Luận án tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:239

Thêm vào BST

Báo xấu

48
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L trong sản xuất carrageenan (car) từ rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty nuôi trồng tại đầm Thủy Triều, xã Cam Đức, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa: tỷ lệ nước/rong khô 20/1, nồng độ enzyme thích hợp 1,45%, pH môi trường 5,1, nhiệt độ thích hợp 420 C, thời gian xử lý enzyme 60 phút; Sau khi xử lý enzyme, chiết car với tỷ lệ nước nấu/rong đã xử lý enzyme là 50/1, nhiệt độ chiết 900 C, thời gian nấu 80 phút.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi

MỤC LỤC MỤC LỤC........................................................................................................................i DANH MỤC KÝ HIỆU.................................................................................................iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT....................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH..............................................................................................ix TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN..........................................xiv MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN............... 3 1.1.1. Giới thiệu về rong sụn........................................................................................... 3 1.1.2. Giới thiệu về carrageenan ..................................................................................... 4 1.1.3. Tính chất lý hoá của carrageenan.......................................................................... 7 1.1.4. Giới thiệu một số kỹ thuật sản xuất carrageenan ................................................ 10 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ OLIGOCARRAGEENAN ............................................................................................ 13 1.2.1. Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở Việt Nam.......................................... 13 1.2.2. Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan ở nước ngoài........................................ 14 1.3. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE ............................................ 14 1.3.1. Enzyme viscozyme L và khả năng sử dụng trong sản xuất carrageenan từ rong sụn.... 14 1.3.2. Enzyme Termamyl 120L và khả năng sử dụng trong thủy phân carrageenan.... 16 1.4. MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN...17 1.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA CARRAGEENAN......................................................................................................... 19 1.5.1. Phương pháp phân tích thành phần và cấu trúc của carrageenan ...................................... 19 1.5.2. Nghiên cứu cấu trúc của carrageenan ................................................................. 22 1.6. GIỚI THIỆU VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘC CHẤT..................................................... 24 i
1.7. SURIMI VÀ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CARRAGEENAN, OLIGOCARRAGEENAN TRONG SẢN XUẤT SURIMI................................................................................................26 1.7.1. Giới thiệu về surimi............................................................................................. 26 1.7.2. Nghiên cứu ứng dụng carrageenan và oligocarrageenan trong đồng tạo gel thực phẩm.. 30 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 32 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU............................................................................................ 32 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................... 33 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu và phân tích ..................................................................... 33 2.2.2. Phương pháp tinh sạch, xác định cấu trúc và độc chất ....................................... 35 2.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................................ 41 2.4. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ........... 56 2.4.1. Hóa chất .............................................................................................................. 56 2.4.2. Thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án............................................................... 56 2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................................... 57 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 58 3.1. NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME VISCOZYME L TRONG SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY ...58 3.1.1. Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme viscozyme L........................ 58 3.1.2. Xác định chế độ chiết carrageenan ..................................................................... 66 3.2. NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN....77 3.2.1. Xác định nhiệt độ tinh sạch................................................................................. 77 3.2.2. Xác định nồng độ ethanol kết tủa protein trong tinh sạch carrageenan .............. 78 3.2.3. Xác định chế độ kết tủa carrageenan trong dung dịch car sau kết tủa protein.... 80 3.2.4. Đề xuất quy trình tinh sạch carrageenan bằng ethanol ....................................... 82 3.3. NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CARRAGEENAN THÀNH OLIGOCARRAGEENAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME POLYSACCHARASE ......................... 86 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme polysaccharase thích hợp cho thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan ................................................................................................. 86 ii
3.3.2. Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân carrageenan thành oligocar bằng enzyme Termamyl 120L .............................................................. 88 3.4. NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC CỦA OLIGOCARRAGEENAN................................................................................... 97 3.4.1. Xác định nhiệt độ tinh sạch................................................................................. 97 3.4.2. Xác định nồng độ ethanol kết tủa phân đoạn protein.......................................... 98 3.4.3. Xác định chế độ kết tủa oligocarrageenan trong dung dịch oligocarrageenan sau kết tủa protein.............................................................................................................. 100 3.4.4. Đề xuất quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng ethanol ............................. 103 3.4.5. Đánh giá độ sạch của oligocarrageenan tinh sạch............................................. 104 3.4.6. Xác định một số đặc tính cấu trúc của oligocarrageenan.................................. 107 3.5. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC CHẤT HỌC CỦA CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN .......................................................................................... 121 3.5.1. Đánh giá độc tính liều đơn ................................................................................ 121 3.5.2. Đánh giá độc tính liều lặp lại ............................................................................ 125 3.6. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN TRONG SẢN XUẤT SURIMI TỪ CÁ ĐỔNG ......................................................... 134 3.6.1. Thử nghiệm sử dụng carrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng ................ 134 3.6.2. Thử nghiệm sử dụng oligocarrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng ........ 145 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ......................................................................... 157 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................................ 159 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 160 PHỤ LỤC iii
DANH MỤC KÝ HIỆU  : Kappa  : Iota  : Lambda v/w : Thể tích/khối lượng v/v : Thể tích/thể tích kDA : kilodalton iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BLO: hồng cầu hoặc máu ẩn BIL: bilirubin Car: Carrageenan ĐVTN: động vật thí nghiệm EU: Liên minh châu Âu GLEU: bạch cầu GLU: đường niệu JECFA: Ủy ban Chuyên gia về Phụ gia Thực phẩm KPH: không phát hiện KET: Ketin Liều TB: liều trung bình MPV: thể tích tiểu cầu NIT: Nitrit; Oligocar: Oligocarrageenan Pro: Protein QCVN: quy chuẩn Việt Nam SG: tỷ trọng TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam Thận T: thận trái Thận P: thận phải URO: Urobilin w/v: khối lượng/thể tích WFT: nước cất pha tiêm vô khuẩn v
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn....................................................... 4 Bảng 1.2. Một số tính chất đặc trưng của các loại carrageenan..................................... 8 Bảng 1.3. Độ dịch chuyển hoá học sigma từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose ................................................................................................................... 21 Bảng 2.1. Thành phần hóa học chính của cá Đổng cờ.................................................. 33 Bảng 2.2. Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng......................................................... 39 Bảng 2.3. Đánh giá các biểu hiện lâm sàng trên chuột thí nghiệm an toàn .................. 39 Bảng 2.4. Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng không làm mù................................. 40 Bảng 2.5. Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính ............................. 41 Bảng 2.6. Nhiệt độ và pH tối thích của các enzyme ..................................................... 48 Bảng 3.1. Điều kiện thí nghiệm được chọn................................................................... 58 Bảng 3.2. Kết quả ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 3 ..................................... 58 Bảng 3.3. Tối ưu hóa quá trình xử lý rong sụn bằng enzyme Viscozyme L theo hàm mục tiêu sức đông của carrageenan .............................................................................. 61 Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm leo dốc theo hàm mục tiêu hiệu suất thu car từ rong sụn ........ 63 Bảng 3.5. Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc của hàm chập YL ........................... 64 Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu YL ........................................ 65 Bảng 3.7. So sánh các thí nghiệm leo dốc theo từng hàm mục tiêu ............................. 65 Bảng 3.8. Kết quả đánh giá chất lượng carrageenan theo phương pháp xử lý bằng enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất ............................................................. 74 Bảng 3.9. Thành phần hóa học chính của mẫu carrageenan trước tinh sạch ................ 77 Bảng 3.10. Nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ đông đặc của carrageenan thô ................. 77 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong kết tủa và trong dung dịch car sau tinh chế ........................................................................ 78 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa car và hàm lượng protein, lipid, car còn lại trong dung dịch ..................................................................... 80 vi
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa carrageenan................... 82 Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của carrageenan trước và sau tinh sạch .. 84 Bảng 3.15. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của carrageenan trước và sau tinh sạch......................................................................................................................... 84 Bảng 3.16. Thành phần hóa học chính của mẫu oligocarrageenan trước tinh sạch...... 97 Bảng 3.17. Nhiệt độ đông đặc và tan chảy của oligocarrageenan thô .......................... 98 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate trong kết tủa và trong dung dịch oligocar sau tinh chế ................................................. 99 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa oligocarrageenan và hàm lượng protein, lipid, oligocar còn lại trong dung dịch ......................................... 101 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng kết tủa oligocarrageenan......... 102 Bảng 3.21. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của oligocarrageenan trước và sau tinh sạch....................................................................................................................... 104 Bảng 3.22. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh vật của oligocarrageenan trước và sau tinh sạch ................................................................................................................ 105 Bảng 3.23. Kết quả phân tích thành phần hoá học của oligocarrageenan .................. 110 Bảng 3.24. Một số dải hấp thụ chính trên phổ hồng ngoại ......................................... 111 Bảng 3.25. Độ dịch chuyển hoá học 13C-NMR........................................................... 112 Bảng 3.26. So sánh độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan chuẩn (của Hãng Sigma) ............................................................................................ 114 Bảng 3.27. Độ dịch chuyển hóa học của các proton ở vị trí α ................................... 115 Bảng 3.28. Liên kết từ phổ 1H-1H COSY ................................................................... 118 Bảng 3.29. Tương tác của các proton trên phổ ROESY ............................................. 120 Bảng 3.30. Độ dịch chuyển hoá học 13C NMR và 1H NMR của oligocarrageenan.... 121 Bảng 3.31. Biểu hiện lâm sàng của chuột nhắt uống carrageenan và oligocarrageenan ...... 122 Bảng 3.32. Kết quả xét nghiệm nước tiểu chuột lang ................................................. 127 Bảng 3.33. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 21 ngày ..... 128 vii
Bảng 3.34. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, carrageenan, 42 ngày ..... 129 Bảng 3.35. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 21 ngày ... 130 Bảng 3.36. Kết quả xét nghiệm huyết học - sinh hóa máu, oligocarrageenan, 42 ngày ... 130 Bảng 3.37. Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần giải phẫu thứ nhất (ngày 21) ....................................................................................... 131 Bảng 3.38. Trọng lượng tươi trung bình của các cơ quan gan, lách, thận (2 bên) của lần giải phẫu thứ hai (ngày 42) ......................................................................................... 132 Bảng 3.39. Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm .......................................... 145 Bảng 3.40. Kết quả đánh giá surimi sản xuất thử nghiệm .......................................... 156 viii
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty............................ 3 Hình 1.2. Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose ......................................................................... 5 Hình 1.3. Cấu trúc của κ-carrageenan............................................................................. 6 Hình 1.4. Cấu trúc của -carrageenan.............................................................................. 6 Hình 1.5. Cấu trúc của -carrageenan............................................................................. 6 Hình 1.6. Sự chuyển hóa mu-carrageenan thành κ-carrageenan trong môi trường kiềm........... 7 Hình 1.7. Sự chuyển hóa nu-carrageenan thành - carrageenan trong môi trường kiềm ........ 7 Hình 1.8. Sự chuyển hóa -carrageenan thành theta-carrageenan trong môi trường kiềm .... 7 Hình 1.9. Vị trí tồn tại của carrageenan trong rong sụn................................................ 15 Hình 1.10. Quá trình thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan.......................... 16 Hình 1.11. Quá trình thủy phân tinh bột của enzyme amylase ..................................... 17 Hình 2.1. Hình ảnh về nguyên liệu rong sụn (K. alvarrezii (Doty) Doty).................... 32 Hình 2.2. Hình ảnh về cá đổng cờ (Nemipterus virgatus (Tanaka, 1916))................... 32 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát của luận án .............................................. 42 Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn..................................... 43 Hình 2.5. Sản xuất carrageenan theo phương pháp xử lý rong bằng NaOH................. 46 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn được loại enzyme amylase thích hợp cho thủy phân car thành oligocar ....................................................................................................... 48 Hình 2.7. Mô hình liên kết giữa carrageenan và protein............................................... 50 Hình 2.8. Quy trình công nghệ sản xuất surimi ............................................................ 50 Hình 2.9. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình chế biến ..................................................................53 Hình 2.10. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông .................................................54 ix
Hình 2.11. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình hấp đến hiệu suất thu hồi surimi theo thời gian bảo quản đông ........................................................................................ 55 Hình 2.12. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến độ đồng nhất của surimi trong quá trình bảo quản đông........................................ 56 Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi carrageenan ............... 66 Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan.......... 66 Hình 3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất thu nhận carrageenan .................... 68 Hình 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến sức đông và độ nhớt của carrageenan .......... 68 Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến hiệu suất thu carrageenan.................... 70 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/rong đến sức đông và độ nhớt của carrageenan ...... 70 Hình 3.7. Sơ đồ quy trình sản xuất carrageenan từ rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty bằng phương pháp sử dụng enzyme Viscozyme L......................................................... 72 Hình 3.8. Hình ảnh vi ảnh hiển vi thành tế bào rong sụn sau khi xử lý NaOH và Viscozyme L.. 74 Hình 3.9. Hình ảnh về sản phẩm carrageenan sản xuất theo quy trình sử dụng NaOH và quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong sụn.......................................... 75 Hình 3.10. Quy trình tinh sạch carrageenan tinh sạch car bằng cách sử dụng ethanol 960 để kết tủa phân đoạn protein và car ........................................................................ 83 Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan ban đầu .............................................. 85 Hình 3.12. Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan ban đầu ............................................ 85 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch...................................... 85 Hình 3.14. Phổ 13C-NMR của mẫu carrageenan sau tinh sạch.................................... 85 Hình 3.15. Ảnh hưởng của loại enzyme đến mức độ thủy phân carrageenan .............. 87 Hình 3.16. Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử tạo thành ............ 87 Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L ............................................................... 89 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl 120L đến mức độ thủy phân carrageenan.................................................................................................................... 90 x
Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH đến đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Temamyl 120L .............................................................................................................. 90 Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân carrageenan bằng enzyme Temamyl 120L................................................................................................................ 91 Hình 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Temamyl 120L................................................................................................................ 92 Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân carrageenan bằng enzyme Termamyl 120L .............................................................................................................. 92 Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L.................................................................................................. 93 Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến mức độ thủy phân car bằng enzyme Termamyl 120L ............................................................................................... 94 Hình 3.25. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử tạo thành bằng enzyme Termamyl 120L ...................................................................................... 95 Hình 3.26. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân bằng enzyme Termamyl 120L............................................................................................................. 96 Hình 3.27. Quy trình sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty.... 96 Hình 3.28. Quy trình tinh sạch oligocarrageenan bằng cách sử dụng ethanol 960 để kết tủa phân đoạn protein và oligocarrageenan................................................................. 103 Hình 3.29. Phổ 1H, 13C-NMR của mẫu oligocarrageenan sau tinh sạch..................... 106 Hình 3.30. Sự phụ thuộc độ nhớt riêng vào nồng độ dung dịch oligocarrageenan..... 107 Hình 3.31. Phổ khối lượng của oligocarrageenan....................................................... 109 Hình 3.32. Phổ sắc ký khí của mẫu oligocarrageenan nghiên cứu ............................. 110 Hình 3.33. Phổ hồng ngoại của mẫu carrageenan....................................................... 112 Hình 3.34. Phổ 13C-NMR của mẫu oligocarrageenan................................................. 112 Hình 3.35. Cấu trúc disaccharide của carrageenan lý tưởng....................................... 113 Hình 3.36. Phổ 13C-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageeanan ......................................... 115 Hình 3.37. Phổ 1H-NMR của mẫu chuẩn κ-carrageenan ........................................... 115 xi
Hình 3.38. Phổ HSQC ................................................................................................. 116 Hình 3.39. Phổ 1H-1H COSY ...................................................................................... 118 Hình 3.40. Phổ HMBC của oligocarrageenan............................................................. 119 Hình 3.41. Phổ ROESY của oligocarrageenan ........................................................... 119 Hình 3.42. Tương tác của các proton trên phân tử oligocarrageenan ......................... 120 Hình 3.43. Phổ 1H-NMR của oligocarrageenan.......................................................... 120 Hình 3.44. Tăng trọng trung bình của chuột nhắt đực uống carrageenan................... 123 Hình 3.45. Tăng trọng trung bình của chuột nhắt cái uống carrageenan .................... 123 Hình 3.46. Tăng trọng trung bình của chuột nhắt đực uống oligocarrageenan .......... 123 Hình 3.47. Tăng trọng trung bình của chuột nhắt cái uống oligocarrageenan............ 124 Hình 3.48. Hình ảnh giải phẫu của chuột nhắt trong nghiên cứu tính an toàn ........... 125 Hình 3.49. Trọng lượng trung bình của chuột uống carrageenan so với nhóm chứng ...... 126 Hình 3.50. Trọng lượng trung bình của chuột uống oligocarrageenan so với nhóm chứng.... 126 Hình 3.51. Hình ảnh vi thể của gan, lách trong nghiên cứu độc chất ......................... 132 Hình 3.52. Hình ảnh vi thể của thận trong nghiên cứu độc tính ................................. 133 Hình 3.53. Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến cường độ gel của surimi ......... 135 Hình 3.54. Ảnh hưởng của nồng độ carrageenan đến tổng điểm cảm quan của surimi .. 136 Hình 3.55. Biến đổi chất lượng cảm quan của surimi khi phối trộn carrageenan trong quá trình bảo quản đông.............................................................................................. 137 Hình 3.56. Sự biến đổi cường độ gel của surimi khi phối trộn carrageenan trong quá trình bảo quản đông..................................................................................................... 138 Hình 3.57. Sự biến đổi lượng dịch thoát ra sau rã đông surimi bảo quản lạnh đông....... 139 Hình 3.58. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đông và phụ gia sử dụng đến hiệu suất thu hồi surimi cá đổng sau hấp.................................................................................... 141 Hình 3.59. Sự biến đổi hàm lượng protein tại các vị trí khác nhau của các mẫu surimi bảo quản lạnh đông ..................................................................................................... 142 xii
Hình 3.60. Quy trình sản xuất thử nghiệm surimi cá đổng ......................................... 144 Hình 3.61. Ảnh hưởng của nồng độ oligocarrageenan phối trộn đến cường độ gel của surimi cá đổng ............................................................................................................. 146 Hình 3.62. Ảnh hưởng của nồng độ oligocarrageenan phối trộn đến chất lượng cảm quan của surimi cá đổng.............................................................................................. 146 Hình 3.63. Biến đổi chất lượng cảm quan của surimi khi phối trộn oligocarrageenan trong quá trình bảo quản đông .................................................................................... 148 Hình 3.64. Sự biến đổi cường độ gel của surimi khi phối trộn oligocarrageenan trong quá trình bảo quản đông.............................................................................................. 150 Hình 3.65. Sự biến đổi lượng dịch thoát ra sau rã đông của surimi trong quá trình bảo quản lạnh đông ............................................................................................................ 151 Hình 3.66. Ảnh hưởng của quá trình hấp đến hiệu suất thu hồi surimi cá đổng trong quá trình bảo quản đông.............................................................................................. 152 Hình 3.67. Hàm lượng protein giữa các vị trí khác nhau của mẫu surimi sau quá trình bảo quản lạnh đông ..................................................................................................... 153 Hình 3.68. Quy trình sản xuất thử nghiệm surimi cá đổng ......................................... 155 xiii
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 62540105 Nghiên cứu sinh: ThS. Bùi Huy Chích Khóa: 2010 Người hướng dẫn: TS. Đỗ Văn Ninh PGS.TS. Vũ Ngọc Bội Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: 1) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L trong sản xuất carrageenan (car) từ rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty nuôi trồng tại đầm Thủy Triều, xã Cam Đức, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa: tỷ lệ nước/rong khô 20/1, nồng độ enzyme thích hợp 1,45%, pH môi trường 5,1, nhiệt độ thích hợp 420C, thời gian xử lý enzyme 60 phút; Sau khi xử lý enzyme, chiết car với tỷ lệ nước nấu/rong đã xử lý enzyme là 50/1, nhiệt độ chiết 900C, thời gian nấu 80 phút. 2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho qui trình tinh sạch car theo phương pháp kết tủa phân đoạn các thành phần có trong dung dịch car 5% ở nhiệt độ 700C bằng ethanol 960: kết tủa phân đoạn protein hòa tan và các tạp chất trong dung dịch car bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 25%, ly tâm loại bỏ kết tủa protein và tạp chất ở tốc độ 10.000 v/phút trong 15phút, thu dung dịch car và kết tủa car trong dung dịch bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 60% trong thời gian 40 phút, lọc thu kết tủa car và sơ bộ tách nước khỏi car bằng cách rửa kết tủa hai lần bằng ethanol 960, sấy khô kết tủa car bằng kỹ thuật sấy lạnh ở nhiệt độ 45±20C với tốc độ gió 2m/s. Chế phẩm car sau tinh sạch đạt các chỉ tiêu hóa lý, tiêu chuẩn kim loại nặng cũng như đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật gây bệnh của sản phẩm car dùng trong thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế. xiv
3) Luận án đã xác định được các thông số tối ưu cho quy trình sử dụng enzyme polysaccharase thủy phân car thành oligocarrageenan (oligocar): nồng độ car thích hợp 1%, nồng độ enzyme Termamyl 120 L thích hợp 0,5%, nhiệt độ thích hợp 850C, pH thích hợp 6,5, thủy phân trong 16 giờ. Sản phẩm oligocar thu được có từ 2 đến 10 monose và có khối lượng phân tử trung bình nhỏ hơn car khoảng 132 lần. 4) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho qui trình tinh sạch oligocar theo phương pháp kết tủa phân đoạn các thành phần có trong dung dịch oligocar 5% ở nhiệt độ 600C bằng ethanol 960: kết tủa phân đoạn protein hòa tan và các tạp chất trong dung dịch oligocar bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 30%, ly tâm loại bỏ kết tủa protein và tạp chất ở tốc độ 10.000 v/phút trong 15phút, thu dung dịch oligocar và kết tủa oligocar trong dung dịch bằng ethanol 960 ở nồng độ gây kết tủa 80% trong thời gian 60 phút, lọc thu kết tủa oligocar, trước khi sấy khô dùng ethanol 960 để rửa kết tủa oligocar hai lần nhằm tách bớt nước khỏi kết tủa oligocar, sấy khô kết tủa oligocar bằng kỹ thuật sấy lạnh ở nhiệt độ 45±20C với tốc độ gió 2m/s. Chế phẩm oligocar sau tinh sạch đạt các chỉ tiêu hóa lý, tiêu chuẩn kim loại nặng cũng như đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật gây bệnh của sản phẩm oligocar dùng trong thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế. 5) Đã xác định được một số đặc tính và cấu trúc của oligocar. 6) Luận án đã nghiên cứu thử nghiệm độc tính của car và oligocar trên chuột thí nghiệm cho thấy chế phẩm car và oligocar hoàn toàn không độc với chuột thí nghiệm. 7) Luận án đã nghiên cứu thử nghiệm sử dụng car và oligocar trong sản xuất surimi từ cá đổng cho thấy bổ sung car 1% hoặc oligocar 0,2% vào surimi cá đổng có thể làm tăng chất lượng, tăng tính ổn định, hạn chế biến đổi chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông. Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh xv
MỞ ĐẦU Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty được di nhập vào Việt Nam từ những năm 90 của thế kỷ trước và hiện đang được phát triển nuôi trồng tại một số địa phương như Nha Trang - Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận. Hiện rong sụn chủ yếu được người dân thương mại hóa dưới dạng rong khô nguyên liệu bán cho thương lái nước ngoài, đặc biệt là thương lái Trung Quốc [21], [26], [39]. Rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty là loại rong giàu car - một loại polysacharid có hoạt tính sinh học và được sử dụng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Hàm lượng car của rong sụn lên tới 40% trọng lượng chất khô [2], [6], [34], [37]. Hiện có nhiều nghiên cứu sản xuất car từ rong sụn và đa số các nghiên cứu sản xuất car từ rong sụn tại Việt Nam và trên thế giới đều sử dụng phương pháp hóa học để xử lý rong trong quá trình chiết car. Từ car người ta có thể thủy phân tạo thành oligocar - một loại oligosaccharide có hoạt tính sinh học và có nhiều ứng dụng trong dược học, y học và thực phẩm như làm tăng khả năng nhũ hóa thuốc, tăng khả năng tạo độ dẻo dai cho thực phẩm, kích thích sinh trưởng thực vật, hoạt tính chống oxy, hỗ trợ phòng chống và điều trị viêm loét dạ dày, … [34], [35], [36], [38]. Hiện có nhiều kỹ thuật thủy phân car thành oligocar như: phương pháp hóa học, phương pháp sử dụng tia bức xạ hay phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase. Phương pháp hóa học là phương pháp sử dụng các chất hóa học để phân cắt car thành oligocar. Phương pháp này có nhược điểm là sau khi sản xuất, hóa chất lẫn với oligocar nên quá trình tinh sạch oligocar tốn kém. Trong khi đó, phương pháp sử dụng tia bức xạ đòi hỏi phải có thiết bị bức xạ mà các phòng thí nghiệm thông thường không có. Phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase xử lý rong sụn để sản xuất car và sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân car tạo ra các oligocar có ưu điểm là ít gây ô nhiễm môi trường và người ta dễ dàng tinh sạch car cũng như oligocar khỏi enzyme polysaccharase. Chính vì thế, sản phẩm car và oligocar sản xuất theo phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase được gọi là sản phẩm sản xuất theo công nghệ “sạch”. Vì thế, hướng nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase để xử lý rong sụn trong sản xuất car và sử dụng enzyme polysaccharase phân cắt car thành oligocar đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Do vậy, luận án tiến hành “Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp enzyme và ứng dụng trong chế biến và bảo quản surimi”. 1
Mục tiêu chung của luận án Sản xuất car và oligocar từ rong sụn K. alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp sử dụng enzyme và thử nghiệm sử dụng car, oligocar trong sản xuất surimi cá đổng. Mục tiêu cụ thể của luận án - Sản xuất được car từ rong sụn K. alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase. - Sản xuất được oligocar từ rong sụn K. alvarezii Doty (Doty) bằng phương pháp sửu dụng enzyme polysaccharase. - Đánh giá được khả năng ứng dụng car và oligocar trong sản xuất surimi từ cá đổng. Nội dung nghiên cứu 1) Nghiên cứu sử dụng enzyme Viscozyme L trong sản xuất car từ rong sụn K. alvarezii (Doty) Doty. 2) Nghiên cứu tinh sạch car thu nhận từ rong sụn 3) Nghiên cứu thủy phân car thành oligocar bằng phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase 4) Nghiên cứu tinh sạch và xác định một số đặc tính cấu trúc của oligocar. 5) Nghiên cứu đánh giá độc chất học của car và oligocar. 6) Thử nghiệm sử dụng car và oligocar trong sản xuất surimi từ cá đổng. Ý nghĩa khoa học Lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase trong thủy phân car từ rong sụn K. alvarezii Doty (Doty) để sản xuất oligocar cũng như lần đầu nghiên cứu tinh sạch và xác định cấu trúc của oligocar thu nhận bằng phương pháp enzyme. Kết quả nghiên cứu của luận án là các dữ liệu mới và là nguồn tài liệu phục vụ cho giảng dạy thuộc lĩnh vực chế biến, cho cao học viên, nghiên cứu sinh, các nhà nghiên cứu quan tâm đến lĩnh vực này. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra sản phẩm car và oligocar từ rong sụn theo phương pháp sử dụng enzyme nên sản phẩm car, oligocar là sản phẩm “sạch”, thân thiện với môi trường. Mặt khác, kết quả nghiên cứu của luận án có thể được các doanh nghiệp ứng dụng để sản xuất và thương mại hóa sản phẩm oligocar. Do vậy, luận án sẽ góp phần mở rộng đầu ra cho nghề nuôi trồng rong sụn, hạn chế tình trạng xuất khẩu rong nguyên liệu, tăng thu nhập cho nghề nuôi trồng rong sụn và tạo điều kiện cho nghề nuôi trồng rong sụn tại Việt Nam phát triển một cách bền vững. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN 1.1.1. Giới thiệu về rong sụn Rong sụn thuộc ngành tảo hồng (Rhodophyta), Ngành phụ: Rhodophytina Lớp: Florideophyceae Lớp phụ: Rhodymeniophycidae Bộ: Gigartinales Họ: Areschougiaceae Giống: Kappaphycus Loài: bao gồm các loài alvarezii, cottonii, inermis, interme, procrusteanum, striatum. Trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là loài có sản lượng cao nhất. Hình 1.1. Hình ảnh về rong sụn Kappaphycus alvarerii (Doty) Doty Tháng 3/1993, trên cơ sở của chương trình hợp tác về Khu hệ và nguồn lợi rong biển kinh tế Việt Nam giữa Phân viện Vật liệu Nha Trang (nay là Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang) và Nhật Bản, Phân viện Vật liệu Nha Trang đã tiến hành di nhập rong sụn giống từ Nhật Bản để nghiên cứu nhân giống và thử nghiệm nuôi trồng rong sụn tại các vùng ven biển của tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận. Kết quả thử nghiệm cho thấy rong sụn hoàn toàn thích nghi với điều kiện tự nhiên ở nước ta. Từ đó đến nay, nghề nuôi trồng rong sụn phát triển mạnh ở các tỉnh: Ninh Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Kiên Giang và hiện đang là đối tượng nuôi được nhiều tỉnh ven biển miền Trung từ Nghệ An trở vào phía Nam quan tâm. Đến nay, 3
nuôi trồng rong sụn trở thành một nghề mới của Việt Nam, góp phần tạo công việc làm cho hàng ngàn lao động [21], [50], [98]. Rong sụn tươi thường có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll. Rong sụn thuộc loài đơn trụ chia thành 2 phần: Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn. Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thước lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dưỡng (car). Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố. Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lượng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong [39]. Thành phần chính của rong sụn là car. Hàm lượng car có thể chiếm đến 40% trọng lượng khô của rong sụn. Trong đó, car tan chiếm khoảng 33%, car không tan chiếm 7%. Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn nguyên liệu trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn [10] Thành Hàm Đơn vị Thành Hàm Đơn vị phần lượng tính phần lượng tính Protein 2,40 % Cu2+ 2,30 % Cellulose 4,00 % S 2,60 % Ẩm 19,40 % SO42- 8,08 ppm Tro tổng 20,00 % I- 2,30 % Car 40,00 % Cl- 6,87 % K+ 2,20 % Hg 0,01 % Na+ 2,40 % As 0,02 % Ca2+ 0,36 % Pb 0,75 % Fe3+ 0,04 Ppm Cd 0,31 % 1.1.2. Giới thiệu về carrageenan Carrageenan có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng với liên kết luân phiên của βD Galactose pyranose qua liên kết 1-3 và αD Galactose pyranose qua liên 4
kết 1-4 (hình 1.2). Các liên kết ở vị trí số 3 xuất hiện ở các gốc có 2 và 4 sunphat hoặc không có sunphat trong khi liên kết ở vị trí số 4 ở các gốc có 2 sunphat, gốc 2,6 anhydrit và 3,6 anhydrit-2-sunphat, gốc 2,6 disunphat, gốc 2,6 anhydrit và 3,6 anhydrit-2-sunphat. Hợp phần cấu tạo của car gồm có D-Galactose (17 ÷ 31%) còn L- Galactose chiếm lượng rất nhỏ. Do đó, car tạo thành chủ yếu bởi các mạch poly D- Galactose bị sunphat hoá có phân tử lượng 500 ÷ 700Dalton [16]. Các phân tích bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy car có nhiều dạng cấu trúc hoá học khác nhau. Dựa vào cấu trúc hoá học, người ta có thể phân car thành các loại như sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi. Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sunphat hoá, vị trí sunphat hoá, mức độ dehydrat hoá của chuỗi polysacharid. Khối lượng phân tử của đại phân tử car khoảng từ 105 đến 106 phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu và quá trình chiết [50], [51], [65], [87]. Hình 1.2. Cấu trúc của carrageenan với luân phiên liên kết của 1,3 βD Galactose pyranose và 1,4 αD Galactose pyranose Car tự nhiên từ các loài rong khác nhau có thể là hỗn hợp khác nhau của các loại car đã nêu ở trên. Người ta phân chia car ra hai nhóm chính: nhóm 1 chứa các loại mu, nu, kappa, iota và các dẫn xuất của chúng. Các car này tạo gel với ion K+ hoặc có thể xử lý kiềm để có tính chất tạo gel, chúng có đặc điểm là gốc đường có liên kết 1,3 hoặc không có nhóm sunphat hoá ở vị trí C4. Nhóm thứ 2 là lambda, xi, theta và các dẫn xuất của chúng. Chúng không có khả năng tạo gel ngay cả trước và sau khi xử lý kiềm. Đặc trưng của cấu trúc này là cả hai loại gốc đường liên kết 1,4 và 1,3 đều có nhóm sunphat ở ví trí C2. Ngoài ra, thành phần của car gồm có H2SO4, Ca2+ và 3,6 anhydro D-Galactose. Dạng tồn tại của car trong rong đỏ gắn với Ca2+, K+, Na+ như: R=(OSO3)2Ca hoặc R-OSO3Na, ROSO3K (R là gốc polysacharid). Hàm lượng SO3–2 cũng ảnh hưởng đến sức đông của car [16]. Về cơ bản car có 3 loại khác nhau là: κ-car, -car, -car. Trong đó, κ-car chiếm thị phần lớn nhất (80%). Mu và Nu là chất ban đầu tổng hợp nên kappa và iota, việc 5