Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------- BÙI THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội-2006

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------- BÙI THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 40 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS.TS. Từ Minh Koóng 2. GS.TS. Phạm Văn Ty

Hà Nội-2006

Lêi c¶m ¬n

T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n §¹i häc Quèc gia Hµ néi, Tr êng §H Khoa häc Tù nhiªn ®· ñng hé vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn vÒ c¸c thñ tôc, kinh phÝ ®Ó t«i hoµn thµnh nhiÖm vô cña mét nghiªn cøu sinh.

T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c nhÊt ®Õn PGS.TS Tõ Minh Koãng, GS.TS. Ph¹m V¨n Ty nh÷ng ng êi thÇy ®· tËn t×nh h íng dÉn vµ gióp ®ì t«i ®Ó hoµn thµnh c«ng tr×nh nghiªn cøu nµy.

T«i xin c¸m ¬n PGS.TS KiÒu H÷u ¶nh, Chñ nhiÖm Bé m«n Vi sinh vËt häc, ng êi ®· lu«n ñng hé vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi trong thêi gian t«i lµm viÖc vµ lµm luËn ¸n t¹i Bé m«n Vi sinh vËt häc, Tr êng §H Khoa häc Tù nhiªn, §H Quèc gia Hµ néi.

Hoµn thµnh b¶n luËn ¸n nµy, t«i còng ®· nhËn ® îc nhiÒu sù gióp ®ì kh¸c: c¸c thÇy c¸c c« Bé m«n Vi sinh, Khoa Sinh häc, Tr êng §H Khoa hoc Tù nhiªn ®· gióp ®ì vÒ thêi gian, ho¸ chÊt, thiÕt bÞ m¸y mãc cho c¸c thÝ nghiÖm cña luËn ¸n, c¶m ¬n TS. §ç Quyªn, Tr êng §H D îc Hµ néi ®· rÊt nhiÖt t×nh gióp t«i trong viÖc x¸c ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña chÊt kh¸ng sinh b»ng ph ¬ng ph¸p ph©n tÝch khèi phæ vµ céng h ëng tõ h¹t nh©n. Nh©n dÞp nµy t«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi tÊt c¶ sù gióp ®ì quÝ b¸u ®ã.

LuËn ¸n nµy sÏ kh«ng thÓ hoµn thµnh nÕu t«i kh«ng nhËn ® îc sù gióp ®ì vµ ñng hé lín lao tõ gia ®×nh, ng êi th©n vµ nh÷ng ng êi ®· lu«n ë bªn c¹nh t«i trong c¶ nh÷ng lóc thuËn lîi vµ khã kh¨n nhÊt ®Ó l¾ng nghe, ®éng viªn vµ chia sÎ.

Hµ néi, ngµy 21 th¸ng 2 n¨m 2006

Bïi ThÞ ViÖt Hµ

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất cứ công trình nào khác.

Hà nội, ngày 21 tháng 2 năm 2006

Tác giả

Bùi Thị Việt Hà

MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................. 14

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ................................................................................................ 14 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .................................................... 15

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 16

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH .................................................................................. 16 1.1.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) ............................................................................................ 16 1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh .................................................................... 16 1.2. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH ................................................................. 18 1.2. 1.Ức chế tổng hợp thành tế bào .......................................................................................... 19 Liên kết với protein thụ thể ......................................................................................................... 20 1.2.2. Ức chế sự tổng hợp protein .............................................................................................. 20 1.2.3. Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào ....................................................... 21 1.2.4 Ức chế các con đường trao đổi chất ................................................................................. 22 1.2.5. Ức chế sự tổng hợp axit nucleic ....................................................................................... 23 1.3. XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN. ................................. 24 1.3.1. Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ..................................................... 24 1.3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên ................................. 24 1.3.3. Những khái niệm cơ bản về xạ khuẩn ............................................................................... 26 1.3.4. Streptomyces và xạ khuẩn hiếm ........................................................................................ 27 1.3.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN ..................................................................................... 32 1.3.6. Phân loại chi Streptomyces .............................................................................................. 36 1.4. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN ................................................... 37 1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ............................................... 37 1.4.2. Công nghệ lên men CKS – Quá trình sau lên men (Downstream Processing) ................. 40 1.4.3. Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS ............................................................. 40 1.5. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CHẤT KHÁNG SINH ............................................................ 41 1.5.1. Tách chiết CKS từ hệ khuẩn ty ......................................................................................... 42 1.5.2. Tách chiết CKS từ dịch lọc ............................................................................................... 42 1.5.3. Tinh chế CKS .................................................................................................................... 43 1.5.4. Đơn vị chất kháng sinh ..................................................................................................... 43 1.5.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân. ....... 43

1.6. CÁC BỆNH THỰC VẬT DO NẤM GÂY RA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP. ............................................................................................................. 44 1.6.1. Sự lan truyền và chu kỳ phát triển của nấm gây bệnh thực vật. ...................................... 45 1.6.2. Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp ................................................................... 47 1.6.3. Thiệt hại về kinh tế do vi nấm gây ra đối với nông nghiệp .......................................... 51

1.6.4. Sơ lược về tình hình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh trong phòng chống các bệnh do vi sinh vật gây ra ở thực vật trên thế giới và ở Việt Nam ........................................................ 52 1.6.5. Các chất kháng sinh được sử dụng phòng trừ nấm gây hại thực vật. .............................. 54 1.6.6. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật ........................................................................... 59

1.6.7. Ứng dụng xạ khuẩn và các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm

gây bệnh thực vật................................................................................................................................... 59

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 62

2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT ............................................................................................ 62 2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................................................... 62 2.1.2. Hoá chất ........................................................................................................................... 62 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................................... 63 2.1.4. Các công thức môi trường ................................................................................................ 63 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 66 2.2.1. Phương pháp thu mẫu bệnh thực vật, phân lập nấm và định tên ..................................... 66 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn ..................................................................................... 67 2.2.3. Bảo quản giống ................................................................................................................ 68 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn............................................... 68 2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử .................................................................................. 71 2.2.6. Lên men tạo kháng sinh .................................................................................................... 76 2.2.7. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh ........................................................................... 78 2.2.8. Xác định một số tính chất của chất kháng sinh ............................................................... 79 2.2.9. Sản xuất chế phẩm bào tử xạ khuẩn ................................................................................. 81 2.2.10. Tìm hiểu khả năng ứng dụng .......................................................................................... 82 2.2.11. Thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng [10] ................................................................. 83

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................... 86

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN ........................................................................ 86 3.1.1. Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn .......................................... 86 3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao .......................... 88

3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CÁC CHỦNG

XẠ KHUẨN. .............................................................................................................................................. 89 3.2.1. Đặc điểm hình thái ........................................................................................................... 89 3.2.2. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................................ 90 MÀU KTCC ..................................................................................................................................... 91 3.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hoá ............................................................................................. 92 3.2.4. Hoạt tính kháng sinh ........................................................................................................ 94 3.2.5. Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu ............................................. 96 3.2.6. Phân loại ........................................................................................................................ 100

3.3. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CKS CỦA 3 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐÃ LỰA CHỌN .................. 105 3.3.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp ........................................................................ 105

3.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành CKS của 3 chủng T-41,

D-42 và TC-54 ..................................................................................................................................... 107 3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ. ..................................................................... 107 3.3.3. Động học của quá trình lên men của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu .......................... 111 3.3.4. Tối ưu hoá môi trường lên men chủng TC-54 – Phương pháp Box- Willson ................. 113 3.3.5. Lên men xốp chủng T-41 ................................................................................................ 116 3.4. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CKS TC-54 ........................................................................... 117 3.4.1. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ .......................................................................... 117 3.4.2. Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh ..................................................... 119 3.4.3. Xác định Rf của chất kháng sinh ................................................................................... 120

CHẤT KHÁNG SINH ...................................................................................................................... 121

HỆ DUNG MÔI ................................................................................................................................ 121

RF ....................................................................................................................................................... 121

3.4.4. Tách chiết CKS TC-54 bằng chất hấp phụ ..................................................................... 121 3.4.5. Tách chiết CKS TC-54 bằng nhựa trao đổi ion ............................................................. 122 3.4.6. Nhận dạng CKS TC-54 ................................................................................................... 124 3.4.7. Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn ................................ 125 3.4.8. Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC) ..................................................................................... 125 3.5. TÌM HIỂU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CKS THÔ T-41, D-42 VÀ TC-54 ........... 126

3.5.1 Ảnh hưởng của CKS trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn T-41 và TC-54 tới khả năng nảy mầm của hạt ........................................................................................................................................ 126 3.5.2. Ảnh hưởng của CKS T-4l và TC-54 đến khả năng sinh trưởng của cây ...................... 127 3.6. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ....................................................................................................... 129 3.6.1. Quy trình sản xuất chế phẩm T-41 và D-42 ................................................................... 129 3.6.2. Xác định một số tính chất của chế phẩm T-41 và D-42 .................................................. 131 3.6.3. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng .......................................................... 132

KẾT LUẬN ....................................................................................................................................... 141

KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .............................................................. 142

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN..... 143

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

CHỮ VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ

BVTV

Bảo vệ thực vật

CFU (colony forming unit)

Đơn vị hình thành khuẩn lạc

CKS

Chất kháng sinh

CMC (carboxymethyl cellulose)

carboxymethyl xenluloza

CZ (Czapek–Dox–Agar)

Môi trường Czapeck Dox

DAP (diamino acid pymelic)

Axit diamino pimelic

(DHF), dihidrofolic

axit đihidrofolic

dNTP (deoxyribonucleotide

Các loại nucleotit gồm:dATP, dCTP,

triphosphate)Deoxyribo

dGTP and dTTP dùng trong phản

ứng PCR

(PABA) para-aminobenzoic acid

Axit para-aminobenzoic

EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid)

Axit etylen diamin tetra axetic

FDA (Food and Drug Administration)

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

G (-) (+)

Vi khuẩn Gram âm, dương

HPLC ( High performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng cao áp

IR (Infrared) spectroscopy

Phổ hồng ngoại

ISP ( International Streptomyces Project)

Chương trình xạ khuẩn quốc tế

IU/ml

Đơn vị quốc tế/ml

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

Liều gây chết 50 %

LD50 (lethal dose)

MIC (Minimum inhibition concentration)

Nồng độ ức chế tối thiểu

MS ( mass spectrophotometry)

Khối phổ

MW (Molecular Weight)

Trọng lượng phân tử

NAG (N-acetylglucozamine)

N-acetylglucozamin

NAM (N-acetylmuramic)

N-acetylmuramic

NMR ( nuclear magnetic resonance)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PCR (Polymerase chain reaction)

Phản ứng chuỗi polime

PDA (Potato Dextrose Agar)

Môi trường thạch khoai tây

PG (peptidoglycan)

Thành tế bào vi khuẩn

RA (Retinaculiaperti)

Cuống sinh bào tử hình móc câu

RF (Rectiflexibiles)

Cuống sinh bào tử hơi lượn sóng

S (Spirales)

Cuống sinh bào tử dạng xoắn

SDS ( sodium docecyl sulfate)

Natri docecyl sulphat

TLC (thin layer chromatography)

Sắc ký bản mỏng

TLm ( Median Tolerance limit)

Giới hạn chịu đựng trung bình

THF (tetrahydrofolic)

axit tetrahydrofolic

U (Unit)

Đơn vị

UDP-GlcNAc

(Uridine

Diphosphate

-N-

Uridin Diphotphat-N-

acetylglucosamine)

acetylglucosamin

Vi sinh vật

VSV

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes 15

Bảng 3.1. Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất ở một số vùng 73

Bảng3.2. Đặc điểm nuôi cây của 3 chủng 78

Bảng 3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng T-41, D-42 và TC-54 79

Bảng 3.4. Khả năng đồng hoá đường của các chủng T-41, D-42 và TC-54 80

Bảng 3.5. Hoạt phổ kháng khuẩn của 3 chủng xạ khuẩn 81

Bảng 3.6. So sánh đặc điểm phân loại của chủng T-41 với loài chuẩn S. 87

antimycoticus và chủng D-42 với loài chuẩn S.viridogenes

Bảng 3.7. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn TC-54 với chủng 88

chuẩn S. hygroscopicus ISP – 5578

Bảng 3.8. Hoạt tính kháng F. oxysporum của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 93

trên các môi trường lên men khác nhau

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới khả năng sinh trưởng và tổng hợp 95 CKS của các chủng T-41, D-42 và TC-54

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất kháng 96 sinh của 3 chủng xạ khuẩn

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và sinh

97 tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC- 54

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của

98 các chủng T-41, D-42 và TC-54

101 Bảng 3.13. Tối ưu hoá môi trường theo phương pháp Box- Willson

102 Bảng 3.14. Môi trường tối ưu “lên dốc” của chủng TC-54

Bảng 3.15. Các thông số lên men của chủng TC-54 trong nồi lên men 80 lít 103

105 Bảng 1.16. Hoạt tính kháng sinh được chiết bằng các loại dung môi khác

nhau

Bảng 3.17. Hệ số Rf của CKS T-41, D-42, TC-54 trên các hệ dung môi khác 108

nhau

Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm trên cà chua 120

Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm trên bắp cải 121

Bảng 3.20. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh trước khi phun thuốc 122

Bảng 3.21. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 5 ngày sau phun thuốc 123

Bảng 3.22. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh 10, 15 và 20 ngày sau phun thuốc 124

Bảng 3.23. Tổng hợp số liệu khảo nghiệm sau 20 ngày 125

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau 5

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng của tetracylin và aminoglycosit 8

Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của macrolit và chloramphenicol 8

Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của amphotericin B 9

Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của sunfonamit trong quá trình sinh tổng hợp 10

axit folic

Hình1.6. Đồ thị về tỷ lệ các vi sinh vật sinh chất kháng sinh 12

Hình 1. 7. Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học 13

Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc Chi Streptomyces theo nhóm màu 74

Hình 3.2. Tỷ lệ phần trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh 75

Hình 3.3. Hoạt tính kháng sinh của 47 chủng xạ khuẩn 75 Hình 3. 4. Bề mặt bào tử chủng T-41 76 Hình 3.5. Bề mặt bào tử chủng D-42

76 Hình 3.6. Bề mặt bào tử chủng TC-54

77 Hình 3.7. Cuống sinh bào tử chủng TC-54

77 Hình 3.8 Hoạt tính kháng F.oxysporum của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR 82

Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 84

16S, thể hiện mối quan hệ giữa 3 chủng xạ khuẩn T-41, D-42, TC-54 và các 90 đại diện có quan hệ gần gũi thuộc chi Streptomyces

99 Hình 3.11. Động thái lên men CKS của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

104 Hình 3.12. Hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 trên môi trường lên men

xốp

Hình 3.13. Hoạt tính kháng sinh của 3 chủng nghiên cứu chiết ở các pH khác 105

nhau

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng sinh của 3 chủng xạ 106

khuẩn

Hình 3.15. Tách chiết CKS bằng than hoạt tính và giải hấp phụ bằng axeton 109

Hình 3.16. Sơ đồ phân lập chất kháng sinh TC-54-1 110

Hình 3. 17. Công thức cấu tạo của validamyxin 111 Hình 3.18. Mối tương quan giữa đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ 112 chất kháng sinh

Hình 3.19. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng T-41 lên khả năng nảy mầm 113 của hạt

Hình 3.20. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng TC-54 lên khả năng nảy 114

mầm của hạt

Hình 3.21. Ảnh hưởng của CKS TC-54 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc và 115

sinh trưởng của cây mạ

Hình 3.22. Ảnh hưởng của CKS TC-54 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc và 117

sinh trưởng của cây mạ

118 Hình 3.23. Quy trình sản xuất chế phẩm từ T-41 và D-42

119 Hình 3.24. Quy trình thử nghiệm chế phẩm T-41 và D-42

126 Hình 3.25. Diễn biến tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau 20 ngày thử nghiệm

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật như đạo ôn, khô

vằn, thối cổ rễ, mốc sương…đẫ gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm

83% trong số các bệnh ở cây trồng [173,174, 175]. Theo thống kê của Tổ chức Nông

Lương Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên

tới 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới [49,152, 187,189]. Việc sử dụng hoá

chất trong bảo vệ thực vật nhằm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở

Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ thực vật rất đa dạng. Mỗi năm Việt Nam

sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học diệt sâu bệnh. Theo thống kê năm 2004, ở

Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với 1231 tên thương phẩm [61]. Song việc sử

dụng thuốc bảo vệ thực vật thường rất độc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản

sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm

mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực Châu Á Thái Bình

Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương

trình IPM (quản lý dịch hại tổng hợp) với 3 chiến lược cơ bản chính [49, 138]:

1. Sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh.

Hướng dẫn áp dụng với các loại vi sinh vật đối kháng, các chất sinh học diệt

khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng.

2. Làm tăng các loại vi sinh vật có ích, đấu tranh chống các vi sinh vật ký sinh

cho cây ở trong đất.

3. Thúc đẩy khả năng sinh trưởng của cây trồng, làm tăng sức chống chịu của

cây.

Việt Nam là nước nông nghiệp, diện tích đất canh tác 10,126 triệu ha với sản

phẩm nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Khí hậu nhiệt

đới nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây tổn thất

nặng nề đến năng suất cây trồng. Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu USD

thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0%. [61].

Những năm vừa qua, nông dân Việt Nam cũng đã ứng dụng một số chế phẩm kháng

sinh chống nấm gây bệnh cho cây trồng như: validamyxin, jingangmixin, polioxin,

blastixidin S, kasugamyxin…nhưng đây đều là các chế phẩm nhập ngoại.

Xuất phát từ những yêu cầu đó, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay,

cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của nước ta.

Chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ” Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng

sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam”. Đề tài tập trung nghiên cứu các

chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh, tiến hành lên men, chiÕt xuÊt, tinh

chế và xác định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh có tiềm năng nhất; đưa ra quy

trỡnh sản xuất và ứng dụng trong nông nghiệp. Việc tiến hành đề tài này là cần thiết

và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh

thực vật từ các chất có hoạt tính sinh học, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp

sạch, an toàn và bền vững ở Việt Nam.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Việt Nam

Các vi nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam.

 Nội dung nghiên cứu

1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn của Việt Nam có khả năng sinh

chất kháng sinh dùng làm nguyên liệu nghiên cứu đồng thời đóng góp vào

sự tìm hiểu tính đa dạng sinh học cũng như phát hiện nguồn gen quý hiếm từ

xạ khuẩn của Việt Nam.

2. Phân loại một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm mạnh

nhất theo phương pháp sinh học phân tử.

3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh.

4. Xác định cấu trúc hoá học của chất kháng sinh.

5. Thăm dò khả năng ứng dụng.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH

1.1.1. Chất kháng sinh (Antibiotic)

Chất kháng sinh, theo khái niệm cũ là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở

nồng độ thấp (g/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (vi

khuẩn, nấm nem, nấm mốc…) một cách chọn lọc [124]. Thuật ngữ antibiotic bắt

nguồn từ chữ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, còn “bios” là sự sống. Thuật ngữ này

được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân biệt penixillin với sulfonamit

đã được phát hiện từ những năm 1930. Thuật ngữ này đã được thay đổi sau khi

penixillin và các chất kháng khuẩn khác đã được cải tiến và tổng hợp mới trong

phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng rộng rãi hơn để chỉ các

hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặc tổng hợp hoàn toàn có hiệu quả

diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như là một chất hoá

trị liệu có khả năng kháng virut, động vật nguyên sinh, tế bào ung thư…Tất cả các

CKS đều có tính độc chọn lọc. Mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng với một

nhóm vi sinh vật nhất định. Một số CKS sử dụng ngoài mục địch y học có tầm quan

trọng trong sinh thái như agroxin, bacterioxin, yếu tố gây chết (killer factor),

microxin…

1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh

Alexander Fleming, người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu

CKS – nhà sinh vật học người Anh làm việc tại viện St. Mary, London, đã phát hiện

ra penixillin vào tháng 10 năm 1928. Trong khi tiến hành thí nghiệm, ông đã quan

sát thấy một hiện tượng lạ: trên đĩa thạch đã cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus bị

nhiễm một loại nấm mốc xanh và xung quanh vùng nấm mọc thì vi khuẩn không thể

phát triển được. Điều đó chứng tỏ rằng loại nấm này đã sinh ra một chất ức chế sự

phát triển và tiêu diệt S.aureus. Fleming đã phân lập và định tên loại vi nấm này là

Penicillium notatum và đặt tên cho chất kháng khuẩn Êy là penixillin.

Một thập kỷ sau, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh vật häc vµ sinh ho¸

häc Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành

một “loại thuốc thần kỳ”. Năm 1945, A.Fleming, E.Chain và H.W. Florey đã được

nhận giải thưởng Nobel vì đã sự khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một

kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.

Năm 1939, Rene’ Jules Dubos nuôi cấy Bacillus brevis phân lập từ vùng New

Jersey và tách được một hỗn hợp gồm hai chất khác nhau là gramixidin và tiroxidin.

Sau đó ít lâu Abraham, Waksman, Schatz và Bugie [82, 135, 172] đã phát hiện ra

streptomixin, chất này có tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn G(-), đặc biệt là trực

khuẩn lao. Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh. Những năm

1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS. Hàng loạt chất

kháng sinh được phát hiện trong gia đoạn này có ứng dụng trong y học như:

actinomixin (Waksman,1940), chloramphenicol (Erhlich,1947), chlotetraxyclin

(Dugar, 1948), [172]. Trong suốt những năm 1960 và 1970, ngành công nghiệp về

kháng sinh đã bùng nổ khắp thế giới. Vào đầu năm 1970, hơn 270 CKS đã được sản

xuất. Vào những năm 1990, nhiều công ty dược phẩm đã đầu tư để nghiên cứu và

phát triển, tìm ra các chất kháng sinh mới do tình trạng kháng thuốc lan tràn của các

vi sinh vật gây bệnh. [126]. Vào khoảng những năm 1993 đến 2002, số lượng các

tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên từ 90 đến 120 (Công bố tại Hội nghị Khoa học về

tác nhân kháng khuẩn và hoá trị liệu). Tại hội nghị này 21 công ty dược phẩm lớn

đã trình bày các phương pháp để khám phá ra các CKS mới [45,129]. Như vậy, sau

hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra CKS, đến nay, số lượng CKS được phát hiện lên

tới trên 17.000 chất [46]. Tuy nhiên chỉ có 1-2 % CKS đủ tiêu chuẩn để sử dụng

rộng rãi trong thực tiễn y học. Thị trường CKS trên thế giới, theo thống kê năm

2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [174], và sẽ vẫn còn tăng khoảng 0,6% từ năm

2002-2008. Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của ngành công nghệ kháng sinh

trong nền kinh tế quốc dân. Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng

thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới, làm cho chúng ta đang phải đối mặt

với “thời kỳ hậu kháng sinh” (post antibiotic era). [89,90]. Chính vì thế nhiệm vụ

đặt ra của ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh là: một mặt cải biến các CKS cũ

để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển

(R&D) để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế tác động mới hoàn

toàn.[113].

Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng

chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút

được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế

giới. Có thể nói ngành công nghiệp sản xuất CKS vẫn đang là một trong những

hướng phát triển mạnh mẽ nhất trong công nghệ sinh học. Cùng với sự phát triển

mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và

đặc biệt là sự ra đời của công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực

nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao. Dưới đây là các mốc thời gian

phát hiện ra các CKS trong những năm vừa qua. [45,101,108,153]

Hình 1.1. Mốc thời gian tìm ra các chất kháng sinh khác nhau

1.2. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH

Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị

trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh

vật. Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và cấu

trúc hiển vi của tế bào. Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có cơ

chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có

hoạt phổ tương tự như nhau. Đồng thời nó còn phụ thuộc vào nồng độ. Một số chất

kháng sinh khi ở nồng độ thấp không những không tác dụng ức chế sinh trưởng của

vi sinh vật mà còn kích thích vi sinh vật phát triển. Ngoài ra, cùng một chất kháng

sinh như nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác động cũng có thể

không hoàn toàn giống nhau. Nhìn chung, cơ chế tác dụng của CKS được thể hiện

theo năm phương thức sau .

1.2. 1.Ức chế tổng hợp thành tế bào

Thành tế bào của vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp suất

thẩm thấu. Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglycan (PG). PG

là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polisaccarit bao gồm đơn phân là các dẫn

xuất của đường glucoza nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cách liên tục (NAG-

NAM). Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗi polisaccarit của PG

phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptit ngắn giữa các tetrapeptit của

tiểu phần NAM. Để có thể sinh trưởng và phân chia, tế bào phải tổng hợp các đơn

vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trí sinh trưởng của thành tế bào [135]. Phần

lớn các tác nhân kháng khuẩn thông thường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá

trình hình thành liên kết chéo giữa các tetrapeptit của tiểu phần NAM. Nổi bật nhất

giữa các chất này là các kháng sinh -lactam mà đại diện là penixillin và

cephalosporin. Đây là các chất kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng -

lactam. Các kháng sinh -lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắn với

transpeptidaza là enzym cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữa các chuỗi

PG, kìm hãm hoạt tính của enzym này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bào

của vi khuẩn [135]. Tuy nhiên, cần chú ý rằng các chất kháng sinh này chỉ hoạt

động ở giai đoạn tế bào đang sinh trưởng vì các tế bào già hay ở trạng thái nghỉ

không sinh tổng hợp PG. Các penixillin không thấm qua được màng ngoài của vi

khuẩn Gram (-) nên hiệu quả chống các vi khuẩn này rất thấp, tuy nhiên các

penixillin và cephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài

vi khuẩn Gram (-). Tế bào của người không có PG nên các kháng sinh -lactam rất

ít độc đối với tế bào người [135, 172].

Các chất kháng sinh khác như vancomyxin do Streptomyces orientalis sinh

ra và CKS bán tổng hợp xycloserin ức chế sự hình thành thành tế bào theo một cách

khác. Chúng cản trở trực tiếp đến sự hình thành cầu D-alanin-D-alanin liên kết các

tiểu phần NAM của các vi khuẩn Gram (+). Tuy nhiên, các vi khuẩn không có cầu

D-alanin-D-alanin có khả năng đề kháng tự nhiên đối với những chất kháng sinh

này. Một chất kháng sinh ức chế tổng hợp thành tế bào khác là bacitracin ngăn cản

sự vận chuyển các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vị trí tổng hợp của thành tế

bào. Cũng như các CKS -lactam, vancomyxin, xycloserin và bacitraxin làm gián

đoạn sự tổng hợp thành tế bào và làm tế bào bị phá vỡ do áp suất thẩm thấu [135].

Liên kết với protein thụ thể

Người ta cho rằng, một số protein liên kết với penixillin–(Peniciline Binding

Protein (PBP) nằm trên màng tế bào vi khuẩn) là các đích cho các penixillin và các

cephalosporin liên kết. Tất cả các vi khuẩn đều có loại protein này, ví dụ

Staphylococcus aureus có 4 PBP còn E.coli thì có ít nhất là 7 PBP. Các PBP này

hoạt động như các enzym và biểu hiện hoạt tính của cacbocylpeptidaza,

transpeptidaza, enđopeptidaza và transglycozylaza. Song vai trò chính xác của các

PBP, bất kể thuộc hoạt tính enzym nào, trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào,

vẫn chưa được biết rõ, và vì vậy cơ chế phân tử của hoạt động gây chết của các chất

kháng sinh nhóm β-lactam vẫn chưa được giải thích.

1.2.2. Ức chế sự tổng hợp protein

Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S của riboxom gồm

các aminoglycozit và các tetraxyclin. Aminoglycozit bao gồm streptomyxin,

gentamyxin, neomyxin, kanamyxin, amykaxin, tobramyxin…Chúng gắn vào tiểu

phần 30S của riboxom, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra sự bắt cặp không

chính xác giữa các codon của ARNt và các anticodon của ARNvc tương ứng. Kết

quả làm mã di truyền trên phân tử ARNt bị đọc sai. Ví dụ dưới tác động của

streptomyxin, codon UUU mã hoá cho phenylalanin bị đọc sai thành codon AUU

mã cho isolexin. Tetracyclin phong bế vị trí gắn của phân tử ARNvc với ARNtt ở

tiểu phần 30S, ngăn cản sự gắn bổ sung các axit amin vào chuỗi polypeptit đang

được kéo dài. [135]

Hình 1.2. Cơ chế tác động của tetracylin và aminoglycosit

Các tác nhân kháng khuẩn khác có đích tấn công là tiểu phần 50S của

riboxom. Chloramphenicol và một số chất tương tự phong bế vị trí hoạt động của

enzym xúc tác cho sự tạo thành liên kết peptit giữa các axit amin trong chuỗi

polypeptit đang kéo dài, ngăn cản sự tạo thành phân tử protein hoàn chỉnh.

Clindamyxin và các tác nhân kháng khuẩn thuộc nhóm macrolit bao gồm

erythromyxin gắn vào tiểu phần 50S ngăn cản sự dịch chuyển của riboxom từ codon

này đến codon kế tiếp. Kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sự tổng hợp phân

tử protein bị dừng lại.

Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của Macrolit và Chloramphenicol

1.2.3. Chất kháng sinh phá huỷ màng sinh chất của tế bào

Một số CKS phá vỡ màng sinh chất của các tế bào đích bằng cách tương

tác với màng sinh chất và làm tổn thương tính nguyên vẹn của nó. Đây là cơ chế

hoạt động của một nhóm chất gọi là polyen. Amphoterixin B là một polyen có khả

năng kháng nấm vì nó gắn với ergosterol-thành phần cấu tạo nên màng sinh chất

của nấm và tạo ra các lỗ rò trên màng, làm nội chất của tế bào thất thoát ra môi

trường bên ngoài. Màng sinh chất của tế bào người và động vật có thể bị tổn thương

bởi amphoterixin B vì chúng chứa cholesterol là các phân tử có cấu trúc tương tự

như ergosterol, mặc dù cách gắn của amphoterixin B với cholesterol hơi khác so với

ergosterol.

Hình 1.4. Cơ chế tác dụng của Amphotericin B

Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không có sterol nên chúng có khả năng

đề kháng với amphoterixin B. Tuy nhiên, chúng vẫn có thể bị phá vỡ bởi các polyen

khác. Ví dụ: polymyxin một polyen do Bacillus polymyxa sinh ra có khả năng

kháng đặc hiệu đối với vi khuẩn Gram (-). Polymyxin phá vỡ màng sinh chất của vi

khuẩn bằng cách gắn vào photpholipit của màng, làm biến dạng bề mặt tế bào và

thay đổi cấu trúc của màng dẫn đến sự rò rỉ một số chất của tế bào ra môi trường

bên ngoài, gây chết tế bào [135,137].

1.2.4 Ức chế các con đường trao đổi chất

Phần lớn các CKS kháng vi sinh vật theo cơ chế này đều có cấu trúc gần giống

với các chất trao đổi bình thường của tế bào như axit amin, coenzym, nên được coi

là các chất kháng chất trao đổi (antimetabolite), tác dụng theo kiểu ức chế cạnh

tranh. Ở nhiều vi sinh vật axit para-aminobenzoic (PABA) là cơ chất cho phản ứng

enzym dẫn đến sự tổng hợp axit tetrahydrofolic (THF), một dạng của axit folic đóng

vai trò như một coenzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các purin và

pyrimidin của axit nucleic. Để tổng hợp THF, PABA phải được chuyển thành axit

đihidrofolic (DHF), rồi từ DHF tổng hợp nên THF nhờ sự có mặt của các enzym

xúc tác. Sunfonamit là chất hoạt động như một chất kháng chất trao đổi vì nó có cấu

trúc hoá học gần giống với PABA. Khi có mặt sunfonamit, nó sẽ cạnh tranh với

PABA vị trí hoạt động của enzym xúc tác chuyển PABA thành DHF. Kết quả là sự

thiếu hụt DHF đã làm cản trở quá trình tổng hợp THF, ức chế sự sinh trưởng của

các vi sinh vật.

Hình 1.5. Cơ chế tác dụng của sunfonamit

trong quá trình sinh tổng hợp axit folic

Một tác nhân kháng chất trao đổi khác là trimethoprim cũng can thiệp vào quá

trình tổng hợp axit nucleic. Tuy nhiên thay vì gắn vào enzym chuyển hoá PABA

thành DHF, trimethoprim lại gắn vào enzym chuyển DHF thành THF. Các chất

kháng chất trao đổi rất có giá trị trong y học vì chúng ức chế các tế bào vi khuẩn và

động vật nguyên sinh mà không tác dụng lên tế bào người và động vật. Nguyên do

vì người không tổng hợp THF từ PABA như vi khuẩn mà thay vào đó người thu

nhận các axit folic đơn giản từ chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống rồi chuyển

chúng thành THF [135,137].

1.2.5. Ức chế sự tổng hợp axit nucleic

Axit nucleic gồm ADN và ARN là các đại phân tử sinh học không thể thiếu

được đối với sự sống của tế bào. Một số CKS cản trở quá trình sao chép ADN và

phiên mã ở vi sinh vật. Các CKS này ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp axit nucleic

bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotit, ức chế sao chép hoặc làm dừng phiên

mã. Vì sự khác biệt giữa ADN của tế bào prokaryot và eukaryot là rất nhỏ nên

những CKS ức chế sinh tổng hợp axit nucleic không những tiêu diệt vi sinh vật mà

còn độc với cả con người. Ví dụ actinomyxin gắn với ADN ức chế sự tổng hợp

ADN và phiên mã không chỉ ở các tế bào vi khuẩn gây bệnh mà còn đối với cả con

người. Các kháng sinh tổng hợp như các quinolon và fluoroquinolon có khả năng ức

chế đặc hiệu ADN của tế bào prokaryot mà ít ảnh hưởng đến các tế bào eukaryot.

Những kháng sinh này ức chế sự hoạt động của enzym tháo xoắn sợi ADN mạch

kép trong quá trình sao chép ADN của tế bào là ADN gyraza. Các kháng sinh khác

ức chế hoạt động của ARN polymeraza trong quá trình sinh tổng hợp ARN từ ADN

mạch khuôn. Một số kháng sinh bao gồm rifampin kết hợp mạnh mẽ với ARN

polymeraza của prokaryot nhưng ít ảnh hưởng đến ARN polymeraza của eukaryot

nên rifampin độc với vi khuẩn gây bệnh hơn so với con người [135, 137,153].

1.3. XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN.

1.3.1. Xạ khuẩn và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rói và đóng vai trò quan

trọng trong tự nhiên [139]. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá

hợp chất trong đất, trong nước. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu,

thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong 1 gam

đất có khoảng 29.000-2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45 % tổng số vi sinh vật

[181]. Đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60-70%

xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh.

1.3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên

Tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh bao gồm các bước sau: [7,8, 62,99,

134,178]

Thu thập các mẫu đất, bùn, nước, lá… từ các loại môi trường khác nhau.

Phân lập và thuần khiết các chủng từ các mẫu đó.

Thử khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định của các chủng

đã thuần khiết.

Chọn lựa các chủng thuần khiết có hoạt tính sinh học: kháng khuẩn, kháng

nấm, kháng u, dùng trong y học, trong nông nghiệp và trong thú y để nghiên

cứu tiếp. Lên men khối lượng lớn hơn để tách chiết CKS và xác định hoạt

tính kháng khuẩn của CKS.

Xác định phổ kháng khuẩn của CKS.

Nếu CKS là loại cần tìm thì lên men với khối lượng lớn hơn, nghiên cứu thu

nhận và tinh chế chúng.

Xác định tính chất lý, hóa và cấu trúc hóa học của chất kháng sinh (công bố

và đưa ra bản quyền)

Đánh giá CKS qua các thí nghiệm in vitro và in vivo (Hiệu lực và độ độc)

Hình 1.6. Đồ thị về tỷ lệ các chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh

( Japanese patent 1982-1999)

Phần lớn CKS lµ do xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh ra, song khả năng

sinh CKS của các chi thuộc “ xạ khuẩn hiếm” ngày càng được đặc biệt chú ý. Dưới

đây là đồ thị biểu diễn tỷ lệ các vi sinh vật sinh các chất kháng sinh theo khảo sát

năm 1982-1999 ở Nhật Bản và mục đích tuyển chọn các chất kháng sinh được ứng

dụng trong thực tiễn [107].

Những năm vừa qua, số lượng các chất kháng sinh do nấm sinh ra tăng lên

nhiều từ 10%-40% và tỷ lệ các chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra giảm đi đáng kể

từ 80% xuống 50%.

Hình 1.7. Mục tiêu tuyển chọn các chất có hoạt tính sinh học

( Japanese patent 1982-1999)

Nhìn vào đồ thị, chúng ta có thể thấy việc sử dụng chất kháng sinh trong

nông nghiệp và thú y không có sự biến động lớn lắm. Tuy nhiên, vài năm gần đây

xu thế này có vẻ giảm đi đôi chút.

1.3.3. Những khái niệm cơ bản về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn G(+), đặc biệt khác với vi sinh vật nhân

sơ là có tỷ lệ G +X cao (>70 %) , trong khi đó ở vi khuẩn là 25- 45 %, đựơc phân

biệt với các vi sinh vật khác bởi 2 đặc điểm cơ bản [108,140,166].

 Hình thái

Nhiều loại xạ khuẩn có khuẩn ty phân nhánh và tạo thành bào tử. Một số

tạo nang bào tử và động bào tử.

 Sự đa dạng về các chất trao đổi bậc 2

Có khoảng 17.000 chất kháng sinh được phát hiện từ vi sinh vật trong đó 2/3

là do xạ khuẩn sinh ra và chủ yếu là thuộc chi Streptomyces [46]

Theo quan điểm sinh thái học thì xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu

trình phân hủy các chất và có thể sử dụng chất hữu cơ khó phân giải là axit humic.

Gần đây, xạ khuẩn (Actinomycetes) được xác định thuộc bộ Actinomycetales

dựa vào trình tự ADNr 16S. Taxon này có khoảng 100 chi với 1.000 loài. Một nửa

trong số các chi này thuộc vi khuẩn điển hình như dạng cầu, dạng que, không tạo

thành khuẩn ty dạng sợi và bào tử.

Xạ khuẩn điển hình thuộc bộ Actinomycetales gồm Streptomyces,

Actinomadura, Actinoplanes, Dactylosporangium, Microbispora, Micromonospora,

Streptosporangium...Chúng sinh ra rất nhiều chất kháng sinh, kích thước genom

dạng thẳng 8-9 Mbp.

Xạ khuẩn không điển hình thuộc bộ Actinomycetales gồm: Micrococcus,

Arthrobacter, Mycobacterium, Propionibacterium... không sinh ra chất kháng sinh,

genom dạng vòng, kích thước 3-4 Mbp.

1.3.4. Streptomyces và xạ khuẩn hiếm

Xạ khuẩn điển hình được phân chia thành 2 nhóm. Streptomyces và xạ khuẩn

hiếm. Streptomyces là nhóm xạ khuẩn chiếm ưu thế trong đất, chi này có khoảng

500 loài. Xạ khuẩn hiếm lại được chia thành hơn 50 chi khác nhau và gồm nhiều

loài chưa công bố, chúng thường sinh trưởng chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ,

thường khó bảo quản và nuôi cấy trong môi trường dịch thể. Trong khi đó,

Streptomyces lại rất thuận tiện cho việc tìm kiếm và sàng lọc chất kháng

sinh.[60,108, 150].

B ảng 1.1. Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes

Glyxin Arabinoza Galactoza Chi đại diện

Meso- DAP LL- DAP

Typ thành tế bào

I + + * Streptomyces

+ + ** II Micromonospora, Actinoplane

+ III Actinomadura, Microbispora

+ + *** +*** IV Nocardia, Mycobacterium

DAP, diaminopimelic acid, Alanin và glutamic đều có mặt ở +

* Glyxin là amino axit duy nhất không chứa carbon đối xứng trong phân tử

của chúng. Do đó, glycin không có cấu hình dạng D hay L.

** Trong họ Micromonospora thì L-alanin tại vị trí số 1 của phần peptit đổi

thành glyxin ( tức là loại mất nhóm –CH3)

*** Trong nhóm xạ khuẩn có chứa axit mycolic như Norcadia và

Mycobacterium, thì thành tế bào có chứa arabinogalactan (cấu tạo bởi arabinoza

và galactoza)

Theo Lechevalier và Lechevalier, 1967, dựa vào 5000 chủng phân lập từ 16

mẫu đất, đã chia ra khu hệ xạ khuẩn trong đất như sau: Chi Streptomyces chiếm

95,43%, chi Norcadia chiếm 1,98%, Micromonospora chiếm 1,4%,

Thermomonospora 0,22%, Actinoplanes 0,2%, Microbispora 0,18%,

Streptosporangium 0,1%, Actinomadura 0,1%.

Năm 1970, Lechevalier và Lechevalier đã đưa ra tiêu chuẩn phân chia thành

tế bào của xạ khuẩn điển hình ra làm 4 typ. [91,92]. Vào những năm 1980, cấu trúc

hóa học của peptydoglycan đã được làm sáng tỏ và typ thành tế bào lại được xác

nhận lại lần nữa.

1.3.4.1.Thành tế bào typ I

Có chứa LL-DAP và glyxin. Đại diện của typ này là chi Streptomyces có

khoảng 500 loài [108]. Streptomyces là chi lớn nhất. Hầu hết các chủng thuộc chi

này đều sinh trưởng nhanh, tạo thành khuẩn ty khí sinh và tạo bào tử. Chúng sinh ra

nhiều chất kháng sinh. Trong chu trình sống của xạ khuẩn, chúng thể hiện sự biệt

hóa về hình dạng rất phức tạp, nhưng trong đất, chúng thường tồn tại dưới dạng bào

tử [77].

1.3.4.2.Thành tế bào typ II

Chứa meso-DAP, glycin và axit N-glycolyl muramic. Một số chủng thuộc họ

này có chứa 3’ OH-meso-DAP. Hầu hết các chi này thuộc họ Micromonosporaceae.

Họ này gồm các đại diện: Micromonospora, Actinoplanes, Dactylosporangium,

Catenuloplanes (lysin thay thế DAP). Hầu hết các chủng thuộc họ này đều không

tạo khuẩn ty khí sinh. Một số chủng tạo thành nang bào tử và bào tử động [108].

Arabinoza Galactoza Xyloza Maduroza

Họ

Thành phần đường

A + + _ _ Pseudonocardiaceae

Streptosporangiaceae B - - _ + Thermomonosporaceae

C - - _ _ Nocardiopsaceae

D + - + _

1.3.4.3. Thành tế bào typ III

Chứa meso-DAP. Loại này gồm rất nhiều họ như Streptosporangiaceae,

Thermomonosporaceae (thuộc nhóm Actinomadura), Nocadiopsaceae và

Pseudonocardiaceae. Xạ khuẩn có dạng meso-DAP và tạo thành khuẩn ty khí sinh

thường không dễ dàng xá định được. Họ này được phân biệt với các họ khác nhờ

thành phần đường trong toàn bộ tế bào.

1.3.4.4.Thành tế bào typ IV.

Chứa meso-DAP, arabinoza và galactoza. Những vi khuẩn thuộc nhóm này

gồm: Mycobacterium, Nocardia, Gordonia và Rhodococcus. Chúng đều có axit

mycolic, arabinogalactan và axit N-glycolyl muramic trong thành tế bào. Một số

loài gây bệnh phổi, ho gà...về hình dạng thì thường hình que hoặc đa hình, có dạng

sợi đơn giản hoặc có xu thế tạo thành các mảnh nhỏ hình que [108, 148].

1.3.4.5.Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

 Khuẩn lạc

Khác với các vi sinh vật khác, khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì,

có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc có ba lớp: lớp

vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá

trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích

luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường lên men.

Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ

thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh [7,8,176,181]. Các loài xạ khuẩn có thể tạo

các loại sắc hoà tố tan trong môi trường nuôi cấy. Hướng sinh trưởng của khuẩn ty

vào phía trong hoặc ra ngoài mặt môi trường tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty

khí sinh của khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí,

thường phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử [114,134,154].

 Khuẩn ty

Khuẩn ty của xạ khuẩn trông giống hệ sợi của vi nấm, phân nhánh và

không có vách ngăn. Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh, khoảng

30µm một nhánh. Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển là 11µm

[181], “nhân” tế bào xạ khuẩn phát triển đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty. Do

vậy, mỗi đoạn khuẩn ty hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương

lên sau 1-2giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ADN, nhân các gen cần thiết từ genom

và tiến hành tổng hợp protein. Cứ như vậy khuẩn ty hình thành và phát triển.

Xạ khuẩn thuộc nhóm cơ thể dị dưỡng, thường sử dụng nguồn cacbon

như đường, tinh bột, rượu, axit hữu cơ, polysacarit. Nguồn nitơ vô cơ thường là

nitrat, muối amon, nguồn nitơ hữu cơ là: pepton, protein, cao ngô, cao nấm

men…Khả năng đồng hóa các chất ở các loài xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.

Phần lớn chúng ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở môi trường trung tính hoặc hơi kiềm.

 Cấu trúc tế bào

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn G(+). Thành tế bào xạ khuẩn gồm 3 lớp:

lớp ngoài dày khoảng 60-120A°, khi già có thể là 150A°; lớp giữa rắn và chắc hơn,

dày khoảng 50A°, lớp trong dày 50A° được cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptit

gồm các gốc N-axetylglucozamin (NAG) liên kết với các axit N-axetylmuramic

(NAM) bởi các liên kết  1,4- glycozit. Khi xử lý bằng lizozym các liên kết này bị

phá vỡ, thành tế bào bị phá hủy để lại màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại

của tế bào gọi là thể sinh chất (protoplast). Màng tế bào xạ khuẩn chứa nhiều enzym

tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển chất qua màng [42, 77,

108, 134, 150, 171, 182].

Màng sinh chất của xạ khuẩn chủ yếu bao gồm hai thành phần là

photpholipit và protein. Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là

chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự tái sắp xếp lại các phần

tử ADN. Điều này gây ra một số hiện tượng lạ như: tạo ra tính đa hình thái, tính

kháng thuốc. Hơn nữa, sự tự nhân lên của các đoạn ADN còn làm phức tạp thêm

việc nghiên cứu di truyền của xạ khuẩn.

 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất

trong phân loại xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn

sóng (RF), dạng xoắn lò so (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản,

có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống

sinh bào tử theo hai cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu,

que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [114].

Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng

của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giầu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào

tử thường bị kìm hãm [99]. Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành

bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.

1.3.5. Phương pháp phân loại xạ khuẩn

1.3.5.1. Thành tế bào (Peptidoglycan)

Vi khuẩn có một thành tế bào riêng biệt, tại đó biểu hiện nhiều biến đổi thuận

lợi cho các tiêu chuẩn phân loại. Peptiđoglycan được tìm thấy ở tất cả các vi khuẩn

thật trừ Mycoplasma. Trong khi vi khuẩn Gram (-) có lớp peptiđoglycan mỏng với

cấu trúc thông thường thì vi khuẩn Gram (+) lại có lớp này dầy với cấu trúc biến đổi

mang tính phân loại. Có hai typ cấu trúc peptiđoglycan, typ A và typ B. Mặc dù rất

khó xác định trực tiếp những biến đổi về mặt cấu trúc nhưng các dạng này thường

được xác định thông qua thành phần axit amin của peptiđoglycan tinh sạch [108].

Ngoài sự khác biệt phức tạp này thì sự biến đổi trong liên kết chéo giữa điamino

axit cũng hữu ích cho việc phân loại và xác định đặc điểm vi khuẩn. Vì thế việc

phân tích peptiđoglycan được coi là một trong những tiêu chuẩn hoá phân loại thiết

yếu nhất cho vi khuẩn Gram(+), trong đó có xạ khuẩn. Các đồng phân axit

điaminopimelic (DAP) của peptiđoglycan, là một trong các amino axit chìa khoá

phổ biến nhất, có thể được xác định bằng một phương pháp đơn giản: thuỷ phân

toàn bộ tế bào - tiếp đó dùng phép sắc ký bản mỏng [20, 25, 67,83,127,128]. Nhiều

vi khuẩn lactic và vi khuẩn coryneform chứa lysin hoặc ornithin dưới dạng các axit

amin chìa khoá, chúng cũng được tìm thấy trong protein. Khi người ta không phát

hiện được bất cứ đồng phân DAP nào thì thành phần axit amin phải được xác định

bằng cách thuỷ phân peptiđoglycan đã tinh sạch nhờ máy phân tích axit amin tự

động hoặc phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Ngoài ra trong thành tế bào,

thành phần đường và typ thành tế bào là những chỉ số hữu ích nữa cho hoá phân

loại nói chung , đặc biệt đối với một số nhóm xạ khuẩn nói riêng [144,146, 161].

1.3.5.2.Axit béo tế bào

Các axit béo thường nằm ở màng tế bào chất của vi khuẩn và được tạo ra nhờ

con đường tổng hợp điều hoà cao. Sự biến đổi các axit béo trong tế bào vi khuẩn đủ

lớn để xác định các đặc điểm phân loại. Chuẩn bị mẫu cho các metyl este và phân

tích sắc ký khí không đặc biệt dành cho mục đích phân loại này . Người ta phân các

axit béo tế bào thành ba dạng chính [83]:

- Dạng mạch thẳng chứa các axit C15 và C18 cùng với các axit đơn không no

tương ứng,

- Dạng mạch nhánh chủ yếu chứa các axit iso và anteiso chiếm ưu thế nhưng

thiếu các axit không no. Tuy nhiên các axit mạch nhánh iso chứa các axit không

no tương ứng lại chiếm ưu thế ở dạng mạch nhánh của một số xạ khuẩn và vi

khuẩn Gram (-)

- Dạng phức, dạng này chứa thành phần của cả hai dạng trên và được tìm thấy ở

một số vi khuẩn Gram (+), chủ yếu ở xạ khuẩn .

Có một số sự biến đổi đặc biệt ở axit béo không nằm ở màng tế bào chất.

Vi khuẩn Gram (-) có vỏ tế bào đặc trưng, màng ngoài chứa axit béo 3-hyđroxy tiện

lợi làm vai trò đánh dấu ( marker) khi phân loại. Axit mycolic là axit béo 2-alkyl 3-

hyđroxy phân tử lượng cao.

1.3.5.3.Các isoprenoit quinon

Các isoprenoit quinon là chất tương tự coenzym Q của chuỗi hô hấp và được

tìm thấy nhiều trong các vi khuẩn hiếu khí. Phần lớn các vi kuẩn có thành phần các

isoprenoit quinon đơn giản, trong khí đó hầu hết các xạ khuẩn lại có thành phần này

phức tạp và đôi khi lại có các đồng phân cấu trúc.

Menaquinon là quinon ưu thế ở vi khuẩn Gram (+) chứa các isoprenoit quinon.

Vi khuẩn sống trong các môi trường khắc nghiệt thường có những quinon bất

thường. Các phân tích định tính isopren quinon cần dùng phép sắc ký lỏng cao áp

(HPLC) và đôi khi còn cần cả khối phổ ký để xác định đặc điểm loài ở cấp độ phân

tử. Phép sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật cực kỳ đơn giản và hữu dụng để mô tả

định tính tính chất của một số lượng mẫu lớn.

1.3.5.4.Thành phần bazơ của ADN

Thành phần của ADN được trình bày dưới dạng tỷ lệ G+C là một trong những

thành phần thiết yếu của genom một vi sinh vật vì người ta đã biết tỉ số A/T bằng

G/C. Tỷ lệ này ở vi khuẩn và nấm men biến đổi rất nhiều từ ít hơn 30mol% đến hơn

70mol %.[63,64,74,159]. Đây chính là những chỉ số rất giá trị dùng trong phân loại

xạ khuẩn. Phương pháp biến tính bằng nhiệt được dùng phổ biến nhằm xác định

thành phần bazơ này.[147]. Gần đây một phương pháp phân tích mới, dùng HPLC

tiếp sau việc phân hủy nhờ enzym, thành phần ADN ngày càng trở nên một chỉ số

phổ biến và thường xuyên dùng để xác định đặc điểm xạ khuẩn. Phương pháp

HPLC có một ưu điểm nữa là dung dịch ADN chứa ARN có thể được đưa vào phân

tích HPLC bằng cách tách hoàn toàn ARN trên sắc đồ. Càng nhiều số liệu được thu

thập thì độ tin cậy của tiêu chuẩn càng tăng.[81].

1.3.5.5. Lai ADN-ADN

Kỹ thuật lai ADN-ADN có thể kiểm tra được các đoạn tương đồng giữa hai vi

sinh vật bằng cách so sánh tỉ lệ tái tổ hợp khác nguồn gốc của các ADN mạch đơn.

Vì kích cỡ genom của vi khuẩn và nấm men là không quá lớn nên kỹ thuật này được

áp dụng dễ dàng ở cấp độ ADN nhiễm sắc thể. Mặc dầu có nhiều phương pháp

thông dụng để xác định mối quan hệ họ hàng của ADN, nhưng theo nhận định

chung về vi khuẩn thì ranh giới giữa các loài, sự tương đồng về ADN là khoảng

70%. Gần đây Ezaki và cộng sự đưa ra kỹ thuật sử dụng chất nền huỳnh quang thay

cho đồng vị phóng xạ. Kỹ thuật này làm cho việc sử dụng phép lai ADN-ADN để

xác định đặc điểm vi sinh vật một cách nhanh chóng. [59,108]

Phép lai ADN-ADN là phương pháp tốt nhất đưa ra một cặp kết quả cuối cùng

khi xác định đặc điểm. Cần nhớ rằng tính tương đồng ADN-ADN không phải là

một giá trị tuyệt đối như thành phần bazơ của ADN mà nó chỉ là chỉ số tương đôí

giữa các bên tham gia nên nó không phù hợp cho việc mô tả một taxon (đơn vị phân

loại) [20,22,23,80].

1.3.5.6. Trình tự ARN ribosom

Hiện nay phần lớn các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ

tương đồng về trình tự ARNr phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể vi sinh

vật [74, 97, 170]. Tất cả các loài vi sinh vật đều có cùng một cách tổng hợp protein

nhờ các riboxom. Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã

hóa ARNr ở các vi sinh vật khác nhau để xác định mối quan hệ tiến hoá giữa chúng.

ARNr là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của vi sinh vật và mối

quan hệ giữa chúng bởi vì chúng là thành phần cơ bản có trong mọi tế bào vi sinh

vật. [24,102]. Vai trò và chức năng của chúng là giống nhau ở tất cả các riboxom.

Người ta nhận thấy cấu trúc không gian của phân tử ARNr rất giống nhau giữa các

loài vi sinh vật khác nhau. Các gen mã hóa cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá

trình tiến hoá. Trong quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể bị những đột biến

nhất định, nhưng chọn lọc tự nhiên chỉ giữ lại những đột biến trung tính, ít làm thay

đổi cấu trúc không gian của ARNr, ít ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein của sinh

vật. [158,159].

Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho phân tử ARNr, các nhà

khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đổi.

So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác

biệt giữa các loài gần gũi [85]. Theo Robert W. Bauman, nếu hai loài vi khuẩn có sự

khác biệt về trình tự gen ARNr 16S lớn hơn 3% thì có thể xem là hai loài khác nhau

[135].

Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S là

lớn hơn so với phân tử ARNr 16S. Tuy nhiên trình tự đã được xác định hoàn chỉnh

của gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phong

phú và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế. Chính vì vậy phương

pháp giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S để làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh

chủng loại của vi sinh vật vẫn là lý tưởng nhất. Lần xuất bản thứ tư của cả

“Bergey’s Manual of Systemmatic Bacteriology” và “The Prokaryote” đều dựa vào

tiêu chuẩn ARNr 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài tương ứng của vi sinh vật.

Chính vì vậy có thể nói phương pháp xác định trình tự gen ARNr 16S là phương

pháp phân tử phổ biến nhất được dùng để định loại vi khuẩn [62,135].

Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng

cách đã tính toán. Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại

ở các cấp độ cao hơn chi. Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các đặc điểm

kiểu hình (phenotypic) và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng

rãi. Nhìn chung các đặc điểm hoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương

quan tốt với cây phát sinh chủng loại [30,145,164,165,166].

1.3.6. Phân loại chi Streptomyces

Streptomyces là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Khuẩn ty sinh

dưỡng (0,5-2,0 µm) được sinh ra từ sợi khuẩn ty và phát triển theo kiểu phân nhánh,

sau đó tạo thành hệ khuẩn ty sinh dưỡng. Từ khuẩn ty sinh dưỡng phát triển thành

khuẩn ty khí sinh. Ở hầu hết các loại khuẩn ty khí sinh hình thành cuống sinh bào

tử có từ 3 đến nhiều bào tử. Bề mặt bào tử có kết cấu khác nhau , có thể nhẵn, xù xì,

phủ gai hoặc lông. Ở những loại khác, khuẩn ty khí sinh là những sợi nhỏ dài, thẳng

hoặc mang các nhánh ngắt quãng, sắp xếp thành chùm. Mỗi nhánh có 2 hoặc nhiều

bào tử hình cầu hoặc elip có dạng gai hoặc dạng tóc… Bề mặt khuẩn lạc có dạng

lông mịn, dạng bông, dạng da, dạng bột, hoặc dạng nhung [20,52,56, 154,170,176].

Mầu sắc khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất rất khác nhau. Chúng có

thể hình thành sắc tố tan và tiết vào môi trường. Các loài thuộc chi Streptomyces có

cấu tạo giống vi khuẩn Gram (+), hiếu khí, dị dưỡng. Nhiệt độ tối ưu là 25-28°C và

pH tối ưu thường là 6,5-8.

Các đặc điểm về hóa phân loại của chi này được đặc trưng bởi [159,183,

186]:

+ Thành tế bào thuộc Typ I chứa LL- DAP ( axit L-diaminopimelic).

+ Peptidoglican (PG) ở Streptomyces có đặc điểm: liên kết chéo trong

PG được hình thành giữa D-alanin tận cùng của tetrapeptit này với nhóm axit

diaminopimelic (DAP) ở vị trí thứ ba của tetrapeptit khác. Đặc điểm này lại giống

với cấu trúc của hầu hết các vi khuẩn G(-). Đây là một trong các đặc điểm rất khác

biệt của xạ khuẩn với hầu hết các nhóm vi khuẩn G(+) khác.

+Axit béo bão hòa, đồng phân nhánh 15-17C với lượng ít và không bão

hòa với mạch phân nhánh 16C izo và 15-17C canteiso được metyl hóa ở nguyên tử

cácbon thứ 10.

+ Dạng menaquinon 9. [33,142,143]

+ Photpholipit dạng II: photpholipit chứa nitơ là photphotidylenatolamin.

+ Mol % (G+C) của ADN là 69-78

Đó là các đặc điểm mà Stackebrandt đã nghiên cứu và đưa ra để dùng

trong phân loại chi Streptomyces. [159]

1.4. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

1.4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

Vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên sinh ra các sản phẩm trao đổi chất và

các thành phần tế bào chỉ ở mức độ cần thiết cho sự sinh sản và sự duy trì loài. [42].

Những quá trình lên men công nghiệp phải chọn hoặc tìm ra được những cá thể có

khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm mong muốn với năng suất cao. Trong việc tối

ưu hóa các quá trình lên men công nghiệp, cần phải tìm ra trạng thái sinh lý để có

năng suất cao nhất và duy trì trong một thời gian dài [42,43]. Vấn đề kinh tế chủ

yếu đối với một quá trình lên men là làm sao từ cơ chất ban đầu, trong một thể tích

nồi lên men nhỏ tới mức cho phép, trong một thời gian ngắn có thể đạt tới mức thu

hoạch cao đối với các sản phẩm mong muốn. Để có được kết quả đó cần phải xác

định các thông số cần thiết cho sự phát triển và hình thành tối ưu sản phẩm của quá

trình sinh tổng hợp.

1.4.1.1. Thành phần môi trường lên men

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon thường là các đường đơn: glucoza, fructoza... hay các loại

đường đôi như: sacaroza, maltoza, lactoza... hoặc cũng có thể là các loại tinh bột,

các chất có thành phần không xác định như rỉ đường [7,8,53]. Trong tất cả các

nguồn cacbon thì glucoza là nguồn cacbon dễ tiêu hoá, nhưng nó thường gây nên

hiện tượng kiềm chế dị hoá trong tổng hợp CKS ở một ngưỡng nồng độ nào đó

[99]. Tuy nhiên ta có thể khắc phục đuợc hiện tượng này bằng cách bổ sung liên tục

một lượng nhỏ glucoza theo định kỳ, mà không dẫn đến tích lũy các chất trao đổi ức

chế, nhờ đó có thể tiến hành sản xuất CKS từ nguồn cacbon là glucoza.[40,68].

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ, tồn tại ở hai dạng vô cơ và hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ gồm: cao

-), song thông thường quá trình sinh tổng

ngô, cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương... Nguồn nitơ vô cơ thường dùng

+) hoặc nitrat (NO3

ở dạng muối amôn(NH4

hợp CKS đòi hỏi cả hai nguồn nitơ trong môi trường. [88]. Nguồn và nồng độ nitơ

trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp CKS. Sự dư thừa các

amon hay các nitơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp của nhiều chất

kháng sinh như erythromixin, leucomixin, novobioxin…[53,78,99]. Tác dụng

ngược của nguồn nitơ dễ tiêu (amon) có thể được loại trừ khi bổ sung Mg3(PO4)2

vào môi trường. Sự hình thành CKS của mỗi chủng đòi hỏi tỷ lệ C/N nhất định.

Ảnh hưởng của nguồn photpho vô cơ

Bên cạnh nguồn C và N thì photphat vô cơ được xem như là yếu tố tham gia

điều chỉnh sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn [182]. Nồng độ photphat thích hợp cho

tổng hợp CKS thường không vượt quá 10mg/ml [44]. Nồng độ photphat cao sẽ làm

tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, do đó rút ngắn pha tổng hợp và kéo dài pha

dinh dưỡng, hoặc lượng photphat dư thừa sẽ ức chế quá trình tổng hợp các enzym

tham giam vào tổng hợp enzym [44,52]. Tuy nhiên cũng có những ngoại lệ như sinh

tổng hợp nocaxidin bởi Nocardia uniformic lại cần một nồng độ photphat vô cơ cao

100-200 g/ml [7,16, 182].

1.4.1.2. Điều kiện nuôi cấy

 Độ thông khí

Xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khí, có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh

vật khác, nhất là trong giai đoạn nhân giống. Do đó yếu tố thông khí có ảnh hưởng

quyết định đến sinh tổng hợp CKS. Đối với hàng loạt CKS thì độ thông khí để đạt

hiệu suất cực đại là lưu lượng thổi khí 1v/v/phút.

 Nhiệt độ

Hầu hết xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28  300C. Nhiệt độ thích hợp cho

sự tổng hợp CKS còn phụ thuộc vào từng chủng sản. Ví dụ chủng S.griseus nhiệt độ

tối ưu cho sản xuất CKS streptomyxin là 260C, nhiệt độ ức chế sản xuất là 30, còn

S.rifamices thì nhiệt độ tối ưu cho sản xuất lại là 190C, nhiệt độ ức chế là 270C. [7].

 pH môi trường

Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường. pH thích hợp cho

sinh tổng hợp CKS thường là pH trung tính. pH axit hay kiềm đều ức chế quá trình

tổng hợp CKS. Bởi vậy mà trong hệ thống nồi lên men, thường thiết kế bộ phận

điều chỉnh pH tự động bằng HCl và NaOH [44,182].

 Chất lượng bào tử và giống sinh dưỡng

Thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện

lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là

vào tuổi và khả năng đồng đều về mặt di truyền cùng hoạt tính trao đổi chất của

chủng giống phản ánh điều kiện nuôi cấy.[41].

Tuổi của giống cho hiệu suất CKS cao nhất là 24 giờ tuổi, tuy nhiên thời

gian nuôi còn phụ thuộc vào từng chủng và tuổi của bào tử giống. Tỷ lệ giống vào

môi trường lên men phụ thuộc vào chủng xạ khuẩn và thành phần môi trường nhân

giống (thường là từ 2 - 10%).

Các phòng thí nghiệm hiện nay trên thế giới đã có rất nhiều phương pháp để

lựa chọn các điều kiện lên men thích hợp cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp

CKS của chủng sản. Chẳng hạn nhóm nghiên cứu của Duetz đã dùng phương pháp

96 giếng , đây là phương pháp có nhiều ưu việt hơn, tuy nhiên không có một mô

hình chuẩn nào cho việc lựa chọn các điều kiện tối ưu cho sự tạo thành các sản

phẩm bậc 2 ở vi sinh vật. [106]

1.4.2. Công nghệ lên men CKS – Quá trình sau lên men (Downstream Processing)

Đây là một thuật ngữ thường dùng để mô tả quá trình tinh sạch các sản

phẩm đã được tạo thành trong thời gian lên men nhờ vi sinh vật. Quá trình này gồm

các bước: tinh sạch sản phẩm, phân tích kinh tế, tạo sản phẩm ở quy mô lớn. Việc

thu hồi và xác định các sản phẩm có phân tử nhỏ (300-800 MW), đặc biệt là các sản

phẩm bậc hai, là bước nghiên cứu quan trọng. [46]

Sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp lên men chìm

trong nồi lên men có khuấy liên tục và sục khí. Có hai hình thức lên men: lên men

theo mẻ và lên men liên tục, được mô tả trong tài liệu [46]. Cấu tạo nồi lên men

phải đảm bảo tạo điều kiện lên men tối ưu: độ thông khí, nhiệt độ nuôi, pH…

Hai yếu tố quan trọng nhất trong quá trình sau lên men là: đặc tính sinh

lý của phân tử cần được tách chiết và tinh sạch (đó là trọng lượng phân tử (MW), sự

phân cực của phân tử, sự tích điện của các ion) và nồng độ của chất cần tinh sạch có

trong dịch nuôi cấy. Nhìn chung, đặc tính lý hóa của phân tử có thể xác định nhờ

một số phương pháp sắc ký như: trao đổi ion, lọc gel, tách phân lớp hay phương

pháp hấp phụ. Nồng độ của phân tử cần xác định có trong dịch lên men thường rất

ít, đối với một chủng hoang dại khi lên men thì nồng độ CKS thường từ 0,1-

10g/ml. Còn đối với một quá trình lên men chuẩn thì nồng độ là 300-600g/ml.

Tùy theo khả năng sinh kháng sinh của từng chủng sản, nhưng khoảng 5-10 L dịch

lên men là có thể đủ cho việc xác định phổ hấp phụ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại

(IR) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và các dữ

liệu về cấu trúc phân tử trong database.[46,48]

1.4.3. Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS 1.4.3.1. Cá́c pha trao đổi chất

Quá trình sinh tổng hợp CKS xẩy ra theo hai pha điển hình. Pha sinh

trưởng (trophophase) sử dụng các thành phần chủ yếu của môi trường, tăng sinh

khối và pha sinh tổng hợp (idiophase). Sự tạo thành sản phẩm thường vào giai đoạn

cuối của pha sinh trưởng, tuy nhiên điều này lại hoàn toàn phụ thuộc vào từng

chủng giống sinh kháng sinh. Sinh trưởng chậm lại đôi khi xuất hiện quá trình tự

tan của khuẩn ty và sinh tổng hợp CKS mạnh.[98]. Hoạt tính sinh tổng hợp bị giới

hạn thường là do cạn kiệt chất dinh dưỡng trong môi trường và sự thay đổi pH.

Nồng độ của nguồn cacbon, nitơ và pH môi trường cũng có thể điều khiển sự phát

triển của chủng sản ở trạng thái hoạt động, và chúng ta có thể kéo dài pha sinh tổng

hợp bằng cách giữ các yếu tố này ở mức độ thích hợp [16,21,31,38].

1.4.3.2. Sự hình thành và sinh tổng hợp CKS

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS và vai trò

của chúng đối với bản thân xạ khuẩn trong tự nhiên. Một số tác giả cho rằng sự hình

thành CKS là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong môi trường tự nhiên. Một số

khác lại cho rằng, sự hình thành CKS là do sù cạnh tranh trong môi trường dinh

dưỡng [46]. Thường các CKS không có một chức năng rõ rệt đối với tế bào sản sinh

ra chúng [26]. Chúng không tham gia vào quá trình trao đổi chất nên sự mất khả

năng hình thành CKS không làm mất khả năng sinh trưởng [115]. Lại có quan điểm

cho rằng CKS chỉ là sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào [44].

Trong điều kiện tự nhiên xạ khuẩn chỉ hình thành một lượng rất nhỏ các

CKS, thường không quá 50mg/l môi trường nuôi cấy [21, 37,42, 46].

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và c¸c vi sinh vật tạo ra chúng cũng

rất đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng dường như theo một số con đường

nhất định. Các con đường này chỉ là sự cải biên các con đường sinh tổng hợp của tế

bào. Các vật liệu ban đầu của quá trình chuyển hóa thứ cấp (CKS) là những chất

trao đổi sơ cấp.[41].

1.5. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CHẤT KHÁNG SINH

Tinh sạch các chất trao đổi từ vi sinh vật là một quá trình phức tạp, đòi

hỏi rất nhiều kỹ thuật, do các chất này rất đa dạng về cấu trúc hoá học nên trọng

lượng phân tử rất khác nhau. Chúng có thể tan trong nước hay tan trong các dung

môi hữu cơ tuỳ theo đặc tính của từng chất. Thường những chất tan trong dung môi

hữu cơ dễ tinh sạch hơn tan trong nước. Những chất khó tinh sạch nhất là những

chất dễ tan trong nước, trung tính hoặc lưỡng tính. Phương pháp trao đổi ion rất

hiệu quả đối với những chất tan trong nước axit hoặc kiềm và không hiệu quả đối

với những chất tan trong dung môi hữu cơ. Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp rất

hữu dụng trong việc tách chiết các chất trao đổi từ vi sinh vật.[21,32,95]

1.5.1. Tách chiết CKS từ hệ khuẩn ty

Chiết rút là phương pháp thích hợp nhất để tách chiết CKS ra khỏi hệ

sợi. Hiệu quả càng cao nếu khả năng hòa tan của CKS trong tác nhân chiết càng lớn.

Do vậy khả năng tách chiết phụ thuộc vào tỷ lệ hòa tan của chất dùng để chiết đối

với pha rắn, tỷ lệ khuếch tán của các hợp chất trong pha lỏng và tỷ lệ chuyển dịch

của các chất vào trong chất tách chiết. Trước khi tách chiết, sinh khối cần được rửa

bằng nước để loại bỏ các thành phần còn sót của môi trường. Metanol là dung môi

thường được sử dụng tách chiết CKS từ hệ sợi rất có hiệu quả. Metanol cũng loại bỏ

những tạp chất phân cực không mong muốn. Các loại đường và peptit có trong sinh

khối có thể tách bằng các dung môi không phân cực hoặc rượu thấp là không thích

hợp như etanol, metanol, …[132,168,179]

1.5.2. Tách chiết CKS từ dịch lọc

Các chất có trọng lượng phân tử thấp thường hòa tan trong nước và dung

môi hữu cơ. Để tách chiết có hiệu quả, phải lựa chọn dung môi hòa tan CKS như

etyl-acetat, butanol, etanol…và có thể bổ sung các chất như: axit oleic, axit

palmitic…để làm tăng khả năng hòa tan của CKS trong dung môi hữu cơ. Dung

môi có chứa CKS được cô chân không ở nhiệt độ thấp, thường dưới 60°C để loại

dung môi. CKS thô nhận được bằng phương pháp tách chiết từ sinh khối và dịch lọc

là nguyên liệu cơ sở để tinh chế.[31,103,171].

1.5.3. Tinh chế CKS

Kết tinh là phương pháp cơ bản nhất để tinh chế CKS và tách chiết các

sản phẩm phân tích để xác định tính chất lý hóa của chúng. Sự kết tinh có thể thực

hiện bằng cách giảm nhiệt độ hay thay đổi dung môi. Dung môi chứa các vệt kháng

sinh cuối cùng của quá trình kết tinh có thể loại bỏ bằng cách cô chân không.

Phương pháp sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng hoặc sắc ký lỏng cao áp là những

phương pháp thông dụng để tinh chế và tách chiết CKS.

1.5.4. Đơn vị chất kháng sinh

Hoạt tính sinh học của CKS thường được biểu hiện bằng đơn vị có điều kiện

trong 1ml dung dịch (đv/ml) hoặc trong 1mg (đv/mg) chế phẩm. Đơn vị hoạt tính

của CKS là lượng kháng sinh nhỏ nhất có thể ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một

chủng vi sinh vật kiểm định trong một thể tích môi trường nhất định.

Ví dụ đơn vị hoạt tính của penixillin là lượng penixillin nhỏ nhất có thể

ức chế sự sinh trưởng của tụ cầu vàng 209P trong 50 ml môi trường canh thang.

Ngày nay, đối với các chất đã tinh khiết, người ta xác định đơn vị theo định lượng

(g/ml). Con số g/ml càng tiÕn dần đến 1000 càng chứng tỏ độ tinh khiết của

CKS. Trước đây 1 mg penixillin tương đương 1667 đơn vị (Oxford), nhưng độ tinh

khiết của streptomyxin rất cao, 1 mg streptomyxin tương đương 1000 đv [4].

1.5.5. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân đựơc phát hiện vào đầu những năm 1960

và hiện nay được coi là một trong những kỹ thuật quan trọng nhất trong việc xác

định cấu trúc phân tử. Sự cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một trong những dạng

quang phổ học rất phức tạp. Khi các hạt nhân được đặt trong một từ trường, phần

lớn các spin sắp xếp thẳng hàng theo phương của từ trường và nằm ở trạng thái spin

thấp hơn. Bức xạ điện từ có thể gây nên sự chuyển tiếp từ trạng thái spin thấp hơn

lên trạng thái spin cao hơn. Một phổ NMR là một đồ thị biểu diễn độ lớn và các

dạng năng lượng được hấp thụ bởi một phân tử khi các nguyên tử của nó có sự

chuyển tiếp từ trạng thái spin thấp hơn lên trạng thái spin cao hơn trong từ trường

đặt vào [9,28,131].

Sự cộng hưởng là một khái niệm đựơc dùng để mô tả sự hấp thụ bức xạ điện

từ khi tần số của sự tiến động và tần số của sự bức xạ điện từ kết hợp với nhau. Đó

là lý do tại sao toàn bộ quá trình này được gọi là sự cộng hưởng từ hạt nhân. Sự hấp

thụ năng lượng bởi một phân tử được đo và được vẽ thành đồ thị để đưa ra quang

phổ NMR.

Nhiều loại hạt nhân nguyên tử khác nhau trong phân tử, như 13C hay 1H,

không hấp thụ năng lượng ở cùng tần số. Thực tế, thường có các môi trường hóa

học khác nhau tồn tại trong 1 phân tử, nó làm thay đổi các tần số cộng hưởng của

các hạt nhân khác nhau. Bằng cách quan sát các tần số cộng hưởng khác nhau đo

được trong kỹ thuật quang phổ NMR, thông tin về các môi trường hóa học khác

nhau trong phân tử được thu nhận và định hướng cho việc hiểu biết về cấu trúc phân

tử.

1.6. CÁC BỆNH THỰC VẬT DO NẤM GÂY RA VÀ CÁC CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP.

Vi nấm - Nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng.

Việt Nam là nước nhiệt đới, có khí hậu nóng ẩm vì vậy việc nhiễm nấm là

không thể tránh khỏi. Một lượng lớn cây lương thực, cây công nghiệp ngắn ngày bị

nhiễm các loại vi nấm gây bệnh tạo ra hàng loạt các dịch bệnh khác nhau ảnh hưởng

lớn đến năng suất cây trồng.[118,122].

Vi nấm là vi sinh vật có nhân điển hình, phát triển nhanh chóng do quá trình

phát tán bào tử nhờ gió hoặc nước, do đó dễ dàng xâm nhập vào cây trồng hoặc hạt

giống. Ngoài ra nó còn tồn tại ngay trong đất và xâm nhập vào cây trồng thông qua

bộ rễ. Cây có thể bị nhiễm bởi một hoặc vài loại nấm có thể bao gồm cả những loại

nấm ký sinh không gây hại đến cây, nhưng phần lớn là các loại nấm gây hại cây

trồng. Sự nhiễm bệnh do nấm có thể xẩy ra ở một giai đoạn phát triển nào đó của

cây và tuỳ theo chủng nấm gây bệnh mà triệu chứng bệnh có thể được biểu hiện ở

các mức độ khác nhau [18,51,66].

1.6.1. Sự lan truyền và chu kỳ phát triển của nấm gây bệnh thực vật. 1.6.1.1. Sự lan truyền của nấm gây bệnh thực vật

Phát tán bào tử là hình thức lan truyền quan trọng nhất của hầu hết các loại

nấm gây bệnh ở các phần trên mặt đất của cây, giúp nấm lan truyền từ cây này sang

cây khác, từ vùng này sang vùng khác. Bào tử được lan truyền bằng cách chủ động

hay thụ động là tuỳ thuộc vào đặc điểm sinh học của mỗi loại nấm và ảnh hưởng

của yếu tố môi trường [12,13].

1.6.1.2. Sự lây nhiễm

Bào tử nấm là nguồn bệnh đầu tiên trong quá trình lây nhiễm của nấm. Quá

trình lây nhiễm bắt đầu từ giai đoạn bào tử tiếp xúc với bề mặt ký chủ. Để lây

nhiễm, trước hết bào tử phải được nảy mầm. Nói chung, có hai kiểu nảy mầm : nảy

mầm trực tiếp và nảy mầm gián tiếp. Nảy mầm trực tiếp sinh ra ống mầm, về sau nó

phát triển thành sợi nấm, còn trong nảy mầm gián tiếp một bào tử ban đầu sẽ tạo ra

nhiều bào tử nhỏ, các bào tử này sau đó sẽ nảy ra nhiều ống mầm [5]. Sự nảy mầm

của bào tử tuỳ thuộc vào nhiều điều kiện sinh thái như độ ẩm, nhiệt độ, độ pH môi

trường, ánh sáng và oxy … Độ ẩm là yếu tố có tác dụng quyết định, trong khi nhiệt

độ ảnh hưởng trực tiếp tới tỷ lệ, tốc độ và kiểu nảy mầm của bào tử, còn ánh sáng là

yếu tố ít ảnh hưởng nhất đến sự nảy mầm. Tuy nhiên các yếu tố này có quan hệ chặt

chẽ với nhau.[18].

Sau khi bào tử nảy mầm, ống mầm sẽ xâm nhập vào bên trong mô ký chủ

bằng nhiều con đường: qua bề mặt nguyên vẹn, qua vết thương cơ giới hoặc qua khí

khổng trên ký chủ. Phytophthora infestans có thể xâm nhập qua khí khổng hoặc qua

lớp biểu bì nguyên vẹn của lá. Nấm Penicillium spp. và Rhizopus spp. là những loại

ký sinh yếu chỉ có thể xâm nhập vào cây qua vết thương cơ giới [15].

Sau khi xâm nhập, nấm sẽ phân huỷ các cấu trúc tế bào và các chất hữu cơ khó

tan thành dễ tan để hấp thụ. Vũ khí hoá học của nấm để tấn công vào tế bào ký chủ

là các enzym, chất sinh trưởng và độc tố [3]. Tác động đầu tiên của nấm là tiết ra

các enzym phân giải vách tế bào của cây, chủ yếu là xenluloza và pectin. Sau khi

phân giải vách, nấm sử dụng các enzym thuỷ phân để phân giải các thành phần

trong tế bào chất.

Mặc dù nấm có cơ chế xâm nhập chủ động và có hệ thống enzym rất phong

phú, song quá trình lây nhiễm của nấm mạnh hay yếu còn tuỳ thuộc vào quan hệ ký

sinh - ký chủ. Trong thực tế, hầu hết các loại cây đều có những phản ứng và cơ chế

bảo vệ nhất định để kìm hãm hoặc chống lại các hoạt động lây nhiễm của nấm. Các

yếu tố như độ dày lớp biểu bì, lớp sáp, số lượng và kích thước khí khổng có ảnh

hưởng đến sự nảy mầm và xâm nhập qua bề mặt ký chủ của nhiều loại nấm gây

bệnh trên cây. Ngoài ra, cây còn có cơ chế bảo vệ sinh học, đặc biệt là enzym

kitinaza, các chất kìm hãm proteaza và chất kìm hãm amilaza... lần lượt phân giải

kitin, kìm hãm hoạt tính proteaza và amilaza có trong tế bào nấm [13]. Đây được

coi là cơ chế miễn dịch tự nhiên.

1.6.1.3. Chu kỳ phát triển của nấm

Nhìn chung chu kỳ phát triển của nấm được chia thành hai dạng dựa trên hình

thức sinh sản và ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh tới các giai đoạn phát triển của

nấm (chu kỳ lây nhiễm). Dạng thứ nhất là chu kỳ phát triển hoàn toàn, trong đó nấm

trải qua cả hai giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính. Ở dạng thứ hai, tức là chu kỳ

phát triển không hoàn toàn, nấm không có hoặc bỏ qua giai đoạn sinh sản hữu tính

[6].

Chu kỳ lây nhiễm hay còn gọi là "chu kỳ lây bệnh" bao gồm tất cả các giai

đoạn ký sinh bên trong ký chủ và thời kỳ không ký sinh. Nhìn chung chu kỳ gây

bệnh của nấm là một quá trình hoạt động liên tục dẫn đến việc hình thành bệnh, tuy

nhiên giai đoạn ký sinh trong chu kỳ có thể được lặp lại nhiều lần tuỳ thuộc vào đặc

điểm và tốc độ sinh sản nhiều thế hệ của ký sinh trong vụ mùa. Trong những điều

kiện nhất định (nhiệt độ, độ ẩm không thích hợp …) nấm sẽ chuyển sang giai đoạn

bảo tồn.

Nắm vững chu kỳ gây bệnh cụ thể có ý nghĩa lớn trong công tác phòng

trừ bệnh đạt hiệu quả cao bởi nhờ đó có thể tìm được điểm yếu hoặc điểm quyết

định hình thành bệnh trong chu kỳ, từ đó chọn các biện pháp phòng trừ thích hợp và

dựa vào những thay đổi trong chu kỳ bệnh ở các vùng sinh thái khác nhau có thể

điều chỉnh các biện pháp phòng trừ sao cho có hiệu quả nhất.

1.6.2. Các loại nấm gây bệnh thực vật thường gặp 1.6.2.1. Rhizoctonia

Đặc điểm chung

Rhizoctonia là một trong những đối tượng bệnh hại quan trọng nhất hiện nay,

Rhizoctonia sống trong đất, có sợi màu trắng vàng, sau chuyển thành màu vàng nâu.

Hạch nấm thường tồn tại trên vết bệnh, ban đầu có màu trắng sau chuyển thành màu

nâu. Nấm có thể tồn tại trong đất hoặc xác cây trồng trong nhiều năm dưới dạng

hạch nấm [35,66,100, 110,136,156,157]

Rhizoctonia gây bệnh cho rất nhiều loại cây trồng khác nhau, đặc biệt từ khi

có các giống cải tiến thấp cây, cây ngắn ngày, cây sử dụng lượng phân đạm cao...

được gieo cấy trên diện rộng, thâm canh tăng vụ và phát triển diện tích trồng lúa,

trồng rau quanh năm. [34,136,156]. Nấm có thể gây hại trên cây trồng các mùa vụ,

nhưng phổ biến nhất là trong vụ xuân. Thời tiết nóng ẩm, mưa nhiều ở Việt Nam

tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm bệnh. Đặc biệt vào vụ lúa mùa và

ngô hè thu ở các tỉnh phía Bắc hay vụ bắp cải đông sớm bệnh thường nặng hơn,

ngoài ra hàm lượng phân đạm cao cũng giúp bệnh phát triển sớm và gây thiệt hại

nhiều hơn.

Các triệu chứng bệnh do nấm Rhizoctonia

Trên các cây trồng khác nhau như bắp cải, cà chua, khoai tây, đậu đỗ, đậu

tương, rau cải, su hào, ngô,... nấm Rhizoctonia thường gây bệnh ở rễ, phần thân sát

mặt đất của cây con và trên bắp thân lá của cây trưởng thành [66]. Triệu chứng

thường gặp do Rhizoctonia gây ra gồm: thối đen rễ cây hoa màu , lở cổ rễ cây con,

teo thắt gốc thân, khô vằn (lúa, ngô) và thối rữa (bắp cải, xà lách). Vết bệnh ở cây

con thường có màu nâu, úng nước trên phần thân sát mặt đất, dẫn tới hiện tượng cây

bị héo và đổ rạp trên mặt đất được gọi là lở cổ rễ cây con (phổ biến trên cây con

trong giai đoạn vườn ươm) [35, 136]. Trên những cây già hơn vết bệnh hoá gỗ có

màu nâu đậm và thắt lại tại phần thân tiếp giáp với mặt đất được gọi là hiện tượng

teo thắt thân. Cây nhiễm bệnh chết nhanh ở các vùng trồng rau, bệnh phổ biến và

gây hại rất nghiêm trọng. Trên lúa và ngô, những đám vết chết loang lổ trên phiến lá

và bẹ lá được gọi là bệnh khô vằn, bệnh thường xuất hiện khi cây đã lớn và đang

đóng bắp. Với bắp cải và xà lách bị nhiễm nấm, bệnh được gọi là bệnh thối ướt. Vết

bệnh lúc đầu là vết lá chết màu nâu vàng ở các lá ngoài, thông thường chỉ thấy một

lớp nấm trắng xám trên bề mặt, sau đó vết bệnh lan rất nhanh và gây thối toàn bắp.

Khi trời ẩm, trên vết bệnh có thể nhìn thấy sợi nấm nằm xen kẽ với hạch nấm. Hạch

nấm dẹt có màu nâu, trên bề mặt hạch có các lỗ rất nhỏ.[110,156]

1.6.2.2. Fusarium

Đặc điểm chung

Fusarium là loài nấm phân bố rộng ở tất cả các vùng địa lý trên thế giới, có

khả năng gây bệnh cao với nhiều loại cây, Fusarium gây thiệt hại không nhỏ đối với

nền sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Mặt khác nó còn sản

sinh độc tố gây nguy hiểm cho động vật hoang dại, vật nuôi và con người. Fusarium

gây ra nhiều bệnh khác nhau với cây trồng, điển hình là bệnh héo bó mạch, héo

vàng cây... F. oxysporum ký sinh trên hệ rễ thường gây thối rễ. F. moniliform tiết ra

giberelin kích thích sinh trưởng gây nên bệnh lúa von, đặc biệt nó còn tiết ra

fumonisin gây bệnh ung thư thực quản [11]. Chỉ tính riêng ở khoai tây thiệt hại do

Fusarium spp. gây bệnh thối củ trên đồng ruộng và trong bảo quản cũng đã chiếm

tới 20% sản lượng thu hoạch được [29,130].

Fusarium oxysporum gây bệnh thường tồn tại trong đất, thậm chí trong đất

nhiễm bệnh một vài năm. Nấm gây bệnh có thể lan truyền qua hạt giống, cây nhiễm

bệnh hoặc lan truyền theo nước tưới và nhờ gió[29]. Fusarium oxysporum phát

triển thuận lợi trong điều kiện thời tiết ấm và ẩm, trên đất cát pha bạc màu và đất

thịt nhẹ. Trong điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ trung bình 27-30oC, ẩm độ đất

tương đối cao, bệnh có thể phát triển mạnh, gây thiệt hại không nhỏ đến năng suất

cây trồng [11]. Bệnh phát triển nhiều trên đồng ruộng từ tháng 3 trở đi và gây hại

mạnh trong khoảng tháng 9 đến tháng 11 .

Các triệu chứng bệnh do Fusarium

Ở những cây bị nhiễm bệnh, lá héo rũ cụp xuống, thường bắt đầu từ các lá chết

phía gốc ở một bên cây, sau đó lan ra toàn cây làm cho lá héo rũ màu vàng. Bệnh

gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây, nhưng nặng nhất là vào cuối thời

kỳ sinh trưởng. Cây con bị nấm lây nhiễm sẽ không phát triển được và trở nên khô

héo. Còn khi bị nhiễm nấm ở giai đoạn đang phát triển thì triệu chứng của cây thể

hiện rõ hơn. Vết bệnh ở cổ rễ và phần thân sát mặt đất có màu nâu, vết bệnh lan

rộng có thể làm khô tóp cả phần thân sát mặt đất, rễ phát triển kém và bị thối dần

dẫn tới cây héo vàng xẹp xuống rồi chết. Khi chẻ dọc thân cây bệnh, sẽ thấy bó

mạch dẫn có màu nâu trên bề mặt vết bệnh có thể xuất hiện lớp nấm màu trắng -

hồng nhạt khi trời nóng và ẩm [130].

1.6.2.3. Sclerotium

Đặc điểm chung

Sclerotium có phạm vi phân bố rộng từ vùng có khí hậu lạnh như Sapa đến

các vùng đất cát ven biển hay vùng có khí hậu nóng và khô, đến các vùng đồng

bằng. Sclerotium rolfsii gây bệnh, sống trong đất, sợi nấm màu trắng đâm tia, các

sợi nấm này sản sinh ra nhiều hạch nhỏ. Hạch nấm tồn tại trong đất và có thể xâm

nhập trực tiếp vào mô cây và gây bệnh cho cây. Nấm gây hại trên nhiều loại cây

trồng như: lạc, lúa, ngô, cây họ đậu, cà chua, khoai tây, dưa hấu, bầu bí, cây làm

thuốc (bạch truật, địa tiền...) [3,5]. Ở Việt Nam, bệnh do Sclerotium thường gây

nguy hiểm cho các cây trồng cạn, phổ biến nhất là bệnh héo rũ trắng gốc và bệnh

tiêm hạch trên lúa. Trên lúa bệnh xuất hiện nhiều hơn ở úng, trũng.

Nấm phát triển và gây bệnh ở nhiệt độ 15-370 C, điều kiện thích hợp cho nấm

phát triển là khí hậu nóng ấm, ẩm độ không khí và ẩm độ đất cao [12]. Bệnh do

Sclerotium nặng nhất là vào vụ xuân. Nấm gây hại nặng trên cây cà chua và cây lạc

ở miền Bắc Việt Nam vào thời điểm trước khi thu hoạch, lúc đó đất trồng quá ẩm

ướt. Sau khi thu hoạch, nếu thu dọn ruộng không sạch thì các hạch nhỏ của nấm gây

bệnh vẫn có thể tồn tại trong đất và thân cây chết mục rồi tiếp tục gây bệnh cho các

cây trồng vụ sau. Trên các ruộng đất cát pha bị mất nước thường xuyên cũng

thường thấy nấm bệnh xuất hiện. S. rolfsii tồn tại nhiều năm trong đất và xác cây bị

bệnh.

Các triệu chứng bệnh do Sclerotium rolfsii

Lúc đầu lá từ màu xanh chuyển sang màu vàng hoặc màu nâu tối, khi cây mới

bị bệnh có hiện tượng héo vàng phần thân, lá trên mặt đất, cây có thể bị đổ rạp

xuống và chết. Ở phần cổ rễ, thân ngầm sát mặt đất của cây nhiễm bệnh thường có

màu nâu, thối mục khô xác. Khi quan sát phần xung quanh gốc cây sẽ thấy nhiều

hạt tròn nhỏ như hạt cải màu trắng hoặc nâu trên phần mô bị bệnh được gọi là hạch

nấm. Hạch còn non có màu trắng, khi già trở thành màu nâu. Các hạch nấm này dễ

lẫn với trứng của côn trùng nên hay nhầm tác nhân gây chết là do côn trùng. Cùng

với sự xuất hiện của hạch nấm là các sợi nấm gây bệnh có màu trắng mọc lan trên

mặt đất [3].

1.6.2.4.Pyricularia oryzae

Đặc điểm chung

Bệnh đạo ôn do nấm P.oryzae gây ra là một trong những bệnh hại quan trọng

nhất ở các nước trồng lúa nước trên thế giới [118]. Bệnh này đã gây ra những thiệt

hại đáng kể ở nhiều địa phương, thậm chí có nơi thiệt hại đến 80% năng suất cây

trồng. Ở nước ta mấy năm gần đây, dịch bệnh đạo ôn thường xuyên xảy ra ở các

tỉnh duyên hải miền Trung, Đồng bằng và Trung du Bắc bộ. Đáng chú ý, vụ đông

xuân 1994-1995 dịch bệnh đạo ôn phát triển diện rộng (trên 500.000) ha. Riêng 2

tỉnh Thái Bình và Nam Định đã phải sử dụng tới 250 tấn thuốc hoá học để trị bệnh

[15].

P.oryzae thuộc họ Moniliaceae bộ Monilialea – lớp nấm bất toàn. Cành bào tử

phân sinh hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và hơi gấp khúc. Nấm

thường sinh ra các cụm cành từ 2-3 ngăn ngang, bào tử không màu, kích thước

trung bình của bào tử nấm 19-23x10-12m. Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở

nhiệt độ 25-280C và ẩm độ không khí là 93% trở lên. Quá trình xâm nhập của nấm

vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm độ không khí và ánh sáng. Trong quá

trình xâm nhập nấm tiết ra một số độc tố như axit piconilic và piricularin có tác

dụng kìm hãm hô hấp và phân huỷ các enzym chứa kim loại của cây dẫn đến kìm

hãm sự sinh trưởng của cây lúa.

Các triệu chứng bệnh

Bệnh đạo ôn có thể phát sinh từ thời kỳ mạ đến khi lúa chín và có thể gây hại

ở bẹ lá , lá, cổ bông, thân, gié và hạt. Vết bệnh trên mạ lúc đầu hình bầu dục nhỏ sau

tạo thành hình thoi nhỏ hoặc dạng tương tự hình thoi, màu nâu hồng hoặc nâu vàng.

Khi bệnh nặng, từng đám vết bệnh kế tiếp nhau làm cây mạ có thể héo khô hoặc

chết.

Vết bệnh trên lá lúa thường lúc đầu là chấm nhỏ màu xanh lục sau chuyển

snag màu xám nhạt. Sự phát triển tiếp tục của triệu chứng bệnh thể hiện khác nhau

tuỳ thuộc vào mức độ phản ứng của cây [15].

1.6.3. Thiệt hại về kinh tế do vi nấm gây ra đối với nông nghiệp

Hàng năm thế giới thiệt hại do bệnh cây khoảng 537,3 triệu tấn các loại nông

sản chủ yếu chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp của thế giới [15,105,

111,116,121,180], tính riêng đối với lúa chiếm khoảng 9%, ngô 10%, cây rau 12%,

cây ăn quả 16,5%, trong đó bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83% [1,121]. Theo

số liệu của Tổ chức Nông-Lương của Liên Hợp Quốc (FAO), tổn thất hàng năm về

các sản phẩm nông nghiệp do các tác nhân gây hại khác nhau gây ra là 20% tổng

sản lượng toàn cầu [49]. Tính thành tiền tổn thất mỗi năm là 8 tỷ USD về gạo [24],

3 tỷ USD về khoai tây, 3 tỷ USD về đường, 2,5 tỷ USD về cà phê, 2 tỷ USD về lúa

mạch, 2 tỷ USD về ngô, 1.5 tỷ USD về lúa mì và 1 tỷ USD về lạc, trong đó riêng

tổn thất do nấm chiếm khoảng một nửa (nghĩa là khoảng 12 tỷ USD). Trong số 45

bệnh lúa đã mô tả, có tới 60% do nấm gây ra [118]. Ở Việt Nam trong số 24 bệnh

hại lúa ở Việt Nam có 13 bệnh do nấm gây ra, 34 bệnh ở ngô có 26 và trong 21

bệnh ở khoai tây có 8 bệnh là do nấm gây ra. [3, 8, 13]

Tính từ năm 1957 đến nay, nước ta đã trải qua nhiều đợt dịch bệnh hại cây

trồng như đạo ôn, khô vằn, héo rũ, thối cổ rễ,... mà tác nhân gây bệnh chủ yếu và

nghiêm trọng nhất là vi nấm, phổ biến là Fusarium oxysporum, Rhizoctonia spp.,

Sclerotium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Mucor spp., hầu hết chúng là

những loài bán ký sinh và hoại sinh điển hình, có phạm vi ký chủ rộng, gây nhiều

tổn thất lớn về sản lượng thu hoạch và làm mất tính ổn định về năng suất của nhiều

giống cây trồng.

Cây bị nhiễm mốc ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và chất lượng cây trồng.

Khi xâm nhập vào cây, nấm lấy hết các chất dinh dưỡng của cây làm nguyên liệu

xây dựng tế bào cho mình vì vậy làm giảm giá trị của cây. Tình hình dịch hại do

nấm qua các năm không hề giảm mà còn có chiều hướng tăng với các bệnh ngày

càng phức tạp cùng với sự phòng vệ ngày càng cao của chính các loài nấm đó. Vì

vậy việc nghiên cứu những chế phẩm nhằm hạn chế những thiệt hại do nấm đang là

mối quan tâm hàng đầu được các nhà khoa học đặt ra hết sức cấp bách. [105,188]

1.6.4. Sơ lược về tình hình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh trong phòng chống các bệnh do vi sinh vật gây ra ở thực vật trên thế giới và ở Việt Nam

Các nhà bệnh học thực vật trên toàn Thế giới đã bỏ ra nhiều năm để

điều tra tình hình sử dụng chất kháng sinh trong việc ngăn chặn các bệnh ở thực vật.

Họ rất quan tâm đến các tác nhân kháng bệnh có khả năng bị trừ thải ngay và có tác

dụng chọn lọc cao, ngoài ra còn có khả năng vận chuyển đựơc trong cơ thể thực vật.

Mặc dù rất nhiều chất được tìm kiếm và phát hiện ra nhưng chỉ một số ít được sử

dụng trong thực tiễn [47,69, 141,187].

Bộ Nông nghiệp, Hải sản và Thực phẩm Anh (MAFF) đã đưa ra chỉ

định tất cả các chất kháng sinh dùng trong y học không đ ợc phép sử dụng trong

nông nghiệp [116,123].

Còn Hiệp hội Thuốc trừ sâu của Canada cho phép 2 sản phẩm đựợc phép bán

trên thị trường là: Terramyxin (oxytetracycline) (21.6%) và Agrimyxin 17,

(streptomyxin 17% hoạt tính), dạng ướt. [68,94,75].

Ở Mỹ , Cục Bảo vệ Môi trường (Environment Protection Agency

(EPA), khuyến cáo những chất kháng sinh được dùng trong nông nghiệp là

streptomyxin, các tetracyclin và kasugamyxin [116].

Hiệp hội thuốc trừ sâu New Jealand khuyến nghị: Chỉ những chất kháng sinh

sau đây mới được phép dùng trong nông nghiệp: 'Agrimycin 17' (170g/kg sulphat

streptomyxin) và kasugamyxin.

Ở Hà lan, 2 chất kháng sinh đựơc phép sử dụng là: streptomycin và

validamyxin.

Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập được Streptomyces.sp 5406 có khả

năng sinh ra chất kháng sinh phòng chống bệnh thối rễ và đã áp dụng trên 6 triệu ha

trồng bông và đã thu được những kết quả khả quan. Ngoài ra, Trung Quốc còn ứng

dụng chế phẩm YIB (yield increasing bacteria) trên 6,7 triệu ha ở 30 tỉnh khác nhau.

Chế phẩm này không những phòng chống bệnh do vi khuẩn mà còn chứa các

hormon thực vật như IAA, giberilin làm tăng năng suất cây trồng. Sau đó cũng tại

Trung Quốc jingangmyxin, một chất kháng sinh được tách chiết từ một loài

Streptomyces hygroscopicus, ứng dụng rất thành công trong phòng chống bệnh thối

rễ. Hơn 10 nhà máy công nghiệp của Trung Quốc hiện nay đang sản xuất chế phẩm

thương mại này [116].

Ở Nhật Bản đã có những chế phẩm chống các bệnh đạo ôn, khô vằn rất

có hiệu quả như blastidin S, kasugamyxin, validamyxin.

Ở Ấn Độ, đã ứng dụng chế phẩm từ một loại nấm là Trichoderma viridae

và dùng aureofulvin để phòng chống một số nấm gây bệnh từ đất và bệnh ở rễ như

Rhizoctonia spp và Fusarium spp.

Ở rất nhiều nước như Hàn Quốc, Malaysia, Thailand, Pakistan cũng đã rất

thành công trong việc ứng dụng các chất kháng sinh trong phòng chống các bệnh do

vi sinh vật gây ra ở thực vật.

Nhìn chung, so với trong y học, việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực

vật vẫn còn ở mức độ thấp, tuy nhiên, những thành tựu thu được và xu hướng phát

triển hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng cuả CKS trong nền nông nghiệp hịên

đại. Cần phải có sự phối hợp một cách có kế hoạch trong việc tìm kiếm CKS mới và

xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học và có thể phối hợp với các biện pháp hoá

học sẽ đem lại những hiệu quả to lớn trong phòng chống bệnh và nâng cao hiệu suất

cây trồng. Có thể coi CKS là hoá chất lý tưởng cho việc phòng và chống các bệnh

thực vật. Vì không gây ô nhiễm môi trường. Sau đây là một số chất kháng sinh trên

thế giới đã được sử dụng trong nông nghiệp.[123, 168].

1.6.5. Các chất kháng sinh được sử dụng phòng trừ nấm gây hại thực vật. 1.6.5.1. Blastixidin S

Do Streptomyces griseochromogenes sinh ra, dùng để phòng chống bệnh đạo

ôn do Pyricularia oryzae gây ra. Blastixidin S được Takeuchi tinh chế từ dịch nuôi

chủng xạ khuẩn đó [169]. Khả năng diệt mầm bệnh được Misato phát hiện năm

1959. Blastixidin S thu được dưới dạng tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước,

hầu như không tan trong dung môi hữu cơ, ổn định ở pH 5-7 nhưng không ổn định

trong môi trường kiềm. Cấu trúc hoá học của Blastixidin S đã được xác định (Otake

và cs, 1966). Phân tử Blastixidin S gồm 1 nucleotit là cytoxin và một amino axit là

axit blastidic.[184].

Cấu trúc của Blastixidin S

Blastixidin S có phổ tác dụng rộng. Ngoài khả năng ức chế sự sinh trưởng của

P.oryzae chúng còn có khả năng ức chế vi khuẩn, nấm và còn có thể chống u, chống

virut (Tanaka và cs 1961, Hairai, Shimomura, 1965). Độc tính cấp khá cao (LD50

53,3mg/kg đối với chuột), thường sử dụng trong điều trị bệnh đạo ôn ở lúa do độc

tính đối với cá lại thấp ( LD50 cá chép >40ppm).

Cơ chế tác động

Khả năng chống bệnh đạo ôn của Blastixidin S liên quan tới các hoạt động ức

chế mạnh mẽ sự phát triển của hệ sợi P.oryzae [123]. Chúng ức chế sự liên kết giữa

leucin và phenylalanin thành polypeptit trong tổng hợp protein ở E.coli. Blastixidin

S được dùng để chống bệnh đạo ôn và được sử dụng trong thực tiễn từ năm 1962 ở

Nhật.[133].

1.6.5.2. Kasugamyxin.

Kasugamyxin là chất kháng sinh thuốc nhóm aminoglycozit do Streptomyces

kasugaensis sinh ra (Umezawa và cs 1965) đã được sử dụng để chống bệnh đạo ôn.

Không độc đối với thực vật, động vật (động vật có vú và cá) [184]. Kasugamyxin

hòa tan tốt trong nước. Phân tử gồm 3 phần: D-inositol, kasugamine và 1 chuỗi bên

axit iminoacetic (Suhara và cs 1966). Kasugamine được sinh tổng hợp từ glucoza và

manoza và 1 phần từ myo-inositol và glyxin [50, 58, 123].

CÊu tróc cña kasugamyxin

Kasugamyxin chỉ có tác dụng mạnh đối với P.oryzae khi dùng trong môi

trường axit. Còn đối với vi khuẩn kể cả Pseudomonas thì lại tác dụng ở pH trung

tính. Đây là đặc điểm cần lưu ý để pha chế chế phẩm khi sử dụng cho từng

đối tượng. [58 ].

Kasugamyxin ức chế tổng hợp protein ở E.coli do can thiệp vào sự liên kết

giữa aminoacyl-ARNvc với phức hợp ARNtt-30S riboxom mà không làm sai mã di

truyền. Kháng sinh này có độ độc thấp đối với chuột, thỏ, chó, khỉ. Liều lượng gây

chết (LD50) với chuột là 2g/kg và giới hạn chịu đựng trung bình (TLm) với cá chép

lớn hơn 1000 ppm.

Xạ khuẩn sinh kasugamyxin được lên men → cô đặc → xấy phun → chế

phẩm dạng bột có 3% kasugamyxin. Khi sử dụng thì pha ra các nồng độ cần

thiết. Bệnh đạo ôn được điều trị tốt ở nồng độ thấp khoảng 20ppm. Hạt thóc được

xử lý với 2% kasugamyxin ở dưới ruộng ẩm thì cây được bảo vệ khỏi bệnh đạo ôn 2

tháng sau khi xử lý [184].

1.6.5.3.Polioxin

Polioxin là nhóm kháng sinh thuộc họ nucleotit peptidylpyrimidin, được tạo ra

bởi Streptomyces cacaoi var.asoensis (Isono và cs 1965).Chất kháng sinh này được

coi là rất an toàn khi sử dụng trong phòng chống nấm bệnh , không độc cho vật nuôi

và cây trồng. Đặc tính nổi trội của polioxin là ức chế sự tổng hợp kitin thành tế bào

nấm (Hori và cs 1974). Polioxin được sử dụng rộng rãi để diệt các chủng gây bệnh

cây như: Alternaria alternara, Rhizoctonia solani, Cochliobolus miyabeanus từ năm

1967.

R=CH2OHpolioxinB

R = COOH polioxin D

Cấu trúc hóa học của polioxin được Isono và Suzuki minh họa từ năm 1965,

1967, 1969. Polioxin ức chế rất nhiều sự phát triển của nấm bệnh nhưng lại không

có tác dụng đối với vi khuẩn và nấm men. Các chế phẩm polioxin có thể tác dụng ở

bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào của lúa mà không gây độc ở thực vật thậm chí với

nồng độ 800ppm [184].

Polioxin gây phồng lên một cách bất thường ở đầu ống mầm bào tử và

đầu hệ sợi của nấm bệnh ( Eguchi và cs, 1968), Trong một hệ thống tế bào tự do của

Neurospora crassa, polioxin D ức chế sự liên kết giữa N-acetylglucosamine

(GlcNAc) vào thành kitin trong một phương thức cạnh tranh giữa UDP-GlcNAc và

polioxin D (Endo và Misato 1969). Mối liên hệ giữa cấu trúc của polioxin và hoạt

tính tổng hợp kitin đã được làm sáng tỏ nhờ phân tích động học. Những ưu điểm

tuyệt vời của polioxin trong thực tế là do cơ chế tác động của chúng.

1.6.5.4.Validamyxin

Validamyxin A được tách chiết từ môi trường nuôi cấy của chủng Streptomyces hygroscopicus var limoneus [57,70]. Chủng này đồng thời cũng sinh ra 5 thành phần có cấu trúc tương tự nhau và được định tên từ Validamyxin là B-F, cùng với valydoxylamine A (Iwasa và cs, 1971) [ 70,79]. Chất này được sử dụng để diệt nấm gây bệnh khô vằn ở lúa mà không gây độc cho thực vật, động vật, chim cá, côn trùng. (Matsuura, 1983). [65].

Trong phân tử của validamyxin có 2 vòng cyclitol phân nhánh hydroxymetyl

trong cấu trúc phân tử nối với nhau bằng cầu nối ozit [99,134]. Validamyxin A, C,

D, E, F đều có chứa nhóm chung là validoxylamin nhưng giữa chúng khác biệt nhau

bởi vị trí liên kết với trung tâm glucoza hoặc số lượng phân tử D-glucoza.Trong khi

đó validamyxin B lại chứa validoxilamine B trong phân tử. Validoxylamine này có

nguồn gốc từ hydroxyvalidamin chứ không phải từ validamine như các validamyxin

khác ( Hori, 1971).[57].

Validamyxin A đặc biệt có hiệu

quả để phòng chống các bệnh thực vật

do Rhizoctonia spp gây ra như khô vằn,

thối thân thối rễ, đốm đen trên nhiều loại

hạt (Wakae, Matssura, 1975).

Validamyxin A [100,184] được sử dụng trong thực tiễn vào những năm 1973. Ở

Trung Quốc mỗi năm sản xuất 5000 tấn chế phẩm.[19,71].

Validamyxin không cần phải tiếp xúc liên tục với tác nhân gây bệnh thì mới

có hiệu quả ức chế sinh trưởng của nấm (Wakae, Matssura, 1975). Về cơ chế tác

dụng thì validamyxin A có hoạt tính ức chế enzym trehalaza trong R.solani AG-1,

cạnh tranh giữa validoxylamin A (một dạng hoạt tính của validamyxin A) và cơ

chất (trehaloza) [73]. Do trehaloza là 1 hydratcacbon dự trữ của một số nấm nên

người ta cho rằng trehalaza đóng vai trò thiết yếu để chuyển hóa trehaloza thành D-

glucoza và sẽ được đưa đến đầu sợi nấm.[73].

Ngoài hoạt tính chống lại R.solani validamyxin A còn có hoạt tính chống vi

khuẩn và một số nấm khác nữa. Người ta đã kiểm tra trên 150 loài thực vật thì thấy

rằng validamyxin không gây độc cho thực vật ngay cả ở nồng độ 1000ppm.

Validamyxin A cũng ít độc đối với động vật. Nồng độ gây độc đối với chuột là

10g/kg. Liều gây chết đối với cá (LD50) lớn hơn 1000ppm. Validamyxin dễ bị các vi

sinh vật phân hủy trong môi trường đất. Chúng được Pseudomonas denitrificans

phân cắt thành D-glucoza và validoxylamine A, sau đó lại được phân cắt tiếp thành

valienamine và validamine [185].

Validamyxin A đã được sử dụng trong phòng chống bệnh khô vằn ở lúa dưới

dạng dung dịch 3-5% hoặc dạng bột 0.3% [116,185]. Cặn thuốc còn lại sau khi

phun ở trong hạt lúa và rơm rạ thấp hơn giới hạn cho phép, khi kiểm tra bằng kỹ

thuật sắc ký khí. Theo Cục Bảo vệ môi trường Mỹ (FPA), validamyxin có độ độc

thuộc nhóm IV, nghĩa là chúng được sử dụng trong thực tiễn và không độc. Vì thế,

validamyxin A được coi là một trong những sản phẩm kháng nấm lý tưởng có

nguồn gốc vi sinh vật, có triển vọng và an toàn cho môi trường. Ở Hàn Quốc, năm

2000 validamyxin là CKS sử dụng trong nông nghiệp nhiều nhất, số tiền nhập khẩu

thuốc này lên tới 9 tỷ đô la, chiếm vị trí số 1.[116].

1.6.5.5. Triển vọng

Trong nông nghiệp, nhu cầu tìm kiếm các chất kháng nấm mới và có hiệu quả

vẫn tăng không ngừng do một số bệnh thực vật vẫn ở ngoài tầm kiểm soát của con

người, mặc dù chúng ta đã có nhiều sản phẩm thiết yếu phục vụ cho mùa màng. Tuy

việc sử dụng các chất kháng nấm trong nông nghiệp gây ra một số tác dụng không

mong muốn nhưng nhu cầu sử dụng vẫn không ngừng tăng lên trong tương lai.

Việc khám phá ra các CKS kháng nấm mới và an toàn trong nông nghiệp là rất

có triển vọng nếu chúng ta dựa vào nguồn vi sinh vật phong phú, vào chiến lược và

công nghệ mới để sàng lọc tìm ra các thuốc, các enzym ức chế và một số các chất

có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật. Yêu cầu với một chất kháng nấm trong nông

nghiệp ngày nay là phải có khả năng chống lại được nhiều loại nấm bệnh khác nhau

và đồng thời phải an toàn, không những cho người, động vật, cho thực vật mà còn

cả với hệ sinh thái.

Ở Việt Nam đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng chất kháng sinh

trong phòng chống các bệnh do vi nấm ở thực vật, đây đang là một hướng mới mở

ra triển vọng to lớn về một biện pháp hữu hiệu trong phòng trừ các bệnh gây thiệt

hại cho mùa màng và khắc phục những hạn chế của hoá chất bảo vệ thực vật.

1.6.6. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật

Sự đối kháng giữa các vi sinh vật trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học

phòng chống bệnh cây [54]. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm

rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Khi điều tra xạ khuẩn đối kháng trong đất ở Nhật cho

thấy ở nơi có nhiều xạ khuẩn trong đất thì ở đó các dòng Fusarium bị biến mất

nhanh [184]. Thông thường, một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loại

nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây

bệnh có trong đất. Tuy nhiên, khi sử dụng các chủng có hoạt phổ rộng phải chú ý để

tránh xạ khuẩn ức chế luôn cả khu hệ vi sinh vật có lợi cho vùng rễ. Không phải tất

cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4 -

5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn

ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự

nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm

gây bệnh.

Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ vi

sinh vật thông qua các enzym phân giải [136]. Ngoài ra, nhiều xạ khuẩn còn tiết ra

các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ vi sinh vật

có lợi trong vùng rễ.

1.6.7. Ứng dụng xạ khuẩn và các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật

Trong thiên nhiên, các loại vi sinh vật đối kháng ức chế hoạt động hoặc tiêu

diệt vi sinh vật gây bệnh chủ yếu bằng các chất kháng sinh là các sản phẩm trao đổi

chất của chúng. Sự đối kháng của các vi sinh vật trong đất là cơ sở của biện pháp

đấu tranh sinh học phòng chống bệnh cây.

Sử dụng các chất kháng sinh trong lĩnh vức bảo vệ thực vật có nhiều

triển vọng hơn so với hoá chất bảo vệ thực vật bởi các hợp chất tự nhiên này có

nhiều ưu việt: có tác dụng chọn lọc cao, có thể tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh ngay ở

nồng độ thấp, có tác dụng nhanh, thường không độc hoặc độc thấp đối với người,

động vật và thực vật, có khả năng ức chế vi sinh vật đã kháng thuốc hoá học, thời

gian bán huỷ ngắn do đó không gây ô nhiễm môi trường...CKS và dịch lên men các

chủng sinh CKS được dùng để xử lý hạt giống hay hồ rẽ cây con trước khi gieo

trồng nhằm tiêu diệt mầm bệnh bên trong và ngoài hạt, diệt bệnh ở các bộ phận trên

mặt đất của cây và làm sạch mầm bệnh trong đất. Tuy nhiên, để khắc phục tính

kháng thuốc của vi sinh vật, ngoài việc định kỳ thay thuốc, người ta còn dùng phối

hợp các CKS. Bên cạnh đó còn cần chú ý tới việc đảm bảo sự cân bằng của khu hệ

vi sinh vật hữu ích trong đất.[54].

Hiện nay, tại Việt Nam đã sử dụng nhiều loại CKS như: validamyxin chống

bệnh khô vằn, polioxin chống bệnh đen lá, jingangmyxin chống bệnh héo rũ,

streptomyxin chống bệnh bạc lá hại lúa... Mặc dầu đã thu được những thành tựu

nhất định, song việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở

mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số loại hoá chất BVTV nhất

định. Bên cạnh đó giá thành của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện

sản xuất của người nông dân. Do đó cần có sự phối hợp thống nhất trong việc

nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền thông, xây

dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn trong phòng chống

dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế đồng thời bảo vệ môi

sinh và sức khoẻ cộng đồng [72].

Những thành tựu to lớn thu được trong việc sử dụng CKS chống bệnh truyền

nhiễm vào những năm 40 của thế kỷ 20 đã mở ra xu hướng đầy triển vọng trong sử

dụng CKS bảo vệ thực vật. CKS là một trong các hợp chất thiên nhiên lý tưởng có

nhiều ưu việt trong việc phòng chống các bệnh cho cây trồng. Vì vậy, việc phân lập

xạ khuẩn để tìm kiếm các CKS mới trong bảo vệ thực vật đã và sẽ vẫn là một vấn

đề thời sự hấp dẫn cho các nhà khoa học ở nhiều chuyên ngành khác nhau.

CHƯƠNG 2.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT

2.1.1. Nguyên liệu

2.1.1.1. Mẫu cây

Mẫu nghiên cứu là các đối tượng cây trồng bị bệnh khác nhau (cây công

nghiệp ngắn ngày, cây lương thực, cây ăn quả, cây rau và các loại quả tươi bị nhiễm

mốc tự nhiên). Các mẫu được thu thập tại những địa điểm khác nhau: Hà Tây, Bắc

Ninh, Viện Rau Quả, Trường Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội theo thời vụ trong

năm 2003.

2.1.1.2. Mẫu đất

71 mẫu đất được lấy từ độ sâu 5  10 cm ở các địa hình khác nhau: đất núi,

đất bãi trong và ngoài đê, đất ruộng lúa, đất vườn ở một số vùng khác nhau trên cả

nước. Từ đó đã phân lập được 508 chủng xạ khuẩn.

2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định

- Staphylococus aureus nhận được từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội

- Pseudomonas solanacearum nhận được từ Viện KHKT Nông Nghiệp.

- Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Penicillium nhận được từ Bộ môn

Bệnh cây và Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội.

- Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococus aureus ATCC 9347, Shigella

flemeri, Salmonella typhi DT, Escherichia coli ATCC 15224, Candida albicans,

Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes, Fusarium oxysporum

VCM3081, Aspergillus niger VCM3004, nhận được từ Bảo tàng giống chuẩn Trung

tâm Công nghệ Sinh học, ĐH Quốc gia Hà Nội và Viện Da liễu, Bộ Y Tế.

2.1.2. Hoá chất

- Các loại đường chuẩn: glucoza, arabinoza, raffinoza, fructoza, lactoza,

xyloza, inositol, saccaroza, các loại dung môi: metanol, butanol.... do hãng Merk

sản xuất (Đức).

- Các dung môi: n-butanol, etanol, etyl-acetat, iso-propanol, metanol, aceton

của Trung Quốc.

- Validamyxin A chuẩn do Cục Bảo vệ thực vật cung cấp.

- Proteaza K, Tag polymeraza, Merck Đức.

- Deoxynucleosit triphotphat, carboxymethyl cenloloza, Sigma, Mỹ

- Mexyl MZ 72 WP (công ty thuốc trừ sâu Sài Gòn)

- Rovral 50WP ( Aventis Crob Science Việt Nam) [19]

- Validacin 3DD ( Cty thuốc bảo vệ thực vật I) [1]

- Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dành cho phân tích.

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị

Cân điện 0,001g Thụy Điển

Kính lúp soi nổi dùng điện Nhật Bản

Kính hiển vi quang học OLYMPUS Nhật Bản

Tủ thổi khí vô trùng Anh

Máy đo pH Delta 320 Nhật

Kính hiển vi điện tử quét JEOL Nhật

Máy đo quang phổ tử ngoại (UV-VIS Spectrophotometer Cary IE-Varian): Úc

Máy đo phổ hồng ngoại (FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer, HP)

Mỹ

Máy HPLC (Azilent 1100, HP) Mỹ

Máy sequencing ABI Prism 3100 Avant Mỹ

Máy NMR Brucker-400MHz Đức

Khổ phối 5989-MS

2.1.4. Các công thức môi trường

Môi trường phân lập và giữ giống nấm

Môi trường khoai tây (PDA-Potato Dextrose Agar) (g/l): Khoai tây miếng -

200, thạch - 18, đường - 20, nước 1lit, pH 7 - 7,4.

- Môi trường WA (Water Agar): đun 15g WA trong 800ml nước cho tan

thạch. Bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, để

nguội khoảng 40oC rồi rót ra đĩa Petri.

- Đặt 3 - 4 mảnh/ đĩa, rót môi trường WA đã khử trùng vào đĩa Petri

Môi trường CZ (Czapek–Dox–Agar) (g/l): NaNO3-2; KH2PO4 -1;

MgSO4.7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; thạch - 20; nước -1 lít

Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn:

Môi trường ISP - 4 (g/l): tinh bột tan - 10; K2HPO4 - 1,0; MgSO4.7H2O - 1,0;

NaCl - 1,0; (NH4 )2SO4 - 2; CaCO3 - 2; nước - 1 lit; dung dịch khoáng - 1ml; pH 7-

7,2; thạch - 18g.

Dung dịch khoáng có thành phần (g/100ml nước); FeSO4.7H2O-0,1;

MnCl2.4H2O - 0,1; ZnSO4.7H2O - 0,1.

Môi trường Gauze I (g/l): tinh bột tan - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4.7H2O - 0,5;

NaCl - 0,5; (NH4)2SO4 - 2; KNO3 - 0,5; FeSO4 - 0,01; nước - 1lit; pH 7 - 7,4; thạch

18g.

Môi trường giữ giống: có thêm (g/l): pepton - 5; cao nấm men - 10.

Môi trường Gauze II (g/l): Nước chiết thịt - 30ml; pepton - 5; NaCI - 5;

glucoza -10; thạch - 18; nước - 1lit, pH 7 - 7,4.

Môi trường ISP-I (g/l): Tryton - 5, cao nấm men - 3, thạch - 18, nước 1lit, pH

7 -7,2.

Môi trường ISP-2 (g/l): cao nấm men - 4; cao malt - 10; dextroza - 4; nước cất

1 lit, thạch - 18, pH 7 - 7,3.

Môi trường ISP- 6 (g/l): Pepton - 10, cao nấm men - 1, xitrat sắt - 0,5, thạch -

18, nước - 1lit, pH 7 - 7,2.

Môi trường ISP-9 ( g/l): (NH4)2SO4 - 2,64; KH2PO4 - 2,38; K2HPO4 - 5,65;

MgSO4 - 1; dung dịch muối B - 1 ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; nước - 1lit; pH

6,8 - 7.

Môi trường 79 (g/l): glucoza - 10, pepton - 10, cazein thuỷ phân - 2, cao nấm

men - 2, NaCI - 6, K2HPO4 - 0,2, thạch - 18, nước 1lit, pH 7 - 7,4.

Môi trường A-4H (g/l): glucoza - 15; bột đậu tương - 15; NaCl - 5; CaCO3 -1;

nước - 1lít; pH 7.

Môi trường A-4 (g/l): glucoza - 10; bột đậu tương - 10; NaCl - 5; CaCO3 - 1;

nước 1lít; pH 7.

Môi trường A-9 (g/l): glucoza-10; rỉ đường - 20; pepton - 5; nước - 1 lít; pH 7.

Môi trường A-12 (g/l): tinh bột tan - 10; rỉ đường - 10; bột đậu tương - 10;

KH2PO4 - 2; CaCO3 - 1; NaCl - 5; nước - 1lít; pH 7.

Dung dịch muối khoáng A

- Dung dịch muối khoáng cơ sở (g/l): K2HPO4 - 3 ; MgSO4 - 3 ; NaCl - 3 ;

CaCO3 - 6; nước cất 1000 ml .

- Dung dịch muối khoáng vệt (g/l): CuSO4 - 6,4; FeSO4 - 1,1; MnCl2 - 7,9;

nước cất 1000 ml.

- Cách làm : Lấy 30ml dung dịch muối khoáng cơ sở và 0,1ml dung dịch muối

khoáng vệt phân vào bình nón 250ml. Bổ sung thêm 20ml nước cất sao cho mỗi

bình có 50ml dung dịch hỗn hợp muối (dung dịch muối A) chỉnh pH 7.

Dung dịch muối B (%): CuSO4 - 0,64; FeSO4 - 0,11; MgCl2 - 0,79; nước –

100ml.

Các môi trường lên men xốp:

Môi trường: Gạo + Dịch khoáng

Môi trường: Gạo + Nước

Môi trường: Bột gạo + Trấu + Bột đậu tương

Môi trường: Bột đậu tương + Trấu

Môi trường: Bột gạo + Trấu

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp thu mẫu bệnh thực vật, phân lập nấm và định tên

2.2.1.1. Phân lập nấm gây bệnh

Phân lập nấm gây bệnh (từ các mẫu cây trồng):

Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, mới. Rửa mẫu bệnh sạch đất cát

dưới vòi nước. Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp. Khử trùng bề mặt các mảnh mô

trên bằng cồn (etanol 70%) trong vòng 3 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng.

Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng dao mổ vô trùng cắt các mảnh

mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ). Dùng

panh vô trùng đặt các mảnh mô nhỏ trên vào môi trường PDA, trên đĩa Petri. Ghi

chú cẩn thận bằng bút viết kính: ngày, cây, bệnh... Để đĩa môi trường đã đặt mẫu

trong tủ ấm (30oC). Theo dõi sự phát triển của sơị nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm

đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi

trường thích hợp: PDA hoặc CZ. Thu nhận giống thuần khiết: lấy phần đỉnh sợi

nấm mọc trên đĩa thạch, cây truyền sang các ống thạch nghiêng chứa môi trường

CZ, khi đã nhận được giống thuần khiết thì bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC.

2.2.1.2. Phương pháp xác định các đặc điểm phân loại, đặc điểm hình thái và

định tên.

 Các đặc điểm hình thái nấm được quan sát bằng mắt thường, kích thước của

khuẩn lạc nấm được đo bằng thước đo. Các chỉ tiêu cần xác định :

- Hình dạng mặt trước khuẩn lạc.

- Hình dạng và màu sắc bào tử.

- Hình dạng mặt sau khuẩn lạc.

- Sự hình thành sắc tố.

 Các đặc điểm phân loại được quan sát dưới kính hiển vi

Làm tiêu bản, soi dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử, mô tả

hình dạng kích thước sợi nấm và cơ quan sinh bào tử, định tên sơ bộ tới giống (chi).

- Định tên đến loài.

- Chụp ảnh khuẩn lạc, sợi nấm và cơ quan sinh bào tử.

2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn

2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski

Cân 1g đất cho vào bình nón 50ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy

lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5ml dịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5ml

nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3, ... , 10-6 . Từ mỗi nồng độ pha

loãng ở các nồng độ 10-3 đến 10-6 , nhỏ 0,1ml sang đĩa Petri chứa môi trường ISP4.

Dùng que gạt vô trùng trang đều sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4-7 ngày. Trên

mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy 3 pha sang đĩa Petri chứa môi

trường ISP4 để làm sạch. Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 -7 ngày, từ các khuẩn

lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng ISP-

4 và Gauze I tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10-14 ngày. Theo ISP màu sắc

khuẩn ty khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: White (W)

nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng,

Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và

nhóm màu không xác định (X) [7,8, 176]

2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh

 Phương pháp thỏi thạch (dùng để sơ tuyển xạ khuẩn) [4]

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 4 và Gauze I trong hộp Petri sau

7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào hộp Petri đẫ cấy vi sinh

vật kiểm định. Để vào tủ lạnh 4-5h cho CKS khuếch tán vào môi trường thạch sau

đó để vào tủ ấm. Vi khuẩn kiểm định nuôi ở 370C, nấm men và nấm mốc nuôi ở 28-

300C, đọc kết quả sau vài ngày. Hoạt tính kháng sinh được xác định dựa vào kích

thước vòng vô khuẩn ( D - d, mm ), D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường

kính thỏi thạch.

 Phương pháp đục lỗ (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể) [4]

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy vi sinh vật kiểm

định trong hộp Petri. Nhỏ vào các lỗ khoan dung dịch cần thử (các bước tiếp theo

tiến hành như phương pháp thỏi thạch).

 Phương pháp khoanh giấy lọc (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dung

môi).

Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm được tẩm một lượng dịch CKS

(1ml/10 khoanh giấy lọc). Sau đó sấy khô ở 400C. Đặt khoanh giấy lọc đã tẩm CKS

vào hộp Petri đã cấy vi sinh vật kiểm định. (Các bước tiếp theo giống phương pháp

thỏi thạch).

2.2.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh [4]

Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hoá được cấy truyền sang các binh

nón dung tích 250 ml chứa 100 ml môi trường Gauze I và nuôi lắc 220 vòng/ phút

trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng.

Giống phát triển tốt được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang binh nón dung tích 250

ml chứa 80 ml môi trường Gauze I dịch thể. Quá trình lên men kéo dài 96 giờ ở nhịêt

độ phòng trên máy lắc 220 vòng/ phút. Sau đó thử hoạt tính kháng sinh trong dịch lọc.

2.2.3. Bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy lên môi trường thạch nghiêng

Gauze I, ở nhiệt độ phòng. Sau 10 - 14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt, các ống giống

được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 60 C. Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần.

Để bảo quản lâu giống được giữ trong ống cát, trong parafin lỏng vô

trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2

năm.

2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

2.2.4.1. Đặc điểm hình thái

a) Quan sát hình thái cuống sinh bào tử [113,134, 177]

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gauze I có găm lamen nghiêng

450 trên bề mặt môi trường. Sau 7-9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình

dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử

có các dạng thẳng hay hơi lượn sóng kí hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu

hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn

ký hiệu là S (Spirales).

b) Bề mặt bào tử

Dùng màng cacbon đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử,

sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét.

Bào tử có hình dạng: tròn, ovan, elip, hình que [113]

Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng

mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu

là Ha (Hairy).

2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy

a) Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan [113,154]

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường: Gauze I, Gauze II, ISP-2, ISP-4, 79

và khoai tây (KT) ở nhiệt độ phòng. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu khuẩn

ty khí sinh (KTKS ), khuẩn ty cơ chất (KTCC) và sắc tố tiết ra môi trường.

b) Sự hình thành sắc tố melanin [113]

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP- 6 ở nhiệt độ phòng. Bắt đầu

quan sát màu của môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14. Nếu sinh melanin,

màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu

đen.

2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý sinh hoá

a) Nhiệt độ tối ưu

Xạ khuẩn cấy trên môi trường thạch nghiêng Gauze I và nuôi ở các nhiệt

độ: 250C, 280C, 370C. Khả năng sinh trưởng được xác định sau 7-10 ngày

nuôi.[182]

b) Khả năng sinh enzym ngoại bào [27].

Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng cách nuôi xạ khuẩn trên môi

trường chứa cơ chất dùng để xác định hoạt tính enzym.

- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza).

- Cazein (xác định hoạt tính proteaza ).

- CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza).

- Gelatin (xác định hoạt tính gelatinaza ).

c) Khả năng chịu muối

Cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng ISP- I có bổ sung thêm NaCI với

các nồng độ 0,5; 1; 3; 5; 7; 8; 9; 10; 11 và 12 (%), sau 7-10 ngày lấy ra quan sát sự

sinh trưởng.

d) Khả năng sử dụng các nguồn cacbon [113]

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP-9 có bổ sung 1% các nguồn

đường: Glucoza, manitol, maltoza, raffinoza, arabinoza, inostol, fructoza, lactoza,

sacaroza, xyloza, xitrat natri, rhamnoza.

Cách làm: cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100 ml

môi trường ISP-9 còn nóng. Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy xạ

khuẩn, sau 14 ngày quan sát sự sinh trưởng.

Trong đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi

trường không có đường được coi là đối chứng âm (-).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương một ít:

có khả năng sử dụng loại đường đó, kí hiệu là (+).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, kí hiệu là (++).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không có

khả năng sử dụng loại đường đó , kí hiệu là (-).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đối

chứng dương nhiều, kí hiệu là ().

e) Xác định axit diaminopimelic (DAP) của xạ khuẩn [146,161]

Nguyên tắc: Ninhydrin phản ứng với nhóm -NH2 của axit diaminopimelic ở

100oC. tạo ra sản phẩm là các vệt mầu tím đỏ.

Tiến hành: Cho khoảng 50mg tế bào ướt vào ống thuỷ tinh có nút vặn (cỡ

3mm100mm). Thuỷ phân tế bào bằng 1ml 6N HCl ở 100oC trong 16 giờ tại nồi ổn

nhiệt khô. Làm lạnh dịch thuỷ phân tới nhiệt độ phòng.

Bổ sung 2ml nước cất vô trùng. Loại bỏ phần cặn cùng giấy lọc. Chấm chừng

3 l dung dịch lên giấy sắc ký bản mỏng. Dùng 1l của 0,01M LL- diaminopimelic

acid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) làm dung dịch chuẩn. Đặt giấy

sắc ký bản mỏng trong bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp metanol - nước - 6N HCl -

pyridine (80:26:4:10, v/v) trong 3 giờ hoặc lâu hơn. Phun dung dịch 0,2%

ninhydrin (trong nước bão hoà n - butanol) lên giấy sắc ký bản mỏng, đặt trong tủ

sấy ở nhiệt độ 100oC trong 5 phút). Vết LL- DAP tách rời, xuất hiện từ TLC như là

các vết màu tím đỏ. LL-DAP (Rf 0,29), meso-DAP (Rf 0,24).

2.2.5. Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.5.1. Tách chiết ADN theo phương pháp của Saito Mura [142]

Nguyên tắc: Thành tế bào của vi sinh vật được phá vỡ nhờ lyzozym và các

chất tẩy mạnh như SDS-Tris-HCl giúp ADN được giải phóng. Protein và ARN

được tách ra khỏi ADN nhờ các enzym ARN-aza, proteaza K và các dung môi

Chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Cuối cùng ADN được tủa bằng etanol tuyệt đối

(lạnh -22) và xác định nồng độ ADN trong dịch mẫu.

Tiến hành: ADN được chiết xuất và tách từ sinh khối ướt theo phương pháp

của Saito và Miura. Lấy 3 vòng que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuôi, ly tâm

lạnh ở 4oC với tốc độ 8.000 vòng trong15 phút và rửa 2 lần bằng 300l dung dịch

muối EDTA pH 8,0 (0.5M Na2EDTA, 0,15M NaCl). Sau đó tạo dịch huyền phù trở

lại trong 200l đệm 10TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm,

1: 2). Bổ sung 10l lysozym (Sigma, 1mg/ml lysozyme), giữ ở 37oC trong nồi cách

thuỷ trong 15 phút. Bổ sung dung dịch Tris-SDS (0,1M Tris-HCl pH 9,0 và 1%

SDS) với thể tích bằng thể tích mẫu. Dịch mẫu được giữ ở 60o C trong nồi cách thuỷ

khoảng 10-30 phút. Sự tan tế bào được xác định bằng độ trong của dung dịch cùng

với sự tăng độ nhớt tương ứng. Dịch tan tế bào được làm lạnh trong đá 10 phút, bổ

sung 150l cloroform-isoamyl alcohol (24:1, giữ ở 4oC) với thể tích bằng 1/3 thể

tích mẫu. Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 10.000 vòng trong 20 phút để phân lớp. Sau

đó chuyển phần nhớt ở pha đầu sang eppendorf mới và ADN được tách nhờ bổ sung

etanol lạnh (etanol 95,5% giữ ở-22oC) với thể tích gấp đôi thể tích mẫu và 2l của

3M axetat-natri (pH=4.5). Ngâm ADN trong 100l etanol 70% trong 30 phút và sau

đó ngâm liên tiếp trong etanol 80, 90, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phút. Sợi ADN

làm khô ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và được làm tan trở lại trong 20l đệm

0,1TE (10TE) ở 4oC qua đêm. Dịch đem phân tích bằng máy quang phổ kế ở các

bước sóng 230, 260 và 280nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260nm. Ở bước

sóng 280nm chứng tỏ sự có mặt của prôtêin. Bước sóng 230nm biểu hiện sự có mặt

của chất đệm, các muối như EDTA và của ARN. Các tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của

ADN ở các bước sóng 230 : 260 : 280nm là 1,0: 0,45: 0,515. Hàm lượng ADN được

tính như sau: 1 đơn vị OD (mật độ quang, Optical Durity) ở 260nm tương đương

với 50g/ml ADN.

Cách tính: Đơn vị mẫu  độ loãng  chỉ số/1000 = ADN g/l.

Nếu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và

ARNaza

2.2.5.2. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)[23, 102,146,162]

Nguyên tắc: Phương pháp này sử dụng ADN polymeraza và các

oligonucleotit tổng hợp nhân tạo, một đoạn ADN dùng làm khuôn được nhân lên

nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỷ lần mà không cần đến nhiều tế bào vi

khuẩn. Nhờ phản ứng này một đọan gen bất kỳ sẽ được khuyếch đại khi biết được

trình tự nucleotit ở hai đầu, ta đã tổng hợp được cặp mồi bổ sung với trình tự của

hai điểm từ đầu 5’ tới đầu 3’ của sợi bổ sung và nhờ có enzym ADN polymeraza mà

ADN khuôn được tổng hợp khi đã có sẵn dNTP.

Tiến hành: Mỗi chu kỳ của phản ứng đòi hỏi 3 bước:

Biến tính (denaturation) sợi ADN bằng nhiệt độ ADN được tách thành hai sợi

đơn. Nhiệt độ giảm xuống cho phép mồi bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN

khuôn. Hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzym Taq polymeraza và dNTP giúp cho

việc tổng hợp ADN mới bổ sung với sợi ADN gốc. Khi các chu kỳ được lặp lại, các

đoạn ADN vừa mới được tổng hợp ở các chu kỳ trước trở thành khuôn cho chu kỳ

sau. Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường không quá 30 chu kỳ và mỗi

phản ứng PCR thường kéo dài khoảng 2-3 giờ. Khi thực hiện phản ứng PCR, một số

yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến kết quả của phản ứng như nồng độ mồi, nhiệt độ và

thời gian ủ mồi, nồng độ ADN khuôn, nồng độ một số ion, như Mg2+.

Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR.

Trình tự mồi: Mồi xuôi 27 5’-agagtttgatcctggctcag-3’ 27-47

Mồi ngược 1525 5’-aaaggaggtgatccagcc-3’ 1525-

1507

dNTP (2,5mM) 2l

Mồi 1l (10pmol cho mỗi loại mồi (ngược và xuôi)

10 taq buffer 0,25l Nước cất 12l

Mẫu (50-90ng) 2l Taq polymeraza 0,3l (taq 5U/ml)

Tổng cộng thể tích phản ứng 20 l

Chương trình chạy PCR

Biến tính ADN ở 94oC trong 1 phút.

Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 94oC  1phút. 50oC  1 phút. 72oC  90 giây.

Hết một chu kỳ.

Tổng hợp : 72oC  2 phút.

Kết thúc chương trình  4oC nhiệt độ bảo quản.

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agaroza

Pha đệm

Tiến hành pha dung dịch đệm 10  TAE

Tris 242g Axit axetic 57.1ml

0.5MEDTA. Na2 pH=8.0 100ml pha với một lít nước

Trong quá trình chạy điện di dùng dung dịch đệm 1TAE (của 10  TAE pha

loãng dịch 10 trong 100 ml nước cất đã khử trùng).

Đổ gel.

- Cân 0,8- 1,2 g agaroza cho vào 100ml dung dịch đệm 1TAE, đun sôi cho đến

khi agaroza tan hết.

- Lắc đều để nguội đến 40-50oC.

- Đổ gel vào khay đã cài sẵn lược.

- Để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và đặt khay gel vào máy điện di.

Tra mẫu:

- Dùng pipet hút 2l dung dịch ADN trộn với 2l 6  loading buffer.

- Tra 1l của 1 kb ADN ladder (Takara) trộn với 2l của 6  loading buffer

dùng như ADN chuẩn.

- Tra mẫu vào từng giếng.

Chạy điện di với dòng điện 100V trong thời gian 20-30 phút

cho tới khi vạch màu đến 2/3 bản gel.

Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad.

Kết quả ADN mới được nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình dưới

những vạch đỏ màu da cam.

2.2.5.3. Phân tích trình tự ADNr 16S theo phương pháp của Sanger [23]

 Nguyên tắc:

Dựa trên trình tự của đoạn mồi đặc hiệu để xác định trình tự ADN của mẫu

cần phân tích trực tiếp từ sản phẩm PCR.[55]

27f 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

920r 5’-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3’

1100f 5’-GCAACGAGGCGCAACCC-3’

350f 5’-TACGGGAGGCAGCAG-3’

1100r 5’-AGGGTTGCGCTCGTTG-3’

350r 5’-CTGCTGCCTCCCGTAG-3’

1 525r 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-

780f 5’-GATTAGATACCCTGGTAG-3’

3’

 Trình tự 4 mồi:

Tiến hành:

Tinh sạch sản phẩm PCR: Dùng Spinfilter unit (bộ kít làm siêu sạch sản phẩm

PCR), lấy 20l sản phẩm PCR cho vào Eppendorf, lọc qua spinfilter unit có bổ sung

50l chất đệm spinbind sau đó loại bỏ dung dịch bằng siêu ly tâm tốc độ 13 000rpm

trong 30 giây. Spinfilter unit được rửa bằng 20l chất đệm spinclean, đem ly tâm 2

lần với tốc độ 13 000 vòng/phút trong 30 giây. Sau đó spinfilter unit được cài vào

một Eppendorf mới. Cuối cùng, tách sản phẩm ADN ra khỏi spinfilter unit bằng

siêu ly tâm tốc độ 13000rpm trong 60 giây cùng với 10l chất đệm rửa trôi.

- Xác định nồng độ ADN: Sản phẩm ADN sau được đo bằng cappilary cell

bước sóng 260nm và tính theo công thức: ADNABS 260  20  50ng/l.

- Sử dụng kit BigDye Terminator để xác định trình tự ADN trực tiếp từ sản

phẩm PCR: lấy chừng 1l sản phẩm sạch PCR (từ 30 hoặc 90ng) làm ADN khuôn

và 3,2pmol/l primer cho vào ống PCR (0.2ml, MicroAmp PCR), 2l BigDye, tổng

thể tích 20l. Các mẫu được làm biến tính ở 96oC trong 3 giây rồi thực hiện 25 chu

kỳ theo chu trình sau: 96oC trong 3 giây, 50oC trong 5 giây, 60oC trong 4 phút.

Bước cuối cùng ở 4oC, thời gian bảo quản.

- Tủa sản phẩm ADN đã nhuộm và gắn với Big Dye: Bổ sung 2l của 3M Na

acetate (pH=4.5) và 500l của etanol. Ly tâm tốc độ 15000 vòng/phút trong 30

phút. Sau đấy mẫu được rửa hai lần trong 500l của 70% etanol, loại bỏ etanol dùng

ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút. Làm khô mẫu bằng thiết bị khô chân không

trong 5 phút. Cuối cùng bổ sung 15l Hi - Dye formamit cho việc tách rời các

nucleotit và trộn nhẹ nhàng trong 1 phút, làm biến tính trong nước sôi 2 phút.

Làm lạnh ngay trong nước đá khoảng 5 phút. 10l mẫu tra vào giếng của khay

mẫu và được phân tích trong thiết bị đọc trình tự tự động ABI Prism 3100 Avant.

2.2.6. Lên men tạo kháng sinh

2.2.6.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp [125]

Xạ khuẩn được lên men trên các môi trường cơ bản (theo Porter) là: A -

4, A - 4H, A - 9, A -12, ISP - 4 và Gauze I. Sau 96 giờ nuôi cấy lắc tròn 220

vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men

(phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra môi

trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo.

2.2.6.2. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon, nitơ lên sinh tổng hợp chất

kháng sinh

Xạ khuẩn được lên men trên môi trường dịch thể trong bình nón 250ml với

thành phần môi trường cơ bản như sau:

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Bổ sung nguồn cacbon(%): Tinh bột tan 1 và 2; glucoza - 1,5; lactoza - 1,5;

saccaroza - 1,5; rỉ đường - 1,5; vào hỗn hợp dung dịch muối (dung dịch muối A) đã

bổ sung 0,2% (NH4)2SO4 .

Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/phút. Sau 96

giờ lên men xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men bằng phương pháp

đục lỗ thạch.

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Bổ sung nguồn nitơ (%): Cao nấm men - 1,0; bột đậu tương 1 và 2; pepton –

1; (NH4)2SO4 - 0,2 ; NH4Cl - 0,1 và KNO3 - 0,1 vào hỗn hợp dung dịch muối đã bổ

sung thêm 1,5% glucoza. Sau đó bổ sung giống rồi lên men và thử hoạt tính kháng

sinh bằng phương pháp đục lỗ.

2.2.6.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng hình thành chất

kháng sinh

Xạ khuẩn được nuôi lắc trên môi trường A-12 (220 vòng/phút ) đã chỉnh

pH theo các pH 5, 6, 7, 8, 9 bằng NaOH và HCl 1N. Sau 120 giờ thử hoạt tính

kháng sinh.

2.2.6.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất kháng sinh

Xạ khuẩn được nuôi cấy vào môi trường A-12 và nuôi lắc 220 vòng/ phút ở

các nhiệt độ 250C, 300C, 370C sau 120 giờ thử hoạt tính kháng sinh bằng phương

pháp đục lỗ.

2.2.6.5. Động học của quá trình lên men

Xạ khuẩn được lên men trên môi trường dịch thể phù hợp trong bình tam giác

250 ml chứa 100 ml môi trường. Nuôi trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau 24 giờ lấy

một bình xác định các thông số: sinh khối, pH, hoạt tính kháng sinh.

Mục đích của việc nghiên cứu động học lên men là để xác định thời gian và

điếu kiện tối ưu cho việc hình thành CKS.

Hoạt tính kháng sinh (đv/ml) được xác định theo phương pháp của

Dmitrieva [4]

2.2.6.6.Phương pháp tối ưu hóa của Box-Willson (phương pháp tìm giá trị

tối ưu của hàm mục tiêu khi các biến số thay đổi) [2]

- Chọn 3 biến của thành phân môi trường là glucoza, bột đậu tương và thể tích

môi trường.

- Mức trung bình của 3 biến là: glucoza 10g/l, bột đậu tương 10g/l, thể tịch

môi trường là 75ml (dựa trên thành phân môi trường đã chọn cho chủng TC-

54 là A-4)

- Thí nghiệm lặp lại 3 lần

- Xác định hàm mục tiêu: trong các chỉ tiêu đã chọn, chỉ tiêu nào là quan trọng

nhất, tiêu biểu nhất cho quá trình tổng hợp CKS.

Cách làm:

Pha 1,8lít môi trường có nồng độ bột đậu tương – 7g/l, glucoza – 7g/l, NaCl 5g/l,

CaCO3-1g/l chia vào 12 bình nón dung tích 500ml, mỗi bình chứa 100 ml môi

trường và 12 bình nón dung tích 500 ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường. Cân

bổ sung vào các môi trường lượng bột đậu tương và glucoza cụ thể như sau:

- 3 bình thí nghiệm 1, mỗi bình 0,6g bột đậu tương và 0,6g glucoza.

- 3 bình thí nghiệm 2 chỉ bổ sung 0,6g glucoza mỗi bình.

- 3 bình ở thí nghiệm 3, mỗi bình bổ sung 0,6 g bột đậu tương

- 3 bình ở thí nghiệm 4 không bổ sung.

- 3 bình ở ths nghiệm 5, mỗi bình 0,3g bột đậu tương và 0,3g glucoza.

- 3 bình ở thí nghiệm 6, mỗi bình 0,3g glucoza.

- 3 bình ở thí nghiệm 7, mỗi bình 0,3g bột đậu tương.

- 3 bình ở thí nghiệm 8, không bổ sung.

2.2.6.7. Lên men trên môi trường xốp (rắn)[120]

Xạ khuẩn được nuôi trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau, sau 7 ngày bắt

đầu kiểm tra hoạt tính kháng sinh bằng cách cân 1g môi trường nuôi cấy cho vào

đĩa Petri đã cấy vi sinh vật kiểm định (các bước tiếp theo giống phương pháp

thỏi thạch).

2.2.7. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh

2.2.7.1. Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối bằng dung môi hữu cơ

Sau khi lên men dịch nuôi cấy và sinh khối được tách riêng. Phần sinh khối

được chiết bằng các loại dung môi khác nhau, với tỷ lệ chiết là 1:1. Hỗn hợp dung

môi sinh khối nay được lắc 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm loại sinh khối.

Cuối cùng dung môi chiết được thử hoạt tính kháng sinh trên VSV kiểm định bằng

phương pháp khoanh giấy lọc.

2.2.7.2. Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ

CKS trong dịch lên men có thể được tách bằng nhiều phương pháp khác nhau

như: hấp phụ, trao đổi ion hay tách chiết bằng các dung môi hữu cơ. Dịch lên men

sau khi loại sinh khối có thể được tách bằng các loại dung môi hữu cơ khác nhau

như: n-butanol, etyl axetat... tỷ lệ giữa dịch chiết và dung môi là 1:1. Hỗn hợp dịch

lên men và dung môi được lắc ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thử hoạt tính

kháng sinh trong dung môi và trong dịch chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc.

 Dịch nuôi cấy Streptomyces hygroscopicus TC-54 được axit hóa bằng axit oxalic về pH 4,5. Các ion Ca+ trong dịch nuôi cấy được loại bỏ nhờ quá trình lọc.

 Xử lý dịch lọc bằng Ambelit IR-120 (H) và IR-45(OH) để loại bỏ các gốc

2.2.7.3. Tách chiết chất kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion [70,71,179]

 Nhồi cột Dower-50 X-2 (H). CKS hấp thụ trong nhựa Dower-50 X-2 (H)

H+ và OH- bẩn.



được giải hấp thụ bằng NH4OH 0,5N.

Thu được CKS dạng thô.

2.2.7.4. Định tính kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng (thin layer

chromatography -TLC) [70]

Chuẩn bị bản mỏng: cân 1 g Silicagel G cho vào cối nghiền mịn, thêm 10ml

nước cất. Nghiền nhanh rồi tráng lên tấm kính kích thước 10x20 cm để khô ở nhiệt

độ phòng, sau đó hoạt hóa trong tử sấy 1100C/1giờ để nguội bỏa quản trong bình

hút ẩm. Bản mỏng tráng Silica gel GF254(Merck, Germany) được hoạt hóa ở 1100C

trong 1 giờ.

Các chất kháng sinh cần xác định được chạy trong bản silica gel G khai triển

trong hệ dung môi n-propanol-axit axetic-nước (4:1:1). Kiểm tra bằng thuốc thử

naphthoresorcin-H2SO4 hoặc bằng hiện hình sinh học.

2.2.8. Xác định một số tính chất của chất kháng sinh

2.2.8.1. Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh

Dịch nuôi cấy sau khi lọc được đun cách thuỷ ở 400C, 700C và 1000C kéo dài

20, 40, 60 phút, sau đó làm nguội và xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương

pháp đục lỗ thạch. [7].

2.2.8.2. Xác định Rf của chất kháng sinh bằng sắc ký giấy.

CKS được hoà tan trong các dung môi hữu cơ khác nhau rồi chấm 0,05 ml

dịch hoà tan này lên giấy sắc ký Whatman số 1 với kích thước 2x20 cm, chạy trong

các hệ dung môi khác nhau. Sau khi chạy sắc ký, băng giấy được làm khô tự nhiên

và hiện hình bằng phương pháp vi sinh vật với vi sinh vật kiểm định là Fusarium

oxysporum. Rf được tính theo công thức:

Rf = d / D

Trong đó: d - là khoảng cách từ điểm chấm tới điểm hiện CKS.

D - là khoảng cách từ điểm chấm đến điểm dung môi chạy đến .

2.2.8.3. Xác định phổ tử ngoại, hồng ngoại của chất kháng sinh

Sau khi có CKS ở dạng tinh khiết, tiến hành đo phổ hấp phụ tử ngoại và hồng

ngoại.

2.2.8.4. Phân tích nồng độ CKS bằng sắc ký lỏng cao áp ( HPLC)[103].

Nguyên tắc: Phương pháp này cho phép xác định nhanh hàm lượng các hợp

chất đi qua dưới tác dụng của UV với độ tách tốt, kết quả cho độ chính xác cao

nhưng đòi hỏi mẫu và dung môi phải thật sạch.

Tiến hành: Chất phản ứng chạy qua máy -680, hai bơm 510, vòi bơm U6k.

Bộ tách sóng 410UV. Sử dụng cột RP18, kích thước cột 125mm x 4,6mm, tốc độ

chảy 0,8ml/phút. Bước sóng 220nm.

Pha động: Dung dịch A 500ml Na2B4O7 (0,1M), dung dịch B 500ml KH2PO4

(0,1M).

Chuẩn bị mẫu: CKS thu được sau khi sắc ký trao đổi ion được sử dụng để bơm

lên cột.

2.2.8.5. Phân tích cấu trúc chất kháng sinh TC-54 bằng phổ cộng hưởng từ

hạt nhân (NMR)[9]

Cấu trúc hoá học của chất kháng sinh được xác định trong phòng thí

nghiệm về dược phẩm của Trường Đại học Pari 5 (Laboratorie de Pharmacognosie,

Faculte de Pharmacie, Pari 5).

Chất sau khi tinh sạch được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những

proton có các mức năng lượng khác nhau từ thấp đến cao. Sự khác nhau này được

phản ánh thông qua tần số cộng hưởng. Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ

proton, carbon, … nhờ máy công hưởng từ hạt nhân Bruker, Avance 400 (Đức).

Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ trên sẽ xác định được số

nguyên tử C, H cũng như nhũng nhóm chức có thể tham gia vào bộ khung cacrbon.

CKS TC-54 sau khi đã được tinh sạch, giải hấp phụ trong etanol. Dịch etanol

cho bay hơi trên mày chân không PeedVac, SPD 1010 (Mỹ). Phần cặn được hòa tan

trở lại trong dung dịch dimethyl sulfoxode (DMSO) để tiến hành đo và phân tích

các phổ.

2.2.8.6. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) [8,112].

CKS được hòa tan trong nước hoặc cồn 70% đến nồng độ 10mg/ml. Sau đó

pha loãng vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định theo hệ số 2.

1:1/2:1/4:1/8:1/16:1/32:1/64.... Cấy VSV kiểm định vào 1ml môi trường và nuuoi ở

nhiệt độ thích hợp. Đối chứng không bổ sung CKS. Sau 5 ngày xác định nồng độ ức

chế tối thiểu.

2.2.9. Sản xuất chế phẩm bào tử xạ khuẩn

2.2.9.1. Quy trình sản xuất (áp dụng cho sản xuất chế phẩm của chủng T-41

và D-42)[17]

Giống trong các ống nghiệm được cấy truyền sang các bình nón dung tích

250ml có chứa 50g môi trường lên men xốp để tạo giống khởi động. Sau 5 đến 7

ngày giống từ các bình khởi động được cấy truyền sang các bình nón dung tích

1000ml có chứa 200g môi trường lên men xốp để sản xuất chế phẩm. Lượng giống

cấy vào các bình 1000ml là 5%. Sau 12 đến 14 ngày nuôi, chế phẩm được đưa vào

buồng sấy và sấy ở nhiệt độ 40 - 500C, sau đó đưa vào máy xay để cho ra chế phẩm

dạng bột và đóng gói hoàn thiện.

2.2.9.2. Xác định một số tính chất của chế phẩm

a) Số lượng và chất lượng bào tử của chể phẩm

Chế phẩm sau khi hoàn thiện được kiểm tra số lượng bào tử xạ khuẩn có trong

1 g chế phẩm.

b) Khả năng tồn tại trong đất trồng

Chế phẩm được bổ sung vào đất đã khử trùng rồi để ở điều kiện tự nhiên. Sau

7 ngày tiến hành phân lập lại xác định số lượng bào tử xạ khuẩn của chế phẩm có

trong 1 gam đất.

c) Độ tinh sạch của chế phẩm

Bổ sung chế phẩm vào các môi trường phân lập vi khuẩn và phân lập nấm

nhằm kiểm tra trong chế phẩm có chứa các bào tử vi khuẩn hay bào tử nấm.

2.2.10. Tìm hiểu khả năng ứng dụng

2.2.10.1. Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của

hạt.

Dịch nuôi cấy xạ khuẩn đã kiểm tra hoạt tính kháng sinh được pha loãng đến

các nồng độ: 1; 50 và 100%. Ngâm hạt của một số loại cây và dịch đã pha loãng,

sau 24 giờ vớt ra, đặt vào hộp Petri có lót giấy thấm và bổ sung nước thấm ướt. Mỗi

hộp đặt 100 hạt. Để vào tủ ấm theo dõi khả năng nảy mầm của hạt sau 4 ngày. Đối

chứng ngâm trong nước cất. Tính tỷ lệ nảy mầm, thí nghiêm lặp lại 3 lần.

2.2.10.2. Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và

phát triển của cây

Dịch nuôi cấy pha loãng đến các nồng độ: 1, 2, 10, 50 và 100%, ngâm hạt

thóc vào, sau 24 giờ lấy ra để vào hộp Petri có lót giấy thấm đã tẩm ướt bằng các

dịch có nồng độ tương ứng, hàng ngày bổ sung các dịch pha loãng có nồng độ

tương ứng. Quan sát sự nảy mầm sau 4 ngày và sự sinh trưởng của cây sau 10 ngày.

2.2.11. Thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng [10]

2.2.11.1.Chế phẩm T41 và D42 ( theo quy trình ở mục 2.2.9.1)

Chế phẩm sau khi đã hoàn thiện về mặt sản xuất được đem thử nghiệm trên

đồng ruộng.

Vật liệu thử nghiệm chế phẩm:

- Tổng diện tích thử nghiệm: 36m2 ruộng chia thành 36 ô thí nghiệm (1m2/ ô).

- Nấm gây bệnh cây: sử dụng hai loại nấm gây bệnh phổ biến và chủ yếu trên

cây trồng hiện nay là Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii.

- Chế phẩm: (CP)

 2 chế phẩm sinh học vừa sản xuất (T-41, D-42)

 1 chế phẩm sinh học khác từ Trichoderma viridae.

 2 thuốc hoá học diệt nấm là Rovral 50 WP và Mexyl MZ72

 Validacin 3DD

- 2 loại cây trồng thử nghiệm: Bắp cải giống và cà chua giống.

Mô hình bố trí thử nghiệm:

Với 2 loại nấm bệnh có 2 công thức thí nghiệm, mỗi công thức có 6 ô đất gồm 1

ô đối chứng và 5 ô thử nghiệm như sau:

1) Nấm gây bệnh (ô đối chứng)

2) Nấm gây bệnh + CP T41

3) Nấm gây bệnh + CP D42

4) Nấm gây bệnh + CP từ Trichoderma (Thay công thức này bằng

validacin 3DD 0,15%)

5) Nấm gây bệnh + Rovral 50 WP

6) Nấm gây bệnh + Mexyl MZ72

Mỗi công thức được lặp lại 3 lần, do đó với mỗi loại nấm gây bệnh cần sử

dụng hết 18 ô đất.

Các bước tiến hành thử nghiệm:

Lây nhiễm nấm gây bệnh vào đất trồng ở tất cả các ô bằng cách đưa trực

tiếp nấm vào đất. Nấm gây bệnh được cấy trong các túi nilon chứa 30g môi

trường trấu + cám. 7 ngày sau khi cấy, nấm được đem lây nhiễm vào đất

với liều lượng là Rhizoctonia solani 60g/ ô và Sclerotium rolfsii 60g/ ô.

7 ngày sau khi lây nhiễm nấm, tiến hành bổ sung lần 1 các chế phẩm vào

đất theo từng công thức thí nghiệm với liều lượng như sau:

 CP T41: 30g/ ô thí nghiệm.

 CP D42: 30g/ ô thí nghiệm.

 CP Trichoderma: 60g/ ô thí nghiệm.

 Rovral50 WP 0,1%

 Mexyl MZ72 0,25%

 Validacin 3DD 0,15%

7 ngày sau khi bổ sung chế phẩm tiến hành trồng bắp cải giống và cà chua

giống với số lượng 35 cây/ ô.

7 ngày sau khi trồng cây tiến hành bổ sung chế phẩm lần 2 với liều lượng

như lần 1. Đồng thời 7 ngày một lần, xác định số cây bị bệnh ở các ô.

Bổ sung chế phẩm lần 3 được tiến hành 10 ngày sau lần bổ sung thứ 2.

2.2.11.2.Chế phẩm TC-54

Chế phẩm được sản xuất như sau:

 Lên men chủng Streptomyces hygroscopicus TC-54 trong nồi lên men 10L,

trong 5 ngày với các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và lên men. Sau 5 ngày,

thu dịch lên men. Ly tâm, loại bỏ sinh khối, chỉ lấy dịch. Sau đó bảo quản lạnh

và đem đi thử nghiệm ngay. Chế phẩm được pha loãng với nồng độ 25%.

 Thí nghiệm trên lúa bị bệnh được tiến hành tại xã Trần Lãm, thành phố Thái

Bình.[10].

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm diện hẹp, nhắc lại 3 lần, diện tích 1 ô công thức

50m2.

 Công thức 1 : Chế phẩm TC-54.

 Công thức 2 : Validacin 3DD 0,25%.

 Công thức 3 : Đối chứng

Số dảnh bị bệnh

Chỉ tiêu, phương pháp điều tra.

Số dảnh điều tra

 Tỷ lệ bệnh =

 Chỉ số bệnh =

n4: Số dảnh bị bệnh cấp 4: Số dảnh có lá đòng bị bệnh

n3:Số dảnh bị bệnh cấp 3: Số dảnh có bẹ lá thứ nhất dưới lá đòng bị bệnh

n2: Số dảnh bị bệnh cấp 2: Số dảnh có bẹ lá thứ nhất dưới lá đòng bị bệnh

n1: Số dảnh bị bệnh cấp 1: Số dảnh có bẹ lá thứ ba dưới lá đòng bị bệnh

N: Tổng số dảnh điều tra

 Quan sát và ghi nhận mức độ bị bệnh ở 50 khóm ngẫu nhiên trên

đường chéo góc (Trong mỗi khóm chọn 1 dảnh cao nhất để quan sát).

Thời điểm điều tra: Xác định tỷ lệ và chỉ số bệnh trước phun, sau phun thuốc

5, 10, 15, 20 ngày.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN

3.1.1. Sự phân bố và hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn

Từ 71 mẫu đất lấy ở nhiều vùng khác nhau trong cả nước, chúng tôi đã phân

lập và thuần khiết được 508 chủng xạ khuẩn. Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn

trong đất được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1 Số lượng và sự phân bố xạ khuẩn trong đất ở một số vùng

Nơi lấy mẫu Số lượng mẫu đất Số lượng xạ khuẩn / 1g đất (x 104 CFU) Số chủng đã phân lập

Trà Mi (Quảng Ninh) 3 3,1 .104 – 4,5.104 37

Cầu Diễn (Hà Nội) 9 1,9.104 – 3,5.104 45

Trà Cổ (Quảng Ninh) 14 15 – 26 53

Thành Phố Vũng Tàu 3 18 – 37 25

5 14– 28 53 Xuyên Mộc (Bà Rịa – Vũng Tàu)

Nam Định 3 1,5.104 – 5,6.104 45

Châu Giang (Hưng Yên) 7 1,2.103 – 3,7.103 37

Tiền An (Bắc Ninh) 8 2,3.103 – 4,6.103 53

Nghệ An 09 23 – 43 31

Bắc Ninh 10 3,3. 103 – 5,4.103 79

Tổng 71 1,5 – 5,6.104 508

Mặc dù ở đây chúng tôi không đi sâu vào nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn

trong đất, tuy nhiên có thể thấy số lượng xạ khuẩn trong các mẫu đất là khá phong

phú. Tuỳ thuộc vào tính chất đất và ở các địa điểm khác nhau, số lượng xạ khuẩn

(Streptomyces) có thể dao động từ 1,5.104 đến 5,6.108 CFU/ g đất.

Hình 3.1. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc Chi Streptomyces theo nhóm màu.

Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3

Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân chia theo nhóm màu

của Shirling và Gottlieb. Số lượng xạ khuẩn nhiều nhất vẫn là nhóm xám chiếm

39% tổng số các chủng phân lập, sau đó là đến nhóm trắng chiếm 22,8% và nhóm

hồng 20,2%, nhóm xanh da trời 5,3% cuối cùng ít nhất vẫn là nhóm xanh lục chiếm

2,9%. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây [7]. Ở đất than bùn, số

lượng xạ khuẩn nhóm xám chiếm 61,8% trong tổng các nhóm, ở đất podsol (đất

axit) chiếm 59,64% còn đất kiềm (carbonat) chiếm 35,4%.

Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh không cao, 136 chủng có

hoạt tính trên tổng số 508 chủng xạ khuẩn phân lập được, chiếm 26,77%. Điều này

có thể một phần là do số lượng vi sinh vật kiểm định là không nhiều. Tuy nhiên, tỷ

lệ xạ khuẩn kháng nấm lại cao hơn. Đáng chú ý là tỷ lệ xạ khuẩn kháng

F.oxysporum, nấm gây bệnh thối cổ rễ phân lập trực tiếp từ thực vật: có 82 chủng,

chiếm 16,14%. Cũng như thường lệ, tỷ lệ kháng vi khuẩn Gram (+) bao giờ cũng

cao nhất, chiếm 23,2%, sau đó mới đến vi khuẩn Gram (-) chiếm 8,0%. Tính đối

kháng của các nhóm xạ khuẩn phân lập được với 5 loại vi sinh vật kiểm định tiêu

biểu cho các nhóm vi sinh vật khác được minh hoạ ở hình 3.2.

Hình 3.2. Tỷ lệ phần trăm các chủng có hoạt tính kháng sinh.

Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3

Trong số 508 chủng phân lập được, có 58 chủng ưa nhiệt chiếm 11,4%. Đây là

các chủng sinh trưởng tốt ở 45-500C. Trong số này có 8 chủng có hoạt tính kháng

sinh: 6 chủng chỉ chống nấm không chống vi khuẩn, 2 chủng vừa chống vi khuẩn

vừa chống F. oxysporum. Tuy nhiên, chúng tôi mới chỉ dừng lại ở mức điều tra chứ

không đi sâu nghiên cứu các chủng ưa nhiệt này.

3.1.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao

Sau khi điều tra sơ bộ về các chủng có hoạt tính kháng sinh, chúng tôi chọn ra

47 chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiến hành sàng lọc bước 2. Ở bước này, xạ

khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể ISP4, sau đó lọc tách khuẩn ty.

Tiến hành chiết kháng sinh từ dịch lọc và từ sinh khối bằng dung môi khác nhau.

Hoạt tính kháng sinh cũng được xác định với 5 loại vi sinh vật kiểm định nêu trên.

Kết quả hình 3.3 cho thấy, CKS vừa tích luỹ trong sinh khối vừa tiết ra môi trường.

Mục tiêu của chúng tôi là tuyển chọn được chủng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh

thực vật, trước hết là F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ. Bảy chủng có hoạt tính

chống nấm mạnh nhất đã được lựa chọn và được ký hiệu là TC-54, C-5, TC-37,

BC-54, BC-87, T-41, D-42. Các chủng này thuộc 5 nhóm màu khác nhau.

Hình 3.3. Hoạt tính kháng sinh của 47 chủng xạ khuẩn Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3

Chủng ký hiệu TC-54, T-41 và D-42 đều thuộc nhóm xám, chủng C-5 thuộc

nhóm hồng, chủng TC-37 thuộc nhóm xanh da trời, chủng BC-86 thuộc nhóm trắng

và chủng BC-87 thuộc nhóm vàng. Dựa trên hoạt tính kháng nấm của các chủng, 3

chủng xạ khuẩn được chọn để tiếp tục nghiên cứu là chủng có ký hiệu TC-54, D-41

và D-42. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm phân loại của 3 chủng này.

3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN.

3.2.1. Đặc điểm hình thái

 Chủng T-41

Chủng T-41 có bề mặt bào tử xù xì (W) và cuống sinh bào tử xoắn (S), số

lượng bào tử trên một chuỗi là 10-50.

 Chủng D-42

Chủng D-42 có bề mặt bào tử nhẵn (Sm) và cuống sinh bào tử thẳng (RF). Số

lượng bào tử trên một chuỗi là 10  50.

 Chủng TC-54 có bề mặt bào tử xù xì (W) và cuống sinh bào tử dạng

xoắn kép (S). Số lượng bào tử trên một chuỗi: 10-50.

Hình 3. 4. Bề mặt bào tử chủng T-41 (SEM x15.000) Hình 3.5. Bề mặt bào tử chủng D-42 (SEM x 10.000)

Hình 3.6. Bề mặt bào tử chủng Hình 3.7. Cuống sinh bào tử chủng

TC-54 (SEM x15.000) TC-54 ( SEM x5000)

3.2.2. Đặc điểm nuôi cấy

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn có đặc điểm rất khác biệt với các nhóm vi khuẩn

khác ở chỗ rất đa dạng về màu sắc khi nuôi trên các môi trường nuôi cấy khác nhau.

Tuỳ theo thành phần của môi trường nuôi cấy mà màu sắc KTCC và KTKS hay sắc

tố hoà tan tiết ra khác nhau. Các đặc điểm nuôi cấy của các chủng TC-54, T-41, D-

42 được trình bày ở bảng 3.2.

 Chủng T-41

Sau 7 ngày nuôi cấy, màu KTKS của chủng T-41 thay đổi từ trắng đến xám.

Sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Gauze I, II, ISP-4, ISP-2, KT màu KTKS đều

chuyển dần sang xám đen. Sau 21 ngày, màu KTKS trên các môi trường ISP 2, ISP

4, KT chuyển sang màu đen, và trên môi trường ISP 4, KTKS bị nát ra. Còn trên

môi trường 79 sau 21 ngày màu KTKS vẫn là màu trắng.

 Chủng D-42

Từ kết quả ở bảng 3.2 ta thấy mầu sắc KTKS cũng như sinh trưởng của chủng

D- 42 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy. Trên 2 môi trường KT và ISP 4, chủng

này sinh trưởng mạnh, màu sắc KTKS xám và xám đen, trên môi trường Gauze I và

Gauze II sinh trưởng bình thường còn trên môi trường ISP 2 thì chủng này không có

khả năng sinh trưởng. Sắc tố hoà tan chỉ thấy tiết ra trên môi trường ISP 4 còn các

môi trường khác không có.

Bảng 3.2. Đặc điểm nuôi cấy của 3 chủng

Màu KTKS Môi trường Sinh trưởng Màu KTCC Màu sắc tố hoà tan

Gauze I

Gauze II

Xám đen Trắng Xám đen Xám đen Trắng

ISP - 2 Vàng nhạt Không màu Trắng xám Không màu Vàng nhạt Không màu Vàng nhạt Không màu Không mầu Xám Trắng xám Vàng nhạt Không màu Vàng nhạt Không màu

– –

ISP - 4 Vàng nhạt Không màu Vàng nhạt Không màu

Xám Nâu

Trắng Xám

KT Vàng

Xám – Xám nhạt Xám đen Trắng Xám đen Trắng Trắng Trắng Xám đen Trắng

+++ ++ +++ ++ ++ +++ ++ – ++ ++ +++ +++ +++ + ++ ++ +++ ++ Vàng nhạt Không màu Không màu Không màu Vàng nhạt Không màu Không màu Xám đen Không màu Trắng xám Vàng nhạt Không màu Ký hiệu chủng T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4 T-41 D-42 TC 5-4

+++: sinh trưởng tốt ; ++: sinh trưởng bình thường; + sinh trưởng kém

 Chủng TC-54

Sau 7 ngày nuôi cấy, màu KTKS của chủng TC-54 thay đổi từ trắng đến xám.

Sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường Gauze I, ISP 4, 79 và KT màu của KTKS đều

chuyển dần sang đen. Sau 21 ngày, màu KTKS bị nát ra và có dạng xám đen.

3.2.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hoá

 Chủng T-41

Chủng T-41 có thể sinh trưởng ở 370C, dải pH cho sinh trưởng rộng, có thể từ

5-9, không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt. T-41

có khả năng tạo thành một số enzym ngoại bào như amylaza, proteaza và xenlulaza,

có khả năng chịu muối đến 5%. Thành tế bào chứa LL-DAP nên thuộc typ I.

Bảng 3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng T-41, D-42 và TC-54

Thông số Các đặc điểm sinh lý - sinh hoá

T-41 D-42 TC-54

Phân giải xenluloza(mm) 42 45 12

Phân giải cazein (mm) 40 48 14

Phân giải gelatin (mm ) 44 38 +

Thủy phân tinh bột (mm) 35 18 14

Phân giải kitin (mm) 42 46 -

Khử nitrat - - +

Hình thành melanin - - -

Thành phần DAP trong tế bào LL-DAP LL-DAP LL-DAP

Thang nhiệt độ sinh trưởng (0C) 20  370 20  320 20  40

Nhiệt độ tối ưu (0C) 28  300 26  280 28  300

Thang pH cho sinh trưởng 5  9 6,5 8 5  8,5

pH tối ưu 6,5 7,5 7,0 7,5 7,0 7,5

Khả năng chịu muối (%) 5 8 5

Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy chủng T-41 không có khả năng sử dụng lactoza,

các nguồn đường khác đều có thể đồng hóa được tuy nhiên, mức độ sử dụng mỗi

loại đường không giống nhau, trong đó khả năng đồng hóa tốt nhất là fructoza và

mantoza

 Chủng D-42

Chủng D-42 sinh trưởng tốt ở dải pH 6,5  8. Tuy nhiên pH tối ưu cho sự sản

sinh CKS là: 7,0 7,5 và không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi

trường thạch hữu cơ chứa sắt. D-42 có khả năng hình thành một số enzim ngoại bào

như amylaza, xenluloza, kitinaza và proteaza, có khả năng sinh trưởng ở nồng độ

muối 8%. Chủng này cũng có thành tế bào thuộc typ I. Khả năng sử dụng đường

của D-42 rất khác nhau. D-42 có khả năng sử dụng hầu hết các loại đường, tuy

nhiên, với một vài nguồn đường khả năng sử dụng của D-42 là chưa rõ ràng.

Bảng 3.4. Khả năng đồng hoá đường của các chủng T-41, D-42 và TC-54

Nguồn đường Chủng

D - glucoza T-41 + D-42 ++ TC-54 ++

Arabinoza + + -

Xyloza + + +

Inositol + + ++

Mannitol + ++

+  Fructoza + +

 ++  Ramnoza +

 Raffinoza + ++

Lactoza - ++ +

Mannoza + + -

Maltoza + + + ++

Sacaroza + ++

+  Natrixitrat + +

|: Không xác định

 Chủng TC-54

Chủng TC-54 sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 - 300C và không sinh trưởng ở

450C. Thành tế bào chứa LL-DAP thuộc typ I. pH thích hợp cho sinh trưởng là 6-8.

Chủng này không có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường thạch hữu

cơ có chứa sắt và có khả năng tạo thành một số enzym ngoại bào như amilaza,

xenlulaza, proteaza, khả năng chịu muối đến 5%.

Xạ khuẩn TC-54 không có khả năng sử dụng arabinoza, mannoza, nhưng 10

loại đường còn lại là glucoza, sacaroza, ramnoza, fructoza, raffinoza, maltoza,

xyloza, lactoza, inositol, manitol đều có thể sử dụng được với các mức độ khác

nhau.

3.2.4. Hoạt tính kháng sinh Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn cũng là một trong các chỉ tiêu phân loại

cần được nghiên cứu. [62, 153, 180].

Bảng 3.5. Phổ kháng sinh của 3 chủng xạ khuẩn

VSV kiểm định Chủng T-41 Chủng D-42 Chủng TC-54

Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm)

B. subtilis ATCC 6633 S. lutea ATCC 122222 P. vulgaris K. pneumonia S. aureus 209P S. typhi DT E. coli ATCC 15224 P. solanaceraum T. utilis BC 5-Y2524 C. albicans T. mentagrophytes F. oxysporum R. solani Penicillium .sp A. niger Sclerotium rolfsii C. tropicalis 28 26 - 22 50 42 30 26 35 30 28 23 19 28  10 30 28 19 44 35 30 23 25 16 23 26 22 28 21 15 14 18 26

 Chủng T-41

Số liệu ở bảng 3.5 cho thấy chủng T-41 có phổ ức chế các vi sinh vật kiểm

định khá rộng, không những có khả năng kháng nấm mà còn có khả năng chống vi

khuẩn Gram (+) và Gram (-). Tuy nhiên, có thể thấy chủng T41 chủ yếu chống lại

được các vi nấm gây bệnh đặc biệt là F.oxysporum với vòng ức chế là 50mm, còn

Rhizoctonia solani là 42 mm, Sclerotium rolfsii là 35 mm, Penicillium. sp là 30mm.

 Chủng D-42

Chủng D - 42 chỉ có hoạt tính chống một số nấm gây bệnh như F.oxysporum,

Rhizoctonia solani, mà không có hoạt tính kháng các vi khuẩn kiểm định khác. Khả

năng đối kháng các chủng vi sinh vật kiểm định cùng với các đặc điểm về hình

thái, sinh lý sinh hoá được dùng để tham khảo trong phân loại các chủng xạ khuẩn

này.

Hình 3.8 Hoạt tính kháng F.oxysporum của 3 chủng T-41, D-42, TC-54

 Chủng TC-54

Chủng TC-54 ức chế được 16 trong số 17 vi sinh vật kiểm định. Phổ kháng

nấm của chủng này khá mạnh. Vòng kháng F. oxsporum đạt đến 35mm, kháng T.

mentagrophytes đạt 44 mm, C. albicans đạt 19 mm, và C. tropicalis đạt 23 mm.

Việt Nam là nước nông nghiệp, nông dân có thói quen dùng nhiều phân

chuồng và phân ủ bón cho cây trồng. Việc ứ đọng các chất hữu cơ trong đất ảnh

hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của cây trồng làm cho cây có sức đề kháng

kém hơn so với các bệnh do tác nhân gây bệnh từ đất. Nông dân không thể phun

kháng sinh vào đất. Do vậy, đấu tranh sinh học với các bệnh cây cũng là một hướng

quan trọng. Ở nước ta, nhất là nông thôn, điều kiện vệ sinh còn thấp, nguồn nước

sinh hoạt bị ô nhiễm, do vậy bệnh da liễu rất phổ biến. T. mentagrophytes là nấm

gây bệnh ngoài da chiếm tỷ lệ cao trong số các bệnh da liễu. C. albicans rất thường

gặp trong các bệnh phụ khoa và gây bệnh candidoz. Việc nhiễm các nấm ảnh hưởng

nghiêm trọng đến sức khoẻ người lao động.

Vì những lý lẽ trên, 3 chủng xạ khuẩn có ký hiệu T-41, D-42, TC-54 là những

chủng rất quý, cần được giữ gìn để nghiên cứu sâu hơn nhằm đưa vào ứng dụng

thực tiễn.

3.2.5. Giải trình tự ADNr 16S của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu

Để có thể phân loại chính xác đến loài, chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự

ADNr 16S của 3 chủng nghiên cứu.

Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP4 thạch nghiêng, lấy hai

vòng que cấy và tách chiết qua nhiều bước (theo phương pháp tách chiết ADN tổng

số như đã nêu). Kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agaroza 1% cho thấy trên bản

gel thu được băng ADN duy nhất không bị lẫn ARN.

Trong ADN tổng số được tách chiết có gen mã hoá ARNr 16S của các chủng

nghiên cứu. ADN này được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để nhân gen ARNr

16S lên nhiều lần bằng các cặp mồi đã thiết kế. Với cặp mồi được thiết kế dựa trên

trình tự bảo thủ của gen ARNr 16S của E. coli thì theo lý thuyết sản phẩm PCR thu

được phải có độ dài xấp xỉ 1500bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các

băng có kích thước khoảng 1500bp đúng như lý thuyết. Băng ADN rất rõ, không bị

đứt gãy, có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng trong các phản ứng tiếp theo. Sản phẩm

PCR được tinh sạch bằng bộ kit vivapure theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản

phẩm PCR được kiểm tra hàm lượng ADN và độ tinh sạch. Sau đó sản phẩm này

được khuếch đại tiếp với các mồi và các hóa chất của bộ kit Cycle sequencing để

chuẩn bị xác định trình tự. Sau đó mẫu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI

1 2 3 4

1.5 kb

3100 Avant .

Hình 3. 9: Kết quả điện di sản phẩm PCR

1) Marker 2) Chủng T-41

3) Chủng D-42 4) Chủng TC-54

Trình tự nucleotit của đoạn gen mã hoá cho ARNr 16S được giải bằng máy

giải trình tự tự động ABI 3100 Avant của hãng Perkin-Elmer (Mỹ). Sau đó chuỗi

trình tự này được so sánh với tất cả các chuỗi nucleotit ADNr 16S đã được công bố

trên ngân hàng gen quốc tế ( http: //www.ncbi.nlm.nih.gov ) bằng chương trình

BLAST.

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAA

CGATGAACCGGTTTCGGCCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCC

CTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACTGCCGACCGCATGGT

CTGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTG

ATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGA

GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG

ATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGA

AGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT

 Chủng T-41

ACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGT

CGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACTCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGT

AGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGG

CGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT

TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGT

CCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCA

AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAG

AACCTTACCAAGGCTTGACATACATCGGAAACCTCTGGAGACAGGGGCCCCCTTGTGGTCGGTG

TACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG

CGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTTGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCC

GGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGC

ACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAA

GCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCG

CAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGA

AAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACT

GGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGATCCACCTCCTTT

AGAGTTTGATCCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGA

ACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCC

TTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACAACCACTAGGGGCATCTCT

TGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTA

ACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGA

ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAAATGGGCGAAAGCCTGAT

GCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAG

CGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG

TAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCGG

ATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGACTAGAGTGTGGTAG

GGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCG

AAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA

GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCG

GTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAA

GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAA

CCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTA

CAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG

CAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGG

GGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAC

ACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGTGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGC

 Chủng D-42

CTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCA

GATCAGCAGTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAG

TCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCGTTATGGAAGGAATGTCCAAAGTGGGACTGGC

GATTGGGACCAAATCCTAAC  Chủng TC-54

TTTAGAGTTTGATTCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTC

GAACGATGAACCGGTTTCGGCCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCT

GCCCTGCACTNTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACTGCCGACCGCA

TGGTCTGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGG

GGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGA

CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAG

CCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGA

AGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT

AATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCG

CGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTC

GGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGG

TGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAG

GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGT

TGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACT

CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGA

AGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACATCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGG

TGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG

AGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCTTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTG

CCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCT

GCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAA

AAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAAT

CGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCAC

GAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGA

CTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGC

Độ phần trăm tương đồng giữa các chủng được xác định:

AY999831.

Chủng T-41 có độ tương đồng 99% so với chủng Streptomyces antimycoticus

tương đồng 99% so với chủng Streptomyces

Chủng D-42 có độ diastatochromogenes D63867.

AB217603.

Chủng TC-54 có độ tương đồng 99% so với chủng Streptomyces hygroscopicus

3.2.6. Phân loại

Đối chiếu với khoá phân loại xạ khuẩn của ISP, chúng tôi nhận thấy chủng T-

41 có nhiều đặc điểm giống với loài S. antimycoticus và chủng D-42 cũng có nhiều

điểm giống với loài S.viridogenes. Kết quả so sánh các đặc điểm của chủng T-41 với

loài S. antimycoticus và chủng D-42 với loài S.viridogenes được trình bày ở bảng

3.6.

Bảng 3.6. So sánh đặc điểm phân loại của chủng T-41 với S. antimycoticus

Waksman 1957 và chủng D-42 với S.viridogenes Waksman 5454

Chủng D42

Đặc điểm phân loại (Theo ISP) Chủng T41 Loài chuẩn S. antimycoticus Waksman 1957

Màu KTKS Xám Xám Xám Loài chuẩn S.viridogenes Waksman 5454 Xám

Khác so với KTCC Khác so với Màu KTCS 0 0

0 0 0 KTCC 0

Xanh lá cây nhạt 0 0

S (spirales) RF(Rectusflexibilis) Hình thành melanin Sắc tố hoà tan Chuỗi bào tử Xanh lá cây nhạt RF

W Sm Sm S (spirales) W

Bề mặt bào tử

Khả năng sử dụng đường

D-glucoza ++ ++ ++ ++

L-Arabinoza ++ ++ ++ ++

D-Xyloza Maltoza + +++ + +++ ++ ++ + ++

Inositol ++ ++ ++ -

D-Mannitol Fructoza ++ +++ + +++ ++ ++ ++ ++

100

Ramnoza Raffinoza + ++ + ++ ++ ++ ++ ++

Qua bảng 3.6 và so sánh với các đặc điểm của chủng chuẩn theo ISP cho thấy

chủng T-41 có nhiều đặc điểm giống với S. antimycoticus. Chủng S. antimycoticus

này được Waksman phát hiện từ năm 1957. Như vậy, theo ISP có thể phân loại

chủng T-41 thuộc loài S. antimycoticus. Đối với chủng D-42, nhận thấy có một vài

sai khác về khả năng sử dụng đường (fructoza, inositol), như vậy chỉ có thể sơ bộ

nhận định chủng D-42 có nhiều đặc điểm giống với loài S. viridogenes, chủng này

lần đầu tiên cũng được Waksman tìm thấy với ký hiệu chủng là S. viridogenes 5454.

Bảng 3.7. So sánh đặc điểm phân loại của chủng TC-54 với chuẩn S.

hygroscopicus ISP – 5578

S. hygroscopicus Đặc điểm phân loại Chủng TC-54 subsp. limoneus

Xám đen Xám đen Màu KTKS

Vàng nhạt Vàng nhạt Màu KTCC

Chuỗi bào tử S S

Bề mặt bào tử W W

Hình thành melanin 0 0

10 – 50 10 – 50 Số bào tử trên chuỗi

Khả năng sử dụng đường

D – glucoza ++ ++

D-Xyloza - ++

Inositol + ++

D – fructoza + ++

L – ramnoza + ++

Saccaroza ++ ++

Raffinoza + -

Arabinoza + -

Manitol + ++

Natri suxinat + +

101

Gr (+), Gr (-) Gr (+), Gr (-) Hoạt tính kháng sinh chống Nấm men, nấm mốc Nấm men, nấm mốc

Sự sai khác về khả năng đồng hoá đường không thể khẳng định được rằng

chủng D-42 có thuộc loài đó. Chính vì thế chúng tôi tiếp tục nghiên cứu về trình tự

ADNr 16S của cả 3 chủng này.

Khi đối chiếu với các khoá phân loại, chúng tôi thấy rằng chủng TC-54 rất

giống với loài S. hygroscopicus. Đặc điểm đặc trưng của loài này là trên bề mặt

khuẩn lạc có các giọt nước nhỏ trong suốt (hydro=nước). Các giọt nước này lớn

dần, lan vào nhau làm cho khuẩn lạc ẩm ướt. Khi sợi già sẽ bị thuỷ phân, hệ sợi

chuyển sang màu xẫm và nát. Trong bảo tàng giống chuẩn của Nhật Bản thống kª

cã đến 20 loài phụ thuộc S. hygroscopicus. Đa số các loài phụ của loài này mang tên

các chất kháng sinh khác nhau do chúng sinh ra. Đã có rất nhiều chất kháng sinh

chống nấm do loài này sinh ra.

Qua so sánh các đặc điểm phân loại giữa chủng TC-54 và chủng chuẩn S.

hygroscopicus nhận thấy: chủng TC-54 có nhiều đặc điểm giống S. hygroscopicus

về hình thái cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử, khả năng hình thành sắc tố melanin,

khả năng sử dụng đường.

Tuy nhiên, có một vài sai khác về khả năng đồng hoá đường (bảng 3.7). Như

vậy, có thể phân loại chủng TC-54 thuộc vào loài S. hygroscopicus và chủng này có

tên gọi là S. hygroscopicus TC-54.

Việc phân loại chính xác cần phải xác định thêm một số đặc tính khác nữa như

phân tích trình tự ADNr 16S, lai ADN-ADN, và xây dựng cây phát sinh chủng loại.

Dựa vào kết quả dải trình tự ADNr 16S, vào phần mềm CLUSTAL 1.83 và vào các

trình tự đã có sẵn thuộc chi Streptomyces trong ngân hàng gen (GeneBank), chúng

tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại (Hình 3.10).

Nhìn vào cây phát sinh chủng loại, có thể thấy chủng T-41 rất gần gũi với

chủng Streptomyces antimycoticus AY99983 với độ tương đồng 99.9%. Hơn nữa,

dựa vào các đặc điểm truyền thống đã được nghiên cứu ở trên, chủng này được xác

định là S. antimycoticus và ký hiệu là S. antimycoticus T41. Chủng này lần đầu

102

tiên được Waksman phát hiện vào năm 1957.[113].

PHYLIP_1

Streptomyces thermovulgaris Z68098

100

Streptomyces griseus AB045867 Streptomyces violascens AY999737

Streptomyces sannurensis AY331685

Streptomyces kasugaensis AY99920 Streptomyces morookaensis AJ781349

Streptomyces kashimirensis AJ781337

Streptomyces griseoverticillat AY999892

Streptomyces sapporonensis AJ781378

98 100

D42

Streptomyces diastatochromogenes D63867

Streptomyces bottropensis AF397892

Streptomyces europaeiscabiei AY207595

100

Streptomyces scabiei AB026211

100

Streptomyces roseolilacinus AY999879 Streptomyces somaliensis AJ007401 Streptomyces lavendofoliae AJ781336 Streptomyces gobitricini AJ781335

Streptomyces platensis AB045882

Streptomyces daliensis AY785161

Streptomyces sclerotialus AJ621608

84 54

Streptomyces rimosus AB045883 Streptomyces erumpens AJ621603

Streptomyces yatensis AF336800 Streptomyces rutgersensis AY508511

100 75

100

Streptomyces viridogennes TC54 Streptomyces hygroscopicus AB217603 Streptomyces violaceusniger AJ391823 Streptomyces sporocinereus AJ781368

100

Streptomyces endus AY999 Streptomyces antimycoticus AY999831

0.01

AAYAY999831 T41

Hình 3.10. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 16S, thể hiện mối quan hệ giữa 3 chủng xạ khuẩn T-41, D-42, TC-54 và các đại diện có quan hệ gần gũi thuộc chi Streptomyces.

Riêng đối với chủng D-42, dựa vào việc phân tích trình tự ADNr 16S thì thấy:

chủng này giống với chủng Streptomyces diastatochromogenes D63867 nhưng khi

phân tích các đặc điểm truyền thống thì chủng D-42 lại có nhiều đặc điểm giống với

chủng S.viridogenes tuy chỉ khác về khả năng đồng hoá đường. Điều này càng

103

chứng tỏ tầm quan trọng của việc phân tích trình tự ADNr 16S, vì chỉ dựa vào các

đặc điểm sinh lý sinh hoá thôi, chúng ta chưa thể khẳng định được chính xác tên

của loài đó. Nhờ vào kết quả phân tích này chúng tôi so sánh ngược trở lại giữa

chủng D-42 và S.diastatochromogenes cho thấy có các đặc điểm giống và khác

nhau như sau: [ 36,113]

Giống nhau: cả 2 chủng này đều thuộc nhóm xám (Gr), bề mặt bào tử nhẵn

(sm), cuống sinh bào tử dạng xoắn, đều có khả năng sử dụng các loại đường giống

nhau và đều có khả năng chống nấm tốt.

Khác nhau: chủng D-42 có hình thành sắc tố hòa tan, còn chủng

S.diastatochromogenes thì không hình thành, chủng D-42 không hình thành sắc tố

melanin khi nuôi cấy trên môi trường ISP 6 còn chủng S.diastatochromogenes lại

hình thành melanin. Sự khác nhau về khả năng hình thành sắc tố và sự tạo melanin

có thể do tác động của nhiều yếu tố khác nhau, tuy nhiên ở đây chúng tôi chưa thể

khẳng định được là do nguyên nhân cụ thể nào, nhưng nằm trong phạm vi biến dị

loài.

Các nghiên cứu trên thế giới về loài Streptomyces diastatochromogenes cho

thấy chủng này có khả năng sinh CKS oligomyxin. Oligomyxin là CKS thuộc nhóm

macrolit có khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng rất tốt. Chất này đã được

một số hãng sản xuất lớn trên thế rất quan tâm. Chủng xạ khuẩn này lần đầu tiên đã

được Krainsky phát hiện từ những năm 1914, sau đó đến năm 1948 được Waksman

và Henrici phân loại lại. Như vậy, dựa vào tất cả các đặc điểm về hình thái, sinh lý

sinh hóa và đắc điểm về sinh học phân tử, có thể phân loại chủng D-42 thuộc loài

Streptomyces diastatochromogenes. Dựa vào cả đặc điểm sinh lý sinh hoá và phân

tích trình tự ADNr 16S thì chủng TC-54 có độ tương đồng với chủng Streptomyces

hygroscopicus là 100%. Như vậy chủng này được định danh là S. hygroscopicus

TC-54. Theo bộ sưu tập của Bảo tàng giống Nhật Bản (JCM) thì Streptomyces

hygroscopicus có tới 20 dưới loài khác nhau và tổng hợp được khoảng hơn 20 các

chất kháng sinh khác nhau. Do diều kiện chưa cho phép nên chúng tôi vẫn chưa

phân loại được dưới loài của chủng này. Các chất kháng sinh do Streptomyces

104

hygroscopicus sinh ra bao gồm: abomyxin, angustmyxin, ascomyxin, decoyinin,

psicofuranin, nigerixin, geldanamyxin, scopafungin, glebomyxin, hialomyxin A, B,

endomyxin A, B, helixin A, B, tylosin, minimyxin, hygromyxin, vulgamyxin,

validamyxin, ossamyxin. [36].

3.3. KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CKS CỦA 3 CHỦNG XẠ KHUẨN ĐÃ LỰA CHỌN

3.3.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp

Trong công nghệ kháng sinh, môi trường đóng vai trò quan trọng hàng đầu.

Một môi trường lên men tốt phải là môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh trưởng

tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao. Ở đây chúng tôi dùng 5 loại môi trường lên

men cơ sở là A- 4, A- 4H, A- 9, A-12 và Gauze I [125]. Quá trình lên men được tiến

hành trong bình nón dung tích 500ml chứa 100ml môi trường. Nuôi lắc 200 vòng/

phút ở 28-300C. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Sau 120 giờ lên men, xác định hoạt tính

kháng sinh với vi sinh vật kiểm định là F. oxysporum. Kết quả được trình bày ở

bảng 3.8.

 Chủng T-41

Trên 5 loại môi trường lên men, chủng T-41 chỉ có hoạt tính kháng vi sinh vật

kiểm định trên 4 môi trường A-4, A-4H, A-12 và Gauze I. Song chỉ trên môi trường

A-12 chủng T-41 cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất (20mm).

Với mục đích chọn môi trường sản xuất CKS chống nấm thì môi trường A-12

thích hợp hơn cả với chủng T-41. Tuy nhiên, khi so sánh khả năng hình thành CKS

trên môi trường rắn với môi trường dịch thể A-12 chúng tôi nhận thấy hoạt tính

kháng sinh trên môi trưởng rắn mạnh hơn rất nhiều (44mm) so với môi trường dịch

thể A-12. Trên cơ sở đó chúng tôi tìm hiểu khả năng hình thành CKS của chủng T-

41 trên môi trường xốp, đồng thời sử dụng môi trường A-12 cho những nghiên cứu

tiếp theo.

 Chủng D-42

Từ kết quả ở bảng 3.8 ta thấy CKS của chủng D-42 được tích luỹ nội bào rất

105

lớn trừ môi trường Gauze I. Hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men của môi

trường A - 9 là lớn nhất. Tuy nhiên, lượng sinh khối được tạo ra trong môi trường

này lại không đáng kể. Bên cạnh đó môi trường A-12 cho lượng sinh khối rất lớn

16,5 g/L mà lượng kháng sinh trong dịch lọc của A-12 chỉ yếu hơn môi trường A-

9. Mặt khác lượng kháng sinh tích luỹ trong sinh khối của môi trường này cũng lớn

hơn cả, dung môi dùng để chiết CKS từ sinh khối sử dụng etanol là tốt nhất. Điều

chúng tôi quan tâm ở đây là lựa chọn ra một môi trường lên men thích hợp cho

chủng D-42 làm sao có hiệu suất kháng sinh là cao nhất.

Bảng 3.8. Hoạt tính kháng F. oxysporum của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu

trên các môi trường lên men khác nhau

Môi trường pH Sinh khối Chủng xạ khuẩn Hoạt tính kháng sinh

(D-d, mm) sau lên men (mg/ml)

A-4 6.87±0,15 10,33±1,53 6.1

A-4H 6,4±0,1 12,33±0,58 7.2 T-4.1 A-9 1,93±0,15 0,67±0,58 7.0

A-12 7,63±0,15 22,00±2,0 6.7

Gauze1 6,7±0,2 15,67±1,53 6.3

A-4 9,2±0,36 21,0±2,65 6.54

A-4H 13,57±1,25 16,67±2,52 7.69 D -42 A-9 12,2±0,53 32,67±2,52 8.1

A-12 16,8±0,26 21,00±1,0 7.27

Gauze1 2,4±1,35 13,67±1,53 6.84

A-4 13,96±0,62 34,33±2,08 8.5

A-4H 16,53±0,57 28,33±1,53 8

TC 5-4 A-9 9,43±0,31 19,67±1,53 4

A-12 18,58±0,59 22,33±1,53 4

6 Gauze1 8,0±0,46 23,00±2,0

106

Các giá trị sau ± là giá trị SD với n=3.

Như vậy trong 6 loại môi trường cơ bản, môi trường A-12 là môi trường thích

hợp hơn cả cho sự sản sinh CKS của chủng này. Đây là môi trường giầu dinh dưỡng

với nguồn cacbon là tinh bột tan và rỉ đường, nguồn nitơ là bột đậu tương. Có thể ,

rỉ đường và đậu tương, ngoài cacbon và nitơ còn cung cấp một số tác nhân nào đó

cần thiết cho sinh trưởng và tổng hợp CKS của chủng D-42.

 Chủng TC-54

Với chủng TC-54, môi trường A-12 cho lượng sinh khối lớn nhất do môi

trường rất giàu dinh dưỡng (tinh bột tan, rỉ đường, bột đậu tương) song lại không

cho hoạt tính kháng sinh cao nhất. Bên cạnh đó, với môi trường A-4H, lượng sinh

khối tạo thành khá cao 16,7 mg/ml và hoạt tính kháng nấm chỉ sau môi trường A-4.

Điều quan tâm ở đây là cần lựa chọn môi trường lên men sao cho hiệu suất kháng

sinh cao nhất. Như vậy, trong 5 loại môi trường thí nghiệm có thể chọn môi trường

A-4 là môi trường thích hợp cho quá trình tổng hợp CKS và được sử dụng cho các

nghiên cứu tiếp theo.

3.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành CKS của 3 chủng T-41, D-42 và TC-54

3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ.

Chủng T-41 và D-42 được lên men lắc 220 vòng/ phút trên môi trường A-12,

chủng TC-54 được lắc trên môi trường A-4 ở các nhiệt độ và pH ban đầu khác

nhau. Sau 120 giờ lấy ra xác định hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định là

F. oxysporum. Kết quả trình bày ở bảng 3.9.

Như vậy, cả 3 chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh trưởng trong dải pH từ 5

đến 9, tuy nhiên kết quả ở bảng 3.9 cho thấy pH 7 là thích hợp nhất với sinh trưởng.

Chủng T-41 sinh kháng sinh mạnh ở pH 7-8, chủng D-42 ở pH 7 còn chủng TC-54

ở pH 6-8. Cả ba chủng đều có khả năng sinh trưởng và cho hoạt tính kháng sinh

107

mạnh nhất ở 300C, pH trung tính hoặc hơi kiềm

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sinh trưởng và tổng hợp CKS

của các chủng T-41, D-42 và TC-54

pH ban đầu

Ký hiệu

Các chỉ tiêu

chủng

5

7

8

9

6 T-41

5,27±0,21

6,07±0,31

6,77±0,15

7,27±0,21

8,17±0,31

pH sau lên

men

D-42

5,32±0,07

6,81±0,1

7,22±0,09

8,23±0,15

8,55±0,23

TC-54

5,13±0,15

6,88±0,1

8,21±0,09

8,33±0,12

8,82±0,08

6,27±0,21

T-41

5,67±0,15

6,57±0,21

7,87±0,06

7,37±0,15

Sinh khối (g/l)

D-42

6,6±0,1

8,53±0,31

14,85±0,78 12,57±0,21 7,27±0,21

TC-54

6,22±0,11

7,57±0,22

10,43±0,76 9,48±0,29

5,65±0,17

Hoạt tính

T-41

9,67±1,53

15,0±1,0

19,67±2,08 16,33±1,53 13,0±2,0

kháng sinh

D-42

12,33±2,52 13,67±1,53 30,33±1,53 20,33±1,53 14,67±0,58

(D-d, mm)

19,33±1,53

23,0±1,0

31,67±3,06 25,33±1,53 21,0±1,53

TC-54

Các giá trị sau ± là giá trị SD với n=3.

Sau đó các chủng này tiếp tục được nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ lên

men tới khả năng hình thành chất kháng sinh. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10.

Nhiệt độ lên men cũng là một trong các điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và hình thành chất kháng sinh của vi sinh vật. Chúng tôi tiến hành lên men ở

các nhiệt độ 25, 30, 35 và 450C. Các kết quả cho thấy: cả 3 chủng đều sinh trưởng

và cho hoạt tính kháng sinh cao ở nhiệt độ 25-350C. Ở 450C khả năng sinh kháng

sinh của cả ba chủng xạ khuẩn đều giảm hẳn. Như vậy các kết quả cho thấy nhiệt độ

sinh trưởng tối thích của ba chủng là 25-35C phù hợp với nhiệt độ tối thích của đa

108

số xạ khuẩn.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành chất kháng sinh của 3 chủng xạ khuẩn (Vi sinh vật kiểm định F. oxysporum)

Các chỉ tiêu Nhiệt độ ban đầu(0C)

Ký hiệu chủng

25 30 35 45

T-41 KXĐ KXĐ KXĐ -

pH sau lên men D-42 KXĐ KXĐ KXĐ -

TC-54 6,8 7,6 6,8 6,5

T-41 7,6±0,31 8,0±0,26 6,97±0,2 4,33±0,33

Sinh khối (g/l) D-42 10,17±0,5 13,57±0,47 7,6±0,44 4,6±0,5

TC-54 8,79±0,38 10,57±0,21 8,2±0,36 4,2±0,36

T-41 17,67±0,58 20,33±1,53 15,33±0,58 9,33±0,58

D-42 22,33±0,58 30,0±1,73 20,2±0,36 10,2±0,36 Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm)

TC-54 21,0±1,0 31,0±1,0 17,67±0,58 12,67±0,58

Các giá trị sau ± là giá trị SD với n=3.

3.3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất

Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Tinh bột tan, glucoza, lactoza, sacaroza và rỉ đường sử dụng để xác định mức

độ ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và hình thành CKS của

các chủng đã tuyển chọn.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.11 cho thấy cả 3 chủng có khả năng sử dụng

nhiều loại đường khác nhau. Tuy nhiên, glucoza, lactoza và rỉ đường là 3 loại

đường thích hợp hơn cả, làm tăng khả năng tích luỹ sinh khối và sinh tổng hợp CKS

109

của 3 chủng này. Lượng sinh khối được tạo thành trong môi trường chứa tinh bột

tan là cao nhất nhưng lại không cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong khi đó, trên

môi trường chứa lactoza và rỉ đường, lượng sinh khối thu được ít hơn so với các

nguồn cacbon khác nhưng lại cho hoạt tính kháng sinh cao hơn. Điều này chứng tỏ

trong rỉ đường, ngoài đường còn có một số chất hữu cơ khác cũng có ảnh hưởng tới

quá trình tổng hợp CKS của chủng này.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC- 54

Nguồn cacbon

Glucoza

Các chỉ tiêu

Ký hiệu chủng

Tinh bột tan (1%)

Tinh bột tan (2%)

Lactoza (1%)

Sacaroza (1%)

Rỉ đường (10ml/l)

(1%)

T-41

5,9

6,7

7,1

6,9

5,7

6,2

D-42

7,5

7,45

7,4 8

7,18

7,27

7,62

pH sau lên men

TC-54

7,5

7,1

7,5

7,8

7,9

T-41

16,33±0,45

15,0±0,3

16,67±0,15 12,27±0,97

7,93±0,25

10,53±0,12

D-42

18,0±0,44

15,93±0,42

15,53±0,74 10,07±0,32

8,67±0,21

12,37±0,31

Sinh khối (g/l)

TC-54

21,33±1,53

18,63±0,55

20,5±0,5

13,57±0,55

11,6±0,6

13,3±0,3

T-41

21,0±1,0

16,33±0,58

21,67±0,58 17,33±0,58 13,67±0,58

15,5±0,5

D-42

17,17±0,29

15,43±0,4

10,0±0,0

8,33±0,58

19,67±0,58

23,0±1,0

Hoạt tính kháng sinh (D- d,mm)

TC-54

20,33±0,58

16,33±0,58

30,67±0,58 28,33±0,58 18,33±0,58 25,33±0,58

Vi sinh vật kiểm định F. oxysporum. Các giá trị sau ± là giá trị SD với n=3.

Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Umezawa khi nghiên cứu sinh tổng

hợp kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn [50,58].

Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng trong lên men công nghiệp là cao

ngô, cao nấm men và bột đậu tương còn nguồn nitơ vô cơ hay được sử dụng là

110

sunfat amon, clorua amon và nitrat amon.

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và TC-54 (Vi sinh vật kiểm định F. oxysporum)

Sinh khối (g/l)

Hoạt tính kháng sinh (D-d,mm)

Nguồn

%

nitơ

T-41

D-42

TC-54

T-41

D-42

TC-54

Bột đậu

24,5±0,5

10,8±0,36

10,87±0,15 16,57±0,51 25,33±0,58

tương

Bột đậu

14,5±0,5

22,67±0,58 17,67±0,58

9,63±0,15

11,6±0,1

9,7±0,15

tương

Cao nấm

17,0±0,0

1 13,6±0,26 13,57±0,15 12,28±0,23 12,33±0,58 28,33±0,58

men

21,33±0,58

12,0±0,58

14,33±0,58

Pepton

14,13±0,4 13,13±0,26

7,73±0,15

10,67±0,58 18,67±0,58 12,33±0,58

0,1

NH4Cl

7,9±0,26

6,07±0,29

6,77±0,15

9,0±0,58

12,33±0,58 15,33±0,58

(NH4)2SO4 0,2

7,63±0,5

8,0±0,26

7,9±0,15

14,5±0,5

15,5±0,5

10,33±0,58

KNO3

0,1 7,17±0,31

7,17±0,25

5,23±0,4

Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh tổng hợp CKS của các chủng nghiên cứu

trình bày ở bảng 3.12 đã khẳng định ưu thế của bột đậu tương lên khả năng sinh

tổng hợp CKS của chủng T-41 và TC-54. Điều này có thể do khi dùng bột đậu

tương không những chứa 40% protein mà còn chứa một số chất khác cần cho sinh

tổng hợp CKS.

Đối với chủng D-42, hoạt tính kháng sinh đạt mạnh nhất trên nguồn nitơ là cao

nấm men, tiếp đó là bột đậu tương. Lượng bột đậu tương thích hợp cho lên men của

chủng này là 1%.

3.3.3. Động học của quá trình lên men của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã lựa chọn môi trường lên men

tối ưu cho các chủng xạ khuẩn. Xạ khuẩn được lên men trong các bình tam giác

250ml chứa môi trường lên men thích hợp. Cứ sau 24 giờ thì lấy 1 bình đem lọc

tách sinh khối và dịch lên men. Sau đó đo pH dịch lên men và xác định khối lượng

111

sinh khối sau khi đã sấy khô tuyệt đối.

Hình.3.11. Động thái quá trình lên men CKS của 3 chủng T-41, D-42, TC-54.

112

Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3

Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của các chủng T-41, D-42 và

TC-54 trong môi trường lên men đã chọn được biểu hiện ở hình 3.11.

Với chủng T-41, tốc độ sinh tổng hợp kháng sinh mạnh sau 72 giờ và tăng dần

theo thời gian và đạt cực đại sau 120 giờ sau đó giảm dần. Lượng sinh khối lớn nhất

đồng thời hoạt tính kháng sinh tích luỹ cũng đạt cực đại.

Hoạt tính kháng sinh của chủng D-42 bắt đầu xuất hiện sau 24 giờ lên men rồi

tăng dần và đạt cực đại sau 96 giờ (đạt 32 mm). Sau 120 giờ, hoạt tính kháng sinh

giảm mạnh. Lượng sinh khối tăng dần cùng với thời gian và đạt trạng thái cực đại

sau 96 giờ nuôi (pha cân bằng). Sau thời điểm này lượng sinh khối giảm nhanh (pha

suy vong). Qua đồ thị ta cũng thấy hoạt tính kháng sinh trong lên men có quan hệ

với tốc độ sinh trưởng của xạ khuẩn trong môi trường. Hoạt tính kháng sinh và sinh

khối đạt cực đại ở cuối pha cân bằng. pH môi trường giảm mạnh sau 24 giờ nuôi

sau đó tăng dần cho tới khi kết thúc quá trình lên men.

Đối với chủng TC-54 tốc độ sinh tổng hợp kháng sinh mạnh dần sau 24 giờ

lên men, lượng sinh khối tăng dần theo thời gian và đạt cực đại ở 120 giờ, sau đó

sinh khối giảm hẳn do tự phân.

Từ những kết quả trên, nhận thấy sinh trưởng trong quá trình lên men là đặc

điểm của từng chủng và có liên quan đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh

của chúng. Nhìn chung, hoạt tính kháng sinh bắt đầu tăng dần sau 24 giờ lên men.

Sau 120 giờ, sự tích luỹ CKS và sinh khối giảm mạnh. Điều này liên quan chặt chẽ

đến sự hình thành các axit hữu cơ trong môi trường lên men và sự sinh trưởng của

xạ khuẩn.

3.3.4. Tối ưu hoá môi trường lên men chủng TC-54 – Phương pháp Box- Willson

Từ kết quả lựa chọn được môi trường lên men cơ sở thích hợp (môi trường

A4), chúng tôi tiến hành thí nghiệm tối ưu hoá theo phương pháp cuả Box- Willson.

113

Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 3.13.

Bảng 3.13. Tối ưu hoá môi trường theo phương pháp Box- Willson

(Vi sinh kiểm định F . oxysporum)

Lượng môi trường (ml) Glucoza (g/l) Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) Bột đậu tương (g/l)

+13 +13 +100 311

-7 +13 +100 331

+13 -7 +100 25,331,15

-7 -7 +100 26,330,58

+13 +13 -50 28,670,58

-7 +13 -50 30,670,58

+13 -7 -50 270

-7 -7 -50 24,671,53

Sở dĩ chúng tôi chỉ chọn 1 chủng xạ khuẩn TC-54 vì chủng này có nhiều đặc

tính ưu việt hơn so với 2 chủng còn lại và do vậy cần nghiên cứu sâu hơn về khả

năng hình thành CKS cũng như cần tiến hành lên men trên nồi lên men lớn. Trong

quá trình sinh trưởng thì nhu cầu về carbon và nitơ là quan trọng nhất, ngoài ra còn

có nguồn khoáng, các nhân tố sinh trưởng khác. Vì vậy, chúng tôi đã chọn 3 biến là

lượng bột đậu tương và lượng glucoza và thể tích môi trường để xem hàm lượng

nào là thích hợp.

Theo phương pháp của Box – Willson [2], cần phải xác định được các trị số

của hàm mục tiêu ở mỗi thí nghiệm và kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số, chọn hệ

số nào có trị số tuyệt đối lớn nhất và chọn cho biến đó một bước thay đổi phù hợp.

Ở đây trong 3 yếu tố trên, sự thay đổi về hàm lượng glucoza trong môi trường có

ảnh hưởng lớn nhất tối hiệu suất tổng hợp kháng sinh của chủng TC-54. Do đó,

chúng tôi tiến hành tiếp thí nghiệm môi trường tối ưu “lên dốc” bằng cách chỉ thay

đổi hàm lượng glucoza, còn các thành phần khác vẫn giữ nguyên như trong môi

trường cơ bản A-4. Mức tối thiểu về lượng glucoza là 10 g/l và mỗi “bước nhảy” sẽ

114

tăng thêm 1,5g/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.14.

Bảng 3.14. Môi trường tối ưu “lên dốc” của chủng TC-54

Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) STT Glucoza (g/l) B. subtilis

Bột đậu tương (g/l)

F. oxysporum Chiết Chiết trong trong butanol axeton Chiết trong axeton Chiết trong butanol

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 11,5 13 14,5 16 17,5 19 20,5 22 23,5 Lượng môi trường trong một bình (ml) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 27 27 28 26 28 30 30 32 35 32 21 19 18 20 19 20 20 18 25 20 18 18 25 22 22 23 21 23 24 19 18 18 18 18 20 20 21 21 21 20

Kết quả bảng 3.14 cho thấy, khi hàm lượng glucoza thay đổi thì hoạt tính

kháng sinh cũng thay đổi theo. Tuy nhiên, sự thay đổi này không nhiều so với mỗi

mức chênh lệch về hàm lượng glucoza. Ở các thí nghiệm từ 1 đến 9 cho thấy, hoạt

tính kháng sinh kháng F. oxysporum tăng khi tăng lượng glucoza, nhưng đến thí

nghiệm thứ 10 thì lượng glucoza tăng nhưng hoạt tính kháng sinh giảm đi. Điều đó

chứng tỏ, tới một mức nào đó khi dư thừa glucoza sẽ kìm hãm quá trình tổng hợp

CKS của chủng TC-54.

Bằng cách này đã lựa chọn được môi trường tối ưu cho quá trình lên men CKS

của chủng TC-54 như sau: (g/L)

Glucoza 22 NaCl 5 (NH4)2SO4 2

Bột đậu tương 10 pH 7 CaCO3 1

Sau khi đã lựa chọn được các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men,

chủng TC-54 được tiến hành lên men trong nồi lên men 80L. Sau đó, các thông số

115

về lên men được nghiên cứu. Sự sinh trưởng trong quá trình lên men mang đặc tính

của từng chủng và có liên quan đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chúng.

Kết quả cho thấy tốc độ sinh tổng hợp kháng sinh mạnh dần sau 24 giờ nuôi.

Bảng 3.15. Các thông số lên men chủng TC-54 trong nồi lên men 80 lít

Thời gian lên men (giờ) Thông số lên men 0 24 48 72 96 120 144

Sinh khối (g/l) 0,1 5,7 8,6 11,5 13,8 14,7 11,2

pH môi trường sau lên men 7 6,8 7,2 7,5 7,6 8,2 8,7

Hoạt tính kháng sinh (đv/ml) - 12 90 320 950 1020 970

10 1,8 0,61 0,5 0,28 0,25 0,24 Đường khử (mg/ml)

Trong quá trình lên men pH dịch nuôi giảm sau 24 giờ và tăng dần lên cho đến

khi kết thúc lên men. Tuy nhiên, sự tích luỹ CKS giảm sau 120 giờ. Điều này liên

quan chặt chẽ đến sự hình thành các axit hữu cơ trong môi trường và sự sinh trưởng

của xạ khuẩn. Lượng sinh khối cũng tăng dần cùng với thời gian và đạt cực đại ở

120 giờ sau đó sinh khối giảm hẳn do phân đoạn và tự phân. Cả sinh khối và hoạt

tính kháng sinh tích đều đạt cực đại, 1020 đơn vị/ ml ở thời điểm này. Hàm lượng

đường trong môi trường lên men giảm mạnh ngay từ những giờ đầu lên men. Sau

24 giờ, nồng độ đường chỉ còn 15% và sau 48 giờ là dưới 10% và tiếp tục giảm theo

thời gian. Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được ly tâm và tách chiết dùng

cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.5. Lên men xốp chủng T-41

Sở dĩ chúng tôi chọn hướng lên men xốp cho chủng T-41 là vì trong quá trình

nghiên cứu, CKS của chủng T-41 thường tích luỹ trong sinh khối hơn là trong dịch

nuôi. Việc lên men xốp vừa rẻ tiền, vừa cho lượng sinh khối cao đồng thời với mục

tiêu sử dụng cho cây trồng nên điều kiện vô trùng không đòi hỏi tuyệt đối. Sau 7

ngày nuôi cấy chủng T-41 bắt đầu cho hoạt tính kháng sinh và đạt hoạt tính kháng

116

sinh mạnh nhất vào ngày thứ 12, sau đó hoạt tính giảm dần. Hoạt tính kháng sinh

khi nuôi trên môi trường gạo có chứa dịch khoáng là cao nhất. Sau đó là đến môi

trường có bổ sung bột gạo, bột trấu, bột đậu tương.

Hình 3.12. Hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 trên môi trường lên

men xốp. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3. (Vi sinh vật kiểm định

F.oxysporum).

3.4. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CKS TC-54

3.4.1. Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ

Chúng tôi đã sử dụng 8 loại dung môi để chiết rút CKS, kết quả ở bảng 3.16

cho thấy cả 8 loại dung môi đều có thể dùng để chiết CKS TC-54.

Với chủng T-41, nếu chiết từ sinh khối thì etanol cho kết quả cao nhất, còn

nếu chiết từ dịch lọc thì n-butanol cho hiệu suất cao hơn cả.

Kết quả ở bảng 3.16 cho thấy kháng sinh từ chủng TC-54 nằm cả trong sinh

khối và dịch lọc nhưng trong sinh khối nhiều hơn. Chiết CKS từ sinh khối bằng

metanol cho hoạt lực mạnh nhất. Tuy nhiên, do etanol cho kết quả chỉ sau metanol

nên để thuận lợi và kinh tế, chúng tôi dùng etanol. Hoạt tính kháng sinh ở dịch lọc

kém hơn, việc chiết bằng n- propanol hay n- butanol cho hoạt tính mạnh hơn các

dung môi còn lại. Từ kết quả trên chúng tôi đã chọn được dung môi thích hợp cho

mỗi chủng T-41 và D-42, TC-54. Các chủng này được nuôi lắc 220 vòng/ phút

117

trong 5 ngày, dịch nuôi được lọc để thu dịch lọc và sinh khối.

Bảng 3.16. Hoạt tính kháng sinh được chiết bằng các loại dung môi khác nhau

Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm)

(VSV kiểm định F.oxysporum Nguồn chiết Dung môi

T-41 D-42 TC 5-4

n- butanol 17,00±1,0 22,00±2,0 23,33±0,58

Etyl - axetat 12,00±2,0 21,00±2,0 20,00±1,0 Dịch lọc Iso - butanol 15,033±0,58 19,67±2,08 22,33±1,53

n- propanol 13,33±1,53 19,00±1,0 23,67±0,58

Iso - popanol 8,00±1,0 17,67±2,08 41,00±1,00

Sinh khối

21,67±1,53 37,33±2,52 42,33±0,58 Etanol

Metanol 11,33±1,53 34,67±1,53 51,00±1,0

Axeton 20,00±2,0 39,00±1,0 25,33±1,53

Etyl - axetat 14,67±0,58 25,33±1,53 19,00±1,00

Tiến hành tách kháng sinh bằng các dung môi thích hợp ở các pH 3, pH 7 và

pH 10, kết quả được thể hiện ở hình 3.13.

Hình 3.13. Hoạt tính kháng sinh của 3 chủng nghiên cứu chiết ở các pH

118

khác nhau. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3.

Chủng D-42, nhận thấy ở tất cả các dung môi lượng kháng sinh thu được từ

sinh khối cao hơn nhiều so với từ dịch lọc. Đây là một lợi thế trong lên men của

chủng D-42 bởi lượng sinh khối trong lên men rất cao ở môi trường A-12 (16,5g/l).

Dung môi chiết tốt nhất là etanol (40 mm). Trong dịch lọc, etyl-axetat là dung môi

chiết thích hợp.

Hình 3.13 cho thấy đối với chủng T-41 ở pH 3 thuận lợi cho việc tách chiết

CKS từ sinh khối. Còn đối với chủng D-42 thì ở pH 7 khả năng hòa tan CKS là lớn

nhất. Chủng TC-54, ở pH 7, CKS trong dịch lọc và sinh khối đều có hoạt tính kém

hơn hẳn pH 3 và pH 10. Tuy nhiên ở pH 3 cho hoạt tính cao hơn pH 10 đôi chút. Vì

thế chúng tôi chọn pH 3 cho các lần tách chiết sau.

3.4.2. Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh

Khả năng bền với nhiệt độ của CKS T-4l, D-42 và TC-54 được thể hiện ở hình 3.14.

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng sinh của 3 chủng

xạ khuẩn. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3.

119

(VSV kiểm định F.oxysporum)

Hoạt tính kháng sinh của chủng T- 4l và D-42 hầu như không thay đổi ngay

cả ở 1000C thời gian kéo dài 60 phút. Do đó việc tách chiết sử dụng và bảo quản

CKS hầu như không gặp trở ngại gì về điều kiện nhiệt độ. Điều này cho thấy đây là

những CKS chịu nhiệt và rất thuận lợi cho việc tách chiết chúng trong nghiên cứu.

Chủng TC-54 ở 30-400C, hoạt tính kháng sinh khá mạnh, dung dịch kháng sinh khi

giữ ở 700C 60 phút hoạt tính vẫn hầu như không thay đổi. Ở 1000C và kéo dài tới

60 phút vẫn còn hoạt tính kháng sinh khoảng 50%. Do đó, việc tách chiết, sử dụng

và bảo quản CKS phải ở nhiệt độ không quá 600C để đảm bảo hoạt lực của kháng

sinh.

3.4.3. Xác định Rf của chất kháng sinh

CKS T-41 được hoà tan vào axeton và chấm lên bảng giấy sắc ký Whatman số

1, chạy trong các hệ dung môi. Xác định Rf bằng phương pháp hiện hình sinh học

với vi sinh vật kiểm định là F.oxysporum. Kết quả thí nghiệm xác định được Rf

trong các hệ dung môi là:

Hệ dung môi: n-butanol: H20 ( 84: 16 ) có Rf = 0.73

Hệ dung môi: n-butanol: a.axetic: H20 ( 1: 2: 1 ) có Rf = 0.89

Hệ dung môi: metanol : axit axetic : H20 (2 : 1 : 1) có Rf=0,67

CKS thô của chủng D-42 được hoà tan vào trong etylaxetat và chấm lên băng

giấy sắc ký Whatman No1 (kích thước 2x20 cm). Sau đó chạy trên 3 hệ dung môi n

- butanol: axit axetic: H20 (1 : 2 : 1); n - butanol : H20 (86:14); metanol : axit axetic:

H20 (2 : 1 : 1). Khi dung môi đã chạy đến điểm dừng bỏ giấy sắc ký ra khỏi hệ dung

môi, để khô tự nhiên. Sau đó xác định Rf bằng phương pháp hiện hình sinh học với

VSV kiểm định là F.oxysporum.

Kết quả ở bảng 3.17 cho thấy trong mỗi hệ dung môi ta sẽ thu được một hệ số

Rf, tuỳ khả năng hoà tan của CKS D-42 và lực kéo của hệ dung môi mà Rf có thể

lớn hay nhỏ. Tương tự, CKS TC-54 thô được hoà tan trong axeton và chấm lên

băng giấy sắc ký Whatman, chạy trong trên 3 hệ dung môi n - butanol: axit axetic:

H20 (1 : 2 : 1); n - butanol : H20 (86:14); metanol : axit axetic: H20 (2 : 1 : 1). Xác

120

định Rf hiện bằng phương pháp hiện hình sinh học dùng B. subtilis và F. oxysporum

Kết quả thí nghiệm xác định được Rf trong n - butanol: axit axetic: H20 (2 : 1: 1) là

0,45~0,77, còn trong hệ n - butanol: H20 (84 : 16) là 0,5; metanol: axeton: H20 (16 :

6 : 75) là 0,65. Kết quả sắc ký cho thấy đối với CKS TC-54, khi khai triển trong hệ

dung môi n - butanol: axit axetic: H20 (2 : 1: 1) có hệ số Rf từ 0,45~0,77. Ở đây

xuất hiện nhiều vệt sắc ký nên chúng tôi tiến hành phân lập TC-54 bằng các

phương pháp tiếp theo được trình bày dưới đây.

Bảng 3.17. Hệ số Rf của CKS T-41, D-42, TC-54

trên các hệ dung môi khác nhau

Chất kháng sinh Hệ dung môi Rf

0.73 n-butanol: H20 ( 84: 16 )

0.89 T-41 n-butanol: a.axetic: H20( 1: 2: 1 )

0,67 metanol : axit axetic : H20 (2 : 1 : 1)

0,81 n - butanol: axit axetic: H20 (2 : 1: 1)

0,78 D-42 n - butanol: H20 (84 : 16)

0,11 metanol: axeton: H20 (16 : 6 : 75)

0,45~ 0,77 n - butanol: axit axetic: H20 (2 : 1: 1)

0,5 TC-54 n - butanol: H20 (84 : 16)

0,65 metanol: axeton: H20 (16 : 6 : 75)

3.4.4. Tách chiết CKS TC-54 bằng chất hấp phụ

Dịch nuôi cấy chủng TC-54 sau khi loại bỏ sinh khối, chỉnh pH về 3, 7 và 10

rồi thêm 2% than hoạt tính. Sau đó tiến hành giải hấp phụ bằng cách lắc 2 giờ trong

axeton.

Kết quả thể hiện trên hình 3.15 cho thấy than hoạt tính có thể hấp phụ rất

mạnh CKS, vì trong dịch lọc sau khi xử lý than hoạt không còn khả năng kháng

khuẩn nữa. Như vậy, có thể thu CKS bằng hấp phụ trên than hoạt tính ở các pH

121

khác nhau và phản hấp phụ bằng axeton. Tuy nhiên ở pH=3 là thích hợp hơn cả.

Đây cũng là phương pháp đơn giản để nghiên cứu chất kháng sinh trong phòng thí

nghiệm.

Hình 3.15. Tách chiết CKS bằng than hoạt tính và giải hấp phụ bằng axeton. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3.

3.4.5. Tách chiết CKS TC-54 bằng nhựa trao đổi ion

Quy trình phân lập CKS TC-54-1 được mô tả như sau:

Dịch nuôi cấy chủng S. hygroscopicus TC-54 sau 5 ngày lên men được axit

hóa bằng cách bổ sung axit oxalic tới pH=3; sau đó ly tâm loại bỏ sinh khối và thu

dịch lọc. Dịch lọc được chạy qua cột trao đổi ion Amberlit IR-120 (dạng H) và IR-

45 (OH) để loại bỏ các cation và anion. Sau đó lại được nhồi vào cột Dowex-50 X-

2, lúc này CKS được hấp thụ trong nhựa và được rửa giải bằng NH4OH 0,5N trong

đệm pyridin- axit axetic pH 7,5. Chất hấp thụ trong cột và được rửa giải gọi là CKS

 Kiểm tra độ tinh khiết của TC-54-1: Bằng sắc ký lớp mỏng,

TC-54-1 ở dạng tinh khiết hơn. Còn chất qua cột được gọi là CKS TC-54-2.

triển khai với 3 hệ dung môi khác nhau:

1. n-butanol-axit axetic-nước ( 4:1:5) có Rf= 0,55

2. n-propanol-axit axetic- H20 (4:1:1) có Rf=0,3

122

3. n-butanol bão hòa nước có Rf=0,75

Dịch nuôi cấy TC-54 (10L, 1210 đv/ml)

- chỉnh pH 4,5 (bằng axit oxalic) - ly tâm

Dịch lọc

- chạy qua cột nhồi nhựa trao đổi ion Ambelit IR-120 (dạng H+). - chạy qua cột nhồi nhựa trao đổi ion Ambelit IR-45 (dạng OH-).

Dịch lọc đã loại bỏ các cation và anion

- chạy qua cột Dowex-50 WX-2, CKS hấp phụ trong nhựa. - giải hấp thụ bằng NH4OH 0,5N - thu hồi, cô đặc.

TC-54-1 (610 g/ml)

Hình 3.16. Sơ đồ phân lập chất kháng sinh TC-54-1

Kết quả cho thấy với các hệ dung môi khác nhau, chất TC-54-1 đều cho một

- chạy qua cột Dowex-50 WX-2, vết trên bản sắc ký lớp mỏng. Chúng tôi kết luận sơ bộ chất TC-54-1 là tinh khiết.

0.4L, CKS hấp thụ trong nhựa. Trên sắc ký lớp mỏng chất, TC-54-1 có màu tím đỏ khi hiện màu với thuốc thử

- giải hấp thụ bằng NH4OH ninhydrin. Với thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc chất TC-54 cho màu tím sẫm. Từ

0,5N những đặc điểm trên, chúng tôi dự đoán sơ bộ chất này có chứa nhóm amine và

hydroxyl. Mặt khác, chất TC-54-1 dễ tan trong nước, trong các CKS được phân lập - thu hồi 2 L ( 550g/ml ), cô

từ loài S. hygroscopicus cho đến nay chỉ có validamyxin có tính chất này (cấu trúc đặc.

hóa học của valydamyxin thuộc nhóm giả đường, có nhiều nhóm hydroxyl nên chất

này dễ tan trong nước và có nhóm amin), do vậy chúng tôi nghĩ đến chất TC-54-1

123

có thể là CKS thuộc nhóm validamyxin.

Đối chiếu với kháng sinh chuẩn validamyxin A do Viện Bảo vệ Thực vật cung

cấp, chúng tôi đã tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng, phân tích dữ liệu các

phổ UV, IR và 1HNMR để nhận dạng chất TC-54-1.[84]

3.4.6. Nhận dạng CKS TC-54

Cảm quan: Đây là dạng bột không màu, tan trong nước, tan trong metanol,

DMF và DMSO, tan vừa trong etanol và axeton, ít tan trong etylaxetat và dietylete.

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (chấm chồng với validamyxin) trên bản

SKLM với hệ dung môi n-propanol-axit axetic-nước (4:1:1) cho thấy chất TC-54-1

trùng với valydamyxin A chuẩn.

Phổ tử ngoại của CKS TC-54-1 trong nước không có đỉnh hấp phụ.

Phổ hồng ngoại có các pic đặc trưng cho nhóm hydroxyl (OH)  = 3420cm-1

và những liên kết ete ( C-O-C)  = 1000-1100cm-1.

Phổ cộng hưởng từ proton 1HNMR (400MHz, DMSO – D6) cho một pic kép

(d) có độ dịch chuyển hóa học là 5,77 ppm, đây là proton H. Vùng có độ dịch

chuyển hóa học từ 3 - 5 ppm tương ứng với các proton của nhóm metylen liên kết

với các nhóm hydroxyl (CH-OH).

Dựa theo tài liệu nghiên cứu validamyxin của Iwasa (phân lập và xác định cấu

trúc) [69], kết quả phân tích phổ UV, IR, 1HNMR chất TC-54-1và so sánh với mẫu

chuẩn validamyxin A, chúng tôi sơ bộ nhận dạng chất TC-54-1 là validamyxin.

Định lượng CKS TC-54-1 bằng HPLC dựa vào mẫu validamyxin A chuẩn

theo phương pháp mô tả trong mục 2.2.8.4 kết quả cho thấy hàm lượng validamyxin

A thu được sau quá trình tách chiết và làm sạch là 610g/ml. Hàm lượng CKS ở

một chủng hoang dại đạt được nồng độ này là khá cao. Điều này hết sức quan trọng

trong việc tinh chế một hàm lượng CKS lớn.

Cấu trúc validamyxin như sau:

124

Hình 3. 17. Công thức cấu tạo của validamyxin

3.4.7. Mối tương quan giữa nồng độ CKS và đường kính vòng vô khuẩn

Thí nghiệm tiếp theo, phân tích mối tương quan giữa nồng độ CKS (đv/ml) và

đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm) theo phương pháp của Dmitrieva , kết quả

được minh họa ở hình 3.18.

Hình 3.18. Mối tương quan giữa đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ

chất kháng sinh. VSV kiểm định F.oxysporum.

Có thể thấy rằng nồng độ chất kháng sinh và độ lớn vòng vô khuẩn tỷ lệ thuận

trong một giới hạn nồng độ nhất định, nếu quá giới hạn này thì dù nồng độ có tăng,

vòng vô khuẩn cũng không tăng.

Như vậy, có thể thấy được mối tương quan bậc nhất giữa nồng độ CKS và

đường kính vòng vô khuẩn. Ở đây sử dụng VSV kiểm định là F.oxysporum có

đường kính vòng vô khuẩn là 40mm thì nồng độ CKS tương ứng là 1210đv/ml. So

với các chủng hoang dại sinh kháng sinh đã được công bố thì chủng xạ khuẩn này là

chủng có hoạt tính khá cao.

3.4.8. Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC)

Do CKS này hoà tan được vào nước nên chúng tôi đã lựa chọn nước làm chất

hoà tan để xác định MIC.

MIC của TC-54 đối với F. oxysporum được xác định theo phương pháp mục

125

2.2.8.6 là: 1,5 g/ml

3.5. TÌM HIỂU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÁC CKS THÔ T-41, D- 42 VÀ TC-54

3.5.1 Ảnh hưởng của CKS trong dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn T-41 và TC-54 tới khả năng nảy mầm của hạt

Một CKS muốn được sử dụng trong nông nghiệp, lâm nghiệp ngoài việc có

hoạt tính chống tác nhân gây bệnh còn phải đáp ứng một số yêu cầu khác như

không độc đối với cây, không kìm hãm khả năng nảy mầm của hạt và không ảnh

hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây.

Hình 3.19 cho thấy: dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn T-41 không pha loãng

(nồng độ 100%) thì khả năng nảy mầm của hạt luôn kém hơn so với nước, thậm chí

với đậu đũa thì ở nồng độ 100% ức chế hoàn toàn khả năng nảy mầm của hạt. Còn

dịch nuôi cấy ở nồng độ 50% thì khả năng nảy mầm của hạt cũng bị ức chế, tuy

nhiên không ức chế mạnh như nồng độ 100%. Ở nồng độ 1% dịch nuôi có tác dụng

kích thích sự nảy mầm của hầu hết các loại hạt trong thí nghiệm, trừ trường hợp đậu

đũa, ở nồng độ 1% khả năng nảy mầm của hạt là thấp hơn so với nồng độ 50%. Như

vây, ở nồng độ dịch nuôi (1%) sẽ làm tăng tỷ lệ nảy mầm của một số loại hạt.

Hình 3.19. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng T-41 lên khả năng nảy mầm của hạt. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3.

Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng TC-54 đến khả năng

126

nảy mầm của hạt trình bày trong hình 3.20 cho thấy nhìn chung dịch nuôi nguyên

chất (nồng độ 100%) sẽ ức chế khả năng nảy mầm của hạt đối với cải củ và đậu cô

ve, hầu như khả năng nảy mầm là rất ít ( 5% và 26%) so với đối chứng ngâm trong

nước vô trùng là 60% và 90%. Ở nồng độ dịch nuôi cấy là 50% thì khả năng nảy

mầm của hạt cũng kém hơn so với đối chứng. Còn ở nồng độ 1%, dịch nuôi có tác

dụng kích thích khả năng nảy mầm của hầu hết các loại hạt trong thí nghiệm.

3.5.2. Ảnh hưởng của CKS T-4l và TC-54 đến khả năng sinh trưởng của cây

Dịch nuôi cấy chủng T-41 được pha loãng đến các nồng độ 1, 2, 10, 50 và

100%. Thử ảnh hưởng của CKS đến khả năng sinh trưởng của cây sau 10 ngày nảy

mầm. Trong thí nghiệm này, một lần nữa lại khẳng định khả năng kích thích sự nảy

mầm của hạt đối với CKS ở nồng độ 1%. Có thể thấy ngay kết quả trong hình 3. 21.

Hơn nữa, chiều dài thân cây mạ ở nồng độ 1% và 2% cũng cao hơn hẳn so với đối

chứng.

127

Hình 3.20. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng TC-54 lên khả năng nảy mầm của hạt. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3.

Hình 3.21. Ảnh hưởng của CKS T-4l lên tỷ lệ nảy mầm hạt thóc và

và sinh trưởng của cây mạ. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3.

Thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sử dụng CKS TC-54 thô pha trong vào nước

cất để có nồng độ 20mg/ml, sau đó pha loãng tiếp bằng nước cất đến các nồng độ

10; 5; 1; 0,5; 0,1; 0,01; 0,005; 0,001 (mg/ml). Thử ảnh hưởng của chất kháng sinh

đến tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc, khả năng sinh trưởng của mầm và rễ, sau 10 ngày.

Sở dĩ ở đây chúng tôi lặp lại thí nghiệm về tỷ lệ nảy mầm là do: trong thí nghiệm ở

mục 3.5.1, chúng tôi chỉ thí nghiệm trên dịch nuôi cấy, thì thấy nếu dùng dung dịch

nuôi 100% thì tỷ lệ nảy mầm của hạt có giảm hơn so với đối chứng, tuy nhiên

không ức chế hoàn toàn quá trình nảy mầm của hạt.

Còn trong thí nghiệm này, chúng tôi dùng CKS đã được tách chiết ở dạng thô

128

thì thấy ở nồng độ 5; 10mg/ml CKS này ức chế hoàn toàn quá trình nảy mầm. Ở

nồng độ 1mg/ml tỷ lệ nảy mầm đã giảm so với đối chứng. Ở nồng độ 0,001mg/ml

CKS không những không ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm mà còn kích thích quá trình

nảy mầm của hạt. Tỷ lệ này tương đương với nồng độ 1% dịch nuôi cấy. Những kết

quả nghiên cứu này rất quan trọng trong việc sử dụng CKS ở các nồng độ khác nhau

ứng dụng trong thực tiễn theo từng mục đích và đối tượng khác nhau.

CKS TC-54 ở nồng độ 10 và 5 mg/ml ức chế hoàn toàn khả năng nảy mầm

của hạt thóc. Chỉ ở nồng độ 0,001mg/ml mới có tác dụng kích thích nảy mầm đồng

thời kích thích sự phát triển của rễ và sự sinh trưởng của cây (chiều dài thân). Như

vậy, những nghiên cứu sơ bộ cho thấy nồng độ chất kháng sinh cao ức chế khả năng

nảy mầm của hạt. Tuy nhiên, nồng độ thấp hơn không những không ức chế mà còn

kích thích sự nảy mầm và sinh trưởng của cây. Nhìn chung, nồng độ đủ ức chế nấm

gây bệnh F.oxysporum không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây.

3.6. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

3.6.1. Quy trình sản xuất chế phẩm T-41 và D-42

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm 2 dạng chế phẩm:

- Chế phẩm bào tử dùng để đưa vào đất trồng. Xạ khuẩn sẽ sinh trưởng trong

đất, tạo các ổ sinh thái, hình thành CKS ức chế các nấm gây bệnh.

- Chế phẩm kháng sinh thô dùng để phun vào cây để tiêu diệt trực tiếp khi nấm

bệnh đã xuất hiện trên cây.

- Đối với các chủng T-41 và D-42, chúng tôi xây dựng quy trình sản xuất chế

129

phẩm bào tử và được minh hoạ ở hình 3.23.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của CKS TC-54 lên tỷ lệ nảy mầm của hạt thóc và

130

sinh trưởng của cây mạ. Ký hiệu (T) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n=3

3.6.2. Xác định một số tính chất của chế phẩm T-41 và D-42

Số lượng và chất lượng của chể phẩm bào tử T-41 và D-42

Tiến hành đếm số lượng bào tử xạ khuẩn trên một gam chế phẩm T-41 và D-

42 bằng cách pha loãng nồng độ. Kết quả thu được số lượng bào tử xạ khuẩn trên

một gam chế phẩm là: 3,5 x109 - 1,4x1011/ gam chế phẩm.

Khả năng tồn tại trong đất trồng của chể phẩm bào tử T-41 và D-42

Sau khi bổ sung chế phẩm bào tử T-41 và D-42 vào đất (đã được khử trùng)

trong 7 ngày, chúng tôi tiến hành phân lập lại để đếm số lượng bào tử xạ khuẩn tồn

tại trong đất. Kết quả cho thấy số lượng bào tử xạ khuẩn trong đất sau 7 ngày là:

4,3x105/g đất.

Cấy giống

Nhân giống khởi động (Bình dung tích 250ml chứa 50g môi trường nuôi cấy) xốp)

5%, 5-7 ngày

Lên men xốp (Bình dung tích 1000ml chứa 200g môi trường xốp)

12 - 14 ngày

Sấy(40 - 500C), xay mịn

Đóng gói

Chế phẩm

131

Hình 3.23. Quy trình sản xuất chế phẩm từ T-41 và D-42

Độ tinh sạch của chế phẩm

Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của chế phẩm bằng cách cấy chế phẩm vào

môi trường nuôi cấy vi khuẩn và nuôi cấy nấm để kiểm tra xem trong chế phẩm của

chúng tôi có nhiễm vi khuẩn hoặc nấm hay không. Kết quả thu được là trong chế

phẩm không có lẫn nấm hay vi khuẩn nào khác.

3.6.3. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên đồng ruộng

3.6.3.1. Chế phẩm T-41 và D-42

Từ những kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, cùng với việc sản xuất

chế phẩm bào tử của chủng T-41 và D-42, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đồng

ruộng với sự cộng tác của Bộ môn Bệnh cây và Trung tâm Bệnh cây Nhiệt đới

Trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội.

Quá trình thử nghiệm chế phẩm trong đất trồng được sơ đồ hoá như sau:

Lây nhiễm nấm gây bệnh cây vào đất

Sau 7 ngày

Bổ sung chế phẩm lần 1

Sau 7 ngày

Trồng cây

Sau 7 ngày

Bổ sung chế phẩm lần 2

Xác định số cây bị bệnh ở các ô

Sau 10 ngày

Bổ sung chế phẩm lần 3

132

Hình 3.24. Quy trình thử nghiệm chế phẩm T-41 và D-42

Trong các thí nghiệm này, chúng tôi có sử dụng 2 loại thuốc hoá học có tên

thương phẩm là: mexyl (metalaxyl 18% và mancozeb 64%), rovral (iprodione

96%), đã được phép sử dụng tại Việt Nam và validacin 3DD. Đây là các chất chống

nấm gây bệnh thực vật rất tốt và hay được sử dụng ở Việt Nam.

Bệnh mốc trắng do Sclerotium rolfsii gây ra khá phổ biến ở các cây hoa màu.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn cà chua là đối tượng để nghiên cứu. Như đã

mô tả thí nghiệm trong phần 2.2.11.1, kết qủa thí nghiệm được trình bày ở bảng

3.18.

Có thể thấy rằng, với 2 loại thuốc hoá học dùng để diệt nấm rất phổ biến hiện

nay thì khi dùng mexyl, rovral tỷ lệ cây bị bệnh sau 31 ngày thí nghiệm tương ứng

là 28,57% và 31,43 %. Trong khi đó chế phẩm T-41 có tỷ lệ bệnh là 28,57% tương

đương với khi dùng mexyl và hiệu lực còn cao hơn cả rovral. Còn chế phẩm D-42

thì tỷ lệ cây bị bệnh chiếm 39,05%. Tỷ lệ này là cao nhất trong số các chế phẩm

được thử nghiệm. Tuy nhiên so với đối chứng 89,05% thì đây vẫn là con số đáng

được quan tâm. Kết quả này rất khả quan cho việc dùng chế phẩm sinh học thay thế

cho các chế phẩm hoá học.

Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm trên cà chua

( nấm gây bệnh : Sclerotium rolfsii)

Công

thức

1

2

4

5

6

3 Đối chứng

mexyl

D42

T41

T. viride

rovral

50WP

MZ72

Ngày

Tỷ lệ cây bị bệnh tại các thời điểm thí nghiệm(%)

8,57±3

9,52±2,52

17,14±1,73 20,95±4,04 20,95±5,13

Ngày thứ 7 39,05±3,79

28,57±1

25,71±4,36 24,76±5,51

Ngày thứ 17 55,95±1,53 17,14±4,36 16,19±2,52

Ngày thứ 24 63,43±2,65 21,9±4,16 25,71±2,65 33,33±2,08 25,71±4,36 26,67±5,03

Ngày thứ 31 89,05±3,79 28,57±3,46 31,43±2,65 39,05±1,15 28,57±4,36 29,52±5,69

133

Thí nghiệm tiếp theo chúng tôi thử nghiệm trên bắp cải. Đất trồng bắp cải

được nhiễm Rhizoctonia solani, sau 7 ngày lây nhiễm thì trồng bắp cải vào đất đó.

xuân. Bệnh gây hại nặng trên cây cải bắp với triệu chứng lở và thắt cổ rễ cây con và

triệu chứng thối bắp cây trưởng thành. Tỉ lệ bệnh do nấm bệnh gây ra trên cây cải bắp ở

vụ xuân vào giai đoạn chuẩn bị thu hoạch dao động từ 9 - 99% ở các vùng trồng rau

xung quanh Hà Nội.

Loại nấm này có thể gây hại cho cây trồng quanh năm và đặc biệt gây hại nặng vào vụ

Trong khi đó, những kết quả trên bảng 3.19 cho thấy chế phẩm D-42 lại có tác

dụng diệt R. solani trên bắp cải với hiệu lực tương đối cao, hơn cả rovral và T-41,

nhưng kém hơn hẳn so với validacin. Vì validacin là kháng sinh đặc hiệu dùng để trị

bệnh này.

Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm trên bắp cải

( Nấm gây bệnh Rhizoctonia solani)

1 2 3 4 5 6

Công thức

Validacin

Rovral

Mexyl

Đối chứng

D42

T41

3DD

50WP

MZ72

Ngày

Tỷ lệ cây bị bệnh tại các thời điểm thí nghiệm(%)

Ngày thứ 15

73,3±5,51

18,66±4,52

18±1,15

26,6±4,16

10±1

16,3±3,58

Ngày thứ 30

100±5,67

18±5,36

20±2,67

33,3±4,04

10±1,15

17,3±3,33

3.6.3.2. Khảo nghiệm chế phẩm TC-54 tại xã Trần Lãm,Thái Bình.

Rhizoctonia solani là nấm thường xuyên gây hại nặng ở giai đoạn cây con,

trên nhiều thời vụ trồng ở nước ta. Nguồn gây bệnh tồn tại dưới dạng sợi và hạch

nấm ở trong đất hoặc xác cây trồng. Ở lúa bệnh khô vằn biểu hiện thành từng mảng,

vết bệnh to, nổi lên thành từng đám vằn, khô. Những cây bị bệnh có thể phát hiện

134

đựơc bằng mắt thường. Chủng TC-54 được nuôi cấy trong môi trường A4, trong nồi

lên men 10l, thông khí là 1v/1v/phút, ở 300C, trong 5 ngày. Lọc loại bỏ sinh khối,

dịch lọc đuợc dùng làm chế phẩm kháng sinh.

Chúng tôi dùng 3 công thức để thí nghiệm đối với giống lúa Q5. Công thức

thứ 1 dùng chế phẩm TC-54, công thức thứ 2 dùng validacin 3DD thương phẩm -

đây là loại thuốc đang được dùng phổ biến trong phòng chống bệnh khô vằn hại lúa

hiện nay. Công thức thứ 3 là đối chứng. Thí nghiệm đựơc bắt đầu tiến hành vào lúc

lúa làm đòng, là thời kỳ lúa bị bệnh nặng nhất. Kết quả về tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh

trước khi phun được trình bày trong bảng 3.20.

Bảng 3.20. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh trước khi phun thuốc

Số dảnh bị bệnh

Công thức Số lần nhắc lại Tỷ lệ bệnh(%)

Số dảnh điều tra Chỉ số bệnh( %) C1 C2 Tổng

1 50 3 3 6 12,0 4,5

2 50 5 5 10 20,0 7,5 1 3 50 8 4 12 24,0 8,0

Trung bình 18,66 6,66

1 50 5 6 11 22,0 8,5

2 50 4 4 8 16,0 6,0 2 3 50 7 3 10 20,0 6,5

Trung bình 19,33 7,0

1 50 7 5 12 24,0 8,5

2 50 4 4 8 16,0 6,0 3 3 50 4 3 7 14,0 5,0

Trung bình 18,0 6,5

Qua bảng 3.20 cho thấy, trước khi phun thuốc tỷ lệ bệnh giữa các công thức

biến động từ 18 - 19,33% và chỉ số bệnh từ 6,5 - 7,0%. Tỷ lệ bệnh đánh giá được

mức độ phân bố của bệnh, còn chỉ số bệnh chỉ ra đựơc mức độ nặng nhẹ của bệnh.

135

Dựa vào những thông số này mà các nhà bảo vệ thực vật đưa ra những quyết định

đúng đắn để ngăn chặn dịch bệnh. Sau phun thuốc 5 ngày, kết quả ở bảng 1 cho

thấy: nếu dùng dung dịch TC-54 thì tỷ lệ bệnh là 21,33 % còn đối chứng là 28%.

Tuy nhiên dùng validacin thì tỷ lệ bệnh là 20,33%. Như vậy dung dịch TC-54 đã có

tác dụng giảm tỷ lệ bệnh sau 5 ngày tuy nhiên tỷ lệ này so với dùng validacin vẫn

còn cao hơn 1,33%. Kết quả trình bày ở bảng 3.21.

Bảng 3.21. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau phun thuốc 5 ngày

Số dảnh bị bệnh

Công thức Chỉ số bệnh (%)

Số lần nhắc lại Tỷ lệ bệnh (%) C1 C2 C3 Tổng Số dảnh điều tra

1 50 3 3 8 16,0 6,0

2 50 5 5 2 12 24,0 10,0 1 3 50 8 4 2 12 24,0 10,5

Trung bình 21,33 8,83

1 50 5 6 1 12 22,0 8,5

2 50 3 4 7 16,0 6,0 2 3 50 8 2 1 11 20,0 6,5

Trung bình 20,0 7,66

1 50 5 9 4 18 24,0 8,5

2 50 3 7 3 13 16,0 6,0 3 3 50 4 5 2 11 14,0 5,0

Trung bình 28,0 13,5

Sau phun thuốc 10, 15, 20 ngày, chúng tôi lại tiến hành điều tra để so sánh

giữa các công thức với nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.22.

Theo số liệu ở bảng 3.22, sau khi phun thuốc 10 ngày thì mức độ bị bệnh cấp

4 ở lô đối chứng tăng lên đáng kể. Ở đây tỷ lệ bệnh đã lên đến 34%. Nếu dùng dung

136

dịch TC-54 thì tỷ lệ này giảm đi, chiếm 22,66%, nếu dùng validacin thì tỷ lệ này là

20,66%. Điều đó chứng tỏ dung dịch TC-54 đã có tác dụng làm ức chế mức độ gây

bệnh, tuy nhiên nếu so với validacin thì vẫn chưa hiệu quả bằng

Chúng tôi lại tiếp tục nghiên cứu tiếp về vai trò tác dụng của thuốc vào thời

điểm 15 ngày sau phun thuốc. Ở lô đối chứng tỷ lệ bệnh lên đến 41,33%, còn với

công thức 1 tỷ lệ này ở mức 24,0%, công thức 2 tỷ lệ này là 21, 33%. Điều đó cho

thấy nếu dùng TC-54 thì tỷ lệ bệnh sau 15 ngày đã giảm 17,33%.

Sau đó chúng tôi tiến hành lấy mẫu thí nghiệm sau 20 ngày phun thuốc để tiếp

tục đánh giá hiệu lực của thuốc.

Bảng 3.22. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau phun thuốc 10, 15 và 20 ngày

Công thức Số dảnh bị bệnh trung bình sau 10 ngày phun thuốc

Số dảnh điều tra Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3 Cấp 4 Tổng

5,33 4,33 8,0 1,66 Tỷ lệ bệnh trung bình (%) 24,0 21,33 34,0 Chỉ số bệnh trung bình (%) 12,5 13,0 19,0

50 50 50 1 2 3

11,33 2,0 4,0 10,33 1,0 5,0 3,33 17,0 4,0 Số dảnh bị bệnh trung bình sau 15 ngày phun thuốc

3,0 4,33 2,33 Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3 Cấp 4 0,66 0,33 5,0 5,66 4,66 6,0 Tổng 12,0 10,66 20,66 24,0 21,33 34,0 12,5 13,0 19,0

50 50 50 1 2 3

2,66 3,66 7,33 Số dảnh bị bệnh trung bình sau 20 ngàyphun thuốc

50 50 50 1 2 3 Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3 Cấp 4 1,33 1,66 2,0 0,66 6,66 2,33 2,66 2,66 10,66 7,0 4,66 3,33 Tổng 12,66 9,0 33,33 25,33 20.0 44,66 14,5 12,8 34,16

Kết quả bảng 3.23 cho thấy: sau 20 ngày thì tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh vẫn tiếp

tục tăng lên ở cả 3 công thức. Số dảnh bị bệnh cấp 4 cũng tăng lên, điều đó chứng tỏ

137

tác dụng của thuốc đã giảm. So sánh trong cả qúa trình theo dõi thì thấy rằng : ở lô

đối chứng tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh tăng dần lên đến ngày cuối cùng theo dõi là

44,66% và 34,16% tương ứng. Nếu dùng TC-54 thì tỷ lệ bệnh giảm xuống còn

25,33%, tỷ số bệnh là 14,5%. Điều đó chứng tỏ TC-54 có vai trò tốt trong việc

phòng chống bệnh khô vằn ở lúa. So với loại thuốc đang đựơc dùng phổ biến hiện

nay là validacin tuy không có hiệu lực bằng, nhưng tỷ lệ chệnh lệch không nhiều

lắm. Đây mới chỉ là dịch kháng sinh thô, việc tối ưu hoá quá trình lên men và hoàn

thiện quy trình chiết chắc chắn sẽ tạo được chế phẩm có hoạt tính cao.

Bảng 3.23. Tổng hợp số liệu khảo nghiệm sau 20 ngày

Sau phun thuốc ( ngày)

Công thức 0 5 10 15 20

18,676,11 21,334,62 22,674,04 24,03,46 25,337,57

6,671,89 8,832,47 10,331,53 12,53,97 14,56,14

19,333,06 19,333,06 20,678,08 20,336,66 20,06,11

6,671,89 7,01,32 8,53,61 11,06,61 12,86,11

18,005,29 18,005,29 34,09,17 41,337,57 44,669,45

6,51,8 6,51,8 19,06,24 28,166,37 34,178,43 Chỉ tiêu (%) Tỷ lệ bệnh Chỉ số bệnh Tỷ lệ bệnh Chỉ số bệnh Tỷ lệ bệnh Chỉ số bệnh

Theo kết quả tính toán thì tỷ lệ bệnh trước phun thuốc giữa các công thức biến

động từ 18,0 - 19,3% và chỉ số bệnh từ 6,5 - 7,0%.

Qua 4 đợt sử dụng chế phẩm kháng sinh TC-54 chống bệnh khô vằn ở lúa có

thể rút ra kết luận sau: chế phẩm TC-54 có khả năng phòng trừ bệnh khô vằn hại

lúa, hiệu lực của chế phẩm đạt cao nhất sau 5-10 ngày. Điều tra sau phun thuốc 5-10

ngày không thấy vết bệnh mới xuất hiện, sau 15-20 ngày vết bệnh mới bắt đầu xuất

hiện. So với validacin thương phẩm thì tỷ lệ bệnh cao hơn từ 2-5,3%, chỉ số bệnh

138

cao hơn khoảng 2%. Nếu so sánh với đối chứng thì dùng TC-54 tỷ lệ bệnh sẽ giảm

đi 10-19%, chí số bệnh giảm đi 9-20%. Điều đáng chú ý là validamyxin là CKS đã

được nghiên cứu hoàn thiện về công nghệ lên men, chiết rút và công thức chế phẩm,

trong khi TC-54 mới dừng ở dịch lên men tự nhiên.

Hình 3.25. Diễn biến tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau 20 ngày thử nghiệm

Nếu được nghiên cứu sâu hơn thì chắc chắn hiệu quả ứng dụng sẽ còn cao hơn

nhiều. Trong thí nghiệm này, chỉ muốn so sánh tác dụng phòng chống nấm gây

bệnh khô vằn cho lúa giữa validacin và chế phẩm TC-54 đã thấy có tác dụng tương

tự. Nếu tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về tất cả các chỉ tiêu đặc biệt là nồng độ kháng

sinh thì kết quả sẽ thuyết phục hơn.

Từ những kết quả thực nghiệm đồng ruộng có thể rút ra nhận xét sau:

validamyxin lần đầu tiên được phát hiện ở Trung Quốc sau đó được triển khai

nghiên cứu toàn diện ở Nhật Bản và không lâu sau, cả hai nước đều tung ra thị

trường chế phẩm validacin như là thuốc chủ lực chống nấm gây bệnh khô vằn. Khác

với sản xuất kháng sinh dùng trong y tế và thú y luôn phải tinh khiết để tránh các

phản ứng phụ, nên thường có giá thành cao. Đối với kháng sinh thực vật thì có thể

bỏ qua khâu này. Chỉ cần chiết ở mức độ vừa phải để nâng cao nồng độ hoặc thậm

chí có thể dùng dung dịch nuôi cấy. Tuy nhiên trong dịch nuôi cấy còn chứa các

139

mảnh tế bào, do đó cần có các chất bảo quản để có thể lưu giữ lâu dài.

Đã có nhiều ý kiến tranh luận về mặt trái của việc sử dụng CKS trong nông

nghiệp, nhất là trong chăn nuôi và thú y. Việc lạm dụng CKS có thể làm xuất hiện

các vi khuẩn kháng thuốc để rồi các vi khuẩn này lại truyền các gen kháng thuốc

cho các vi khuẩn gây bệnh ở người, làm mất đi cơ hội sử dụng có hiệu quả vũ khí

kháng sinh trị bệnh cho người. Tương tự như vậy, trong nuôi trồng thủy sản người

ta cũng nghiêm cấm sử dụng một số CKS để chữa bệnh và xử lý ô nhiễm môi

trường nuôi tôm cá.

Chính vì những lý lẽ trên, nhiệm vụ của chúng tôi là đưa ra một loại chế phẩm

kháng sinh thô hoặc chế phẩm chứa bào tử xạ khuẩn sinh kháng sinh chỉ dành riêng

cho bảo vệ thực vật. Loại thứ nhất dùng để trị bệnh, tức là phun trực tiếp vào cây bị

bệnh nhằm diệt các tác nhân gây bệnh. Loại thứ 2 dùng để phòng chống. Khi đưa

bào tử xạ khuẩn vào đất (khoảng 109 bào tử/m2), chúng sẽ nảy mầm tạo ổ sinh thái

và ức chế các nấm gây bệnh. Mặc dù ở trong đất, lượng chất kháng sinh sinh ra

không nhiều và dễ bị phân hủy bởi các vi sinh vật đất, tuy nhiên chúng được tạo ra

140

liên tục và trên diện rộng nên khả năng ức chế các nấm bệnh khác là rất lớn.

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra được những kết luận sau:

1. Từ 71 mẫu đất, đã phân lập được 508 chủng xạ khuẩn và chọn được 3

chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cao nhất được ký hiệu là: T-41, D-

42, TC-54 để nghiên cứu sâu hơn.

2. Đã tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích

trình tự gen ADNr 16S để khẳng định:

Chủng T-41 là Streptomyces antimycoticus Waksman, 1957. -

Chủng D-42 là Streptomyces diastatochromogenes (Krainsky 1914) -

Waksman và Henrici, 1948.

Chủng TC-54 là Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman và Henrici, 1948.

3. Đã xác định được điều kiện lên men thích hợp cho 3 chủng xạ khuẩn:

- Môi trường A-12 thích hợp cho các chủng T-41 và D-42 sinh tổng hợp

kháng sinh, trong đó khả năng sinh kháng sinh của T-41 trên môi trường

xốp mạnh hơn trên môi trường dịch thể. Môi trường A-4 thích hợp nhất cho

chủng TC-54 sinh kháng sinh.

- T-41 và D-42 đều cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất ở nhiệt độ khoảng

300C, pH trung tính hoặc hơi kiềm. Nguồn cacbon thích hợp nhất cho để

tổng hợp chất kháng sinh của chủng T-41 là tinh bột tan (1%) và D-42 là rỉ

đường. Bột đậu tương (1%) là nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho lên men

của các chủng này. Ở cả hai chủng, lượng sinh khối tích luỹ và hoạt tính

kháng sinh đạt cực đại sau khoảng 96-120 giờ nuôi.

- Trên môi trường lên men xốp, hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 đạt cao

nhất vào ngày thứ 12.

4. Dựa vào phổ UV, IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, CKS TC-54 sơ bộ định

141

dạng là validamyxin.

5. Đã bước đầu ứng dụng 3 loại chế phẩm sản xuất từ 3 chủng xạ khuẩn

nghiên cứu.

Chế phẩm bào tử T-41, rất có hiệu quả trong việc chống nấm Sclerotium -

rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua.

Chế phẩm D-42 có hiệu quả tốt trong phòng chống bệnh lở cổ rễ và thối -

bắp do Rhizoctonia solani gây ra trên bắp cải.

Chế phẩm dạng dịch TC-54 có hiệu quả tốt đối với việc phòng chống -

bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani) ở lúa với hiệu lực gần xấp xỉ

validacin.

KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO

1. Tiếp tục nghiên cứu bản chất hoá học của 2 CKS tách chiết từ T-41 và D-42.

2. Tiếp tục hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm.

3. Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm sinh học từ các chủng xạ khuẩn

142

ở quy mô lớn hơn.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Kiều Hữu Ảnh, Phạm Văn Ty, Lê Gia Hy, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Thanh

Huyền, 2003, Tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces

hygroscopicus TC-54 có hoạt tính cao chống nấm gây bệnh, Tạp chí Sinh học,

tập 25-số 2A, trang 85-91.

2. Nguyễn Thị Chính, Lý Ngọc Oanh, Bùi Thị Việt Hà, 2003, Một số nấm bệnh

gây hại cho cây lúa , cây vải và khả năng ức chế chống bệnh nấm của cây, Tạp

chí Sinh học, tập 25-số 2A, trang 99-103.

3. Bùi Thị Việt Hà, Đào Duy Đạt, Kiều Hữu Ảnh, 2004, Phân lập và tuyển chọn

xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật, Tạp chí Khoa học

Tự nhiên và Công nghệ, T.XX, No2AP, Đại học Quốc gia Hà nội, Phụ trương

ngành Sinh học, 103-107.

4. Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Thanh Huyền, Đinh Xuân Tuấn, Kiều Hữu Ảnh,

2004, Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật

cuả 2 chủng xạ khuẩn T-41 và D-42, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, số 4, tr 50-

56.

5. Bui Thi Viet Ha, Pham Van Ty, Dao Thi Luong, Tu Minh Koong, Le Gia Hy,

(2005), Study on Streptomyces hygroscopicus for control of phytopathogenic

fungi, Vnu, J. Scen Nat Tech, T.XXI, N04AP, 182-187.

6. Bùi Thị Việt Hà, Phạm Văn Ty, ( 2005), Khảo nghiệm chế phẩm kháng sinh

TC-54 trong phòng chống nấm gây bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani) hại lúa,

Báo cáo khoa học, hội nghị toàn quốc những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong

143

Khoa học sự sống, tr 475 - 477.

PHỤ LỤC

144

Phụ lục 1. Hoạt tính kháng sinh của chủng T-41 trên các loại

môi trường khác nhau

Phụ lục 2. Khả năng bền nhiệt của CKS TC-54.

145

Phụ lục 3. Hoạt tính kháng sinh của chủng D-42 trên các loại môi trường khác nhau

Phụ lục 4. Hình thái khuẩn lạc của Fusarium oxysporum

Phụ lục 5. Hình dạng bào tử màng dày của Fusarium oxysporum

146

Phụ lục 6. Đặc điểm hình thái của Sclerotium rolfsii trên môi trường PDA

Phụ lục 7. Hình thái khuẩn lạc Rhizoctonia solani

147

Phụ lục 8. Hình dạng sợi nấm Rhizoctonia solani

Phụ lục 9. Hình dạng sợi nấm Sclerotium rolfsii

148

149

Phụ lục 10 Kết quả phân tích validamyxin A chuẩn bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Phụ lục 10 Kết quả phân tích validamyxin A chuẩn bằng

sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Phụ lục 11. Kết quả phân tích CKSTC-54-1 bằng

150

sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Phụ lục 12. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của CKSTC-

151

54-1

Phụ lục 13 . Phổ NMR của CKS TC-54-1

152

Phụ lục 14 . Phổ NMR của CKS TC-54-1

153

Phụ lục 15. Thử nghiệm chế phẩm T41, D42 trên bắp cải

Phụ lục 16. Thử nghiệm chế phẩmT41, D42 trên cà chua

154

Phụ lục 17.Triệu chứng bệnh khô vằn do R.solani gây ra ở lúa

155

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ Nông Nghiệp & PTNT (2002), Danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng,

hạn chế sử dụng, cấm sử dụng ở Việt Nam, Hà Nội.

2. Lâm Khải Bình, (1972), Xác xuất thống kê và quy hoạch thực nghiệm, Nhà

xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội.

3. Đường Hồng Dật (1969), Khoa học bệnh cây, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà

Nội.

4. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình

Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty, (1978), Một số phương pháp nghiên

cứu vi sinh vật học, Tập III, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội.

5. Bùi Xuân Đồng, Hà Huy Kế, (1999), Nấm mốc và phương pháp phòng chống,

Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

6. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh

học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

7. Lê Mai Hương, (1993), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập ở

Hà Nội và vùng phụ cận, Luận án tiến sĩ, Hà Nội.

8. Lê Gia Hy, (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất

kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam,

Luận án Tiến sĩ, Hà Nội.

9. Đỗ Quyên, (2003), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một

số tác dụng sinh học của cây bỏng nổ ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ dược học.

10. Phạm Chí Thành, (1988), Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng, Trường Đại

học Nông nghiệp 1, Hà nội.

11. Lê Lương Tề (1997), " Nghiên cứu tác động của một số yếu tố ngoại cảnh và

thuốc hoá học đến sự sinh trưởng và phát triển của Fusarium solani (Mart)

156

Sace", Tạp chí chuyên ngành bảo vệ thực vật, (154), tr. 19-22.

12. Lê Lương Tề (1997), Bệnh cây, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

13. Hà Minh Trung, Lê Văn Thuyết, (1995): ”Chiến lược bảo vệ thực vật trong

chương trình lương thực, thực phẩm”, Hội nghị tổng kết chương trình cây

lương thực, thực phẩm, Bộ NN và PTNN

14. Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết (2001), Sản xuất, chế biến và sử dụng thuốc

bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.

15. Ngô Vĩnh Viễn, Hà Minh Trung, Mai Thị Liên, 1998, ”Một số kết quả nghiên

cứu về bệnh đạo ôn (1991-1995)”, Trong: Nghiên cứu về bệnh hại, 81-89.

Tài liệu tiếng Anh

16. Adinarayana K, P. Ellaiah, B. Srinivasulu, R. Bhavani Devi, G. Adinarayana,

(2003), “Response surface methodological approach to optimize the nutritional

parameters for neomycin production by Streptomyces marinensis under solid-

state fermentation”, South Africa, Proc Biochem.38, 1565-1572.

17. Adinarayana K, T. Prabhakar, V. Srinivasulu, M. Anitha Rao, P. Jhansi

Lakshmi, P. Ellaiah, (2003), “Optimization of process parameters for

cephalosporin C production under solid state fermentation from Acremonium

chrysogenum”, Proc Biochem. 39, 171-177.

18. Agrios, G. N. (1997), Plant Pathology, 4th Edition. Academic Press, San

Diego.

19. Alan C, Katz, Martin F.K.J, (2005), “Global pesticide registration issues”, In

Forum on China pesticide export development strategy, 51-77.

20. Annaliesa S. Anderson and Elizabeth M. H. Wellington, (2001), “The

taxonomy of Streptomyces and related Genera”, Inter. J. Sys.Evol.Microbiol

51, 797–814.

21. Anurag Khetan, Wei.S. Hu, (2002), “Metabolic Engineering of Antibiotic

Biosynthetic pathways”, In: Industrial Pharmaceutical Biotechnology, Press

157

Wiley-VCH, 717-719.

22. Arnold L, Demain, Julian E. Davies, (1999), Manual of Industrial

Microbiology and Biotechnology, 174-176.

23. Ausubel, Frederik M, Brent Roger, Robert E. Kingston, Davide D. Moore,

Seidman, J. Smith and Struhl. K, (1999), Short protocols in molecular biology,

published by John Wiley & Sons, Inc, 13-50.

24. Barker, R. and R.W. Herdt with B. Rose (1985), “The Rice Economy of Asia”.

Washington, D.C., and Los Baños, Laguna, Philippines, Resources for the

Future with IRRI, in Farm Pesticide, Rice Production, and Human Health, 51-

25. Benjamin Lewin (2000), Genes VII, published by Oxford University.

26. Beom Seok Kim, Surk Sik Moon, and Byung Kook Hwang, (1999),” Isolation,

identification, and antifungal activity of a macrolide antibiotic, oligomycin A,

produced by Streptomyces libani”, Can. J. Bot.Rev. Can. Bot. 77(6), 850-858.

27. Berdy, J. (1974), "Recent development in antibiotic research and classification

of antibiotic according to the chemical structure", Adv.Appl. Microbiol, 18,

309-406.

28. Bradley. L, Ackermann, Brian T.R, Luigi.C, Sergio.S, John E.C, (1996),

“Rapid analysis of Antibiotic Containing mixtures from fermentation broths by

using liquid chromatography – Electrospray Ionization – Mass Spectrometry –

Time of flight – Mass Spectrometry”, J.Am.Soc.Mass.Spectrom, 7, 1227-1237.

29. Bugress L.W, Liddell C.M, Summerell B.A (1998), Laboratory manual for

Fusarium research, 2nd Edition, University of Sydney, Australia, 156-160.

30. Bum. K, Chang.K, Jongsik.C, Young. K, Sueng. L, (2004), “ Phylogenetic

analysis of the genera Streptomyces and Kitasatospora base on partial RNA

polymerase a-subunit gene (rpoB) sequences”, Inter J. Sys Evol Microbiol, 54,

158

593-598.

31. Bu'Lock, J. D, (1974), “Secondary metabolism of microorganisms”, In B.

Spencer(ed.), Industrial aspects of biochemistry, 1. North Holland Publishing

Co., Amsterdam, 335-346.

32. Byung.K.H, Song.W.L, Beom. S.K, Jung.Y.L, Sucrk.S.M, (2001), “Isolation

and In Vivo and In Vitro Antifungal Activity of Phenylacetic Acid and

Sodium Phenylacetate from Streptomyces humidus”, J. Appl.Environ.

Microbiol, 67(8), 3739–3745.

33. Collins.M.D., T. Pirouz, M.Goodfellow and D.E.Minikin, (1977), “Distribution

of menaquinones in Actinomycetes and Corynebacteria. J.Gen.Microbiol, 100,

221-230.

34. Calzolari. A, Finelli. F, and Mazzoli. G. L, (1999), “A severe unforeseen

outbreak of fire blight in the Emilia-Romagna region”. Acta Hortic, 489, 171-

176.

35. Castro, C., Davis, J. R., and Wiese, M.V. (1988), “Quantitative estimation of

Rhizoctonia solani AG-3 in soil”, Phytopathology 78, 1287-1292.

36. Catalogue of strains, (2005), Japan Collection of Microorganism, Ninth edi,

Riken BioResource Center.

37. Cidaria. D., G. Borgonovi, G. Pirali, (1993), “AB 023, novel polyene

antibiotics.I. Taxonomy of producing organism, fermentation and antifungal

activity”, J.Atibiot, 46, 251-254.

38. Demain, A. L. (1968), “Regulatory mechanisms and the industrial production

of microbial metabolites”, Lloydia 31:395-418.

39. Demain, A. L, (1973), “Mutation and the production of secondary

metabolites”, Adv. Appl. Microbiol.16:177-202

40. Demain, A. L., and Y. M. Kennel, (1978), “Resting-cell studies on carbon-

source regulation of -lactam antibiotic biosynthesis”, J. Ferment.Technol.

159

56:323-328.

41. Demain, A. L., and J. Piret, (1979), Relationship between antibiotic

biosynthesis and sporulation, p. 183-188. In M. Luckner and K. Schreiber

(ed.), Regulation of secondary product and plant hormone metabolism.

Pergamon Press,New York.

42. Demain. A. L, A. Fang, (1995), “Emerging concept of secondary metabolism

in actinomycetes”, J. Actinomycetologica, 9, 98-117.

43. Demain, A.L, (1992), “Microbial secondary metabolism: a new theoretical

frontier for academia, a new opportunity for industry”, Ciba Found. Symp,

171, 3-23.

44. Demain, A.L. (1974), "How do antibiotic - producing microorganism avoid

suicide?” Annuals of the New York academy of science, 235, 601-602.

45. Dominique L. Monnet, (2004), “Antibiotic development and the changing role

of the pharmaceutical industry”, in: The global threat of antibiotic resistance,

a multidisciplinary Meeting, Sweden.

46. Donald B. Borders, (2002), “Isolation and identification of small molecular”, In

Industrial pharmaceutical Biotechnology, Press Wiley-VCH, 257-265.

47. EPA Office of Pesticide Programs, (2000), Pesticide registration eligibility

decisions (REDs) fact sheets. Online.

48. Erdem Guzeltunc, Kutlu O, Ulgen, (2001), “Recovery of actinorhodin from

fermentation broth”, J. Chromato A, 914, 67–76.

49. FAO yearbook – Production (1994), 7, 43

50. Fukagawa, Y., Sawa, t., Takeuchi, T., Umezawa, H (1968a), “Studies in

biosynthesis of kasugamycin I. Biosynthesis of kasugamycin and the

kasugamine moiety”, J. Antibiot., 21, 50-54.

51. George N.A (1991), Plantpathology, 3rd Edition, Academic press , INC

160

London, Sydney, Tokyo, Toronto.

52. Gersch, D., A. Skurk, and W. Romer, (1979), “Phosphate inhibition of secondary metabolism in Streptomyces hygroscopicus and its reversal by cyclic AMP”, Arch. Microbiol. 121, 91-96.

53. Gesheva V. , V. Ivanova, R. Gesheva, (2005), “Effects of nutrients on the

production of waAK-111-81 macrolide antibiotic by Streptomyces

hygroscopicus”, Microbiol. Res, 160, 243-248.

54. Goodman, R. N. (1959), “The influence of antibiotics on plants and plant

disease control”. in: Antibiotics: Their Chemistry and Non-Medical Uses. H. S.

Goldberg, ed. D. van Nostrand and Company, Inc. Princeton, N J, 322-448

55. Guido Meurer, C.R. Hutchinson, (2001), Gene for the biosynthesis of microbial

secondary metabolites, In: Industrial pharmaceutical Biotechnology, Press

Wiley-VCH, 740-779.

56. Gilson. P, Ekrem. A, Marian. M, Carlos. R, Jolanta. Z, Czerwinska,

Matthew. D and Michael Goodfellow, (2003), “Classification of novel soil

streptomycetes as Streptomyces aureus sp. nov., Streptomyces laceyi sp. nov.

and Streptomyces sanglieri sp. nov”, J. Antonie van Leeuwenhoek ,83(3), 245

– 255.

57. Haijun Dong, Taifo Mahmud, Ingo Tornus, Sungsook Lee, Heinz G. Floss,

(2001), “Biosynthesis of the Validamycins: Identification of Intermediates in

the Biosynthesis of Validamycin A by Streptomyces hygroscopicus var.

limoneus”, J. Am. Chem. Soc., 123, 2733-2742.

58. Hamada. M., Hashimoto, T., Takahashi , S., Yoneyama, M., Miyake, T.,

Takeuchi, Y., Okami, Y, Umezawa, H (1965), “Antimicrobial activity of

kasugamycin”, J. Antibiot, 18, 104-106.

59. Hatanaka H, Iwami M, Kino T, Goto T, Okuhara M, (2003), “FR-900520 and

FR-900523, novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces. I.

Taxonomy of the producing strain”, J. Appl Environ Microbiol, 69, (3), 1647-

161

1654.

60. Hildgund Schrempf, (2001), “Investigation of Streptomycetes using tool of

recombinant DNA technology”, In Industrial Pharmaceutical Biotechnology,

Press Wiley-VCH, 501-507.

61. Hoe Do Van, (2005), “Renewals of pesticide policies in Vietnam”, In Forum

on China pesticide export development strategy, 35-50.

62. Holt J.G, N.R.Krieg, P.H.A.Sneath, J.T.Staley, S.T.Williams, (2000), Bergey’s

Manual of Determinative Bacteriology (9th edition), Lippincott Williams &

Wilkins .

63. Hopwood, D.A, (1983), Actinomycetes genetics and antibiotic production. In:

Biochemistry and Genetic Regulation of Commercially Important Antibiotics.

L.C. Vining (ed.), Addison-Wesley, MA, 1-24.

64. Hopwood. D.A, Merrick. M. J. (1997), "Genetics of antibiotic production", J.

Bacteriol, 41, 596- 636.

65. Horii, S., Iwasa, T, Kameda Y, (1971), “Studies on validamycin, new

antibiotic, V. Degradation studies”, J. Antibiot, 24, 57-58.

66. Howell C. R (1989), "Relevance of mycoparasitism in the biological control of

Rhizoctonia solani by Gliocladium virens", Phytopathology, 77, 990 - 4.

67. http://biosci.cbs.umn.edu/asire/protocol/isolation.html.

68. Hurley, L. H., and D. Bialek, (1974), “Regulation of antibiotic production:

catabolite inhibition and the dualistic effect of glucose on indolmycin

production”, J. Antibiot. 27:49-56.

and Biological Approaches to Plant Protection, John Wiley & Sons, Wiley

69. Hutson. D.H, D. Hutson, Miyamoto. J, (1998), Fungicidal Activity: Chemical

Series in Agrochemicals and Plant Protection, 57 -59.

70. Iwasa, T., Higashide, E., Shibata M., (1971a), “Studies on validamycin, new

antibiotics. III. Bioassay method for the determination of validamycin”, J.

162

Antibiot, 24, 114-118.

71. Iwasa, T., Kameda, Y., Asai, M., Horii, S., Mizuno k, (1971c), “Studies on

validamycins, new antibiotics. IV. Isolation and characterization of

validamycin-A and B”, J. Antibiot, 24, 119-123.

72. Jikun Huang, Fangbin Qiao, Linxiu Zhang and Scott, (2003), “Farm Pesticide,

Rice Production, and Human Health”, in Farm Pesticide, Rice Production,

and Human Health, 1-54.

73. Joachim Mueller, Roger A. Aeschbacher, Astrid Wingler, Thomas Boller, and

Andres Wiemken, (2001), “Trehalose and Trehalase in Arabidopsis”, Plant

physiol, 125, 1086-1093

74. Johnson, j. L, (1984), “Nucleic acids in bacterial classification”. In Bergey’s

Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1 (eds. Krieg, N. R. and Holt, J. G.)

Baltimore: Williams &Wilkins. 8-9.

75. Jones, A. L., and Schnabel, E. L. (2000), “The development of streptomycin-

resistant strains of Erwinia amylovora”, in: Fire Blight: the Disease and its

Causative Agent Erwinia amylovora. J. Vanneste, ed. CAB International, 235-

251.

76. Jones, A. L., Norelli, J. L., and Ehret, G. R. (1991), “Detection of

streptomycin-resistant Pseudomonas syringae pv. papulans in Michigan apple

orchards”, Plant Dis. 75, 529-531.

77. Jongsik Chun, Seung .B.K, Youn Kyung Oh, Goodfellow.M, (1999),

“Amycolatopsis thermoflava sp.nov, a novel soil actinomycete from Hainan

Island, China”, Int .J. Syst.. Bacteriol. 49, 1369-1373.

78. K. Adinarayana, T. Prabhakar, V. Srinivasulu, M. Anitha Rao, P. Jhansi

Lakshmi, P. Ellaiah, ( 2003), “Optimization of process parameters for

cephalosporin C production under solid state fermentation from Acremonium

chrysogenum”, Proc Biochem 39, 171-177

79. Kameda, Y., Horii, S., Yamoto T, (1975), “Microbial transformation of

163

validamycin”, J. Antibiot, 28, 298-306.

80. Kim, S. B and M. Goodfellow, (2003), “Streptomyces avermitilis sp. nov.,

nom. rev., a taxonomic home for the avermectin-producing Streptomycetes”, J.

Antim Agents Chemother, 47(5), 1496-1502.

81. Kimura, M. (1980), “A simple method for estimating evolutionary rates of base

substitutions through comparative studies of nucleotide sequences”, J. Mol.

Evol. 16:111–120.

82. Klein. P. H (1993), "Microbiology", Chapter 16, Second edition, 383-396.

83. Komagata, k., and Suzuki K. (1987), “Lipid and cell wall analysis in bacterial

systematic”, Methods Microbiol, 19, 161-207.

84. Laatsch H., (2003), AntiBase: A Natural Products Database for Rapid Structure

Determination, Chemical Concepts,Weinheim.

see Internet http://www.gwdg.de/ucoc/laatsch/

85. Lane, D. J, (1991), “16S/23S rRNA sequencing”, In Nucleic Acid Techniques

in Bacterial Systematics, Ed. By Stackebrandt, E. and Goodfellow, M., John

Wiley & Sons, Chichestep, 115-175.

86. Laszlo Vertesy, W. Aretz, E. Ehlers, S. Hawser, D. Isert, M. Knautf, M. Kurz,

M. Schiell, M. Vogel, J. Wink, (1998), “3874, H1 and H3, Novel Antifungal

Heptaene Antibiotics produced by Streptomyces sp. HAG 003874”, J. Antibiot.

51, (10), 921-928.

87. Lee J.Y, Moon. S.S, Hwang BK, (2003), “Isolation and Antifungal and

Antioomycete Activities of Aerugine Produced by Pseudomonas fluorescens

strain MM B16”, Appl. Environ. Microbiol, 69(4), 2023-2031.

88. Lee, M.C., Kojima, J., Demain, A.L., (1997), “Effect of nitrogen source on

biosynthesis of rapamycin by Streptomyces hygroscopicus”, J. Ind. Microbiol.

Biotechnol, 19, 83–86.

89. Levy, S. B. (1998), “The challenge of antibiotic resistance”, Sci. Am. 278, 46-

164

53.

90. Levy, S. B. (1992), The Antibiotic Paradox: How Miracle Drugs are

Destroying the Miracle, Plenum Press, New York.

91. Lechevalier. M.P, C.D. Bievre, H.A. Lechevalier, (1977), “Chemotaxonomy of

aerobic Actinomycetes: phospholipid composition”, Int.J.Sys.Bact, 20, 435-

443.

92. Lechevalier M.P., H.A. Lechevalier, (1970), Chemical composition as a

criterion in the classification of aerobic actinomycetes, Int. J. Syst. Bacteriol.

20435–443.

93. Lechevalier H.A, S.T. Williams, M.E. Sharpe, J.G. Holt, (1989), “The

Actinomycetes: A practical guide to genetic identification of actinomycetes”,

in: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2344–3330.

94. Lieberman, P. B., and Wootan, M. G. 1998. Protecting the crown jewels of

medicine: A strategic plant to preserve the effectiveness of antibiotics. Online.

Center for Science in the Public Interest Documents Library Reports.

95. Lilia F.B.F, Serge.F, Raoudha. B. A.M, (2005), “Purification and structure

elucidation of antifungal and antibacterial activities of newly isolated

Streptomyces sp. strain US80”, Res Microbiol, 156, 341–347.

96. Manulis, S., Zutra, D., Kleitman, F., David, I., and Zilberstaine, M. (1999),

“Streptomycin resistance of Erwinia amylovora in Israel and occurrence of fire

blight in pear orchards in the autumn”, Acta Hortic. 489, 85-87.

97. Maria Cruz Martin, Angel Manteca, Marin Luisa Castillo, Fernando Va´zquez,

and Francisco Javier Me´ndez, (2004), “Streptomyces albus isolated from a

Human Actinomycetoma and Characterized by Molecular Techniques”, J.

Clin.Microbiol , 42, (12), 5957–5960.

98. Martin, J. F., and L E. McDaniel, (1975), “Kinetics of biosynthesis of polyene

macrolide antibiotics in batch cultures: cell maturation time", Biotechnol.

165

Bioeng. 17:925-938.

99. Martin .J.F, A.L. Demain (1980), “Control of antibiotics synthesis”, Microbiol

Rev, 44(2): 230–251

100. Matsuura, K, (1983), “Characteristics of validamycin A in controlling

Rhizoctonia diseases”, Pesticid .Chemi; Human Welfare and the Environment,

Pergamon Press, Oxford, 2, 301-308.

101. McDevitt D, Rosenberg M, (2001), “Exploiting genomics to discover new

antibiotics”, Trends. Microbiol, 9,611–617.

102. Mehling. A, F. Wehmeir, W. Piepersberg, (1995), “Nucleotide sequences of

Streptomycete 16S ribosomal DNA: Towards a specific identification system

for Streptomycetes using PCR”, Microbiology, 141, 2139–2147.

103. Mierzwa, R., J.A. Merquez, M. Patel, R. Cooper, (1989), “HPLC detection

method for microbial products in fermentation broth”, J. Chromatogr.

Labrary. 43, Elsevier, New York, 55-110.

104. Miller, P C H, Walklate, P. J, (2000), “The assessment of agricultural sprayer

performance in field and wind tunnel conditions”, American Society of

Agricultural Engineers Annual International Meeting, Milwaukee, Wisconsin,

102

105. Miller, P C H; Lane, A. G, Wheeler. H C, (2000), “Matching the application of

fungicides to crop canopy characteristics”, Proceedings, Brighton Crop

Protection Conference – Pests and Diseases, 629-636.

106. Minas W, Bailey JE, Duetz WA., (2000), “Streptomyces in micro-cultures:

growth, production of secondary metabolites, and storage and retrieval in 96-

well format”. Antoine van Leeuwenhoek;78,297–305.

107. Miyadoh. S , (1993), Research on antibiotic screening in Japan over the last

decade:Aproducing microorganisms approach, Actinomycetologica, 100–106.

108. Miyadoh S. (2001), Identification manual of Actinomycetes, Business Center

166

for Academic Societies Japan.

109. Moller, W. J., Schroth, M. N., and Thomson, S. V, (1981), “The scenario of

fire blight and streptomycin resistance”, Plant Dis, 65, 563-568.

110. Mostapha. N. K, (2004), “Biological control of Rhizoctonia solani, the causal

agent of rice sheath blight by antagonistic Bacteria in green-house and field

condition”, J. Plant Pathol, 3(2), 88-96.

111. National Agricultural Statistics Service. (1997), Agricultural Chemical Usage,

No. 96172. U.S. Dept. Agriculture.

112. National Commitee For Clinical Laboratory Standards (NCCLS), (2002),

Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of

Yeasts: approved standard, 2nd ed., Villanova, p. 1-30.

113. Newman D.J, Cragg G.M, Snader K.M, (2003), “Natural products as sources of

new drugs over the period”, J Nat Prod, 66, 1022–1037.

114. Nonomura. H (1974), “ Key for classification and identification of 458 species

of Streptomyces included in ISP”, J. Ferment Technol, 52 (2), 78-92.

115. Norimasa Tamehiro, Takeshi Hosaka, Jun Xu, Haifeng Hu, Noboru Otake, and

Kozo Ochi, (2003), “Innovative Approach for Improvement of an Antibiotic-

Overproducing Industrial Strain of Streptomyces albus”, Appl.Environ

Microbiol, 69(11), 321-327.

116. NHMRC. (2001), "Antibiotic in Agronomy and Horticulture",

nhmre.webmaster@heath.gov.an.

117. Ochi, K., Okamoto, S., Tozawa, Y., Inaoka, T., Hosaka, T., Xu, J. and

Kurosawa, K, (2004), “Ribosome Engineering and Secondary Metabolite

Production”, Adv Appl Microbiol, Academic Press, Review.

118. Oerke, E.C., H. Dehne, F. Schohnbeck, and A. Weber, (1995), Crop

Production and Crop Protection: Estimated Losses in Major Food and Cash

Crops, Amsterdam: Elsevier, 67-90.

119. Òmura S, Y.Tanaka, (1986), Macrolide antibiotics, In: Biotechnology, Rehm,

167

H.J. Reed G.Coord V.C.H. Verlasgesellschaft Weinhiem, 4, 291-358.

120. Ohno A, Ano T, Shoda M., (1993), “Production of antifungal peptide

antibiotic, iturin by Bacillus subtilis NB22 in solid state fermentation”, J

Ferment. Bioeng,75,23–7.

121. Ou.S.H, (1995), Rice diseases, second edi, 109-185.

122. Pathak, P. K. and G.S. Dhaliwal, (1981), “Trend and Strategies for Rice Pest

Problems in Tropical Asia IRRI”, Res. Pap. Ser, 64.

123. Patricia S. McManus, Virginia O. Stockwell, George W. Sundin, Alan L.

Jones, (2002), “Antibiotic use in plant agriculture”, Ann. Rev.Phytopathol, 40,

443-465

124. Paul Singleton, Diana, (1999), Dictionary of Microbiology and Molecular

Biology, second edi, Sainburg, John Willey & Son.

125. Porter. N, (1995), “Culture conditional for antibiotic-producing

microorganisms”, Methods in enzymol, XVIII, 3-23.

126. Powers JH, (2003), Development of drugs for antimicrobial-resistant

pathogens. Curr. Opin. Infect. Dis;16:547-51.

127. Pridham, T. G. & Tresner, H. G. (1974a). Family VII. Streptomycetaceae

Waksmanand Henrici1943. InBergey’sManual of Determinative Bacteriology,

8th edn, pp. 747–748. Edited by R. E. Buchanan & N. E. Gibbons. Baltimore:

Williams &Wilkins.

128. Pridham, T. G. & Tresner, H. G. (1974b). Genus I. Streptomyces Waksman and

Henrici 1943, 339. In Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th

edn, pp. 748–829. Edited by R. E. Buchanan & N. E. Gibbons. Baltimore:

Williams & Wilkins.

129. Program and Abstracts of the 33rd Annual Interscience Conference on

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, New Orleans (LA), October 17-20,

168

(1993) Washington (DC): American Society for Microbiology

130. Puhalla J.E (1985), Classification of strains of Fusarium oxysporum on the

basis of vegetatative compatibility, Australian Centre for International

Agricultural Research (ACIAR), 24, 135-45.

131. Rachev. R, V. Gesheva, T. Tewfike, S. Bojkova and R. Zvetkova, (2003), “A

new antibiotic, TH818, and its properties”, Biotechnol. Appl. Biochem, 37, 21-

132. Respiromycin A1, A2, B, C and D, (1993), “a novel group of anthracycline

antibiotic”, J. Antibiot, 46, 936 - 951.

133. Results of fungicide field trials, (1997), Japan Plant Protection Association,

Tokyo, Japan.

134. Robert D. Nolan, Thomas C, (1988), “Isolation and Screening of

Actinomycetes”, In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, London.

135. Robert W. Bauman (2004), International Edition Microbiology, published by

Pearson Benjamin, San Francisco.

136. Robson G.D, Kuln P.J, Trinci A.P.J (1989), "Effect of validamycin A on the

production of cellulose, xylanase and polygalacturonase by Rhizoctonia

solani", J. Gen. Microbiol, 135, 2709 - 2715.

137. Roger Y. Stanier, Ingraham J. L, Wheelis M. L, Painter P. R (1995), General

Microbiology, published by The Macmillan Press Ltd.

138. Rola, A. C. and D. A. Widawsky. (1998), “Pests, pesticides, and integrated pest

management in rice”, In Impact of rice research, Proceedings of the

International Conference on the Impact of Rice Research, Bangkok, Thailand,

135-158.

139. Ronald M.Atlas (1995), Microorganism in our World, published by Mosby-

Year Book, Inc.

140. Rong-Yang Wu, Ming-Ho Chen, (1995), “Identification of the Streptomyces

169

strains KS3-5”, Bot. Bull. Acad. Sin, 36, 201-205

141. Saad, A. T., Hanna, L. , and Choueiri. E, (2000), “Evaluation of streptomycin

and oxytetracycline resistance of Erwinia amylovora populations in Lebanon”,

Phytopathology, 90, 68 (Abstr.)

142. Saddler,G. S.,Goodfellow,M.,Minnikin,D. E.&O’Donnell,A. G. (1986).

“Influence of the growth cycle on the fatty acid and menaquinone composition

of Streptomyces cyaneus NCIB 9616”, J. Appl. Bacteriol., 60, 51–56.

143. Saddler,G. S.,O’Donnell,A. G.,Goodfellow,M.&Minnikin,D. E. (1987).

“SIMCA pattern recognition in the analysis of streptomycete fatty acids”, J

Gen. Microbiol, 133, 1137–1147.

144. Saito, H., and K. Mura, (1963), “Preparation of transforming deoxyribonucleic

acid by phenol treatment”, Biochem. Biophy. Act, 72, 619-629.

145. Saitou, N& Nei, M (1987), “The neighbor-joining method: a new method for

constructing phylogenetic trees”, Mol. Biol. Evol, 4, 406-425.

146. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (1989), Molecular cloning, Cold Spring

Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

147. Sanger F.,S.Nicklen,R.Coulson, (1977), DNA sequencing with chain

terminating inhibitors, Proc. Natl.Acad.Sci., 745463–5467.

148. Schleifer, K. H. and Kandler, O. (1972), “Peptidoglycan types of bacterial cell

wall and their taxonomic implications”, Bacteriol. Rev, 36, 407-477.

149. Severin. V, Constantinescu. F, and Jianu. F, (1999), “Appearance, expansion,

and chemical control of fire blight (Erwinia amylovora) in Romania”, Acta

Hortic, 13, 79-84.

150. Sezaki M, Miyadoh S, (2001), “Practically used Antibiotics and their related

substances”, In Identification Manual of Actinomycetes, Japan.

151. Shaw. K. J, Rather, P. N, Hare. R. S, and Miller G. H, (1993), “Molecular

genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationship of the

170

aminoglycoside-modifying enzymes ”, Microbiol. Rev, 57, 138-163.

152. Shen, V. Ch. (1992), “Development and application of agricultural antibiotic

Jingangmicin in China”, FAO regional consultation on biological control of

plant diseases, Hangzhau, China.

153. Sheo B. Singh, John F. Barrett, (2006), “Empirical antibacterial drug discovery

- Foundation in natural products, Natural Products Chemistry”, Biochemi

pharmacol xxx, 1-10.

154. Sherling. E. B, Gootlieb. D (1966), “Method for characterization of

Streptomyces species”, Int, J. Syst. Bacterol, 16, 313-350.

155. Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E. and Holt, J. G. (1986), Bergey’s

Manual of Systematic Bacteriology 2. Baltimore: Williams & Wilkins.

156. Sneh, B., Burpee, L., and Ogoshi, A. (1991), Identification of Rhizoctonia

species, APS Press, St. Paul, MN, USA, 133-140.

157. Sneh, B., Jabaji-Hare, S., Neate, S. and Dijst, G, (1996), “Rhizoctonia species:

Taxonomy, Molecular Biology, Ecology”, J. Pathol.Control, Kluwer

Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 578.

158. Stackebrandt, E., Liesack, W. & Witt, D. (1992), “Ribosomal RNA and rDNA

sequence analyses’, Gene, 115, 255–260.

159. Stackebrandt, E. and Liesack, W. O’Donnell, A. G, (1993), Nucleic acid and

classification. London: Academic press, 195-250.

160. Stall, R. E., and Thayer, P. L. (1962), “Streptomycin resistance of the bacterial

spot pathogen and control with streptomycin”, J. Plant Dis. Rep. 46, 389-392.

161. Staneck, J. L., and G. D. Roberts. (1974), “Simplified approach to

identification of coryneform bacteria with LL-diaminopimelic acid in the cell

wall”, J. Gen. Microbiol, 29, 59-71.

162. Suzuki, Y., Nagata, A., Ono, Y., and Yamada, T. (1988), Molecular cloning

and characterization of an rRNA operon in Streptomyces lividans TK21. J.

171

Bacteriol. 170:2886-2889.

163. Suzuki. K., Goodfellow. M, (1993), “Cell envelopes and classification”, In

Handbook of new Bacterial Systematics (eds. Goodfelow, M. and O’Donnell,

A. G.). London: Academic Press, 195-250.

164. Swofford, D. L , (1998), Phylogenetic Analysis Parimony, version 4.0,

Smithsonian Istitution, Washington DC.

165. Swofford, D. L. & Olsen, G. J. (1990), Phylogenetic reconstruction In

Molecular Systematics, Edited by D.Hillis&C.Moritz.Sunderland,

MA:SinauerAssociates, pp. 411–501.

166. Takeuchi, T., Sawada, H., Tanaka, F., and Matsuda, I, (1996), Phylogenetic

analysis of Streptomyces spp. causing potato scab based on 16S rRNA

sequences, Int. J. Syst. Bacteriol, 46,476-479.

167. Tamaoka, J. (1994), Determination of DNA base composition. In Chemical

Methods in Prokaryotic Systematics, Editedby M.Goodfellow &A.

G.O’Donnell. Chichester: Wiley, 463–470.

168. Tanaka Y.T., S.O. Mura, (1993), “Agroactive compounds of microbial origin”

Annu. Rev.Microbiol. 4757–87.

169. Tashiro, N., K. Miyashita, and T. Suzui, (1990), “Taxonomic studies on the

Streptomyces species isolated as causal organisms of potato scab”, Ann.

Phytopathol. Soc. Jpn.56:73–82.

170. Tobias K, Mervyn J.B, Mark J.B, Keith F.C, David A Hopwood, (2000),

Practical Streptomyces Genetics, Norwich, England.

171. Tongchai .K, Phuripun. L, Charan. C, (1995), Antibiotic Production of

Actinomycetes in Forest Termite Soil, 20-40.

172. Tortora, Funke, Case, (2002), Microbiology, published by Benjamin

Cummings, San Francisco.

173. The future role of Pesticides in US Agriculture, (2000), The National Academy

172

of Sciences.

174. The World Antibiotic Market 2002-2009, (2004), Management report,

http://www.biz-lib.com/ZKC78659.html

175. Thomas. R.M, J.A.Turner, (1998), “A review of changes in fungicide use on

winter wheat” in England & Wales 1970 – 1996, 7th International Congress

Plant Pathol. Edinburgh, 45-50.

176. Tresner. H. D, Buckus. E. J (1963), “System of color wheels for Streptomyces

taxonomy”, Appl. Microbiol, 11, 335 - 338.

177. Tresner, H. D, M. C. Davies, and E. Jackus, (1961), “Electron microscopy of

Streptomyces spore morphology and its role in species differentiation.”,

J.Bacteriol.81, 70-80

178. Umezawa, H. (1982), “Trends in antibiotic research and its expanded area:

Antibiotics and low molecular weight immunomodifiers”, Trends in Antibiotic

Research, Japan Antibiotic Research Association, Tokyo, 1-15.

179. Umezawa.H, S.Koudo, (1975), Ion-exchange chromatography of

aminoglycozide antibiotics, methods in enzymology, XVIII, 262-278.

180. USDA National Agricultural Statistics Service, (2000), Agricultural Chemical

Usage Reports (PCU-BB). Online. Agricultural Statistics Board.

181. Waksman, S.A. (1961) The Actinomycetes. Classification, identification and

descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co.,

Baltimore, USA.

182. Weinberg E.D, (1973), Secondary metabolism: Control by temperature and

inorganic photphate, Ind.Microbiol, 15, 1-14.

183. William, S.T., M. Goodfellow, G. Alderson, (1989), “Genus Streptomyces

Waksman and Henrici “, In: Bergey’s manual of systematic bacteriology, IV,

S.T.William, M.E. Sharpe and J.G. Holt, Baltimore: Williams and Wilkins,

2452-2493.

184. Yamaguchi. (1998), "Natural product - derived fungicides as exemplified by

173

the antibiotic", In: Fungicidal Activity, 57-79.

185. Yasunobu Miyamoto and Seiichiro Ogawa, (1992), “Total synthesis of

validamycin H”, J. Carbohyd. Res, 223, 299-301.

186. Yoshiko Okamoto-Hosoya, Susumu Okamoto, and Kozo Ochi, (2003),

“Innovative Approach for Improvement of an Antibiotic-Overproducing

Industrial Strain of Streptomyces albus”, Appl Environ Microbiol, 69(11),

6412–6417.

187. Yuanbo (1992), "Development of biological control of plant diseases in Asia

Pacific region", FAO Regional expert consultation of plant diseases,

Hangzhou, China.

188. Yudelman, M., A.Ratta and D. Nygaard, (1998), Pest Management and Food

Production: Looking to the Future. Food, Agriculture and the Environment

Discussion, International Food Policy, Research Institute, Washington D.C, 25

189. Zang, B.X. (1992),"Biological control of plant diseases in Asia - Pacific

174

region", FAO regional expert consultation of plant diseases, Hangzhou, China.