Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:193

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh" trình bày các nội dung chính sau: Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các mẫu bệnh phẩm; Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và S. aureus; Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Lã Thị Huyền 2. PGS.TS. Nguyễn Minh Hiền Hà Nội, 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý cho phép của đồng tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin đảm bảo tính khách quan và kết quả xử lý số liệu trong nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan
ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lã Thị Huyền, Trƣởng phòng Công nghệ tế bào động vật- Viện CNSH và PGS.TS. Nguyễn Minh Hiền, Trƣởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn là những ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Các Cô đã chỉ bảo cho tôi nhiều ý kiến hƣớng dẫn qúy báu, động viên và giúp đỡ tôi giải quyết những khó khăn vƣớng mắc trong quá trình thực hiện luận án và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán bộ nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện CNSH - Viện Hàn Lâm KH và CN Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các anh chị ở khoa Sinh hoá, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt là em Nguyễn Trọng Linh đã luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô khoa CNSH - Học viện KH và CN, các thầy cô trong hội đồng nghiên cứu sinh đã nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ tôi, cho tôi các ý kiến quí báu để sửa chữa và hoàn thiện luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi chuyên tâm làm việc và hoàn thành luận án. Cuối cùng tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, các đồng nghiệp ở Khoa Nông- Lâm trƣờng Đại học Hoa Lƣ đã luôn động viên và giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và công tác. Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả NCS. Nguyễn Thị Loan
iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan …………………………………………………………………… i Lời cảm ơn………………………………………………………………………. ii Mục lục ………………………………………………........................…………. iii Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt …………………………………………. v Danh mục các bảng ……………………………………………………..……… vi Danh mục các hình………………………………………………………............ viii MỞ ĐẦU…………………………………………………………………........... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................. 3 1.1. Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …... 3 1.1.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện ……........... 3 1.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay ……………………………. 4 1.1.3. Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……………………... 7 1.2. Một số kỹ thuật phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ….. 10 1.2.1. Cấy máu và xét nghiệm sinh hoá ………………………………………. 10 1.2.2. Kỹ thuật xác định sự có mặt của DNA …………… ………………………… 11 1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …………………………… 15 1.3.1. Trên thế giới ……………………………………………………………. 15 1.3.2. Ở Việt Nam …………………………………………………………….. 17 1.4. Kháng sinh và kháng kháng sinh ở vi khuẩn …………….…………. 19 1.4.1. Kháng sinh và cơ chế tác động …………………………………………. 19 1.4.2. Kháng kháng sinh của vi khuẩn và cơ chế kháng kháng sinh ………….. 21 1.4.3. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn trên thế giới và ở Việt Nam… 28 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ……………………………………………......... 35 2.1.1. Các mẫu bệnh phẩm……...……………………………………………... 35 2.1.2. Cách tính cỡ mẫu nghiên cứu …………………………………………... 35 2.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu …………………………………………... 36 2.2.1. Nguyên vật liệu ………………………………………………………… 36
iv 2.2.2. Các thiết bị ……………………………………………………………... 36 2.2.3. Hoá chất……………………………………………………………….... 36 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………...…….... 38 2.3.1. Nhóm phƣơng pháp vi sinh truyền thống ……………………………..... 38 2.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử …………………………………………. 39 2.3.3. Phƣơng pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngƣỡng phát hiện của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR ………………………... 46 2.3.4. Phƣơng pháp thống kê ………………………………………………….. 48 2.4. Đạo đức nghiên cứu …………………………………………………… 48 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………..... 50 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện ….. 50 3.1.1. Kết quả phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm …………………....... 51 3.1.2. Tỉ lệ các loại vi sinh vật phân lập đƣợc ………………………………… 52 3.1.3. Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập …….. 53 3.2. Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện . ………. 55 3.2.1. Kết quả lựa chọn, phân tích trình tự gen đích ………………………….. 55 3.2.2. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò ………………………………………… 58 3.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với gen đích ………... 60 3.2.4. Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn ……... 71 3.2.5. Kết quả tối ƣu phản ứng realtime PCR ………….……………………... 75 3.2.6. Kết quả xác định ngƣỡng phát hiện ……………………………………. 77 3.2.7. Kết quả tạo các đối chứng dƣơng …………………….………………… 78 3.2.8. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu ……………………………….... 82 3.2.9. Kết quả xác định độ ổn định …………………………………………… 87 3.3. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E. coli ………………… 91 3.3.1. Kết quả kháng sinh đồ ………………………………………………….. 92 3.3.2. Kết quả xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng của E. coli …….. 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………...………... 105 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ Ac Acinetobacter baumannii BV Bệnh viện Ct Thresold cycle (chu kì ngƣỡng) CTX-M Cefotaxime- Munich DNA Deoxyribonucleic Axit Ec Escherichia coli ECDC European Centre for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Châu Âu) ESBL Extended-Spectrum Beta-lactamase (beta-lactamase phổ rộng) FN Fall Negative (âm tính giả) FP Fall Positive (dƣơng tính giả) GADPH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase HAI Hospital Aquired- Infections Hu Human I Intermediate (trung gian) Kp Klebsiella pneumoniae MRSA Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus MSSA Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus NK Nhiễm khuẩn NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện Pa Pseudomonas aeruginosa PCR Polymerase Chain Reaction S Sensitivity (nhạy cảm) Sa Staphylococcus aureus R Resistant (đề kháng) VSV Vi sinh vật WHO World Healthy Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây NKBV ……………………………….. 4 Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp ………. 5 Bảng 1.3. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất …. 6 Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi, mẫu dò và gen đích của các chủng vi khuẩn …… 37 Bảng 2.2. Trình tự mồi 16S rARN và gen mã hoá ESBL ………………………... 38 Bảng 2.3. Thành phần và chƣơng trình chạy phản ứng PCR …………………...... 42 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với DNA đích …………………..................................... 44 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn …………………………… 45 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn … 45 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng realtime PCR trên mẫu chủng chuẩn …………... 46 Bảng 3.1. Tỷ lệ xét nghiệm và tỷ lệ cấy dƣơng tính theo loại bệnh phẩm ……….. 51 Bảng 3.2. Tỷ lệ phân lập vi sinh vật theo loại bệnh phẩm ……………………….. 52 Bảng 3.3. Các mồi và mẫu dò cho phản ứng realtime PCR ………………............ 58 Bảng 3.4. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò với DNA của vi khuẩn A. baumannii, K. pneumoniae và DNA ngƣời ……….. 62 Bảng 3.5. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của từng cặp mồi, mẫu dò với DNA của vi khuẩn S. aureus, E. coli, P. aeruginosa………………… 64 Bảng 3.6. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn A. baumannii, K. pneumoniae và gen GADPH ………………………….. 66 Bảng 3.7. Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA của vi khuẩn E. coli, S. aureus, P. aeruginosa ……………….. 70 Bảng 3.8. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn A. baumannii, K. pneumoniae và của ngƣời (Hu) ………. 73
vii Bảng 3.9. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn E. coli, S. aureus, P. aeruginosa ………………………........ 75 Bảng 3.10. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR ở các nhiệt độ khác nhau ………………………………………...................... 76 Bảng 3.11. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với Master mix IDT và HQ ………………………………………………... 77 Bảng 3.12. Giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng multiplex realtime PCR với các nồng độ pha loãng …………………………………………………....... 77 Bảng 3.13. So sánh phƣơng pháp multiplex realtime PCR và nuôi cấy theo mẫu bệnh phẩm …………………………………………………………....... 86 Bảng 3.14. Kết quả phát hiện loại vi sinh vật bằng phƣơng pháp multiplex realtime PCR so sánh với phƣơng pháp cấy máu …………………….. 87 Bảng 3.15. Giá trị chu kì ngƣỡng của các mẫu khảo sát thời gian bảo quản ............ 88 Bảng 3.16. Tỷ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa và Acinetobacter sp ……….. 93 Bảng 3.17. Tỷ lệ kháng kháng sinh của E. coli và K. pneumonia ……………………. 94 Bảng 3.18. Tỷ lệ kháng kháng sinh của S. aureus ……………………………………... 96 Bảng 3.19. Tính nhạy cảm kháng sinh của 5 chủng E. coli …………………………... 98 Bảng 3.20. Các mẫu E. coli có mang gen ESBLs …………………………............ 100
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Định nghĩa nhiễm khuẩn bệnh viện ………………….…………… 3 Hình 1.2. Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn…. 22 Hình 1.3. Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa các vi sinh vật……………. 23 Hình 1.4. Cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn……………………….. 23 Hình 1.5. Bản đồ về tình trạng kháng kháng sinh trên thế giới đến năm 2050 29 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu …………………………………………………. 49 Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên môi trƣờng thạch máu… 50 Hình 3.2. Hình ảnh khuẩn lạc của các vi khuẩn trên môi trƣờng Chapman…. 54 Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng S. aureus, A. baumannii, E. coli, K. pneumoniae và P. aeruginosa …………. 54 Hình 3.4. Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số chủng vi khuẩn A. baumannii và P. aeruginosa ………………….. 55 Hình 3.5. Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số chủng vi khuẩn E. coli, S. aureus, K. pneumoniae ……………….. 55 Hình 3.6. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng ………………. 56 Hình 3.7. Kết quả PCR nhân bản gen bla OXA -51 like của A. baumannii, gyrB của P. aerruginossa, gen YccT của E. coli, gen Nuc của S. aureus và gen Cyt của K. pneumoniae ……………………………….. 57 Hình 3.8. Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): A. baumannii, (B): Klebsiella pneumoniae và (C): GADPH của ngƣời ………………. 61 Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại DNA của vi khuẩn (A): S. aureus, (B): E. coli, (C): P. aeruginosa ………………………………………………… 63 Hình 3.10. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hốn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn: ống đối chứng không có DNA ……….. 66 Hình 3.11. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích vi khuẩn (A): A. baumannii, (B), K. pneumoniae và (C) 67 DNA ngƣời …………………………………………………
ix Hình 3.12. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn: ống có hốn hợp các DNA đích …………. 68 Hình 3.13. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn ống không có đối chứng ………………… 68 Hình 3.14. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn …………………………………………... 69 Hình 3.15. Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩn ống có hỗn hợp các DNA đích ………...... 70 Hình 3.16. Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng chuẩn (A): A. baumannii, (B): K. pneumoniae và (C): GADPH của ngƣời ….......................... 72 Hình 3.17. Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng (A): E. coli, (B): S. aureus và P. aeruginosa .........…………………………………..... 74 Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen Cyt của chủng K. pneumoniae ……………………………………………………….. 78 Hình 3.19. Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) vào tế bào E. coli chủng DH5α ………………………………………....... 79 Hình 3.20. Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi KpCytF/R ……… 80 Hình 3.21. Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp mang gen Cyt ………………… 80 Hình 3.22. Biểu đồ khuếch đại DNA của một số chủng chuẩn K. pneumoniae 83 Hình 3.24. Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dƣơng là các chủng vi khuẩn S. aureus, P. aeruginosa, E. coli sau thời gian bảo quản……. 89 Hình 3.25. Biểu đồ khuếch đại DNA của các mẫu đối chứng dƣơng là các chủng A. baumannii, K. pneumoniae, Hu sau thời gian bảo quản… 90 Hình 3.26. Hình ảnh kiểm tra khả năng kháng một số loại kháng sinh của 5 vi khuẩn A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli và S. aureus……………………………………………………………….. 92 Hình 3.27. Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen SHV, TEM ……..... 99 Hình 3.28. Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen CTX-M …………... 99
1 MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện (HospitalAquiredInfections-HAI) (NKBV) là một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu trong công tác chăm sóc sức khoẻ tại Việt Nam cũng nhƣ trên toàn thế giới. NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn tới làm tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần. Ngoài ra NKBV còn góp phần gây ra tình trạng kháng thuốc của một số vi khuẩn và làm gia tăng việc xuất hiện những tác nhân gây bệnh mới. Tác nhân gây NKBV đã có nhiều thay đổi trong vài thập kỷ qua. Các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện có thể là các vi khuẩn Gram dƣơng và các trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng. Trong đó NKBV do trực khuẩn Gram âm đa kháng thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một tai họa thực sự cho các bệnh viện. Nuôi cấy vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên phƣơng pháp này còn nhiều hạn chế nhƣ: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày) tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết quả cấy máu âm tính cũng không loại trừ đƣợc nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) có thể không thể hiện đầy đủ cộng đồng vi sinh vật trong vết thƣơng. Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân đƣợc cho là phƣơng pháp có độ nhạy và chính xác cao, thời gian phát hiện nhanh, có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán nhiễm khuẩn. Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm do nƣớc ngoài sản xuất để phát hiện vi sinh vật trong máu và dịch cơ thể đã thu đƣợc nhiều thành công, tuy nhiên chế tạo bộ sinh phẩm để có thể chủ động trong chẩn đoán, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam là yêu cầu đối với ngành y tế. Với mong muốn phát triển một bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để xác định nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đƣa ra đƣợc quyết định phù hợp nhằm tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí
2 điều trị cũng nhƣ tác dụng phụ chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh” với 3 mục tiêu sau: 1. Phân lập và định danh đƣợc các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến thƣờng gặp. 2. Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus. 3. Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc và khảo sát sự tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended- Spectrum Beta- lactamase: ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli. Nội dung nghiên cứu: 1. Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các mẫu bệnh phẩm. 2. Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và S. aureus. 3. Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli. Tính mới của luận án 1. Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và S. aureus. 2. Luận án đã cung cấp các thông tin mới về tỷ lệ phân lập và tỷ lệ kháng một số loại kháng sinh của 5 vi khuẩn: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và S. aureus và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli tại bệnh viện Thanh Nhàn.
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện 1.1.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện Trong thời kỳ trung cổ, các bệnh viện đã đƣợc thành lập để điều trị các nạn nhân bệnh dịch hạch và sau đó là các bệnh viện với các nhân viên y tế đang phục vụ xã hội nhƣ hiện nay. Năm 1869, Sir James Young Simpon đã thực hiện nghiên cứu dịch tễ học bệnh viện với hơn 4000 bệnh nhân ở Scotlen và Anh, và ông nhận thấy tỷ lệ tử vong cao hơn ở những bệnh nhân đã đƣợc ở lại trong bệnh viện điều trị hậu phẫu. Ông đã sử dụng thuật ngữ “hospitalism” cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóc tại bệnh viện. Sau nhiều năm các công trình nghiên cứu chuyên sâu của các tác giả Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Josheph Lister và Rober Koch đã xác định đƣợc các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện và giới thiệu các nguyên tắc khắc phục chính nhƣ rửa tay và khử trùng các dụng cụ trong phẫu thuật giảm sự lan truyền của bệnh và tử vong [1]. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện. Nhiễm khuẩn thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện” [2] (Hình 1.1). Hình 1.1. Thời gian xảy ra nhiễm khuẩn bệnh viện [2] Để chẩn đoán NKBV ngƣời ta thƣờng dựa vào định nghĩa và tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng vị trí NKBV. Ví dụ nhiễm khuẩn vết mổ sau phẫu thuật, nhiễm khuẩn máu có liên quan đến dụng cụ đặt trong lòng mạch, nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu. Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học các nhà khoa học đã xác định có
4 khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra tại bệnh viện. NKBV dẫn đến nhiều hệ luỵ cho ngƣời bệnh và hệ thống y tế nhƣ tăng biến chứng và tử vong cho ngƣời bệnh, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến 15 ngày, tăng sử dụng kháng sinh dẫn đến tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật và tăng chi phí điều trị [3], [4]. 1.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay 1.1.2.1. Trên thế giới Tại Châu Âu (2016-2017), tỷ lệ NKBV của khu vực là 6,3% trong đó các nhiễm khuẩn (NK) thƣờng gặp nhất là: nhiễm khuẩn hô hấp (41,8%), nhiễm khuẩn tiêu hoá (20,8%), nhiễm khuẩn tiết niệu (18,4%), tiếp đến là nhiễm khuẩn sau khi phẫu thuật, nhiễm khuẩn da và mô mềm và một số nhiễm khuẩn khác [5], [6]. Theo báo cáo của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Châu Âu (ECDC), tỷ lệ các vi khuẩn gây NKBV (2017) tại một số nƣớc Châu Âu và tỷ lệ chung cho cả khu vực [7] thể hiện trên Bảng 1.1. Bảng 1.1. Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện [7] Vi khuẩn Bỉ (%) Pháp (%) Ý (%) UK (%) Châu Âu (%) P. aeruginosa 17,1 23,1 19,4 7,2 19,9 S. aureus 12,2 18,0 20,1 30,6 18,5 K. pneumoniae 13,4 11,5 17,6 9,0 15,2 E. coli 20,7 12,2 9,7 18,9 13,5 A. baumannii 0 2,7 14,7 1,8 4,5 Nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Truyễn Nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia, (từ 7/2016 đến 7/2018), tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV K. pneumoniae (14%), A. baumannii (13,2%), P. aeruginosa (10,8%), E. coli (1,2%), S. aureus (1,6%) [8]. Các nghiên cứu tại một số quốc gia về tỷ lệ mắc NKBV và loại NK hay gặp:
5 Bảng 1.2. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp tại một số quốc gia Năm Tên quốc gia Tỷ lệ NKBV NKBV có tỷ lệ cao nhất NK tiết niệu: 24,3% BV Đại học Martin- 2013 5,2%. NK hô hấp: 22,7% Slovakia [9] NK phẫu thuật: 22,7% Viêm phổi bệnh viện 2015 Mỹ [10] 3,2% NK đƣờng tiêu hoá, NK tại chỗ phẫu thuật. 2016 Ấn Độ [11] 3,7% NK tiết niệu 31,9% Viêm phổi: 23,4% 2017 Canada [12] 7,3% NK vết mổ: 20,2% NK máu: 15,2% NK vết mổ: 29,0% NK đƣờng hô hấp dƣới 2017 Swizeland [13] 4,5% 18,2% NK đƣờng tiết niệu:14,9% NK máu:12,8% 2016-2018 BV Đại học truyền NK tiết niệu: 36,3% nhiễm và bệnh Nhiệt NK máu: 19,6% đới Serbia [8] Viêm phổi:15,7% 1.1.2.2. Tại Việt Nam Tình hình NK tại Việt Nam chƣa đƣợc xác định đầy đủ, ít có tài liệu và giám sát về NKBV đƣợc công bố. Nghiên cứu của bệnh viện (BV) Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng và VINAREX (2013) khảo sát trên 3671 bệnh nhân của 15 khoa Hồi sức tích cực tại 15 BV của 3
6 miền cho thấy tỷ lệ NKBV là 27,3% và tỷ lệ các loại vi khuẩn thƣờng gặp: A. baumannii (31%), P. aeruginosa (18%), K. pneumoniae (12%) và S. aureus (6%) [14]. Các nghiên cứu gần đây của các BV về tỷ lệ NKBV và NK có tỷ lệ cao nhất: Bảng 1.3. Tỷ lệ NKBV và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất Tỷ lệ NKBV có tỷ lệ cao Năm Khu vực NKBV nhất 2015-2016 BV Sản nhi- Ninh Bình [15] 7,17% NK hô hấp: 56,73%, 2016 Đại học Y dƣợc Huế [16] 5,2% NK Vết mổ: 60% 2106 BV TW Quân Đội 108 [17] 3,86% NK vết mổ: 37,25%. 2016-2017 BV Đa Khoa Ninh Thuận [18] 2,4% NK hô hấp: 40,6% 2016-2017 BV Đa Khoa Nông Nghiệp [19] 6,94%. NK hô hấp: 55,55% 2017 BV Đa Khoa Vĩnh Phúc [20] 2,7% NK hô hấp: 42% Tỷ lệ NKBV ở Việt Nam tƣơng đƣơng với các kết quả nghiên cứu của WHO với qui mô vùng, quốc gia và liên quốc gia, tỉ lệ này dao động từ 2,7% đến 10% ngƣời bệnh nhập viện, trong đó các vi khuẩn gây NKBV chủ yếu là các trực khuẩn Gram âm với tỷ lệ gần 70% với các vi khuẩn: A. baumannii, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli, các vi khuẩn Gram dƣơng chiếm khoảng 30% chủ yếu là S. aureus. Một số nghiên cứu tại các bệnh viện về tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV:
7 Bảng 1.4. Tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện Tên các bệnh viện Ac Pa Kp Ec Sa BV Chợ Rẫy-2014 [21] 59,3 12 12 3,3 5,8 BV Bạch Mai-2015[22] 21,4 14,3 34,8 14,3 / BV Đa khoa Phú Thọ-2016 [23] 21,5 14,45 7,1 7,1 14,4 BV Sản- Nhi Ninh Bình (2015-2016) [15] 7,7 20,2 25 13,5 22,1 BV Đa khoa Nông nghiệp (2016-2017) [19] / 13,73 11,13 25,15 24,07 Ac: Acinetobacter baumannii, Pa: Pseudomonas aeruginosa, Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec: Escherichia coli, Sa: Staphylococcus aureus. 1.1.3. Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện Các tác nhân gây NKBV biến đổi theo nhóm cộng đồng dân cƣ, các chuyên khoa điều trị khác nhau và có sự khác nhau giữa các quốc gia. 1.1.3.1. Tụ cầu Staphylococcus aureus S. aureus là vi khuẩn Gram dƣơng hàng đầu gây nhiều bệnh khác nhau từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng đa dạng ở phổi, xƣơng, tim, nhiễm khuẩn huyết và đóng vai trò quan trọng trong NKBV liên quan đến truyền dịch, ống thở, nhiễm khuẩn vết bỏng và nhiễm khuẩn vết mổ. S. aureus kháng methicillin (MRSA) và S. aureus mẫn cảm với methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây NKBV dẫn tới điều trị khó khăn [24]. Trong thập kỷ qua các trƣờng hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA gây NKBV và NK mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tuỷ xƣơng, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [25]. MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a, đây là một loại protein đƣợc gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa). Protein này có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam. Gen femA mã hoá cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó gen này đƣợc sử dụng nhƣ một marker phân tử phát hiện MRSA [26], [27]. 1.1.3.2. Vi khuẩn Acinetobacter baumannii A. baumannii là cầu trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí, không lên men glucose,
8 đƣợc tìm thấy phổ biến trong đất, nƣớc và môi trƣờng. A. baumannii có khả năng thích ứng với điều kiện và môi trƣờng sống đa dạng, tồn tại lâu trong môi trƣờng bệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế. Nhờ khả năng tạo màng sinh học (biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩn A. baumannii có thể gắn chặt vào bề mặt. Loài này đƣợc chỉ ra là nguyên nhân gây các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh viện bao gồm: nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu [28]. Theo các công trình công bố gần đây A. baumannii đã và đang trở thành vi khuẩn siêu kháng thuốc, nổi lên nhƣ tác nhân hàng đầu gây NKBV tại các bệnh viện trên thế giới. Trƣớc đây, carbapenem thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do A. baumannii, đặc biệt đối với các chủng kháng thuốc nhƣng hiện nay không còn hiệu quả bởi sự xuất hiện của các chủng đa kháng hoặc đa kháng thuốc phổ rộng. Nhiều cơ chế kháng liên quan đến tính kháng carbapenem ở A. baumannii nhƣ sản xuất carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, các protein màng bị biến đổi, tăng biểu hiện các bơm màng hay sự mất các kênh màng, thay đổi tính thấm của màng. Tính kháng với carbapenem ở A. baumannii liên quan chủ yếu tới sự biểu hiện của β-lactamase, carbapenemase; trong khi những cơ chế khác chỉ đóng vai trò thứ yếu. Bên cạnh đó, carbapenemase phổ biến nhất ở A. baumannii là β-lactamase mã hoá bởi bla-OXA. Trong một nghiên cứu của Gadsby NJ và cộng sự (2015) đã sử dụng gen bla-OXA-51 like để phát hiện A. baumannii gây nhiễm trùng đƣờng hô hấp dƣới [29]. 1.1.3.3. Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae K. pneumoniae là vi khuẩn Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn có nhiều hình thể, có khi nhƣ cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không sinh nha bào. Dễ mọc trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng nhƣ thạch dinh dƣỡng hay thạch máu, khuẩn lạc lầy nhầy, màu xám. K. pneumoniae thƣờng gây bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp, một loại vi khuẩn phát triển rất tốt trong đƣờng hô hấp của ngƣời, là mầm “bệnh cơ hội” chiếm 10% tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến trong nhiễm khuẩn
9 đƣờng tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch đồng thời là tác nhân gây bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn cộng đồng [30]. Mối nguy hiểm của K. pneumoniae trong các cơ sở y tế đang gia tăng do khả năng kháng kháng sinh phổ rộng beta-lactam của chúng. Các nghiên cứu chỉ ra rằng K. pneumoniae kháng kháng sinh phổ rộng có xu hƣớng đa kháng thuốc dẫn đến khả năng thất bại trong điều trị [31]. K. pneumoniae đã kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay nhƣ cephalosporin và carbapenem. Gadsby NJ và cộng sự (2016) trong một nghiên cứu đã chọn gen citrate synthase (gtlA) để phát hiện vi khuẩn này do gây nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp dƣới [32]. 1.1.3.4. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi, có khi xếp thành chuỗi, di động nhờ một lông duy nhất ở một cực, có pili, không có bào tử, là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tốt trên các môi trƣờng thông thƣờng, nhiệt độ 30 – 37oC, có thể mọc ở 42oC, pH: 7,0 - 7,2. P. aeruginosa phát hiện thấy có mặt ở nhiều nơi trong bệnh viện nhƣ: nền nhà, giƣờng, chăn, đệm, tay nhân viên y tế, dụng cụ y tế. Loài này đƣợc biết thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội thƣờng gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thƣơng, vết mổ, vết bỏng, từ vết thƣơng vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết và các bệnh nhân nhiễm khuẩn do P. aeruginosa thƣờng gặp nhiều ở các khoa Hồi sức cấp cứu, khoa Bỏng, khoa Tiết niệu, khoa Chăm sóc bệnh nhân sau phẫu thuật. P. aeruginosa cũng là một trong những vi khuẩn kháng kháng sinh mạnh nhất hiện nay, cũng trong cùng một nghiên cứu Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã chọn gen mục tiêu là DNA gyrase subunit B (gyrB) để phát hiện P. aeruginosa gây nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp dƣới, bởi vì gen này có tỷ lệ phát hiện cao hơn và đặc hiệu [32]. 1.1.3.5. Vi khuẩn E. coli E. coli là vi khuẩn Gram âm phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn bệnh viện và chúng đƣợc tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp và nhiễm khuẩn