31,83 56,69

Các oxysesquiterpen 1,80 8,47 12,07 21,05

Các oxy diterpen 6,29 15,62 10,81 5,72

Các chất không phải terpen 23,24 48,91 25,40 13,20

Các chất không phát hiện 36,06 15,47 18,89 2,25

aRI (retention index): đo liên quan đến n-alkan trên cột DB-5, được tham khảo trong các tài liệu; b: các hợp chất được liệt kê theo thứ tự tách rửa trên cột DB-5; c: Thành phần % dựa trên phần trăm diện tích peak; -:

Hợp chất không phát hiện.

Tổng % các chất phát hiện 63,94 84,53 81,11 97,75

Từ bảng 3.9 cho thấy: có một số peak tách được nhưng không phát hiện được,

tuy nhiên số cấu tử tìm thấy trong tinh dầu nụ hòe HY và HB là 15 và 20 cấu tử

tương ứng với 63,94% và 84,53% dầu. Trong tinh dầu hoa, số cấu tử phát hiện được

là 22 tương ứng với 81,11% và 97,75% dầu. Nhìn chung tinh dầu nụ hoa hòe có ít

monoterpen. Theo số liệu mẫu 2 và 4 thì thành phần các terpen bao gồm:

monoterpen (0,08%; 1,09%), sesquiterpen (11,45%; 56,69%), sesquiterpen oxy hóa

(8,47%; 21,05%) và diterpen oxy hóa (15,62%; 5,72%). Trong các sesquiterpen tìm

thấy (α-copaen, β-elemen, caryophyllen, α-humulen, δ-cadinen,…) thì caryophyllen

và α-humulen chiếm hàm lượng lớn. Những cấu tử chính của dầu nụ và dầu hoa tìm

thấy theo thứ tự mẫu 1-4 là caryophyllen (26,84%; 9,08%; 25,17%; 44,61%), α-

humulen (5,77%; 2,37%; 6,05%; 10;96%), (-)-caryophyllen oxit (1,47%; 5,89%;

9,96%; 17,45%), 8-heptadecen (10,62%; 6,39%; 4,81%; 7,05%), phytol (5,99%;

15,37%; 10,81%; 5,72%) và hexacosan (19,57%; 6,20%). Các n-alkan tìm thấy chủ

yếu là alkan mạch dài như eicosan, docosan, tricosan và hexacosan. Kết quả cũng

đã chỉ ra sự khác biệt giữa tinh dầu hoa và nụ không chỉ ở lượng và chất. Một số

cấu tử tìm thấy trong tinh dầu hoa nhưng không thấy trong dầu nụ là α-copaen, β-

elemen, δ-cadinen, phenanthren, farnesyl axetat, eicosan, pentadecan. Ngược lại,

một số cấu tử tìm thấy trong dầu nụ nhưng không phát hiện trong dầu hoa là 3-

hexanon, 2-hexanon, 3-hexanol, 2-hexanol, nerolidol và isophytol. So với bảng 3.5,

ba cấu tử không phát hiện được trong tinh dầu nụ hoa nhưng được tìm thấy trong

dịch chiết clorofoc là α-pinen, (-)-β-pinen, γ-terpinen. So với kết quả tổng kết các

thành phần phát hiện trong ba dịch chiết (bảng 3.8), các terpen phát hiện được trong

tinh dầu nhưng không phát hiện trong các dịch chiết là iso-phytol;

hexahydrofarnesyl axeton; farnesyl axetat; phenanthren; humulen epoxit II; (-)-

caryophyllen oxit; nerolidol; δ-cadinen; α-humulen; caryophyllen; β-elemen; α-

copaen; l-limonen; 2-hexanon; 3-hexanon; 2-pentanon và metyl butyrat.

Sự thay đổi thành phần tinh dầu nụ, hoa hòe còn thể hiện trên mẫu ở các vùng

trồng khác nhau. Đối với dầu nụ, lượng sesquiterpen của mẫu HY (32,61%) cao hơn

mẫu HB (11,45%) nhưng lượng các monoterpen, sesquiterpen oxy hóa, diterpen

oxy hóa và các thành phần khác không phải là terpen thì ngược lại, thấp hơn mẫu

HB. Đối với dầu hoa, lượng chất không phải là terpen và các chất diterpen oxy hóa

của tinh dầu mẫu HY cao hơn trong mẫu HB; lượng các monoterpen, sesquiterpen

và sesquiterpen oxy hóa của dầu HY lại thấp hơn trong mẫu HB. Các thay đổi trên

phần lớn phụ thuộc vào các điều kiện: thổ nhưỡng, giống loài, chăm sóc, khí hậu,

thời điểm thu hoạch. Tuy nhiên để chứng minh giả thuyết này, các mẫu phải được

thu thập và nghiên cứu sâu hơn nữa.

3.1.4. Đánh giá thành phần rutin trong nụ hòe Việt Nam

Chất lượng của nụ hòe thể hiện qua lượng rutin chứa trong nó do đó thành phần

rutin (tính theo %KLK, w/w) được chọn làm tiêu chí đánh giá chất lượng nụ hòe

thu thập từ 8 địa phương cho mục đích chiết xuất rutin.

3.1.4.1. Định lượng rutin trong nụ hòe ở các vùng trồng chính

Lấy 5g mỗi mẫu hòe xay2 (có phân bố dạng nụ trình bày trên bảng 3.2) vào bình

chiết, thêm vào 250ml metanol. Chiết liên tục (khoảng 8h) trong hệ thống chiết

Soxhlet ở nhiệt độ sôi của dung môi đến khi dịch chiết không màu (định tính rutin

bằng NaOH 0,1M). Cất quay chân không dịch chiết, sấy chân không cắn chiết ở 600C tới khối lượng không đổi. Rutin được định lượng từ các cắn chiết bằng

phương pháp: HPLC, UV-VIS và PP trọng lượng (xem phần 3.1.2- sơ đồ 3.1).

a. Phương pháp trọng lượng

Cắn chiết được hòa tan và kết tinh lại lần lượt trong 50ml mỗi dung môi (nước,

etanol 96%). Lượng chất rắn thu được chuyển vào bình phản ứng, thêm vào 250ml

dung dịch axit H2SO4 2% rồi đun sôi hỗn hợp liên tục trong 3h. Hỗn hợp phản ứng

được để nguội, làm lạnh cho quercetin kết tủa. Lọc rửa kết tủa bằng nước lạnh 4 lần (mỗi lần 25ml); sấy chân không ở 1250C đến khối lượng không đổi, xác định mQ

[8]. Vì 1g quercetin tương ứng với 2,019g rutin khan nên thành phần rutin trong

(%)

100

mẫu thử được tính theo công thức (3.5). Kết quả được trình bày trong bảng 3.10.

m . 019 kh

(3.5)

(%)

Bảng 3.10: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP TL) kh (g) mcắn (g) mQ (g) K1 STT mẫu Tên mẫu STT TN m0

2,404 0,709 31,805 1 4,501

2,475 0,703 31,556 2 4,498 1 ĐL-KB 2,419 0,715 32,040 3 4,506

TB 2,433 0,709 31,80 4,502

2,518 0,721 32,320 1 4,501

2,449 0,675 30,281 2 4,502 2 ĐL-EK 2,528 0,704 31,539 3 4,508

TB 2,498 0,700 31,38 4,504

2,391 0,663 29,510 1 4,537

2,178 0,680 30,540 2 4,493 NA 3 2,269 0,687 30,701 3 4,521

TB 2,279 0,677 30,25 4,517

2,219 0,598 26,903 1 4,491

2,118 0,613 27,292 2 4,533 4 NA* 2,017 0,624 27,734 3 4,542

TB 2,118 0,612 27,31 4,522

2,392 0,757 34,208 1 4,466

4,48 2,377 0,737 33,215 2 5 TN 2,429 0,716 32,115 3 4,502

TB 2,399 0,737 33,18 4,483

2,779 0,813 36,301 1 4,521

2,855 0,759 35,140 2 4,361 6 TB 2,692 0,721 34,100 3 4,267

TB 2,775 0,764 35,18 4,383

2,297 0,658 30,798 1 4,315 7 HB 2,278 0,664 30,981 2 4,328

kh (g) mcắn (g) mQ (g) K1

(%)

STT mẫu Tên mẫu STT TN m0

2,278 0,642 29,992 3 4,321

TB 2,284 0,655 30,59 4,321

1 4,525 2,405 0,706 31,492

2 4,545 2,518 0,721 32,024 8 HY 3 4,556 2,322 0,699 30,985

TB 2,415 0,709 31,50 4,542

1 4,419 2,169 0,656 29,966

2 4,502 2,182 0,664 29,782 9 MC 3 4,335 2,201 0,673 31,362

4,419 TB 2,184 0,665 30,37

1 4,791 2,285 0,760 32,011

2 4,592 2,301 0,674 29,614 10 HN 3 4,688 2,122 0,651 28,046

4,690 TB 2,236 0,694 29,89

b. Phương pháp UV-VIS và HPLC

Hình 3.2: Phổ 3D của dung dịch Hình 3.1: Phổ UV-VIS cắn Soxhlet (ở

rutin chuẩn (HPLC) trên) và phổ rutin chuẩn (0,075mg/ml)

Phổ hấp thụ của cắn chiết Soxhlet nụ hoè TB và dung dịch rutin chuẩn (metanol)

quét trên máy UV-VIS được trình bày trong hình 3.1. Vì thành phần rutin chiếm

chủ yếu trong cắn chiết nên dạng phổ của hai mẫu gần giống nhau. Tuy nhiên phổ

cắn chiết Soxhlet cũng thể hiện mức độ tạp trong mẫu (đường cong không trơn mà

có nhiều cực đại, cực tiểu hấp thụ hơn). Phổ 3D của dung dịch rutin chuẩn trong

metanol quét trên máy HPLC với pha động metanol: 0,02M NaH2PO4 (pH = 3):

tetrahydrofuran = 10:70:20 (v/v)), λ=254nm, tốc độ dòng 1ml/phút trình bày trên

hình 3.2. Hai phổ đều cho thấy rutin hấp thụ cực đại tại 254nm và 362nm nên có thể

định lượng rutin tại một trong hai bước sóng này.

- Phân tích rutin được thử nghiệm trên hai hệ thống HPLC DAD-7000 (cột

RP18) và HPLC SPD-M10A vp (cột C18) theo phương pháp ngoại chuẩn. Các kết

quả đạt được trên hai hệ thống này tương đương nhau.

- Tiến hành khảo sát các mẫu chuẩn trên máy HPLC và UV-VIS PC1650, khoảng

nồng độ tuyến tính của rutin tìm thấy là 0,5-1,5mg/l đo tại λ = 254nm (đối với

HPLC) và 0,025-0,1mg/ml đo tại λ = 362,5nm (đối với UV-VIS), do đó đường

chuẩn mỗi phương pháp được xây dựng trong khoảng nồng độ trên [8, 44, 56].

- Dựng đường chuẩn: Cân 25mg rutin chuẩn (99,0%, Dr. Ehrentorfer GmbH, Đức)

vào bình định mức 50ml, thêm metanol đến vạch, lắc cho tan hết rutin được ddG

(0,495mg/ml).

Bảng 3.11: Độ hấp thụ của dung

dịch rutin chuẩn

362,5

(190-

(nm)

400nm)

Amax Ach Cpha TT (mg/ml)

1 0,0247 0,661 1,465

2 0,0495 1,319 2,817

3 0,0743 1,964 3,86

Hình 3.3: Đường chuẩn rutin trên máy UV-VIS 4 0,0990 2,635 3,978

Lấy chính xác 0,5ml; 1,0ml; 1,5ml và 2ml ddG vào bốn bình định mức 10ml,

định mức bằng metanol đến vạch được các ddG1 (0,0247; 0,0495; 0,0743; 0,0990

mg/ml). Phân tích các ddG1 trên máy UV-VIS ở bước sóng 362,5nm, số liệu và

đường chuẩn dựng được trình bày trên bảng 3.11 và hình 3.3.

Lấy chính xác 10µl, 20µl; 30µl ddG vào ba bình định mức 10ml, thêm metanol

tới vạch và lắc đều, để ổn định được các ddG2 (0,495; 0,990; 1,485mg/l). Phân tích

các ddG2 trên máy HPLC với cột C18, detector UV ở λ = 254nm, nhiệt độ lò cột 400C, pha động metanol:0,02M NaH2PO4 (pH=3,0):tetrahydrofuran=10:70:20(v/v),

tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích bơm mẫu 15μl [55, 58]. Số liệu và đường chuẩn

dựng được trình bày trên hình 3.4.

Hình 3.4: Đường chuẩn và số liệu đường chuẩn rutin phân tích trên HPLC

- Chuẩn bị mẫu thực: cân 10mg cắn chiết vào bình định mức 10ml, định mức bằng

metanol đến vạch, lắc cho tan (gọi là ddA). Lấy chính xác 1ml ddA pha loãng trong

10ml metanol (dùng bình định mức 10ml), lắc đều, để ổn định được ddA1 (Cpha =

0,1mg/ml). Lấy chính xác 1µl ddA vào bình định mức 10ml, định mức metanol tới

vạch, lắc đều và để ổn định được ddA2 ( Cpha = 1mg/l). Phân tích các mẫu ddA1 trên

máy UV-VIS ở λ = 362,5nm; các ddA2 được lọc qua màng lọc 0,45µm rồi phân tích

trên máy HPLC ở λ = 254nm, nồng độ của rutin trong mỗi mẫu thực sẽ được xác

định trên máy (Ctính).

100

K = 1

Thành phần rutin (KLK) trong nụ hòe được tính theo công thức (3.6):

. Cm can . mC pha

tính kh 0

(3.6)

Kết quả định lượng thành phần rutin trong cắn chiết nụ hòe bằng phương pháp

UV-VIS và HPLC được trình bày trên bảng 3.12 và bảng 3.13.

Bảng 3.12: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP UV-VIS)

362,5

kh (g)

(nm)

Ath STT Tên STT mcắn Ctính K1 m0 (mg/ml) (g) (%) mẫu mẫu TN

1 4,512 1,941 2,041 0,0776 33,376

2 4,502 1,912 2,014 0,0766 32,514 1 ĐL-KB 3 4,492 1,911 2,020 0,0768 32,667

TB 4,502 1,921 2,025 0,0770 32,85

1 4,511 2,266 1,815 0,0690 34,657

2 4,501 2,243 1,735 0,0660 32,866 2 ĐL-EK 3 4,501 2,241 1,658 0,0630 31,380

TB 4,504 2,250 1,736 0,0660 32,97

1 4,513 2,261 1,657 0,0630 31,557

2 4,518 2,264 1,652 0,0628 31,468 3 NA 3 4,521 2,328 1,661 0,0631 32,512

TB 4,517 2,284 1,657 0,0630 31,85

1 4,524 1,922 1,795 0,0682 28,989

2 4,516 1,903 1,776 0,0675 28,448 4 NA* 3 4,526 1,923 1,795 0,0682 28,991

TB 4,522 1,916 1,789 0,0680 28,81

1 4,476 2,129 1,921 0,0730 34,733

2 4,551 2,224 1,951 0,0742 36,242 5 TN 3 4,421 2,101 1,889 0,0718 34,125

TB 4,483 2,151 1,920 0,0730 35,03

1 4,375 2,432 1,691 0,0643 35,732

2 4,461 2,512 1,722 0,0655 36,860 6 TB 3 4,312 2,355 1,636 0,0622 33,965

TB 4,383 2,433 1,683 0,0640 35,52

362,5

kh (g)

(nm)

Ath STT Tên STT mcắn Ctính K1 m0 (mg/ml) (g) (%) mẫu mẫu TN

4,331 2,260 1,605 0,0610 31,837 1

4,310 2,240 1,597 0,0607 31,551 2 7 HB 4,321 2,230 1,603 0,0609 31,447 3

TB 4,321 2,243 1,602 0,0609 31,61

4,531 2,051 1,838 0,0699 31,626 1

4,535 2,062 1,841 0,0700 31,820 2 8 HY 4,561 2,101 1,845 0,0701 32,307 3

TB 4,542 2,071 1,841 0,0700 31,92

4,425 2,389 1,536 0,0584 31,523 1

4,413 2,327 1,512 0,0575 30,307 2 9 MC 4,420 2,384 1,531 0,0582 31,390 3

TB 4,419 2,367 1,526 0,0580 31,07

4,785 1,755 2,140 0,0813 29,836 1

4,592 1,720 2,121 0,0806 30,199 2 10 HN 4,694 1,725 2,130 0,0810 29,755 3

TB 4,690 1,733 2,130 0,0810 29,93

Bảng 3.13: Thành phần rutin trong nụ hòe một số vùng (PP HPLC)

kh (g)

STT STT mcắn Ctính K1 Tên mẫu m0 Speak mẫu TN (mg/l) (g) (%)

4,512 2,254 2239031 0,663 33,132 1

4,502 2,249 2230261 0,661 33,004 2 1 ĐL-KB 4,492 2,259 2230222 0,661 33,224 3

TB 4,502 2,254 2233171 0,662 33,12

4,511 2,295 2158823 0,640 32,547 1

4,501 2,288 2155286 0,639 32,467 2 2 ĐL-EK 4,501 2,293 2154261 0,638 32,524 3

TB 4,504 2,292 2156123 0,639 32,51

kh (g)

STT STT mcắn Ctính K1 Tên mẫu m0 Speak (mg/l) TN mẫu (g) (%)

1 4,513 2,210 2034311 0,603 29,541

2 4,517 2,240 2034290 0,603 29,915 3 NA 3 4,520 2,302 2033917 0,603 30,717

TB 4,517 2,251 2034173 0,603 30,06

1 4,524 2,222 1927932 0,572 28,099

2 4,515 2,304 1926941 0,572 29,179 4 NA* 3 4,526 2,212 1928922 0,572 27,974

TB 4,522 2,246 1927932 0,572 28,42

1 4,476 1,812 2790563 0,825 33,390

2 4,551 1,901 2791842 0,825 34,468 5 TN 3 4,421 1,811 2789354 0,824 33,772

TB 4,483 1,841 2790586 0,825 33,88

1 4,375 2,201 2349261 0,696 34,991

2 4,461 2,193 2349123 0,695 34,189 6 TB 3 4,312 2,204 2349106 0,695 35,548

TB 4,383 2,199 2349163 0,695 34,90

1 4,331 1,971 2292110 0,679 30,891

2 4,310 1,962 2289888 0,678 30,870 7 HB 3 4,321 1,982 2291373 0,679 31,125

TB 4,321 1,972 2291124 0,678 30,96

1 4,531 1,875 2603503 0,770 31,864

2 4,535 1,842 2610032 0,772 31,353 8 HY 3 4,561 1,861 2603602 0,770 31,419

TB 4,542 1,859 2605712 0,771 31,55

1 4,425 2,319 1983230 0,588 30,830

2 4,413 2,307 1984102 0,589 30,768 9 MC 3 4,420 2,319 1982311 0,588 30,85

TB 4,419 2,315 1983214 0,588 30,82

kh (g)

STT STT mcắn Ctính K1 Tên mẫu m0 Speak (mg/l) TN mẫu (g) (%)

4,785 2,405 2016581 0,598 30,059 1

4,592 2,323 2015581 0,598 30,240 2 10 HN 4,694 2,335 2015780 0,598 29,739 3

TB 4,690 2,354 2015981 0,598 30,01

Kết quả thành phần rutin trung bình trong nụ hòe các vùng theo các phương pháp

được tổng kết trên bảng 3.14. Kết quả cho thấy thành phần rutin trong các mẫu nụ

hòe nghiên cứu nằm trong khoảng 29,94 - 35,20%. Nếu như trữ lượng nụ hòe trong

nước hiện nay xấp xỉ 15.000 tấn/năm (theo kết quả mục 3.1.1) thì Việt Nam sở hữu

một nguồn rutin với trữ lượng khoảng 4491 đến 5280 tấn/năm.

TB (%)

Bảng 3.14: Tổng kết thành phần rutin trong nụ hoè theo ba phương pháp

(%) K1

SK (%) K1

STT Mẫu K1

1 ĐL-KB 31,80 32,85 33,12 32,59

2 31,38 32,97 32,51 32,29

3 30,25 31,85 30,06 30,72

4 ĐL-EK NA NA* 27,31 28,81 28,42 28,18

5 TN 33,18 35,03 33,88 34,03

6 TB 35,18 35,52 34,90 35,20

7 HB 30,59 31,61 30,96 31,05

8 HY 31,50 31,92 31,55 31,66

9 MC 30,37 31,07 30,82 30,75

10 HN 29,89 29,93 30,01 29,94

- Thành phần rutin trong nụ hòe khác nhau đối với mỗi vùng trồng, sự khác nhau

này có thể giải thích do ảnh hưởng của điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, thời điểm thu

hái, giống, loài, điều kiện chăm sóc,…. Thành phần rutin đạt cao nhất trong nụ hòe

Thái Bình (35,20%), Thái Nguyên (34,03%); thấp nhất đối với mẫu hòe Hà Nội

(29,94%). Rutin trong hòe Đắc Lắc là 32,29 - 32,59% và một số vùng còn lại như

Nghệ An, Hòa Bình, Hưng Yên, Móng Cái nằm trong khoảng 30-31%.

Như vậy rutin trong nụ hòe Việt Nam cao hơn trong nụ hòe một số nước khác

(hòe Hungary là 12%, hòe Bungari là 24,3-28,7% [77]). Kết quả này cũng phù hợp

với công bố trước đó về thành phần rutin của tác giả Lê Thị Anh Đào: với nụ hòe

Thái Thụy (Thái Bình) là 35,51% và Lạng Giang (Bắc Giang) là 34% (PP TL) [14].

Như vậy với trữ lượng lớn và chất lượng tốt, nụ hoè Thái Bình vẫn là nguyên liệu

tốt nhất để sản xuất rutin ở Việt Nam. Trong luận án này, nụ hòe Thái Bình được

lựa chọn làm nguyên liệu để triển khai cho phần nghiên cứu quá trình trích ly rutin.

- Kết quả cũng phản ánh sự thay đổi lượng rutin trong nụ hoè Nghệ An ở dạng sao

và dạng phơi: rutin trong dạng phơi là 30,72% nhưng trong dạng sao khô còn

28,18%. Như vậy rutin giảm 2,54% từ dạng phơi sang dạng sao, kết quả này phù

hợp với công bố [5, 7]. Để tăng cường một số hoạt tính trong một số bài thuốc dân

gian, nụ hòe thường được sao. Việc sao nụ hiếm khi được dùng khi nụ hòe được sử

dụng làm nguyên liệu trích ly rutin. Tuy nhiên trong trường hợp thu hoạch vào

những ngày mưa, người dân thường phải sao trực tiếp trên bếp để tránh thiu, mốc.

Do nhiệt độ cao và tốc độ tăng nhiệt không kiểm soát trong quá trình gia nhiệt mà

một phần rutin chuyển thành quercetin (phần đường trong phân tử rutin đứt ra) dẫn

đến sụt giảm rutin trong mẫu. Như vậy với mục đích chiết rutin thì nụ hòe phơi khô

tự nhiên là nguyên liệu trích ly rutin tốt nhất.

Bảng 3.14 đã cho thấy phần lớn các giá trị thành phần rutin đạt được ở các mẫu

tuân theo quy luật: K1 (PP trọng lượng) < K1 (PP HPLC) < K1 (PP UV-VIS). Theo

một số công bố: phương pháp trọng lượng được đánh giá là sẽ cho sai số thừa vì

quercetin tự do và các flavonoit khác chưa tách hết trong quá trình tinh chế nên hàm

lượng rutin thu được chính là hàm lượng flavonoit toàn phần và quercetin tự do tính

ra rutin; trong PP HPLC, sử dụng pha động có tính axit kết quả thu được không ổn

định vì rutin là glucosit có phần đường dễ bị thủy phân và có nhiều nhóm –OH của

phenol có hoạt tính cao [2, 29]. Tuy nhiên trong thực nghiệm đã tiến hành, kết quả

xác định bằng PP trọng lượng lại nhỏ nhất. Có thể sự mất mát rutin trong quá trình

tinh chế thô và hiệu suất quá trình chuyển hóa rutin thành quercetin chưa đạt 100%

chính là nguyên nhân làm K1 (PP trọng lượng) luôn nhỏ hơn khi phân tích bằng hai

PP còn lại. PP UV-VIS đo độ hấp thụ của rutin trong cắn chiết mà không qua giai

đoạn tách flavonoit nên giá trị độ hấp thụ đo được có thể còn bị ảnh hưởng của một

số flavonoit khác làm cho giá trị K1 luôn cao. Thực tế dựa vào khả năng phân tách,

độ chính xác, độ lặp thì HPLC là phương pháp định lượng rutin trong các dịch chiết,

chế phẩm thuốc, sản phẩm thô hay tinh nói chung cho kết quả tin cậy nhất. Tuy

nhiên về mặt khoa học thì để đánh giá mức độ tin cậy của các phương pháp phân

tích này, cần phải chứng thực bằng sai số của chúng.

3.1.4.2. Đánh giá các phương pháp phân tích hàm lượng rutin

Với số lượng mẫu nghiên cứu là 10 và số lần lặp cho mỗi kết quả phân tích là 3,

ta có n = 10, f = 2, fts = 20, mi = 3. Tra bảng G0,095 (10,2) = 0,445 [25]. Áp dụng

công thức (2.1) tính phương sai kết quả phân tích theo từng phương pháp. Áp dụng

công thức (2.5), (2.6), (2.7) để tính toán kết quả sai số của phương pháp phân tích.

* Phương pháp trọng lượng

Phương sai theo kết quả phân tích TL trình bày trên bảng 3.15.

Bảng 3.15: Phương sai theo kết quả phân tích trọng lượng*

Số TT mẫu Đại

lượng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 mi

∑

1 =

2 3033,9 2956,2 2746,1 2237,8 3304,9 3715,4 2807,9 2977,4 2768,5 2688,3 uy

∑

1 =

95,40 94,14 90,75 81,93 99,54 105,54 91,77 94,50 91,11 89,67

0,059 1,058 0,418 0,173 1,096 1,212 0,277 0,270 0,747 3,988 s2

* Số liệu trích bảng 3.10

2 max

429

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 fi

s n

3,988 9,297

2 is

∑

1 =

Theo tiêu chuẩn Cochran (2.5) ta có:

Vì G < G0,095 (10,2) nên áp dụng (2.6) tính phương sai tái sinh:

2 i

∑

9297

2 ts

1 = n

297 10

9297

964,0

Như vậy sai số của phương pháp phân tích trọng lượng theo kết quả đo tính theo

2 ts

(2.7) là:

* Phương pháp UV-VIS

Phương sai theo kết quả phân tích UV-VIS trình bày trên bảng 3.16. Bảng 3.16: Phương sai theo kết quả phân tích UV-VIS*

Số TT mẫu Đại

lượng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 mi

∑

1 =

2 3238,3 3266,0 3043,1 2490,1 3684,4 3789,1 2998,0 3056,5 2897,6 2687,5 uy

∑

1 =

98,56 98,90 95,54 86,43 105,10 106,56 94,84 95,75 93,22 89,79

0,212 2,692 0,335 0,098 1,188 2,129 0,041 0,123 0,445 0,056 s2

* Số liệu trích bảng 3.12

2 max

368,0

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 fi

s n

2,692 7,319

2 is

∑

1 =

Theo tiêu chuẩn Cochran (2.5) ta có:

2 i

∑

732,0

2 ts

1 = n

319,7 10

Vì G < G0,095 (10,2) nên áp dụng (2.6) tính phương sai tái sinh:

732

856,0

2 ts

- Sai số của phương pháp phân tích UV-VIS theo kết quả đo tính theo (2.7) là:

* Phương pháp HPLC

Phương sai theo kết quả phân tích HPLC trình bày trên bảng 3.17.

Bảng 3.17: Phương sai theo kết quả phân tích HPLC*

Số TT mẫu Đại

lượng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 mi

∑

1 =

2 3290,8 3171,2 2711,1 2423,5 3443,5 3656,9 2876,0 2985,5 2848,9 2702,4 uy

∑

1 =

99,36 97,54 90,17 85,25 101,63 104,73 92,89 94,64 92,45 90,04

0,012 0,002 0,361 0,439 0,299 0,467 0,02 0,077 0,002 0,064 s2

* Số liệu trích bảng 3.13

2 max

268

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 fi

s n

0,467 1,743

2 is

∑

1 =

Theo tiêu chuẩn Cochran (2.5) ta có:

2 i

∑

1747

2 ts

1 =i 10

743,1 10

Vì G < G0,095 (10,2) nên áp dụng (2.6) tính phương sai tái sinh:

174,0

417

2 ts

Như vậy sai số của phương pháp phân tích HPLC theo kết quả đo tính theo (2.7) là:

( TL

)

964,0

* So sánh các sai số:

sts

HPLC

( UV

)

856,0

(

417

− VIS

,0) =

Kết quả tính toán sai số của từng phương pháp ( ;

sts

; ) cho thấy PP phân tích trọng lượng cho sai

số phân tích cao nhất. HPLC sử dụng cho nghiên cứu này có pha động mang tính

axit nhưng peak rutin vẫn được tách rõ ràng và kết quả định lượng ổn định, cho sai

số thấp nhất. Do đó PP HPLC với điều kiện phân tích đã thực hiện: cột C18, detector UV, λ = 254nm, nhiệt độ lò cột 400C, pha động metanol:0,02M NaH2PO4

(pH=3,0):tetrahydrofuran=10:70:20(v/v), tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích bơm mẫu

15μl được lựa chọn làm phương pháp đánh giá hàm lượng rutin sản phẩm trong các

nghiên cứu tiếp theo.

3.1.4.3. Định lượng rutin trong một số dạng nụ

Nụ hòe TB ở các dạng: tấm, trung bình, sắp nở và hoa được xay2, chiết Soxhlet

trong metanol đến khi kiểm tra không còn rutin (8h). Phân tích dịch chiết trên hệ

thống HPLC, kết quả thực nghiệm được trình bày trên bảng 3.18.

Bảng 3.18: Thành phần rutin trong các dạng nụ hoè

Mức m0 mcắn Ctính K1 Mẫu Speak (g) (mg/l) (%) giảm (%) (g)

Nụ tấm (< 1mm) 4,383 2,553 2236179 0,662 38,58 -

Nụ trung bình (1-2mm) 4,383 2,852 1824636 0,542 35,26 3,32

Nụ sắp nở và hoa 4,383 1,285 1407328 0,420 12,30 26,28

trong bảng 3.18 cho thấy thành phần rutin giảm dần theo

Kết quả xác định K1

sự phát triển của nụ. Nụ hoè non dạng tấm cho lượng rutin cao nhất (38,58%), gấp

3,14 lần nụ sắp nở (12,30%) và 1,09 lần nụ trung bình (35,26%) hay thành phần

rutin trong nụ dạng tấm giảm 3,32% khi nụ trung bình và giảm 26,28% khi nụ sắp

nở và thành hoa. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu sự tích lũy rutin và

một số flavonoit trong nụ và hoa hòe ở Bungari theo sự phát triển từng mùa và cá

thể. Sự tích lũy rutin bắt đầu bằng sự hình thành các nụ với lượng lớn nhất là

287 mg/g (tương ứng 28,7% KLK) trong suốt giai đoạn sớm nhất của sự phát triển

hoa (giữa tháng 7) và có xu hướng đạt mức cao tới giữa tháng 8 sau đó giảm tới

44 mg/g (1,26%) tương ứng với sự giảm các flavonoit trong suốt và sau thời kỳ hoa

[59]. Một nghiên cứu khác cũng chỉ ra: rutin chiếm ưu thế trong nụ non (có thể tới

90% hỗn hợp flavonoit glycosit) nhưng sophorabiosit và kaempferol 3-rutinosit lại

chiếm ưu thế ở các giai đoạn phát triển sau của quả [77]. Như vậy khi nụ hòe dạng

tấm là thời điểm thu hoạch nguyên liệu chiết xuất rutin tốt nhất. Tuy nhiên do yếu tố

năng suất sản lượng nên thực tế nụ hòe Việt Nam thường được thu hoạch ở dạng nụ

trung bình khi tỷ lệ nụ tấm đạt 5-7,5% [39].

3.1.4.4. Định lượng rutin trong nụ hòe theo thời gian bảo quản

Nụ hòe TB (có phân bố dạng nụ theo bảng 3.2) được bảo quản ở điều kiện thường (trong túi ninon) trong 2,5 năm và 3,5 năm, được sấy khô, xay2 rồi chiết

Soxhlet trong metanol đến khi kiểm tra không còn rutin (8h). Phân tích dịch chiết

trên máy HPLC, kết quả thực nghiệm được trình bày trên bảng 3.19.

Bảng 3.19: Độ giảm rutin trong nụ hòe theo thời gian bảo quản

kh (g)

∆t Mức t mcắn Ctính K1 Mẫu m0 Speak qtn (mg/l) (%) giảm (%) (g) (năm)

0,25 4,383 2,200 2349164 0,695 1,530 34,90 - - TB*

4,301 2,452 1371970 0,409 1,003 23,33 2,25 33,15 TB2,5 2,50

*: Số liệu trích từ bảng 3.13

4,144 2,639 812855 0,245 0,648 15,63 3,25 55,21 TB3,5 3,50

Kết quả trên bảng 3.19 đã cho thấy bảo quản ở điều kiện bình thường thành phần

rutin trong nụ hòe bị sụt giảm rất nhanh. Tính từ thời điểm đánh giá mẫu lần đầu thì

hàm lượng rutin bị sụt giảm 33,15% sau khoảng thời gian 2,25 năm và 55,21% sau

khoảng thời gian 3,25 năm. Nụ hòe dù đã sấy khô, đóng bao ninon nhưng bảo quản

trong thời gian dài, ở điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Việt Nam rất dễ bị mối mọt, nấm

mốc, hình thành một số enzym cắt mạch rutin (phân hủy) làm cho hàm lượng rutin

trong nguyên liệu giảm nhanh. Nếu như không có biện pháp xử lý mẫu và bảo quản

hợp lý nụ hòe như: ngâm vào dung dịch nước muối ăn loãng, định kỳ phơi hoặc sấy

lại để làm giảm độ ẩm hoặc bảo quản trong các chỗ thoáng mát,... thì việc đảm bảo

nguồn nguyên liệu tốt và ổn định cho sản xuất liên tục ở quy mô công nghiệp là

điều khó khăn.

3.2. Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin chất lượng cao

Quy trình nghiên cứu được tiến hành theo phần 3.1.3 - sơ đồ 3.1. Tất cả các nghiên cứu sử dụng nguyên liệu là nụ hòe TB xay2 (trừ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ mịn nguyên liệu đến quá trình trích ly có sử dụng thêm nụ hòe xay1

và nụ hòe nghiền)

* Xử lý mẫu và tách rutin khỏi pha trích: Lấy mỗi mẫu 10g (= 0,01kg) hòe xay2 vào

bình tam giác 250ml, thêm vào 100ml HCl 0,2% ngâm trong 2h. Lọc bỏ dịch trên phễu Buchner (có thể dùng vải lọc 180 đường/mm đối với hòe xay2), bột liệu được

rửa bằng nước đến trung tính (kiểm tra nước rửa bằng giấy quỳ). Các mẫu này gọi

là mẫu sau xử lý, được sử dụng để nghiên cứu trích ly rutin.

Sau khi trích ly rutin và thực hiện quá trình lọc bỏ bã nụ. Với các mẫu trích ly

bằng etanol và metanol, dịch lọc được bổ sung thêm 100ml nước cất rồi cất chân

không thu hồi dung môi. Phần dịch còn lại sau cất được làm lạnh cho rutin thô kết

tủa. Với các mẫu trích ly bằng NaOH 20%, dịch lọc được axit hóa bằng HCl đến pH

= 2 - 3 cho rutin kết tủa. Với các mẫu trích ly bằng nước nóng, sau khi giảm áp hạ

bớt nhiệt độ, lọc nóng, dịch lọc được làm lạnh cho rutin kết tủa.

Mỗi mẫu rutin thô được lọc rửa bằng nước trên phễu Buchner, được sấy ở 600C

đến khối lượng không đổi, xác định khối lượng và phân tích HPLC.

* Đánh giá hàm lượng rutin bằng PP HPLC: Lấy 0,01g mỗi mẫu rutin thô thu được

vào từng bình định mức 10ml, định mức bằng metanol đến vạch được ddB. Lấy 1ml

ddB vào bình định mức 10ml, định mức bằng metanol đến vạch được ddB1 (Cpha =

0,1g/l). Mẫu ddB1 được phân tích HPLC ở điều kiện đã trình bày trong mục 3.1.4.2.

3.2.1. Nghiên cứu khảo sát các dung môi trích ly rutin

3.2.1.1. Trích ly rutin bằng dung môi nước

a. Trích ly không có trợ giúp của sóng siêu âm và sóng vi ba

Mỗi mẫu sau xử lý được đưa vào các bình trích ly, thêm vào Vml nước để đạt tỷ

lệ Kv = 40, 44, 48, 52 (kg/kg). Các bình được đặt trong thiết bị gia nhiệt (chịu áp), điều chỉnh P = 1atm để T0 = 1000C giữ điều kiện trích ly này trong τ = 40 phút. Các

áp suất tương ứng với nhiệt độ được nghiên cứu trong quá trình trích ly này là 1000C -1atm, 1090C -1,5atm, 1190C - 2atm, 1260C - 2,5atm. Trên cơ sở kết quả của

các nghiên cứu, tìm được Kv có lượng rutin trích ly cao nhất trong các giá trị khảo

sát. Lặp lại quá trình trích ly này với Kv cố định, khảo sát lần lượt các yếu tố nhiệt

độ và thời gian. Quá trình thực nghiệm với các điều kiện trích ly được tổng kết trên

bảng 3.20, kết quả thu được trên bảng 3.21, đồ thị biểu diễn quan hệ của Kv, thời

gian, nhiệt độ với lượng rutin trích ly được trong các khảo sát trên hình 3.5 ÷ 3.7.

Bảng 3.20: Điều kiện khảo sát quá trình trích ly rutin bằng nước

Thông số khảo sát

Kv = 40, 44, 48, 52 (kg/kg)

Thông số cố định T0 = 100 (0C), τ = 40 (phút) T0 = 100 (0C), Kv = 44 (kg/kg)

τ = 30, 40, 50, 60 (phút) T = 100, 109, 119, 1260C τ = 40 (phút), Kv = 44 (kg/kg)

Theo tài liệu [17] thì độ tan của rutin trong nước sôi là 1/100 (g/ml). Với quá

trình hòa tan thông thường và khả năng tan của rutin thì Kv = 35 đã có thể hòa tan

hết lượng rutin có rutin trong 0,01kg nụ hòe (0,0031kg rutin). Thực tế do ảnh hưởng

cấu trúc của vật liệu nên với Kv = 52 và thời gian trích ly 40 phút hiệu suất quá

trình trích ly vẫn chỉ đạt 62,42% - kết quả thực nghiệm trên bảng 3.21.

Bảng 3.21: Kết quả ảnh hưởng của Kv, τ và T0 đến quá trình trích ly

Điều kiện trích q0.10-3 Kv- Ctính HLth qtn.10-3 Htn Speak-rut. τ-T (g/l) (kg) (%) (kg) (%) ly rutin

40 1609426 0,0551 55,10 1,620 52,50 2,94 Kv= 40÷52

44 1608257 0,0551 55,06 1,960 63,52 3,56

kg/kg (T0=1000C, τ= 48 1607381 0,0550 55,03 1,948 63,13 3,54

40 phút) 52 1664339 0,0570 56,98 1,926 62,42 3,38

30 3,540 1584014 0,0542 54,23 1,92 62,22 τ = 30÷60

40 3,562 1610302 0,0551 55,13 1,964 63,65

50 3,630 1610886 0,0552 55,15 2,002 64,88

phút (Kv = 44 kg/kg, T0= 1000C) 60 3,984 1635130 0,0560 55,98 2,23 72,27

100 3,547 1615560 0,0553 55,31 1,962 63,59 T=100÷1260C 109 3,788 1741159 0,0596 59,61 2,258 73,18 (τ= 40 phút, 119 4,340 1693256 0,0580 57,97 2,516 81,54 Kv = 44kg/kg) 126 4,383 1710197 0,0586 58,55 2,566 83,16

- Trên hình 3.5 ở nhiệt độ trích ly 1000C, trong khoảng khảo sát 40 < Kv < 45 thì Kv

ít ảnh hưởng đến quá trình trích ly rutin. Theo chiều của đồ thị có thể dự đoán

khoảng 0 < Kv < 40 mới là khoảng Kv ảnh hưởng nhiều đến quá trình trích ly do:

khi lượng nước tăng (Kv tăng) làm mức độ hòa tan rutin tăng, do đó lượng rutin

trong pha trích cũng có thể tăng theo. Tuy nhiên ở mỗi nhiệt độ thì rutin có một độ

hòa tan nhất định (xem hình 1.6), nếu bỏ qua các yếu tố động học mà chỉ đơn thuần

xét đến tính tan thì việc tăng Kv có thể chỉ làm tăng tốc độ quá trình trích ly trong

3,0

) g k (

2,5

3 - 0 1 .

2,0

n t

2,0

) g k ( 3 - 0 1 . n t q

1,5

1,0

0,5

0,0

40 42 44 46 48 50 52

30 35 40 45 50 55 60 Thoi gian (phut)

(kg/kg) K v

một khoảng thời gian ∆τ nào đó. Việc đánh giá ảnh hưởng của Kv tại một thời gian

Hình 3.6: Quan hệ giữa thời gian trích Hình 3.5: Quan hệ giữa Kv và

lượng rutin thu được ly và lượng rutin

trích ly mà chưa đánh giá được tại thời gian đó tốc độ quá trình trích ly thay đổi lớn

sẽ khó đưa ra một kết luận cụ thể. Tuy nhiên trong khoảng khảo sát thì Kv = 44

(kg/kg) là giá trị phù hợp nhất được lựa chọn thể thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

do độ chênh lệch hiệu suất trích ly tại Kv = 44, 48 và 52 lớn nhất là 1,7%. Nếu tăng

Kv mà hiệu suất tăng không đáng kể thì sẽ không kinh tế (tăng Kv sẽ ảnh hưởng đến

kích thước thiết bị).

- Trên hình 3.6 cho thấy: trong khoảng thời gian khảo sát 30-60 phút, lượng rutin

trích ly được tăng dần theo thời gian trích ly. Thời gian trích ly kéo dài tạo điều kiện

cho rutin từ sâu trong các mao quản trong cấu trúc tế bào khuếch tán ra ngoài do đó

làm tăng lượng rutin. Thời gian trích ly 40 phút ở khảo sát ban đầu chưa phải là thời

gian trích ly cho lượng rutin cao nhất, trong khoảng thời gian trích ly 50 - 60 phút

3,0

thì lượng rutin tăng mạnh hơn.

) g k (

2,5

2,0

3 - 0 1 . n t q

- Trên hình 3.7, trong khoảng nhiệt độ khảo sát (100 - 1260C), lượng rutin tăng

1,5

1,0

0,5

0,0

nhanh theo nhiệt độ. Ở cùng một giá trị Kv, hiệu suất trích ly tại 1000C (τ = 60

100 105 110 115 120 125 130 T (0C)

phút là 72,27%) thấp hơn hiệu suất trích ly ở 1090C (τ = 40 phút là 73,18%); hiệu suất trích ly ở 1090C tăng thêm 10% khi trích ly ở 1260C. Điều này có thể giải

thích trên cơ sở độ tan của rutin theo nhiệt

Hình 3.7: Quan hệ giữa nhiệt độ

trích ly và lượng rutin độ (hình 1.6): trong khoảng nhiệt độ 100 - 1250C thì đường biểu diễn độ tan của

rutin là một đường cong có vách dựng đứng. Do khả năng hòa tan rutin cao trong

khoảng nhiệt độ này nên lượng rutin trích ly được tăng nhanh (hiệu suất trích ly

rutin cũng tăng nhanh).

Như vậy trong phương pháp trích ly bằng nước ở giá trị Kv ít ảnh hưởng, nhiệt độ

là yếu tố quyết định, tăng nhiệt độ sẽ hiệu quả hơn rất nhiều so với việc tăng thời

gian trích ly.

* Kiểm chứng quá trình trích ly rutin bằng nước tại điều kiện tối ưu và trích ly

rutin bằng dung dịch kiềm (NaOH, pH = 8) ở nhiệt độ cao:

= 1260C. Lặp lại quá trình trích ly ở điều kiện trên ba lần.

Từ kết quả khảo sát trên chọn các điều kiện tối ưu là: τ = 40phút, Kv = 44 kg/kg, T0

- Thí nghiệm trích ly rutin ở điều kiện trên nhưng dung môi nước được đưa đến

pH1 = 8 (dùng NaOH 1M). Dịch lọc sau khi nguội, được đưa về pH2 = 5 (dùng dung

dịch HCl 1M). Kết quả các mẫu thí nghiệm được trình bày trên bảng 3.22. So với một số kết quả trích ly rutin bằng nước và nước đã xử lý ở T0 cao đã công

bố (hiệu suất > 80% [17, 39]) thì nghiên cứu này sử dụng nước máy để trích ly rutin và hiệu suất đạt 82,68% ở điều kiện τ = 40phút, Kv = 44kg/kg, T0 = 1260C.

Bảng 3.22: Kết quả trích ly rutin bằng nước và dung dịch kiềm (NaOH, pH = 8) (τ = 40phút, Kv = 44 kg/kg, T0 = 1260C)

q0.10-3 qtn.10-3 s2(Htn) DM trích ly Speak Ctính (g/l) HLth (%) Htn (%) (kg) (kg)

4,341 1723926 0,0590 59,02 2,562 83,03

4,406 1683909 0,0577 57,65 2,54 82,32 Nước 0,126 4,357 1710782 0,0586 58,57 2,552 82,71

TB 58,41 2,551 82,68

3,676 1645061 0,0563 56,32 2,070 67,09

3,634 1676899 0,0574 57,41 2,086 67,61 Dung dịch 0,079 kiềm 3,662 1652947 0,0566 56,59 2,072 67,16

TB 56,77 2,076 67,29

)

100

(

n t

Kết quả bảng 3.22 còn cho thấy nếu

sử dụng dung dịch kiềm (NaOH, pH = 8) trích ly rutin ở nhiệt độ cao (1260C) thì

hiệu suất bị giảm 15,39% so với sử dụng

nước (hình 3.8).

Trong phương pháp này, mục đích của

Nuoc

việc thay đổi pH dung môi và dịch lọc là

Dung dich kiem Dung môi

tạo điều kiện cho rutin hòa tan tốt hơn và

Hình 3.8: Hiệu suất trích ly rutin kết tủa tốt hơn. Tuy nhiên quá trình trích ly lại tiến hành ở nhiệt độ 1260C trong

dung dịch kiềm có pH = 8, dù chưa phải

bằng nước và kiềm (NaOH, pH = 8) ở 1260C là môi trường kiềm mạnh nhưng ở nhiệt

độ cao (có áp suất) đã có sự phân hủy một phần rutin dẫn đến hiệu suất trích ly

giảm. Như vậy trích ly rutin trong dung dịch kiềm (NaOH, pH = 8) ở nhiệt độ cao

không phù hợp.

b. Trích ly có trợ giúp của sóng siêu âm và sóng vi ba

Nước và mẫu sau xử lý (Kv = 20kg/kg) được đưa vào bình trích ly. Các bình này

được đưa vào lò vi sóng (công suất 800W) để trích ly ở các thời gian (2; 2,5; 3; 3,5;

4; 5; 6 và 10 phút). Tương tự, với Kv = 20kg/kg và dung môi nước, các bình nguyên

liệu được đưa vào bể siêu âm LC 60H (tần số 35kHz) để trích ly ở nhiệt độ thường

trong các thời gian 2,4 và 10 phút. Kết quả trình bày trong bảng 3.23, hình 3.9.

HLth τ Bảng 3.23: Kết quả trích ly rutin dưới tác động của sóng vi ba và siêu âm qtn.10-3 q0.10-3 Ctính Cpha Htn PP Speak (kg) (g/l) (g/l) (kg) (%) (%) (phút)

1,985 1,054 20909547 0,716 67,93 1,348 43,70 2

2,5 2,034 1,006 20138160 0,689 68,52 1,393 45,16

1,994 0,612 12765746 0,437 71,46 1,425 46,17 3

3,5 2,158 0,611 12466557 0,427 69,85 1,507 48,84 Sóng vi

ba 2,206 1,108 23167684 0,793 71,61 1,580 51,19 4

2,311 0,666 13400199 0,459 68,87 1,592 51,59 5

2,314 1,287 25546885 0,875 67,94 1,572 50,94 6

10 2,387 0,869 16796786 0,575 66,15 1,579 51,17

0,240 0,741 15462740 0,529 71,46 0,171 5,55 2 Siêu âm 0,266 0,953 19450671 0,666 69,85 0,186 6,03 4 (35kHz) 10 0,349 0,939 19654297 0,673 71,61 0,250 8,09

Do rutin hầu như không tan trong nước lạnh nên mặc dù có sự trợ giúp của sóng

siêu âm tần số 35kHz thì hiệu quả trích ly trong 10 phút vẫn dưới 10%. Quá trình

trích ly rutin bằng nước trong lò vi sóng, ở Kv = 20 kg/kg rất thấp nhưng chỉ cần 4

phút đã trích ly được 51,19% lượng rutin trong nguyên liệu. So với quá trình trích ly rutin trong nước ở 1000C trong nồi hấp điều khiển nhiệt bằng áp suất, dù Kv lớn

hơn gấp 2,2 lần thì sau 30 phút mới trích ly được 62,22% lượng rutin trong nguyên

liệu (xem bảng 3.21).

Như vậy trích ly rutin trong lò vi sóng tiết kiệm được rất nhiều thời gian so với

quá trình trích ly thông thường. Điều này có thể được giải thích như sau: dưới tác

2,0

dụng của sóng vi ba, nước ngấm vào các mao quản của hạt nguyên liệu nhanh hơn.

vi song

1,6

Nước trong các mao quản của hạt hòe xay2 được đốt nóng, truyền nhiệt cho

) g k ( 3 - 0 1 . n t q

1,2

các phẩn tử khác của nguyên liệu tạo ra

0,8

quá trình đốt nóng nhanh và sôi nước từ nội cấu trúc hạt hòe xay2. Do đó mà quá

siêu âm

0,4

trình hòa tan rutin vào dung môi xảy ra

0,0 0

rất nhanh, thúc đẩy tốc độ trích ly.

8 6 Thoi gian (phut)

3.2.1.2. Trích ly rutin bằng dung dịch

NaOH ở nhiệt độ thường

Hình 3.9: Ảnh hưởng của sóng siêu Mỗi mẫu sau xử lý được ngâm trong

âm và sóng vi ba đến qtn 200ml NaOH có lần lượt nồng độ là Ci

(%) trong τ = 1,5 (h). Mẫu được lọc để bỏ bã nụ và lấy pha trích. Pha trích được

trung hòa bằng dung dịch axit HCl 20% tới pH = 2-3 cho rutin thô kết tủa. Lọc rửa rutin thô bằng nước sau đó sấy khô ở 600C và xác định khối lượng.

- Từ kết quả khảo sát Ci, chọn CNaOH cho qtn cao nhất trong các giá trị khảo sát và

lặp lại thực nghiệm ở CNaOH này với thời gian trích ly thay đổi để tìm τ phù hợp.

- Lặp lại quá trình trích ly như trên ở điều kiện CNaOH và τ cho qtn cao nhất. Ảnh

hưởng của pH pha trích đến lượng rutin thô kết tủa được khảo sát trong khoảng pH

= 1÷6. Kết quả trình bày trên bảng 3.24 và biểu diễn trên hình 3.10÷ 3.13.

Mối quan hệ giữa lượng rutin trích ly được và τ ngâm trích có dạng một đường

cong có tiệm cận (hình 3.10). Đối với khoảng thời gian ngâm trích khảo sát, trong

giai đoạn đầu của quá trình trích ly từ 1-2h, do sự chênh lệch nồng độ rutin giữa

dung môi và bề mặt hạt hòe lớn nên tốc độ quá trình trích xảy ra rất nhanh, lượng

rutin tăng cùng với thời gian trích. Trong khoảng từ 2-5h, quá trình trích có hiệu

quả gần không đổi (đoạn nằm ngang trên đồ thị hình 3.10), thời gian trích ly tăng

nhưng lượng rutin tăng không đáng kể và hiệu suất trích ly sau 5h chỉ đạt 76,74%.

Thông số Điều kiện trích Bảng 3.24: Khảo sát ảnh hưởng của CNaOH, τngâm, pH đến quá trình trích ly qtn.10-3 q0.10-3 HLth Ctính Htn Speak (%) (kg) (g/l) (kg) (%) ly rutin khảo sát

2,91 1,161 2119126 0,0726 72,55 0,842 27,29 CNaOH =

2,91÷23,08% 8,26 2,451 1132440 0,0388 38,77 0,950 30,79

13,04 2,624 1952634 0,0669 66,85 1,754 56,84 (τngâm = 1,5h,

pH = 3) 16,67 2,901 2080570 0,0712 71,23 2,066 66,96

20,00 1,824 1696177 0,0581 58,07 1,059 34,33

23,08 1,133 1899181 0,0650 65,02 0,737 23,87

1 2,408 2355720 0,0807 80,65 1,687 54,67 τngâm =1÷5h

1,5 3,120 2226616 0,0762 76,23 2,066 66,96 (pH = 3; CNaOH

= 16,67%) 2 3,448 2250859 0,0771 77,06 2,309 74,83

3 3,850 2061876 0,0706 70,59 2,361 76,51

4 3,700 2151548 0,0737 73,66 2,368 76,73

5 3,650 1599495 0,0548 54,76 2,368 76,74

1 2,858 2011344 0,0689 68,86 1,968 63,77 pH =1÷6

1,5 2,868 2061000 0,0706 70,56 2,024 65,58 (CNaOH =

16,67%; 2 3,197 2253196 0,0771 77,14 2,466 79,93

τngâm = 3h) 3 3,619 1974482 0,0676 67,60 2,447 79,29

4 2,957 2235086 0,0765 76,52 2,263 73,34

5 2,305 2346373 0,0803 80,33 1,852 60,02

6 2,182 2342868 0,0802 80,21 1,750 56,73

Thực chất quá trình trích ly rutin xảy ra trong các mao quản của hạt hòe nên bề

mặt tiếp xúc pha sẽ chuyển dần vào trong làm giảm nhanh vận tốc trích ly (hình

1.4). Quá trình này trích ngâm rutin ở điều kiện thường (không có sự tác động của

các yếu tố công nghệ khác như khuấy trộn, siêu âm,...) nên hiệu suất trích ly thấp và

sau 2h trích ly thì việc tăng thời gian trích không có ý nghĩa. Do đó để tăng cường

hiệu quả trích ly thì quá trình này phải được thực hiện thêm các yếu tố công nghệ

khác. Tuy nhiên trong khảo sát đã thực hiện đối với quá trình ngâm trích này thì

3,0

2,5

2,0

) g k ( 3 - 0 1 . n t q

1,5

1,0

0,5

0,0 0

20 C

25 (%)

3 5 4 Thoi gian (h)

NaOH

thời gian trích kinh tế nhất nên chọn tại 2,5h.

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ Hình 3.10: Ảnh hưởng của τ ngâm

NaOH đến lượng rutin trích ly trích đến lượng rutin trích ly

Trong khoảng pH, CNaOH khảo sát, mối quan hệ giữa qtn và các yếu tố này có

dạng gần giống parabol lồi (có cực đại) (hình 3.11 và hình 3.12). Trong khoảng

CNaOH = 2,91÷23,08%, lượng rutin trích ly được tăng khi tăng CNaOH và đạt giá trị

cao nhất (Htn = 66,96%) khi CNaOH = 16,67%. Ngược lại trong khoảng CNaOH =

16,67 ÷ 23,08%, qtn lại giảm khi tăng CNaOH.

Kết quả chỉ ra nồng độ NaOH 16,67% trích rutin tốt nhất phù hợp với công bố

[13, 14, 15]. Để lý giải điều này, cơ chế của quá trình trích ly rutin bằng dung dịch

NaOH được đưa ra như sau: Trong môi trường kiềm, rutin phản ứng với NaOH tạo

thành muối phenonatri dễ tan trong nước theo phản ứng 3. Đây là một phản ứng

thuận nghịch nên trong môi trường axit, muối phenonatri sẽ thủy phân trở lại thành

rutin nhờ tính chất này nên có thể trích ly rutin bằng kiềm và để kết tủa rutin từ pha

trích phải đưa pha trích về môi trường axit.

Khi nồng độ dung dịch NaOH tăng, tính kiềm mạnh hơn nên phản ứng có thể xảy

ra theo phản ứng 4 và 5 và đó là nguyên nhân lượng rutin thu được giảm (hiệu suất

trích ly giảm).

)

100

3,0

(

h t

2,5

L H

2,0

) g k ( 3 - 0 1 n t q

1,5

1,0

0,5

0,0 0

6 pH

Hình 3.13: Ảnh hưởng của pH (1÷6) Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến lượng

ONa

đến hàm lượng rutin thô rutin trích ly

ONa

NaOH H+

C6H10O4-O-C6H11O4

ONa

C6H10O4-O-C6H11O4

(3)

NaOH H+

C6H10O4-O-C6H11O4

-O-C6H10O4-O-C6H11O4

CH2

COOH

O OH

(4)

C 1

COOH

C6H10O4-O-C6H11O4

CO-CH2-O-C6H10O4-O-C6H11O4

(5)

HCOOH

COOH

CH3

Glucose

OH OH Rhamnose

Trong khảo sát này thì pH là yếu tố độc lập với quá trình hòa tan rutin trong

nguyên liệu vào dung môi, ảnh hưởng của nó chính là lượng rutin kết tủa trong pha

trích. Cơ chế của quá trình theo chiều nghịch của phản ứng 3 do đó khoảng pH ảnh

hưởng đến lượng rutin kết tủa là môi trường axit (pH = 1÷6). Thực nghiệm cho thấy

cân bằng của phản ứng tạo kết tủa rutin từ pha trích là một cân bằng động, lượng

rutin kết tủa đều bị giảm khi môi trường pha trích là axit mạnh (1 < pH < 2 rutin bị

thủy phân nên kết tủa bị tan) hoặc môi trường pha trích là axit yếu (4 < pH < 6,

rutin kết tủa chậm và không kết tủa hết). Khoảng pH cho lượng rutin kết tủa cao

nhất là 2 - 4 (hình 3.11). Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng rutin thô cũng được

xem xét trên hình 3.12. Trong khoảng pH = 1 - 5, hàm lượng rutin thô thu được lại

giảm so với pH = 5 - 6. Như vậy khi thay đổi pH để rutin kết tủa, thì các tạp chất

(pigment, axit béo, clorophyl ...) cũng được kết tủa theo. Trong số các tạp đó, một

số chất kết tủa tốt ở môi trường axit mạnh làm giảm hàm lượng rutin thô. Quá trình

thực nghiệm cho thấy khi pha trích được trung hòa axit HCl 0,1M đến pH = 3 – 4,

các hạt rutin kết tủa rất nhanh (tính bằng giây) và có kích thước lớn hơn hơn ở các

pH khác làm tốc độ sa lắng của hạt xuống đáy bình chứa nhanh hơn, quá trình lọc

cũng dễ dàng hơn. Thậm chí các hạt rutin có thể lọc rửa bằng sàng R0,008, trực tiếp

dưới vòi nước. Tuy nhiên quá trình kết tủa nhanh và tạo các hạt to này sẽ dẫn đến

hạt rutin chứa nhiều tạp hơn, hàm lượng rutin thô sẽ giảm.

Việc điều chỉnh pH pha trích để rutin kết tủa sẽ liên quan đến ba vấn đề: lượng

rutin kết tủa, hàm lượng rutin và lượng HCl tiêu tốn, để cân đối các tiêu chí trong

nghiên cứu này chọn pH = 3.

* Kiểm chứng quá trình trích ly rutin tại điều kiện tối ưu:

Từ kết quả khảo sát trên, chọn được các điều kiện tối ưu là: CNaOH = 16,67%,

τngâm = 3h, pH (pha trích) = 3. Lặp lại quá trình trích ly rutin ở các điều kiện trên, kết

quả trình bày ở bảng 3.25.

Bảng 3.25: Kết quả trích ly rutin bằng NaOH tại điều kiện tối ưu

(%)

q0.10-3 Ctính qtn.10-3 Htn Số TN HLth Speak (kg) (g/l) (kg) (%)

1 1,756 2063336 0,0706 70,64 2,374 76,93

2 1,825 2138696 0,0732 73,22 2,384 77,25

3 1,763 2160603 0,0740 73,97 2,157 69,91

TB 72,61 2,305 74,70

Ở điều kiện trích ly tối ưu CNaOH = 16,67%, τngâm = 3h, pH(pha trích) = 3 thì hiệu

suất trích ly trung bình đạt 74,70%; hàm lượng rutin thô đạt 72,61%.

3.2.1.3. Trích ly rutin dùng nước vôi trong kết hợp với Borax

* Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ borax: Borax được pha trong nước vôi trong ở

các nồng độ khác nhau. Khả năng tan của borax được theo dõi ở ba mức: tan hoàn

toàn (HT); tan kém hơn nhưng vẫn tan hết (HT-K); tan không hết (KH). Mỗi mẫu

sau xử lý được ngâm trong 200ml dung dịch nước vôi – borax ở các tỷ lệ borax

(Cborax) trong 2h, sau khi lọc bỏ bã, pha trích được axit hóa bằng HCl 20% đến pH =

3 (tương tự mục 3.2.1.2). Kết quả trình bày trong bảng 3.26, hình 3.13.

Bảng 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ borax đến quá trình trích ly rutin

Cborax q0.10-3 qtn.10-3 Borax Speak Ctính (g/l) HLth (%) Htn (%) (kg) (kg) (%o)

0 0 0,718 674148 0,0231 0,166 23,08 5,37

1 HT 2,935 1463672 0,0501 1,471 50,11 47,67

2 HT 3,379 1571746 0,0538 1,818 53,81 58,92

3 HT-K 3,493 1943579 0,0665 2,324 66,54 75,32

4 HT-K 3,255 2193317 0,0751 2,444 75,09 79,20

5 KH 3,317 2201496 0,0754 2,500 75,37 81,01

3,0

Kết quả cho thấy: hiệu suất trích ly

2,5

rutin trong nước vôi chỉ đạt 5,37%, khi

thêm borax vào nước vôi với nồng độ

2,0

) g k ( 3 - 0 1 . n t q

tăng từ 1-5%o thì hiệu suất trích ly cũng

1,5

tăng dần. Trong khoảng nồng độ borax

1,0

từ 4-5%o trong nước vôi, hiệu suất của

0,5

quá trình đạt 79,20 - 81,01%. Thực tế

0,0 0

cho thấy sự có mặt của borax với lượng

4 C

5 (%o)

borax

nhỏ tới %o đã cải thiện hiệu quả quá

trình trích ly rutin bằng nước vôi rất lớn.

Để giải thích điều này, một số phản Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ borax

H2O

ứng được dự đoán có thể đã xảy ra trong đến lượng rutin trích ly

2- + 7H2O → 4H3BO3 + 2OH- (7) B4O7 Ca(OH)2 = Ca2+ +OH- (8)

ONa

quá trình trích ly rutin như sau: Na2B4O7 2Na+ + B4O7 (6)

ONa

OH- H+

C6H10O4-O-C6H11O4

ONa

C6H10O4-O-C6H11O4

(3)

Các phản ứng có thể xảy ra khi axit hóa pha trích bằng HCl 20% là: HCl = H+ + Cl- (9) Ca2+ + 2Cl- = CaCl2 (10) Na2B4O7 (dư) ↔ 2Na+ + B4O7 2- (11) Na+ + Cl- = NaCl (12)

2- là gốc axít yếu nên dễ thành H2B4O7:

B4O7

2- + 2H+ → H2B4O7 (13)

B4O7

Để giải thích cơ chế của quá trình này, hai giả định được ra như sau: có thể

borax 4%o đóng vai trò làm chất ổn định pH cho dung môi trích ly, đưa pH của

nước vôi về giá trị mà tại đó quá trình trích ly rutin được tốt hơn; hoặc có thể borax

đóng vai trò tác nhân kích thích sự tạo thành muối và phức của rutin tan tốt trong

môi trường kiềm. Để minh chứng cho các giả thuyết trên, pH của pha trích và dung

môi đã được xác định trên bảng 3.27.

Bảng 3.27: Kết quả xác định pH cho dung môi và pha trích

Pha trích Pha trích (nước Nước sau Mẫu Nước Nước vôi +

(nước vôi) vôi+ borax 4%o) lọc rutin vôi borax 4%o

12,70 (28,50C) 12,03 (28,40C) 8,67 (28,50C) 8,20 (28,20C) 2,55 (26,80C) pH (T0C)

Bảng 3.27 cho thấy pH của nước vôi có borax 4%o giảm so với nước vôi do có

mặt của H3BO3 theo phản ứng (7). Tuy nhiên sự giảm này không đáng kể. Sau hai

quá trình trích ly (bằng nước vôi và bằng dung dịch nước vôi + borax 4%o) thì pha

trích thu được đều có pH giảm (cụ thể là từ 12,70 xuống 8,67; từ 12,03 xuống 8,20).

Sự giảm pH của pha trích chủ yếu do các axit hữu cơ và thêm vào đó là nhiều thành

phần khác trong nụ hòe được trích ly cùng với rutin đã làm giảm bớt độ kiềm của

dung môi. Pha trích được axit hóa đến pH = 3 - 4 cho rutin kết tủa nên nước sau khi

lọc rutin có pH = 2,55. Với các kết quả kiểm chứng pH trên thì giả thuyết borax

4%o đóng vai trò làm chất ổn định pH, đưa pH của nước vôi về giá trị mà quá trình

trích ly tốt nhất bị loại bỏ. Trong quá trình này, việc tạo muối canxiphenolat với

rutin là ít khả năng do nhóm -OH của phenolic không đủ sức để kết hợp với một

bazơ yếu là Ca(OH)2 hoặc nếu phản ứng xảy ra thì cũng rất yếu. Chỉ với lượng tính bằng %o của borax, các cation Na+ sẽ thế các nguyên tử hydro trong nhóm phenolic

của rutin tạo thành muối natriphenolat (tan tốt trong môi trường kiềm - phản ứng (3). Sự có mặt của natriphenolat như một tác nhân kích thích để các Ca2+ đẩy Na+ ra

khỏi nhóm phenolat hình thành nên các phức canxi-rutin và việc cạnh tranh này

thuần túy là do mức năng lượng gây nên.

Các Na+ sau khi bị đẩy ra lại đi tìm các nhóm –OH của rutin để tạo thành của rutin. Quá trình tiếp diễn xảy ra nên khi nồng độ borax tăng, tức là tăng lượng Na+

hoạt động, kích thích quá trình tạo phức rutin-canxi nên hiệu suất trích ly tăng.

Như vậy trong dịch chiết tồn tại hai dạng chính của rutin là dạng phức rutin-

canxi, muối rutin với natri. Các dạng muối và phức này tan rất tốt trong môi trường kiềm và chỉ bị phá vỡ, giải phóng ra Ca2+, Na+ và các nhóm phenolic khi pha trích

được axit hóa đến pH = 3. Trong quá trình này nước vôi đóng vai trò tạo ra môi

trường kiềm để hòa tan một phần rutin đồng thời hòa tan phá vỡ cấu trúc các muối,

axit của alcanoit tạo điều kiện cho rutin thoát ra ngoài tốt hơn.

Kết quả thực nghiệm trên bảng 3.26 cho thấy: ở nồng độ borax 5%o thì lượng

rutin trích ly được tăng không đáng kể so với nồng độ 4%o. Borax chất dễ hòa tan trong nước (hòa tan 3,7% tại 200C (dung dịch đạt pH = 9,32); 50,1% tại 1000C)

nhưng khả năng tan trong nước vôi trong lại rất giới hạn. Ở tỷ lệ 4%o trong nước

vôi, borax tan đã khó khăn, dung dịch này để sau vài giờ sẽ kết tủa một phần xuống

đáy bình. Do đó khi tăng tỷ lệ borax lên 5%o thì dung dịch borax không tan hết (bão

hòa) nên tỷ lệ borax phù hợp nhất là 4%o .

* Khảo sát ảnh hưởng của pH pha trích đến lượng rutin thô kết tủa: Lấy mỗi mẫu

10g rutin thô 75,09% hòa tan trong 500ml nước vôi - borax 4%o, dùng HCl 20%

axit hoá dung dịch rutin đến mỗi pH khác nhau để rutin kết tủa. Lọc rửa rutin kết

tủa đến trung tính, sấy khô, cân và phân tích trên HPLC. Khả năng kết tủa của rutin

được chia làm 5 trạng thái: không kết tủa (KT); tủa + lơ lửng dạng huyền phù (HP);

tủa hạt to và nhanh (H-T); tủa bắt đầu tan một phần (T-T); tủa rồi lại tan mạnh (T-

H). Kết quả trình bày trên bảng 3.28. Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ kết tủa của

rutin cho thấy khả năng kết tủa tốt nhất của rutin rơi vào khoảng pH= 4,5 - 4 (đạt

được 94,76%), nên chọn pH = 4 là hợp lý.

100

Bảng 3.28: Ảnh hưởng pH đến lượng rutin kết tủa

Trạng thái pH qtn.10-3 (kg) Mức kết tủa (%)

12 0 0 dịch trích ly

12-7 0 0 KT

6-5 3,506 46,69 HP

4,5-4 7,116 94,76 H-T

4-3 6,766 90,10 T-T

3-2 1,179 15,70 T-H

* Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly: 10g nụ hoè xay2 sau xử lý được đặt trong bình chiết (có lỗ) với chiều dày lớp hạt

hòe là 4cm, dung dịch nước vôi – borax (4%o) được đi qua liên tục lớp hạt này với

tốc độ dòng 2ml/phút. Trích ly các mẫu trong thời gian khác nhau (khoảng khảo sát

là 1-5h). Quá trình axit hóa pha trích đến pH = 4, thu hồi rutin thô và phân tích

tương tự như các thí nghiệm trên. Kết quả trình bày trong bảng 3.29, hình 3.15.

τ(h) Bảng 3.29: Ảnh hưởng thời gian trích ly đến lượng rutin q0.10-3 qtn.10-3 HLth Speak. Ctính Htn

(kg) (g/l) (kg) (%) (%)

1,0 1,452 2011344 0,0689 68,86 0,929 30,12

1,5 1,496 1952634 0,0669 66,85 1,581 51,23

2,0 1,378 2119126 0,0726 72,55 2,143 69,44

2,5 1,479 1974482 0,0676 67,60 2,715 87,98

3,0 1,722 1696177 0,0581 58,07 2,763 89,56

3,5 1,245 2346373 0,0803 80,33 2,873 93,12

4,0 1,312 2226616 0,0762 76,23 2,925 94,81

4,5 1,604 1821192 0,0624 62,35 2,932 95,01

5,0 1,273 2294673 0,0786 78,56 2,969 96,23

101

Thời gian trích ly phụ thuộc vào bề dày lớp hạt hòe, tốc độ chảy của dung môi.

Thực nghiệm tiến hành với lớp hạt hòe đứng yên, lớp dung môi chuyển động liên

3,0

tục tạo nên sự chênh lệch nồng độ lớn

) g k (

2,5

trên bề mặt hạt do đó quá trình trích ly

3 - 0 1 .

n t

2,0

hiệu quả hơn so với quá trình ngâm trích

1,5

thông thường. Trong quá trình này,

1,0

lượng rutin thu được tăng khi tăng thời

0,5

gian trích ly, đặc biệt tăng mạnh trong 1

0,0

- 2,5h đầu. Sau 5h trích ly được 96,23%

Thoi gian (h)

lượng rutin có trong nụ hòe. Tuy nhiên

để tính kinh tế thì thời gian trích ly 3,5h

Hình 3.15: Ảnh hưởng thời gian trích là hợp lý với hiệu suất đạt 93,12%, hàm

đến lượng rutin trích ly lượng đạt 80,33%.

Nước

* Sơ đồ công nghệ trích ly rutin bằng nước vôi trong kết hợp với borax:

Vôi sống

Nước vôi trong Borax

TB chiết 1

Bơm

TB chiết 2 TB chiết 3 TB chiết n

Axit HCl 20% Bể chứa dịch chiết

Bơm

Lọc khung bản Nước

Buồng sấy 600C

Rutin thô

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ công nghệ trích ly rutin bằng nước vôi - borax

102

Nụ hòe xay2 được đưa vào trong các thùng chứa. Dung dịch nước vôi + borax

4%o chảy qua thùng chứa nguyên liệu liên tục với tốc độ chậm. Dịch chiết từ các

thùng nguyên liệu được thu gom vào bể chứa. Sau một thời gian trích ly, kiểm tra

dịch chiết đi ra từ thùng nguyên liệu bằng HCl 20% nếu không thấy rutin kết tủa thì

ngừng cấp dung môi, thay nguyên liệu mới. Toàn bộ pha trích trong bể thu gom

được bổ sung HCl 20% để đưa pH dung dịch xuống 4. Sau 30 - 40phút (rutin thô

kết tủa hoàn toàn), hỗn hợp được đưa vào máy lọc khung bản. Tại đây rutin thô vừa

được ép lọc, vừa được rửa bằng nước. Rutin sau ép được đưa vào buồng sấy ở nhiệt độ 600C đến khô. Sản phẩm được đóng bao nilon kín.

Các kết quả thực nghiệm cho thấy, nước vôi - borax 4%o là dung môi mang lại

hiệu quả cao về kinh tế cho quá trình trích ly rutin. Đây là phương pháp trích ly

rutin có chi phí thấp nhất do: tận dụng được nước vôi trong (phần bỏ đi); liều lượng

borax sử dụng rất ít (4%o); công nghệ đơn giản không cần phải đầu tư lớn về diện

tích cũng như thiết bị; phù hợp với sản xuất tư nhân, nhỏ lẻ. Tuy nhiên trong luận án

này không lựa chọn và đề xuất phương pháp trích ly rutin bằng nước vôi - borax

4%o vì vấn đề môi trường và sức khỏe. Nước thải của quá trình lọc ép và rửa rutin

có axit boric, thậm chí có cả HCl, borax dư và rất nhiều chất khác. Nếu dung dịch

này không được xử lý thỏa đáng mà thải trực tiếp ra môi trường sẽ gây ô nhiễm

nghiêm trọng.

* Đánh giá ảnh hưởng của dung môi trích ly đến rutin sản phẩm: Ảnh hưởng của

dung môi trích ly (nước vôi + borax 4%o) đến chất lượng sản phẩm được thể hiện

qua lượng Ca, Na, B trong rutin. Rutin 75,74%; 80,01% và 98,01% được phân tích

kim loại trên máy ICP-MS, kết quả trình bày trong bảng 3.30.

Bảng 3.30. Kết quả phân tích kim loại xác định Na, B, Ca trong rutin

Mẫu Ca (mg/kg) Na (mg/kg) B (mg/kg)

Rutin 75,74% 2986,514 1002,398 8931,053

Rutin 80,01% 2649,744 815,707 135,201

Rutin 98,01% 658,108 136,655 90,284

103

Kết quả phân tích kim loại bằng ICP-MS cho thấy trong cả ba mẫu rutin đều có

Ca, Na, B và lượng vết của một số kim loại khác. Sự xuất hiện của Ca, Na, B trong

sản phẩm thể hiện ảnh hưởng của dung môi trích ly (nước vôi + borax) đến chất

lượng rutin. Kết quả trên bảng 3.30 cho thấy: quá trình tinh chế đã làm giảm hàm

lượng Ca, Na, B trong rutin thô (từ rutin 75,741% đến rutin 80,01%, rutin 98,01%)

nhưng vẫn chưa loại bỏ được hoàn toàn các kim loại này. So với tiêu chuẩn cho

phép về hàm lượng kim loại nặng (≤ 0,001%) ở bảng 1.1 – trang 41 thì rutin 98,01% có tổng kim loại Ca, Na, B vẫn nằm dưới giới hạn cho phép (8,84.10-4%).

3.2.1.4. Nghiên cứu quá trình trích ly rutin trong dung môi etanol

Mỗi mẫu sau xử lý được đưa vào bình, thêm vào 200ml cồn 50% v/v (hoặc 60,

70%) và trích ly ở nhiệt độ sôi của dung môi trong 30phút. Thực hiện quá trình trích

ly tương tự trong Cetanol = 70% ở các thời gian trích ly khác nhau (τ = 20 ÷ 60 phút).

- Với các mẫu khảo sát tác động của siêu âm trong bể rửa LC 60H (tần số 35kHz)

sau khi bổ sung đủ lượng cồn, mẫu được siêu âm trong một thời gian nhất định.

Các mẫu này được đem trích ly tiếp ở nhiệt độ sôi của dung môi như trên. Kết quả

trình bày trên bảng 3.31, đồ thị hình 3.16÷3.17.

Bảng 3.31: Kết quả trích ly rutin trong cồn (có/không siêu âm)

Siêu âm Ko siêu âm Thông Điều kiện trích ly số khảo qtn.10-3 qtn.10-3 rutin Htn (%) Htn (%) sát (kg) (kg)

50 1,800 58,32 1,476 47,84 Cetanol = 50 ÷ 70% 60 1,825 59,15 1,478 47,89 (τ = 30phút) 70 2,011 65,17 1,589 51,49

20 1,855 60,11 1,325 42,95

30 2,000 64,83 1,590 51,53 τ = 20÷60phút 40 2,064 66,88 1,609 52,16 (Cetanol =70%) 50 2,067 66,99 1,617 52,39

60 2,035 65,97 1,632 52,90

104

3,0

sieu am khong sieu am

không siêu âm có siêu âm

) g k (

2,0

2,5

) g k (

3 - 0 1

2,0

n t

1,5

3 - 0 1 .

n t

1,5

1,0

0,5

0,0

70 C

(%)

60 50 40 Thoi gian (phut)

etanol

Hình 3.17: Thời gian và lượng rutin Hình 3.16: Kết quả trích ly rutin bằng cồn

trích ly (không/có siêu âm) (không/ có siêu âm)

Như vậy đối với cả quá trình trích ly không và có siêu âm thì etanol 70% trích ly

tốt hơn etanol 50 và 60% (hình 3.16). Trích ly rutin bằng etanol có trợ giúp của siêu

âm cho hiệu quả cao hơn trích ly không siêu âm dù hiệu suất đạt được còn hạn chế:

ở điều kiện CEtOH = 70%, τ = 40 phút, Kv = 20 thì hiệu suất trích ly mới đạt 66,88%

(hình 3.17). Điều này cũng dễ hiểu vì rutin ít tan trong cồn lạnh nên vận tốc quá

trình trích ly lớn nhất khi đun hỗn hợp trích ở trạng thái sôi. Việc siêu âm mẫu lạnh

trước khi nâng nhiệt hỗn hợp trích ly đến nhiệt độ sôi chỉ có tác dụng cho etanol

ngấm vào nguyên liệu và hòa tan rutin một phần nên cải thiện hiệu quả trích ly

không đáng kể. Bảng 3.31 cho thấy trong khoảng thời gian trích ly khảo sát 30 - 40

phút, hiệu suất quá trình trích ly (etanol 70%, Kv = 20) không thay đổi nhiều.

3.2.1.5. So sánh quá trình trích ly rutin siêu âm trong các dung môi

Mỗi mẫu sau xử lý được bổ sung 200ml dung môi etanol 96% (hoặc etanol 70%,

natrihydroxit 20%, metanol) sau đó đưa vào bể rửa LC 60H, tần số 35kHz siêu âm

trong 2,5h. Kết quả trên bảng 3.32 và hình 3.18.

Với trích ly siêu âm (LC 60H, 35kHz), lượng rutin trích ly được ở cùng một điều

kiện trích ly giảm dần theo thức tự các dung môi metanol, NaOH 16,67%, etanol

96%, etanol 70%. Lượng rutin trích ly được cao nhất với dung môi metanol (hiệu

suất trích ly đạt 91,5% với hàm lượng rutin 80,31%). Trong dung môi etanol 96%,

105

hiệu suất trích ly chỉ đạt 75,34% nhưng hàm lượng rutin đạt cao nhất (83,47%).

Bảng 3.32: Kết quả trích ly trong các dung môi dùng siêu âm

q0.10-3 Cpha Ctính qtn.10-3 HLth Htn Dung môi Speak (kg) (mg/ml) (mg/ml) (kg) (%) (%)

Etanol 70% 3,026 2,100 40723442 1,194 1,721 56,85 55,76

Etanol 96% 2,785 1,300 37009489 1,085 2,325 83,47 75,34

NaOH 16,67% 4,499 1,700 30996826 0,909 2,405 53,46 77,94

Metanol 3,516 1,200 32870986 0,964 2,823 80,31 91,50

3,0

Theo [63] thì độ hòa tan của rutin trong

2,5

metanol và etanol xác định theo phương

2,0

) g k ( 3 - 0 1 . n t q

pháp bão hòa (283,15÷333,15K) tăng khi

1,5

nhiệt độ tăng.

1,0

0,5

0,0

Tuy nhiên mức tan của rutin trong các

Etanol 70Etanol NaOH Metanol Dung môi

dung môi này khác nhau. Độ tan của rutin trong dung môi etanol tại 500C (212,4.105

Hình 3.18: Trích ly siêu âm rutin

trong một số dung môi mol) gần như tương đương với độ tan của rutin trong metanol ở 100C (228,9.105mol). Ở nhiệt độ thường (250C) độ tan của rutin trong metanol (303,4.105mol) gấp 4,5 lần

trong etanol do đó lượng rutin trích ly trong metanol cao hơn trong etanol. Ngoài

hòa tan tốt rutin, metanol còn là dung môi có độ phân cực lớn hơn etanol, hòa tan

nhiều tạp chất hơn trong nguyên liệu do đó dung môi metanol cho hiệu suất trích ly

cao hơn nhưng ngược lại hàm lượng rutin thô lại thấp hơn trong etanol. Như vậy

trích ly rutin bằng metanol có sử dụng sóng siêu âm làm giảm thời gian trích ly và

tăng hiệu suất đến cực đại.

Etanol 70% cho lượng rutin trích được thấp nhất trong các dung môi nghiên cứu.

Đó là do nồng độ etanol thấp (70%) và có thể do có nước vì theo [81] thì nước là

dung môi không phù hợp cho quá trình trích ly siêu âm. Phương pháp trích ly siêu

âm cho hiệu quả cao nhưng lại phụ thuộc nhiều vào dung môi trích ly [70]. Cơ

106

chế tác dụng của sóng siêu âm đến quá trình trích ly rutin nói riêng, trong trích ly

nói chung có thể được giải thích như sau:

Khi truyền sóng siêu âm có cường độ lớn vào trong chất lỏng, chúng sẽ tạo ra

các vùng nén dãn liên tiếp làm xuất hiện tính chất bất đồng nhất về mật độ khối

lượng trong môi trường. Khi cường độ sóng siêu âm đủ lớn, tính bất đồng nhất ấy

càng trở nên rõ rệt. Kết quả là ở vùng nén áp suất tăng lên rất cao, ở vùng dãn áp

suất giảm đi đáng kể đến mức nhỏ hơn áp suất khí quyển nên hình thành một vùng

áp suất âm. Do đó dưới tác dụng của sóng siêu âm cường độ lớn, chất lỏng dường

như bị xé ra, bị căng ra làm chúng trở thành môi trường không liên tục. Nơi bị xé ra

lập tức hình thành các túi khí chứa không khí và hơi nước bão hoà gọi là các lỗ

hổng. Các túi khí này đầu tiên là các bọt khí có kích thước nhỏ sau đó tăng lên rất

nhanh và do sự chênh lệch áp suất, túi khí này bị vỡ tung ra, chất lỏng lấp lại lỗ

hổng đó. Do đó nó tăng cường rất mạnh quá trình khuyếch tán rutin từ nụ hoè vào

dung môi. Tuy nhiên trong quá trình siêu âm, sử dụng các dung môi chứa nước sẽ

tạo thành các gốc tự do “insonation” của dung môi, các gốc này ảnh hưởng đến

rutin làm hạn chế quá trình trích ly.

3.2.2. Lựa chọn dung môi và công nghệ trích ly

Qua kết quả khảo sát thực hiện ở mục 3.2.1, kết quả quá trình trích ly rutin bằng

các dung môi khác nhau với các điều kiện phù hợp trong khoảng nghiên cứu được

tổng kết trên bảng 3.33.

Như vậy quá trình trích ly rutin phụ thuộc rất lớn vào các dung môi. Trong những

khảo sát trên cho thấy dung môi (nước vôi + borax 4%o) cho hiệu quả kinh tế cao

nhưng nước thải ảnh hưởng đến môi sinh rất lớn. Metanol là một dung môi trích ly

hiệu quả không chỉ cả về kinh tế lẫn kỹ thuật (hiệu suất trích 91,5%). Mặc dù là một

loại dung môi ảnh hưởng đến đường hô hấp nhưng hoàn toàn có thể khắc phục bằng

cách sử dụng các thiết bị kín, dây chuyền công nghệ khép kín. Do đó quá trình trích

ly rutin dùng metanol sẽ được nghiên cứu trên hai mô hình dễ triển khai trong công

nghiệp là mô hình khuấy trộn và siêu âm.

107

Bảng 3.33: Kết quả tổng kết các quá trình trích ly rutin

PP trích Dung môi và điều kiện

Htn (%) HLth (%) 82,68 58,41

Trích ly ở T0 cao 67,29 56,77 Nước; τ= 40phút, Kv = 20, T0 = 1260C Nước kiềm; τ = 40phút, Kv = 20ml/g, T0 = 1260C

51,19 71,61

74,70 72,61

Trích ly trong lò vi sóng Nước; τ = 4phút, Kv = 20ml/g, T0 = 1000C Ngâm trích ở T0 thường NaOH; CNaOH = 20%, τ = 3h, pH (dịch lọc) = 3 Trích ly ở T0 thường với Nước vôi + borax 4%o; 93,12 80,33 dung môi chuyển động τ = 3,5h, pH = 4

52,16 71.2 Trích ly ở nhiệt độ sôi Etanol; Cetanol = 70% Kv= 20 ml/g, τ = 40phút

dung môi Etanol- siêu âm 64,83 73,03 CEtanol = 70%, Kv = 20 ml/g, τ = 30phút

Trích ly siêu âm 91,5 80,31 Metanol, Kv = 20ml/g, τ = 2,5h, 35kHz

3.2.3. Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin có trợ giúp khuấy trộn

3.2.3.1. Tối ưu hóa quá trình trích ly rutin

a. Xây dựng quy hoạch thực nghiệm để giải bài toán trích ly

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly rutin (tùy theo phương pháp)

bao gồm: nồng độ dung môi, nhiệt độ, kích thước nguyên liệu, thời gian trích ly, tỷ

lệ dung môi/nguyên liệu, tốc độ khuấy trộn,.... Với quá trình trích ly rutin từ nụ hòe

có trợ giúp khuấy trộn thì hiệu suất trích ly (hay lượng rutin trích ly) phụ thuộc chủ

yếu và ba yếu tố: thời gian trích ly, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và tốc độ khuấy. Chọn quá trình trích ly rutin từ nụ hòe xay2 có sự trợ giúp của khuấy trộn thực hiện

ở nhiệt độ phòng, dung môi metanol 98%. Quá trình trích ly được nghiên cứu trong

120

điều kiện trên với phạm vi biến đổi sau: Thời gian trích ly: z1 = 60-180 phút;

1 =Δz

0 1 =z

phút; phút. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu: z2 = 10-20 ml/g;

0 2 =z

2 =Δz

100

300

ml/g; ml/g. Tốc độ khuấy: 200-400vòng/phút; z3 =

0 3 =z

2 =Δz

vòng/phút; vòng/phút. Kế hoạch thực nghiệm bậc một hai mức

tối ưu trình bày trên bảng 3.34.

108

Bảng 3.34: Kế hoạch thực nghiệm bậc một hai mức tối ưu

Biến mã Biến thực

N0 x1 x2 x3 z1 (phút) z3 (vòng/phút)

- + - + - + - + - - + + - - + + - - - - + + + + z2 (ml/g) 10 10 20 20 10 10 20 20 60 180 60 180 60 180 60 180 200 200 200 200 400 400 400 400

0 0 0 120 15 300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

b. Xây dựng thuật toán tính toán tối ưu quá trình trích ly rutin

Bắt đầu

Nhập p, y, y0

Quy hoạch bâc 1

Sai Quy hoạch bậc 2 f < f(p,f2,f1)

f < f(p,f2,f1)

Đúng Sai

Đúng

Phương trình hồi quy

Cực trị ràng buộc

Điểm tối ưu

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ khối tính toán tối ưu quá trình trích ly rutin

Kết thúc 109

Áp dụng phương pháp thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm. Sơ đồ khối quá

trình tính toán được trình bày trên sơ đồ 3.3.

c/ Xây dựng phần mềm cho bài toán trích ly

Phần mềm được xây dựng với 3 tham số chính là x1, x2, x3 trong phương trình hồi

quy. Hàm mục tiêu xây dựng chính là hiệu suất trích ly (hoặc lượng rutin trích ly)

đạt cao nhất [3, 46]. Trên cơ sở sơ đồ 3.3, bằng lập trình Matlab đã xây dựng thành

công chương trình quy hoạch thực nghiệm (tuyến tính, phi tuyến) tối ưu hóa 3, 4

biến hai mức tối ưu (trình bày trong phụ lục D).

3.2.3.2. Áp dụng tìm điều kiện tối ưu quá trình trích ly rutin có khuấy trộn

Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch bậc một hai mức tối ưu cho ở bảng 3.35.

Bảng 3.35: Kết quả quy hoạch thực nghiệm trích ly rutin có khuấy trộn

z1 z2 z3 q0.10-3 Ctính HLth qtn.10-3 Htn TT C (g/l) Speak (ml/g) (v/phút) (%) (%) (phút) (kg) (mg/l) (kg)

60 2,329 0,0012 23595219 0,692 57,65 1,343 43,52 1 10 180 3,797 0,0013 31786400 0,932 71,69 2,722 88,21 2 200 60 3,379 0,0015 35785562 1,049 69,94 2,364 76,60 3 20 180 3,966 0,0020 47599011 1,396 69,78 2,768 89,69 4

60 2,042 0,0018 29596623 0,868 48,21 0,985 31,91 5 10 180 2,017 0,0017 27079403 0,794 46,70 0,942 30,53 6 400 60 2,114 0,0015 36381675 1,067 71,11 1,503 48,72 7 20 180 2,655 0,0012 28796448 0,844 70,35 1,868 60,53 8

2,434 0,0014 24586528 0,721 51,49 1,253 40,61 9

2,597 0,0012 24971184 0,732 61,01 1,584 51,34 10 120 15 300

2,538 0,0016 29476357 0,864 54,01 1,371 44,43 11

Phương trình hồi quy thực nghiệm của lượng rutin trích ly tương hợp với bức

^ Y

516,2

364,0

434

676

−

x 1

tranh thực nghiệm tìm được là:

(3.7)

110

Phương trình hồi quy thực nghiệm của hiệu suất trích ly rutin tương hợp với bức

^ Y

71,58

53,8

17,10

79,15

−

x 1

tranh thực nghiệm tìm được là:

(3.8)

Thông số tối ưu cho quá trình trích ly rutin tìm được là: thời gian trích ly 180

(phút), tỷ lệ lỏng/rắn là 20 (ml/g), tốc độ khuấy 200 (vòng/phút). Hiệu suất đạt

93,202 (%).

Phương trình hồi quy (3.8) cho thấy các thông số ảnh hưởng độc lập với nhau

trong quá trình trích ly, hằng số tự do b0 = 58,71 chứng tỏ còn nhiều yếu tố ảnh

hưởng tới quá trình trích ly ngoài 3 yếu tố khảo sát chính. Phương trình cho thấy:

- Hiệu suất trích ly tỷ lệ thuận với lượng dung môi. Lượng dung môi càng lớn thì

động lực của quá trình chuyển khối càng lớn, làm tăng quá trình khuếch tán đối lưu

và khuếch phân tử của rutin từ nguyên liệu vào dung môi.

- Hiệu suất trích ly tỷ lệ thuận với thời gian trích ly: quá trình phá vỡ màng tế bào

và khuếch tán rutin cần một thời gian đủ lớn nên thời gian càng lâu thì lượng rutin

từ nguyên liệu khuếch tán vào dung môi càng lớn.

- Trong phương trình hồi quy tìm được, hiệu suất trích ly tỷ lệ nghịch với tốc độ

khuấy. Việc tăng tốc độ khuấy lại làm giảm lượng rutin trích ly được do: dung môi

trích ly là chất dễ bay hơi. Tăng tốc độ khuấy làm tăng quá trình khuếch tán đối lưu

của rutin nhưng cũng làm tăng lượng dung môi bay hơi nên quá trình trích ly nhanh

đạt trạng thái bão hòa. Tuy nhiên tốc độ khuấy thấp quá lại làm chậm quá trình

khuếch tán đối lưu của rutin. Vậy tốc độ khuấy trộn cần đạt một giá trị thích hợp,

kết quả 200 (vòng/phút) là giá trị hợp lý.

Khảo sát lại điểm tối ưu bằng cách tiến hành lặp lại 3 thí nghiệm trích ly rutin

tại τ = 180 phút ; Kv= 20 ml/g ; V = 200 vòng/phút. Ở các điều kiện này hiệu suất

trích ly trung bình đạt được là 92,02%, hàm lượng rutin xấp xỉ 70%.

3.2.4. Nghiên cứu công nghệ trích ly rutin có trợ giúp siêu âm

Trong nghiên cứu này, các thông số thực nghiệm được khảo sát là tần số siêu âm,

công suất âm, thời gian trích ly, Kv và độ mịn của nguyên liệu.

111

3.2.4.1. So sánh quá trình trích ly rutin siêu âm và khuấy trộn

Mẫu hòe xay2 sau xử lý được trích ly trong bể rửa siêu âm LC 60H (35kHz) với

dung môi trích là metanol, Kv = 15,836kg/kg theo các thời gian trích ly khác nhau.

Trích ly ở điều kiện tương tự nhưng có trợ giúp của khuấy trộn ở tốc độ 200

vòng/phút, kết quả hai mẻ thí nghiệm được mô tả trên bảng 3.36, hình 3.19. Kết quả

bảng 3.36 cho thấy: ở cùng thời gian trích ly, lượng rutin trích được trong quá trình

trích ly có trợ giúp của siêu âm (35kHz, công suất âm 300Weff/600Wpeak) hiệu quả

hơn trợ giúp khuấy trộn (200vòng/phút).

Bảng 3.36: Kết quả trích ly rutin sử dụng siêu âm và khuấy trộn

τ q0.10-3 Cpha Ctính HLth qtn.10-3 Htn PP trích ly Speak (phút) (kg) (mg/ml) (mg/ml) (kg) (%) (%)

2,665 2,020 72442072 1,222 60,51 1,613 52,27 30

3,199 1,500 57118492 0,964 64,25 2,056 66,62 35

3,595 1,910 64158536 1,328 69,52 2,499 81,00 60 Siêu

3,966 1,150 23970363 0,808 70,28 2,787 90,33 120 âm

(35kHz) 4,483 1,120 28728820 0,726 64,79 2,905 94,13 180

4,462 1,120 28887106 0,730 65,21 2,910 94,30 240

4,460 1,820 42177706 1,187 65,20 2,908 94,24 270

1,909 3,510 54054494 2,754 78,45 1,498 48,54 30

3,020 1,550 19875113 1,012 65,32 1,973 63,94 35

3,379 1,390 29268170 0,972 69,94 2,364 76,60 60 Khuấy

trộn (200 3,702 1,040 22549253 0,688 66,11 2,447 79,31 120

vòng/phút) 3,966 1,410 31148552 0,984 69,78 2,768 89,69 180

3,988 1,150 24119140 0,801 69,65 2,777 90,01 240

*: Số liệu trích một phần từ bảng 3.35

3,986 1,950 44582186 1,359 69,71 2,779 90,05 270

Ở thời điểm đầu của quá trình trích ly (0-60 phút), hiệu quả của siêu âm hơn

khuấy trộn không đáng kể, từ 60 phút đến 270 phút siêu âm hơn hẳn khuấy trộn. Để

112

siêu âm-35kHz

3,0

đạt hiệu suất ≈ 90%, trích ly siêu âm

Kh-200vong/phut

2,5

mất 120phút trong khi đó trích ly

2,0

) g k ( 3 - 0 1 . n t q

khuấy trộn mất 240phút. Thời điểm

1,5

pha trích bắt đầu đạt bão hòa đối với

1,0

0,5

trích ly siêu âm là 180 phút, trích ly

khuấy trộn là 240 phút. Như vậy

0,0 0

50 100 150 200 250 Thoi gian(phut)

trích ly dùng siêu âm tiết kiệm thời

gian so với dùng khuấy trộn.

3.2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh Hình 3.19: Ảnh hưởng của siêu âm và

hưởng đến trích ly siêu âm khuấy trộn đến quá trình trích ly

a. Ảnh hưởng của độ mịn nguyên liệu

Ba mẫu hạt hòe sau xử lý có phân bố kích thước theo bảng 3.3 được trích ly

trong bể siêu âm (đầu phát siêu âm I5GE039, tần số 25kHz), dung môi metanol, Kv

= 20 ml/g, thời gian trích ly 20 phút. Kết quả được trình bày trên bảng 3.37.

Bảng 3.37: Ảnh hưởng của độ mịn nguyên liệu đến quá trình trích ly rutin

ST PP làm q0.10-3 Cpha Ctính HLth qtn.10-3 Htn Speak (%) (kg) (mg/ml) (mg/ml) (kg) (%) T nhỏ

1 Nghiền 4,030 0,815 16829346 0,576 70,71 2,849 92,34

2 3,717 0,896 19643521 0,673 75,14 2,793 90,52

3 Xay2 Xay1 3,296 0,740 17485769 0,599 80,93 2,668 86,46

Kết quả cho thấy tại cùng một điều kiện trích ly thì qtn(hạt nghiền) >qtn(hạt xay2) >qtn(hạt xay1). Như vậy hiệu suất trích ly rutin tăng khi độ mịn nguyên liệu tăng, hiệu suất đạt được trong quá trình trích ly hạt hòe nghiền, xay2, xay1 tương ứng là 92,34%; 90,52%; 86,46%. Với phương pháp xay, kích thước hạt xay2 nhỏ hơn kích thước hạt xay1 nên hiệu suất trích ly cao hơn. Tuy nhiên với nguyên liệu càng mịn,

ngoài rutin thì nhiều tạp chất sẽ được hòa tan tốt hơn nên độ tinh khiết của rutin sẽ

giảm. Ngược lại sự tăng hiệu suất thì hàm lượng rutin: HLrut. (hạt nghiền) < HLrut. (hạt xay2) < HLrut. (hạt xay1). Để cân đối giữa tiêu chí hàm lượng và hiệu suất cũng

113

như sự thuận lợi cho quá trình lọc, phương pháp xay đến phân bố kích thước xay2 là

phương pháp chia nhỏ nguyên liệu phù hợp hơn đối với quá trình trích ly này.

b/ Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (Kv)

Mẫu hòe xay2 sau xử lý được trích ly trong bể rửa siêu âm TPC-280 (30kHz), với

dung môi metanol trong thời gian 20phút ở các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu thay đổi (Kv= 10, 15, 20, 25, 30 (ml/g)). Vì tỷ trọng của metanol d = 791,8kg/m3 nên

Kv(kg/kg) được chuyển đổi trên bảng 3.38.

Bảng 3.38. Kết quả tính toán Kv (với mHòe = 0,01kg)

10 15 20 25 30 Kv (ml/g)

100 150 200 250 300

79,18 118,77 158,36 197,95 237,54 Vdm (ml) mdm.10-3 (kg)

7,918 11,877 15,836 19,795 23,754 Kv (kg/kg)

Ảnh hưởng của Kv đến trình trích ly rutin bày trong bảng 3.39. Ở các điều kiện

nghiên cứu trên trong khoảng Kv = 7,918 ÷ 23,754kg/kg, hiệu suất trích ly tăng khi

Kv tăng (đạt cao nhất 97,11% với Kv = 23,754kg/kg). Trên bảng 3.39 cho thấy: khi

Kv = 15,836 ÷ 23,754kg/kg thì lượng rutin trích ly được tăng không đáng kể nên

khoảng này được chọn để khảo sát mô hình động học và Kv = 15,836kg/kg được lựa

.10-3

chọn cố định cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.39: Kết quả trích ly rutin khi Kv thay đổi q0.10-3 HLth Ctính Cpha qtn Kv Htn STT Speak-rut. (kg/kg) (kg) (mg/ml) (mg/ml) (kg) (%) (%)

1 7,918 4,441 0,730 12136223 0,417 57,07 2,534 82,13

2 11,877 4,805 1,000 16657453 0,569 56,92 2,735 88,64

3 15,836 5,255 1,020 16813344 0,574 56,26 2,956 95,81

4 19,795 5,387 1,170 18759601 0,644 55,01 2,963 96,03

5 23,754 5,432 1,570 14985637 0,866 55,16 2,996 97,11

c/ Ảnh hưởng của công suất âm và tần số siêu âm

114

τ Tần số Bảng 3.40: Hiệu suất trích ly và hàm lượng rutin ở tần số 25kHz và 30kHz qtn.10-3 q0.10-3 HLth Speak Ctính Cpha Htn (%)

(phút) (kg) (mg/ml) (mg/ml) (kg) (%)

5 2,548 0,860 17658752 0,605 70,30 1,792 58,06

10 3,689 0,720 11874763 0,407 56,46 2,083 67,50

15 4,428 1,320 21547890 0,738 55,89 2,475 80,21

20 25kHz 5,277 1,210 18654398 0,639 52,78 2,785 90,26

25 5,677 1,280 18674293 0,639 49,95 2,836 91,90

30 6,013 1,350 19057328 0,652 48,33 2,906 94,18

35 6,048 1,450 20352718 0,697 48,05 2,906 94,18

5 3,430 0,870 15834721 0,542 62,31 2,137 69,27

10 4,081 1,170 20725480 0,710 60,65 2,475 80,21

15 4,979 0,840 14091545 0,482 57,43 2,860 92,67

20 30kHz 5,255 1,140 18644612 0,638 55,99 2,942 95,35

25 5,404 1,100 17654721 0,604 54,95 2,969 96,23

30 5,646 1,329 20136715 0,693 52,18 2,949 95,48

35 5,941 1,080 15748624 0,539 49,92 2,966 96,12

Mẫu hòe xay2 sau xử lý được trích ly siêu âm trong TPC-280 (30kHz), I5GE039

(25kHz), dung môi metanol với Kv = 15,836kg/kg ở các thời gian trích ly 5, 10, 15,

20, 25, 30 và 35 phút. Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng 3.40.

Hiệu suất trích ly (30kHz) > hiệu suất trích ly (25kHz) nhưng hàm lượng rutin

(30kHz) < hàm lượng rutin (25kHz). Quá trình trích ly bằng siêu âm (30kHz) trong

khoảng 25 phút hiệu suất đã đạt 96,23%. Độ tinh khiết của rutin cũng phụ thuộc vào

tần số siêu âm, công suất âm, nhìn chung bị giảm khi tăng thời gian trích ly.

Như vậy với tần số siêu âm lớn, năng lượng sóng siêu âm lớn, khả năng khuếch

tán các chất từ nguyên liệu vào dung môi tăng. Cùng với sự tăng của lượng rutin

hòa tan thì quá trình hoà tan các tạp chất vào pha trích cũng tăng dẫn tới hàm lượng

115

rutin thô giảm. Hàm lượng rutin trong các nghiên cứu trích ly siêu âm đã khảo sát là

55-70%.

3.2.5. Xây dựng mô hình động học và xác định các thông số của mô hình cho

quá trình trích ly rutin

Trong quá trình trích ly rutin, một số yếu tố có khả năng làm phân huỷ rutin:

dung môi là kiềm đặc kèm theo nhiệt độ cao, ánh sáng, có enzym phân hủy rutin

trong dung dịch trích ly, nhiệt độ trích ly quá cao, ... Tuy nhiên thực nghiệm tiến

hành trích ly rutin trong các dung môi cồn rượu, kiềm loãng, kiềm đặc ở nhiệt độ

thường; bình trích ly tối màu; nhiệt độ phòng nên sự phân hủy của rutin trong quá

trình này không đáng kể: coi q2=0, do đó q=q1. Mô hình toán học của quá trình trích

−

ly rutin với sự trợ giúp của sóng siêu âm từ (2.27) trở thành dạng (3.9):

dq dt

KK + cb v mK v

⎡ KKmKK ⎢ ⎣

⎤ ⎥ ⎦

(3.9)

dq dt

1 +

mKKK v cb KK 1 cb

(3.10) Tại trạng thái cân bằng: nên

t − T

Kq =

−

Giải phương trình vi phân (3.8) ta có nghiệm tổng quát của phương trình thể hiện

⎛ ⎜ ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

(3.11) quan hệ lượng rutin trích ly được theo thời gian là:

11+

KK cb KK cb

K KK cb

1 KK tl

(3.12) ; Trong đó:

(2 KKKK

−

Ứng với mỗi tỷ lệ dung môi Kv, hiệu suất trích ly tối đa đạt được là:

100

−

v +

KK cb KK cb

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

⎛ ⎜ ⎜ ⎝

(3.13)

3.2.5.1. Mô hình động học của quá trình trích ly siêu âm rutin

a/ Xây dựng mô hình trích ly siêu âm ở tần số 30kHz

Với 0,01kg hạt hòe xay2, xây dựng mô hình từ kết quả thực nghiệm Kv = 15,836 kg/kg và 7,918 kg/kg ở 250C sau đó kiểm chứng mô hình ở Kv = 11,877kg/kg.

116

* Thực nghiệm với Kv= 15,836 kg/kg

Bảng 3.41: Kết quả quá trình trích ly rutin ở Kv=15,836kg/kg

0 5 10 15 20 25 30 35

0 2,137 2,949 2,966 2,475 2,860 2,969 t (phút) qtn.10-3 (kg)

2,942 * số liệu trích từ bảng 3.39 Xác định được các tham số K = 2,957.10-3 kg; T = 4,597phút; sai số lớn nhất là

8,3%. Thay số vào (3.12) ta có các phương

kHz

−

10.957,2

01,0

trình:

cb 30

836,15 K

836,15

+kHz

597,4

836,15 30

kHz

1 kHz

836,15

(3.14)

(3.15)

* Thực nghiệm với Kv= 7,918 kg/kg

kHz

−

Lượng rutin trong dung dịch khi nồng độ đạt bão hòa là 2,530.10-3 kg, nên K = 2,530.10-3 kg. Ta có phương trình tương ứng Hình 3.20: Đồ thị qtn và qlt ở Kv =

10.530,2

01,0

K 1

cb 30

918,7 K

918,7

+kHz

kHz

15,836kg/kg, 30kHz (SSmax = 8,3%) là: (3.16)

cbK 30 = 0,311 (kg hạt hòe/kg dung môi)

⇒ K1 = 0,3557 hay hàm lượng rutin ban đầu trong pha rắn là 35,57%. Đây là hàm

Lấy phương trình (3.14)/(3.16) ta có

lượng rutin trong nụ hòe TB tính được từ mô hình. Sai số của giá trị K1 tính theo mô

kHz

hình và thực nghiệm (35,20% - bảng 3.14) là 1,05%.

= 0,581 (phút-1); Với các thông số mô hình đã xác định

(3.15) ⇒

được, ta dựng được đồ thị so sánh giữa lượng rutin trích ly thực nghiệm (qtn) và

theo mô phỏng (qlt) ở Kv = 15,836kg/kg, tần số 30kHz trên hình 3.20.

* Thí nghiệm kiểm chứng mô hình với Kv = 11,877kg/kg

117

Thay Kv=11,877kg/kg vào mô hình tìm được các tham số K = 2,799.10-3kg; T =

4,352 phút, tính được qlt (bảng 3.42) và dựng được đồ thị giữa qtn và qlt (hình 3.21).

Bảng 3.42: Kết quả kiểm chứng mô hình ở Kv = 11,877kg/kg

0 t (phút) 5 10 12 15 20 25 30 35

2,610 2,718 2,731 2,735 2,851 2,829 2,861

2,518 2,621 2,710 2,771 2,790 2,796 2,798 2 8 qtn.10-3 (kg) 0 1,067 1,872 2,462 qlt.10-3 (kg) 0 1,031 1,912 2,354

Các kết quả cho thấy mô hình phù hợp với thực nghiệm. Mô hình trích ly rutin từ

hạt hòe xay2 (khối lượng m) có tác

động siêu âm ở nhiệt độ thường, tần

số 30kHz với tỷ lệ dung môi bất kỳ

− 30

t kHz

kHz

Kq =

−

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

⎛ ⎜ ⎜ ⎝

kHz

3557

được viết theo dạng (3.10):

311,0 K

311,0

v +

Với:

kHz

(3.17)

311,0(581,0

(3.18)

Hình 3.21: Kiểm chứng mô hình ở Kv = Trong đó m, Kv là khối lượng nụ hòe 11,877 kg/kg, 30kHz ( SSmax = 4,4%) và tỷ lệ dung môi/nụ hòe (kg/kg).

Trường hợp khi Kv vô cùng lớn, các giá trị K và T trên (3.17) và (3.18) đạt cực đại

tương ứng bằng 0,3557 (kg) và 5,53 (phút). Hiệu suất trích ly rutin ở 250C, tần số

(%)

100

311,0 K

311,0

v +

30kHz xác định từ tỷ lệ dung môi Kv sẽ là:

(3.19)

b/ Đánh giá ảnh hưởng của bề mặt tiếp xúc pha đến Ktl

S riêng π=

- Giả thiết hạt nghiền, xay2, xay1 đều có dạng hình cầu với (3.20)

2 =

6 d ρ

- Trong trường hợp khuấy trộn mạnh (3.21)

118

Diện tích bề mặt riêng pha rắn (trên cơ sở phân bố của các kích thước hạt) được

trình bày trên bảng 3.43.

0,15-0,3 0,08-0,1 0,1-0,15 <0,08 0,3-1 >1 Bảng 3.43: Diện tích bề mặt riêng của tập hợp hạt theo phân bố (i=1÷6) d.10-3 (m) Tập

tb.10-3 (m)

0,08 0,09 0,13 0,23 0,65 1 di hợp

2 (m2/kg)

hạt 65,732 58,428 42,068 22,863 8,090 5,259 Ki

Phân bố trong 1kg hạt 0,002 0,125 0,246 0,414 0,208 0,005

2.phân bố (m2/kg)

Nghiền Kni 0,151 7,280 10,357 9,475 1,679 0,026

(m2/kg)

Kn 28,968

Phân bố trong 1kg hạt 0,006 0,027 0,080 0,480 0,407 0

2.phân bố (m2/kg)

Xay1 Kx1i 0,345 1,136 1,826 3,882 2,142 0

(m2/kg) 2

Kx1 9,331

Phân bố trong 1kg hạt 0,101 0,115 0,210 0,536 0,038 0

2.phân bố (m2/kg)

Xay2 Kx2i 5,907 4,829 4,807 4,338 0,198 0

(m2/kg) 2

Kx2 20,079

2 = 28,968(m2/kg); Kx1

2 = = 20,079(m2/kg). Mặt khác từ kết quả thông số mô hình trích ly

Thực nghiệm đã xác định được khối lượng riêng của hạt ướt trung bình bằng tính được: Kn

kHz

ρ=1141(kg/m3) (bảng 3.4) nên 9,331(m2/kg); Kx2 2

029

=kHz

= 0,581 (phút-1) nên ở tần số 30kHz – mục 3.2.5.1-a đã xác định được

tlK

(kg/m2phút).

c/ Đánh giá ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

Từ mô hình trích ly ở tần số 30kHz đã thiết lập ở mục 3.2.5.1-a và kết quả khảo

sát mô hình ở các Kv khác nhau (bảng 3.44), quá trình trích ly rutin ở các Kv tính

theo mô hình và thực nghiệm trình bày trong đồ thị hình 3.20-3.21.

119

kHz

Bảng 3.44: Ảnh hưởng của Kv đến quá trình trích ly rutin ở 30kHz

vK 30

kHz

(kg/kg) 7,918 11,877 15,836 19,795 23,754

tnq 30

kHz

.10-3 (kg) 2,534 2,735 2,956 2,963 2,996

K 30

kHz

2,530 2,799 2,957 3,060 3,133 (kg)

T 30

kHz

3,93 4,36 4,60 4,76 4,87 (phút)

ltq 30

.10-3 (kg) 2,514 2,771 2,918 3,014 3,081

kHz

SS (%) 0,8 1,3 1,3 1,7 2,8

tnH 30

kHz

(%) 82,12 88,64 95,80 96,03 97,10

ltH 30

* số liệu trích từ bảng 3.38

(%) 80,63 88,87 93,60 96,67 98,82

Hình 3.22: Ảnh hưởng của Kv đến quá Hình 3.23: Đồ thị của qtn và qlt theo

trình trích ly siêu âm ở 30kHz thời gian ở các Kv (30kHz)

Đồ thị hình 3.22 - 3.23 cho thấy lượng rutin trích ly được tăng khi Kv tăng trong

khoảng khảo sát 7,918÷15,836 (kg/kg). Tuy nhiên trong khoảng Kv = 15,836

÷23,754 (kg/kg), hiệu suất trích ly rutin tăng không đáng kể. Xét tại Kv =

15,836kg/kg và Kv = 19,795 (kg/kg), khi Kv tăng 1,25 lần, hiệu suất trích ly tăng

0,24%. Nếu tăng Kv sẽ tiêu tốn dung môi và không kinh tế về mặt thiết bị nên lựa

chọn Kv = 15,836 (kg/kg) là tỷ lệ lỏng/rắn phù hợp cho quá trình trích ly này. Mặt

120

khác, bảng 3.44 cho thấy sai số thấp nhất giữa qtn và qlt là 0,8% ở Kv = 7,918 ÷

15,836 (kg/kg) (trong khoảng xây dựng mô hình trích ly). Do ngoại suy mô hình ở

Kv = 19,795 và 23,754(kg/kg) nên sai số giữa thực nghiệm và mô hình có giá trị cao

hơn, sai số cao nhất tại Kv = 23,754(kg/kg) là 2,8%.

d/ Đánh giá ảnh hưởng của công suất âm và tần số trong trích ly siêu âm

Trên cơ sở kết quả trích ly rutin

theo thời gian (bảng 3.45), dựng

được đồ thị hình 3.24. Từ đồ thị

hình 3.24 cho thấy:

- Lượng rutin trích ly được tăng

mạnh trong giai đoạn đầu của quá

trình trích ly sau đó giảm dần và

đạt bão hòa.

- Ở cùng một thời gian trích ly trên

hai thiết bị siêu âm có cùng công

suất âm thì hiệu quả trích ly rutin ở

tần số cao tốt hơn tần số thấp (trích Hình 3.24: Đồ thị q = f(ln(t)) ở Kv=15,836 (kg/kg) tại 35kHz, 25kHz, 30kHz ly dùng TPC-280, 30kHz tốt hơn

trích ly dùng I5GE039, 25kHz). Trích ly ở tần số cao hơn, quá trình bão hòa xảy ra

sớm hơn. Tại Kv = 15,836 (kg/kg), thời điểm quá trình trích ly bắt đầu bão hòa ở tần

số 25kHz là 30 phút và 30kHz là 25phút.

- Hiệu quả trích ly phụ thuộc vào công suất âm thiết bị, so sánh kết quả trích ly

trong I5GE039, TPC-280 và LC 60H thì hiệu quả trích ly trong LC 60H thấp hơn

nhiều so với trích ly trong I5GE039 và TPC-280. Dù thiết bị LC 60H có tần số cao

hơn (35kHz) nhưng công suất âm thấp dẫn đến hiệu quả trích ly kém hơn. Tại Kv =

15,836 (kg/kg), thời điểm quá trình trích ly bắt đầu bão hòa trong LC 60H là

180phút.

121

Bảng 3.45: Lượng rutin trích ly theo thực nghiệm và mô hình

I5GE039 (tần số 25kHz, TPC-280 (tần số 30kHz, LC 60H (tần số 35kHz,

300Weff/600Wpeak) 400Weff/800Wpeak) 400Weff/800Wpeak) t

(phút) SS qtn 35kHz .10-3 qlt 35kHz .10-3 SS (%) qtn 25kHz .10-3 qlt 25kHz .10-3 qtn 35kHz .10-3 qlt 35kHz .10-3 SS (%) (%) (kg) (kg) (kg) (kg) (kg) (kg)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

5 - - 1,612 1,503 2,137 1,960 6,7 8,3

10 - - 2,198 2,23 2,475 2,621 1,5 5,9

15 - - 2,475 2,582 2,86 2,843 4,3 0,6

20 - - 2,785 2,752 2,942 2,918 1,2 0,8

25 - - 2,836 2,834 2,969 2,944 0,1 0,9

30 1,613 1,676 3,9 2,916 2,874 2,949 2,952 1,4 0,1

2,966 2,955 0,37 35 1,856 1,840 0,9 2,906 2,893 0,4

60 2,499 2,386 4,5 - - - -

120 2,787 2,813 0,9 - - - -

180 2,905 2,890 0,4 - - - -

240 2,910 2,904 0,2 - - - -

* Số liệu được trích lược từ bảng 3.39 và bảng 3.40

270 2,908 2,905 0,1 - - - -

e/ Tính các thông số mô hình trích ly siêu âm ở các tần số 35kHz, 25kHz

Bảng 3.46: KX và TX của mô hình trích ly hạt xay2 ở 35Hz, 30kHz, 25kHz

35kHz 2,907.10-3 25kHz 2,911.10-3 30kHz 2,957.10-3

KX (kg) TX (phút) 34,904 6,882 4,597

Gọi KX, TX là các giá trị K và T xác định được từ thực nghiệm trích ly rutin từ hạt xay2 ở Kv = 15,836 (kg/kg) với X là các quá trình trích ly ở 35kHz, 25kHz, 30kHz.

122

kHz

Từ các kết quả thực nghiệm trên bảng 3.39 và bảng 3.40, hoàn toàn xác định được các tham số KX và TX. Số liệu được tổng kết trên bảng 3.46.

kHz

Kết quả cho thấy: ; Mặt khác ta có:

K 30

836,15( kHz

kHz

K K

30 K cb 836,15( K

)1 )1

+ +

X cb 30 cb

X cb

kHz

(

836,15)(

(3.22)

kHz

T 30

836,15)(

tl X KK ( tl

30 cb X cb

kHz

(3.23)

T 30

kHz

tl K

30 cb X cb

(3.24) Từ (3.22) và (3.23) Ta có:

Bảng 3.47: Các thông số và mô hình trích ly siêu âm hạt hòe xay2

30kHz 35kHz 25kHz

cbK

(kg/kg) 0,311 0,282 0,284

(phút-1)

X tl K .

0,581 0,082 0,419

0,029 0,004 0,021

tlK (kg/m2phút) 2 (m2/kg) Kx2

−

t − 882 ,6

t − 597 ,4

t − 904 ,34

907,2

10.

911,2

10.

957,2

10.

−

⎛ ⎜ 3 1 ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

20,079

028

146,0

218

,81

704

809,81

122,83

−− e

,0 −− e

Mô hình tại Kv = 15,836(kg/kg)

( 1

)t

( 1

)t

( 1

)t

t − T

Kq =

−

⎛ ⎜ ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

3557

311,0 K

311,0

v +

,0 284

284 K

v +

,0 282

282 K

v +

Mô hình phụ

K v 282

K v 284

,0(082,0

,0(419

311,0(581,0

thuộc vào Kv

cbK

Thay các giá trị KX và TX vào phương trình (3.22) và (3.24), tính được các

X tl K .

trình bày trong bảng 3.47 đối với mẫu hạt hòe xay2. Kết quả tính toán và

XK đều giảm khi tần số giảm và công suất âm giảm. Khi tần

và cho thấy cả

số và công suất âm giảm thì hiệu quả quá trình trích ly rutin cũng giảm theo.

123

Trong kết quả này, các giá trị Kcb tìm được đã phản ánh mức độ nhanh đạt bão

hòa của các quá trình trích ly (trích ly ở 30kHz đạt bão hòa sớm nhất). Bên cạnh đó

XK : LC 60H có công suất

kHz

004,0

=tl

thì ảnh hưởng của công suất âm thiết bị thể hiện rõ trên

kHz

K 25

021,0

=tl

kg.m-2.phút-1 và I5GE039 có công suất âm âm 300Weff/600Wpeak thì

kg.m-2.phút-1 tức tăng 5,25 lần. Đồ thị 400Weff/800Wpeak thì

hình 3.25 và hình 3.26 biểu diễn quan hệ qtn và qlt ở tần số 35kHz, 25kHz.

Hình 3.25: Đồ thị so sánh qtn và qlt ở Kv Hình 3.26: Đồ thị so sánh qtn và qlt ở Kv

= 15,836kg/kg, 35kHz (SSmax = 4,5%) = 15,836kg/kg, 25kHz (SSmax = 6,7%)

f/ Tính toán quá trình trích ly (25kHz) các tập hợp hạt hòe nghiền, xay1,2

Giả thiết tác động của sóng siêu âm tần số 25kHz lên các hạt nghiền, xay2, xay1

là như nhau và các quá trình trích ly có Htd xác định. Quá trình trích ly hạt xay2 ở 25kHz = 0,021 (kg/m2phút),

−

tần số 25kHz, Kv = 15,836kg/kg đã xác định được: Ktl K25kHz = 2,911.10-3 kg với hiệu suất trích ly tối đa Htd = 94,34%. Từ (3.10) ta có:

1ln(

)

−

)

1ln(

−

q K

t H H

(3.25) hay có thể được viết là: (3.26)

−

1 K

1 KTK tl

Từ (3.12) ta cũng có: (3.27)

trích ly hạt Áp dụng (3.26) và (3.27) tính các giá trị T, Kcb của các quá trình

nghiền, xay1:

124

−

190,5

n tn

1ln(

)

−

1ln(

)

−

20 9234 ,0 ,0 9434

20 H H

254

(

)

−

1 kHz 25

1 K

1 021

190,5

,0*

968,28*

1 836,15

−

x 1

056,8

(phút)

x tn

1ln(

)

−

1ln(

)

−

20 8646 ,0 ,0 9434

20 H H

1 x

570,0

(

)

−

1 25 kHz

056

,0*

331,9*

1 K

1 021

1 836,15

(phút)

Kết quả xác định các thông số của mô hình trình bày trên bảng 3.48.

Bảng 3.48: Các thông số và mô hình trích ly hạt nghiền, xay1,2 ở 25kHz

Hạt xay1 Các thông số Hạt nghiền Hạt xay2

0,023 0,065 0,1 dđạidiện.10-3 (m)

28,968 20,079 9,331 K2 (m2/kg)

5,190 T (phút) 6,882 8,056

0,254 0,284 0,570 Kcb (kg/kg)

2,849 K.10-3 (kg) 2,910 3,202

0,021 Ktl (kg/m2phút)

−

t − 190,5

t − 882 ,6

t − 056 ,8

849,2

10.

910,2

10.

202

10.

−

⎛ ⎜ 3 1 ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

⎛ ⎜ 3 1 ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

Mô hình tại

193,0

146,0

124,0

Kv =

,80

089

810,81

026,90

−− e

15,836(kg/kg)

( 1

)t

( 1

)t

( 1

)t

t − T

Kq =

−

⎛ ⎜ ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

3557

,0 254

254 K

570,0 K

570,0

,0 284

284 K

v +

Mô hình phụ

,0(608,0

K v 254

,0(422

K v 284

v 570,0(196,0

thuộc vào Kv

125

Kết quả các thông số của mô hình phản ánh thời gian để đạt bão hoà tỷ lệ nghịch

với bề mặt riêng pha rắn. Bề mặt riêng của pha rắn càng lớn thì thời gian cần thiết

để quá trình trích ly bão hoà càng nhỏ và ngược lại. Quá trình trích ly nhanh đạt bão hòa theo thứ tự: hạt nghiền, xay2 và hạt xay1. Khi kích thước hạt càng nhỏ thì Kcb

càng nhỏ, nếu dùng nguyên liệu có độ mịn cao thì không cần trợ giúp siêu âm.

Trong các nghiên cứu trên, do cách thức tiến hành thực nghiệm (mẫu và dung

môi được đặt trong bể siêu âm có nước) nên tác động của sóng siêu âm đến quá

trình trích ly chỉ là tác động gián tiếp. Sóng siêu âm được truyền trong môi trường

nước, qua môi trường thủy tinh, đến môi trường của dung môi (metanol) rồi mới

đến hạt hòe. Khi sóng siêu âm truyền tới mặt phân cách giữa hai môi trường có độ

trở kháng âm khác nhau, phần năng lượng của chùm tia siêu âm phản xạ trở về tỷ lệ

thuận với độ chênh lệch trở kháng giữa 2 môi trường gọi là hệ số phản xạ:

− +

( Z ( Z

) )

Z 1 Z 1

⎡ ⎢ ⎣

⎤ ⎥ ⎦

(3.28)

Gọi R1, R2, R3 lần lượt là hệ số phản xạ giữa môi trường nước và thủy tinh, thủy

tinh và dung môi, dung môi và nguyên liệu. Do đó độ truyền âm trong nguyên liệu

chỉ còn là: 100 – [ (R1 + R2 + R3).100], (%) (3.29)

Như vậy hiệu quả trích ly đã bị giảm rất nhiều lần so với quá trình trích ly trực

tiếp (dung môi và mẫu được đưa trực tiếp vào bể siêu âm).

3.2.5.2. Mô hình động học quá trình trích ly rutin có trợ giúp của sóng vi ba (lò vi

sóng) và khuấy trộn

a/ Mô hình động học quá trình trích ly rutin có trợ giúp của sóng vi ba

Từ kết quả trích ly rutin dưới trợ giúp của sóng vi ba (lò vi sóng) từ hoè xay2 trong thực nghiệm trình bày trên bảng 3.23, xác định được Kvs = 1,581.10-3 (kg);

(

)

−

K KmKK 1

KK tl

Tvs = 1,163 (phút). Từ (3.12) ta có: (3.30)

K v KKT

(

(3.31)

126

Áp dụng (3.30) và (3.31) để tính cho quá trình trích ly hạt hòe xay2 dùng dung

3 −

017,0

(

)

−

(

)

,0(*20

3557

10.581,1

)

−

10.581,1 01,0* −

K KmKK 1

1 −

(981,3

phút

)

vs KK tl

163,1

,0(*

20*

20 0166

v KKT (

K vs cb

(198,0

)

mkg /

2 phút

K vs tl

981,3 079,20

môi nước trong lò vi sóng:

t − vsT

Kq =

−

Mô hình trích ly rutin từ hạt hòe xay2 bằng nước trong lò vi sóng ở Kv bất kỳ

⎛ ⎜ ⎜ ⎝

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

3557

được viết theo dạng (3.10):

,0 017,0

017 K

v +

(3.32) Với:

K v 017

,0(981,3

(3.33)

Sai số lớn nhất của mô hình là 3,8%.

b/ Mô hình động học quá trình trích ly rutin có trợ giúp của khuấy trộn

Xuất phát từ kết quả thực nghiệm nghiên cứu quá trình trích ly siêu âm trong bể

kHz

kHz K >

LC 60H (tần số 35kHz) và khuấy trộn (200vòng/phút) trên bảng 3.36. Đồ thị hình

; và . Từ 3.19 đã phản ánh các quan hệ:

kh cho quá trình trích ly hạt hòe xay2

kh, Ktl

kết quả thực nghiệm xác định được: Kkh = 2,778.10-3 (kg), Tkh = 61,25 (phút).

Áp dụng (3.30) và (3.31) tính toán Kcb

-3

(225

)

−

(

)

836,15

,0(*

778,2

10.

)

2,778.10 01,0*

3557

−

K KmKK 1

1 −

(470

)

phút

kh KK tl

836,15 225

,0(*25,61

836,15*

v KKT (

K kh cb

(173,0

)

mkg /

2 phút

K kh tl

,3 470 079,20

bằng metanol có khuấy.

127

Mô hình trích ly rutin từ hạt hòe xay2 trong metanol có khuấy trộn ở Kv bất kỳ

t − khT

Kq =

−

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

⎛ ⎜ 1 ⎜ ⎝

3557

được viết theo dạng (3.10):

,0 225

225 K

K v 225

,0(470

v +

(3.34); (3.35)

c/ Tổng kết các thông số mô hình trích ly rutin có trợ giúp của khuấy trộn và

sóng vi ba (lò vi sóng)

Kết quả tổng kết các thông số xác định được từ hai mô hình trích ly trong nghiên

cứu trình bày trong bảng 3.49.

Bảng 3.49: Các thông số mô hình trích ly rutin khuấy trộn và trong lò vi sóng

Các thông số Sóng vi ba (lò vi sóng) Khuấy trộn

dung môi nước dung môi metanol

3,981 3,470 Ktl.K2 (phút-1)

T (phút) 1,163 61,25

0,017 0,225 Kcb (kg/kg)

K.10-3 (kg) 1,581 2,778

− T

−

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

⎛ ⎜ ⎜ ⎝

0,198 0,173 Ktl (kg/m2phút)

3557 m

3557

225,0 K

225,0

v +

v 1 +

Mô hình phụ

017,0 K 017,0

v 017,0(981,3

,0(470

K v 225

thuộc vào Kv

3.3. Nghiên cứu công nghệ tinh chế rutin

Tinh chế rutin đạt tới hàm lượng cao sẽ rất khó khăn nếu dùng phương pháp tinh

128

chế thông thường bởi:

- Tính tan của các tạp chất làm chúng không loại được bằng quá trình kết tinh lại.

- Các tạp chất này có khuynh hướng hút, bám lên rutin kết tinh và do dó được kết

tinh cùng với rutin.

- Rutin có khuynh hướng hình thành các tinh thể hỗn hợp với các tạp chất và kết

tinh cùng nhau.

Trong quá trình trích ly, công đoạn tách rutin khỏi pha trích bằng phương pháp

bay hơi dung môi hay kết tinh lại đã giảm bớt được phần lớn các tạp chất dễ tách

khỏi rutin nhưng bản thân rutin thô vẫn còn chứa một lượng nhất định các tạp chất

như pectin, pectat, clorophil, sắc tố, chất béo,... Trong các tạp chất này, các tạp chất

khó tách nhất khỏi rutin là các chất có bộ khung flavol tương đồng với rutin. Vì

tương đồng cấu trúc nên chúng có khả năng hòa tan, kết tủa gần giống rutin trong

các dung môi khiến quá trình tinh chế bằng kết tinh lại thông thường chỉ đạt được

một hiệu quả nhất định. Mặt khác đối với mỗi loại dung môi khác nhau cũng như

nguyên liệu khác nhau thì rutin sản phẩm lại mang các loại tạp chất có đặc thù khác

nhau. Với sản phẩm trích ly từ nụ hòe theo PP nước, rutin thô nhiều pectin,

pectate... thường có màu xanh lục; theo PP kiềm rutin thô nhiều tạp mang tính bazơ,

thường có màu vàng sậm; theo PP metanol rutin thô nhiều chlorophin, sắc tố, chất

béo (xem bảng 3.7). Đặc điểm chung của tất cả các loại rutin sản phẩm này là đều

có chứa flavonoit (ít nhất 14 flavonoit đã được tìm thấy trong nụ hòe [27, 43]) cụ

thể như isoquercitrosit, quercetin, kaempferol 3-rutinosit,... Muốn tách triệt để các

flavonoit này không thể dùng phương pháp tinh chế thông thường. Do đó phần

nghiên cứu này đi vào khảo sát ba quá trình tinh chế rutin: kết tinh lại, sắc ký cột và

sắc ký lỏng điều chế để nâng cao hàm lượng rutin cho các mục đích sử dụng khác

nhau (làm dược phẩm, chất chuẩn hay chế phẩm trung gian).

Nguyên liệu cho nghiên cứu tinh chế là rutin thô trích ly từ mẫu hòe TB trích ly

bằng nước vôi -borax có hàm lượng 75,74% (rutin 1); 69,78% (rutin 2) và 80,01%

(rutin 3). Kế hoạch nghiên cứu tinh chế rutin tùy theo chất lượng mà chia ra làm ba

loại mục tiêu theo bảng 3.50.

129

Bảng 3.50: Kế hoạch nghiên cứu tinh chế rutin theo mục tiêu

(%)

Hướng sử dụng SP Giai đoạn Phương pháp Mục tiêu HLt

I Kết tinh lại 80 – 95 SP trung gian

II Sắc ký cột 92 – 98 Đạt TC dược phẩm

III Pre-HPLC 98 - 99,98 Làm chất chuẩn

3.3.1. Nghiên cứu tinh chế rutin bằng phương pháp kết tinh lại

Rutin 1 (hàm lượng 75,74%) được hòa tan và kết tinh lại trong các dung môi như

nước, cồn, dietyl ete, metanol như sau:

Mỗi mẫu 1,005g rutin thô được hòa tan trong từng dung môi (nước sôi, etanol

nóng) sau đó lọc bỏ các tạp chất lơ lửng, làm lạnh để rutin kết tủa. Lọc và rửa rutin bằng nước lạnh, rồi sấy khô ở 600C đến không đổi. Sản phẩm có màu vàng xanh,

không giống màu vàng sậm ban đầu.

Mỗi mẫu 1,005g rutin thô được hòa tan bằng 3ml metanol nóng (hoặc dietyl ete

sau đó lọc bỏ các tạp chất lơ lửng. Thêm etyl axetat dung dịch sau lọc, đuổi bớt

dung môi đưa dung dịch về trạng thái bão hòa để rutin kết tủa. Lọc và rửa rutin bằng nước lạnh, sấy khô ở 600C đến không đổi. Sản phẩm có màu vàng sáng rõ rệt.

Độ tinh khiết của rutin trong các lần tinh chế được theo dõi trên sắc ký bản mỏng

hiện màu dưới đèn UV với các hệ dung môi triển khai: axeton/n-hexan = 3/2; axit

axetic/n-butanol/nước =1/4/5. Sản phẩm được kiểm tra trên sắc ký bản mỏng trong

ba hệ dung môi triển khai, quá trình tinh chế thực hiện đến khi chấm sản phẩm trên

bản mỏng chỉ thấy một vạch của rutin thì dừng. Hàm lượng rutin sau tinh chế được

đánh giá bằng HPLC, kết quả trên bảng 3.51.

Bảng 3.51: Kết quả tinh chế rutin trong các dung môi

Dung môi KT ∆HTC (%) HLt (%)

Nước 9,35 78,01

Etanol 13,35 79,98

Metanol 26,05 82,06

Dietyl ete 7,5 77,56

130

Kết quả cho thấy kết tinh lại trong metanol cho hiệu quả tinh chế tốt. Do đó quá

trình tinh chế được nghiên cứu tiếp theo là kết tinh lại rutin trong các hệ dung môi

metanol- etylaxetat, metanol- axeton với tỷ lệ rutin thô/metanol-etyl axetat bằng 1/3

(g/ml), kết quả trong bảng 3.52.

Bảng 3.52: Kết quả tinh chế rutin trong hệ các dung môi

HLt (%) Hệ dung môi HTC (%)

Metanol- etyl axetat 77,12 94,45

Metanol- axeton 64,14 98,01

Từ kết quả bảng 3.50 và bảng 3.51 cho thấy sử dụng hệ dung môi có thể tăng

hàm lượng rutin từ 75,74% lên > 90%. Lặp lại quá trình tinh chế liên tiếp trong hai

hệ dung môi thì hiệu suất tinh chế lần thứ nhất đạt 77,12% và lần thứ hai đạt

64,14%. Như vậy, quá trình tinh chế rutin được đề xuất là: hòa tan và kết tinh lại

liên tiếp trong các hệ dung môi (metanol-etyl axetat và metanol- axeton), hàm lượng

rutin có thể đạt tới 98,01% (ký hiệu SP 1). Công nghệ tinh chế rutin trình bày trên

sơ đồ 3.4. Bột rutin thô

Dung môi 2 Cấp nhiệt Metanol

Lọc nóng (màng lọc) Hạ nhiệt

Dung môi 1 Dịch lọc

Rutin kết tủa Cất phân đoạn dung môi

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ công nghệ tinh chế rutin

Bột rutin thô được đưa vào thùng khuấy có metanol nóng (thùng được cấp nhiệt,

dùng nước sôi hoặc hơi quá nhiệt). Sau khi rutin tan hết, dung dịch rutin được lọc

131

nóng qua màng lọc để bỏ phần tạp chất lơ lửng. Dịch lọc được đưa về thùng chứa,

bổ sung dung môi thứ nhất (etylaxetat). Tại đây hỗn hợp được làm lạnh (dùng nước)

cho rutin kết tinh, phần dung môi được cất phân đoạn và thu hồi sử dụng tiếp theo.

Rutin kết tủa được đưa trở lại thùng khuấy, hòa tan trong metanol nóng rồi bổ sung

dung môi thứ hai (axeton). Dung dịch được làm lạnh sâu để rutin kết tinh, phần

dung môi được cất thu hồi tái sử dụng. Sản phẩm thu được có thể lặp lại các quá

trình trên trong các hệ dung môi khác nhau đến khi chất lượng đạt yêu cầu.

Trong công nghệ này quá trình kết tinh rutin được thực hiện trong các hệ dung

môi chứ không phải là một dung môi đơn lẻ. Việc sử dụng thêm một dung môi dung

môi thứ hai (khác metanol) ngoài mục đích hạn chế khả năng hòa tan của rutin

trong dung môi ban đầu để rutin sớm kết tinh còn nhằm tăng cường hòa tan một số

tạp chất khác. Phương pháp tinh chế bằng hòa tan và kết tinh lại rutin trong các hệ

dung môi là phương pháp rẻ tiền và dễ triển khai trên quy mô công nghiệp.

3.3.2. Tinh chế bằng sắc ký cột

a. Khảo sát hệ dung môi rửa giải và pha rắn hấp phụ

Mẫu tinh chế là rutin 2 (hàm lượng 69,78%), sản phẩm của quá trình trích ly

rutin bằng nước vôi – borax. Quá trình tinh chế được nghiên cứu trên cột chiết pha

rắn cỡ nhỏ (5cm x 5mm) nhồi 0,5g chất hấp phụ là silicagel 0,063-0,2mm và florisil

100-200 U.S.mesh. Chất hấp phụ (silicagel, florisil) được sấy ở 3000C trong 2h và để nguội trong

bình hút ẩm sau đó nhồi cột. Hoạt hóa cột rồi đưa rutin thô nồng độ 0,1g/ml hấp phụ

lên mỗi cột (V= 0,2ml). Tiến hành rửa giải bằng các hệ dung môi khác nhau: n-

hexan, axeton, metanol; clorofoc, axeton, metanol; clorofoc- metanol với các tỷ lệ là

20-1, 10-1, 8-1; butanol: axeton: nước = 4:1:5.

Quá trình thực hiện gián đoạn, dung môi rửa giải sau khi ra khỏi cột được đem đi

phân tích HPLC. Kết quả trình bày trên bảng 3.53. Từ kết quả trên thấy, để tinh chế

rutin thì chất hấp phụ silicagel tốt hơn chất hấp phụ là florisil nên chọn silicagel

làm chất hấp phụ cho quá trình tinh chế rutin trên sắc ký cột.

132

- n-Hexan và axeton rửa giải được nhiều tạp chất, metanol là dung môi hòa tan tốt

đồng thời cũng là dung môi giải hấp rutin khỏi chất hấp phụ. Hệ dung môi cho quá

trình tinh chế rutin trên sắc ký cột được lựa chọn là n-hexan-axeton-metanol.

Bảng 3.53: Kết quả phân tích các dung môi sau rửa giải trên cột

Diện tích peak rutin PP Dung môi Silicagel Florisil

n-hexan 76509 394820

1 axeton 832066 185059

metanol 3340791 2864836

20/1 1468896 822921

clorofoc/metanol 10/1 0 0 2 8/1 0 0

metanol 455988 0

axeton và nước 481669 6330930

170860 47010 3 butanol

610688 2522021 metanol

0 0 clorofoc

0 0 4 axeton

metanol 443966 1695163

b. Nghiên cứu tinh chế ruin bằng sắc ký cột (1,2cm x 22cm )

Bảng 3.54: Kết quả tinh chế rutin trên sắc ký cột

Khối lượng Hàm lượng STT Loại rutin (g) (%)

1 Rutin thô đưa vào cột 0,0351 69,78

2 Rutin sau khi qua cột 0,0166 96,59

Hiệu suất tinh chế 65,68

Kết quả bảng 3.54 cho thấy sau khi tinh chế rutin bằng sắc ký cột với chất hấp

phụ là silicagel thì hàm lượng rutin tăng 26,81% (từ 69,78 lên 96,59% (ký hiệu SP

133

2)), hiệu suất tinh chế đạt 65,68%. Hiệu suất tinh chế thấp vì trong thực nghiệm này

rutin vẫn còn nằm ở các phân đoạn sản phẩm khác. Phương pháp này có thể nâng

hàm lượng rutin đến chất lượng mong muốn bằng cách tăng chiều dài cột tách hay

lặp lại quá trình tinh chế nhiều lần. Tuy nhiên đây là một PP tinh chế có giá thành

cao hơn với PP kết tinh lại do đó không nên sử dụng để tinh chế rutin hàm lượng

thấp mà nên kết hợp dùng sau PP tinh chế bằng cách kết tinh lại trong các hệ dung

môi để tăng tiếp hàm lượng sản phẩm.

3.3.3. Tinh chế rutin bằng sắc ký lỏng điều chế

Trong nghiên cứu này quá tải thể tích được lựa chọn cho kỹ thuật điều chế. Có

thể tính thể tích mẫu quá tải theo hai cách: dựa vào công thức xác định hoặc

dựa vào khảo sát bơm mẫu thực tế. Với phương pháp khảo sát bơm mẫu thực tế: ở

một nồng độ mẫu tối đa xác định, thể tích mẫu được đưa vào thiết bị được tăng dần,

quan sát đến khi peak rutin bị biến dạng ở mức có thể chấp nhận được thì dừng;

chọn thể tích bơm mẫu trên để thực hiện điều chế. Do thực hiện điều chế trên thiết

bị sắc ký lỏng Agilent 1100 nên rutin 3 (hàm lượng 80,01%) được lựa chọn để tránh

tắc các đầu fit trong máy.

3.3.3.1. Tính toán thông số quá trình điều chế

- Điều kiện phân tích: rutin được phân tích trên hệ thống HPLC SCL-10AVP (Shimadzu, Nhật); cột Supelcosil™ LC-18 (150mm × 4,6mm, 5μm); tốc độ dòng 1ml/phút; thể tích tiêm mẫu 15μl; bước sóng 254nm; nhiệt độ lò cột 400C.

- Điều kiện điều chế: cần tính toán chế độ điều chế cho hệ thống Pre-HPLC 1100

(Agilent, Mỹ); cột Eclipse XDB-C18 (150mm x 21,2mm, 5μm).

+ Kết quả tính toán chuyển từ chế độ phân tích sang điều chế:

Tốc độ dòng (prep.) =

(3.36)

Thể tích (prep.) một lần bơm =

(3.37) = 318,6 (μl)

134

(3.38) Tải lượng (prep.) một lần bơm =

Sơ đồ quá trình tính toán được trình bày như sau:

Sơ đồ tính toán

Cột điều chế Eclipse XDB-C18 150mm x 21,2mm, 5μm

Cột phân tích SuperlcosilTM LC-18 150mm × 4,6mm, 5μm.

Tốc độ dòng (prep.) =

F1 : 1 ml/phút (x1)max : 15 μl/lần tiêm g/lần tiêm

F2 : ~ 21,24 ml/phút (x2)max: ~ 318,6 μl/lần tiêm ~ g/lần tiêm

Tải lượng (prep.) trong một lần bơm mẫu =

= 101,4mm

F2 = ? x2 = ? D2 L2 = 250mm

F1 = 1ml/phút x1 = 40 μ g D1 = 4,6mm L1 = 150mm

3.3.3.2. Xác định điều kiện điều chế trên thiết bị Pre-HPLC 1100

Rutin 80,01% được hoà trong metanol ở nồng độ 100g/l sau đó được điều chế trên

hệ thống Pre-HPLC 1100 ở chế độ đẳng dòng. Do thiết bị Pre-HPLC Agilent 1100

chỉ có 2 kênh dung môi nên hai loại pha động được khảo sát gồm tetrahydrofuran

(THF)/metanol và dung dịch NaH2PO4 0,02M (pH=3)/metanol. Khảo sát tỷ lệ pha

động với các pha động: THF /metanol = 30/70; 50/50 và 70/30; NaH2PO4 0,02M

(pH=3)/metanol = 50/50 và 30/70 tại bước sóng 254nm. Sau khi tìm được pha động

phù hợp, thực hiện quá trình điều chế cắt phân đoạn rutin theo thời gian lưu của

peak. Mỗi phân đoạn được thu vào một lọ đựng mẫu, cất chân không thu hồi dung

135

môi và rutin. Rutin của từng phân đoạn được phân tích trên máy sắc ký lỏng (HPLC

SCL-10AVP) để xác định độ tinh khiết.

3.3.3.3. Kết quả điều chế rutin trên hệ thống điều chế Pre-HPLC 1100

Với pha động NaH2PO4 0,02M (pH=3)/metanol=50/50 và 30/70 không phát

hiện được rutin. Pha động THF/metanol thì luôn tách rutin dù chạy với bất kỳ tỷ lệ

nào. Khi tăng lượng metanol trong pha động này thì thời gian lưu tR của rutin cũng

tăng do dó nghiên cứu điều chế được thực hiện trên pha động THF/metanol = 30:70.

Kết quả phân tích rutin 80% ở nồng độ 100g/l, tốc độ dòng 21,24ml/phút, lượng

mẫu tiêm 318μl đã xuất hiện hiện tượng quá tải cột (peak bị kéo đuôi - hình 3.27-a),

chọn điều kiện này để thực hiện điều chế.

a b

Hình 3.27: Sắc ký đồ rutin trước (a) và sau (b) đánh dấu cắt phân đoạn

* Điều chế lần 1: Trên cơ sở thời gian lưu của rutin (từ khi bắt đầu xuất hiện peak

đến khi hết đuôi peak), cắt peak rutin làm 13 phân đoạn (hình 3.27-b). Mỗi phân

đoạn sản phẩm được hứng vào các lọ đựng mẫu ký hiệu từ vial 1-13 (bảng 3.55).

Bốn phân đoạn cuối (vial 10-13) được loại bỏ do nồng độ rutin thấp. Kết quả xác

định hàm lượng rutin ở 9 phân đoạn sản phẩm chính được trình bày trên bảng 3.56.

Bảng 3.56 cho thấy phân đoạn sản phẩm thứ 3 (vial 3) là phần cắt tại đỉnh peak

rutin có hàm lượng cao nhất là 93,09% (sắc ký đồ trên hình 3.28). Phần chân peak

136

bị đuôi được cắt làm 5 phân đoạn và độ tinh khiết của rutin giảm dần ở các vial thu

mẫu theo chiều đuôi chân peak.

Bảng 3.55: Kết quả cắt phân đoạn theo peak rutin

Bảng 3.56: Hàm lượng rutin ở các phân đoạn sau cắt peak

Phân Speak (rutin) HL (%) đoạn

1 2809658 21,53

2 2741798 22,36

3 4388742 93,09

4 3144866 34,11

5 3042074 34,62

6 153090 17,52

7 238150 16,22

8 132860 16,74

9 883851 14,48

* Điều chế lần 2: Rutin trong vial 3 với hàm lượng 93,09% được pha với nồng độ

100g/l và thực hiện điều chế. Kết quả tính toán hai quá trình điều chế rutin được

137

tổng kết trên hình 3.29, bảng 3.57.

Hình 3.28: Sắc ký đồ của rutin sau tinh Hình 3.29: Sắc ký đồ của rutin sau tinh chế

chế trên pre-HPLC lần thứ 1 trên pre-HPLC lần thứ 2

Từ kết quả bảng 3.57 cho thấy: chỉ sau một lần điều chế có thể đưa rutin từ hàm

lượng 80,01% tới hàm lượng 93,09%, hiệu suất quá trình đạt 65,43%. Lần tinh chế

thứ 2 tiếp theo làm hàm lượng rutin tăng lên 6,3% (đạt 99,39%%, ký hiệu SP 3),

hiệu suất quá trình đạt 91,17%. Hiệu suất quá trình cho lần điều chế thứ hai cao hơn

lần thứ nhất do hàm lượng rutin đưa vào điều chế làn thứ hai cao hơn lần thứ nhất.

Quá trình tinh chế sâu hoàn toàn có thể thực hiện được bằng cách lặp lại quá trình

điều chế nhiều lần trên hệ thống pre-HPLC. Với hàm lượng 99,39% thì rutin không

những đạt yêu cầu dược phẩm (98%) mà còn có thể sử dụng làm chất chuẩn.

Bảng 3.57: Kết quả điều chế rutin phân đoạn thứ 3

Nồng độ Thể tích Lượng Hàm lượng Loại rutin mẫu (g/ml) bơm mẫu rutin (%) (μl) (mg/lần)

Đưa vào điều chế 0,1 318,6 3,186 80,01

Sau khi điều chế 1,923 93,09

Hiệu suất điều chế (lần 1) 65,43

Đưa vào điều chế 0,1 318,6 3,186 93,09

Sau khi điều chế 1,526 99,39

Hiệu suất điều chế (lần 2) 91,17

138

So với phương pháp tinh chế bằng kết tinh lại và sắc ký cột thì tinh chế bằng hệ

thống sắc ký lỏng điều chế là một phương pháp có chi phí cao: tiêu tốn dung môi và

đòi hỏi dung môi có độ tinh khiết cao, công suất điều chế nhỏ, nguyên liệu đầu vào

phải tương đối sạch để tránh các hiện tượng tắc đầu lọc, fit,... Tuy nhiên đây là

phương pháp đạt được hiệu quả kỹ thuật rất cao, có thể xử lý đối với các mẫu mà

các phương pháp tinh chế khác không giải quyết được. Phương pháp này phù hợp

nhất với ứng dụng điều chế các chất chuẩn hoặc dung dịch chuẩn.

Như vậy so với mục tiêu đặt ra trong bảng 3.50 thì các phương pháp tinh chế đã

nghiên cứu hoàn toàn đáp ứng được sản phẩm có hàm lượng đạt tiêu chuẩn dược

phẩm (98%) và làm chất chuẩn.

3.3.4. Đánh giá chất lượng rutin sau các quá trình tinh chế

3.3.4.1. Đánh giá nguyên liệu và các sản phẩm

Kết quả đánh giá một số thông số cơ bản của sản phẩm trình bày trên bảng 3.58.

Kết quả cho thấy rutin SP 1 và SP 3 tinh chế được hoàn toàn đạt tiêu chuẩn dược

điển Việt Nam và dược điển châu Âu.

Bảng 3.58: Một số thông số của rutin sản phẩm trước và sau tinh chế

Chất Tổng Ca, Độ ẩm Tro sulfat Quercetin Rutin Sản

phẩm màu (%) (%) (%)

Rutin 1 có Na, B (%) 127,55.10-4 8,75 3,12 75,74

Rutin 2 có 9,52 3,59 69,78

Rutin 3 7,56 3,57 80,01

SP 1 - 35,88.10-4 8,84.10-4 3,21 1,15 98,01

SP 2 vết 4,12 1,87 96,59

-: Không phát hiện

SP 3 - 3,05 (%) 4,24. 10-5 4,98. 10-5 3,11. 10-5 1,8. 10-5 2,05. 10-5 1,21. 10-5 0,56 99,39

3.3.4.2. Phân tích cấu trúc rutin sản phẩm

Sau khi trích ly và tinh chế, việc nghiên cứu cấu trúc sản phẩm được tiến hành

139

trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ HP 5989B MS, xác định được số khối của sản phẩm là 611. Ngoài ra phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (MeOD, 500MHz). phổ 13C-NMR và các phổ 2D-HMQC, 2D-HMBC cũng được phân tích trên thiết bị

Bruker Avance 500 MHz. Kết quả giải phổ của sản phẩm trình bày trên bảng 3.59

và bảng 3.60.

Bảng 3.59: Kết quả giải phổ 1H-NRM ( MeOD, 500MHz) của rutin

Vị trí Nhóm Độ dịch chuyển Số proton. chiều. hằng số kết nối chức hóa học (ppm) H

H6 CH 1H. d. J=2,0 Hz 6,23

H8 CH 1H. d. J=2,0 Hz 6,42

H2’ CH3 1H. dd. J1=2,0 Hz. J2=2,1 Hz 7,65

H3’ CH3 1H. d. J=8,5 Hz 6,90

H6’ CH3 1H. d. J=2,1 Hz 7,69

Hg1 CH3 1H. d. J=7,7 Hz 5,13

Hg2 CH 1H. m 3,51

Hg3 CH 1H. m 3,43

Hg4 CH 1H. m 3,29

Hg5 CH 1H. m 3,32

1H. m 3,41 Hg6 CH2 1H. dd. J1=11 Hz. J2=1,2 Hz 3,82

Hr1 CH 1H. d. J=1,5 Hz 4,54

Hr2 CH 1H. dd. J1=3,3 Hz. J2=1,5 Hz 3,65

Hr3 CH 1H. dd. J1=9,5 Hz. J2=3,3 Hz 3,56

Hr4 CH 1H. m 3,3

Hr5 CH 1H. m 3,5

Hr6 CH3 1H. d. J=6,2 Hz 1,19

140

Bảng 3.60: Kết quả giải phổ 13C-NRM, 2D-HMQC, 2D-HMBC của rutin

Vị trí Nhóm Độ dịch chuyển HMQC HMBC chức hóa học (ppm) H

C2 C 159,3 C2-H2’. C2-H6’

C3 C 135,6 C3-Hg1

C4 C=O 179,4

C5 C 163,0 C5-H6

C6 CH 100,0 C6-H8 6,23

C7 C 166,1 C7-H6. C7-H8

C8 CH 94,9 C8-H6 6,42

C9 C 158,5 C9-H8

C10 C 105,0 C10-H6. C10-H8

C1’ C 123,1 C1’-H2’. C1’-H3’. C1’-H6’

C2’ CH 123,6 C2’-H3’. C5’-H6’ 7,65

C3’ C 145,9 C3’-H2’ 6,90

C4’ C 149,8 C4’-H2’. C4’-H3’. C4’-H6’

C5’ CH 116,0 C5’-H3’. C5’-H6’

C6’ CH 117,7 C6’-H3’ 7,69

Cg1 CH 104,7 Cg1-Hg2 5,13

Cg2 CH 75,7 Cg2-Hg3 3,51

Cg3 CH 78,3 Cg3-Hg2 3,43

Cg4 CH 71,41 Cg4-Hg3. Cg4-Hg5 3,29

Cg5 CH 77,2 Cg5-Hg4. Cg5-Hg3 3,32

Cg6 68,6 CH2 3,41 và 3,82 Cg6-Hg4

Cr1 CH 102,4 Cr1-Hg6a. Cr1-Hg6B 4,54

Cr2 CH 72,1 Cr2-Hr1 3,65

Cr3 CH 72,3 Cr3-Hr1. Cr3-Hr2. Cr3-Hr4 3,56

Cr4 CH 73,9 Cr4-Hr2. Cr4-Hr3. Cr4-Hr6 3,3

Cr5 CH 69,7 Cr5-Hr1. Cr5-Hr4. Cr5-Hr6 3,5

Cr6 CH3 17,9 Cr6-Hr4 1,19

141

Từ những kết quả giải phổ, công thức cấu tạo của sản phẩm xác lập được trên

hình 3.30. So sánh với các số liệu đã công bố về cấu trúc hóa học của rutin có thể

khẳng định đây là cấu trúc hóa học của rutin. Như vậy sản phẩm được trích ly và

tinh chế là rutin, các phương pháp hóa lý sử dụng trong quá trình này không làm

cấu trúc rutin biến đổi. Bên cạnh đó kết quả của việc đo phổ cũng thể hiện được

mức độ tinh sạch của rutin sản phẩm là > 98%.

OH

5'

4'

6'

OH

3'

2'

1'

2 O 1

CH3

9

3

8 O

r6 r5

O

7 r4

g1

HO

O

OH

O

4

10 g1 g2

r2

g5

6 g6

O HO

5 r3 OH

OH

HO

g3

g4

HO

OH

Hình 3.30: Công thức cấu tạo của rutin sản phẩm theo kết quả giải phổ

142

KẾT LUẬN

1. Trữ lượng nụ hòe khô Việt Nam hiện nay khoảng 15.000tấn/năm, tập trung chủ

yếu ở ba vùng là Thái Bình, Nghệ An và Tây Nguyên. Các thành phần chính trong

phân đoạn dễ bay hơi của nụ hòe (đặc biệt là tinh dầu nụ, hoa hòe) đã được tìm

thấy. Thành phần rutin trong nụ hòe Việt Nam vào khoảng 29,94 ÷ 35,20% (KLK);

đạt cao nhất trong nụ hòe Thái Bình, Thái Nguyên (34,03 ÷ 35,20%) và trong nụ

dạng tấm (38,58%). Rutin trong nụ hòe sẽ bị giảm 26,28% khi phát triển thành hoa;

giảm 2,54% từ dạng phơi sang dạng sao khô và giảm tới 55,21% khi bảo quản ở

điều kiện thường (3,25 năm). Nguồn nguyên liệu tốt nhất cả về trữ lượng và chất

lượng là nụ hòe Thái Bình.

2. Trong ba công nghệ trích ly rutin đạt hiệu quả kinh tế và kỹ thuật cao đã tìm

được: trích ly rutin với lớp dung môi chuyển động (nước vôi-borax 4%o), trích ly

rutin bằng metanol có khuấy trộn, trích ly siêu âm rutin trong metanol thì công nghệ

trích ly siêu âm rutin trong metanol là phương án sản xuất hiệu quả và hiện đại

(hiệu suất đạt 96,23%, hàm lượng rutin 55-70%).

3. Trên cơ sở phần mềm quy hoạch thực nghiệm (tuyến tính, phi tuyến) tối ưu hóa

3, 4 biến hai mức tối ưu xây dựng được bằng ngôn ngữ lập trình Matlab, đã áp dụng

tính toán, tìm được phương trình hồi quy thực nghiệm của hiệu suất trích ly và

lượng rutin trích ly cho quá trình trích ly có trợ giúp khuấy trộn.

4. Đã xây dựng được mô hình động học quá trình trích ly rutin có sự trợ giúp của

sóng siêu âm, khuấy trộn, sóng vi ba (trong lò vi sóng) chỉ phụ thuộc vào tỷ lệ

lỏng/rắn và lượng nguyên liệu phù hợp với thực nghiệm; đã xác định được các

thông số (K, T, Ktl, Kcb) của mô hình trong từng điều kiện cụ thể.

5. Đã tinh chế được rutin đạt tiêu chuẩn dược phẩm (hàm lượng 98,01%; 99,39%)

có thể dùng làm chất chuẩn; xây dựng được sơ đồ tinh chế rutin hợp lý, kinh tế và

hiệu quả.

* Đề xuất: Hoàn thiện nghiên cứu tinh chế rutin ở mức độ cao hơn và quy mô công

nghiệp

143

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyen Thi Thu Huyen, Nguyen Minh Tu, Phan Đinh Chau, Pham Van

Thiem (2005), “Research of rutin content in Vietnamese flower bud of Sophora

Japonica L. using UV spectroscopy method”, Tuyển tập các công trình Hội nghị

Khoa học và Công nghệ Hoá Hữu cơ (Toàn quốc, lần thứ III), 370-374.

2. Nguyen Thi Thu Huyen, Nguyen Thị Minh Tu, Phan Đinh Chau, Pham Van

Thiem (2005), “Research on effects of alkali method for rutin extraction from

Vietnamese flower bud of Sophora Japonica L. (Hoe buds)”, Regional symposium on

Chemical Engineering 2005, 74-77.

3. Nguyen Thi Thu Huyen, Pham Xuan Thang, Phan Đinh Chau, Pham Van

Thiem (2007), Study on chemical compositons and rutin content in flower buds of

Sophora Japonica L. by GC-MS and HPLC, Journal of science and technology, Vietnamese academy of science and technology, Vol.45, N01B, 497-502.

4. Nguyễn Thị Thu Huyền, Trần Văn Biển, Phạm Văn Thiêm, Phan Đình Châu

(2007), “Nghiên cứu quá trình chiết rutin từ nụ Sophora Japonica L. bằng phương pháp

quy hoạch thực nghiệm”, Tạp chí khoa học công nghệ, Viện khoa học và công nghệ Việt

Nam, Tập 45, số 1B, 503-508.

5. Nguyen Thi Thu Huyen, Pham Van Thiem, Phan Dinh Chau (2009), “The

composition of fruit essential oil and extract of dried bud of Sophora japonica L.

cultivated in vietnam”, Journal of Science and Technology, Technical Universities,

A (72), 79-82.

6. Nguyen Thi Thu Huyen, Phan Dinh Chau, Pham Van Thiem (2009), “Study on the

composition of essential oil from flower bud and bud of Sophora Japonica L. in Hoabinh

and Hungyen provinces”, Journal of Science and Technology, Technical Universities, A

(72), 67-70.

7. Phan Đình Châu, Bùi Văn Sơn, Nguyễn Thị Thu Huyền (2009), “Nghiên cứu

điều chế một số dẫn xuất este của quercetin”, Tạp chí hóa học, 47 (4A), 28-32.

144

8. Phung Lan Huong, Tran Trung Kien, Nghiem Xuan Son, Le Hoai Nga,

Nguyen Thi Thu Huyen, Pham Van Thiem (2010), “Application of dynamic model

for ultrasonic-assisted extraction from natural products”, In submitted to Chemical

engineering & technology, Wiley.

9. Nguyen Thi Thu Huyen, Tran Trung Kien, Phung Lan Huong, Pham Van

Thiem (2010), “Research on extraction process for rutin assisted by ultrasonic,

microwave and stir bar techniques”, Journal of science and technology, Vietnam academy of science and technology, Vol.48, N0 6A, 305-312.

10. Nguyen Thi Thu Huyen, Tran Trung Kien, Pham Van Thiem (2010),

“Applying the dynamic model of Ultrasonic assisted extraction process for study of

rutin separation from bud Sophora Japonica L.”, Journal of science and technology,

Vietnamese academy of science and technology, Vol.48, N0 6A, 296-304.

11. Nguyễn Thị Thu Huyền, Phan Đình Châu, Phạm Văn Thiêm (2010), “Nghiên

cứu sự tạo phức rutin-kim loại bằng phương pháp UV-VIS”, Tạp chí khoa học và

công nghệ, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, tập 48, số 6A, 109-115.

12. Nguyễn Thị Thu Huyền, Phạm Văn Thiêm, Phan Đình Châu, Nguyễn Hữu

Tùng, Đặng Thị Thu, Trần Thị Trang (2010), “Nghiên cứu quá trình tinh chế rutin

thô trên hệ thống sắc lý lỏng điều chế”, Tạp chí khoa học và công nghệ, Viện khoa

học và công nghệ Việt Nam, tập 48, số 6A, 447-451.

145

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bùi Thị Bằng (1990), "Nghiên cứu phương pháp định lượng rutin trong nụ hòe",

Thông báo dược liệu, 22, 17-20.

2. Bùi Thị Bằng (1991), "Định lượng rutin bằng sắc ký lỏng cao áp (SKLCA)", Tạp

chí dược học, 3, 26-28.

3. Bùi Thị Bằng (dịch-1989), "Nghiên cứu động học chiết xuất flavonoid từ dược

liệu, chiết xuất rutin từ cây Sida Hermaphrodita", Thông báo dược liệu, 24(1), 14-

18.

4. Nguyễn Bin (2004), Các quá trình thiết bị trong công nghệ hóa chất và thực phẩm,

Phân riêng dưới tác dụng của nhiệt (chưng luyện, hấp thụ, hấp phụ, trích ly, kết

tinh, sấy), Tập 4, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, 195-236.

5. Phùng Hòa Bình, Đỗ Ngọc Thanh, Khương Thị Mai Lan (2005), “Nghiên cứu ảnh

hưởng của nhiệt đến thành phần flavonoid trong hòe hoa”, Tạp chí dược học, 8,

10-13.

6. Bộ môn bào chế trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Kỹ thuật bào chế và sinh

dược học các dạng thuốc, Tập 1, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 204-234.

7. Bộ môn Dược liệu (1990), "Nghiên cứu phương pháp chiết xuất rutin đạt tiêu

chuẩn xuất khẩu từ hoa hòe", Báo cáo đề tài 1988-1990, 1-36.

8. Bộ y tế (2002), “rutin, viên rutin, hòe (hoa)”, Dược điển Việt Nam, 251-253, 378-

379; Dược điển Việt Nam-bản bổ sung (2006), 582, Nhà xuất bản y học.

9. Bộ Y tế và Bộ giáo dục đào tạo (1998), Bài giảng Dược liệu, tập 1, 259-294.

10. Cevit Rutin, http://www.thuoc-suckhoe.com/tudien/baiviet/Varic000.htm

http://www.cesti.gov.vn/left/stinfo/khcntn/2005/2005 10/b2.

http://www.vietpharm.com.vn/product/product_detail.php?category_id=&product_

id=67&show_id=13

http://www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/nd_11_12_06.htm

http://www.thaibinh.gov.vn/end-user/article/print_preview.asp?article_id=13887

146

http://www.varisme.org.vn/?path=Vietnamese/NongLamThuyHaiSanThaiBinh

http://www.vinachem.com.vn/XBPViewContent.asp?DetailXBPID=1003&CateX

BPDetailID=79&CateXBPID=1&Year=2003

11. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, 9-31, 571-

573.

12. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây

thuốc, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 1- 409.

13. Lê Thị Anh Đào (2000), "Rutin trong Sophora Japonica L. của Thái Bình và Hà

Bắc", Tuyển tập toàn văn các báo cáo hội thảo quốc gia "Định hướng phát triển

ngành hóa học và công nghiệp hóa chất Việt Nam trước thiên niên kỷ mới", Hội

hóa học Việt Nam, 286.

14. Lê Thị Anh Đào (1997), “Rutin trong nụ hoa hoè Thái Bình và Bắc Giang”, Thông

báo khoa học, (1), 47-50.

15. Lê Thị Anh Đào (2000), "Rutin trong Sophora Japonica L.", Tuyển tập toàn văn

các báo cáo hội thảo quốc gia, hội Hoá học Việt Nam, 286.

16. Nguyễn Văn Đậu (2001), "Đóng góp vào việc nghiên cứu các flavonoid trong nụ

hoa hoè (Sophora japonica L.)", Tạp chí dược học, 8, 13 - 14.

17. Phạm Gia Điền (1995), "Nghiên cứu triển khai công nghệ chiết tách rutin chất

lượng cao từ nụ hòe", “Nghiên cứu chiết tách rutin chất lượng cao từ nụ hòe”, Báo

cáo thực hiện dự án rutin, 1-15.

18. Phạm Gia Điền, Đỗ Quốc Việt, Đoàn Ngọc Đức, Bá Thị Châm, Đào Tố Uyên, Lại

Kim Dung, Trần Văn Đang, Lê Thị Ngọc Liên (2005), "Quy trình công nghệ tinh

chế rutin", Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ

toàn quốc lần thứ 3, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, 303-309.

19. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào

nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất thiên nhiên, Nhà xuất

bản y học, TP Hồ Chí Minh, 172-262.

20. Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Thu

Hương, Hồ Việt Anh (2006), "So sánh hoạt tính chống oxy hoá của một số

147

flavonoid (dạng glucosid và dạng genin) chiết từ hoa hoè và vỏ quýt", Tạp chí

dược liệu, 11(5), 185-188.

21. Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thuy Vy,

Hồ Huỳnh Thùy Dương (2007), "Nghiên cứu tổng hợp và xác định hoạt tính gây

độc tế bào ung thư NCI-H460 của một số dẫn xuất ester của quercetin", Tuyển tập

các công trình hội nghị khoa học và công nghệ hoá học hữu cơ toàn quốc lần thứ

tư, 78-82.

22. El. Dondity và cs. (2002), "Nghiên cứu hóa học và sinh học của cây hòe mọc ở Ai

Cập", Bản tin dược liệu, 7 (4), 127.

23. G. I. Lukpiahskova, S. G. Tiraspo Skata, T. S. Lyktanchikov (1987), "Phép so màu

trong phân tích các dạng thuốc chứa rutin và quercetin", Thông báo dược liệu, 19

(4), 17-20.

24. Trường Giang (2005), “ Hoè - cây xóa đói giảm nghèo ở Quỳnh Lưu”, website hội

nông dân Việt Nam,

http://www.hoinongdan.org.vn/channel.aspx?Code=NEWS&NewsID=2265&c=13

25. Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi (2007), Xử lý số liệu và quy hoạch thực nghiệm

trong nghiên cứu hóa học, Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, 4-181.

26. Nguyễn Thị Bích Hằng, Phạm Thanh Kỳ, Ngô Thùy Linh, Phan Văn Kiệm (2008),

“Rutin, Scutellariosiad II và Leonurisid A phân lập từ vỏ thân cây Vọng cách –

Premna corymbosa rottl. Ex willd.”, Tạp chí Dược học, 384.

27. Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị Hồng Nhan, Nguyễn Thị Thanh Thuyền, Nguyễn Thị

Mỹ Lữ (2003), “Nghiên cứu tách chất màu tự nhiên từ cây hòe (Sophora Japonica

L.”, Hội nghị hóa học toàn quốc lần thứ IV, 161-165.

28. Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị Hồng Nhan (2003), “Khảo sát độ bền rutin và quercetin

trích từ cây hòe (Sophora Japonica L. )”, Hội nghị hóa học toàn quốc lần thứ IV,

261-266.

29. Nguyễn Quang Hoan, Bùi Thị Bằng, Đinh Thị Thuyết (1991), "Nghiên cứu so sánh

một số phương pháp định lượng rutin", Thông báo dược liệu, 23 (3+4), 35-36.

30. Nguyễn Tiến Hùng, Hà Hồi, Huỳnh Thị Thành, Trần Thị Quỳnh Chi, Lê Thị Thu

148

Cúc, Ngô Thị Hoàng Linh (2005), “Nghiên cứu độ ổn định của nụ hòe sau thu

hoạch”, Tạp chí dược học, 11, 8-10.

31. Nguyễn Tiến Hùng, Hà Hồi, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Việt Hương, Tống

Viết Thắng (2005), "Nghiên cứu phương pháp chế biến nụ hòe sau thu hoạch", Tạp

chí dược học, 11, 14-15.

32. Vũ Mạnh Hùng (2005), "Nghiên cứu tác dụng ức chế tính thấm thành mạch máu

của cracetin", Tạp chí sinh học, 9(3), 17-21.

33. Nguyễn Cửu Khoa, Hoàng Thị Kim Dung (2003) "Nghiên cứu tổng hợp một số

dẫn xuất của quercerin, xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của chúng",

Hoá học thế kỷ XXI vì sự phát triển bền vững, tập III, 229-233.

34. Trần Trung Kiên, Nghiêm Xuân Sơn, Phùng Lan Hương (2008), "Mô hình động

học của quá trình tách curcumin từ củ nghệ vàng bằng trích ly siêu âm", Tạp chí

hóa học, T46 (5A), 318-325.

35. Đinh Ngọc Lâm (1987), Cây hòe, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội, 1-15.

36. Nguyễn Nhật Lệ (2001), Tối ưu hoá ứng dụng, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật,

1-194.

37. Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Mai Phương (1992), "Tách tinh chế và nghiên cứu một số

tính chất của lectin trong nụ hoa hòe Sophora japonica L.", Tạp chí sinh học,

14(2), 32 - 38.

38. Công Luận (2009), “Sáng kiến đem lại hiệu quả kinh tế cao trên đất Tây Nguyên”,

Báo điện tử đảng cộng sản Việt Nam,

http://www.cpv.org.vn/cpv/Modules/News/NewsDetail.aspx?co_id=30631&cn_id

=79589

39. Phòng nghiên cứu xí nghiệp dược phẩm TW 2, Trường Đại học Dược Hà Nội

(1990), "Nghiên cứu phương pháp chiết xuất rutin đạt tiêu chuẩn xuất khẩu từ hoa

hòe", Báo cáo đề tài, 1-20.

40. Trần Kim Qui, Trần Lê Quan, Nguyễn Trung Nhân (2003), "Điều chế quercetin từ

hoa hoè Sophora Japonica L., và thử hoạt tính chống ung bướu", Tạp chí phát triển

KHCN, 6 (7 &8), 81 - 84.

149

41. Sở khoa học và công nghệ tỉnh Tuyên Quang, Danh mục TBCN chào bán,

http://tuyenquangkhcn.org.vn/new/index.php?id_cate=53&id_scate=70&id_sscate

=79&id_contents=112&action=detail

42. Phan Tống Sơn, Lê Kiều Nhi, Phan Minh Giang, Nguyễn Văn Đậu (2002), “Phân

lập và xác định rutin từ cây Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) của Việt Nam”,

Tạp chí dược học, 7, 11-13.

43. Tang YP và cs. (2002), "Một chất coumaronochromon mới của cây hoa hòe

(Sophora Japonica)", "Phân lập và xác định các chất chống ôxy hoá từ cây hoa hoè

(Sopora Japonica)", Bản tin dược liệu, I (8), 23.

44. Techmart Việt Nam, Thông tin về thiết bị công nghệ đang chào bán công nghệ sản

xuất rutin

http://www.techmartvietnam.com.vn/Members/tctd/200410036470461869

http://www.techmart.cesti.gov.vn/DetailSell.asp?ProductID=VN03TMSH0231&Pa

geIndex=8

http://www.skhcndaklak.gov.vn/Portals/0/DuLieu/techmart/vatlieu_hoachat_duocli

eu.doc

45. Nguyễn Thị Phương Thảo, Trịnh Văn Lẩu (2005), "Góp phần nghiên cứu định

lượng rutin trong hoa hòe bằng phương pháp HPLC", Tạp chí kiểm nghiệm thuốc,

3(1),15-17.

46. Phạm Trương Thị Thọ (1996), “Áp dụng lý thuyết qui hoạch thí nghiệm tìm điều

kiện tối ưu để nâng cao hiệu quả của chiết xuất các hoạt chất từ dược liệu”, Tạp chí

dược liệu, 1(1), 21-23.

47. Nguyễn Thuần, Stefan Nikolov, Nguyễn Thượng Dong (1995), "Nghiên cứu hóa

học phần trên mặt đất của cây Ngưu Tất (Achyranthes bidentata BI)", Tạp chí dược

học, 6, 1-2, 21.

48. Nguyễn Quốc Thức, Nguyễn Thượng Dong, Bùi Thị Bằng, Trần Văn Thùy, Đặng

Vũ Lương (2006), "Nghiên cứu thành phần flavonoid trong cây Ban (Hypericum

japonicum Thunb. Ex Murr.)", Tạp chí Dược liệu, 11 (3), 113 – 117.

150

49. Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ Quốc gia

(2004), “Chọn giống hoè và sơ chế nụ hoè”, Báo Nông nghiệp Việt Nam,

http://vst.vista.gov.vn/home/item_view?objectPath=home/database/an_pham_dien

_tu/nong_thon_doi_moi/2004/2004_00045/MItem.2004-11-

23.3556/MArticle.2004-11-23.3907

50. Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm, Nhà xuất bản khoa học và

kỹ thuật, 9-262.

51. Viện dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và

kỹ thuật, 521-527.

52. Phạm Thị Ngọc Yến, Ngô Hữu Tình, Lê Tấn Hùng, Nguyễn Thị Lan Hương

(2005), Cơ sở Matlab và ứng dụng, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 1-234.

Tiếng Anh

53. AOAC (1998), "AOAC official method 952.28: Rutin in Drugs,

Spectrophotometric method", AOAC international, 20.12.10 .

54. DAB-10 (1999), German Pharmacopoeia 10th edition.

55. David Harvey (2006), Modern analytical chemistry, DePauw University, New

York, 1-816.

56. Etani Hiroshi (1992), "Production of rutin", Patent No. JP4084894, Nhật.

57. Everaldo Moreira da Costa, José Maria Barbosa Filho, Ticiano Gomes do

Nascimento, Rui Oliveira Maceedo (2002), “Thermal characterization of the

quercetin and rutin flavonoids”, Thermochimica Acta., 392-393, 79-84.

58. Flavonoid derivatives (2005), HPLC Applications, Alltech chromatography, 493.

59. Gevrenova, R. Kitanov, G. Ilieva D. (2004), "Accumulation of rutin during flower

development in cultivated in Bulgaria Sophora japonica L.", 3rd Conference on

Medicinal and Aromatic Plants of Southeast European Countries, Nitra, Slovak

Republic.

60. Hao-yun Feng (2006), Studies on the cosmetic bioactivity for Sophora japonica L.

and Lycium chinense Mill, Master's Thesis, Chinese.

151

61. Jian Tao, Qinxue Hu, Jing Yang, Rurun Li, Xiuyi Li, Chengping Lu, Chaoyin

Chen, Ling Wang, Robin Shattock, Kunlong Ben (2007), “In vitro anti-HIV and -

HSV activity and safety of sodium rutin sulfate as a microbicide candidate”,

Antiviral Research, 75(3), 227-233.

62. Jing Zhou, Liu-fang Wang, Jin-yi Wang, Ning Tang (2001), “Synthesis,

characterization, antioxidative and antitumor activities of solid quercetin rare

earth(III) complexes”, Journal of Inorganic Biochemistry, 83(1), 41-48.

63. Junqing Zi, Bin Peng, Weidong Yan (2007), "Solubilities of rutin in eight solvents

at T = 283.15, 298.15, 313.15, 323.15, and 333.15 K", Fluid Phase Equilibria,

261(1-2), 111-114.

64. Kessler M., Ubeaud G., Jung L. (2003), “Anti- and pro-oxidant activity of rutin and

quercetin derivatives”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 55 (1), 131-142.

65. Kimura Masayuki, Yamada Hiromi (1984), "Interaction in the Antibacterial

Activity of flavonoids from Sophora japonica L. to Propionibacterium", Journal of

the Pharmaceutical Society of Nhật, 104(4), 340-346.

66. Kreft S, Knapp M, Kreft I (1999), “Extraction of rutin from buckwheat

(Fagopyrum esculentum Moench) seeds”, J. Agric. Food Chem., 47 (11), 4649 -

4652.

67. Kreft Samo, Strukelj Borut, Gaberscik Alenka, Kreft Ivan (2002), "Rutin in

buckwheat herbs grown at different UV-B radiation levels: comparison of two UV

spectrophotometric and an HPLC method", Journal of experimental botany,

53(375), 1801-1804.

68. Kurisawa M, Chung JE, Uyama H, Kobayashi S. (2003), “Enzymatic synthesis and

antioxidant properties of poly(rutin)”, Biomacromolecules, 4 (5), 1394–1399.

69. L. M. Zhang, X. Zhao, J. J. Ji, I. Ji. Dai (2009), “TG-DTG as an effective method

for the characterization of rutin extracted from the buds of Sophora japonica L.”,

Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 95(3), 917-922.

70. L. Paniwnyk, E,beaufoy, J.P. Lorimer, T.J. Mason (2001), "The extraction of rutin

from flower buds of Sophora Japonica", Ultrasonics Sonochemistry, 8, 299-301.

152

71. Lee Mi-Nyeong, Kim Byeong-Rok, Kim Tae-Kwan, Park Yoon-Chang (2003),

"Method of extracting rutin from Buck Wheat growed by Hydroponics", Patent No.

WO 03092410.

72. Levy Rebelo F. De Carvalho, João José Hiluy Filho, Icaro Gusmão P. Vieira,

Francisca Noelia P. Mendes (2005), "The production of tri-hydroxyethylrutin

(troxerutin) in a pilot plant", 2nd Mercosur Congress on Chemical Engineering,

4th Mercosur Congress on Process Systems Engineering.

73. Natale Alfredo Santagati, Loredana Salerno, Giuseppina Attaguile, Francesca

Savoca, Giuseppe Ronsisvalle (2008), "Simultaneous determination of catechins,

rutin, and gallic axit in Cistus species extracts by HPLC with diode array

detection", Journal of Chromatographic Science, 46(2), 150-156.

74. Pelletier Pascale, Breton Lionel, Liviero Christel (2002), "Sophora Japonica

extracts for promoting desquamation/ epidermal renewal of the skin and/or

combating skin aging", Patent No. US 2002041907.

75. Pham Gia Dien, Do Quoc Viet, Tran Khac Vu, Nguyen Thi Hanh, Nguyen Quyet

Chien (1995), "Research on the rutin extraction process of high quality from flower

bud of Sophora Japonica L.", Journal of chemistry, 172 - 175.

76. Raymond P. W. Scott (2003), Preparative chtomatography,

http://www.library4science.com

77. Reneta Gevrenova, Gerassim Kitanov, Dessislava Ilieva (2007), "Ontogenetic and

seasonal variation in the flavonoid composition of Sophora japonica cultivated in

Bulgaria", Pharmaceutical Biology, 45(2), 149 - 155.

78. Rutin (2001), The British Pharmacopoeia, 1.

79. Shibata Shinya, Ishihara Chiyoko, Matsumoto Keisuke (2002), “Method for

obtaining rutin and high-purity rutin”, JP Patent 2002223787.

80. Toshitaka Yasuda, Hiroki Nakagawa (1994), "Purification and characterization of

the rutin - degrading enzymes tartary Buckwheat seeds", Phytochemistry, 37(1),

133 – 136.

81. Y Yang, Fan Zhang (2007),"Ultrasound-assisted extraction of rutin and quercetin

153

from Euonymus alatus (Thumb.) Sieb", Ultrasonic sonochemistry, Sciencedriect.

82. Youngki Park, Hak-Ju Lee, Sung-Suk Lee, Don-Ha Choi, Jung-Soo Oh (2004),

"New isoflavone glycoside from the woods of Sophora japonica", Bull. Korean

Chem. Soc., 25(1), 147-148.

83. Yu Bai, Fengrui Song, Maolian Chen, Junpeng Xing, Zhiqiang Liu, Shuying Liu

(2004), "Characterization of the rutin- metal complex by electrospray ionization

tandem mass spectrometry", Analytical sciences, 20, 1147-1151.

84. Yu-Ping Tang, Hua-Xu Zhu, Jin-Ao Duan (2008), "Two new isoflavone

triglycosides from the small branches of Sophora japonica", J. Asian Nat. Prod.

Res., 10 (1), 65-70.

85. Yuping Tang, Fengchang Lou, Jinghua Wang, Shufei Zhuang (2001), “Four new

isoflavone triglycosides from Sophora Japonica L.”, Journal of Natural Products,

64 (8), 1107-1110.

Tiếng Nga

86. И. A. Бaлaндинa, B. И. Глызин, H. И. Гринкевич, Л. Ш. Городецкий, З. Б.

Кристалл, Б. В. Шемеренкин (1982), Cпocoб пoлyЧeния pyтинa, Опиcaниe

изoбрeтeния 904709, 1-4.

154

PHỤ LỤC

Phụ lục A: Phổ và kết quả định lượng rutin trong nụ hoè

Bảng A.1: Độ hấp thụ của dịch chiết nụ hoè TB và rutin chuẩn trên máy UV-VIS

Mẫu chuẩn Mẫu thực (0,075mg/ml) TT

λ (nm) A λ (nm) A λ (nm) A

0,937 1,941 1 ⇑ 359,8 1,680 ⇓ 312,8 ⇑ 357,8

0,918 2,29 2 ⇑ 312,0 0,938 ⇓ 306,4 ⇑ 256,4

3 0,913 3,978 ⇑ 305,6 0,922 ⇓ 302,4 ⇑ 210,0

4 0,804 3,978 ⇑ 301,6 0,915 ⇓ 283,8 ⇑ 208,0

5 2,064 1,292 -0,005 ⇑ 256,6 ⇓ 238,0 ⇓ 483,2

6 2,296 0,756 ⇑ 216,2 2,328 ⇓ 215,2 ⇓ 282,6

7 0,098 1,308 ⇑ 214,4 2,443 ⇓ 197,8 ⇓ 237,4

8 0,067 3,838 ⇑ 197,0 0,324 ⇓ 195,8 ⇓ 208,8

9 0,218 0,023 ⇑ 192,8 ⇓ 191,0

-0,002 0,937 10 ⇓ 477,4 ⇓ 312,8

Ghi chú: kí hiệu ⇑ và ⇓ chỉ các cực đại và cực tiểu hấp thụ

Hình A.1: Phổ hấp thụ của dịch chiết Hình A.2: Phổ hấp thụ của rutin chuẩn

metanol nụ hòe trong metanol (0,075mg/ml)

155

Bảng A.2: Một số phương pháp phân tích rutin và các flavonoit bằng kỹ thuật HPLC (tham khảo)

Điều kiện phân tích

TT Đối tượng phân tích Cột, nhiệt độ Pha động Detector, (nm) Dòng (ml/phút)

NaH2PO4 1 Flavonoit [58] UV, 254nm 1,0 metanol:0,02M (pH=3,0):tetrahydrofuran=10:70:20(v/v/v) C18, RP18 (250mm x 4,6mm x 5μm), T0 400C

1 UV, 350nm X-Terra 1,0 (axit axetic (2,4%)/etanol/axetonitril = 35/5/10 (v/v/v)) : metanol = 70: 30

0,8 2 UV, 261nm Novapak® C18 metanol : acetic axit : H2O = 36.7%: 0.3%: 63%

trong sản 3 1,5

UV, 350nm UV, 360nm Lichrospher 100 RP – 18; 5 mm, 250x4 mm Rutin từ dịch chiết lúa mì Rutin Rutin phẩm bánh mì Rutin 4

5 1,0 UV, 360nm

LiChrospher 100RP- 18e; T0 =20 0C Các flavonol (có rutin) và flavon trong thức ăn và đồ uống

0,28% axit axetic : metanol : ACN = (35:5:10) (v/v/v) axit axetic 2,5% : axetonitril = 80:20 - A: 19% axetonitril, 5% metanol và 1% THF trong nước (pH 3,0); B: 55% axetonitrile và 15% metanol trong nước (pH 3,0) 0–15 min, 2% B; 15– 28 min, 2–28% B; 28–40 min, 28–36% B; 40–44 min, 36% B; 44–45 min, 36–80% B; 45–52 min, 80% B

156

Điều kiện phân tích

TT Đối tượng phân tích Cột, nhiệt độ Pha động Detector, (nm) Dòng (ml/phút)

6 UV, 360nm Zorbax C18, T0 40 °C 1,0

7 UV, 350nm X- Tera 1,0

8 UV Hypersil ODS C18 Rutin trong dạng thuốc rắn Rutin Flavonoit glycoside ( rutin)

9 UV, 339nm 1,0

Rutin, quercetin, eupafolin, hispidulin C18, Dynamax 250mm x 4,6mm x 5μm

C18 10 Rutin UV, 261nm Novapak® column 0,8

11 400

Phenomenex Luna 5mm C18 (2) 250 x 2mm ; T0 45°C

12 UV, 210nm C18 1 Flavonol (có rutin) trong liều uống dạng rắn Ginkgo biloba Catechin, phenolic axit gallic,rutin metanol–nước 1:1 (v/v); pH 2,8 (chỉnh bằng axit photphoric) Dung môi: (axit axetic (2,4%)/Etanol/axetonitril = 35/5/10 (v/v/v)): Metanol = 70:30 metanol và đệm phosphat, pH= 3,23 Nước được axit hóa tới pH 3,0 bằng axit photphoric; Chế độ gradien: metanol/nước 1:1 (0- 10 min) và 7:3 (10-20 min); Chế độ đẳng dòng metanol/nước (7:3) Hỗn hợp của metanol (36,7%), axit axetic (0,3%) và nước (63%) Pha động: axetonitril và 0,3% axit focmic được thay đổi sau 15 phút theo tỷ lệ từ 15:85 thành 25:75 axetonitril–đệm photphat 50mM, pH 2,5

157

Điều kiện phân tích

TT Đối tượng phân tích Cột, nhiệt độ Pha động Detector, (nm) Dòng (ml/phút)

13 355 nm Rutin Lichrospher 100RP- 18 (5mm)

14 UV, 360 nm Rutin

15 Rutin UV, 340 nm Agilent C18; T0 250C 0,8

Pha động metanol (A) và 2% axit axetic trong nước ( B); Chương trình dung môi (40% A tới 70% A trong 0±2 min, 1 ml min±1) Pha động gồm đệm 2,5% axit axetic và axetonitril (80:20) Pha động: Nước (KH2PO4 0.03M) : CH3CN : CH3OH = 10 : 10 : 80 (0 – 15 phút đầu) và 15 : 15 : 70 (15 – 30 phút tiếp theo)

16 Rutin Pha động: metanol : nước (48 : 52) 1 UV, 258nm Appolo RP18 (250x4 mm, 5 μm)

17 Rutin và quercetin C8 (guard C18)

18 Rutin từ mạch nha UV, 350nm X- Terra (xoắn X) 1 Pha động MeCN : metanol : 25mM KH2PO4 pH=3,0 (20:15:65 v/v/v) Hỗn hợp axit axetic 2,4%/etanol/axeton/axetonitril = 35/5/10/50)): metanol = 70: 30 (v/v)

158

Hình A.4: Sắc ký đồ rutin chuẩn Hình A.3: Sắc đồ dịch chiết Soxhlet 0,495mg/l

Hình A.6: Sắc ký đồ rutin chuẩn Hình A.5: Sắc ký đồ rutin chuẩn 0,990mg/l 1,485mg/l

Hình A.7: Kết quả phân tích rutin chuẩn

159

Hình A.8: Kết quả phân tích rutin trong nụ hòe Thái Nguyên

Hình A.9: Kết quả phân tích rutin trong nụ hòe Đăk lăk- K’bang

160

Hình A.10: Kết quả phân tích rutin trong nụ hòe Đăk lăk- Eaka

Hình A.11: Kết quả phân tích rutin trong nụ hòe Nghệ An (sao)

161

Hình A.12: Kết quả phân tích rutin trong nụ hòe Nghệ An (phơi)

Hình A.13: Kết quả phân tích rutin trong nụ hòe Hà Nội

162

Hình A.14: Kết quả phân tích rutin trong nụ hòe Thái Bình

Phụ lục B: Phổ GC-MS phân tích thành phần nụ hòe

Hình B.2: Sắc ký đồ của phần chiết n- Hình B.1: Sắc ký đồ của dịch chiết

hexan nụ hòe khô clorofoc nụ hòe khô

163

Hình B.3: Sắc ký đồ của dịch chiết metanol Hình B.4: Sắc ký đồ của tinh dầu nụ

nụ hòe khô hòe HB

Hình B.5: Sắc ký đồ của tinh dầu nụ hòe Hình B.6: Sắc ký đồ của tinh dầu hoa

HY hòe HB

Hình B.7: Sắc ký đồ của tinh dầu hoa

hòe HY

164

Phụ lục C: Phổ và đồ thị phần trích ly rutin

Hình C.1: Điểm chuẩn rutin 0,68g/l Hình C.2: Điểm chuẩn rutin 0,97g/l

Hình C.4: Đường chuẩn rutin (0.68; Hình C.3: Điểm chuẩn rutin 1,26g/l 0.97;1.26g/l)

Bảng C.1: Số liệu đường chuẩn rutin (0,68; 0,97;1,26g/l)

Hình C.5: Sắc đồ của rutin thô trích ly bằng etanol 700 Hình C.6: Sắc đồ của rutin thô trích ly bằng etanol 960

165

Hình C.7: Sắc đồ của rutin thô trích ly bằng Hình C.8: Sắc đồ của rutin thô trích ly bằng

)

100

HLth Htn

(

HLth H tn

(

n t

h t

n t

L H

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Etanol 70% Etanol 96%NaOH 16,67% Metanol Dung moi

10 12 14 16 18 20 22 24 26 (kg/kg) K v

metanol natrihydroxit 16,67%

Hình C.9: Hiệu suất trích ly và hàm lượng Hình C.10: Quan hệ giữa hàm lượng, hiệu

rutin trong một số dung môi trích suất trích ly rutin vào Kv

Hình C.11: Sắc ký đồ của rutin thô trích Hình C.12: Sắc ký đồ của rutin thô trích ly

ly bằng metanol (khuấy 120phút) bằng metanol (siêu âm 120phút)

166

Sơ đồ C.1: Sơ đồ công nghệ trích ly rutin từ mạch ba góc

Sơ đồ C.1 trình bày sơ đồ công nghệ trích ly rutin từ mạch ba góc quy mô

công nghiệp, trong đó: 1. Hệ thống chiết ngược dòng; 2. Thiết bị trao đổi nhiệt; 3.

Bình đong cồn; 4. Thùng chứa pha trích; 5. Máy cất chân không; 6. Sinh hàn; 7,8.

Thùng chứa cồn để thu hồi; 9. Nồi tinh chế có sinh hàn hồi lưu; 10. Phin lọc chân

không (lọc nóng); 11. Nồi chứa dichloetan đem thu hồi; 12. Nồi tinh chế rutin trong

nước sôi; 13. Nồi kết tinh; 14. Máy vẩy; 15. Sấy chân không.

Mạch ba góc khô đã cắt nhỏ được trích ly trong cồn 70-80% (3-5 lần). Pha trích được cất chân không loại dung môi ở 800C. Rutin thô được chuyển vào nồi tinh chế

bằng dicloetan (tỷ lệ dicloetan/rutin = 4/1(w/w)). Tại đây dung dịch được đun nóng

167

45-500C kèm theo khuấy khoảng 30 phút để hoà tan rutin. Sau đó dung dịch được

chuyển sang bộ phận lọc, dịch lọc được cất thu hồi dicloetan. Phần cặn rắn được

chuyển sang nồi phản ứng tiếp theo, tại đây nước được đưa vào và đun sôi để hoà

tan rutin, có kèm theo khuấy trộn (tỷ lệ nước/rutin thô = 200/1(l/kg)). Dung dịch này được chuyển sang nồi kết tinh làm lạnh đến 50C. Quá trình ly tâm được thực

hiện tiếp theo để lấy rutin tinh thể, rửa tinh thể bằng nước lạnh (có thể kết tinh lại rutin trong cồn nếu cần). Rutin tinh được sấy chân không ở 50-600C đến khi độ ẩm

đạt 0,2%. Lượng rutin thô thu được bằng khoảng 15% khối lượng nguyên đầu.

Ghi chú: ở Ba Lan, rutin thô được hòa tan trong metanol sôi, sau đó kết tủa bằng

dung dịch kiềm; ở Hungari, xử lý rutin thô bằng clorofoc, axeton sau đó kết tinh lại

hai lần.

Phụ lục D: Phần mềm quy hoạch thực nghiệm

(Phần mềm quy hoạch tuyến tính (phi tuyến) tối ưu hóa 3, 4 biến hai mức tối ưu)

clear;clc;clf

p=0.05;%Muc co nghia 0.01 0.05 0.2

% -----Quy hoach tuyen tinh--------------------------------%

y=[43.51972753

88.21042704

76.59755895

89.68641929

31.91064894

30.53389409

48.71664723

60.52835637]%ke hoach tai nhan 2^k

y0=[40.61256821

51.33775455

44.4316612]%Thi nghiem lap tai tam

%---------Quy hoach phi tuyen----------------------------------------------------

168

% y=[ ...%ke hoach tai nhan 2^k

% ...% Canh tay don 2k

% ]';%Tam n0=1

% y0=[ ]';%Thi nghiem lap tai tam

%-----------------------------------------------------------

[hang cot]=size(y);

switch hang

case 2^3

qh31(p,y,y0); shg;

case 2^3+2*3+1

qh32(p,y,y0); shg;

end

function qh31(p,yy,yy0)

% So cac yeu to

k=3;N=2^k;shs=k+2+(k-1)*k/2;

% -------------------------------------%

% Toa do khong thu nguyen

xx0=[1 1 1 1 1 1 1 1 ]';

xx1=[-1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 ]';

xx2=[-1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 ]';

xx3=[-1 -1 -1 -1 1 1 1 1]';

X=[xx0 xx1 xx2 xx3 xx1.*xx2 xx1.*xx3 xx2.*xx3 xx1.*xx2.*xx3];

%--he so pt hoi quy------

B=(X'*X)^(-1)*X'*yy;

% Danh gia tinh co nghia he so Student

f2=length(yy0)-1;

S11binh=sum((yy0-sum(yy0)/length(yy0)).^2)/f2

Sb=sqrt(S11binh/N)

t=abs(B)/Sb

169

hsvn=0;

for i=1:shs

if t(i)

B(i)=0;

hsvn=hsvn+1;

end

Bkiemdinh=B

l=shs-hsvn;

f1=N-l

studentpf2=student(p,f2)

fisherpf21=fisher(p,f2,f1)

% Kiem dinh tinh tuong hop Fisher

y=B(1)+B(2).*xx1+B(3).*xx2+B(4).*xx3+B(5).*xx1.*xx2+B(6).*xx1.*xx3+B(7).*

xx2.*xx3+B(8).*xx1.*xx2.*xx3;

Sdubinh=(sum((yy-y).^2))/f1

F=Sdubinh/S11binh

%--Viet ra man hinh--------------

if F

hold on;

fill([0 10 10 0 0],[0 0 10 10 0],'y','EdgeColor','none'); axis off;

text(0.1,9,['PTHQ bac 1 tuong hop voi buc tranh thuc nghiem:'])

text(0.5,8,['y = b0 ']);

text(1,7,'+ b1.x1 + b2.x2 + b3.x3 ');

text(1,6,'+ b12.x1.x2 + b13.x1.x3 + b23.x2.x3')

text(1,5,'+ b123.x1.x2.x3 ')

hold on;

plot([0,10],[4 4],'r');

170

text(1,3.5, ['b0= ' num2str(B(1))])

text(1,2.5, ['b1= ' num2str(B(2))]); text(4,2.5, ['b2= ' num2str(B(3))]); text(7,2.5,

['b3= ' num2str(B(4))]) ;

text(1,1.5, ['b12= ' num2str(B(5))]); text(4,1.5, ['b13= ' num2str(B(6))]);

text(7,1.5, ['b23= ' num2str(B(7))]) ;

text(1,0.5, ['b123= ' num2str(B(8))]) ;

else

hold on;

fill([0 10 10 0 0],[0 0 10 10 0],'y','EdgeColor','none'); axis off;

text(0.5,9.5,['PTHQ bac 1 khong tuong hop, can tien hanh hoi quy phi tuyen'])

end

function qh32(p,yy,yy0)

%----Cac he so--------

k=3;n0=1 ;anpha=1.215;

N=2^k+2*k+n0 ;shs=(k+1)*(k+2)/2+1;

%------Toa do khong thu nguyen----------------------------------

xx0=[1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ]';

xx1=[-1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -anpha anpha 0 0 0 0 0 ]';

xx2=[-1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 -anpha anpha 0 0 0 ]';

xx3=[-1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 0 0 -anpha anpha 0]';

x1p=xx1.^2-sum(xx1.^2)/N;

x2p=xx2.^2-sum(xx2.^2)/N;

x3p=xx3.^2-sum(xx3.^2)/N;

X=[xx0 xx1 xx2 xx3 xx1.*xx2 xx1.*xx3 xx2.*xx3 xx1.*xx2.*xx3 x1p x2p x3p];

%-----He so phuong trinh hoi quy---------------------------------------

B=inv(X'*X)*X'*yy;

%---Kiem dinh tinh co ngia Student

f2=length(yy0)-1;

171

S11binh=sum((yy0-sum(yy0)/length(yy0)).^2)/f2

Sbop=sqrt(S11binh/(sum(xx0.^2)));

Sbi=sqrt(S11binh/(sum(xx1.^2)));

Sbju=sqrt(S11binh/(sum((xx2.*xx3).^2)));

Sbjj=sqrt(S11binh/(sum(x1p.^2)));

Sbiju=sqrt(S11binh/sum((xx1.*xx2.*xx3).*2));

% Sb=sqrt(Sbop^2+Sbjj^2*(sum(xx1.^2)/N))^2

t(1)=abs(B(1))/Sbop;

t(8)=abs(B(8)/Sbiju);

for i=2:4

t(i)=abs(B(i))/Sbi;

t(i+3)=abs(B(i+3))/Sbju;

t(i+7)=abs(B(i+7))/Sbjj;

end

f2=length(yy0)-1;

hsvn=0;

for i=1:shs

if t(i)

B(i)=0;

hsvn=hsvn+1;

end

B(1)=B(1)-B(9)*(sum(xx1.^2)/N)-B(10)*(sum(xx2.^2)/N)-B(11)*(sum(xx3.^2)/N);

l=shs-hsvn;

f1=N-l

studentpf2= student(p,f2)

fisherpf2f1=fisher(p,f2,f1)

172

% Kiem dinh tinh tuong hop Fisher

y=B(1)+B(2).*xx1+B(3).*xx2+B(4).*xx3 + B(5).*xx1.*xx2 + B(6).*xx1.*xx3 +

B(7).*xx2.*xx3...

+ B(8).*xx1.*xx2.*xx3...

+ B(9).*xx1.^2+ B(10)*xx2.^2+ B(11).*xx3.^2;

Sdubinh=(sum((yy-y).^2))/(N-f1)

F=Sdubinh/S11binh

%--Viet ra man hinh--------------

if F

hold on;

fill([0 10 10 0 0],[0 0 10 10 0],'y','EdgeColor','none'); axis off;

text(0.5,9.7,['PTHQ bac 2 tuong hop voi buc tranh thuc nghiem:'])

text(0.8,9,['y = b0 '])

text(1,8.2,[' + b1.x1 + b2.x2 + b3.x3'])

text(1,7.4,[' + b12.x1.x2 + b13.x1.x3 + b23.x2.x3 '])

text(1,6.6,[' + b123.x1.x2.x3'])

text(1,5.8, [' + b11.x1^2 + b22.x2^2+b33.x3^2'])

hold on;

plot([0 10],[5.5 5.5],'r'); shg;

text(1,5, ['b0= ' num2str(B(1))]);

text(1,4, ['b1= ' num2str(B(2))]); text(4,4, ['b2= ' num2str(B(3))]);text(7,4, ['b3= '

num2str(B(4))]);

text(1,3, ['b12= ' num2str(B(5))]);text(4,3, ['b13= ' num2str(B(6))]); text(7,3,

['b23= ' num2str(B(7))]);

text(1,2, ['b123= ' num2str(B(8))]);

text(1,1, ['b11= ' num2str(B(9))]); text(4,1, ['b22= ' num2str(B(10))]); text(7,1,

['b33= ' num2str(B(11))]);

else

hold on;

173

fill([0 10 10 0 0],[0 0 10 10 0],'y','EdgeColor','none'); axis off;

text(0.5,9.5,['PTHQ bac 2 khong tuong hop voi buc tranh thuc nghiem'])

end

function f=fc(x)

% -------------------

B=[58.7130

8.5268

10.1693

-15.7906

0];

% --------------------------

[hang cot]=size(B);

switch hang

case 8

f=-sum([1 x(1) x(2) x(3) x(1)*x(2) x(1)*x(3) x(2)*x(3) x(1)*x(2)*x(3) ].*B');

case 11

f=-sum([1 x(1) x(2) x(3) x(1)*x(2) x(1)*x(3) x(2)*x(3) x(1)*x(2)*x(3) x(1)^2

x(2)^2 x(3)^2].*B');

end

clear;clc;

%___________________

%Thoi gian

Z1=[60 180];

%ty le long/ran

174

Z2=[100 200];

% Van toc

Z3=[200 400];

%______________________

x0=[0; 0; 0];

lb=[-1 -1 -1];

ub=[1 1 1];

%________________________________

%-------------

[x, fmin]=fmincon('fc',x0,[],[],[],[],lb,ub);

T=x(1)*(Z1(2)-Z1(1))/2+(Z1(1)+Z1(2))/2;

n=x(2)*(Z2(2)-Z2(1))/2+(Z2(1)+Z2(2))/2;

w=x(3)*(Z3(2)-Z3(1))/2+(Z3(1)+Z3(2))/2;

%_______________________________________

fill([0 10 10 0 0],[0 0 10 10 0],'y','EdgeColor','none'); axis off; shg;hold on;shg;

text(3,9.3,'CHUONG TRINH TOI UU HOA');

plot([0 10],[8.8 8.8],'r')

text(3,0.5,'NGUYEN THI THU HUYEN')

plot([0 10],[0.9 0.9],'r')

%______________________________

fmax=-fmin;

text(1,8,['Hieu suat lon nhat: Y_m_a_x = ' num2str(fmax) ' (%)'] )

text(1,6,['Thoi gian toi uu: T_m_a_x = ' num2str(T) ' (phut)'])

text(1,5,['Ty le long/ran toi uu : n_m_a_x = ' num2str(n) ' (ml/10g)'])

text(1,4,['Van toc toi uu : w_m_a_x = ' num2str(w) ' (vong/phut)

'])

function f=fisher(p,f2,f1)

ff2=[ 9.5 12 13.1 13.7 14 14.3 15.6

3.6 4 4.2 4.2 4.3 4.3 4.5

175

2.7 2.9 2.9 3 3 3 3

2.4 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.4

2.2 2.3 2.3 2.2 2.2 2.2 2.1

2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2

2 2 2 2 2 2 1.8

2 2 2 1.9 1.9 1.9 1.7];

ff05=[ 164.4 199.5 215.7 224.6 230.2 234 254.3

18.5 19.2 19.2 19.3 19.3 19.3 19.5

10.1 9.6 9.3 9.1 9 8.9 8.5

7.7 6.9 6.6 6.4 6.3 6.2 5.6

6.6 5.8 5.4 5.2 5.1 5 4.4

6 5.1 4.8 4.5 4.4 4.3 3.7

5.6 4.7 4.4 4.1 4 3.9 3.2

5.3 4.5 4.1 3.8 3.7 3.6 2.9];

ff01=[4052 4999 5403 6525 5764 5859 6366

89.5 99 99.2 99.3 99.4 99.3 99.5

34.1 30.8 29.5 28.7 28.2 27.9 26.1

21.2 18 16.7 16 15.5 15.2 13.5

16.3 13.3 12.1 11.4 11 10.7 9

13.7 10.9 9.8 9.2 8.8 8.5 6.9

12.3 9.6 8.5 7.9 7.5 7.2 5.7

11.3 8.7 7.6 7 6.6 6.4 4.9];

if f1>=7

f1=7;

end

switch p

case 0.2

f=ff2(f2,f1);

case 0.05

176

f=ff05(f2,f1);

case 0.01

f=ff01(f2,f1);

end

function t = student(p,f2)

Stu=[3.08 6.31 12.71 31.82 63.66 127.32 636.62

1.89 2.92 4.30 6.97 9.93 14.09 31.60

1.64 2.35 3.18 4.54 5.84 7.45 12.94

1.53 2.13 2.78 3.75 4.60 5.60 8.61

1.48 2.02 2.57 3.37 4.03 4.77 6.86

1.44 1.94 2.45 3.14 3.71 4.32 5.96

1.42 1.90 2.37 3.00 3.50 4.03 5.41

1.40 1.86 2.31 2.90 3.36 3.83 5.04];

switch p

case 0.2

j=1;

case 0.1

j=2;

case 0.05

j=3;

case 0.02

j=4;

case 0.01

j=5;

case 0.005

j=6;

case 0.001

j=7;

177

end

t=Stu(f2,j);

end

Phụ lục E: Phần tinh chế rutin

a. Tinh chế trên sắc ký cột

- Cột rửa sạch bằng hỗn hợp rửa sunfocromic, tráng và làm khô nước, bôi mỡ vào

khóa cho đều, nhồi một lớp bông thủy tinh dưới đáy cột. Cân lấy 15g silicagel (kích

thước hạt 0,063-0,2mm) cho vào cột (tính theo tỷ lệ 20-100g silicagel/1gmẫu).

Dùng đũa thuỷ tinh bọc cao su gõ nhẹ sao cho chất nhồi được nén chặt đều, bề mặt

cột phẳng. Cột sau khi nhồi có đường trong 1,2cm, chiều cao lớp chất hấp phụ là

22cm.

- Metanol được đưa vào cột, mở khóa, hút chân không cho dung môi chảy xuống,

kiểm tra thấy cột silicagel không đứt gãy hay có bọt thì phủ lên bề mặt cột một lớp

muối (Na2SO4) sau đó lại đưa metanol vào và hút ra hết [12, 19].

- Đưa hệ dung môi rửa giải vào cột, mở khóa và hút chân không cho dung môi chảy

ra khỏi cột đến khi bề mặt lớp dung môi rửa giải vừa đến mép lớp chất hấp phụ trên

cột thì đóng khóa.

- Rutin được hòa tan trong metanol, dùng pipet hút dung dịch mẫu đưa lên cột (đầu

pipet vòng quanh thành cột để mẫu chảy xuống và lan đều trên bề mặt cột). Mở

khóa cho dung môi tự chảy vài ml, đóng khóa. Đưa tiếp mẫu lên cột, mở khóa cho

dung môi chảy vài ml, đóng khóa và đưa tiếp mẫu đến hết. Quan sát thấy lớp dung

dịch rutin màu vàng trên cột tụt xuống khỏi bề mặt cột một đoạn khoảng 5mm.

- Đưa dung môi rửa giải vào đầy cột, mở khóa và điều khiển hút chân không sao

cho cho tốc độ dòng dung môi khoảng 4ml/phút, thu riêng từng phân đoạn chất ra

khỏi cột. Bổ sung dung môi sao cho bề mặt lớp chất hấp phụ không được khô. Cứ

như vậy đến khi kết thúc quá trình rửa giải, làm sạch cột (dùng 240ml metanol). - Phân đoạn rutin được cất chân không ở 600C để thu hồi dung môi và rutin tinh.

Xác định lượng rutin tinh sản phẩm và đánh giá hàm lượng bằng PP HPLC.

178

Hình E.1: Sắc ký đồ dịch rửa giải tạp chất Hình E.2: Sắc ký đồ dịch rửa giải tạp chất

của rutin thô trên cột bằng n-hexan của rutin thô trên cột bằng axeton

Hình E.3: Sắc ký đồ giải hấp rutin trên cột Hình E.4: Ảnh bản mỏng kiểm tra độ tinh

bằng metanol khiết của rutin trong quá trình tinh chế

b. Tinh chế dùng máy sắc ký điều chế

Hình E.5: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 1 Hình E.6: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 2

(vial 1) (vial 2)

179

Bảng E.1: Sự khác nhau giữa quy mô phân tích và điều chế trong sắc ký lỏng

Thông số Quy mô phân tích (HPLC) Quy mô điều chế (Pre-HPLC)

Cần thông tin về mẫu (định tính Cần đạt được lượng lớn sản

và định lượng) nên mục tiêu được phẩm tinh khiết nên công

Mục tiêu nhấn mạnh là tốc độ và độ phân suất được nhấn mạnh, còn

giải, trong khi yếu tố về lượng tốc độ và độ phân giải được

mẫu bị bỏ qua xem nhẹ hơn

Đường kính cột 2-5mm > 10mm

Đường kính hạt 10μm cấu trúc lỗ toàn thể hoặc 10μm hoặc tốt hơn 50μm cấu

nhồi 30μm cấu trúc màng mỏng trúc lỗ toàn thể

Tốc độ dòng ~ 1ml/ph > 10 ml/ph

Vận tốc pha 0,1-1 cm/giây 0,01-0,5cm/giây động

Thể tích mẫu < 200μl >1000μl

Độ nhạy Cao thấp detector

Khối lượng mẫu < 0,5mg > 100mg tiêm

Bảng E.2: Quá tải cột nồng độ và quá tải thể tích

Quá tải nồng độ Quá tải thể tích

- Áp dụng khi chất phân tích tan kém trong - Chỉ có thể áp dụng khi khả năng tan của dung môi (không pha được mẫu có nồng độ chất phân tích trong dung môi đủ lớn lớn)

Giữ nguyên nồng độ, liên tục tăng thể tích - Liên tục tăng nồng độ của mẫu tiêm

tiêm. Theo đó, peak liên tục bị biến dạng trong khi thể tích tiêm không đổi. Khi đó,

theo hướng tù dần (kiểu xung vuông). Tuy các peak ngày càng biến dạng với sự thay

nhiên, peak vẫn giữ được chiều cao và độ đổi về dạng peak tam giác

đối xứng

180

Quá trình này ngừng khi trên peak xuất

hiện rẻo thừa (roãng rộng ở chân peak), Đặc trưng của quá tải thể tích là giữ nguyên

đồng thời cực đại của peak cũng xê dịch được thời gian lưu của chất phân tích dưới

(thay đổi chiều cao peak), hầu hết các điều kiện quá tải

trường hợp đều hướng tới thời gian trễ

Hình E.7: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 3 Hình E.8: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 4

(vial 3) (vial 4)

Hình E.9: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 5 Hình E.10: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 6

(vial 5) (vial 6)

181

Hình E.11: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 7 Hình E.12: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 8

(vial 7) (vial 8)

Hình E.13: Sắc ký đồ của rutin phân đoạn 9 (vial 9)

182

n i t u r a ủ c R M N H

ổ h P : 1 . F h n ì H

Phụ lục F: Phổ phân tích cấu trúc và kim loại của rutin

183

) p ế i t ( n i t u r a ủ c R M N H

ổ h P : 2 . F h n ì H

184

) p ế i t ( n i t u r a ủ c R M N H

ổ h P : 3 . F h n ì H

185

n i t u r

R M N C

3 1

ổ h P : 4 . F h n ì H

186

n i t u r a ủ c T P E D & R M N C

3 1

ổ h P : 5 . F h n ì H

187

) p ế i t ( n i t u r a ủ c T P E D & R M N C

3 1

ổ h P : 6 . F h n ì H

188

n i t u r a ủ c C B M H ổ h P : 7 . F h n ì H

189

) p ế i t ( n i t u r a ủ c C B M H ổ h P : 8 . F h n ì H

190

) p ế i t ( n i t u r a ủ c C B M H ổ h P : 9 . F h n ì H

191

n i t u r a ủ c C Q M H ổ h P : 0 1 . F h n ì H

192

) p ế i t ( n i t u r a ủ c C Q M H ổ h P : 1 1 . F h n ì H

193

) p ế i t ( n i t u r a ủ c C Q M H ổ h P : 2 1 . F h n ì H

194

Bảng F.1: Kết quả phân tích kim loại của rutin 75,74% (bằng ICP-MS)

195

Bảng F.2: Kết quả phân tích kim loại của rutin 80,01% (bằng ICP-MS)

196

Bảng F.3: Kết quả phân tích kim loại của rutin 98,01% (bằng ICP-MS)

197

198

Phụ lục G: Thiết bị sử dụng, nguyên liệu và sản phẩm

Hình G.2. Bể siêu âm TPC-280 (30 Hình G.1: Thiết bị cất tinh dầu nụ hòe kHz), Telsonic, Thụy Sỹ

Hình G.3: Hệ thống GC-MS QP 2010, Hình G.4: Hệ thống HPLC SCL-10A

Shimadzu, Nhật vp, Shimadzu, Nhật

Hình G.5: Hệ thống pre-HPLC 1100, Hình G.6. Nụ hòe phơi Agilent, Mỹ

199

Hình G.7. Nụ hòe sao Hình G.8. Hòe nghiền

Hình G.10. Hòe xay1 Hình G.9. Hòe xay2

Hình G.11. Sản phẩm rutin thô 80,1% Hình G.12. Sản phẩm rutin tinh 98%

200

Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Khảo sát nguồn nguyên liệu, nghiên cứu nâng cao hiệu suất tách chiết và chất lượng rutin từ nụ hoa hoè Việt Nam

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm khắc phục tình trạng chưa có phương thức khai thác hiệu quả cũng như góp phần sản xuất ra rutin phục vụ cho nhu cầu làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất khẩu. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chuyên ngành: Quá trình và Thiết bị Công nghệ Hóa học Mã số: 62.52.77.01

LỜI CAM ĐOAN

Lời cảm ơn

NGƯỜI CẢM ƠN

KÝ HIỆU MỘT SỐ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU TOÁN HỌC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

∑

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

( 1

)t

( 1

)t

( 1

)t

( 1

)t

( 1

)t

( 1

)t

Cột điều chế Eclipse XDB-C18 150mm x 21,2mm, 5μm

Cột phân tích SuperlcosilTM LC-18 150mm × 4,6mm, 5μm.

F1 : 1 ml/phút (x1)max : 15 μl/lần tiêm g/lần tiêm

F2 : ~ 21,24 ml/phút (x2)max: ~ 318,6 μl/lần tiêm ~ g/lần tiêm

OH

5'

4'

6'

OH

3'

2'

1'

2

O 1

CH3

9

3

8

O

r6 r5

O

7

r4

g1

HO

O

OH

O

4

10

g1 g2

r2

g5

6

g6

O HO

5

r3 OH

OH

HO

g3

g4

HO

OH

KẾT LUẬN

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm