Luận án Tiến sỹ Hóa học: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

BÙI VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

BÙI VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 9440117

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Bùi Minh Lý

2. PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng

dẫn của PGS.TS. Bùi Minh Lý và PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến, có tham khảo

thêm các tài liệu đáng tin cậy, có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu, kết quả trong luận

án là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận án này.

Tác giả luận án

Bùi Văn Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS.

Bùi Minh Lý và PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến, những người thầy bằng cả tâm

huyết của mình đã hướng dẫn tôi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên

cứu và chia sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi làm luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS. TS. Phạm Quốc Long - Viện trưởng Viện Hóa

học các Hợp chất thiên nhiên, cùng ban lãnh đạo Viện, bộ phận đào tạo của Viện đã

tạo điều kiện rất nhiều cho tôi hoàn thành luận án của mình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị phụ trách của Học Viện

Khoa học Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án của mình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới UBND tỉnh Khánh Hòa, ban giám hiệu trường

Đại học Khánh Hòa, Khoa KHTN và Công nghệ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để

tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo viện, các nhà khoa học, anh chị em và bạn

bè đang công tác tại Viện Nghiên cứu Ứng dụng và Công nghệ Nha Trang, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi

làm thực nghiệm và luôn động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các nhà khoa học trong nhóm nghiên cứu

PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân, PGS.TS. Thành Thị Thu Thủy, GS.TSKH.

Anatolii I. Usov và PGS.TS. Yoshiaki Yuguchi đã tạo điều kiện giúp đỡ và hướng

dẫn tôi trong quá trình hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các đề tài hợp tác quốc tế với Liên Bang Nga mã

số VAST.HTQT.Nga.02.15-16 và VAST.HTQT.Nga.06.13-14, với Nhật Bản mã

số VAST.HTQT.NHATBAN.02.13-15 đã tài trợ kinh phí giúp hoàn thành luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Như Hậu, Viện Nghiên cứu Ứng dụng và

Công nghệ Nha Trang đã giúp đở tôi trong quá trình thu thập mẫu rong nâu và

giám định tên khoa học.

Tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn

động viên tôi hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này.

Xin chân thành cảm ơn!

Tác giả Bùi Văn Nguyên

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ ii

MỤC LỤC .............................................................................................................iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................... vii

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .............................................................................. xi

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 4

1.1. Tổng quan về rong nâu ............................................................................ 4

1.1.1. Giới thiệu về rong biển ................................................................... 4

1.1.2. Giới thiệu về Rong Nâu .................................................................. 7

1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới ................................. 7

1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam ..................................... 9

1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu ................................................... 14

1.1.3.1. Polysaccharide .............................................................................. 14

1.1.3.2. Hợp chất phenolic ......................................................................... 19

1.1.3.3. Hợp chất carotenoid ...................................................................... 21

1.1.3.4. Hợp chất Terpenoid ...................................................................... 22

1.1.3.5. Các hợp chát khác ......................................................................... 25

1.2. Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan) ................................. 26

1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan ............................................................ 26

1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu ........ 26

1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan .......................................................... 28

1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan ........................................................... 29

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan .................................. 30

1.2.5.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối ........................ 30

1.2.5.2. Hoạt tính chống virus .................................................................... 32

1.2.5.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch ....................................... 33

1.2.5.4. Hoạt tính chống oxy hóa................................................................ 35

1.2.5.5. Giảm lipid máu ............................................................................. 36

1.2.5.6. Kháng viêm ................................................................................ 36

1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan .......................................................... 37

1.2.5.8. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................ 37

1.2.5.9. Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu. ............................ 37

1.2.5.10. Các ứng dụng của fucoidan......................................................... 38

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội

dung nghiên cứu của luận án .......................................................................... 39

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 39

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................................... 44

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 49

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 49

2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 50

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan............................... 51

2.2.1.1. Phương pháp tách chiết fucoidan .................................................. 51

2.2.1.2. Phương pháp phân đoạn fucoidan ................................................. 51

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan .............................. 51

2.2.2.1. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .......................... 51

2.2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ..................................... 53

2.2.2.3. Phương pháp phổ IR ..................................................................... 53

2.2.2.4. Phương pháp phổ NMR ................................................................. 54

2.2.2.5. Phương pháp phổ MS .................................................................... 59

2.2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) .................................... 64

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ................................................. 66

2.2.3.1. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro............ 66

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế

bào ung thư trên thạch mềm ....................................................................... 68

2.2.3.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu ................. 68

Chương 3. THỰC NGHIỆM ............................................................................... 70

3.1. Thu thập và xử lý rong ............................................................................. 70

3.2. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu .......................................... 71

3.3. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan ....................................... 77

3.3.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate ........................................... 77

3.3.2. Xác định thành phần monosaccharide .............................................. 77

3.3.3. Xác định hàm lượng sulfate ............................................................... 78

3.3.4. Phương pháp khử sulfate ................................................................... 78

3.3.5. Xác định hàm lượng axít uronic ........................................................ 78

3.3.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa ................................................... 79

3.3.7. Thủy phân tạo oligosaccharide .......................................................... 79

3.3.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) .............................................................. 79

3.3.9. Phổ IR ................................................................................................. 80

3.3.10. Phổ NMR .......................................................................................... 80

3.3.11. Phổ ESI-MS/MS ............................................................................... 80

3.3.12. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) ..................................... 80

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học ...................................................................... 81

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào .................................................................... 81

3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch

mềm .............................................................................................................. 82

3.4.3. Thử nghiệm hoạt tính chống đông tụ máu ........................................ 83

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 85

4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan .......................... 85

4.2. Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06

loài rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các

fucoidan thu được. ........................................................................................... 86

4.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S.

binderi và S. duplicatum ................................................................................ 90

4.3.1. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi ................. 90

4.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum .......... 92

4.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong

nâu Sargassum aquifolium .............................................................................. 96

4.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan ........................................................ 96

4.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan ...................................................... 100

4.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation) ...................................... 100

4.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA ....... 101

4.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis) .......... 104

4.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion .............................. 106

4.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3 .................................. 107

4.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4 ................................................ 111

4.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6 ................................................ 115

4.4.2.8. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5 ................................................ 117

4.4.2.9. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M

bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS ..... 117

4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học ............................................................. 124

4.4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................. 124

4.4.3.2. Hoạt tính chống khối u in vitro .................................................... 124

4.4.3.3. Hoạt tính chống đông tụ máu ...................................................... 126

4.5. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân

lập từ rong nâu Turbinaria decurrens.......................................................... 131

4.5.1. Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ

rong nâu Turbinaria decurrens. ............................................................... 131

4.5.2. Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria

decurrens. ....................................................................................................... 135

4.5.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M .......................... 142

4.6. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong

nâu Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào ... 144

4.6.1. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương

pháp tán xạ tia X góc nhỏ .......................................................................... 144

4.6.2. Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt

tính gây đốc tế bào. .................................................................................... 151

KẾT LUẬN ........................................................................................................ 156

KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 159

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............. 160

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 162

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Các phương pháp sắc ký CC GC GC-MS

Sắc ký cột thường Sắc ký khí Sắc ký khí - Phổ khối

GLC GPC HPLC Sắc ký khí, pha tĩnh lỏng Sắc ký lọc gel Sắc ký lỏng cao áp

LC-MS

GC - FID Sắc ký lỏng cao áp - Phổ khối Sắc ký khí – Đầu dò ion

Column Chromatography Gas Chromatography Gas Chromatography - Mass Spectrometry Gas Liquid Chromatography Gel permeation chromatography High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography - Mass Spectrometry Gas Chromatography – Flame Ionization Detector hóa ngọn lửa

Các phương pháp phổ 13C-NMR 1H-NMR COSY Carbon-13 NMR Spectroscopy Proton NMR Spectroscopy Correlation Spectroscopy

ESI-MS

HMBC

ESI-MS

HSQC

Phổ CHTHN carbon 13 Phổ CHTHN proton Phổ tương tác hai chiều 1H- 1H Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết Phổ hồng ngoại Phổ khối MALDI-TOF/MS IR MALDI- TOF/MS

NMR Electron Spray Ionization Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence Infrared Spectroscopy Time-of-flight mass spectrometry with matrix-assisted laser desorption/ionization Nuclear Magnetic Resonance

NOESY Cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) Phổ NOESY

Rgc Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Radius of gyration

Small-angle X-ray Scattering Total correlation spectroscopy Bán kính hồi chuyển, bán kính quay Tán xạ tia X góc nhỏ Phổ tương tác toàn phần

SAXS TOCSY

viii

Hoạt tính sinh học APTT

CS Hep-G2 HIV Cell Survival, Cell Viability Human hepatocellular carcinoma Human immunodeficiency virus

IC50 Inhibitory Concentration 50%

Activated Partial Thromboplastin Time Xét nghiệm APTT đánh giá chức năng đông máu Tế bào sống sót Ung thư gan ở người Virus gây suy giảm miễn dịch ở người Nồng độ ức chế 50% tăng trưởng của đối tượng thử Ung thư biểu mô phổi Ung thư mô liên kết Human lung adenocarcinoma Human Rhabdomyosarcoma

Fucose Fucofuranose Fucopyranose Galactose Glucose Glucuronic Acid Mannose Xylose Đường fucose Fucofuranose Fucopyranose Đường galactose Đường glucose Axit glucuronic Đường mannose Đường xylose

LU-1 RD Monosaccharide Fuc Fucf Fucp Gal Gluc GlucA Man Xyl Hóa chất Cetavlon Hexadecyl trimethyl ammonium bromid

Hexadecyltrimethylammonium bromide, Cetrimonium bromide Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Ethanol Methanol Trifluoroacetic acid Dimethylsulfoxid Ethyl acetat Ethanol Methanol Axit trifluoroacetic

DMSO EtOAc EtOH MeOH TFA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần loài và phân bố rong nâu Khánh Hòa ................................. 12

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan .............................................. 27

Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lượng phân tử của fucoidan ........................................ 30

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu .................... 39

Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại ..................... 54

Bảng 2.2. Độ dịch chuyển hóa học của C và H trong một số gốc đường ................ 56

Bảng 2.3: Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate .................. 61

ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm ................................................. 61

Bảng 2.4. Fucoidan phân đoạn SmF3 của rong S. mcclurei ................................... 62

Bảng 2.5. Thông số  đối với một số dạng cấu trúc polymer ................................. 65

Bảng 4.1. Thành phần polysaccharid tan trong nước từ một số loài rong nâu (% trên

trọng lượng rong khô) ............................................................................................ 87

Bảng 4.2. Thành phần hóa học của các fucoidan phân lập được từ 06 loài rong nâu

thu ở Nha Trang. ................................................................................................... 88

Bảng 4.3. Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ Sargassum binderi 91

Bảng 4.4. Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ S. duplicatum ........ 93

Bảng 4.5. Hiệu suất và thành phần (%) của FSA và các phân đoạn fucoidan thu

được sau sắc ký trao đổi anion. .............................................................................. 98

Bảng 4.6. Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-deS

so sánh với fucoidan mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M). .......................... 101

Bảng 4.7. Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa ......................................... 104

Bảng 4.8. Hiệu suất và thành phần (%) của các phân đoạn tách 1,0M-deS trên cột

sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ của chúng. ................................... 107

Bảng 4.9. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-2 ( = ppm, ký hiệu của các

gốc đường xem Hình 4.16). ................................................................................. 109

Bảng 4.10. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-4 ..................................... 114

Bảng 4.11. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-6 ..................................... 116

Bảng 4.12. Kết quả phân tích methyl hóa FSA-1,5M và 1,5M-deS. ..................... 118

Bảng 4.13. Tỉ lệ sống sót của các tế bào ung thư khi có mặt các phân đoạn fucoidan

từ FSA. ................................................................................................................ 124

Bảng 4.14. Tác dụng của chất thử tới kích thước trung bình và mật độ của các quần

thể tế bào ............................................................................................................. 125

Bảng 4.15: Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong

Turbinaria decurrens........................................................................................... 135

Bảng 4.16. Kết quả thử nghiệm tác dụng chống khối u của FTD-2,0N trên tế bào

ung thư gan Hep-G2 ............................................................................................ 142

Bảng 4.17. Hiệu suất, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu

fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam. ................................................... 146

Bảng 4.18. Bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc ước lượng từ đồ thị Guinier

của các mẫu fucoidan đo trong NaCl 0,5M.. ........................................................ 149

Bảng 4.19. Hoạt tính độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư

gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. .............................................................. 152

Bảng 4.20. Liên hệ giữa hoạt tính với KLPT trung bình của các mẫu fucoidan .... 153

Bảng 4.21. Liên hệ giữa hoạt tính với hàm lượng sulfat và tỉ lệ sulfat/đường của các

mẫu fucoidan. ...................................................................................................... 153

Bảng 4.22. Liên hệ giữa hoạt tính với bán kính hồi chuyển Rgc của các mẫu

fucoidan. ............................................................................................................. 154

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh

Hòa........................................................................................................................ 11

Hình.1.2. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan đặc trưng tách và phân lập từ rong

nâu ........................................................................................................................ 46

Hình 2.1. Hình dạng rong Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens............ 50

Hình 2.2. Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysaccharide. 52

Hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ion hóa ESI-MS ................................ 59

Hình 2.4. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate ...................................................... 60

Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate ...................................................... 61

Hình 2.6. Cơ chế phân mảnh oligosacaride với sự có mặt của ion kim loại ............ 62

Hình 2.7. Phổ MS và cơ chế phân mảnh của fucoidan ........................................... 62

Hình 3.1. Vị trí địa lý nơi thu thập mẫu rong nâu và ảnh rong Sargassum aquifolium

.............................................................................................................................. 70

Hình 3.2. Rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens ..................... 71

Hình 3.3. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum

aquifolium ............................................................................................................. 73

Hình 3.4. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens

.............................................................................................................................. 74

Hình 3.5. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu Sargassum

polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso),

Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto)

.............................................................................................................................. 75

Hình 3.6. Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) ....... 76

Hình 4.1. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium ........... 86

Hình 4.2. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens ............. 86

Hình 4.3. Tách các phân đoạn của fucoidan từ S.binderi trên cột DEAE-Cellulose 90

Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của fucoidan phân đoạn F2 từ rong Sargassum binderi .. 92

Hình 4.5. Phân đoạn của fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum ................ 93

Hình 4.6. Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum

.............................................................................................................................. 94

xii

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của fucoidan FSDu chiết từ rong nâu S. duplicatum ......... 94

Hình 4.8. Sơ đồ chiết xuất, phân lập và chuyển hóa các fucoidan của S. aquifolium

.............................................................................................................................. 97

Hình 4.9. Sắc ký đồ GPC của fucoidan FSA từ rong nâu Sargassum aquifolium ... 99

Hình 4.10. Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium .......... 99

Hình 4.11. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-2,0M ........................................... 102

Hình 4.12. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,5M ........................................... 103

Hình 4.13. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,0M ........................................... 103

Hình 4.14. Sắc ký đồ của 1.0M-deS trên cột trao đổi anion DEAE-Sephacel. ...... 106

Hình 4.15. Một phần của phổ HSQC của deS-2 ................................................... 108

Hình 4.16. Các mảnh cấu trúc của fucoidan desulfat hóa deS-2 (các gốc đường đều

ở dạng pyranose). ................................................................................................ 108

Hình 4.17. Một phần của phổ HMBC của deS-2 ................................................. 110

Hình 4.18. Phổ HSQC của deS-4 ......................................................................... 112

Hình 4.19. Một phần của phổ HMBC của deS-4 .................................................. 112

Hình 4.20. Mảnh cấu trúc của deS-4 .................................................................... 114

Hình 4.21. Phổ HSQC của deS-6 ......................................................................... 115

Hình 4.22. Một phần của phổ HMBC của deS-6 .................................................. 115

Hình 4.23. Mảnh cấu trúc của deS-6 .................................................................... 116

Hình 4.24. Phổ ESI-MS của FSA-1,5M trong vùng m/z 320 đến m/z 610 ........... 120

Hình 4.25. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]- với m/z 243 .................................. 121

Hình 4.26. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- với m/z 389 ................................ 122

Hình 4.27. Phổ ESIMS/MS thức âm của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) .................. 123

Hình 4.28. Hình ảnh dưới kính hiển vi ngược của các quần thể tế bào Hep-G2 nuôi

cấy trên thạch mềm dưới tác dụng của cácchất thử .............................................. 126

Hình 4.29. Hoạt tính chống đông máu của các fucoidan từ S. aliqualium đo được

bằng phương pháp APTT..................................................................................... 127

Hình 4.30. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn các fucoidan từ rong nâu Turbinaria

decurrens ............................................................................................................ 132

Hình 4.31. Sắc ký đồ của GPC của fucoidan FTD từ rong nâu Turbinaria decurrens

............................................................................................................................ 133

xiii

Hình 4.32. Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens .......... 134

Hình 4.33. Phổ IR của FTD-2,0N ........................................................................ 135

Hình 4.34. Các đoạn trích từ phổ 1H-NMR của FTD-2,0N .................................. 136

Hình 4.35. Các đoạn trích từ phổ 13C-NMR của FTD-2,0N ................................ 137

Hình 4.36. Một đoạn trích từ phổ HSQC của FTD-2,0N ...................................... 138

Hình 4.37. Một đoạn trích từ phổ HMBC của FTD-2,0N ..................................... 138

Hình 4.38. Phổ ESI-MS/MS của ion [FucSO3]- (m/z 243) ................................... 139

Hình 4.39 : Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) ............................. 140

Hình 4.40. Sơ đồ phân mảnh của Fucoidan FTD-2,0N ......................................... 141

Hình 4.41. Hình ảnh hiển vi của các khối u dưới tác dụng của chất thử ............... 142

Hình 4.42. Vùng tán xạ góc nhỏ so sánh với vùng góc lớn thường được dùng trong

các phương pháp phân tích nhiễu xạ (diffraction analysis). .................................. 144

Hình 4.43. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo tán xạ tia X góc nhỏ ....................... 145

Hình 4.44. Đồ thị Kratky cho các kết quả đo SAXS của 6 mẫu fucoidan trong nước

và trong dung dịch NaCl 0,5M............................................................................. 147

Hình 4.45. Đồ thị Kratky cho tất cả các kết quả đo tán xạ tia X góc nhỏ của 6 mẫu

fucoidan trong nước............................................................................................. 148

Hình 4.46. Đồ thị Guinier của mặt cắt ngang cho các kết quả đo tán xạ tia X góc

nhỏ của 6 mẫu fucoidan trong dung dịch NaCl 0,5M trong nước. ........................ 149

Hình 4.47: Cấu trúc dựa trên các dữ kiện hóa học và phổ được đề xuất cho Fto bởi

Thành Thị Thu Thủy và Yuguchi......................................................................... 150

Hình 4.48. Mô hình cấu trúc cho các mạch nhánh của Fto [92]. ........................... 150

Hình 4.49. Đồ thị Kratky của Fto so sánh với các đồ thị lý thuyết ước lượng được từ

4 mô hình cấu trúc trên Hình 4.48 . ...................................................................... 151

MỞ ĐẦU

Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa

dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,…

Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260

km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn

1.000.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong

biển đa dạng và phong phú. Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển đã được

xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục

(Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes). Rong biển có vai

trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển, càng ngày càng được con người khai

thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp...

Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong

biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là nhóm rong có kích

thước cá thể rất lớn và dài cùng với sinh lượng lớn. Do vậy, rong nâu được coi là

nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp,

công nghiệp sản xuất dược liệu, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Trong các

ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng làm nguồn nguyên

liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao

gồm fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,…

với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1,2,3,4,5,6].

Trong số các polysaccharide từ rong nâu, fucoidan là hợp chất được đặc biệt

quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu,

kháng khuẩn, chống virus kể cả HIV, chống ung thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều

biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, các đặc tính chống

bổ thể, chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dạ dày và khả

năng điều trị trong phẫu thuật,… [6]. Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn

gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết

glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với nhau và khả năng

phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate cũng như các nhánh khác được sắp xếp

không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường là

bao gồm chủ yếu fucose và sulfate cùng một số các gốc đường khác như galactose,

glucose, manose, xylose..., đôi khi còn có uronic acid [6,7].

Nhờ vào sự đa dạng cấu trúc hóa học và sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú

vị, sulfated polysaccharide (fucoidan) đã được nghiên cứu mạnh và sâu. Việc giải

thích làm sáng rõ chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là hết sức phức tạp,

fucoidan được tách ra từ rong nâu thường là hỗn hợp của nhiều cấu trúc sulfated

polysaccharide khác nhau. Fucoidan thông thường là có cấu trúc phân nhánh và

chứa nhiều monosaccharide khác nhau cũng như có nhóm sulfate và axtate [7,8].

Fucoidan từ rong nâu thuộc chi Sargassum, Hormophysa và Turbinaria có cấu trúc

hóa học phức tạp [9,10] nhưng lại rất hấp dẫn về hoạt tính cũng như ứng dụng của

chúng và sẵn có trong tự nhiên. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm

xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng chỉ có một vài kết

quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan [10,11,12]

như liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh, vị trí các gốc sulfate, các phân tử

đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn các công trình nghiên cứu về hoạt tính

sinh học được tiến hành trên các sản phẩm fucoidan thô. Vì vậy, mối quan hệ giữa

cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng

tỏ [12,13,14]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế

bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu thì việc xác định

chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là điều quyết định đầu tiên và đang thu hút

sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Chính vì vậy tôi chọn tên đề tài luận

án là “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một

số loài rong nâu Việt Nam”.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là:

Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính

sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt

Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển của Việt Nam

và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu.

Để đạt được mục tiêu trên của luận án, các nội dung nghiên cứu của luận án bao

gồm:

Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu

sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan

Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết

xuất từ một số loài rong nâu chọn lọc.

Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một

số fucoidan chọn lọc.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về rong nâu

1.1.1. Giới thiệu về rong biển

Rong biển hay còn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc

thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản. Rong biển sinh trưởng

phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh

và tạo ra sinh khối lớn [1,4]. Tổng số loài rong biển trên thế giới được báo cáo chủ

yếu thuộc 3 ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài

thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000 loài thuộc ngành rong đỏ

(Rhodophyta) và hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ

sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới.

Tổng số loài rong biển ở Việt Nam ước tính khoảng 1.000 loài, trong đó có

khoảng 639 loài: 151 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc

ngành rong nâu (Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76

loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [1]. Trong tất cả các loài này, 310 loài

phân bố ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc và 484 hiện diện ở các tỉnh phía Nam,

156 loài phân bố ở cả hai vùng [15].

Đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm. Các

nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp,

trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển. Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển

đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật

đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trước. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại,

rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc

hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được

coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên

thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các

nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu. Rong biển cũng được

sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công

nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401

Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan...), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt

hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định),

thức ăn gia súc, nông nghiệp ... Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong

thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến.

Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được

sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là

những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của

một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6

triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD. Các nước và lãnh thổ cung cấp rong

biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước

cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban

Nha, Mỹ và Nhật [16].

Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển

đều là những hợp chất có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Hàm lượng của các

chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trưởng và phát

triển của rong. Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã được nghiên cứu, thành

phần trong rong gồm có : nước chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5%

trọng lượng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino acid thiết yếu,

hàm lượng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu

(fucoxanhthin), các sắc tố xanthophyll khác là violaxanthin, antheraxanthin,

neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lượng (

K, Na, Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn,

Mo,…). Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng được

chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide. Nhóm monosaccharide

gồm các đường đơn như : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó

quan trọng nhất là mannitol. Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được

phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913. Các nghiên

cứu cho thấy hàm lượng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía

Bắc. Hàm lượng mannitol trong rong biển thường cao vào các tháng mùa hè và có

xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong. Quy trình chiết tách

mannitol ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên nguyên tắc : làm lạnh dung dịch

mannitol sau khi đã được chiết bằng cồn nóng để thu được các tinh thể mannitol.

Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên

liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp

thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có

độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [1,2,3,4,5,6]. Nhóm

polysaccharides gồm có : fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan.

Fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các tính chất sinh học

đa dạng và đặc thù của nó như khả năng tăng cường miễn dịch, chống đông tụ máu,

chống viêm nhiễm, kháng virus, điều trị rối loạn đường huyết và hỗ trợ trong điều

trị ung thư. Laminaran đóng vai trò như chất dự trữ trong rong nâu. Laminaran là

chất tạo hệ miễn dịch ở động vật có vú, laminaran sulfate hóa đã được chứng minh

là có đặc tính giống heparin. Laminaran bị hòa tan, nhưng mức độ hòa tan phụ

thuộc vào mức độ phân nhánh, độ phân nhánh càng cao thì mức độ hòa tan càng

cao, do đó nếu độ phân nhánh nhỏ thì chỉ có thể hòa tan trong nước ấm ( 60 –

800C). Laminaran có hoạt tính chống đông tụ máu và chống ung thư. Agar và

alginate được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm : được sử dụng làm

chất ổn định trong bánh kẹo, kem, nước ngọt hay làm chất làm đông đặc và tạo gel

trong sản xuất thịt đông lạnh; trong công nghệ sinh học được dùng làm môi trường

nuôi cấy, trong y học dùng làm vải băng bó vết thương truyền thống, lấy dấu răng,

pha thuốc, pha huyết thanh, trong một số công thức chống chảy máu dạ dày, trong

việc cấy ghép tế bào, tác động vào các tế bào sản xuất insulin để điều trị bệnh tiểu

đường loại 1. Vỏ nang bằng alginate không bị dịch tiêu hóa phân hủy và chỉ tan

trong ruột. Màng được tạo thành từ alginate và gelatin kết hợp với một số chất như

tinh dầu tràm, rau má, nghệ, dầu mù u có tác dụng trong điều trị vết thương như vết

bỏng, làm giảm sự nhiễm khuẩn, làm nhanh lành vết thương; trong công nghiệp

giấy : alginate được trộn lẫn với bột giấy rồi xử lý sẽ cho bề mặt giấy nhẵn, mịn

không xù xì; trong công nghiệp dệt và tơ nhân tạo : alginate cho nhũ tương mịn và

bền nên được dùng trong kỹ nghệ sơn, xà phòng, cao su, phim ảnh, vải lợp nhuộm

vecni và sơn để tăng độ bền của màu. Màu vẽ có alginate dễ tan đều trong nước.

Carrageenan là một ionic polysaccharide, mạch thẳng được sulfate hóa, chúng mang

đầy đủ tính chất đặc trưng của polysaccharide. Carrageenan là polysaccharide có

khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch, chúng tồn tại trong một số loài rong đỏ

thuộc họ Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thường được chiết từ một số loài

rong như Gigartina, Chondrus, Iridea, Eucheuma. Carrageenan tách chiết từ các loài

rong khác nhau có thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc cũng như khả năng tạo

gel khác nhau. Tính chất và khả năng tạo gel của carrageenan phụ thuộc vào độ lặp

lại của các mắt xích, vị trí và số lượng nhóm sulfate và đặc biệt là sự có mặt của

vòng 3,6 anhyđro D – galactose. Cầu 3,6 anhyđro D – galactose cho phép tạo nên

cấu trúc xoắn, là điều kiện chủ yếu để tạo gel của carrageenan. Rong biển còn được

sử dụng để làm thức ăn cho nuôi tôm, thức ăn gia súc, được dùng trong công nghiệp

dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn điện, lọc và hấp thụ các hợp chất, công nghiệp giấy,

trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh. Rong biển cũng là nguồn nguyên liệu cho công

nghiệp nước giải khát, đồ hộp, socola, mỹ phẩm cao cấp. Rong biển cũng được sử

dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các

thuốc khác. Polyphenol trong rong nâu cũng được dùng làm trà chống lão hóa. Năm

2007, tại Mỹ đã có quy trình sản xuất biodiesel từ rong biển. Thực tế còn cho thấy

rong biển có tiềm năng sử dụng trong xử lý nước thải. Một số loài rong biển có khả

năng hấp thụ các ion kim loại nặng như : Zn và Cd từ nước bị ô nhiễm. Do khả năng

hấp thụ cao mà một số vi lượng có trong rong khá cao nên rong được dùng làm thức

ăn bổ sung để phòng bệnh thiếu một số chất như sắt, iod,.. [1,2,3,4,5,6,17,18,19,20]

1.1.2. Giới thiệu về Rong Nâu

Rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4 chi

Sargassum, chi Turbinaria, chi Dictyota, chi Padina, sản lượng tự nhiên cao nhất so

với các nhóm rong biển khác. Đặc biệt chi rong Sargassum, chúng hình thành các

thảm rong biển rộng từ vài hecta cho đến cả vài chục hecta, các chi còn lại mật độ

vừa phải, chúng mọc trên các bãi triều và rạn ngầm có nền đáy đá hoặc san hô.

Chúng phân bố rộng, chiếm ưu thế trong các bãi triều ven biển ở vùng biển nhiệt

đới và cận nhiệt đới. Rong nâu nơi sâu phát triển muộn hơn nơi cạn; sinh lượng cao

vào tháng 3 và kéo dài đến tháng 6. Sự phát triển ở những vùng có nền đáy cứng,

nước trong, sóng mạnh, những bãi triều có độ đốc 5-25% ở đó rong phát triển tốt

nhất [1,2,3,4,5,6].

1.1.2.1. Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới

Việc phân loại tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm

sinh sản, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học...người ta chia rong thành một số

ngành riêng biệt. Con số các ngành rong hiện nay vẫn chưa thống nhất tùy theo các

tác giả khác nhau.

Một trong những tác giả có các công trình nghiên cứu quan trọng về bộ rong

nâu này là J. Agardh. Năm 1820, ông đã lập ra một hệ thống phân loại về chi rong

Mơ và đã mô tả 62 loài. Ông chia chi này thành 7 nhóm và sắp xếp vào một bộ

Fucoideae. Năm 1824, ông bổ sung thêm số lượng lên 67 loài. Sau đó một số tác giả

khác như Greville, Gaudichaud, Montagne… có mô tả thêm loài nhưng vẫn sắp xếp

vào hệ thống J. Agardh. Năm 1889, ông đã bổ sung thêm vào hệ thống phân loại với

nhiều chi, nhóm… trong đó có 180 loài. Hệ thống phân loại của J. Agardh đưa ra

năm 1889 đã được nhiều tác giả đồng tình và sử dụng. Quan trọng nhất là Grunow

(1915-1916), đã triển khai và sử dụng hệ thống phân loại của J. Agardh, mô tả 230

loài với nhiều thứ và dạng trên cơ sở thu mẫu ở nhiều nước trên thế giới. Một số tác

giả khác đã góp phần vào việc nghiên cứu họ này như ở Nhật Bản đã mô tả 41 loài,

45 loài ở vùng biển Ấn Độ.

Đến năm 1931-1936, Setchell nghiên cứu rong biển ở Hồng Kông, Trung

Quốc đã đặc biệt chú ý đến họ Sargassaceae, ông đã mô tả thêm 32 loài. Từ đó đến

nay, nhiều tác giả ở Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Philippin, Úc, Ấn Độ, Mỹ…

đã có nhiều nghiên cứu bổ sung, đã có nhiều hội nghị quốc tế về rong biển kinh tế,

trong đó các loài rong nâu mới cũng được bổ sung, nâng tổng số loài được biết hiện

nay trên thế giới khoảng 1500 loài. Các loài được mô tả và cập nhật bổ sung một

cách đầy đủ trên trang web www.algaebase.org

Như vậy đến thời điểm này rong nâu được phân chia thành 9 bộ, 265 chi và

hơn 1500 loài trong đó số lượng thành phần loài một số chi rong nâu trên thế giới

như:

Chi Sargassum C.Agardh, 1820. thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng

873 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhưng trong đó 562 loài được

chấp nhận sự phân loại Chi Turbinaria J.V.Lamouroux, 1825. thuộc họ

Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng 53 tên loài trong cơ sở dữ liệu

www.algaebase.org, nhưng trong đó 28 loài được chấp nhận sự phân loại

Chi Dictyota J.V.Lamouroux, 1809. thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales có

khoảng 316 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhưng trong đó 76 loài

được chấp nhận sự phân loại

Chi Padina Adanson, 1763. thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales. Hiện nay

số lượng loài chi Padina có khoảng 62 tên loài trong cơ sở dữ liệu

www.algaebase.org, nhưng trong đó 39 loài được chấp nhận sự phân loại (Tsutsui

Isao et al, 2005).

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada,

Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ai-len, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chi lê, Argentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ

Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ

Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận

nhiệt đới.

Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên

667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum . Hàn Quốc

khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000

tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng

27.000 tấn

1.1.2.2. Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam

Riêng việc kiểm tra danh mục cập nhật ngành rong biển Việt Nam đang tiến

hành bởi các nhà phân loại, con số thành phần loài hiện có thể dự báo khoảng 800

loài. So với các nước trong khu vực thành phần loài rong biển Việt Nam đa dạng

phong phú giữa tự nhiên và nuôi trồng, có nhiều tiềm năng, góp phần về sản lượng

khai thác nguồn lợi rong biển khu vực Đông Nam Á.

Đối với rong nâu Việt Nam, các tác giả trong nước và ngoài nước đã nghiên

cứu tương đối đầy đủ về mặt phân loại. Việc phân loại được thực hiện theo phương

pháp hình thái so sánh, trong đó các tiêu chí phân loại là đặc điểm của cơ quan sinh

sản, là cơ quan ít biến đổi theo các điều kiện sinh thái, là phương pháp sử dụng từ

lâu nhưng vẫn còn phổ biến và vẫn đảm bảo được mức độ tin cậy trong điều kiện

Việt Nam và trên thế giới. Đến thời điểm này một số chi rong nâu thống kê được:

Chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài (4 loài 1 thứ), chi

Sargassum 68 loài trong đó ở Khánh Hòa có 39 loài [1,2,3,4,21].

Năm 2013, theo công bố của Nguyen Van Tu, Le Nhu Hau và đồng sự đã có

tổng số 827 loài được công bố, trong đó chi rong nâu Chlorophyta (180 loài). So

với các nước Philippin, Đài Loan, Thái Lan hay Malaysia, rong biển Việt Nam rất

đa dạng loài.

Sự phân bố một số chi rong nâu: Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina ở

Khánh Hòa [1,2,3,4,21].

Nguồn lợi rong nâu được tập trung phân bố trên 4 khu vực ven biển Khánh

Hòa theo trình tự từ Bắc đến Nam (Hình 1.1)

+ Khu vực 1: Vịnh Vân Phong (Hòn Bịp, Hòn Ó, Hòn Dút, Cù Meo, Rạn

Trào, Rạn Tướng, Mũi Dù, Mũi Đá Son, Sủng Rong, Lạch Cổ cò, Sủng Ké..) -

Huyện Vạn Ninh.

+ Khu vực 2: ven biển xã Ninh Thuỷ, xã Ninh Phước, xã Ninh Vân, Đầm Nha

Phu (Bãi Đá lát, Mỹ Giang, Hòn khô, Bãi Đá nọc, Bãi Cây Tra, Bãi Cỏ, Bãi Cây

Bàn, Bãi Vũng Tàu, Hòn Thị, Đảo Khỉ... và vài bãi cạn ngầm Bãi cỏ - Thị xã Ninh

Hòa).

+ Khu vực 3: Vịnh Nha Trang (Mũi Kê Gà, Bãi tiên Đường Đệ, Hòn Chồng,

khu vực Hòn Đỏ, Hòn Rùa, Đảo Hòn Tre - Mũi Nam Bãi Trủ, Bãi Rạn, Bãi Ngéo,

Hòn Một, Hòn Mun, Bãi rạn ngầm Lớn, Mũi Cá sấu Trí Nguyên, Sông Lô, Mũi Cầu

Hinh).

+ Khu vực 4: Đảo Bình Ba, xã Cam Lập ( dọc theo bờ Đông bán đảo Cam

Lập, từ mũi Sốp đến mũi Cà Tiên) – Thành phố Cam Ranh.

Từ những chuyến khảo sát thực địa ven biển Khánh Hòa, đã xác định số lượng

thành phần loài riêng một số chi rong nâu có tần suất xuất hiện tại 4 khu vực: chi

Dictyota 9 loài, chi Padina 3 loài, chi Turbinaria 4 loài, chi Sargassum 21 loài

(Bảng 1.1)

Hình 1.1. Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh Khánh

Hòa [21]

Bảng 1.1. Thành phần loài và phân bố rong nâu Khánh Hòa [21]

Vùng 1 - Vùng 4- Vùng 2- Vùng 3- Vịnh Vân Vịnh Ninh Thuỷ, Vịnh Nha Phong Vạn Cam Ninh Phước Trang Ninh Ranh

i ã B

n ạ R

m a N

i ũ M

c ợ ư Đ n ò H

n ế đ p ố S

n o S á Đ

, g n ớ ư r T n ạ R

, ) d n a l a e p n i V

i ũ M

(

i ũ M

Ó n ò H

, ỏ c i ũ M

, i ó h K n ò H

c ự v

, i r T

( e r T

u r T

, ù D

ệ Đ g n ờ ư Đ - n ê i T

n ớ L n ạ C

, o e M m ù C

, p ị B o n à ò r H T

n ò H

i ũ M

ỏ c i ã b m ầ g n n ạ R

u h P a h N m ầ Đ

i ã B

ô l g n ô S - g n ồ h C n ò H

g n a i G ỹ M

n â V h n i N

n ò H

i a B

) n ạ R

i ã B

a B h n ì B o ả đ c ự v u h K

u h K

n ê i T à C

T Loài T

Chi Dictyota

D. cervicornis x x x x x x 1 Kuetz.,

D. linearis x x x x x x x x x x 2 (C.Ag.) Grev.

D. dichotoma x x x x x x x x x x x x

3 (Hudson)

J.V.Lamouroux

D. divaricata x x x x x x 4 Lamx.

D. pinnatifida x x x 5 Kuetz.,

6 D. patens J.Ag. x x x x x x x x

D. indica Sond. x x x x x x 7 sensus coil.

x 8 D. friabilis Setch. x x x x x x x

D. ceylanica var.

x 9 anastomosans x x x x

Yam.

Chi Padina

P. boryana Thivy, x x x x x x x x x x x x x x

P. australis Hauck, x x x x x x x x x x x x

P. gymnospora x x x x x x x x x x

(Kütz.) Sond.

Chi Turbinaria

T. ornata (Turn.) x x x x x x x x x x x x x

J.Ag.

x x x x x x x T. gracilis Sond. x x x

x x x x x x T. decurrens Bory.

de Saint-Vinc.

T. conoides (J. Ag.) x x x x x x x x x x

Kütz.

Chi Sargassum

S. angustifolium x x 1 (Turn.) C. Agar.

2 S. aemulum Sonder x x

3 S. assimile Harvey x

S. brevifolium

S. binderi Sond. Ex x x x x x x x x x x 4 J. Ag.

S. crassifolium

J. Ag.

x x x x

J. Ag.

denticarpum

S. cristaefolium C. x x 7 Ag.

Ajisaka

feldmanii

10 S.

S. duplicatum J. x x x x x x 9 Ag.

x x

Phamhoang

S. ilicifolium x

S. henslowianum C.

(Turn.) C. Ag.

Ag. Ex J. Ag.

S. kuetzingii x x 13 Setchell

14 S. mcclurei Setch. x x x x x x x x x

S. microcystum x x x x 15 Mont.

x S. olygocystum x x x x x 16 Mont.

18 S. sandei Reinb.

S. polycystum x x x x x x x x x x x x 17 C. Ag.

x x 19 S. serratum Dai x x x x x x x x

x x S. swartzii (Turn.) x x x x 20 C. Ag.

S. vietnamense x x 21 A Zin & N.H.Dinh

1.1.3. Thành phần hóa học của rong Nâu

1.1.3.1. Polysaccharide

Polysaccharide là thành phần chính của rong nâu, bao gồm alginate (1),

laminaran (2), fucoidan (3) và dẫn xuất của chúng. Một số thành phần khác như

porphyran (4), axít alginic (5) và ascophyllan(6) đã được báo cáo ở một số loài

rong nâu [22,23,24]. Ascophyllan (6) đã được tách chiết từ rong nâu Ascophyllum

nodosum ức chế sự phát triển và tiêu diệt tế bào ung thư [24].

1 2

3 4

5 6

Alginate (1) là anionic polysaccharide, là co-polymer mạch thẳng được tạo

thành từ liên kết (14) glycosid của axít β-D-mannuronic (M) và axít α-L-

guluronic acid (G). Sodium alginate (8) tách từ rong nâu Sargassum fulvellum có

khả năng ức chế sự phát triển của khối u.

Theo công thức cổ điển của Haworth, hai monomer này chỉ khác nhau ở

nhóm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranose, còn theo quan

niệm hiện đại, hai gốc uronic này có cấu tạo dạng ghế, có cấu hình khác nhau: axít

mannuronic có cấu hình 4C1 còn axít guluronic là 1C4. Chính sự khác nhau của mạch

cấu trúc này nên hai uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [19].

Các chuỗi axít polyguluronic có dạng nếp gấp, còn axít polymannuronic có

dạng phẳng. Khoảng cách giữa 2 uronic acid trong chuỗi axít polyguluronic là 8,7

Å; axít polymannuronic là 10,35 Å và khoảng cách giữa hai uronic acid trong chuỗi

luân phiên axít polyguluronic và polymannuronic là 9,5 Å [19].

Trong phân tử alginate, tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay

đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate. Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer

M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block: Block homopolymeric

guluronic (Poly-G) gồm các gốc axít guluronic nối tiếp nhau (GGGG); Block

homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc axít mannuronic nối tiếp nhau

(MMMM) ; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai gốc axít guluronic và

axít mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (MGMGMGMG)[19].

Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng trong mạch phân tử thay

đổi tùy theo nguồn gốc của alginate. Do cấu trúc của các gốc G và M khác nhau nên

hình dạng của các khối cũng khác nhau: Poly – M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên

sự mềm mại của mạch phân tử, trong khi poly - G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền

chặt hơn. Cấu trúc hóa học của alginate có tính chất quyết định đến các tính chất vật

lý, hóa học và sinh học của nó [19].

Alginate có ảnh hưởng khác nhau đến hệ sinh học, phụ thuộc rất lớn vào

thành phần hóa học và khối lượng phân tử của alginate. Hoạt tính sinh học của

alginate cho thấy sự tăng trưởng quá nhanh các thực bào và nguyên bào sợi, tương

tự như một phản ứng viêm với dị vật. Các thí nghiệm cho thấy mức độ cảm ứng các

yếu tố gây ra hoại tử khối u và interleukin 1 phụ thuộc hàm lượng acid mannuronic

trong mẫu alginate. Kết quả này giải thích các phân đoạn giàu mannuronat không

tham gia vào việc tạo gel sẽ thoát ra ngoài các viên nang và khởi động một phần

phản ứng miễn dịch này có thể có liên quan một phần với các liên kết (1 → 4)

glycoside, vì các polyuronat hormopolymer diequartorial khác như axít D–

glucuronic cũng thể hiện tính chất này. Khả năng miễn dịch của các

polymannuronat đến nay đã được chứng minh trong các thử nghiệm lâm sàng để

ngăn ngừa các bệnh nhiễm khuẩn, để làm tăng khả năng miễn dịch không đặc hiệu.

Ngoài ra, alginate có tính tẩy xạ, khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng

con đường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đưa chất phóng xạ này ra khỏi cơ

thể. Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó ngăn ngừa được sự hấp thu

strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được thải theo phân ra ngoài. Việc

dùng alginate làm chất tẩy xạ không ảnh hưởng đến quá trình trao đổi ion Ca2+ và

khả năng phát triển bình thường của cơ thể. Ngoài ra một số nghiên cứu cũng cho

thấy alginate còn có khả năng chống oxy hóa, tác dụng chống đông tụ máu, phòng

xơ vữa động mạch ở trẻ em [19].

Alginate còn có rất nhiều ứng dụng khác trong cuộc sống. Các ứng dụng của

alginate đều dựa trên ba đặc điểm đó là khả năng tạo dung dịch có độ nhớt cao; khả

năng tạo gel khi thêm muối canxi vào dung dịch natri alginate trong nước; khả năng

tạo màng natri hay calci alginate và sợi calci alginate. Ngày nay các alginate đang

được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, các ngành công nghiệp dệt may và các lĩnh

vực bao gồm cả giấy mạ, dược phẩm và hàn…Ví dụ kỹ nghệ thức ăn, người ta dùng

rất nhiều alginate để làm kem, socola, bánh, món tráng miệng. Trong công nghiệp,

alginate được sử dụng rất nhiều trong kỹ nghệ giấy, dệt, vải hồ, kỹ nghệ cao su.

Nhu cầu alginate dùng trong in vải sợi chiếm khoảng 50% tổng lượng alginate sản

xuất trên toàn thế giới. Trong công nghệ dược phẩm, alginate thường dùng làm chất

nhũ hóa và chất gây thấm trong các dạng thuốc có cấu trúc nhũ tương và hỗn dịch,

dùng trong tá dược bao của viên nén hay tham gia vào thành phần của vỏ nang.

Alginate có thể được sử dụng để kết hợp để làm màng bao của viên tan trong ruột,

điều này rất có lợi cho việc bào chế các thuốc ảnh hưởng đến đường tiêu hóa, tương

kỵ với dịch vị…Alginate dùng để sản xuất lớp màng chống chất phóng xạ, nó

thường dùng để chỉ thị độ ô nhiễm phóng xạ của vùng biển. Màng được tạo thành từ

gelatin và alginate được ứng dụng trong điều trị tổn thương bỏng. Màng này có tác

dụng ngăn cản sự xâm nhiễm, giảm viêm đẩy mạnh quá trình lành hóa vết thương,

đặc biệt có hiệu quả ở dạng bỏng khô [19].

Laminaran (2) là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thường

gọi là laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là : 1,3 – β – D – glucan.

Laminaran là một polysaccharide dự trữ của rong nâu, hàm lượng từ 1 – 15%

trọng lượng rong khô tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh

sống của từng loại rong. Thường vào mùa hè hàm lượng laminaran giảm vì phải tiêu

hao cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong. Laminaran được hình

thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết β-(1→3) và một ít

liên kết β-(1→6), gốc đường cuối mạch của một số phân tử có thể có các gốc

mannitol hay vẫn là glucose. Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác

nhau rõ rệt về tỉ lệ của các liên kết β-(1→3) và liên kết β-(1→6) cũng như cách

thức nối của các liên kết này trong chuỗi glucan [19,22].

Hoạt tính sinh học của Laminaran là thực phẩm chức năng có giá trị dược lý

được FDA chấp thuận trong việc chống đông máu, làm giảm hàm lượng cholesterol

trong máu và kích thích miễn dịch bẩm sinh. Hợp chất laminaran có trong rong biển

có thể hỗ trợ không để tế bào miễn dịch “tử vong”, từ đó có tác dụng bảo vệ hệ

thống miễn dịch không bị tổn thương dưới tác động của tia bức xạ. Khả năng chống

tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên nhiên này đem lại niềm hy vọng cho

những người đang dùng tia phóng xạ chữa trị các khối u gây ung thư trong cơ thể.

Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng sức đề kháng với nhiễm trùng và thúc đẩy

sự lành của vết thương. Laminaran với những đặc tính của một alpha – amylase gây

ra kích hoạt các enzyme có mặt trong quá trình tăng trưởng ở thực vật và sự kích

thích của hoạt động phân giải protein của các tế bào được xử lý. Hiện nay,

laminaran được nghiên cứu để sử dụng như là một chất thúc đẩy hạt giống nảy mầm

và tăng tốc độ tăng trưởng cây trồng [19].

Fucoidan (3) là một anion polysaccharide sulfate hóa nằm trong thành tế bào

của rong nâu, hợp chất này được Kylin mô tả đầu tiên vào năm 1913 từ loài rong

nâu Laminaria digitata. Thành phần cấu tạo rất phức tạp, trong đó fucose chiếm

từ 18,6% đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7% đến 32,9%, ngoài ra còn có mặt

các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose,

rhamnose ,..và acid uronic [23].

1.1.3.2. Hợp chất phenolic

Hợp chất phenolic là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp của thành phần hóa

học rong nâu, là hợp chất chứa các nhóm OH gắn trực tiếp vào nhân bezen, bao

gồm các hợp chất flavonoid, lignnin, tannin và phlorotannin. Các hợp chất này có

nhiều hoạt tính khác nhau. Phlorotannin (7) có trọng lượng phân tử từ 400-

400.000Da, chiếm 0.5 đến 20% trong rong nâu. Hàm lượng phenolic được phân tích

định lượng và nghiên cứu so sánh từ nhiều loài thuộc ngành rong nâu (Fucaceae),

được báo cáo ở các họ như Sargassaceae, Cystoseiraceae và Laminariaceae. Các

hợp chất Phlorotannin như dieckol (9), eckol (10), 8,8’- bieckol (11), 6,6’- bieckol

(12) và 6,8’- bieckol (13) đã được tách chiết từ một số loài rong nâu Sargassum

fulvellum, Sargassum thunbergii, Ecklonia cava, Hijikia fusiformis, Ishige

okamurae, Eisenia arborea. Phloroglucinol (14) tách từ Ecklonia cava. Một hợp

chất Phlorotannin là dioxinodehydroeckol (15). Sáu hợp chất bromophenol và dẫn

xuất của nó (16-21) tách tử rong nâu Leathesia nana [24].

12 13

17 16

1.1.3.3. Hợp chất carotenoid

Carotenoid là các hợp chất màu tự nhiên được tìm thấy ở nhiều loài thực vật và

động vật. Trong thành phần hóa học của rong nâu có chứa các hợp chất catatonic

bao gồm lutein, zeaxanthin (22) và fucoxanthin (23). Rong nâu được coi là giàu có

hợp chất chuyển hóa thứ cấp đặc biệt như carotenoid có nhiều hoạt tính sinh học

như hoạt tính chống oxi hóa, chống ung thư, chống viêm và chống virus. Các hợp

chất a-carotene (24), b-carotene (25), chlorophyll a và phaeophytin a (26) đều có

những hoạt tính sinh học quý giá [24].

23 24

1.1.3.4. Hợp chất Terpenoid

Một số terpenoid được tách từ rong nâu Sargassum fallax, sargaquinone (27),

axít sargaquinoic (28), axít sargahydroquinoic (29), axít fallachromonoic (30),

fallahydroquinone (31), fallaquinone (32), sargachromenol (33). Các hợp chất này

có họat tính chống oxi hóa và ngăn ngừa ung thư. Các hợp chất atomarianone A

(34), và atomarianone B (35) đã được tách từ Taonia atomania có hoạt tính gây độc

tế bào ung thư [24].

Hợp chất diterpenoid tách từ rong nâu Cystoseira mediterranea như taondiol

(36), isoepitaondiol (37), stypodiol (38), stypoldione (39) và sargaol (40), các hợp

chất này có hoạt tính chống oxi hóa và chống ung thư. Hợp chất 2β,3α-epitaondiol

(41), flabellinol (42) đã được tách từ rong nâu Styporodium flabelliforme hoạt tính

gây độc tế bào ung thư [24].

34 35

36 37

38 39

40 41

42 43

1.1.3.5. Các hợp chát khác

Cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein đã được nghiên cứu tách chiết từ

rong nâu. Các aminoaxit đã được nghiên cứu nhiều. Deoxylapachol a 1,4 -

Naphthoquinone (43) và dẫn xuất đã được tách từ rong nâu Landsburgia

quercifolia. Sargachromanol E (44) tách từ rong Sargassum siliquastrum các hợp

chất này có khả năng gây độc tế bào ung thư. Hợp chất ergosterol (45) tách từ rong

nâu Lyengaria stellata. Fucosterol (46) tách từ rong nâu Pelvetia siliquosa,

Cystoseira foeniculacea và Sargassum angustifolium các hợp chất axít α-linolenic

(47), axít γ-linolenic (48) và axít docosahexaenoic (49) ngăn chặn sự phát triển của

tế bào ung thư [24].

44 45

1.2. Tổng quan về Sulfated polysaccharide (Fucoidan)

1.2.1. Giới thiệu chung về Fucoidan

Fucoidan là một sulfated polysaccharide phân lập từ rong nâu lần đầu tiên

bởi Kylin vào năm 1913 [23]. Theo danh pháp carbohydrate, vì các polysaccharide

được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan. Sulfated

polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu và động vật trên thực tế chỉ có mặt trong

ngành Da gai (echinoderms), cụ thể là cầu gai và hải sâm [10]. Nhưng ngược lại,

cấu trúc của các sulfated polysaccharide từ rong nâu phức tạp hơn nhiều trong thành

phần. Ngoài fucose và sulfate, chúng còn có thể chứa thêm các monosaccharide

khác như: galactose, xylose, manose, axít glucuronic,… đồng thời có thể bị acetyl

hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các polymer sinh học phức tạp này

trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến. Chính vì vậy, tên gọi thông thường

“fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các sulfated polysaccharide từ

rong nâu, độc lập với thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên nó không được sử

dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật [10].

Sulfated polysaccharide (Fucoidan) là hợp chất được đặc biệt quan tâm

nghiên cứu nhờ các hoạt tính sinh học đa dạng và đặc thù của chúng như: chống

đông tụ máu, chống huyết khối, kháng virut, kháng dính, kháng tạo mạch

(antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều

biến hệ miễn dịch, ngừa thai [6]. Vì vậy, mà fucoidan trở thành một nguồn tiềm

năng cho các ứng dụng làm thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng, dược liệu,...

và số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng 10 năm trở lại

đây [25].

1.2.2. Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu

Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu

hoạch rong. Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố rằng hàm lượng fucoidan từ 1-

20% trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [26]. Năm 1994, Koo đã báo

cáo rằng các loài rong L. religiosa, U. pinnatifida, H. fusiforme và S. fulvellum có

chứa hàm lượng fucoidan tinh khiết lần lượt là 2.7%, 6.7%, 2.5% và 1.6% [27].

Fucoidan là một sulfated polysaccharide dị thể, nên có thành phần hết sức

phức tạp. Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định

là một polysaccharide có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và

uronic acid được xem như là tạp chất [28]. Tuy nhiên, Percival và Ross đã báo cáo

rằng fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus vesiculosus,

Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56.7% fucose, 4%

galactose, 1.5% xylose, 3% uronic acid và 8% khoáng [29]. Các loài rong khác

nhau thì tỉ lệ fucose/galactose cũng khác nhau [28]. Dillon và cộng sự đã phân lập

fucoidan từ loài rong A. nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [30], trong khi

fucoidan chiết từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [9].

Ngoài ra, các thành phần đường khác (như xylose) cũng được xác nhận là thành

phần của fucoidan [28]. Thành phần của fucoidan từ rong F. vesiculosus là 44.1%

fucose, 26.3% sulfate, 31.1% tro và một lượng nhỏ amino-glucose [9,28]. Do vậy,

thành phần của fucoidan có thể biến đổi theo các loài rong (bảng 1.2) và phương

pháp chiết khác nhau [9].

Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan [9]

Rong nâu Thành phần hóa học

F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1.20)

F. evanescens fucose/sulfate/acetate (1/1.23/0.36)

F. distichus fucose/sulfate/acetate (1/1.21/0.08)

F. serratus L. fucose/sulfate/acetate (1/1/0.1)

Lessonia vadosa fucose/sulfate (1/1.12)

Macrocytis pyrifera fucose/galactose (18/1), sulfate

Pelvetia wrightii fucose/galactose (10/1), sulfate

Undaria pinnatifida fucose/galactose (1/1.1), sulfate (10.4 %)

(Mekabu)

Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4.9/1/1.1), sulfate (12%)

Himanthalia lorea Fucose/xylose/GlcA (2.2/1.0/2.2), sulfate (13%)

và Bifurcaria bifurcate

Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose

(1.5/1.5/1.2/1.2/1), sulfate (17.6 %)

Laminaria angustata fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose

(1/0.67/0.03/0), sulfate (26.2 %)

Sargassum stenophyllum Fucose/galactose/mannose/xylose

(1/0.2/0.02/0.24), sulfate (19 %)

Adenocytis utricularis Fucose/galactose/mannose (1/0.38/0.15), sulfate

Hizikia fusiforme Fucose/galactose/mannose/xylose/GlcA

(1/0.72/0.72/0.2/0.25), sulfate (11.8 %)

Dictyota menstrualis fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate

(1/0.8/0.7/0.8/0.4) và (1/0.3/0.4/1.5/1.3)

Spatoglossum schroederi fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0.5/2/2)

1.2.3. Cấu trúc hóa học của fucoidan

Cấu trúc của fucoidan là vô cùng phức tạp và không đồng nhất với những thay

đổi trong cơ cấu liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đường khác

nhau trong polysaccharide, phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [7,8,10,11,31].

Chính vì vậy việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay

cả khi sử dụng các kỹ thuật quang phổ NMR phân giải cao mới nhất [14]. Đã có

nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được

công bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật

trong cấu trúc của fucoidan.

Năm 1950 Percival và Ross đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong nâu thường gặp

Fucus vesiculosus là một polysaccharide (50) có bộ khung chính là -L-

fucose(12), vị trí nhánh là -L-fucose(13) và các nhóm sulfate ở vị trí 4 của

gốc đường L-fucospynanose. Mô hình cấu trúc này của fucoidan đã tồn tại 43 năm

[29].

Năm 1993 Patanka và các công sự đã nghiên cứu lại cấu trúc fucoidan phân

lập từ Fucus vesiculosus. Kết quả cho thấy sự khác nhau về bản chất liên kết

glycoside của fucoidan này (51) với mạch chính là -L-fucose(13) thay vì -L-

fucose(12) như fucoidan nghiên cứu trước. Mặt khác nhóm sulfate được tìm thấy

chủ yếu ở vị trí 4, phù hợp với mô hình trước [32]. Sự khác nhau này được giải

thích là do kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan đã được Percival và Ross chiết

trong môi trường nước nóng, còn Pantakar chiết trong dung môi axít; mặt khác khác

nhau về phương pháp methyl hóa và cuối cùng là khác nhau về phương pháp phân

tích cấu trúc. Percival và Ross phân tích cấu trúc của fucoidan dựa trên các tính chất

về sắc ký và hóa học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl

hóa được Pantakar phân tích bằng phương pháp GC-EI/MS.

1.2.4. Tính chất hóa lý của fucoidan

Fucoidan là một anion sulfated polysaccharide, có độ nhớt thấp và tính hút

ẩm cao [29], fucoidan tan tốt trong nước và trong dung môi axít. Nhìn chung,

fucoidan có trọng lượng phân tử không cao. Trọng lượng phân tử của fucoidan chiết

từ loài rong A.nodosum là từ 417-1.323 kDa, trong khi đó với loài rong F.

vesiculosus là 529-887 kDa [33], nhưng Patankar và cộng sự (1993) lại cho rằng

trọng lượng phân tử của fucoidan từ loài rong này là 100 kDa. Rupérez và cộng sự

(2002) đã chiết hai phân đoạn fucoidan với trọng lượng phân tử khác nhau là 1.600

kDa và 43 kDa. Thêm vào đó, galactofucoidan một loại fucoidan được phân lập từ

loài rong Saccharina longicruris có trọng lượng phân tử là 765 kDa và 1.529 kDa

biến đổi tùy thuộc vào thời điểm thu hoạch rong. Nhìn chung trọng lượng phân tử

của fucoidan thay đổi tùy thuộc vào loài rong (bảng 1.3)[34], phương pháp chiết và

điều kiện môi trường.

Bảng 1.3. Sự phân bố trọng lượng phân tử của fucoidan [34]

Trọng lượng phân tử (kDa) Nguồn rong

13 Ascophyllum nodosum

16 Ascophyllum nodosum

25 Hizikia fusiforme

100-180 Fucus vesiculosus (Sigma)

160 Fucus vesiculosus

189 Laminaria japonica

200 Cladosiphon okamuranus

950 Hizikia fusiforme

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan

1.2.5.1. Hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối

Fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính chống

đông tụ máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất. Nishino và cộng sự, đã thử

nghiệm hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ chín loài rong nâu.

Trong số các fucoidan thử nghiệm, fucoidan từ E. kurome thể hiện hoạt tính cao

nhất đối với APTT (38 đơn vị/mg) và TT (35 đơn vị/mg), với fucoidan từ

H.fusiforme hoạt tính APTT (activated partial thromboplastin time) và TT

(thromboplastin time) tương ứng là 25 đơn vị/mg và 22 đơn vị/mg. Hoạt tính chống

huyết khối của phân đoạn F-4 của fucoidan từ L.angustata var. longissima là 200

đơn vị/mg, so với heparin (140 đơn vị/mg) [20,35].

Các nghiên cứu về hoạt tính chống đông tụ máu của fucoidan từ một số loài

rong (E.kurome, H.fusiforme, vv…) đã chỉ ra rằng hàm lượng sulfate có ảnh hưởng

lớn đến hoạt tính chống đông tụ máu, hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính

chống đông tụ càng lớn. Fucoidan sulfate hóa toàn phần bằng biến đổi hóa học

fucoidan tự nhiên cũng làm tăng hoạt tính này. Nishino và cộng sự, đã điều chế ba

loại fucan sulfate hóa toàn phần (fucans oversulfated) có hàm lượng sulfate khác

nhau (tỷ lệ sulfate/đường: 1,38-1,98) bằng sulfate hóa hóa học của một sulfate fucan

(tỷ lệ sulfate/đường: 1.28) phân lập từ rong E. kurome. Các kết quả cho thấy fucan

sulfate hóa toàn phần thể hiện hoạt tính chống đông tụ máu tăng đáng kể so với

fucoidan tự nhiên [36]. Qiu và cộng sự, công bố rằng fucoidan sulfate hóa toàn phần

cho thấy hoạt tính chống đông tụ máu cao gấp bốn lần so với fucoidan tự nhiên [37].

Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất quan trọng với hoạt tính

chống đông tụ của fucoidan. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng fucoidan sulfate hóa

ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt tính chống đông tụ, trong khi đó nhóm

sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này [11,20,38,39]

Duarte và cộng sự, đã công bố rằng các đặc tính chống đông tụ máu của

fucoidan chủ yếu được xác định dựa trên các chuỗi sulfate fucose, đặc biệt các đơn

vị fucosyl disulfated. Silva và cộng sự, đã công bố rằng hoạt tính chống đông tụ

máu của fucoidan từ Padina gymnospora được quyết định bởi 3-O-sulfat tại C-3

của đơn vị đường 4-α-L-fucose-1→ [40]. Để có được hoạt tính chống đông tụ máu

fucoidan cần một mạch đường đủ dài và một dạng cấu trúc linh động để liên kết với

thrombin. Fucoidan tự nhiên từ Lessonia vadosa (Phaeophyta) có khối lượng phân

tử (320.000 Da MW) cho thấy hoạt tính chống đông tụ máu tốt hơn các fucoidan đề

polymer hóa có khối lượng phân tử (32.000 MW) [41]. Các thử nghiệm với

fucoidan trọng lượng phân tử thấp (LMWF) thu được từ A. nodosum bằng thủy

-)-(1→4)-α-L-

phân xít, có cấu trúc lặp lại chủ yếu là [→3)-α-L-Fuc(2SO3

-)-(1]n và có trọng lượng phân tử (Mw) là 3.090 Da, chỉ ra rằng cấu

Fuc(2,3diSO3

trúc phân nhánh không thực sự ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông tụ máu [11,20].

Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đường (fucose, galactose, v.v)

của fucoidan có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông tụ máu [42,43]. Các kết quả

của Pereira và cộng sự, chỉ ra rằng nhóm 2-sulfate của α-L-galactan liên kết 3, là tác

nhân ức chế thrombin mạnh qua trung gian antithrombin hoặc heparin cofactor II

chứ không phải là gốc α-L-fucan [44,45,46]. Axit uronic không có ảnh hưởng trực

tiếp lên hoạt tính chống đông tụ máu, nhưng nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống

đông tụ máu thông qua việc làm cho chuỗi đường trở nên linh động hơn [6,20].

Mourão đã tổng kết các hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối

của fucan sulfate. Các fucan sulfate của rong biển và động vật không xương sống

biển có hoạt tính chống đông tụ máu mạnh gián tiếp bởi antithrombin và/hoặc

heparin cofactor II. Những nghiên cứu này khẳng định rõ ràng rằng hoạt tính chống

đông tụ máu của α-L-fucans sulfate và α-L-galactans sulfate mạch thẳng không chỉ

phụ thuộc vào mật độ và mô hình sulfate hóa mà còn bị ảnh hưởng bởi thành phần

các monosaccharide [20,47].

Hoạt tính chống huyết khối của fucoidan cũng đã được thử nghiệm in vivo

theo mô hình ngẽn tĩnh mạch và động mạch ở động vật thực nghiệm [38].

Galactofucan sulfate được phân lập từ rong nâu Spatoglossum schroederi cho thấy

không có hoạt tính chống đông tụ máu trên một số thử nghiệm in vitro. Tuy nhiên,

nó lại thể hiện hoạt tính chống huyết khối mạnh khi thực hiện thí nghiệm về sự

nghẽn tĩnh mạch trên mô hình động vật, điều này có thể được giải thích do ảnh

hưởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính chống huyết khối của fucoidan. Tác dụng

này đạt tối đa 8 giờ sau khi theo dõi thí nghiệm và nhanh hơn so với heparin. Hoạt

tính này không được phát hiện với các phân tử fucoidan khử sulfate. Hơn nữa,

galactofucan sulfate còn có tác dụng kích thích sự tổng hợp heparan sulfate, một tác

nhân chống huyết khối bằng các tế bào nội mô mạnh hơn heparin 2 lần. Tác dụng

này cũng không sảy ra với các polysaccharide bị khử nhóm sulfate [20,48].

Như vậy có thể thấy rằng fucoidan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm thuốc

chống đông tụ máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng và dược

liệu mà hầu như không có tác dụng phụ.

1.2.5.2. Hoạt tính chống virus

Trong những năm gần đây, người ta đã chứng minh rằng sulfate

polysaccharide (bao gồm fucoidan) thể hiện các hoạt tính kháng virus được thử

nghiệm cả trên động vật thực nghiệm (in vivo) và trong ống nghiệm (in vitro), yếu

tố gây độc tế bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan

tâm xem xét sử dụng trong y học lâm sàng. Fucoidan từ Laminaria japonica có

chức năng kháng RNA và DNA của virus. Hiệu quả chống virus của fucoidan trên

bệnh nhiễm trùng do poliovirus III, adenovirus III, ECHO6 virus, virus coxsackie

B3 virus và virus coxsackie A16 là đáng kể. Fucoidan có thể ức chế sự phát triển

của hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE) và bảo vệ các tế bào được cấy ghép khỏi sự

nhiễm trùng gây ra bởi các virus ở trên. Herpes là một bệnh nhiễm trùng gây ra bởi

virus herpes simplex (HSV). Fucoidan từ Adenocytis utriculari, Undaria pinnatifida

(Mekabu), Stoechospermum marginatum, Undaria pinnatifida, Cystoseira indica và

Undaria pinnatifida cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây

độc cho tế bào Vero. Hơn nữa, fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự

tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của người và

cytomegalovirus [20,34,49,50,51,52].

Dohura và cộng sự, công bố rằng sử dụng fucoidan từ rong nâu có hoạt tính

antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị nhiễm trùng prion đường ruột.

Fucoidan của rong biển có tác dụng làm giảm những cơn đau của những con chuột

bị nhiễm trùng đường ruột (scrapie) khi cho uống trong 6 ngày sau khi nhiễm bệnh.

Ăn chế độ ăn hàng ngày được bổ sung fucoidan có thể phòng ngừa chống lại các

bệnh prion do ăn phải thức ăn nhiễm prion, mặc dù sự đánh giá sâu hơn về dược lý

của nó vẫn còn tiếp tục được thực hiện [20,53].

1.2.5.3. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch

Hoạt tính kháng u của nhiều polysaccharide đã được công bố trong những

năm gần đây. Fucoidan từ Eisenia bicyclics và L. japonica có tác dụng chống u

báng 180. Fucoidan của L. japonica có thể ức chế tế bào gan QGY7703 đến phase

Log, theo đó kiềm chế sự tăng trưởng của khối u [54]. Fucoidan đã được phát hiện

ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của

người [55]. Fucoidan từ L. saccharina, L. digitata, F. serratus, F. distichus và F.

vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính

với các tiểu cầu, một hiệu ứng mà có thể có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di

căn khối u [20,56].

Dựa trên nghiên cứu fucoidan liên kết với fibronectin, Liu và cộng sự đưa ra

giả thuyết rằng fucoidan ức chế sự bám dính của tế bào MDA-MB-231 với

fibronectin theo các cách sau: i) bằng cách ngăn chặn heparin của protein và vùng

liên kết tế bào, ii) bằng cách điều chỉnh việc tổ chức lại cấu trúc dưới phân tử

intergrin alpha5, iii) điều chỉnh giảm sự biểu hiện của vinculin [57]. Bệnh bạch cầu

T-cell khi trưởng thành (ATL) bị gây ra bởi vi rút gây bệnh bạch cầu tế bào T typ 1

(HTLV-1) và đến nay căn bệnh này vẫn chưa có thuốc chữa. Fucoidan ức chế đáng

kể sự tăng trưởng của tế bào máu đơn nhân ngoại biên của bệnh nhân mắc bệnh

bạch cầu (ATL) và các dòng tế bào T bị nhiễm HTLV-1 nhưng không phải là của

các tế bào máu đơn nhân ngoại biên bình thường. Fucoidan từ Mekabu có khả năng

ức chế khối u tới 65,4 % [20,57,58].

Fucoidan của L. japonica có thể phục hồi các chức năng miễn dịch của chuột

bị ức chế miễn dịch, và đó là một miễn dịch tác động trực tiếp trên đại thực bào và

tế bào lympho T [59]. Nó cũng có thể thúc đẩy sự phục hồi chức năng miễn dịch

trên các con chuột bị chiếu xạ. Cơ chế này liên quan đến sự kìm hãm quá trình

giáng hóa tế bào lympho bởi fucoidan [60,61]. Fucoidan có thể làm tăng khả năng

sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interferon-γ (IFN-γ) trong thử nghiệm in vitro, tăng

cường các chức năng của tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào và tế bào giết tự

nhiên (NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại với tế bào hồng cầu

cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo. Fucoidan trọng lượng phân tử lớn được điều

chế từ Okinawa Mozuku (Cladosiphon okamuranus) thúc đẩy sự gia tăng tỷ lệ gây

độc tế bào T ở chuột [62]. Fucoidan từ rong F.vesiculosus có các tác dụng lên sự

trưởng thành và điều hòa miễn dịch trên các tế bào tua (DCs), đây là các tế bào có

kháng nguyên mạnh mẽ, thông qua con đường liên quan ít nhất đến yếu tố nhân tế

bào - κB (NF- κB) [63].

Nhiều polysaccharide thu được từ các nguồn tự nhiên được cải biến đáp ứng

sinh học và đã được chứng minh tăng cường đáp ứng được các miễn dịch với mức

độ khác nhau. Choi và cộng sự, nghiên cứu tác dụng miễn dịch của arabinogalactan

và fucoidan trong thí nghiệm gây độc tế bào in vitro của lách chuột đã bị ung thư,

sau đó được nuôi cấy lại với AG và FU ở nồng độ 10-100 mg/ml.

Ngoài ra, tác dụng của arabinogalactan và fucoidan lên quá trình phân bào

(mitogenic) trong tế bào của lách bạch huyết và các đại thực bào ngoại vi. Đại thực

bào được điều trị bằng arabinogalactan và fucoidan (10-100 μg/ml) gây ra hoạt tính

diệt khối u (tumoricidal) và gia tăng thực bào, tăng hoạt tính của enzym lysosome

và sự sản sinh của nitrit, H2O2, yếu tố hoại tử khối u (TNF)-α, interleukin (IL)-6.

Tuy nhiên, arabinogalactan và fucoidan ảnh hưởng ít đến mức độ IL-1β. Do đó,

hiệu quả tiêu diệt khối u (tumoricidal) của arabinogalactan và fucoidan chủ yếu là

kích hoạt các đại thực bào chủ yếu thông qua trung gian sản xuất của các gốc tự do

(NO và H2O2) và các cytokine (TNF-α và IL-6). Những dữ liệu này cho thấy

arabinogalactan và fucoidan là tác nhân hoạt hóa của tế bào lympho và đại thực bào

và vai trò của chúng trong đáp ứng ngăn ngừa ung thư bởi cơ chế miễn dịch

(immunoprevention) [64].

Bên cạnh việc trực tiếp ức chế sự tăng trưởng của tế bào khối u, fucoidan cũng

có thể hạn chế sự phát triển và lan truyền của các tế bào khối u nhờ các hoạt tính

tăng cường miễn dịch của cơ thể. Fucoidan có thể trực tiếp giết chết các tế bào ung

thư [54], nó có tác dụng chống ung thư trực tiếp trên các tế bào HS-Sultan của con

người thông qua con đường caspase và ERK [55]. Fucoidan làm tăng số lượng đại

thực bào, và gián tiếp phá hủy khối u thông qua tế bào type 1 T-helper (Th1) và

phản ứng của tế bào giết tự nhiên (NK) [20,58].

1.2.5.4. Hoạt tính chống oxy hóa

Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa

quan trọng trong các thí nghiệm in vitro. Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên

tuyệt vời và có khả năng lớn để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do.

Fucoidan từ L. japonica có thể ngăn chặn sự tăng peroxide lipid (LPO) trong huyết

thanh, gan và lá lách của chuột bị tiểu đường một cách rõ ràng. Tuy nhiên, không

phát hiện thấy hiệu quả ức chế trên cả peroxy lipid của homogenates và cả hiệu quả

ức chế gây ra bởi Cys/FeSO4 trong thử nghiệm in vitro. Fucoidan có hiệu quả làm

mất gốc peoxit mạnh mẽ, ảnh hưởng của nó trên gốc hydroxyl là yếu, nó ít có ảnh

hưởng trên 1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH). Fucoidan giúp cho hồng cầu

chuột được bảo vệ đáng kể trên lipid peroxy của đồng trong gan chuột gây ra bởi

axit FeSO4-ascorbic [65]. Micheline và cộng sự công bố rằng fucoidan (homofucan)

từ F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã có một tác dụng

ức chế sự hình thành các gốc tự do hydroxyl và gốc peoxit. Fucan cho thấy hoạt tính

chống oxy hóa thấp so với fucoidan [66].

Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng

sulfate của fucoidan. Các phân đoạn fucoidan từ L. japonica có khả năng làm mất

gốc peoxit và axit hypochlorous tuyệt vời, ngoại trừ các phân đoạn L-B sulfate cao.

Trong hệ thống oxy hóa LDL, các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp LA và LB

thể hiện tác dụng ức chế mạnh quá trình oxy hóa LDL gây ra bởi Cu2+, tuy nhiên

FA và FB ít có tác dụng ức chế trong hệ thống này vì chúng có trọng lượng phân tử

lớn [67]. Cả khối lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan đều đóng vai trò

rất quan trọng trong việc tác động lên các gốc azo 2-2'-Azobis (2-amidinopropane)

dihydrochloride (AAPH) gây ra quá trình oxy hóa LDL. Mối tương quan giữa hàm

lượng sulfate và khả năng làm mất gốc superoxide là tích cực, tỷ lệ hàm lượng

sulfate/fucose là một chỉ số hiệu quả đối với hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu

[20,68].

1.2.5.5. Giảm lipid máu

Fucoidan là hợp chất có hoạt tính tương tự như axit sialic, nó có thể làm tăng

các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của

cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh.

Fucoidan của L. japonica giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-

C, làm tăng HDL-C trong huyết thanh của chuột với sự tăng cholesterol

(hypercholesterolemia) và thỏ với tăng mỡ máu (hyperlipidaemia), ngăn chặn hiệu

quả sự hình thành của tăng cholesterol (hypercholesterol) trong máu ở chuột thí

nghiệm [69,70]. Fucoidan có khả năng làm giảm đáng kể lượng cholesterol và

triglyceride trong huyết thanh của bệnh nhân với chứng tăng mỡ máu

(hyperlipidaemia), mà không có tác dụng phụ gây tổn hại cho gan và thận. Sulfate

fucan trọng lượng phân tử thấp (trung bình Mw = 8.000 Da) phân lập từ L.japonica

có khả năng làm giảm rõ rệt lipít máu của những con chuột có lipít cao. Fucoidan

oligosaccharide cho thấy tác dụng hạ huyết áp tốt trên chuột cao huyết áp và một

trong những cơ chế tác dụng hạ huyết áp cơ bản là chúng có thể ức chế sự sản xuất

angiotensin II trong huyết tương (anti angiotensin II) [20,71].

1.2.5.6. Kháng viêm

Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của

fucoidan thu nhận được từ chín loài rong nâu. Kết quả cho thấy tất cả fucoidan của

9 loài rong đều có khả năng ức chế sự tăng số lượng bạch cầu trên mô hình chuột bị

viêm, hiệu quả chống viêm của fucoidan trong mô hình này không bị ảnh hưởng

nhiều bởi hàm lượng của gốc fucose và sulfate cũng như các đặc tính cấu trúc khác

của bộ khung mạch polysaccharide của chúng [56]. Fucoidan Mekabu có thể làm

giảm tình trạng viêm phổi và điều chỉnh giảm (down-regulated) các phản ứng phản

vệ bị chi phối bởi Th2, tác dụng này có thể hữu ích trong điều trị viêm dị ứng [58].

Yang và các cộng sự, đã đánh giá tác dụng của fucoidan lên sự biểu hiện của

nitric oxide synthetase (iNOS) trong một dòng tế bào đại thực bào, RAW264.7.

Fucoidan ở nồng độ thấp (10 μg/ml) đã làm tăng mức độ biểu hiện cơ bản của iNOS

trong các đại thực bào không hoạt động. Lần đầu tiên họ phát hiện thấy rằng,

fucoidan ức chế sự giải phóng của nitric oxide (NO) trong tế bào RAW264.7 bị kích

thích bởi lipopolysaccharide (LPS). Ảnh hưởng ức chế này lên protein hoạt hóa 1

(Actived Protein-1; AP-1) được kích hoạt bởi fucoidan có thể liên quan với sự ức

chế NO và tác dụng chống viêm [20,72].

1.2.5.7. Chống lại các bệnh về gan

Fucoidan ngăn chặn tổn thương gan gây ra bởi concanavalin A bằng việc

gián tiếp sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm

(proinflammatory cytokine) ở chuột [75]. Các chất xơ trong rong nâu (Laminaria

sp., Sargassum fulvellum và Eisenia bicyclis) có tác dụng chống lại bệnh gan gây ra

bởi D-galactosamine (D- GalN) và tác dụng bảo vệ này được gây ra ít nhất một

phần nhờ fucoidan [76]. Kết quả xơ gan do tổn thương mãn tính gan cùng với sự

tích lũy tăng dần các protein hình sợi nhỏ. Trên thế giới có hơn 100 triệu người bị

xơ gan. Sự có mặt của fucoidan làm giảm suy gan cấp tính và mãn tính gây ra bởi

CCl4. Gan xơ hóa gây ra bởi CCl4 cũng giảm bớt bằng cách tiêm fucoidan. Nguyên

nhân chính gây ra xơ gan là do những thương tổn tế bào gan và sự kích hoạt các tế

bào gan hình sao và điều thú vị là fucoidan có khả năng ngăn chặn tế bào chết do

CCl4 gây ra và ức chế các tế bào gan phát triển. Vì vậy, fucoidan có thể là một chất

chống xơ có tiềm năng nhờ sở hữu chức năng kép, cụ thể là: bảo vệ tế bào gan và ức

chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao [20,77].

1.2.5.8. Hoạt tính kháng khuẩn

Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương

và vi khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não,

một biến chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra. Fucoidan tăng khả năng sản

xuất các dạng interferon kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để

phòng nhiễm trùng và bệnh tật [6,19,20].

1.2.5.9. Tác dụng giảm lượng đường huyết trong máu.

Các nhà nghiên cứu đã công bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong

biển tác động dương tính lên phản ứng insulin và đường huyết trong các động vật

thí nghiệm. Việc đưa thêm các polysacharide này vào cơ thể động vật đã dẫn đến

giảm một cách đột ngột cân bằng hấp thụ đường. Điều này giả thiết rằng các hợp

chất polysaccharide giống fucoidan làm chậm việc truyền glucose vào máu từ ruột,

nhờ vậy giúp giữ mức đường máu ổn định và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức

[6,19,20].

1.2.5.10. Các ứng dụng của fucoidan

Có rất nhiều những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số

lượng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một loại

sulfated polysaccharide hóa giàu fucose từ rong nâu. Nghiên cứu về hoạt tính sinh

học của fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành

công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng.

Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng

và nhãn mác khác nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có

tác dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng

chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ

dày,… Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có

tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, … U-Fucoidan sản

phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional & Dietary Anti-aging

Supplements, Mỹ gây ra sự giáng hóa các tế bào ung thư,… Fucoidan của tập đoàn

Qingdao Yijia Huayi Import & Export Co.,Ltd., Trung Quốc được sử dụng để phục

hồi khả năng kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư và tim

mạch,. Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor’best INC., Mỹ có tác dụng

hỗ trợ điều trị ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch.

Có nhiều các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị

trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ

dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và

Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng

trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Công ty Sannet Khánh

Hòa.

Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng

như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang

ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn

thế giới [6,19,20].

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam liên quan đến nội dung

nghiên cứu của luận án

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Cấu trúc của fucoidan có thể khác nhau giữa các loài rong nâu khác nhau và có

thể thay đổi khác nhau ngay trong cùng một loài. Do sự không đồng nhất cấu trúc

của fucoidan trong các loài rong nâu, các điều kiện tách chiết khác nhau, làm gia

tăng đáng kể các fucoidan. Có thể cơ bản chia làm hai nhóm, một nhóm fucoidan từ

Laminaria saccharina, L. digitata, Analipus japonicus, Cladosiphon okamuranus,

và Chorda filum có mạch chính được tạo thành bởi liên kết lặp lại đều đặn của các

gốc (1→3)-α-L-fucopyranose, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 hoặc vị trí C-4

(52), (55), (59). Nhóm thứ hai bao gồm fucoidan từ các lòai rong Fucus và

Ascophyllum nodosum có liên kết chính lặp lại một cách tuần tự các gốc (1→3)-α-

L-fucopyranose và (1→4)-α-L-fucopyranose (53), (54), (56), (57), (58). Các

fucoidan này được miêu tả ở bảng 1.4.

Bảng 1.4. Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu

Loài rong

Cấu tạo hóa học của các fucoidan

Tài liệu

nâu

Analipus

3(4Fucp) và 1 (2Fucp) /10 (1→3)-α-L-Fucp(2/4SO3

japonicus

[78]

Ascophyllum

-)-(1→]n

[→3)-α-L-Fucp(2SO3

-)-(1→4)-α-L-Fucp(2,3-điSO3

nodosum

52 Bilan et al.,2007

A.nodosum

(1→3)-α-L-Fucp và một ít (1→4)-α-L-Fucp cùng (1→3)-α-L-

(2 và hoặc 4 Fucp)

53 Chevolot et al., 2001 [11]

Chorda filum

-[→3)-α-L-Fucp-(1-]3→3)-α-L-Fucp(2Fucp)-(1→

54 Mariais et al., 2001 [79 ]

Fucus

-)-(1→

→3)-α-L-Fucp-(2,4-diSO3

-)-(1→4)-α-L-Fucp-(2SO3

55 Chizhov et al., 1999 [12]

distichus L

2004 [31]

F. evanescens

-)-(1→

→3)-α-L-Fucp(2SO3

-)-(1→4)-α-L-Fucp(2SO3

56 Bilan et al.,

2002 [68]

57 Bilan et al.,

-)-(1→

F. serratus L →3)-α-L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)-α-L-Fucp(2SO3

- , R2 = H

a. (~50%): R1 = SO3 b. (~50%): R1 = H, R2 = α-L-Fucp-(1→4) )-α-L-

-)-(1→

Fucp(2SO3

-)-(1→3)-α-L-Fucp(2SO3

Laminaria

→3)-α-L-Fucp(4SO3

- -)-(1→ và thêm →3) )-α-L-Fucp(4SO3

58 Bilan et al., 2006

saccharina

hoặc 2Fucp)-(1→

1998 [80]

Stoechosperm

-)-(1→

→3)-α-L-Fucp(2/4SO3

-)-(1→ và →4-α-L-Fucp(2SO3

ummarginatu

59 Usov et al.,

60 Adhikari et al., 2006 [81]

Daniel và cs từ rong nâu A.nodosum đã sử dụng các enzyme đặc hiệu làm xúc

tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosaccharide và khẳng định sự có mặt của

lượng lớn các liên kết glycoside của gốc -L-fucose(13) và -L-fucose (14)

(53) [82].

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991

bởi Nishino và Nagumo. Phổ NMR của polysaccharide là quá phức tạp để cho phép

giải thích cấu trúc một cách trực tiếp, có thể do tính dị thể của cấu trúc. Cấu trúc của

fucoidan này chủ yếu là -L-fucose(13) với các nhóm sulfate ở C-4, không loại

trừ sự có mặt của các nhóm sulfate khác hoặc các nhánh ở vị trí 2 [83]. Fucoidan từ

-)(1→3)fuc(1→ (61) [84]. Một phân đoạn

Sargassum binderi là →3)fuc(2-OSO3

fucoidan F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme chứa thành phần chính fucose,

galactose, mannose, xylose và GlcA, sulfate chiếm 21.8%, khối lượng trung bình là

92.7 kDa. Cấu trúc của fucoidan phân doạn F32 (62) bao gồm →2)-α-D-Man(1→

và →4)-β-D-GlcA(1→ luân phiên nhau, một lượng ít →4)-β-D-Gal(1→ đã được

trộn lẫn. Nhóm sulfate ở vị trí C-6 của →2,3)Man(1→, C-4 và C-6 của

→2)Man(1→, C-3 của →6)Gal(1→, C-2, C-3 hoặc C-4 của fucose [6].

Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Pelvetia canaliculata bằng phương

pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide bao gồm

tetrasaccharide và hexasaccharide có chứa các đơn vị lặp lại disaccharide →3)-α-L-

-)(1→4)-α-L-Fucp-2,3 (đi SO3

-)(1→, dùng enzyme đặc hiệu này chỉ

Fucp (2SO3

thủy phân liên kết (1→4) do đó xác định được cấu trúc hoàn thiện của fucoidan này

-)(1→3)-α-L-Fucp(2SO3

-)(1→]n

(63) [7].

là [→4)-α-L-Fucp-2,3(đi SO3

Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Cladosiphon okamuranus bằng

phương pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide có

-)(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3

cấu trúc là {→3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3

)(1→3)-[α-D-GlcpA-(1→2)]-α-L-Fucp-(1→}m-3)-α-L-Fucp-(1→3)-α-L-Fucp-

-)(1→3)-α-L-Fucp-4(SO3

-)(1→3)-L-Fuc (m =0, 1, 2, 3) (64) [7].

4(SO3

Fucoidan tách và phân lập từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia bằng phương

pháp sử dụng enzyme đặc hiệu để thủy phân về fucoidan oligosaccharide có đơn vị

cấu trúc cơ bản lặp lại là trisaccharide {→4)-β-D-GlcpA-(1→2)-[α-L-Fucp(3SO3

)(1→3)]-α-D-Manp-(1→}n (65) (66) [7].

Fucoidan từ rong nâu Cladosiphon okamuranus được miêu tả khá chi tiết cấu

tạo của chúng như (67), (68), (69) [7].

Trong thành phần của các fucoidan ngoài fucose và sulfate còn có một lượng

nhỏ các monosaccharide như galactose, glucose, mannose, xylose, axít uronic. Cùng

với sự xuất hiện của nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng

tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. Một số fucoidan mà thành phần chủ

yếu là galactose, fucose và sulfate hay còn gọi là sulfated galactofucan được tách từ

một số loài rong nâu như Laminaria angustata, Laminaria longissima, Alaria

fistulosa, Undaria pinnatifida, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides,

Laminaria gurjanovae và Sargassum patens. Trong khi đó có rất nhiều fucoidan có

cấu trúc rất phức tạp được tách chiết và phân lập từ một số loài rong nâu Dictyota

menstrualis, Padina gymnospora, Spatoglossum schroederi, Hizikia fusiforme,

Sargassum fusiforme, Kjellmaniella crassifolia [7]. Thành phần hóa học của chúng

chứa rất nhiều các đường đơn như fucose, galactose, glucose, mannose, xylose, còn

có uronic acid và sulfate, ngoài ra có thể có nhóm acetyl hóa. Vì vậy việc xác định

cấu trúc của chúng đang là một thách thức đối với các nhà khoa học nghiên cứu cấu

trúc của polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng, tuy vậy chúng ta có thể

xác định được đặc điểm cấu trúc đặc trưng của fucoidan. Trong trường hợp này các

nhà khoa học phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác như phân tích methyl hóa, đề sulfate

hóa, tự thủy phân, enzyme thủy phân fucoidan,… kết hợp cùng các phương pháp

hóa lý hiện đại như NMR 2D, 3D, MALDI-TOF/MS/MS, SAXS để giải quyết bài

toán cấu trúc phức tạp của fucoidan.

Việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI-

TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói

chung và fucoidan nói riêng đã tạo ra một bước đột phá mới trong phân tích cấu trúc

phức tạp của polysaccharide rong biển. Ưu điểm của phương pháp này là khả năng

phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng như trật tự giữa các gốc

đường trong phân tử fucoidan. Việc áp dụng thành công phương pháp này nhóm

nghiên cứu của Anastyuk ở Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm

Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga đã công bố lại cấu trúc

fucoidan từ loài rong Fucus evanescens và thêm 03 loại cấu trúc fucoidan mới từ

các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii

đã được công bố [85,86,87,88,89,90]. Nhóm nghiên cứu do Giáo sư Usov đứng đầu

thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đi tiên phong trong việc sử

dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 1D và hai chiều 2D

để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Kết quả đã có 04 loại cấu trúc của fucoidan từ

các loài rong nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus

distichus L. của Nga được công bố [7,8,10,31,68,78]. Do sự đa dạng về cấu trúc và

hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực công nghiệp dược

liệu. Vì vậy dù đã được bắt đầu nghiên cứu từ hơn 100 năm trước, hiện nay

fucoidan vẫn luôn thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học

trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới. Cho đến nay, phần lớn các công bố

về hoạt tính sinh học của fucoidan được thực hiện trên các sản phẩm fucoidan

thương mại hoặc chiết thô nên mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của

fucoidan thực tế vẫn chưa được nghiên cứu một cách rõ ràng. Vì vậy, để có thể sử

dụng fucoidan làm thuốc thì yếu tố tiên quyết và quan trọng nhất là phải xác định

được cấu trúc chi tiết của chúng.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Fucoidan mới chỉ được biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở

lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha

Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Năm 2006, lần đầu tiên tại

Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và

Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân

lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng

màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch

fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học tự nhiên

vốn có của chúng. Nước ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và

phong phú. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của

fucoidan rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Các nghiên cứu công bố về

fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra các đặc điểm về cấu trúc như thành

phần đường, vị trí nhóm sulfat và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan

chiết thô. Năm 2008, NCS Nguyễn Duy Nhứt đã công bố thành phần và cấu trúc

của phân đoạn fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành

phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đường đơn khác như rhamnose,

mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81 -22,07%), tác giả đã

đưa ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic axít và fucose, nhóm

sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [91].

Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố fucoidan từ rong Turbina ornata

có hàm lượng sulfat cao và thành phần đường rất đơn giản chỉ gồm fucose và

galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung

của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở

vị trí C4. Nhóm sulfate cũng được phát hiện thấy chiếm ưu thế ở vị trí C2 và một

phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh được tạo nên bởi các gốc

galactose liên kết 4 [92].

Hàm lượng fucoidan trong rong Nâu Việt Nam chiếm từ 0,5-2,7 % khối

lượng khô và chúng thuộc về nhóm galactofucan sunfate. Các fucoidan chiết từ 05

loài rong S. polycystum, S. oligocystum, S. swatzii, S. denticarpum và Turbinaria

ornata có hoạt tính chống ung thư gan (Hep-2), ung thư màng tim (RD) và fucoidan

chiết từ rong S.mcclurei có hoạt tính chống ung thư vú cả 06 loại fucoidan này đều

có hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính chống kháng trực khuẩn mủ xanh là P.

Aeruginosa. Trong số fucoidan đem thử hoạt tính thì fucoidan từ rong S.polycystum

và Turbinaria ornata cho hoạt tính cao nhất có hoạt tính cao nhất. Sử dụng các

phương pháp phân tích hóa học, GLC, IR, NMR và ESI-MS nhóm tác giả đã bước

đầu đưa ra được đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn fucoidan từ loài rong

S.polycystum; S.swartzii và Turbina ornata như sau [10,92].

Vị trí nhóm sunfate trong fucoidan chiết từ 03 loài rong thuộc chi rong

Sargassum và loài rong Turbina ornata nằm ở vị trí C4 của vòng pyranosse và chỉ

một phần H4 bị sulfate hóa. Nhóm sulfate ở vị trí C4 của cả 02 monome: fucose và

galactose đối với fucoidan từ rong Turbina ornata. Liên kết glycoside chính trong

mạch là liên kết (1→3) và có thể có mạch nhánh. Từ số liệu trên dựa trên phần mềm

toán học các tác giả đưa ra cấu trúc dự đoán của các phân đoạn trên hình 1.2.

Tuy nhiên các cấu trúc đưa ra trên vẫn chỉ là dự đoán còn một số vấn đề chưa

giải quyết thỏa đáng đó là các dữ liệu phổ về các kiểu liên kết và các chuỗi

oligosaccharide trong mạch chính và mạch nhánh của fucoidan.

OSO3

2↓

4↓

→3)-hex-(1→3)-α-L-fuc-(1→3)-uro-(1→3)-α-L-fuc-(1→3)-α-L-fuc-(1→3)-α-L-fuc-(1→

2↑

Fuc4←OSO3

uro

2↑

OSO3

fuc

hex-(1→3)-α-L-fuc-(1→3)-α-L-fuc-(1→3)-hex-(1→3) -hex-(1→3)-hex-(1→3)-α-L-fuc-(1→3)-α-L-fuc-(1→3)-hex-(1→3)-

2↓ 4↑

2↑

4↑

2↓ 4↑

4↑

hex

uro

OSO3

3↑

uro

→3)-α-L-fuc-(1→3)-α-L-fuc-(4.SO3

-)-(1→3)-β-D-gal-(4.SO3

-)-(1→

Hình.1.2. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan đặc trưng tách và phân lập từ rong

a;S.polycystum (F4- cetavlon) b; S.swartzii (F4- cetavlon) c Turina ornata(F2-DEAE

sephadex).

nâu

Năm 2013 B.M.Lý, T.T.T.Thủy, Trần T.T.Vân, Usov và cộng sự đã tìm ra

được cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum polycystum Việt Nam:

C G A

...→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→2)-α-D-Gal-(1→…

C G B

...→2)-α-D-Gal-(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→2)-α-D-Gal-(1→…

D G

...α-D-Gal-(1→3)-α-L-Fuc-(1→2)-α-D-Gal-(1→…

A or B H E

...→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→2)-α-D-Gal-(1→…

↑

α-L-Fuc

F A or B H

...→3)-α-L-Fuc-(1→3)-α-L-Fuc-(1→2)-α-D-Gal-(1→…

↑

β-D-Gal-(1→4)-α-D-Gal

L M

Hình 1.3: Cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum polycystum[10].

Phạm Đức Thịnh [20,86] fucoidan từ 05 loài rong S.denticapum,

S.polycystum, S.swartzii, S.mcclurei và Turbina ornata và nghiên cứu đặc trưng cấu

trúc của các phân đoạn đại diện cho fucoidan của mỗi loài rong, thu được những kết

quả chính sau. Phân đoạn fucoidan SdF3 từ rong S.denticapum có thành phần là

fucose (51,9%), galactose (34,4%), mannose (5,8%) và xylose (8,9%). Hàm lượng

sulfate (39,14%). Liên kết đường trong mạch chủ yếu là liên kết 1→3, nhóm sulfate

chủ yếu ở vị trí C4. Phân đoạn fucoidan SpF3 từ rong S.polycystum có thành phần là

fucose (68,8%), galactose (26,9%) và xylose (4,5%), hàm lượng sulfate (33,99%).

Liên kết đường trong mạch chủ yếu là liên kết →3)-α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate

chủ yếu ở vị trí C4. Phân đoạn fucoidan SwF5 từ rong S.swartzii có thành phần là

fucose (57,1%), galactose (27,4%), mannose (4,0%), xylose (0,9%), rhamnose

(2,0%) và glucose (2,0%), hàm lượng sulfate (42,3%). Liên kết đường chủ yếu

trong mạch là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)-α-L-Fucp-(1→, nhóm

sulfate chủ yếu ở vị trí C2. Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong S.mcclurei có thành

phần là fucose (58,5%), galactose (41,5%), hàm lượng sulfate (35%). Liên kết

đường trong mạch chủ yếu là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)-α-L-

Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và/hoặc C4. Phân đoạn fucoidan ToF2

từ rong Turbina ornata có thành phần là fucose (69,6%), galactose (27,7%) và

rhamnose (2,7%), hàm lượng sulfate (43,26%). Liên kết đường chủ yếu trong mạch

là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)-α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ

yếu ở vị trí C2. Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong Sargassum mcclurei, cấu trúc của

chúng gồm:

-)-(1→3)-Fuc(2,4SO3

-)-(1→ chèn thêm vào gốc α-L-Fucp(3SO3

→3)-Fuc(2,4SO3

liên kết 4 và gốc galactose liên kết 6 ở đầu cuối khử.

-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc(2SO3

-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc

Fuc(2SO3

-)-(1→3)-Fuc(2SO3

-)-(1→4)-Gal-(1→3)- Fuc-(1→3)- Fuc

Gal(2SO3

Lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L-Fucp và gốc

→4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong Sargassum

Trong luận án của Hồ Đức Cường [19] fucoidan chiết tách từ rong nâu

Sargassum henslowianum đã được xác định với thành phần đường chính là fucose

và glucose. Cấu trúc hóa học của fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α(1→3)-

L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C-2, C-4 và một phần của C-3 của fucose.

Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C-4 và liên kết với mạch chính

qua liên kết glycoside (1 -4). Đây là một fucoidan có cấu trúc mới vì đa số

các fucoidan chỉ bị sulfate hóa ở 1 hoặc 2 vị trí của fucose, trong khi fucoidan

này cả 3 vị trí C-2, C-3 và C-4 đều bị sulafte hóa. Đã xác định fucoidan tách chiết từ

rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả

phân tử và ở kích thước cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng

các phương pháp hiện đại như tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ

(SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan được nghiên cứu.

Đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của

fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể

hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm nhưng

không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu

Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày

đã có tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh hoá mỡ máu, khối lượng mỡ trên mô

hình chuột béo phì.

Về nghiên cứu giữa cấu trúc và hoạt tính của fucoidan từ lâu luôn hấp dẫn

các nhà khoa học bởi tính phức tạp cũng như những phát hiện lý thú của nó. Các kết

quả nghiên cứu của Thành Thị Thu Thủy [93] cho thấy fucoidan từ nguồn rong nâu

Sargassum polycystum, Sargasum mcclurei và Tubinara ornata ở Việt nam thể hiện

hoạt tính kháng HIV và hàm lượng của nhóm sulfate có thể là yếu tố mạnh nhất ảnh

hưởng đến hoạt tính HIV.

Kết luận tổng quan luận án:

Các nghiên cứu về hàm lượng, thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của

fucoidan tách chiết và phân lập từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii,

Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum và Sargassum binderi, chưa được

nghiên cứu đầy đủ và hệ thống.

Về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính của fucoidan từ hai loài rong nâu nghiên

cứu trong luận án Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens chưa được nghiên

cứu ở trong và ngoài nước.

Cấu tạo hóa học của fucoidan từ 6 loài rong nâu: Sargassum polycystum

(Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum

denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto), đã được

nghiên cứu ở các công trình trước, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào nói về mối

quan hệ giữa cấu tạo mạch nhánh của fucoidan với hoạt tính gây độc tế bào. Vì vậy

chúng tôi sẽ nghiên cứu mối quan hệ giữa hình dạng, kích thước với hoạt tính sinh

học của fucoidan nhánh từ 6 loài rong trên.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là sulfated polysaccharide (fucoidan) phân

lập từ một số loài rong nâu. Rong nâu được thu thập tại các vùng biển ở vịnh Nha

Trang, Khánh Hòa, Việt Nam. Đối tượng nghiên cứu của luận án cụ thể như sau:

Fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium (FSA) và Turbinaria

decurrens (FTD), các fucoidan này dùng để nghiên cứu cấu trúc hóa học và hoạt

tính sinh học của luận án. Hai loài rong nâu này là đối tượng chính của luận án.

Mô tả thực vật học của rong nâu Sargassum aquifolium J. Ag (Hình 2.1)

Rong dài 50-80 cm, đĩa bám hình nón rộng 1-1,5 cm, chia thùy. Trục chính

ngắn 5 mm, mang 3-4 nhánh chính, hình trụ trơn, đường kính 1-1,5 mm. Các nhánh

bên dài khoảng 10-30 cm, mọc cách nhau 1-5 cm. Lá dày có hình bầu dục, dài 1-3

cm, rộng khoảng 1 cm. Mép lá có răng cưa to và thường dày lên thành hai hàng

răng hay có mâm nhỏ ở chót lá. Gân giữa ít rõ, ổ lông nằm rải rác, rõ ràng. Phao ít,

hình xoan, dài 3-5 mm, rộng 2-3 mm, trơn hay có mũi hoặc gai ở đầu. Cọng phao

hình trụ hay hơi dẹp, trơn hay có ít gai nhỏ, ngắn hay dài bằng phao. Rong cùng

gốc. Đế dẹp, mọc hành chùm dày ở nách lá, phân nhánh đôi không đều, có gai, dài

3-5 mm. Rong khô có màu nâu. Sinh học và sinh thái: Loài thường gặp ở các bãi

san hô chết sâu 2-3 m, mọc rải rác hoặc thành đám như ở Hòn Chồng, Xóm Bầu.

Rong trưởng thành muộn vào tháng 4-5 [2].

Mô tả thực vật học của rong nâu Turbinaria decurrens Bory (Hình 2.1)

Hình dạng rong Rong có nhánh chính cao 10 - 20 cm, đường kính 3 - 4 mm,

bám nhờ rễ. Chung quanh nhánh chính có mang nhiều lá rất đặc biệt, xòe to ra

thành một phiến cỏ hình tam giác, to cỡ 2 cm hơi lõm ở giữa, mép có răng cưa,

không mang phao. Phiến này được mang bằng một cọng dài 1,5 cm hình 3 cạnh, có

răng cưa nhỏ. Đế hình trụ, mọc thành chùm dày, phân nhánh, mọc ở nách lá. Rong

khô có màu vàng hay nâu. Rong được gặp trên đá san hô chết ven các đảo hay các

mũi đá ngoài xa, mọc rải rác ở sâu 1 – 3m, ở vùng Quảng Ngãi, Nha Trang, Phan

Rang. Ngoài ra còn phân bố ở Malaysia, Ấn Độ Dương và Biển Đông [2].

Hình 2.1: Hình dạng rong Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens

Fucoidan từ 6 loài rong nâu: Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum

mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd),

Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto), các fucoidan này đã được

nghiên cứu cấu trúc, dùng để nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính

sinh học.

Fucoidan từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum,

Sargassum denticapum và Sargassum binderi, là đối tượng nghiên cứu về thành

phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của fucoidan.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng là: Chiết tách các fucoidan từ

rong nâu bằng các phương pháp chiết tách thông thường, tham khảo các công bố

trên thế giới phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của luận án.

Các phương pháp chính để xác định thành phần và cấu trúc của các fucoidan

là kết hợp các phương pháp sắc ký, phương pháp hóa học, phổ hiện đại (IR, NMR,

MS, SAXS) và các phép thử hoạt tính sinh học.

Xác định cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là

một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu

trúc của fucoidan chiết từ rong nâu thường hết sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề

như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh

và polymer hóa của chúng. Vì vậy, để xác định được cấu trúc của fucoidan cần phải

phân tích, xác định được các thông số sau: Thành phần các gốc đường và hàm

lượng sulfate, vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường, vị trí liên kết giữa các gốc

đường, trật tự sắp xếp của các gốc đường.

2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan

2.2.1.1. Phương pháp tách chiết fucoidan

Chiết tách fucoidan thực hiện theo phương pháp của Bilan và cộng sự [68]

đây là phương pháp được áp dụng phổ biến nhất thế giới. Mẫu rong khô 200g được

xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH-CHCl3-H2O tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các

chất màu, lọc rửa với axeton, sấy khô. Sau khi sấy khô bã rong được chiết với

250ml dung dịch CaCl2 2% (5 lần) mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 850C trong

5 giờ. Dịch chiết 5 lần được gom lại, sau đó thêm 80ml dung dịch

hexadecyltrimethylammoniumbromide nồng độ 10% trong nước. Tủa tạo thành

được li tâm, rửa với nước nhiều lần, sau đó khuấy trộn với 150ml dung dịch NaI

20% trong cồn để ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, ly tâm tách lấy phần tủa

(làm như vậy 5 lần), sau đó rửa với cồn và hòa tan lại trong nước. Dung dịch được

thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu được fucoidan thô dưới dạng muối Na

(Ký hiệu F), hiệu suất chiết tách tính theo trọng lượng rong khô.

2.2.1.2. Phương pháp phân đoạn fucoidan

Fucoidan thô được hòa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần tủa

không tan là axít polyuronic (PA), phần dịch trong đưa lên cột DEAE-Sephacel.

Đầu tiên rửa cột với dung dịch 0,04N HCl đến khi thử âm tính với cacbonhydrate

bằng phương pháp phenol-axit sulfuric [94], tiếp theo rửa cột với gradient nồng độ

từ 0-2N NaCl hoặc rửa từng nồng độ của NaCl: 0N; 0,5N; 1N; 1.5N và 2N, các

phân đoạn fucoidan thu được theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch

muối NaCl được thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa trong

nước cất với thời gian 48h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan

dạng bột [95].

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan

2.2.2.1. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa

Để xác định vị trí của các liên kết trong fucoidan chủ yếu được thực hiện

bằng phương pháp metyl hóa [12]. Nguyên tắc của phương pháp dựa vào xác định

dạng và số lượng dẫn xuất metyl eter của các đại lượng đường sau khi metyl hóa

các nhóm hydroxy tự do trong chúng, phản ứng này luôn thực hiện trong dung môi

là Dimethyl sulfoside (DMSO) [68]. Ví dụ: nếu sản phẩm thủy phân sau khi metyl

hóa là dạng 2,3,6 tri-O-methyl α-D-glucopyranoza thì có thể cho rằng các gốc

glucozơ liên kết với nhau qua liên kết (1→4) [96].

Hình 2.2. Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycosit trong polysaccharide

2.2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để phân tách

các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. GPC có thể xác

định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lượng trung bình Mw,

trọng lượng phân tử trung bình số Mn, và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là

sự phân bố trọng lượng phân tử của nó. GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất

phân tử lớn như polymer tổng hợp hay các polymer tự nhiên như polysaccharide.

Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố trọng lượng phân tử, GPC cũng tách

một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần của nó như polymer,

oligomer, monomer và các chất phụ gia [97].

Tác giả Descamps và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel

được áp dụng để tinh chế và phân đoạn fucoidan theo trọng lượng phân tử. Áp dụng

sắc ký thẩm thấu gel sau khi thực hiện sắc ký trao đổi ion là phương pháp đặc trưng

để loại bỏ muối được sử dụng để giải hấp chất quan tâm khỏi nhựa trao đổi ion.

Mặc dù, thẩm tách và kết tủa trong cồn cũng được sử dụng cho mục đích loại muối

và các hợp chất trọng lượng phân tử thấp. Tuy nhiên, sắc ký thẩm thấu gel là

phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này cho phép phân đoạn

fucoidan theo trọng lượng phân tử, đồng thời loại bỏ được muối cũng như các tạp

chất trọng lượng phân tử thấp khác. Các loại nhựa được sử dụng cho việc tinh chế

và phân đoạn polysaccharide là Sephadex G-50 và G-100, Sepharose CL-6B, CL-48

và Sephacryl S-400 [12]. Sắc ký thẩm thấu gel và sắc ký trao đổi anion không gây

ảnh hưởng lên nhóm este sulfate của polysaccharide. Tuy nhiên, sự thay đổi mạnh

về lực ion có thể ảnh hưởng đến cấu hình không gian của các polysaccharide.

Những sự thay đổi về cấu hình phân tử này có thể cũng ảnh hưởng đến hoạt tính

sinh học của chúng.

2.2.2.3. Phương pháp phổ IR

Phương pháp phổ hồng ngoại là phương pháp vật lý được ứng dụng rộng rãi

trong phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ nói chung và của fucoidan nói

riêng. Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng, đặc biệt là

với nhóm sulfate. Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ

hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc

đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4,

còn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để

xác định rõ ràng hơn vị trí này [17,18,20].

Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại

Đỉnh Dao động

775 Dao động dãn vòng của - anome

802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6

Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial 822

Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 845

847 Dao động của liên kết C1-H của -anome

893 Dao động của liên kết C1-H của  anomer

917 Dao động vòng của -anome

1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal

1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C

1255-1264 Dao động hoá trị của S=O

Dao động hoá trị đối xứng của COO 1420

Dao dộng gấp của C-H 1430

Dao động hoá trị của C=O 1730

3300-3440 Dao động hoá trị của O-H

2.2.2.4. Phương pháp phổ NMR

Việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp phổ cộng

hưởng từ hạt nhân là một phương pháp mạnh, có thể cung cấp thông tin chi tiết về

cấu trúc phân tử mà khó có thể nhận được bằng bất kỳ phương pháp nào khác.

Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của cacbohydrat

(bao gồm cả mono-, oligo- và polysaccharide-) có độ dịch chuyển hóa học nằm

trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosaccharide có độ dịch

chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các

proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-

anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được coi như một phương pháp đặc

trưng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu  từ 1.2

đến 1.4 ppm là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl, các tín hiệu có độ dịch

chuyển hóa học  từ 5.0 đến 5.5ppm là vùng của H-1 (H-) của fucoidan.

Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiều thuận

lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysaccharide do các tín hiệu

1H-NMR. Vì vùng giá trị  lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau như trong phổ

trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ

proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện

trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện

trong vùng từ 60-80 ppm. Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trưng để nhận biết

trong phổ 13C-NMR là vùng trường cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6)

của vòng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thường xuất hiện

trong vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng

từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axit uronic các tín hiệu sẽ xuất

hiện ở vùng trường thấp hơn từ 170-180 ppm. Các tín hiệu của nguyên tử cacbon có

gắn với nhóm -OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện

trong vùng trường cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín hiệu của các nguyên tử

cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng

furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 13C và 1H của polysaccharide thường

có độ phân giải thấp, các tín hiệu trùng lấp nhau khi trong phân tử của chúng có

chứa nhiều gốc đường tương tự nhau. Điều này gây ra rất nhiều khó khăn trong việc

giải thích chi tiết cấu trúc của polysaccharide. Khi đó, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

hai chiều sẽ giúp xác định thêm những thông tin về các liên kết trong phân tử, thông

qua các tương tác giữa proton với proton và giữa proton với cacbon. Phổ 1H, 1H-

COSY (Correlation spectroscopy) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 1H của hạt

nhân cùng loại, phổ 1H, 13C-COSY (hay cũng được gọi là phổ HMQC

(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) hay HECTOR (Heteronuclear

Correlated Spectroscopy)) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 13C của các hạt

nhân khác loại. Phổ hai chiều 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy) thể hiện sự tương tác của các proton nằm trên các nguyên tử cacbon

ở cách xa nhau nhưng khoảng cách không gian giữa chúng nhỏ hơn 4Å. Phổ 2D-

HMBC (Hecteronuclear Multiple Bond Coherence) thể hiện mối tương quan của tín

hiệu 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của nguyên tử 13C khác cách xa nó 2 hoặc

1H với 13C liên kết trực tiếp với nhau. Phổ 2D-TOCSY (Totally Correlated

3 liên kết, ngược lại phổ 13C-1H HMQC hay HETCOR thể hiện mối tương tác của

Spectroscopy) là phổ tương quan toàn phần biểu diễn sự tương quan của các proton

liên kết và không liên kết trực tiếp nhưng trong cùng một hệ spin giống nhau. Ví dụ:

tất cả proton của một gốc đường là thuộc cùng một hệ spin giống nhau. Tóm lại,

phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin để xác định

trình tự và vị trí của các liên kết trong phân tử polysaccharide thông qua các tương

tác giữa proton với proton và proton với cacbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt

nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp.

Như vậy, có thể thấy việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide là rất

khó khăn, nhưng với polysaccharide sulfate hóa từ rong biển còn khó khăn hơn rất

nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ

lặp lại không cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR

là không đủ và đôi khi không mang lại hiệu quả. Để phân tích cấu trúc các

polysaccharide phức tạp này các tác giả [7,8,10,17,20] thường kết hợp các phương

pháp hóa học như chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion,

sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề

acetyl hóa, sau đó kết hợp các phương pháp phổ NMR, đôi khi cả phương pháp khối

phổ (MS) để phân tích cấu trúc.

Bảng 2.2. Độ dịch chuyển hóa học của C và H trong một số gốc đường

Vị trí H H1 H2 H3 H4 H5 H-6a H-6b

5.2 4.2 3.96 3.92 4.04 3--Man-1

--1 5.15

3.91 4.07 4.76 4.55 3--L-fuc-4-SO3

4.15 3.44 3.63 3.82 3.76 4--GlucpA-1

4.72 3.67 3.84 3.94 3.60 3.74 2--Glap-1

C1 105 C2 73 C3 74.5 C4 89.7 C5 75.6 C6 61.9

H1 H2 H3 H4 H5 H-6a H-6b Vị trí H

C1 C2 C3 C4 C5 C6 Vị trí C

5.14 4.21 3.99 3.82 3.81 3--D-man-1

103.1 71 79.7 67.5 74.8 62.3

5.26 4.24 4.05 3.93 3.75 3,2--D-man-1

101.8 78.5 79.3 68.1 74.7 62.3

5.26 4.1 3.95 3.71 3.71 2--D-man-1

101.8 78.5 79.3 68.1 74.7 62.3

5.03 4.12 3.89 3.57 3.86 1.3 3--L-rha-1

103 71.3 79.1 72.6 70.4 17.9

101.9 79.2 71.2 73.6 70.4 17.8 2--L-rha-1

4.07 3.94 3.48 3.82 1.30 5.19

4.26 3.99 3.65 3.09 1.36 5.24 2,3--L-rha-1

102.1 76.1 77.3 72.2 70.6 18.0

4.791 3.431 3.654 3.563 3.466 3.915 3.727 3--D-glucp-1

4.419 3.590 3.43 3.928 3.712 3.81 -D-galp-16

105.4 72.74 74.49 70.66 70.21 63.1

4.55 3.35 3.55 3.45 3.53 3.77 3.95 3--D-glucp-1

102.9 73.5 75.9 69.8 76.5 60.9

4.98 3.99 3.99 4.24 3.78 3.78 3.78 2,3--D-galp-1

100.1 73.7 81.6 70.3 76.1 62.15

4.64 3.59 3.64 3.99 3.69 3.77 3.77 3--D-galp-13

105.2 72.5 74.6 70.1 76.5 62.4

4.47 3.38 3.48 3.51 3.37 3.96 3.82 -D-glucp-1

103.7 73.9 76.9 70.5 77.6 62.1

101.1 73.2 73.8 73.2 72.8 74.4 -D-glucpA-1

5.03 3.61 3.88 3.56 4.78

5.30 4.62 4.26 4.17 4.5 1.31 3--L-fuc-2-SO3

101.4 76 76 71. 8 69.4 18.2

5.29 3.85 3.95 4.22 4.16 3.78 4--D-gal-1

102.9 71.5 70.9 80.9 73.9 63.0

4.40 3.78 3.75 4.12 3.73 3.78 3--D-gal-1

105.3 72.3 82.7 70.4 77.5 63.0

5.20(3.9) 3.77 3.86 3.81 4.20 1.21 -L-fuc

93.12 69.09 70.29 72.79 67.10 16.33

5.49(3.6) 4.41 4.00 3.89 4.27 1.22 -L-fuc-2-SO3

93.22 78.62 70.21 75.00 69.03 18.36

5.26(4.0) 3.94 4.54 4.17 4.27 1.23 -L-fuc-3-SO3

95.11 69.00 80.82 73.05 69.03 18.36

5.22(3.7) 3.81 3.98 4.62 4.34 1.27 -L-fuc-4-SO3

95.11 71.26 71.26 83.66 68.46

5.34 4.65 4.26 4.17 4.5 1.3 2,3--L-fuc-1

101.4 76 76 72.1 69.4 18.2

2.2.2.5. Phương pháp phổ MS

Kỹ thuật ESI/MS: Nguyên lý chung của kỹ thuật ESI (hình 2.3): trong kỹ thuật

phun mù điện tử, sự ion hóa được thực hiện bằng cách sử dụng điện trường để tạo

các giọt tích điện, tiếp theo các ion phân tử sẽ được tạo ra thông qua sự ion hóa hơi

dung môi từ các giọt đó. Ion hóa phun mù điện là quá trình mà các ion được tạo nên

từ pha lỏng và phát sinh từ sự co các giọt tích điện. Luồng khí N2 được phun cùng

với dung dịch để tạo mù, các giọt ban đầu được hình thành là nhờ vào điện trường,

sự giới hạn tốc độ dòng và % nước trong dung dịch,... Luồng khí trơ nóng được thổi

vào các giọt tích điện, làm bay hơi dần dung môi, khi đó diện tích bề mặt của các

giọt sẽ bị co lại. Khi tỷ lệ điện tích/thể tích giọt vượt quá giới hạn Rayleigh sẽ dẫn

đến sự nổ Coulomb tạo thành các giọt tích điện mới bé hơn và dần dần là ion phân

tử.

Hình 2.3. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ion hóa ESI-MS

Có 5 bước chính trong quá trình hình thành ion:

+ Ion hóa trong dung dịch: mẫu được ion hóa trong dung dịch nhờ vào bản

chất của mẫu và sự có mặt của các ion khác trong dung dịch.

M – NH2 + HA → [M-NH3]+ + A-

M – COOH + B → [M-COO]- + BH+

Hoặc

M + Na+ ↔ [M-Na+]

+ Quá trình tạo mù: Quá trình tạo mù bắt đầu khi dung dịch mẫu đi vào

buồng phun thông qua một kim phun, khí tạo mù cũng đi vào buồng phun qua một

ống bọc ngoài kim này. Sự kết hợp của một dòng khí tạo mù với một điện trường

mạnh (2,5-6,0 kv) trong buồng phun kéo dung dịch mẫu rơi xuống và tạo thành các

giọt tích điện.

+ Đề solvat hóa các giọt tích điện: khí nitơ nóng hóa hơi dần dung môi trong

các giọt làm tăng tỉ lệ điện tích/thể tích. Giới hạn Rayleigh là điện tích tối đa mà

một giọt còn có thể giữ được so với thể tích vốn có của nó. Khi điện tích vượt quá

giới hạn này sẽ dẫn đến sự nổ Coulomb, giải phóng ra các giọt nhỏ hơn và sau đó sẽ

là mẫu mang điện tích.

+ Giải phóng ion khỏi dung dịch: khi năng lượng của giọt vượt quá năng

lượng solvat hóa của chất tan trong dung dịch, ion sẽ được giải phóng vào pha khí.

+ Phản ứng của ion trong pha khí: các phản ứng chuyển và trao đổi điện tích

có thể xảy ra từ buồng áp suất thường đến tận vùng chuyển ion

Theo cơ chế này các mảnh tạo thành khi nhóm sulfate trong vòng đường

chiếm vị trí C-2, C-3, C-4 sẽ xuất hiện một số mảnh đặc trưng tương ứng. Trong

chế độ đo ion âm (negative mode), các gốc đường chứa nhóm sulfate thường bị cắt

đến monomer trước khi vòng đường bị phá vỡ. Tùy theo vị trí các gốc sulfate trong

phân tử đường mà cơ chế phân mảnh các gốc đường xảy ra như sau (hình 2.4 và

2.5) [17,18,20,98]. Các mảnh do vòng fucose sulfate bị phá vỡ tạo thành được kê

theo bảng 2.3:

Hình 2.4. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate

Hình 2.5. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate

Bảng 2.3: Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate

ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm

0,2A

0,3A

0,4A

0,2X

0,3X

0,4X

Vị trí

sulfate

103 73 43 139 169 199 2-O-

183 73 43 59 169 199 3-O-

n,mA, n,mX: cắt theo liên kết n,m của vòng đường như hình 6

183 153 43 59 89 199 4-O-

Trong trường hợp có mặt của ion kim loại, các oligosacaride sẽ phân mảnh

theo các cơ chế sau (hình 2.6) [17,18,20,98]

Hình 2.6. Cơ chế phân mảnh oligosacarit với sự có mặt của ion kim loại

Hình 2.7. Phổ MS và cơ chế phân mảnh của fucoidan

Bảng 2.4. Fucoidan phân đoạn SmF3 của rong S. mcclurei [20,86]

m/z

Thành phần/đặc trưng cấu trúc của monosaccharide

và oligosaccharide

MALDI [M* - Na]−

ESI [M - nNa]n−

−)

Fuc(4 SO3

−), Fuc(2 SO3

−), Fuc(3 SO3

243.00

243.016

−)

Gal(4(6) SO3

−), Gal(2 SO3

259.012

[Fuc2(SO3)]−

389.10

389.077

−)-(1,3)-Fuc

Gal(2 SO3

405.10

405.070

−)

Fuc(2 SO3

−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

491.04

234.0102-

−)

Fuc-(1,3)-Fuc(2,4 SO3

−) **

Fuc(2 SO3

−)-(1,4)-Fuc(2 SO3

−)

Fuc(2 SO3

−)-(1,4)-Fuc (2,3 SO3

182.3233-

−)-(1,3)-Fuc **

Fuc(2,4 SO3

−)

Gal(4/6,3 SO3

−)-(1,3/4)-Fuc(2/3SO3

187.6542-

−)

Fuc(2,4 SO3

−)-(1,4)-Gal(2 SO3

−)

Gal(2 SO3

−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

507.03

242.008

−) **

Gal(2 SO3

−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

[Fuc3(SO3)]−

535.15

535.136

[Fuc3(SO3)]3−

231.007

−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc

Gal(2SO3

551.15

[Fuc2Gal(SO3)3]3−

236.341

[Fuc2Gal(SO3Na)2 − Na]−

315.0402-

653.05

[Fuc4(SO3)]−

681.16

[Fuc3Gal(SO3)]−

697.15

[Fuc4(SO3Na)2 − Na]−

783.04

380.0742-

[Fuc3Gal(SO3Na)2 − Na]−

799.03

388.0702-

−)

Gal(2 SO3

−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(SO3

−)-(1,3)-Fuc(SO3

285.0283-

−)

Gal(4/6,2 SO3

−)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(2 SO3

−)

Fuc-(1,4)-Gal(3 SO3

−)-(1,3)-Fuc(2 SO3

−)-(1,3)-Fuc(2SO3

[Fuc5(SO3)]−

827.13

[Fuc4Gal(SO3)]−

843.12

[Fuc3Gal2(SO3)]−

859.10

[Fuc4Gal(SO3Na)2 − Na]−

944.97

460.0942-

[Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc − Na]−

960.95

[Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal(2SO3Na)-(1,3)-Fuc-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc − Na]−

[Gal(2SO3Na)-(1,3)-Fuc(2SO3Na)-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc − Na]−

[Gal(4SO3Na)-(1,3)-Fuc-(1,4)-Gal-(1,3)-Fuc(4SO3Na)-(1,3)-Fuc − Na]−

[Fuc3Gal2(SO3)3]3−

339.0513-

[Fuc5Gal(SO3)−

989.05

[Fuc4Gal2(SO3)]−

1005.04

[Fuc3Gal2(SO3Na)3 − Na]−

1062.79

338.551

[Fuc5Gal(SO3Na)2 − Na]−

1090.87

[Fuc4Gal2(SO3Na)2 − Na]−

1106.87

541.065

*M: muối natri sulfate oligosaccharide ** Các ion mảnh đặc trưng cho kiểu liên kết có cường độ thấp

2.2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)

Hiện nay, các phương pháp tán xạ là rất hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc

không gian của phân tử chất tan trong dung dịch được các nhà khoa học ứng dụng

hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc [92,99]. Điều lý thú của các phương pháp này là

dựa vào đường cong tán xạ ta có thể biết được các thông số cấu trúc như trọng

lượng, kích thước và hình dạng của phân tử chất tan. Các quá trình tán xạ đều tuân

theo phương trình Bragg:

λ = 2dsinθ

Ở đây,  d và  là bước sóng của tia tới, kích thước của vật tán xạ và góc tán

xạ. Như vậy, với góc tán xạ nhỏ thì có thể nghiên cứu được phân tử lớn. Đường tán

xạ phản ánh sự phụ thuộc của cường độ tán xạ vào góc tán xạ.

Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) với bước sóng nhỏ ( = 0,154nm)

có thể đo được các kích thước của phân tử ở kích thước cỡ nano (local structure).

Do vậy, bằng phương pháp này cấu trúc không gian của phân tử được nghiên cứu.

Phương pháp SAXS rất hữu hiệu trong việc nghiên cứu kích thước, hình

dáng của các chất ở kích thước từ 1 - 100nm trong dung dịch. Dựa vào giá trị của

bán kính từ hồi chuyển để xác định hình dạng của phân tử chất tan. Ví dụ: với phân

tử chất tan có dạng hình trụ đường tán xạ biểu diễn bằng phương trình:

Gc/2)

I(q) = exp (-q2R2

Với RGc là bán kính hồi chuyển của mặt cắt; I(q) là cường độ tán xạ và q là

biên độ của vector tán xạ. RGc được xác định bởi độ dốc của đường ln(q.I(q)) và q2 –

được gọi là “ đồ thị Guinier”, với điều kiện qRGc<1.

Phương pháp LS cho biết các thông tin cấu trúc như bán kính hồi chuyển,

bán kính động học, trọng lượng phân tử... từ sắc đồ tán xạ. Từ bán kính hồi chuyển

Rg (xác định từ tán xạ ánh sáng tĩnh) và bán kính động học Rh (xác định từ tán xạ

ánh sáng động) có thể tính được thông số cấu trúc , thông số này cung cấp các

thông tin về cấu trúc không gian của phân tử chất tan trong dung dịch. Nó giúp

chúng ta xác định phân tử có cấu trúc không gian kiểu chuỗi xoắn, hình trụ hoặc

hình cầu. Bảng 2.5 đưa ra các giá trị khác nhau của  trong cấu trúc của các

polymer.

Thông số cấu trúc ρ là được xác định theo tỷ số:

Ρ = Rg/Rh

Bảng 2.5. Thông số  đối với một số dạng cấu trúc polymer

ρ Cấu trúc không gian

Hình cầu 0.788

Hình sợi 1.50-1.78

Cấu trúc mạch nhánh 1.78-2.0

Hình trụ >2.0

Trọng lượng phân tử trung bình (Mw), bán kính hồi chuyển (Rg) và hệ số thứ

hai của phương trình khí thực nghiệm (A2) được xác định bằng phương trình sau:

Trong đó K là hệ số tương phản quang học; c là nồng độ dung dịch polymer;

Rθ là hệ số Rayleigh; q là giá trị vector tán xạ dọc; θ là góc tán xạ; n0 là chiết xuất

của dung môi; dn/dc là số gia chỉ số khúc xạ của dung dịch; N0 là số Avogadro, và

λ0 độ dài bước sóng trong chân không. Bán kính động Rh xác định bằng phương

pháp tán xạ ánh sáng động (dynamic light scattering – DLS) được xác định theo

phương trình Stokes-Einstein:

rong đó: D là hệ số phân bố; k là hằng số Boltzmann; T là nhiệt độ tuyệt đối,

η là độ nhớt dung môi [92,99].

2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro

Hoạt tính gây độc tế bào được thử tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện

Hóa học các hợp chất thiên nhiên; Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm

sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung

thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks

và Skehan [100, 101]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số

dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein

của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ

lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều

(lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong

điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng

để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ

dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml (hoặc ở dải nồng độ 20 g/ml; 4 g/ml;

0,8 g/ml; 0,16 g/ml). Đối với chất tinh khiết thử với dãi nồng độ 4 g/ml; 0,8

g/ml; 0,16 g/ml; 0,04g/ml.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm

để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi

trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180l) sẽ

được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố

định tế bào bằng axít trichloracetic (TCA).

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy

giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC. Loại

màu SRB thừa không gắn với protêin và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng

axít axetic 1% rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã

bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử

dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của

chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế

bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

] ± ϭ

% Ức chế = 100% - % CS

Trong đó OD: Mật độ quang

σ: độ lệch tiêu chuẩn, được tính theo công thức: σ =

Trong đó: xi: giá trị OD tại giếng i

x: giá trị OD trung bình

n: số giếng thử lặp lại

Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine

(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các

nồng độ 10g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL. DMSO10% luôn được sử

dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được

xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Dùng giá trị CS% của 10 nồng

độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát

triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.

Công thức:

Trong đó: y: nồng độ chất thử

X: Giá trị CS (%)

Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa

học) hoặc IC50  5 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây

độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.

2.2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khối tế bào ung

thư trên thạch mềm

Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm được thử tại Phòng Sinh

học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp của Kim (2005) và Gao (2002)

[102,103]. Kỹ thuật theo dõi sự hình thành khối tế bào là thử nghiệm sự bám dính

và hình thành khuẩn lạc trên thạch mềm, đây được coi là kỹ thuật nghiêm ngặt trong

kiểm tra sự biến đổi của tế bào. Theo kỹ thuật này, tế bào (đã được xử lý bằng các

chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư) được nuôi cấy cùng với chất điều

chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong 10-20 ngày. Tiếp theo giai đoạn

nuôi cấy này, các khuẩn lạc hình thành được nhuộm rồi phân tích hình thái, hoặc

đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên mỗi giếng, thực hiện theo phương pháp của

Skehan và cộng sự [104]. Tóm tắt như sau: Tế bào nuôi trong môi trường MEM bổ

sung 10% FBS ở 370C trong tủ ấm CO2 (5% CO2). Tế bào phát triển trong bình nuôi

cấy 1 lớp, đạt đến phase Log, tế bào được tách khỏi bình và tách rời nhau bởi

trypsin, đếm và hòa lại vào môi trường thạch loãng (0,35 % với thạch mặt và 0,5%

với thạch nền) với nồng độ tế bào 3,33 x 100/mL. Trộn mẫu thử với nồng độ đầu 5-

25 µg/mL. Thí nghiệm được tiến hành trên phiến 6 giếng, lặp lại 2-3 lần. Sau 10-20

ngày lấy ra và nhuộm tế bào bằng tím kết tinh 0,005%, đọc kết quả dưới kính hiển

vi ngược có gắn camera và nối ra máy tính. Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên

thạch được tính lặp lại 3-5 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc [105].

2.2.3.3. Hoạt tính chống đông tụ máu

Đông máu là một quá trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do sự

chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này bị trùng hợp tạo

thành mạng lưới giam giữ các thành phần của máu làm máu đông lại.

Đông máu và chống đông là một quá trình rất phức tạp, cả hai hiện tượng

này cùng xảy ra, song song tiến triển, nhưng cuối cùng là để nhằm cầm máu, hoặc

tránh hiện tượng đông máu tràn lan gây tắc nghẽn mạch máu một khi đã hình thành

đủ.

Quá trình đông máu tự nhiên bao gồm một loạt các phản ứng và đối phản

ứng mà ở mỗi giai đoạn, sản phẩm được tạo ra phải nhanh hơn là sự tiêu hủy của nó

dẫn đến hiện tượng đông máu. Khi cân bằng giữa hai quá trình trên lệch về một phía

thì hoặc sẽ có hiện tượng máu không đông, hoặc hiện tượng máu quá đông.

Phép thử hoạt tính chống đông tụ máu được tiến hành trên máu chuột thí

nghiệm in vitro, kết quả đánh giá qua quan sát trực quan và kiểm tra trạng thái của

máu.

Chương 3. THỰC NGHIỆM

3.1. Thu thập và xử lý rong

Rong nâu được thu thập tại các vùng biển ở Vịnh Nha Trang, Khánh Hòa,

Việt Nam. Thời gian thu mẫu rong nâu vào tháng 5 năm 2014. Các mẫu rong nâu

được phân loại bởi TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha

Trang), tất cả các tiêu bản được lưu giữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công

nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các loài rong nâu thuộc đối tượng nghiên cứu của luận án có tên khoa học cụ

thể như sau:

Hai loại rong nâu là đối tượng nghiên cứu chính của luận án: Sargassum

aquifolium (Turner) C.Agardh và Turbinaria decurrens Bory.

Các loại rong Sargassum polycystum, Sargassum mcclurei, Sargassum

oligocystum, Sargassum denticarpum, Sargassum swatzii và Tubinaria ornata,

dùng tách chiết fucoidan và nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh

học của fucoidan.

Các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum

denticapum và Sargassum binderi, là đối tượng nghiên cứu về thành phần hóa học

và đặc điểm cấu trúc của fucoidan.

Hình 3.1. Vị trí địa lý nơi thu thập mẫu rong nâu và ảnh rong Sargassum aquifolium

Hình 3.2. Rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens

Rong nâu được thu hoạch, rửa sạch bằng nước biển để loại bỏ cát, đất, các

chất bẩn khác,…Sau khi thu hoạch tiếp tục được phơi khô tự nhiên. Mẫu rong sau

khi phơi khô được cắt nhỏ trước khi đem tách chiết fucoidan.

3.2. Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu

Chiết tách fucoidan thực hiện theo phương pháp được sử dụng rất phổ biến

trên thế giới hiện nay của Bilan và cộng sự [68]. Mẫu rong khô 200g được xử lý ở

nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH:CHCl3:H2O tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu,

lọc rửa với axeton, sấy khô. Sau khi sấy khô bã rong được chiết với 250ml dung

dịch CaCl2 2% (5 lần) mỗi lần dung dịch được khuấy trộn ở 850C trong 5 giờ. Dịch

chiết 5 lần được gom lại, sau đó thêm 80ml dung dịch

hexadecyltrimethylammoniumbromide nồng độ 10% trong nước. Tủa tạo thành

được li tâm, rửa với nước nhiều lần, sau đó khuấy trộn với 150ml dung dịch NaI

20% trong cồn để ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, ly tâm tách lấy phần tủa

(làm như vậy 5 lần), sau đó rửa với cồn và hòa tan lại trong nước. Dung dịch được

thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu được fucoidan thô dưới dạng muối Na

(Ký hiệu F), hiệu suất chiết tách tính theo trọng lượng rong khô.

Phương pháp phân đoạn fucoidan: Fucoidan thô được hòa tan trong dung

dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần tủa không tan là axít polyuronic (PA), phần dịch

trong đưa lên cột DEAE-Sephacel. Đầu tiên rửa cột với dung dịch 0,04N HCl đến

khi thử âm tính với cacbonhydrate bằng phương pháp phenol-axit sulfuric [94], tiếp

theo rửa cột với gradient nồng độ từ 0-2N NaCl, hoặc rửa giải theo từng nồng độ

khác nhau của NaCl: 0N; 0.5N; 1N; 1.5N và 2N, các phân đoạn fucoidan thu được

theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl được thẩm tách loại

muối bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa trong nước cất với thời gian 48h, sau

đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột [95].

Qui trình chiết và tách phân đoạn fucoidan theo bản quyền WO 2005/014657

Phương pháp chiết tách fucoidan

Mẫu rong nâu được cắt nhỏ 2-3 cm, xử lý loại màu và các hợp chất trọng

lượng phân tử thấp với EtOH 85 % theo tỷ lệ w/v = 1/10 trong thời gian 10-15

ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.

Mẫu rong 1 kg sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu được tiến hành

chiết với 20 lít dung môi dd axít HCl (pH = 2) ở nhiệt độ 70oC trong thời gian 3h

với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc qua vải lọc, sau đó trung hòa với NaHCO3

đến pH = 6-7. Dịch chiết cô quay chân không ở nhiệt độ 60oC sau đó thẩm tách loại

muối và các hợp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách trong thời gian

48h theo phương pháp [109]. Chúng tôi tiến hành làm sạch và cô đặc dịch chiết

bằng màng siêu lọc kích thước 10 kDa. Dịch chiết sau khi làm sạch ( đã loại nước,

loại muối, các hợp chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp ở nhiệt độ

phòng trong thời gian từ 8-10 giờ) và cô đặc tới 1/10 thể tích ban đầu, được kết tủa

với EtOH 98% theo tỷ lệ Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô sử dụng máy đông

khô chân không thu bột polysaccharide dạng thô chứa fucoidan.

Phương pháp tách phân đoạn fucoidan

Bột polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan, được hòa tan

trong dung dịch 0,04 N HCl, ly tâm tách phần không tan là polyuronan. Phần dịch

trong cho chạy qua cột DEAE-Cellulose , đầu tiên rửa cột với 0,04 N HCl đến khi

thử âm tính với carbonhydrate bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [94], các hợp

chất larminaran không bị hấp thụ trên cột sẽ được rửa giải. Tiếp tục rửa giải cột

bằng muối NaCl cho gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2 N, các

phân đoạn (F1, F2, F3,…) được tách ra theo các nồng độ khác nhau của dung dịch

muối NaCl, mỗi phân đoạn thu được cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách

kích thước 10 kDa trong nước cất sau thời gian 24 giờ, sau đó đem đông khô thu

được các fucoidan dạng bột.

Hình 3.3. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium

Hình 3.4. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens

Hình 3.5. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum

oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto)

Rong nâu

Polyphenol, chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp

Chiết với (Cồn; Aceton; Chloroform) Tỉ lệ w/v = 1/10, t = 10-15 ngày

Rong đã xử lý dung môi

Chiết axít HCl pH 2

Bã rong

(ở 70oC) t = 3 giờ (3 lần)

Dịch chiết rong

Muối, KLN, các hợp chất phân tử thấp

Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10 kDa Tủa với EtOH 98 % Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô

Polysaccharide

Polyuronic axít (PA)

Hòa tan trong HCl 0,04 N Ly tâm lấy dịch trong

Chạy cột sắc ký DEAE- cellulose

Rửa giải với HCl 0,04 N và gradient nồng độ NACl (0-2 N)

0,04N HCl a N NaCl c N NaCl b N NaCl d N NaCl

F1 L F2 F3 F4

Hình 3.6. Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [109]

3.3. Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan

3.3.1. Xác định hàm lượng tổng carbohydrate

Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol-axit

sulfuric [94], Chuẩn bị dung dịch cacbonhydrate có hàm lượng khoảng 0.1-0.2

µg/µl, lấy 200 µl dung dịch thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi

dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem

đun cách thủy trong thời gian 5 phút lấy ra để nguội, đo mật độ quang ở bước sóng

λ = 490 nm. Dung dịch chuẩn sử dụng glucose hoặc galactose.

3.3.2. Xác định thành phần monosaccharide

Thành phần monosaccharide được xác định bằng phương pháp HPLC. Mẫu

fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic

acid) 2M, thủy phân trong 6 giờ ở 100oC sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy

cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn

lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần

đường trên thiết bị phân tích hydrat cacbon IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng

cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa

giải 0.6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên

hệ phân tích Shimadzu C- R2 AX. Các đường đơn fucose, glucose, galactose,

mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn.

Xác định thành phần đường theo phương pháp của Bilan và cộng sự [110].

Nguyên tắc là thủy phân fucoidan thành các monosaccharide, chuyển các

monosaccharide sang dẫn xuất alditol acetate rồi định lượng bằng GC–FID.

+ Thủy phân khử từng phần trên hệ NaBH4/TFA: Cân 15mg fucoidan vào

trong ống nghiệm (có nắp) chứa 1ml TFA 2,0M. Đem đun nóng ống nghiệm ở nhiệt

Độ 80oC trong 3 giờ, sau khi để nguội thêm chính xác 1ml dung dịch inositol

1mg/ml. Lắc đều đem dung dịch lọc, loại tủa, dung dịch còn lại thêm 2ml ethanol cô

quay đến cạn. Sau đó thêm 1ml NH4OH 1M để đuổi axit còn dư sau đó sấy khô

bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC. Cặn được hoà tan trong 0,5 ml dung dịch

NaBH4 10% vừa pha trong NH4OH 1M, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng để qua đêm.

NaBH4 dư được phân huỷ bằng 0,5ml CH3COOH đậm đặc. Tách axít boric và

trimethyl borat bằng cách cho bay hơi nhiều lần ở nhiệt độ 40oC với methanol để

cặn thu được chỉ còn là alditol.

+ Phản ứng acetyl hóa các alditol: Cho 1ml anhydric acetic và 1ml pyridine

vào bình có chứa fucoidan đã được thuỷ phân ở trên và đem đun nóng ở 100oC

trong 1 giờ. Sau đó làm lạnh, bay hơi khô ở nhiệt độ 40oC. Alditol acetat trong hỗn

hợp được chiết bằng ethyl acetat. Xác định thành phần đường đơn trên máy sắc kí

GC-FID Agilent (Mỹ) HP3.

Xác định thành phần monosaccharide bằng phương pháp GLC sau khi đã

alditol axetate. Tại Viện Hóa học hữu cơ N.D. Zelinsky, Viện hàn lâm Khoa học

Nga, Maxcơva, Liên Bang Nga.

3.3.3. Xác định hàm lượng sulfate

Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với

BaCl2/gelatine [111]. Cân khoảng 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn

dung tích 5ml, thêm 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, thời gian 6 giờ.

3.3.4. Phương pháp khử sulfate

Đề sulfate hóa (desulfation) được thực hiện theo phương pháp được mô tả

bởi Bilan và cộng sự (2002) [68], 100 ml dung dịch fucoidan (100 mg) được cho

qua cột trao đổi ion (dạng H+; CG-120, 200–400 mesh, Serva, Germany). Rửa giải

với 200 ml nước cất. Dung dịch sau rửa giải được cô tới gần khô bằng máy cô quay

chân không, mẫu sau đó được hòa tan lại trong 20ml dung dịch hỗn hợp [DMSO

(19ml) : MeOH (1ml)] thêm vào 0,5ml Pyridin, toàn bộ dung dịch được chuyển

sang một ống thủy tinh có nút vặn kín và cho phản ứng ở 100 oC trong thời gian 6h.

Hỗn hợp sau phản ứng được thẩm tách trong nước cất bằng màng thẩm tách 10 kDa

trong thời gian 48h, hỗn hợp sau thẩm tách được đông khô ta thu được mẫu bột

fucoidan đề sulfate.

3.3.5. Xác định hàm lượng uronic acid

Hàm lượng uronic acid được xác định sử dụng phương pháp Carbazole

[112], sử dụng axít D-glucuronic làm chất chuẩn. Chuẩn bị dãy các chất chuẩn với

hàm lượng khác nhau (1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml). Dung dịch

fucoidan dùng để phân tích có hàm lượng 1 μg/ml.

Lấy 250 μl dung dịch chuẩn mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu

cabonhydrate không chứa axít uronic) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 ml dung

dịch A, phản ứng được tiến hành ở 100 oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh

phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B lắc đều và cho phản ứng

lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến

hành đo quang ở bước sóng λ = 525 nm.

3.3.6. Phân tích liên kết bằng methyl hóa

Methyl hóa (methylation) thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi

Chizhov và cộng sự (1999) [12], 1mg mẫu fucoidan đề sulfate hóa (dSF) được hòa

tan trong 1ml DMSO trong một lọ nhỏ có nút vặn ở nhiệt độ 40oC trong thời gian

10 phút, thêm tiếp vào 100 mg bột NaOH và 0,2ml MeI. Hỗn hợp phản ứng được

lắc liên tục trong thời gian 20 phút ở 40 oC, sau đó một lượng tương tự NaOH và

MeI được thêm vào. Hỗn hợp tiếp tục được lắc trong thời gian 1h, sau đó làm lạnh

và thêm vào 1ml nước. Lượng MeI dư được loại bỏ bằng cô quay chân không, phần

dung dịch còn lại được đưa qua cột C18, đầu tiên rửa giải bằng nước cất, tiếp theo

được rửa giải với 50% MeOH. Phần dung dịch được rửa giải với MeOH được cho

bay hơi trên máy cô quay chân không tới gần khô. Để phân tích GC-MS, mẫu sau

khi cho bay hơi được thủy phân với 1ml TFA 4N ở nhiệt độ 100 oC trong thời gian

6h, mẫu sau thủy phân được khử với NaBH4 và Methyl hóa với Ac2O/pyridin. Các

methylate alditol acetate riêng phần được phân tích bằng GLC-MS.

3.3.7. Thủy phân tạo oligosaccharide

Cân 5mg fucoidan sau đó thêm vào 3ml TFA 0,75 M. Sau đó lắc đều, cho

vào tủ sấy ở nhiệt độ 60ºC trong thời gian là 60 phút. Lấy ra để nguội, cô quay chân

không cho bay hết TFA, sau đó thêm 2ml metanol vào mẫu rồi cô quay đến hết, làm

3 lần. Mẫu thu được dùng đo phổ MS, NMR.

3.3.8. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

Khối lượng phân tử trung bình của fucoidan xác định bằng phương pháp sắc

ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC). Phép đo GPC được

thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent 1100, với cột Shodex SB-806HQ và detector

RID (refractive index detector) tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học

Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nhiệt độ của cột được giữ ở 60C. Fucoidan

nồng độ 1mg/ml. Thể tích mẫu bơm là 0,5ml với tốc độ 1,0ml/phút. Dung dịch

NaCl (1mg/ml) được sử dụng làm chất rửa giải.

3.3.9. Phổ IR

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Brucker tại Viện hóa học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3.3.10. Phổ NMR

Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance III 500MHz tại Trung tâm các

phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam. Mẫu được pha trong dung môi D2O. DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-

sulfonic acid) được sử dụng làm chất nội chuẩn, đo ở nhiệt độ 70oC với kỹ thuật đo

khử tín hiệu nước.

Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance 600MHz tại Tại Viện Hóa học

hữu cơ N.D. Zelinsky, Viện hàn lâm Khoa học Nga, Maxcơva, Liên Bang Nga.

. Mẫu được pha trong dung môi D2O.

3.3.11. Phổ ESI-MS/MS

Phổ ESI-MS được ghi trên máy Xevo TQ MS, Waters-USA, kiểu ion hóa

âm. Dung môi MeOH : H2O = 1:1. Chế độ ghi mẫu với kiểu ion hoá âm. Khí phun

mù là N2 với áp suất khí là 30 psi, tốc độ phun khí 650lít/giờ tại nhiệt độ là 180ºC.

3.3.12. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)

Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại BL10C,

Photon Factory, Tsukuba, Nhật Bản. Tia X được phát ở bước sóng  = 0,149 nm.

Phép đo kéo dài 600 giây để đảm bảo đủ thời gian đo cần thiết mà mẫu không bị

phá hủy bởi tia X. Kết quả được tính toán bằng đồ thị Kratky (q2I(q) vs q) và đồ thị

Guinier (ln(qI(q)) vs q2 ). Ở đây, I(q) là cường độ tán xạ và q được định nghĩa bằng

(4)sin( với  là bước sóng,  là góc tán xạ. Từ đồ thị Guinier, bán kính từ hồi

chuyển Rgc có thể xác định được. Giá trị Rgc cho biết cấu trúc không gian của chất

đo ở kính thước cỡ nano. Mẫu fucoidan nồng độ 1 mg/ml trong nước và trong dung

dịch NaCl 0,5M được chuẩn bị cho phép đo SAXS [92,99].

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học

3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Theo phương pháp của Skehan & cs. (1990) và Likhiwitayawuid & cs.

(1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ

(NCI) và trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Mẫu được

triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất

thiên nhiên.

Dòng tế bào (cell lines)

Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi)

Dòng RD (Human rhabdomyosarcoma – Ung thư mô liên kết)

Môi trường và các dụng cụ, hóa chất:

Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME

(Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung L- glutamine, Sodium

piruvat, NaHCO3, PSF (Penicillin- Streptomycin sulfate - Fungizone); NAA (Non-

Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)

Trypsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic

acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B);

Acid Acetic.

Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet

pasteur, các đầu týp cho micropipet…

Chất chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào:

Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO

Tính kết quả:

Kết quả được đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm.

Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của

chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD

(ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%)

theo công thức:

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để

tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công

thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp

để tìm giá trị IC50

Cách tính giá trị IC50:

Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo

thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá

trị IC50. Công thức: 1/y = a + blnX

Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%)

3.4.2. Hoạt tính ức chế hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm

Hoạt tính ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor

promoting assay) in vitro được xác định theo phương pháp của Zhao & cs. (1999),

Gao & cs. (2002), Gao & cs. (2010), hiện đang được triển khai thực hiện tại phòng

Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

Dòng tế bào: Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

Phương pháp tiến hành: Kỹ thuật theo dõi sự hình thành khối u là thử

nghiệm sự bám dính và hình thành khối u trên thạch mềm, đây được coi là kỹ thuật

nghiêm ngặt trong kiểm tra sự biến đổi của tế bào. Theo kỹ thuật này, tế bào (đã

được xử lý bằng các chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư) được nuôi cấy

cùng với chất điều chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong khoảng thời

gian thích hợp để các khối u có thể hình thành. Sau khi nhuộm, khối u hình thành sẽ

được phân tích hình thái, xác định số lượng và mật độ để đánh giá tác dụng của chất

thử.

Tế bào ung thư được nuôi in vitro theo phương pháp Skehan và cs. (1991).

Cụ thể, dòng tế bào được duy trì trong điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%;

nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối) và được hoạt hoá trước khi thí nghiệm tiến hành

từ 18-24 giờ.

Chuẩn bị tế bào: Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy

trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM có bổ sung huyết

thanh bê tươi 7-10%.

Thử nghiệm: Tế bào nuôi trong môi trường MEM bổ sung 10% FBS ở 370C

trong tủ ấm CO2 (5% CO2). Đến phase Log của sinh trưởng, tế bào được tách khỏi

bình và tách rời nhau bởi trypsin, đếm và hòa lại vào môi trường thạch loãng (0,35

% với thạch mặt và 0,5% với thạch nền) với nồng độ tế bào 3,33 x 103/mL. Trộn

mẫu thử với nồng độ đầu 5100 µg/ml. Thí nghiệm được tiến hành trên phiến 6

giếng, lặp lại 3 lần để lấy số liệu trung bình.

Sau 15-20 ngày lấy ra và nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm crystal violet, đọc kết

quả dưới kính hiển vi ngược có gắn camera và nối ra máy tính. Hoạt tính ức chế

hình thành khối u trên thạch mềm được đánh giá qua các chỉ số: Mật độ khối u được

tạo thành (%), kích thước khối u (μm) của mẫu thử nghiệm so sánh với các thông

số tương tự của mẫu đối chứng (là DMSO 1%).

Giá trị % mật độ khói u và kích thước khối u sau khi đo, được đưa vào chương

trình Excel để tìm ra % trung bình độ lệch tiêu chuẩn công thức của Ducan như

sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ:

σ: Độ lệch tiêu chuẩn ; giá trị đo được thực tế của từng mẫu; giá trị trung bình ;

n: số lần lặp lại của thí nghiệm

Đánh giá kết quả: Mật độ khối u giảm so với đối chứng % = (100- mđ)± σ;

Kích thức khối u(μm) = kt ± σ; Tỷ lệ giảm kích thước khối u so với đối chứng (%)

= (100 - kt)± σ.

3.4.3. Hoạt tính chống đông tụ máu

Hoạt tính chống đông tụ máu tương tự heparin của các phân đoạn sulfate

polysaccharide chiết từ rong SA đã được so sánh với Clexane (heparin khối lượng

phân tử thấp) là dược phẩm tiêu chuẩn chống đông tụ. Là một chỉ thị hoạt động

được xác định bởi giá trị của APTT. Kỹ thuật thử nghiệm được mô tả như sau:

Hoạt tính chống đông tụ máu đã được thử nghiệm phân tích trên máy

Coatron®M2 (TECO, Đức) theo một quy trình đã được thiết lập. Huyết tương bình

thường (Cormay, Ba Lan) và hai loại thuốc thử APTT dùng làm thử nghiệm cụ thể

như (Cormay, Ba Lan; nồng độ phospholipid 1.2%) và hỗn hợp Coalin-Cefalin

(Rename Ltd, Nga; nồng độ phospholipid 0.5%). Dung dịch 10 µl Sulfated

polysaccharide (fucoidan) hoặc Heparin Clexan ® pha ở các nồng độ lần lượt là

0.15mg/ml; 0.75mg/ml và 1.5mg/ml trong nước, sau đó thêm 50µl huyết tương bình

thường vào. Hỗn hợp thu được ủ trong 20 phút ở 370C, sau đó thêm 50µl APTT,

hỗn hợp được ủ lại lần nữa trong 5 phút ở 370C. Sau đó lấy 50µl dung dịch CaCl2

0.25M thêm vào tiếp. Sau đó ghi lại thời gian hình thành cục máu đông. Nước tinh

khiết được sử dụng làm mẫu đối chiếu.

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan

Kể từ khi fucoidan được phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin vào

năm 1913 [23] cho đến ngày nay, có rất nhiều các quy trình chiết tách fucoidan

khác nhau đã được áp dụng trong nghiên cứu khoa học cũng như trong sản xuất đại

trà. Mỗi một phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm. Tùy vào mục đích

khác nhau mà ta có thể chọn phương pháp khác nhau để phục vụ cho tách chiết

công nghệ có hiệu suất cao, chi phí giảm, không gây ô nhiễm môi trường, hay tách

chiết để nghiên cứu cấu trúc làm sao cho thật sạch không quan tâm đến giá thành

cao hay thấp.

Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp phân lập

fucoidan từ rong nâu theo Bilan và cs [68] để khảo sát vì hiện nay phương pháp này

đang được áp dụng rộng rãi trong cộng đồng các nhà khoa học. Qui trình phân lập

được trình bày chi tiết trong phần thực nghiệm 3.2. Một sơ đồ phân lập được mô tả

trên Hình 3.3 và 3.4. Chất lượng của sản phẩm fucoidan được đánh giá qua đường

cong phân bố KLPT của các polysaccharide xác định bằng phương pháp sắc ký

thẩm thấu gel GPC (Gel Permeation Chromatography). Đối tượng nghiên cứu là hai

loài rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens của Việt Nam.

Kết quả thực nghiệm cho hiệu suất thu hồi fucoidan từ rong nâu Sargassum

aquifolium và Turbinaria decurrens đạt 3,70 và 2,19% tính theo trọng lượng rong

khô. Sắc ký đồ GPC của hai fucoidan này trên Hình 4.1 và Hình 4.2 chỉ cho một

peak với mức độ phân tán của KLPT không lớn. Điều đó cho thấy các fucoidan này

có chất lượng tốt.

Kết quả khảo sát trên cho thấy phương pháp phân lập fucoidan từ rong nâu

của Bilan và cs. cho hiệu suất chiết tách và độ sạch của sản phẩm cùng khá cao,

hoàn toàn thích hợp để áp dụng trong nghiên cứu các đối tượng rong nâu ở vùng

biển Việt Nam.

Kết luận: Chúng tôi sử dụng quy trình chiết tách fucoidan của Bilan và cộng

sự [87] để nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan.

Khối lượng phân tử (D)

Hình 4.1. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium

Khối lượng phân tử (D)

Hình 4.2. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens

4.2. Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài

rong nâu sinh trưởng ở biển Nha Trang, thành phần hóa học của các

fucoidan thu được.

Trong nội dung nghiên cứu này, 06 loài rong nâu sinh trưởng ở vịnh Nha

Trang được khảo sát về các thành phần polysaccharide tan trong nước, bao gồm

fucoidan, laminaran và alginat. Hàm lượng fucoidan được xác định bằng cách phân

lập trực tiếp theo phương pháp của Bilan và cs. Hàm lượng laminaran và alginat

được xác định bằng tách chiết thông thường trong quy trình tách fucoidan.

Kết quả trên bảng 4.1 cho thấy:

 Hàm lượng fucoidan dao động từ 1.98% (Sargassum denticapum) đến cao nhất

3.70% (Sargassum aquifolium)

 Hàm lượng laminaran dao động từ 0.09% (Sargassum aquifolium) đến 1.05%

(Sargassum duplicatum) là cao nhất,

 Hàm lượng alginat dao động từ 8.52% (Sargassum denticapum) đến cao nhất là

25.08% (Turbinaria decurrens) đây cũng là polysaccharide tan trong nước

chiếm hàm lượng cao nhất trong hầu hết các rong nâu, chính vì vậy mà alginat

được tách chiết nhiều từ rong nâu phục vụ nhiều ứng dụng khác nhau.

Bảng 4.1. Thành phần polysaccharide tan trong nước từ một số loài rong nâu (%

trên trọng lượng rong khô)

Rong nâu Fucoidan % Laminaran % Alginat %

Sargassum aquifolium 3,70 0,09 25,00

Sargassum binderi 2,51 0,03 9,17

Sargassum denticapum 1,98 0,32 8,52

Sargassum duplicatum 2,28 1,05 10,48

Sargassum feldmannii 3,15 0,57 12,04

Turbinaria decurrens 2,19 0,25 25,08

Các kết quả trên cho thấy hàm lượng fucoidan của một số loài rong nâu Việt

Nam cao hơn so với các loài rong nâu Sargassum stenophyllum của Brazil (0,4%),

Sargassum ringgoldianum (0,13%), Sargassum thunbergii (0,88%) và Sargassum

fusiformis còn được gọi là Hizikia fusiformis (1,30 %) của Nhật Bản. Và thấp hơn

so với các loài rong: Sargassum myriocystum (5,34%), Sargassum wightii (6,72%)

của Ấn Độ, Sargassum horneri (4,3%) của Mexico [27,42].

Các thành phần monosaccharid trung tính, hàm lượng sulfat và các axit uronic

của các mẫu fucoidan được xác định và trình bày trên Bảng 4.2.

Bảng 4.2. Thành phần hóa học của các fucoidan phân lập được từ 06 loài rong nâu

thu ở Nha Trang.

Monosaccharid trung tính (% mol) Tên loài Sulfat (%) Uronic acid (%) Man Gal Xyl Glc Fuc

Sargassum aquifolium 12,6 22,9 2,0 8,5 2,2 2,2 9,2

Sargassum binderi 6,5 25,6 42,2 10,3 38,0 9,5 0

Sargassum denticapum 10,8 23,3 40,1 15,9 38,7 5,3 0

Sargassum duplicatum 12,7 21,9 44,8 10,2 32,3 9,9 2,8

Sargassum feldmannii 14,2 24,7 45,6 8,0 44,5 2,3 0

Turbinaria decurrens 7,0 24,3 62,9 2,51 31,5 1,89 1,26

Kết quả phân tích cho thấy:

 Fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 9.2 - 62.9% trong tất cả các mẫu fucoidan,

trong đó hàm lượng fucose cao nhất là fucoidan chiết từ rong Turbinaria

decurrens (62.9%) và thấp nhất là fucoidan chiết từ rong Sargassum aquifolium

(9,2%).

 Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loài rong thuộc chi Sargassum

chiếm tỉ lệ tương đối cao chỉ đứng sau hàm lượng fucose. Trong khi đó, các mẫu

fucoidan chiết từ Turbinaria decurrens có hàm lượng galactose gần bằng một

nửa so với fucose.

 Ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu fucoidan của

các loài rong nghiên cứu đều có thêm các đường đơn khác với hàm lượng nhỏ

hơn là mannose, xylose và glucose.

 Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong

khác nhau, tuy nhiên trong cùng chi rong chúng biến đổi không nhiều. Các kết

quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về sự đa dạng của

thành phần hóa học của fucoidan [6,20].

 Bên cạnh thành phần là các gốc đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các

gốc sulfate và các axít uronic. Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác

nhau không nhiều (bảng 4.2), dao động trong khoảng 21.9-25.6% so với lượng

mẫu phân tích, trong đó lớn nhất là fucoidan của rong Sargassum binderi

(25.6%) và nhỏ nhất là fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum (21.9%).

Theo các tài liệu đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các

đặc điểm cấu trúc của fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các

gốc đường, hàm lượng và vị trí nhóm sulfat trên các gốc đường,... trong đó hàm

lượng các gốc sulfat và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh

hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của fucoidan.

So với fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật

Bản, Hàn Quốc thì fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác biệt lớn về

thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn và hàm lượng các axit

uronic cao hơn. Fucoidan phân lập từ rong Turbinaria decurrens có hàm lượng

fucose cao nhất là 62,9%, trong khi đó fucoidan phân lập từ một số loài rong nâu

của vùng Viễn Đông, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như fucoidan

chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica và Laminaria cichorioides

có hàm lượng fucose lần lượt là 88%, 86% và 100% [22], hay fucoidan chiết từ

rong Hizikia fusiformis (Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80%, fucoidan của từ

rong Sargassum stenophyllum (Brasil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay

loại fucoidan duy nhất được bán thương mại bởi hãng hóa chất Sigma (Mỹ) được

chiết từ rong Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm 100% [6].

Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của fucoidan trong các

loài rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam

và của Brasil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung fucoidan của rong nâu

sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản,

chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn

khác. Trong khi đó fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt

Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa

hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như

rhamnose, xylose, mannose, glucose,... Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng

các đường đơn của fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định

rằng điều kiện môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp

polysaccharide của rong nâu.

4.3. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S.

binderi và S. duplicatum

Trong nội dung này, chúng tôi nghiên cứu sơ bộ một số đặc điểm cấu trúc

của các fucoidan từ hai loài rong nâu Sargassum binderi và S. duplicatum. Quá

trình chiết tách, hiệu suất phân lập và các thành phần cấu tạo của các fucoidan tổng

của hai loài rong nâu này được trình bày trong nội dung 4.2. của luận án. Các kết

quả được trình bày trên Bảng 4.1 và Bảng 4.2.

4.3.1. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi

Tách phân đoạn fucoidan tổng FSB của rong nâu Sargassum binderi trên cột

sắc ký trao đổi anion DEAE-cellulose rửa giải lần lượt với các dung dịch muối

NaCl 0.5M, 1M, 1.5M và 2.0M cho 04 phân đoạn tương ứng là F1, F2, F3 và F4.

Hình 4.3. Tách các phân đoạn của fucoidan từ S.binderi trên cột DEAE-Cellulose

Kết quả sắc ký biểu diễn trên Hình 4.3 cho thấy fucoidan từ loài rong nâu

này có kiểu phân bố polysaccharide theo hàm lượng sulfate rất khác so với các

fucoidan từ các loài rong nâu cùng chi Sargassum khác như S. feldmannii, S.

duplicatum, S. binderi, S. denticapum và S. aquifolium.

Kết quả phân tích hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn

fucoidan này được đưa ra trong Bảng 4.3 cho thấy hàm lượng của các phân đoạn

fucoidan F1- F4 dao động trong khoảng từ 2.5 - 45.7 %, trong đó cao nhất là phân

đoạn F2 chiếm 45.7%, thấp nhất là phân đoạn F4 (2.5%), hai phân đoạn F1 và F3

lần lượt chiếm 17.2% và 15.3%.

Bảng 4.3. Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ Sargassum binderi

Các phân đoạn Thành phần monosaccharid trung tính SO3 Hiệu

(%) (tỉ lệ mol) suất

(%) Rham Man Fuc Gal Xyl Glc

17,2 F1-0.5 М NaCl 22,0 0 0,2 1,0 0,4 0,1 0

45,7 F2-1.0 М NaCl 28,3 0 0,1 1,0 0,3 0,05 0

15,3 F3-1.5 М NaCl 24,0 0 0,1 1,0 0,4 0,07 0

F4-2.0 М NaCl 2,5 28,3 0 0,2 1,0 0,2 0,07 0

Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy, tất cả các phân đoạn của

fucoidan của rong nâu Sargassum binderi đều có hàm lượng fucose rất lớn, thứ hai

là hàm lượng galactose và chỉ chứa một hàm lượng nhỏ các gốc đường mannose và

xylose, đặc biệt các gốc đường rhamnose và glucose không có mặt trong tất cả các

phân đoạn fucoidan của loài rong này. Hàm lượng mannose lớn nhất ở phân đoạn

F1, F4 và nhỏ nhất ở hai phân đoạn F2 và F3.

Hàm lượng sulfate của các phân đoạn sắc ký không tăng lên đều đặn từ F1

đến F4 mà tăng dần từ phân đoạn F1 đến F2 dao động trong khoảng 22% - 28.3%,

F3 đến F4 dao động trong khoảng 24%-28.3%.

Như vậy, các phân đoạn fucoidan của rong nâu Sargassum binderi với thành

phần đường chính là fucose và galactose cùng một lượng lớn sulfat được gọi là các

galactofucan sulfat hóa. Trong khi đó fucoidan của một số loài rong nâu khác thuộc

cùng bộ Fucales sống ở vùng ôn đới như Fucus evanescens, Fucus vesiculosus

trong thành phần của chúng chỉ chứa fucose và sulfat được gọi là các fucan sulfat

hóa [68,35].

Phổ 13C-NMR của phân đoạn F2 tách từ rong nâu Sargassum binderi được

trình bày trên Hình 4.4. Phổ có nhiều tín hiệu mạnh ở vùng anomeric (99.7 - 103.18

ppm) và ở vùng từ trường cao (15.40 ppm và 16.16 ppm) là tín hiệu điển hình của

gốc α-L-fucopyranoside. Các tín hiệu trong vùng 67 -84 ppm là của các nguyên tử

C2 - C5 của vòng pyranoid. Các tín hiệu ở 61.5 ppm ứng với nhóm CH2OH của gốc

β-D-galactopyranose và tín hiệu ở 65.0 ppm là của nhóm CH2OR được cho là của

gốc O-6-β-D-galactopyranose. Một số tín hiệu mạnh ở 173.7 - 174.6 ppm và 20.92

ppm khẳng định sự hiện diện của nhóm O-acetyl.

Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của fucoidan phân đoạn F2 từ rong Sargassum binderi

Phổ 1H-NMR của F2 bao gồm một vài tín hiệu mạnh trong vùng α-anomeric

(5.09 - 5.23 ppm) và vùng trường cao (1-1.5 ppm). Trong khi đó tín hiệu trong vùng

2.0 - 2.2 ppm xác định sự hiện diện của nhóm O-acetyl.

Đặc điểm cấu trúc của fucoidan tách từ rong nâu Sargassum binderi của

Malaysia đã được nghiên cứu và công bố vào năm 2016 [84].

4.3.2. Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum

Fucoidan tổng FSDu của rong nâu Sargassum duplicatum được tách bằng

sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2 x 32 cm), rửa giải gradient với

dung dịch NaCl từ 0,1M đến 2,0M và thu lấy 2 phân đoạn là SDAuF1 (ứng với

khoảng nồng độ NaCl 0,2M - 0,6M) và SDAuF2 (ứng với khoảng nồng độ NaCl

1,0M - 1,4M). Quá trình sắc ký được biểu diễn trên Hình 4.5.

SDAuF

Hình 4.5. Phân đoạn của fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum

Bảng 4.4. Thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan từ S. duplicatum

Phân đoạn Hàm SO4 Axit Thành phần monosaccharide,

fucoidan lượng (%)* uronic mol(%)

(%)* (%)* Fuc Man Gal Xyl Glc

SDAuF1 40,7 32,3 12,71 40,2 3,1 35,7 0 0

SDAuF2 39,88 38,2 13,08 59,5 0 39,4 2 0

*: Hàm lượng tính theo khối lượng mẫu fucoidan

Kết quả xác định thành phần hóa học (Bảng 4.4.) cho thấy 2 phân đoạn

SDAuF1 và SDAuF2 đều có đường fucose và galactose là các thành phần đường

trung tính chính. Fucose của phân đoạn SDAuF2 cao hơn (59,5 %) phân đoạn

SDAuF1 (40 %), phân đoạn SDAuF2 không có sự xuất hiện của đường mannose.

Cả 2 phân đoạn không có sự xuất hiện đường glucose, phân đoạn SDAuF2 hàm

lượng xylose chỉ chiếm một lượng nhỏ.

Fucoidan tổng FSDu được phân lập từ rong nâu S. duplicatum với hiệu suất

2,28% theo phươn pháp của Bilan và cs.. Trên phổ hồng ngoại IR chỉ ra ở hình 4.6

của FSDu xuất hiện tín hiệu hấp thụ ở 1.244 cm-1 (vùng dao động đặc trưng của liên

kết S=O). Vùng tín hiệu đặc trưng cho liên kết C – O – S ở 800-845 cm-1 không

được thể hiện rõ.

Hình 4.6. Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum

Giống như nhiều fucoidan chiết xuất từ rong nâu khác trên thế giới, fucoidan

FSDu từ rong nâu S. duplicatum cũng có phổ 1H-NMR rất phức tạp do có rất nhiều

pic chồng chất lên nhau (Hình 4.7.). Tuy nhiên trên phổ 1H-NMR cũng có những tín

hiệu cộng hưởng đặc trưng giúp cho việc nhận biết fucoidan. Đó là các tín hiệu xuất

hiện trong vùng proton anomer (5,0 – 5,5 pm) và các tín hiệu ở vùng trường cao

(1,2 - 1,5 ppm) của nhóm CH3 của vòng α-L-Fucopyranose.

Trên phổ 1H-NMR của fucoidan từ rong nâu S. duplicatum cũng xuất hiện

những tín hiệu đặc trưng giúp ta nhận biết fucoidan. Đó là các tín hiệu ở vùng 1,2 -

1,4 ppm (nhóm methyl của fucose) và 5,1-5,3 ppm (H-anomer của gốc →3)-α-L-

Fucp(1). Các tín hiệu ở 5,3 ppm và 3,5 ppm đặc trưng cho H-1 và H-6 của gốc β-

D-galactose. Ngoài ra tín hiệu ở 2,1 - 2,3 ppm còn xác nhận sự có mặt của nhóm O-

acetyl trong phân tử của fucoidan này.

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của fucoidan FSDu chiết từ rong nâu S. duplicatum

Trong một công trình nghiên cứu độc lập với luận án này, cấu trúc chính xác

của fucoidan FSDu đã được xác định bới Usoltseva và cộng sự thuộc Viện Hàn lâm

khoa học Nga ở Viễn đông [113]. Theo đó fucoidan này là một galactofucan sulfat

hóa và acetyl hóa. FSDu có cấu trúc phân nhánh rất phức tạp làm cho các phổ NMR

của nó rất khó giải thích. Mạch chính của nó được cấu tạo chủ yếu bởi các gốc

4)-α-L-Fuc-(1 và β-D-Gal luân phiên liên kết với nhau. Mạch nhánh liên kết

với O-6 của galactose và cấu tạo bởi các gốc fucose có liên kết mạch ở O-3 và có

các nhóm thế sulfat ở các vị trí O-2 và O-4. Mạch nhánh có đến 5 gốc đường hoặc

có thể nhiều hơn nữa.

Kết luận chung cho các nội dung nghiên cứu 4.2. và 4.3. nhằm lựa chọn đối

tượng rong nâu để nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính:

 Kết quả phân tích fucoidan và các thành phần polysaccharide tan trong nước

khác chỉ ra rằng fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác

nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng

khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Điều này cho thấy

thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của fucoidan vô cùng phức tạp. Tuy

nhiên, fucoidan của các loài rong trên đều có một đặc điểm chung là bên cạnh

hàm lượng sulfat cao, hai đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn

hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các

galactofucan sulfat hóa. Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói

chung và galactofucan sulfat hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất

rộng và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi

rút,... [95].

 Các fucoidan tách chiết và phân lập từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii,

Sargassum duplicatum, Sargassum denticarpum và Sargassum binderi là các

fucogalactan sulfat hóa chứa nhóm este sulfat và nhóm axít uronic, cùng các

thành phần đường chính là fucose và galactose, với một lượng nhỏ các đường

đơn mannose, xylose và glucose. Cấu trúc của các fucoidan tách chiết từ rong

nâu Sargassum duplicatum và Sargassum binderi đã được nghiên cứu kỹ lưỡng

[84,113].

 Sau khi nghiên cứu thành phần hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu

chúng tôi chọn các đại diện của mỗi chi Sargassum, Turbinaria mỗi loài đại diện

để nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính sinh học. Các loài đó bao gồm

Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens. Các loài này cũng là loài rong

nâu tương đối phổ biến ở biển Việt Nam nói chung và vịnh Nha Trang nói riêng.

 Đại diện cho chi rong nâu Turbinaria chúng tôi chọn loài rong nâu Turbinaria

decurrens vì loài này chưa có nhà khoa học nào nghiên cứu ra cấu trúc hoàn

thiện của chúng.

 Đại diện cho chi Sargassum chúng tôi chọn loài rong nâu Sargassum aquifolium

vì loài rong nâu này chưa từng được nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế

giới. Mặt khác fucoidan này có thêm một thành phần cấu tạo là axít uronic. Điều

này hứa hẹn khả năng tìm ra một dạng cấu trúc fucoidan có tính mới cao.

4.4. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong

nâu Sargassum aquifolium.

4.4.1. Chiết xuất và làm sạch fucoidan

Đối tượng nghiên cứu của phần này là loài rong nâu Sargassum aquifolium

thu hoạch vào tháng 6 năm 2015 ở biển Nha Trang. Mục tiêu nghiên cứu là xác định

hàm lượng fucoidan tổng trong sinh khối, các đặc trưng hóa lý, các đặc điểm cấu

trúc, hoạt tính gây độc tế bào, và hoạt tính chống đông máu của nó cũng như của

các phân đoạn của nó thu được bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion.

Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy, các fucoidan từ các loài tảo biển

thuộc chi Sargassum có cấu trúc đặc biệt phức tạp. Chúng thường được cấu tạo từ

nhiều thành phần đường đơn và không phải đường đơn (sulfate, acetate) khác nhau,

hình thành nên một cấu trúc phân nhánh không theo một trình tự nhất định. Vì thế

việc nghiên cứu cấu trúc của các loại fucoidan này đòi hỏi phải có một sự kết hợp

khéo léo giữa các phương pháp phổ hiện đại với các phương pháp sắc ký và các

phương pháp chuyển hóa hóa học. Các phương pháp tách fucoidan thành các phân

đoạn trên cột trao đổi anion, phương pháp tách loại sulfat (desulfation), và phương

pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa (methylation analysis, gọi tắt là phân tích

methyl hóa) cho phép thu được các phân đoạn đồng nhất hơn, đơn giản hơn, phù

hợp với việc xác định cấu trúc tiếp theo bằng các phương pháp phổ khối lượng và

cộng hưởng từ hạt nhân. Vì thế trong phần này, các nội dung nghiên cứu cụ thể bao

gồm:

 Chiết xuất và tinh sạch fucoidan tổng (ký hiệu là FSA), xác định các đặc trưng

hóa, lý của nó.

 Tách FSA thành các phân đoạn (ký hiệu lần lượt là FSA-0,5M, FSA-1,0M,

FSA-1,5M, và FSA-2,0M) có hàm lượng sulfat tăng dần bằng phương pháp sắc

ký trao đổi anion, khảo sát các sản phẩm thu được.

 Thực hiên phản ứng tách loại sulfat đối với các phân đoạn của FSA (ký hiệu lần

lượt là 1,0M-deS, 1,5M-deS, và 2,0M-deS) , khảo sát các sản phẩm thu được.

 Tách sản phẩm 1,0M-deS thành các phân đoạn có hàm lượng uronic tăng dần

bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion, khảo sát các sản phẩm thu được.

 Thực hiện phép phân tích methyl hóa trên một số sản phẩm chọn lọc.

 Xác định các đặc điểm cấu trúc của FSA và các sản phẩm tiếp theo bằng cách

phân tích tổng hợp các dữ kiện thu được.

 Thử nghiệm các hoạt tính gây độc tế bào, chống khối u và chống đông máu.

Trình tự thực hiện các nội dung chiết xuất, tinh sạch, phân đoạn và chuyển hóa FSA

được trình bày khái quát trên Hình 4.8.

Hình 4.8. Sơ đồ chiết xuất, phân lập và chuyển hóa các fucoidan của S. aquifolium

Fucoidan tổng FSA của rong nâu S. aquifolium được chiết xuất và tinh chế

theo một qui trình hình 4.8. Qui trình này sử dụng nước nóng làm dung môi chiết và

ethanol làm tác nhân kết tủa. Các bước chính của qui trình được tiến hành như sau:

Bột khô của rong nâu S. aquifolium (100 g) được chiết với hỗn hợp dung môi gồm

ethanol, aceton và chloroform để loại các chất béo, chất mầu và các chất có KLPT

thấp khác. Nguyên liệu đã loại chất béo được chiết với 2 L nước ở 800C trong 3 giờ.

Các polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm 8 L ethanol

99,0%. Tủa được hòa tan trong HCl loãng (pH 1,0). Sau khi ly tâm, phần dung dịch

được trung hòa bằng NaHCO3, thẩm tách và đông cô, cho fucoidan tổng FSA dưới

dạng muối natri với hiệu suất 3,7% tính theo nguyên liệu khô.

Kết quả phân tích các thành phần cấu tạo của FSA (Bảng 4.5) cho thấy, FSA

có các thành phần chính là fucose (9.2%), galactose (8.5%), axit uronic (12.6%) và

sulfat (22.9%). Các đường đơn trung tính còn lại gồm xylose (2.2%), glucose

(2.2%) và mannose (2.0%) có hàm lượng nhỏ hơn rõ rệt.

Bảng 4.5. Hiệu suất và thành phần (%) của FSA và các phân đoạn fucoidan thu

được sau sắc ký trao đổi anion.

Fucoidan H% Fuc,% Xyl,% Man a,% Glc,% Gal,% UA,% SO3Na,%

9.2 2.2 2.0 2.2 8.5 12.6 22.9 FSA

4.5 4.9 4.3 6.7 12.0 27.9 5.9 FSA-0.5M 4.7b

FSA-1.0M 21.9 b 15.9 5.7 3.5 2.2 11.3 13.6 21.8

19.2 4.6 2.2 1.7 25.5 5.3 29.2 FSA-1.5M 9.8 b

a Giá trị của mannose thấp hơn thực tế do sự thủy phân các liên kết glucuronosid

31.2 2.9 1.0 0.8 17.3 1.8 31.5 FSA-2.0M 2.3 b

không hoàn toàn. b % của FSA

Phương pháp sắc ký lọc gel GPC được sử dụng để xác định sự phân bố theo

KLPT của các polymer thành phần của FSA và xác định KLPT trung bình của FSA.

Đồ thị sắc ký GPC thu được (Hình 4.9) chỉ gồm 1 peak chứng tỏ FSA có độ sạch

cao. Kết quả tính toán cho thấy FSA có khối lượng phân tử trung bình là 110 kDa.

Chỉ số đa phân tán PI = Mw/Mn = 2,15 cho thấy mức độ phân tán về khối lượng

phân tử của các polysaccharide là không lớn.

Khối lượng phân tử (D)

Hình 4.9. Sắc ký đồ GPC của fucoidan FSA từ rong nâu Sargassum aquifolium

Tách phân đoạn FSA trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-Sephacel

(Pharmacia):

Hình 4.10. Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium

Tương tự như các fucoidan khác, FSA là một hỗn hợp của nhiều

polysaccharide anionic khác nhau về thành phần cấu tạo và mật độ điện tích, vì thế

chúng có thể được tách ra thành các phân đoạn có tính chất đồng nhất hơn bằng

phương pháp sắc ký trao đổi ion. Cụ thể FSA đã được tách thành các phân đoạn có

hàm lượng sulfate tăng dần trên cột sắc ký trao đổi anion như sau:

100

Mẫu FSA (2 g) được hòa tan trong 100 mL nước cất. Dung dịch được ly tâm

để loại bỏ vẩn đục rồi nạp lên cột DEAE-Sephacel (Pharmacia) dạng Cl, rửa giải

lần lượt với các dung dịch NaCl trong nước có nồng độ tăng dần (0,5 M, 1,0 M, 1,5

M, 2,0 M). Mỗi lần rửa giải được tiến hành cho đến khi đầu ra không còn phản ứng

dương tính với thuốc thử carbohydrat (thuốc thử phenol / H2SO4 đậm đặc [94]). Các

phân đoạn sắc ký được đem đi thẩm tách và đông khô. Kết quả sắc ký được biểu

diễn dưới dạng đồ thị trên Hình 4.10. Hiệu suất và thành phần của các phân đoạn

(FSA-0,5M, FSA-1,0M, FSA-1,5M, và FSA-2,0M) được trình bày trên Bảng 4.5.

Kết quả phân tích thành phần của các phân đoạn sắc ký (Bảng 4.5.) cho thấy:

 FSA là một hỗn hợp không đồng nhất của các polysaccharide có các đặc trưng

về thành phần cấu tạo khác nhau.

 Hàm lượng sulfat của các phân đoạn tăng dần lên cùng với nồng độ của dung

dịch muối rửa giải, trong khi hàm lượng của uronic acid giảm dần đi.

 Phân đoạn FSA-0.5M (4,7% tính theo FSA) có hàm lượng uronic acid và

glucose cao có thể được giải thích bởi sự hiện diện của các tạp chất trong mẫu là

alginat và laminaran.

 Phân đoạn chính là FSA-1.0M (21,9% tính theo FSA) có các thành phần đường

đơn đặc biệt phức tạp với sự có mặt đáng kể của fucose, galactose, xylose và

mannose, ngoài ra còn thêm lượng lớn các nhóm sulfat và axit uronic.

 Phân đoạn FSA-1.5M (9,8% tính theo FSA) cấu tạo chủ yếu từ các thành phần

chính là fucose, galactose và sulfat. Các thành phần khác chỉ có hàm lượng nhỏ.

 Phân đoạn FSA-2M (2,3% tính theo FSA) có thành phần cấu tạo đơn giản nhất,

gần như chỉ gồm fucose, galactose và sulfat. Tuy nhiên hàm lượng của nó trong

FSA lại quá nhỏ.

4.4.2. Xác định cấu trúc của fucoidan

4.4.2.1. Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation)

Để tạo thuận lợi cho việc nghiên cứu cấu trúc bằng các phương pháp phổ,

các phân đoạn fucoidan FSA-1,0M và FSA-1,5 được tiếp tục đơn giản hóa cấu trúc

bằng cách loại bỏ tất cả các nhóm sulfat gắn với khung đường.

Phản ứng tách loại sulfat các phân đoạn fucoidan FSA-1,0M và FSA-1,5

được thực hiện bằng cách gia nhiệt các muối pyridinium của chúng trong hỗn hợp

101

dung môi DMSO-MeOH theo qui trình thông dụng được mô tả bởi Usov và cs.

(1998) [114]. Trong quá trình phản ứng chúng tôi quan sát thấy có một ít biểu hiện

thoái biến của các polysaccharid do chia cắt một phần các liên kết fucosidic không

bền. Sản phẩm phản ứng được làm sạch bằng phương pháp thẩm tách và đông khô.

Kết quả thu được sản phẩm tách loại sulfat của FSA-1,0M là 1,0M-deS với hiệu

suất khá cao, đạt 56,6%. Hiệu suất thu 1,5M-deS đạt 44,0%.

Kết quả xác định thành phần của các sản phẩm (Bảng 4.6) cho thấy 1,0M-

deS tuy còn chứa một lượng vết sulfat, các thành phần đường đơn của nó đã tăng

lên như mong đợi, tuy nhiên hàm lượng tương đối của fucose lại giảm đi rõ rệt.

Nguyên nhân có thể là do đã xảy ra phản ứng chia cắt một phần các liên kết

glycosid yếu của fucose.

Bảng 4.6. Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-

deS so sánh với fucoidan mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M).

Glc Gal Uronic SO3Na Fucoidan H% Fuc Xyl Man

acid

21.9b 15.9 5.9 3.5 11.3 13.6 2.2 21.8 FSA-1.0M

8.1 4.0 7.8 14.0 30.6 4.3 2.8 1.0MdeS

9.8b 19.2 4.6 2.2 25.5 5.3 1.7 29.2 FSA-1.5M

b % của FSA

12.8 5.3 2.7 31.6 10.4 1.8 4.1 1.5MdeS

4.4.2.2. Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA

Phổ NMR cung cấp các thông tin quí giá về cấu trúc của các polysaccharide,

nhưng việc áp dụng các phương pháp của CHTHN trên các fucoidan chiết xuất từ

tảo biển bị hạn chế bởi sự đa dạng của các thành phần phân tử của chúng [7]. Thực

tế chỉ có một số rất ít công bố về kết quả giải trực tiếp cấu trúc của fucoidan tự

nhiên chưa bị biến đổi bằng các kỹ thuật NMR [31]. Cách tiếp cận thực tế hơn là kết

hợp các phép phân tích CHTHN và hóa học để xác định các yếu tố cấu trúc của cả

polysaccharide tự nhiên và polysaccharide đã tách loại sulfate.

102

Hình 4.11. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-2,0M

Riêng trong trường hợp FSA và các phân đoạn sắc ký trao đổi anion của nó,

các phổ NMR quá phức tạp (Hình 4.11, 4.12, 4.13 và phụ lục), không thể sử dụng

trực tiếp để giải cấu trúc được. Ngay cả phân đoạn FSA-2.0M (một galactofucan

sulfate hóa) có thành phần đơn giản nhất, phổ 13C-NMR của nó cũng chỉ ra tối thiểu

là sáu tín hiệu trong vùng C-anomer 105-95 ppm cũng như cùng một số lượng các

tín hiệu C-methyl của các gốc fucose trong vùng 20-17 ppm (Hình 4.11). Kết hợp

với việc các tín hiệu ứng với các nhóm CH2OH tự do của galactose vắng mặt, các

dữ kiện này cho thấy FSA-2.0M có cấu trúc phân nhánh không có qui luật, mức độ

phân nhánh rất cao, các nhóm sulfate gắn với nhiều vị trí khác nhau, các đường đơn

gắn kết với nhau theo nhiều kiểu khác nhau.

Phù hợp với dự đoán từ thành phần cấu tạo đa dạng, phổ 13C-NMR của phân

đoạn FSA-1.5M còn phức tạp hơn (Hình 4.12). Cụ thể trên phổ xuất hiện nhiều tín

hiệu hơn ở vùng C-anomer. Một số tín hiệu xuất hiện trong vùng CH2OH không thế

ở 63-61 ppm.

Trên phổ NMR của phân đoạn FSA-1.0M (Hình 4.13) xuất hiện cụm tín

hiệu ở vùng 17 ppm ứng với nhóm methyl của các gốc fucose. Tại vùng C-anomer

(110 - 95 ppm) xuất hiện rất nhiều tín hiệu với cường độ gần tương đương nhau

chứng tỏ sự có mặt của nhiều loại đường cũng như của nhiều kiểu liên kết glycosid

trong mẫu nghiên cứu. Trong phổ cũng xuất hiện tín hiệu của nhóm CH2OH của

103

galatose không thế trong vùng 63-61 ppm và của nhóm cacboxyl của axit uronic tại

175,6 ppm.

Hình 4.12. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,5M

Hình 4.13. Trích đoạn phổ 13C-NMR của FSA-1,0M

104

Phổ 1H-NMR của FSA và của tất cả các phân đoạn sắc ký đều không tách

bạch, vì thế không thể áp dụng kỹ thuật HMBC để gán đặc điểm cấu trúc cho các tín

hiệu.

4.4.2.3. Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis)

Các fucoidan phân đoạn FSA-1.0M, FSA-1.5M và các sản phẩm tách loại

sulfate 1.0M-deS, 1,5M-deS của chúng được nghiên cứu tiếp với phương pháp phân

tích liên kết bằng methyl hóa. Phương pháp này bao gồm các quá trình methyl hóa

các fucoidan bằng MeI với xúc tác NaOH trong dung môi là DMSO, thủy phân

chúng thành các monomer, khử hóa các monomer thành các alditol, rồi acetat hóa

các alditol này thành các alditol acetat methyl hóa từng phần như mô tả trên sơ đồ

phản ứng của Hình 2.2. Phân tích các sản phẩm thu được bằng phương pháp GC-

MS cho phép rút ra kết luận về các thành phần đường đơn và các vị trí liên kết của

chúng trong chuỗi mạch polysaccharide [12].

Kết quả phân tích cho thấy có 3 dẫn xuất của xylose, 9 dẫn xuất của fucose

và 16 dẫn xuất của hexose (manose và galactose) đã được phát hiện. Thành phần

của chúng trong các đối tượng nghiên cứu được trình bày trên Bảng 4.7.

Bảng 4.7. Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa

Vị trí nhóm О- Suy diễn vị trí của 1.0MdeS, 1.5MdeS, FSA-1.0M FSA-

Me trong: nhóm thế , mol% mol% 1.5M , mol%

mol%

Xyl:

2,3,4 Xylp→ 3 2 10 4

2,4 →3Xylp→ 2 tr. -

2,3(3,4) tr. 4 3* 7

Fuc:

2,3,5 Fucf→ 1 2 1 1

2,3,4 Fucp→ 3 4 14 7

2,3 →4(5)Fucp(f)→ 6 3 6 4

3,5 →2Fucf→ - 3 - -

2,4 →3Fucp→ 6 3** 6 6

2 →3,4(5)Fucp(f)→ 6 11 1 2

105

→2,4(5)Fucp(f)→ 3 9 1 7*** -

→2,3Fucp→ 4 - 3 + -

→2,3,4Fuc→ Fuc 4 - 9 -

Hex:

Manp→ 2,3,4,6-Man tr. 2 tr. 1

Galp→ 2,3,4,6-Gal 1 5 2 12

→2Hexp→ 3,4,6 - 5 - -

→4Hexp→ 2,3,6 4 2 15 10

→4Hexp→ 2,3,6 3 4 1 2

→3Hexp→ 2,4,6 4 6 1 -

→6Hexp→ 2,3,4 2 4 8 21

→3,4Hexp→ 2,6 - 7 2 7

→2,3Hexp→ 4,6 8 9 1 3

3,6+4,6 3 - tr.

→2,4Hexp→ 3,6 3 3 tr. 2

→4,6Hexp→ 2,3 2 2 1 2

→3,6Hexp→ 2,4 5 3 10

3,4+2,4 - - 3

→3,4,6Hexp→ 2 5 tr. 10

→2,3,6Hexp→ 4 - 1

→2,4,6Hexp→ 3 - 1

3(4) 9 2 -

3(4) 9 2 2

Gal 1 - 5 4

Các kết quả phân tích trình bày trên Bảng 4.7 cho thấy:

 Có khá nhiều fucitol methyl hóa có nguồn gốc từ các gốc fucofuranose. Đây là

điểm đặc biệt vì trước đây chỉ có một trường hợp tìm thấy sự có mặt một lượng

đáng kể của fucofuranose trong loài Chordaria flagelliformis [8].

 Các polysaccharide sulfate hóa bao gồm chủ yếu các gốc fucose thế hai, thậm

chí đến ba lần. Như vậy, khi nằm trong chuỗi mạch thẳng chúng sẽ phải gắn với

một nhóm sulfate hoặc một mạch nhánh.

106

 Các mẫu tách loại sulfate chứa nhiều gốc fucose đầu mạch không khử (terminal

nonreducing residues). Có khả năng là chúng liên kết với các đường đơn khác

loại nằm trên mạch chính.

 Hàm lượng mannose trong 1,5M-deS là không đáng kể. Vì vậy tất cả các hexitol

methyl hóa bắt nguồn từ các gốc galactose. Phần lớn các gốc này có gắn kết ở

C-4 và C-6.

 Phân đoạn fucoidan mẹ FSA-1,5M có một ít gốc galactose chỉ có gắn kết ở C-6,

nhưng hầu hết số còn lại có thêm các nhóm thế khác, có khả năng là fucose hoặc

sulfate.

 Phân đoạn 1,0M-deS có hàm lượng mannose và galactose không khác nhau

nhiều. Điều đó làm cho việc phân tích các dữ kiện methyl hóa của FSA-1,0M và

1,0M-deS trở nên phức tạp vì các dẫn xuất methyl hóa của hai hexose này

không thể phân biệt được bằng phương pháp phổ khối lượng.

4.4.2.4. Tách 1,0M-deS trên cột sắc ký trao đổi anion

Sản phẩm fucoidan desulfate hóa 1,0M-deS có thành phần axit uronic vì thế

mang thuộc tính anion. Để tiếp tục tạo ra các fucoidan có cấu trúc đồng nhất hơn,

1,0M-deS được tách thành các phân đoạn có hàm lượng uronic tăng dần trên cột sắc

ký trao đổi anion.

Hình 4.14. Sắc ký đồ của 1.0M-deS trên cột trao đổi anion DEAE-Sephacel.

Cách tiến hành cụ thể như sau:

107

Dung dịch 1,0M-deS (130 mg trong 5 mL nước) được nạp lên cột DEAE-

Sephacel (Pharmacia) dạng Cl, rửa giải lần lượt với các dung dịch NaCl trong nước

có nồng độ tăng dần (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 M). Mỗi lần rửa giải được kéo dài đến

khi không còn phát hiện thấy carbohydrate. Các phân đoạn sắc ký sau khi được

thẩm tách và đông khô cho các sản phẩm tách tương ứng (deS-1 đến deS-6).

Sắc ký đồ được biểu diễn trên Hình 4.14. Hiệu suất và thành phần của các

phân đoạn được trình bày trên Bảng 4.8. Các đặc điểm cấu trúc của chúng được

nghiên cứu bằng phép phân tích liên kết bằng methyl hóa (Bảng 4.7) cũng như bằng

các phương pháp phổ CHTHN.

Bảng 4.8. Hiệu suất và thành phần (%) của các phân đoạn tách 1,0M-deS trên cột

sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ của chúng.

Fuc Xyl Man Glc Gal Uronic SO3Na Fucoidan H%

acid

21.9 c 15.9 5.9 3.5 2.2 11.3 13.6 21.8 FSA-1.0M

8.1 4.0 7.8 4.3 14.0 30.6 2.8 1.0MdeS

5.7 3.1 c 15.9 5.4 8.0 30.1 2.5 n.d. deS-1

13.8 c 15.4 12.1 2.3 3.3 38.8 7.1 2.3 deS-2

15.4 c 16.4 10.1 4.5 5.1 24.1 12.1 1.9 deS-3

34.6 c 6.7 2.4 8.4 2.9 4.2 40.9 n.d. deS-4

13.8 c 11.4 3.7 4.4 3.1 5.3 47.0 1.5 deS-5

c % của 1,0MdeS

7.6c 7.4 2.6 4.0 2.7 3.0 51.1 1.5 deS-6

4.4.2.5. Các đặc điểm cấu trúc của deS-2 và deS-3

Các tín hiệu mạnh nhất trên vùng H-anomer của phổ 1H-NMR của phân đoạn

deS-2 được tìm thấy ở δH 5,3 (d, J = 3 Hz), 4,45, 4,47 và 4,49 ppm (d, J = 8 Hz).

Các phổ COSY, TOCSY và ROESY chỉ ra rằng các tín hiệu này lần lượt thuộc về

α-Galp, β-Xylp, và β-Galp. Phổ HSQC (Hình 4.15) kết hợp với các phổ 1H-NMR,

COSY, TOCSY, ROESY của deS-2 và tham khảo bảng 2.2 cho phép gán các tín

hiệu chính trong phổ 13C của deS-2 như trình bày trên Bảng 4.9.

108

Hình 4.15. Một phần của phổ HSQC của deS-2

Hình 4.16. Các mảnh cấu trúc của fucoidan desulfate hóa deS-2 (các gốc đường đều

ở dạng pyranose).

109

Bảng 4.9. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-2 ( = ppm, ký hiệu của các

gốc đường xem Hình 4.16).

H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6

C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6

deS-2

4.25 4.18 3.85,385 5.31 3.88 3.96 A 4)-α-D-Gal -(1

101.7 70.6 70.0 80.0 73.0 61.9

4.15 3.73 3.77,3.77 4.45 3.81 3.77 B 3)- -D-Gal -(1

104.4 71.7 81.6 69.6 76.3 62.2

4.45 3.81 3.77 4.11 3.80 4.06,3.97 C 3,6)- -D-Gal -(1

104.4 71.7 81.6 69.7 74.2 70.7

4.49 3.30 3.48 3.65 4.00,3.32 - D - -D-Xyl -(1

102.9 74.2 77.0 70.5 66.4 -

4.47 3.32 3.58 3.80 4.12,3.40 - E 4)- -D -Xyl -(1

104.6 74.0 75.0 77.5 - 64.2

4.49 3.56 3.69 4.02 3.98 4.04,4.04 F 6)- -D-Gal -(1 104.6 72.1 74.0 70.5 74.7 71.8

Các dữ kiện NMR nêu trên cho phép rút ra các kết luận về một số đặc điểm cấu trúc

của deS-2 như sau:

 Tất cả các gốc α-Galp có vị trí liên kết ở C-4.

 Gốc β-Galp có một vị trí liên kết ở C-3 hoặc C-6, hoặc 2 vị trí liên kết ở C-3

và C-6.

 Còn gốc β-Xylp có vị trí liên kết ở C-4 hoặc chiếm giữ vị trí đầu mút không

khử của mạch nhánh.

110

Hình 4.17. Một phần của phổ HMBC của deS-2

Cấu trúc chuỗi mạch của deS-2 được kết xuất trên cơ sở phân tích phổ

HMBC (Hình 4.17). Cụ thể trên phổ HMBC xuất hiện các tín hiệu ứng với các

tương tác 1H/13C giữa các gốc đường như sau:

 H-1(α-Galp, A)/C-3(β-Galp, B và C),

 H-1(β-Galp, B)/C-4(α-Galp, A),

 H-1(β-Xylp, D)/C-6(β-Galp, C),

 H-1(β-Xylp, D)/C-4(β-Xylp, E), và

 H-1(β-Galp, F)/C-6(β-Galp, F) (thành phần thứ yếu).

Các dữ kiện nêu trên gợi ý sự có mặt của một mạch chính có cấu trúc như

→4)-α-Galp- (1→3)-β-Galp-(1→

Trong cấu trúc đó, một phần gốc β-Galp được thế chỉ bởi một gốc β-Xylp

hoặc bởi một chuỗi ngắn (1→4)-β-Xylp có từ 2 gốc đường trở lên. Hàm lượng

fucose và xylose của phân đoạn deS-2 là giống nhau, nhưng những cố gắng xác

định vị trí của gốc fucose bằng phương pháp phổ NMR đã không cho ra kết quả.

Các phổ NMR hai chiều của deS-2 cũng chỉ ra sự có mặt của một lượng nhỏ

homopolymer của (1→6)-β-Galp. Nó có thể là một mạch nhánh nằm bên cạnh mạch

111

xylose và gắn với mạch chính tại C-6 của gốc →3)-β-Galp-(1→. Nó cũng có thể là

một polysaccharide riêng rẽ, không liên kết với polymer chính.

Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa của mẫu deS-2 (Bảng 4.7) xác

nhận sự có mặt của một mạch chính với các gốc Galp luân phiên liên kết với nhau

tại C-4 và C-3 và mang mạch nhánh tại C-6. Hơn nữa, chúng cũng cho thấy sự có

mặt của:

 Một lượng nhỏ Galp có liên kết mạch ở C-6.

 Các Fuc ở cả hai dạng fucopyranose và fucofuranose và có các liên kết mạch

khác nhau.

 Các Xyl đầu mạch và Xyl liên kết mạch ở C-4.

Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa cho thấy mạch polysaccharide

của deS-3 cho thấy deS-3 có các đặc điểm cấu trúc tương tự như deS-2. Tuy nhiên

nó cũng có những điểm khác biệt như sau:

 Chứa nhiều Gal liên kết ở C-4 hơn Gal liên kết ở C-3.

 Các gốc Gal liên kết ở C-6 gần như hoàn toàn vắng mặt.

 Gốc Xyl đầu mạch chiếm ưu thế vượt trội so với Xyl liên kết ở C-4.

Trước đây đã có một số công bố về các fucogalactan, ví dụ từ các loại rong

nâu Undaria pinnatifida [115,116,117] và Laminaria japonica [118,119]. Các kết

quả nghiên cứu nêu trên đã làm rõ được một phần các đặc điểm cấu trúc của các

fucogalactan deS-2 và deS-3 từ S. aquifolium. Tuy nhiên, cấu trúc chính xác của các

polysaccharide phân nhánh này còn là câu hỏi cho các nghiên cứu trong tương lai.

4.4.2.6. Các đặc điểm cấu trúc của deS-4

Phổ HSQC của deS-4 được trình bày trên Hình 4.18, phổ HMBC trên Hình

4.19 kết hợp với các phổ 1H-NMR, COSY, TOCSY, ROESY của deS-4 và tham

khảo bảng 2.2 cho ta kết quả ở bảng 4.10.

112

Hình 4.18. Phổ HSQC của deS-4

Hình 4.19. Một phần của phổ HMBC của deS-4

Kết quả phân tích các phổ NMR hai chiều của deS-4 theo cách tương tự như

trình bày ở trên cho thấy:

113

 Polysaccharide chính có mạch chủ tạo thành bởi sự gắn kết luân phiên nhau

của các gốc 2)-α-D-Manp-(1 và )4-β-D-GlcpA-(.

 Khoảng một nửa số các gốc mannose có mạch nhánh ở O-3 là một gốc

đường α-L-Fucp hoặc 4-β-D-GlcpA với tỉ lệ 4:1.

Trình tự của các gốc đường đơn trong mạch chính được xác định bởi phổ

HMBC căn cứ trên các tương tác xa của các proton anomer như sau (ký hiệu xem

Hình 4.19):

 H-1(α-Manp, S)/C-4(β-GlcpA, R),

 H-1(α-Manp, U)/C-4(β-GlcpA, T),

 H-1(β-GlcpA, R)/C-2(α-Manp, U), và

 H-1(β-GlcpA, T)/C-2(α-Manp, S).

Vị trí của α-Fucp và β-Xylp ở O-3 của α-Manp được xác nhận bởi các tương tác

tương ứng sau:

 H-1(α-Fucp, V)/C-3(α-Manp, U), và

 H-1(β-Xylp, G)/C-3(α-Manp, U).

Các đặc điểm cấu trúc trên được xác nhận bởi kết quả phân tích các dẫn xuất

metyl hóa.

Trước đây, các fucoglucuronomannan tương tự như polysaccharide chính

của deS-4 đã được tìm thấy trong nhiều loài rong nâu khác nhau. Đặc biệt, một

polysaccharide từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia có cấu trúc phân nhánh với

mạch chính cấu tạo bởi các đơn vị trisaccharid lặp đi lặp lại (Các polysaccharide

tương tự có khả năng có mặt trong các loài Saccharina latissima và Laminaria

bongardiana. Gần đây, có nghiên cứu cho thấy cấu trúc gồm các mạch nhánh

fucooligosaccharide ngắn nằm kề bên với mạch nhánh chỉ có một nhóm Fucp có

mặt trong một fucoglucuronomannan từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia. Còn cấu

trúc mà mạch nhánh chỉ có một gốc Xylp duy nhất như trong deS-4 của S.

aquifolium là lần đầu tiên được tìm thấy.

114

Hình 4.20. Mảnh cấu trúc của deS-4

Bảng 4.10. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-4

H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6

C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6

deS-4

5.38 4.14 3.81 3.69 3.69 3.84,3.79 S 2)- -D-Man -(1

100.0 79.0 70.9 68.0 74.0 61.5

5.36 4.32 3.89 3.83 3.74 3.84,3.79 Uv - -D-Man -(1

99.8 74.6 74.7 66.0 74.0 61.5

5.36 4.34 3.84 3.80 3.74 3.84,3.79 UG 2,3)- -D-Man -(1

99.8 73.9 76.5 65.9 74.0 61.5

4.46 3.38 3.65 3.78 3.75 - T - -D-Gle A-(1

102.8 74.2 77.5 78.8 77.6 176.0

4.46 3.38 3.65 3.78 3.75 - R 4)- -D-Gle A-(1

103.0 74.2 77.5 78.0 77.6 176.0

5.08 3.79 3.93 3.81 4.22 1.20 V -L-Fuc -(1 96.4 69.2 70.5 73.1 67.9 16.6

4.38 3.30 3.44 3.62 4.00,3.29 - G -D-Xyl -(1 104.6 74.4 77.0 70.6 66.5 -

115

4.4.2.7. Các đặc điểm cấu trúc của deS-6

Phổ HSQC của deS-6 được trình bày trên Hình 4.21, phổ HMBC trên Hình 4.22.

Hình 4.21. Phổ HSQC của deS-6

Hình 4.22. Một phần của phổ HMBC của deS-6

116

Phân đoạn deS-6 nổi bật ở hàm lượng uronic acid cao. Phổ HSQC (Hình

4.21) cho thấy thành phần chính của nó là một glucuronan. Nó có mạch chính là các

β-D-GlcpA thế bởi một gốc β-D-Xylp hoặc α-L-Fucp (thứ yếu) ở vị trí C-4 và liên

kết với nhau qua C-3 (Hình 4.21).

Cấu trúc của mạch chính được xác định bởi cường độ mạnh của tín hiệu

tương tác của β-GlcpA H-1/C-3 trên phổ HMBC (Hình 4.22). Vị trí của α-Fucp và

β-Xylp ở O-4 của β-GlcpA được xác định bởi tín hiệu có cường độ mạnh của các

tương tác H-1(β-Xylp, K)/C-4(β-GlcpA, YK) và H-1(α-Fucp, H)/C-4(β-GlcpA,YH)

(thứ yếu). Một fucoglucuronan tương tự đã được tìm thấy với vai trò là một thành

phần nhỏ trong fucoidan chiết xuất từ rong nâu Saccharina latissima. Bên cạnh

fucoglucuronan, deS-6 còn chứa một lượng đáng kể fucoglucuronomannan, thành

phần chính của phân đoạn deS-4.

Hình 4.23. Mảnh cấu trúc của deS-6

Bảng 4.11. Kết quả gán phổ 1H- và 13C-NMR của deS-6

117

4.4.2.8. Các đặc điểm cấu trúc của deS-5

Phân đoạn deS-5 về cơ bản là một hỗn hợp có tỉ lệ gần bằng 1:1 của

fuco(xylo)glucuronomannan và xylo(fuco)glucuronan, lần lượt là thành phần chính

của deS-4 và deS-6.

4.4.2.9. Nghiên cứu một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn FSA-1,5M bằng

phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS

FSA-1,5M là phân đoạn sắc ký trao đổi anion của FSA có hiệu suất thu hồi

cao thứ hai sau FSA-2,0M (9,8% tính theo FSA) (Bảng 4.5). Kết quả phân tích hóa

học gợi ý FSA-1,5M là một fucogalactan sulfate hóa, chủ yếu chỉ có các thành phần

chính là fucose (19,2%), galactose (25,5%) và sulfate (29,2%).

Tuy nhiên phổ NMR của FSA-1,5M (Hình 4.12) lại rất phức tạp, không thể

phân tích trực tiếp để rút ra các kết luận sâu về cấu trúc được. Kể cả mẫu tách loại

sulfate 1,5M-deS cũng không dẫn đến một sự đơn giản hóa đáng kể của phổ. Tuy

nhiên chúng ta vẫn có thể rút một số nhận xét có ích từ phổ 13C-NMR của fucoidan

này. Cụ thể, phổ 13C NMR của FSA-1,5M chứa ít nhất 7 tín hiệu của các C-anomer

trong vùng 105-95 ppm và nhiều tín hiệu của các nhóm methyl của fucose trong

vùng 20-17 ppm, gợi ý FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh không có qui luật, mức

độ phân nhánh rất cao, các đường đơn gắn kết với nhau theo nhiều kiểu và các

nhóm sulfate gắn với các đường ở nhiều vị trí khác nhau. Các tín hiệu thuộc nhóm

CH2OH trong khoảng 61-63 ppm cũng rất phức tạp, có 1 tín hiệu tại 62,7 ppm có

khả năng thuộc về galactose bị thế sulfate hoặc tham gia liên kết glycosid 1→6.

Các đặc điểm cấu trúc sâu hơn của FSA-1,5M được đúc kết từ các dữ kiện

phân tích liên kết bằng methyl hóa và phổ ESIMS/MS. Bảng 4.7 trình bày kết quả

phân tích methyl hóa của FSA-1,5M và dẫn xuất tách loại sulfate của nó là 1,5M-

deS.

Theo kết quả phân tích thành phần cấu tạo trình bày trên bảng 4.5, galactose

(25,5%) là thành phần hexose có hàm lượng cao vượt trội so với hai hexose còn lại

là mannose (2,2%) và glucose (1,7%). Vì thế hầu như tất cả các dẫn xuất hexitol

trên Bảng 4.12. có thể coi như bắt nguồn từ các gốc galactose. Các kết quả trên

Bảng 4.12 cho phép rút ra hai kết luận sơ bộ sau:

118

- 1,5M có hai thành phần đường đơn chính là fucose và galactose. Hai thành

phần phụ gồm một hexose là mannose và một pentose là xylose.

- Sự xuất hiện một lượng đáng kể của các dẫn xuất bắt nguồn từ fucofuranose

(fucf) là một điểm đặc biệt trong cấu trúc của FSA-1,5M.

Bảng 4.12. Kết quả phân tích methyl hóa FSA-1,5M và 1,5M-deS.

Thành phần các dẫn xuất của 1,5MdeS cho thấy:

- Các gốc nằm ở đầu mạch không khử chiếm một hàm lượng đáng kể (24%)

gợi ý FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao và có KLPT không cao. Các

gốc đường có tần suất xuất hiện ở đầu mạch theo thứ tự sau: Gal (12%) >

Fucp (7%) > Xyl (4%) > fucf (1%) và Man (1%).

- Tổng số các gốc Fuc có liên kết ở O-3 chiếm 8%, có liên kết ở O-4 chiếm

6%.

- Tổng số các gốc Gal có liên kết ở O-6 chiếm 21%, ở O-4 chiếm 19%, ở O-2

chiếm 2%. Các gốc Gal có hai và ba vị trí liên kết ở các vị trí 2, 4, 6 chiếm

10%.

So sánh các kết quả nêu trên với các kết quả về thành phần các dẫn xuất của

fucoidan mẹ FSA-1,5M cho phép đưa ra các gợi ý:

- Các gốc Fuc có mức độ sulfate hóa cao. Các nhóm sulfate nằm tại O-2 và O-

5 với tần suất tương đương.

119

- Các gốc Gal có mức độ sulfate hóa thấp hơn các gốc Fuc. Các nhóm sulfate

chủ yếu nằm tại O-3, số còn lại nằm tại các vị trí 6, 4 và 2 với tần suất thấp

dần.

Các kết quả nêu trên cho phép đưa ra các kết luận sơ bộ sau:

- Phân đoạn FSA-1,5M của FSA tuy có thành phần hóa học không quá phức

tạp, có KLPT không quá cao nhưng lại có cấu trúc phức tạp với mức độ phân

nhánh cao do cấu trúc lõi tạo thành bởi nhiều gốc đường khác nhau về cấu

tạo, về dạng (pyranose và furanose) và về số vị trí liên kết.

- Cấu trúc lõi của 1,5M được tạo thành chủ yếu bởi các gốc fucose dưới dạng

pyranose và furanose có vị trí liên kết ở O-3 và O-4, và bởi các gốc galactose

có vị trí liên kết chủ yếu ở O-6 và O-4.

- Các gốc Fuc có mức độ sulfate hóa cao, các nhóm sulfate nằm tại O-2 và O-

5. Các gốc Gal có mức độ sulfate hóa thấp hơn, các nhóm sulfate chủ yếu

nằm tại O-3.

- Các gốc nằm ở đầu mạch không khử chiếm một hàm lượng đáng kể với tần

suất xuất hiện theo thứ tự sau: Gal > Fucp > Xyl.

Để sáng tỏ thêm các thông tin cấu trúc khác, chúng tôi tiến hành thủy phân từng

phần FSA-1,5M dưới điều kiện êm dịu bằng axit trifluoroacetic 0,75 M để chia cắt

các fucoidan tự nhiên thành các mảnh có mức độ polymer hóa thấp hơn, thích hợp

cho phân tích bằng các kỹ thuật của phổ khối lượng. Các phổ ESI-MS và ESI-

MS/MS của sản phẩm thu được sau khi làm sạch được đo trên thiết bị Xevo TQ MS

của hãng Water (USA) ở thức âm, dung môi là hỗn hợp MeOH/H2O 1:1.

Phổ ESI-MS của FSA-1,5M sau khi thủy phân từng phần bằng TFA (Hình 4.24)

cho các tín hiệu quan trọng sau:

 Tín hiệu tại m/z 243 (pic cơ bản) ứng với ion [FucSO3] (thực tế là ion

[FucSO3Na-Na]) của fucose monosulfate. Tín hiệu tại m/z 225 ứng với ion

[FucSO3-H2O].

 Tín hiệu tại m/z 325 ứng với ion [Galfuc].

 Tín hiệu tại m/z 389 ứng với ion [Fuc2SO3] của difucose monosulfate.

 Tín hiệu tại m/z 405 ứng với ion [GalFucSO3]−.

 Tín hiệu tại m/z 421 ứng với ion [Gal2SO3]

120

 Tín hiệu tại m/z 500 ứng với ion [Gal2(SO3)2].

 Tín hiệu tại m/z 507 ứng với ion [GalFuc(SO3)2Na].

 Tín hiệu yếu tại m/z 535 ứng với ion [Fuc3SO3] của trifucose monosulfate.

 Tín hiệu tại m/z 551 ứng với ion [Galfuc2(SO3)] .

Hình 4.24. Phổ ESI-MS của FSA-1,5M trong vùng m/z 320 đến m/z 610

Ngoài ra trên phổ còn quan sát thấy các tín hiệu ứng với các ion có một natri

gồm [Fuc2(SO3)2Na] ở m/z 491, [GalFuc2SO3Na] ở m/z 447 và

[GalFuc(SO3)2Na] ở m/z 507. Như vậy phổ ESI-MS cho thấy mạch lõi (core) của

FSA-1,5M được cấu tạo bởi các đoạn Fuc-Fuc và Gal-Fuc trong đó mỗi đoạn mạch

có thể mang một đến hai nhóm thế sulfate. Khả năng xuất hiện các đoạn mạch Fuc-

Fuc cao hơn các đoạn mạch Gal-Fuc.

Để xác định vị trí của nhóm thế sulfate trên gốc fucose và trật tự cũng như vị

trí liên kết của các gốc đường với nhau, các tín hiệu tại m/z 243 ([FucSO3]), m/z

389 ([Fuc2SO3]) và m/z 405 ([GalFucSO3]−) được tiến hành phá mảnh lần 2.

121

Hình 4.25. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]- với m/z 243

Phổ MS/MS của ion fucose monosulfate [FucSO3] (m/z 243) thu được cho

thấy một tín hiệu yếu tại m/z 225 ứng với ion [M-H2O]−, và 2 tín hiệu mạnh tại m/z

139 và m/z 183 (Hình 4.25). Tín hiệu tại m/z 139 ứng với ion mảnh kiểu 0,2X của

gốc fucose có nhóm sulfate tại O-2, còn tín hiệu tại tại m/z 183 ứng với ion mảnh

kiểu 0,2A của gốc fucose có nhóm sulfate tại O-4 (theo Tissot và cs. [98]). Sự vắng

mặt của tín hiệu tại m/z 169 cho thấy không có mặt nhóm sulfate tại O-3. Cường độ

vượt trội của tín hiệu ở m/z 139 gợi ý rằng các gốc fucose chủ yếu được sulfate hóa

với các vị trí tương ứng của nhóm sulfate

ở O-2. Kiểu phân mảnh của ion [FucSO3]

tại C-2 cũng như tại C-4 được mô tả trên Hình 4.25.

122

Hình 4.26. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- với m/z 389

Phổ ESI-MS/MS thức âm của ion [Fuc2SO3]- (m/z 389) và các kiểu phân

mảnh được trình bày trên Hình 4.26. Phân tích các tín hiệu trên phổ cho phép ta đưa

ra các nhận xét sau:

 Các tín hiệu tại m/z 243 (ion mảnh kiểu C1) và m/z 225 (ion mảnh kiểu B1) là

đặc trưng cho sự có mặt của gốc fucose có nhóm thế sulfate ở O-2 (gốc Fuc2S).

 Sự vắng mặt của tín hiệu ở m/z 139 (ion kiểu 0,2X0) cho thấy gốc Fuc2S không

thể nằm ở đầu khử.

 Mảnh ion 0,2A2 tại m/z 329 cùng với ion 0,2X1 tại m/z 285 chứng tỏ tồn tại liên

kết (1→4) của gốc fucose.

 Mảnh ion 0,3X1 tại m/z 315 là bằng chứng của liên kết (1→3) của fucose.

Các dữ kiện nêu trên cho thấy các gốc fucose trong FSA-1,5M liên kết luân

phiên với nhau trong mạch theo kiểu (1→3) và (1→4). So với các nghiên cứu trước

[92] về cấu trúc của fucoidan có nguồn gốc từ rong nâu Việt Nam thì đa số liên kết

được tìm thấy của fucose trong phân tử fucoidan là liên kết (1→3).

123

Hình 4.27. Phổ ESIMS/MS thức âm của ion [FucGalSO3]- (m/z 405)

Phổ ESI-MS/MS thức âm (Hình 4.27) của ion [FucGalSO3]- (m/z 405) cho

các tín hiệu của các ion mảnh với cường độ yếu. Tuy nhiên chúng ta có thể nhận

biết được tín hiệu ở m/z 241(ion mảnh kiểu B1) đặc trưng cho cấu trúc của một

Galfuc monosulfate với galactose nằm ở đầu không khử, có nhóm thế sulfate nằm ở

vị trí O-2 và liên kết với fucose ở vị trí O-3 (Theo Anastyuk và cs. [83]). Tín hiệu ở

m/z 113 được gán cho mảnh chia cắt kiểu 0,3A1 (cộng hợp với Na). Tín hiệu ở m/z

310 được gán cho mảnh chia cắt kiểu 0,2X1 (cộng hợp với Na). Tín hiệu rất yếu ở

m/z 225 và sản phẩm cộng hợp của nó với Na ở m/z 249 cho thấy một lượng nhỏ

gốc fucose 2-O-sulfate cũng có thể nằm ở đầu không khử. Các tín hiệu khác bao

và m/z 404

gồm m/z 326 ứng với ion [M - SO3], m/z 397 ứng với ion [M - H2O]

ứng với ion [M - H].

Tất cả các dữ kiện thu được cho phép ta rút ra các đặc điểm khái quát về cấu

trúc như sau cho fucoidan FSA-1,5M:

 Fucoidan FSA-1,5M có hàm lượng sulfate cao (31,5%), cấu tạo chủ yếu từ α-L-

fucose (19,2%) và galatose (5,5%). Đường fucose tồn tại dưới cả hai dạng vòng

pyranose và furanose. Đường galactose chỉ có dạng pyranose.

124

 Fucoidan FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao. Mạch chính cấu tạo chủ yếu

bởi các gốc fucose liên kết luân phiên với nhau ở vị trí O-3 và O-4. Các gốc

galactose nằm ở đầu không khử và liên kết với O-3 của fucose tạo thành các

mạch nhánh.

 Trong cấu trúc lõi, các nhóm sulfate chủ yếu nằm ở vị trí O-2 trên cả gốc fucose

và galactose.

4.4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học

4.4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào của FSA và các phân đoạn tách sắc ký của nó được

thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi LU-1 và ung

thư mô liên kết RD theo phương pháp hiện hành của Viện nghiên cứu ung thư quốc

gia USA [120,121]. Thử nghiệm sơ bộ được thực hiện ở nồng độ 100 g/ml với

chứng dương là ellipticin. Hoạt tính gây độc tế bào được biểu diễn bằng tỉ lệ phần

trăm các tế bào sống sót khi có mặt chất thử ở nồng độ nhất định (Bảng 4.13). Các

kết quả thử nghiệm cho thấy FSA-1,5M thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các

dòng ung thư gan Hep-G2 và ung thư phổi LU-1, các giá trị IC50 tương ứng là 60,7

và 80,0 µg/mL. Còn FSA-2,0M thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng ung

thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD, các giá trị IC50 tương ứng là 46,7 và

81,0 µg/mL.

Bảng 4.13. Tỉ lệ sống sót của các tế bào ung thư khi có mặt các phân đoạn fucoidan

từ FSA.

Nồng độ Tỉ lệ tế bào sống sót CS (%) TT Chất thử (g/mL) Hep-G2 LU-1 RD

1 FSA-1.5M 100 70,21,3 40,50,8 41,20,3

2 FSA-2.0M 100 78,250,2 29,30,5 40,51,3

3 Ellipticin 5 0,50,5 1,10,2 0,030,0

4.4.3.2. Hoạt tính chống khối u in vitro

Phép thử hoạt tính chống sự hình thành khối u ba chiều trên thạch mềm được

thực hiện tại Phòng sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

trên các tế bào ung thư gan Hep-G2 theo phương pháp mô tả bởi Gao và cs. (2010)

125

[103]. Các mẫu thử là FSA-1,5M và FSA-2,0M. Hình thái và số lượng của các quần

thể tế bào (khối tế bào 3D) tạo thành khi có mặt chất thử được quan sát và đo đạc

dưới kính hiển vi ngược. Hoạt tính được đánh giá qua các chỉ số về kích thước

(đường kính) và mật độ các quần thể tế bào tạo thành cũng như tỉ lệ giảm của các

chỉ số này so với chứng âm.

Hình ảnh dưới kính hiển vi ngược (Hình 4.28) cho thấy có sự biến đổi về

kích thước và hình thái của các quần thể tế bào tạo thành dưới tác dụng của các chất

thử, trong đó sự biến đổi ở mẫu FSA-2,0M là rõ rệt hơn hẳn so với mẫu FSA-1,5M.

Kết quả đo và tính toán trình bày trên Bảng 4.14 cho thấy các phân đoạn FSA-1,5M

và FSA-2,0M lần lượt làm giảm 22,14% và 41,11% mật độ, cũng như lần lượt làm

giảm 24,72% và 34,03% kích thước của các quần thể tế bào trên thạch mềm.

Các kết quả nêu trên cho phép đưa ra kết luận rằng cả hai mẫu thử nghiệm

đều có khả năng ức chế rõ rệt sự hình thành khối u tế bào ung thư dòng Hep-G2 ở

nồng độ 100 μg/ml, trong đó mẫu 2,0M thể hiện hoạt tính mạnh hơn mẫu 1,5M.

Hoạt tính ức chế này có khả năng là do tác động của các fucoidan tới quá trình

apoptosis của tế bào.

Bảng 4.14. Tác dụng của chất thử tới kích thước trung bình và mật độ của các quần

thể tế bào

Nồng độ

Kích thước của quần thể tế bào

Tỷ lệ giảm mật

mẫu

Mẫu thử

Đường kính

Tỷ lệ giảm so với

độ (% )

(g/ml)

(µm)

đối chứng (%)

Đối chứng (-)

0

41,35  1,85

1.5M

100

24,72 31,13  1,42 22,14  1,12

34,03

100

27,28  0,95 41,11  0,88

2.0M

126

1,5M (100 g/ml)

Đối chứng (-)

2,0M (100 g/ml)

Hình 4.28. Hình ảnh dưới kính hiển vi ngược của các quần thể tế bào Hep-G2 nuôi

cấy trên thạch mềm dưới tác dụng của cácchất thử

4.4.3.3. Hoạt tính chống đông tụ máu

Hoạt tính chống đông máu tương tự heparin của các phân đoạn FSA được

xác định bằng phương pháp APTT (activated partial thromboplastine time, phương

pháp đo thời gian đông máu với thromboplastin không có yếu tố mô và có tác nhân

kích hoạt) [122]. Phép thử được tiến hành trên máy Coatron®M2 (TECO, Đức)

theo quy trình đã được thiết lập bởi công ty cung cấp máy. Các mẫu fucoidan và

chứng dương là Clexan, một heparin khối lượng phân tử thấp, được thử nghiệm ở 3

nồng độ 1, 5, và 10 µg/mL.

Kết quả trình bày trên Hình 4.29. cho thấy phân đoạn FSA-0,5M không có

hoạt tính, trong khi hoạt tính chống đông máu của các fucoidan còn lại tăng từ FSA-

127

1,0M tới FSA-2,0M tỉ lệ thuận với mức độ sulfate hóa. Giá trị 2APTT (được định

nghĩa là nồng độ của chất thử cần thiết để kéo dài gấp đôi thời gian hình thành cục

máu đông) được xác định cho mẫu FSA-2,0M là 6.5 ± 0.4 µg/mL, cho chứng dương

enoxaparin là 3.9 ± 0.4 µg/mL. Điều đó chứng tỏ, ngay cả mẫu fucoidan có mức độ

sulfate hóa cao nhất là FSA-2,0M cũng chỉ có hoạt tính chống đông máu bằng nửa

enoxaparin.

) s ( u á m ụ t g n ô đ n a i g i ờ h T

Nồng độ (µg/ml)

Hình 4.29. Hoạt tính chống đông máu của các fucoidan từ S. aliqualium đo được

bằng phương pháp APTT.

Tóm tắt các kết quả nghiên cứu của nội dung nghiên cứu 4.4:

 Từ rong nâu Sargassum aquifolium ở vùng biển Nha Trang đã chiết xuất được

một fucoidan tổng số gọi tên là FSA với hiệu suất 3.7% tính trên nguyên liệu

khô.

 FSA có KLPT trung bình cao (110 kDa) và có cấu tạo phức tạp với các thành

phần chính bao gồm L-Fucose, D-galactose, D-mannose, axit D-glucuronic, D-

xylose và sulfate. Việc nghiên cứu cấu trúc của FSA trực tiếp bằng các phương

pháp phổ MS và NMR không thể thực hiện được.

 FSA đã được tách thành 04 phân đoạn (ký hiệu lần lượt là FSA-0,5M, FSA-

1,0M, FSA-1,5M, và FSA-2,0M) có hàm lượng sulfate tăng dần bằng phương

pháp sắc ký trao đổi anion.

128

 Các phân đoạn chính là FSA-1,0M và FSA-1,5M (21,0 và 9,8% từ FSA) được

phân tích bằng phương pháp methyl hóa trước và sau khi tách loại sulfate.

 Sản phẩm tách loại sulfate của FSA-1,0M là 1,0M-deS được tách thành 06 phân

đoạn (ký hiệu lần lượt là deS-1 tới deS-6) có hàm lượng axit uronic tăng dần

bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion. Các đặc điểm cấu trúc của chúng được

xác định bằng phép phân tích methyl hóa và bằng các dữ kiện NMR. Kết quả đã

nhận biết được 03 polysaccharide có cấu trúc cơ bản khác nhau:

 Polysaccharide thứ nhất có mạch chính gồm các gốc 2)-α-D-Gal-(1

và 4)-β-D-GlucA-(1 liên kết luân phiên với nhau. Khoảng một nửa

gốc 2)-α-D-Gal-(1 có nhóm thế là α-L-Fucp hoặc β-D-Xylp ở O-3.

 Polysaccharide thứ hai có mạch chính là một (13)-β-D-

glucopyranuronan được thế một phần bởi duy nhất một gốc β-D-Xylp

hoặc α-L-Fucp ở O-4.

 Polysaccharide thứ ba có mạch chính là một xylo(fuco)galactan có mạch

chính thẳng cấu tạo từ các gốc 4)-α-D-Gal-(1 và 3)-α-D-Gal-(1

liên kết luân phiên với nhau. Gốc 3)-α-D-Gal-(1 mang nhóm thế là

một gốc β-D-Xylp hoặc một mạch ngắn gồm 4)-β-D-Xylp-(1, 6)-

α-D-Gal-(1 và α-L-Fuc có liên kết ở các vị trí khác nhau.

 Trong FSA các polysaccharide này mang các nhóm thế sulfate ở các vị trí

khác nhau, không có qui luật xác định.

 Phân đoạn sắc ký FSA-1,5M có hàm lượng sulfate cao (31,5%), có thành phần

đơn giản, cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) và galatose (5,5%), nhưng có

cấu trúc phức tạp, không trực tiếp nghiên cứu được bằng các phổ MS và NMR.

Nghiên cứu FSA-1,5M bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ

ESI-MS/MS của sản phẩm thủy phân từng phần với TFA cho thấy:

 Fucoidan FSA-1,5M cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) và D-

galatose (5,5%). Đường fucose tồn tại dưới cả hai dạng vòng pyranose

và furanose. Đường galactose chỉ có dạng pyranose.

 Fucoidan FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao. Mạch chính cấu tạo chủ

yếu bởi các gốc fucose liên kết luân phiên với nhau ở vị trí O-3 và O-4.

129

Các gốc galactose nằm ở đầu không khử và liên kết với O-3 của fucose

tạo thành các mạch nhánh.

 Trong cấu trúc lõi, các nhóm sulfate chủ yếu nằm ở vị trí O-2 trên cả gốc

fucose và galactose.

 Các phân đoạn fucoidan của FSA có hoạt tính chống đông máu, gây độc tế bào

và chống khối u. Các hoạt tính này tăng theo hàm lượng fucose và mức độ

sulfate hóa.

130

131

4.5. Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của các fucoidan phân lập

từ rong nâu Turbinaria decurrens.

Đối tượng nghiên cứu của phần này là loài rong nâu Turbinaria decurrens

thuộc chi Turbinaria, một chi rong biển phổ biến ở Việt Nam. Mẫu rong được thu

hoạch vào tháng 6 năm 2013 ở đảo Hòn Rùa, vịnh Nha Trang. Đây là đối tượng mới

được chúng tôi nghiên cứu với các mục tiêu là xác định hàm lượng fucoidan tổng

trong sinh khối, thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào.

Các nội dung nghiên cứu của phần này bao gồm:

 Chiết xuất và tinh sạch fucoidan tổng, xác định các đặc trưng hóa, lý của nó.

 Tách FTD thành các phân đoạn (ký hiệu lần lượt là FTD-0,5N, FTD-1,0N và

FTD-2,0N) có hàm lượng sulfate tăng dần bằng phương pháp sắc ký trao đổi

anion, khảo sát các sản phẩm thu được.

 Xác định các đặc điểm cấu trúc của FTD và các sản phẩm tiếp theo bằng cách

phân tích tổng hợp các dữ kiện phổ IR, ESI-MS và NMR (bao gồm cả các kỹ

thuật phổ NMR hai chiều).

 Xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro của fucoidan FTD.

4.5.1. Chiết xuất, phân đoạn và xác định thành phần của các fucoidan từ rong

nâu Turbinaria decurrens.

Fucoidan tổng của rong nâu Turbinaria decurrens (ký hiệu là FTD) được

chiết xuất và tinh chế theo qui trình của Bilan và cộng sự [68]. Quy trình này sử

dụng CaCl2 làm dung môi chiết và Cetavlon tạo phức kết tủa. Trình tự thực hiện các

nội dung chiết xuất, tinh sạch, tách phân đoạn được trình bày trên sơ đồ ở Hình

4.30. Các bước chính của qui trình được tiến hành cụ thể như sau:

Mẫu rong khô 200 g được xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH-

CHCl3-H2O tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với axeton, sấy khô. Sau khi

sấy khô bột rong được chiết với 250 ml dung dịch CaCl2 2% (5 lần) mỗi lần dung

dịch được khuấy trộn ở 850C trong 5 giờ. Dịch chiết 5 lần được gom lại, sau đó

thêm 80 ml dung dịch hexadecyltrimethylammoniumbromide (Cetavlon) nồng độ

10% trong nước. Tủa tạo thành được li tâm, rửa với nước nhiều lần, sau đó khuấy

trộn với 150 ml dung dịch NaI 20% trong cồn để ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3

ngày, ly tâm tách lấy phần tủa (làm như vậy 5 lần), sau đó rửa với cồn và hòa tan lại

132

trong nước. Dung dịch được thẩm tách qua màng 10 kDa và đông khô cho fucoidan

tổng.

Hình 4.30. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn các fucoidan từ rong nâu Turbinaria

decurrens

Kết quả thu được 0,6g fucoidan tổng dưới dạng muối Na (Ký hiệu FTD),

hiệu suất chiết tách là 2,19% tính theo trọng lượng rong khô. GPC là một phương

pháp không những cung cấp thông tin về khối lượng phân tử mà còn giúp ta đánh

giá được độ sạch của mẫu đo và sự phân bố trọng lượng phân tử của

polysaccharide nghiên cứu. Phương pháp sắc ký lọc gel GPC được sử dụng để xác

định sự phân bố theo KLPT của các polymer thành phần của FTD và xác định

KLPT trung bình của FTD.

133

Khối lượng phân tử (D)

Hình 4.31. Sắc ký đồ của GPC của fucoidan FTD từ rong nâu Turbinaria decurrens

Kết quả đo GPC cho thấy fucoidan FTD có khối lượng phân tử trung bình là

227 kDa. Sắc ký đồ trên Hình 4.38. chỉ gồm 1 peak chứng tỏ fucoidan thu được có

độ sạch cao. Chỉ số đa phân tán PI = Mw/Mn = 1.89 cho thấy mức độ phân bố trọng

lượng phân tử của fucoidan nghiên cứu là không lớn.

Kết quả phân tích các thành phần cấu tạo của FTD (Bảng 4.5.) cho thấy, FTD có

các thành phần chính là fucose (62,9%), galactose (31,4%), axit uronic (7%) và

sulfate (24.3%). Các đường đơn còn lại gồm xylose (1,9%), glucose (1.3%) và

mannose (2.5%) có hàm lượng nhỏ hơn rõ rệt.

Tách phân đoan FTD trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-Sephadex

Để thu các phân đoạn có cấu trúc đơn giản hơn, fucoidan thô được tiến hành

tách phân đoạn. Tương tự như các fucoidan khác, FTD là một hỗn hợp của nhiều

polysaccharide anionic khác nhau về thành phần cấu tạo và mật độ điện tích, vì thế

chúng có thể được tách ra thành các phân đoạn có tính chất đồng nhất hơn bằng

phương pháp sắc ký trao đổi ion, quy trình tách phân đoạn như sau:

Dung dịch nước Fucoidan thô (1g / 50ml) được đưa lên cột (24 x 4cm) có

chứa DEAE-Sephadex và rửa giải với HCl 0,01N tiếp theo với các dung dịch NaCl

có nồng độ tăng dần 0,5N; 1,0N; 2,0N . Mỗi một lần như vậy cột được rửa cho đến

khi dung dịch giải hấp không còn thấy xuất hiện phản ứng dương tính của

carbonhydrate với phenol và axit sulfuric đậm đặc. Tất cả dung dịch thu được đem

134

thẩm tách qua màng 10 kDa và làm khô bằng đông lạnh thu được 3 phân đoạn ký là

FTD-0,5N, FTD-1,0N và FTD-2,0N. Đồ thị tách sắc ký được mô tả trong hình

4.32.

Hình 4.32. Các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens

Kết quả phân tích hóa học của FTD và từng phân đoạn được đưa ra trên bảng

4.15. Kết quả phân tích cho thấy fucoidan FTD từ rong nâu Turbinaria decurrens

bao gồm chủ yếu là 2 loại đường là fucose và galactose. Các loại đường khác như

xylose, manose và glucose đều có hàm lượng rất nhỏ. Một nghiên cứu trước đây của

nhóm chúng tôi [92] cho thấy fucoidan tách từ rong Tubinaria ornata cũng bao gồm

chủ yếu là 2 loại đường này. Do vậy, có thể fucoidan từ chi rong Turbinaria ở bờ

biển Khánh Hòa có thành phần đường chủ yếu là fucose và galactose.

Trong 3 phân đoạn tách được, phân đoạn FTD-2,0N là phân đoạn có tỷ lệ

thu hồi lớn nhất và hàm lượng fucose cao đồng thời thành phần đường đơn giản chỉ

gồm 2 đường là fucose và galactose với hàm lượng sulfate rất cao (Hình 4.32). Rất

nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng cao của nhóm sulfate của fucoidan tự

nhiên hứa hẹn một hoạt tính sinh học cao. Do vây, chúng tôi chọn phân đoạn này để

nghiên cứu cấu trúc.

135

Bảng 4.15: Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong

Turbinaria decurrens

Hiệu suất SO3Na Axit Tỷ lệ monosaccharide (mole) Fucoidan uronic (%) Fuc Gal Xyl Man Gluc

24,3 7,0 1 0,50 0,03 0,04 0,02 2,19 FTD

10,5 22,5 1 0,45 0,02 0,07 - FTD-0,5N 19,97

25,7 14,7 1 0,33 0,01 0,02 - FTD-1,0N 30,33

34,5 5,2 1 0,65 - - - FTD-2,0N 45,7

4.5.2. Xác định cấu trúc của FTD-2,0N phân lập từ rong nâu Turbinaria

decurrens.

Để nghiên cứu cấu trúc hóa học của fucoidan FTD-2,0N, chúng tôi đã sử

dụng các phương pháp phổ IR, ESI-MS và NMR. Kết quả cho thầy cấu trúc của

phân đoạn fucoidan FTD-2,0N tách chiết từ rong nâu Turbinaria decurrens là một

galactofucan với hàm lượng sulfate 34,5% (% wt). Cấu trúc của FTD-2,0N được

chứng minh bằng các dữ kiện phổ như sau:

Phổ IR

Vị trí của nhóm sulfate gắn vào fucoidan được xác định bằng phổ IR. Dải

hấp thụ tại 3473 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ tại 1232 cm-1 (S=O) là đặc

trưng cho các sulfate ester. Dải hấp thụ ở 1644 cm−1 xác nhận sự có mặt của các axit

uronic. Dải hấp thụ tại 840 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí

equatorial C-2 và/hoặc C-3 và/hoặc C6 của vòng pyranose kết quả chỉ ra ỏ hình

4.33.

Hình 4.33. Phổ IR của FTD-2,0N

136

Phổ NMR

Vì fucoidan là một polysaccharide có cấu trúc phức tạp, để thu được phổ

NMR và MS có độ phân giải tốt FTD được tiến hành thủy phân nhẹ với điều kiện

đưa ra trong phần phương pháp nghiên cứu. Bộ phổ NMR của sản phẩm thủy phân

từng phần của FTD-2,0N gồm các phổ 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC, NOESY

và TOCSY (Phụ lục) có chất lượng rất tốt, cho phép rút ra nhiều yếu tố cấu trúc tinh

vi.

Hình 4.34. Các đoạn trích từ phổ 1H-NMR của FTD-2,0N

Phổ 1H-NMR của FTD-2,0M (Hình 4.34) có 2 tín hiệu doublet tại vùng thấp

nhất 5,06 và 4,44 ppm là đặc trưng cho các proton anomer H-1α và H-1. Tín hiệu

tại vùng 1,2 - 1,3 ppm là của nhóm CH3 của fucose, các tín hiệu từ 3.2 - 4.5 ppm là

thuộc về các proton từ H-2 đến H-5 của các gốc đường ở dạng vòng pyranoid.

137

Hình 4.35. Các đoạn trích từ phổ 13C-NMR của FTD-2,0N

Phổ 13C-NMR (Hình 4.35) có độ phân giải rất tốt, có 12 nguyên tử carbon

tương ứng với một phân tử fucose và 1 phân tử galactose. 2 tín hiệu ở vùng trường

thấp nhất thuộc về carbon anomer, tín hiệu tại 92,3 ppm ứng với →3)-α-L-

Fucp(1→, tín hiệu tại 96,3 ppm được gán cho -D-Galp. 8 tín hiệu tiếp theo từ 68 -

73 ppm là của các carbon C-2 đến C-5 của các gốc đường ở dạng vòng pyranoid.

Tín hiệu của carbon C-4 cộng hưởng ở khoảng 71 - 72 ppm, giá trị này chứng tỏ

carbon ở vị trí C-4 của cả fucose và galactose không tham gia liên kết glycosid và

không gắn với nhóm thế sulfate, vì nếu có tham gia liên kết hoặc bị sulfate hóa thì

tín hiệu sẽ bị dịch chuyển mạnh về phía trường yếu ở khoảng 80 ppm. Tín hiệu tại

68,3 và 68,9 là của C-5. Tín hiệu tại 73,1 ppm là được gán cho carbon ở vị trí C-2

của fucose, tín hiệu này bị đẩy về phía trường thấp chứng tỏ fucose bị sulfate ở vị trí

C-2 điều này cũng phù hợp với kết quả đưa ra từ phổ IR. Tín hiệu tại 15,7 ppm ứng

với nhóm CH3 của fucose và tại 66.4 ppm được gán cho nhóm CH2OR của -D-

galactose bị sulfate hóa tại O-6.

138

Hình 4.36. Một đoạn trích từ phổ HSQC của FTD-2,0N

Phổ HSQC (Hình 4.36) của FTD-2,0N có các pic đường chéo tại 4,44/96,4

được quy cho H1/C1 của -D-galactose và pic đường chéo tại 5,06/92,3 được quy

cho H1/C1 α-L-fucose.

Hình 4.37. Một đoạn trích từ phổ HMBC của FTD-2,0N

139

Phổ ESI-MS

Để sáng tỏ thêm các thông tin cấu trúc khác, chúng tôi tiến hành đo phổ ESI-

MS của FTD-2,0N với kỹ thuật phổ khối nhiều lần. Phổ ESI-MS cho thấy có pic cơ

bản tại m/z 243 ứng với ion fucose monosulfate [FucSO3]-. Tín hiệu tại m/z 225

đươc gán cho [FucSO3-H2O]−. Tín hiệu tại m/z 389 là của [Fuc2SO3]−. Hai tín hiệu

ở m/z 405 và 507 là của [FucGalSO3]− và [FucGal(SO3)2]−. Để khẳng định vị trí

nhóm thể sulfate trên mạch chính fucose và liên kết giữa mạch nhánh galactose với

mạch chính, 2 tín hiệu tại m/z 243 và 405 của được tiến hành phá mảnh lần 2.

Phổ ESI-MS/MS của ion [FucSO3]- (m/z 243) và kiểu cắt mảnh nó được

trình bày trên Hình 4.38. Berangere Tissot và CS [98] đã nghiên cứu ảnh hưởng của

vị trí nhóm sulfate lên phổ MS của fucose, tín hiệu có cường độ mạch tại m/z 139 là

do nhóm sulfate tại vị trí C-2 của fucose. Không có tín hiệu tại m/z 169 và 1 tín hiệu

có cường độ yếu tại 183 cho thấy không có mặt nhóm sulfate tại vị trí C-3 và chỉ có

một phần rất nhỏ nhóm sulfate ở vị trí C-4.

Hình 4.38. Phổ ESI-MS/MS của ion [FucSO3]- (m/z 243)

140

Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGalSO3]- tại m/z 405 (Hình 4.39.) có các tín

hiệu mạnh nhất là sự cắt mạch glycosid Y1 tại m/z 243 từ phân cắt của monosulfate

fucose và Y’1 tại m/z 259 từ phân cắt của monosulfate galactose (Hình 4.40.). Ion

dạng B1 tại m/z 225 là do sự mất nước của monosulfate fucose và tại m/z 241 từ sự

mất nước của monosulfate galatose, cả 2 tín hiệu này đều có cường độ khá mạnh.

Liên quan đến các nghiên cứu về mối liên kết glycosid, một nghiên cứu trước

0,2A2 yêu cầu hydro tự do ở nhóm hydroxyl C-3 để hỗ trợ việc cắt mạch tại liên kết

đây của các phân mảnh của disaccharid heparin cho thấy cơ chế hình thành các ion

C-2-C-3. Bên cạnh đó ion 0,2A2 tại m/z 345 và 0,2X0 ion có cường độ lớn có thể là

bằng chứng của liên kết (1→4).

Hình 4.39 : Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGalSO3]- (m/z 405)

141

Hình 4.40. Sơ đồ phân mảnh của Fucoidan FTD-2,0N

Các dữ kiện phân tích thành phần hóa học và đặc biệt là các dữ kiện phổ

NMR hai chiều cũng như MS/MS cho phép đưa ra kết luận rằng phân đoạn FTD-

2,0N của fucoidan tách chiết từ rong nâu Turbinaria decurrens là một galactofucan

với hàm lượng sulfate 34,5%(%wt). Cấu trúc của galactofucan này tạo thành từ 2

loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C-2 và -D-galactose bị

sulfate tại vị trí C-6 với tỷ lệ mol L-Fuc trên D-Gal bằng 1:0,65. Galactose nối với

142

fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N được đề

xuất như sau:

[→3-α-L-Fucp2(OSO3

-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3

-)-1→]n

4.5.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của FTD-2,0M

Khả năng ức chế tạo khối u dòng tế bào ung thư gan (HepG2) in vitro của

của fucoidan FTD-2,0N được xác định dựa trên trung bình cộng của kích thước và

mật độ hình thành khối u. Kết quả xác định các thông số trên được thể hiện trong

Bảng 4.16.

Bảng 4.16. Kết quả thử nghiệm tác dụng chống khối u của FTD-2,0N trên tế

bào ung thư gan Hep-G2

Kích thước của khối u Tỷ lệ giảm mật Nồng độ Đường kính độ khối u (% ) Tỷ lệ giảm so mẫu KH mẫu (µm) với đối chứng (100- mđ)± σ (g/ml) ( kt ± σ ) (%)

Đối chứng (-) 0 0 41,35  1,85

100 30,54 FTD-2,0 28,72  1,24 35,25  1,57

Đối chứng (-) FTD-2,0N

Hình 4.41. Hình ảnh hiển vi của các khối u dưới tác dụng của chất thử

Kết quả thử nghiệm nêu trên cho thấy FTD-2,0N có khả năng ức chế sự hình

thành khối u của tế bào ung thư dòng HepG2 ở nồng độ 100 μg/ml, kích thước của

khối u tạo thành giảm 30 - 40% so với đối chứng.

Tóm tắt các kết quả nghiên cứu của nội dung 4.5:

143

Kết luận:

 Fucoidan tổng FTD được phân lập từ với hiệu suất 2,19%. FTD có KLPT trung

bình là 227 kDa, có hàm lượng sulfate là 24,3% và có các thành phần đường đơn

khá đơn giản chỉ gồm chủ yếu là fucose và galactose với tỉ lệ 1:0,5.

 Đã phân lập từ FTD được 03 fucoidan là FTD-0,5N, FTD-1,0N và FTD-2,0N

với các hiệu suất tương ứng là 20, 30, và 46%.

 FTD-2,0N có KLPT trung bình là 227 kDa, có hàm lượng sulfate là 34,5% và có

các thành phần đường đơn giản, chỉ gồm fucose và galactose với tỉ lệ 1:0,65.

 Fucoidan FTD-2,0N có khả năng ức chế sự hình thành khối u của tế bào ung

thư dòng HepG2 ở nồng độ 100 μg/ml.

 Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS cho thấy

FTD-2,0N là một galactofucan tạo thành từ 2 loại đường (1→3)-α-L-Fuc với

nhóm thế sulfate tại vị trí C-2 và -D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C-6.

Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của

FTD-2,0N được đề xuất như sau:

[→3-α-L-Fucp2(OSO3

-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3

-)-1→]n

144

4.6. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của 6 fucoidan phân lập từ rong nâu

Việt Nam, phân tích liên hệ của chúng với hoạt tính gây độc tế bào

4.6.1. Nghiên cứu kích thước và hình dáng của các fucoidan bằng phương pháp

tán xạ tia X góc nhỏ

Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (Small-angle X-ray scattering, gọi tắt là

SAXS) là công cụ mạnh để nghiên cứu hình dáng (shape) và kích thước của các cấu

trúc có độ lớn nằm trong khoảng 1 - 100 nm. Nó thuộc họ các phương pháp tán xạ

góc nhỏ, phân tích cấu trúc dựa trên hiện tượng tán xạ (scattering) của chùm tia X

có cường độ mạnh khi đi qua các cấu trúc có kích thước lớn hơn nhiều so với bước

sóng của nó. Tương tác của tia X với các cấu trúc không đồng nhất của mẫu đo gây

ra một thay đổi rất nhỏ trong hướng đi ban đầu của nó (Hình 4.42). Vì thế hiện

tượng này được gọi là tán xạ góc nhỏ. Hiện tượng tán xạ tia X góc nhỏ xảy ra trên

mọi loại trạng thái của vật chất, dù là tinh thể, chất rắn vô định hình, chất lỏng hay

chất khí. Do đó phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ được áp dụng rộng rãi để nghiên

cứu các hợp kim, vật liệu composit, vật liệu nano và các polymer nhân tạo cũng như

tự nhiên.

Hình 4.42. Vùng tán xạ góc nhỏ so sánh với vùng góc lớn thường được dùng trong

các phương pháp phân tích nhiễu xạ (diffraction analysis).

Xác định cấu trúc bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ cho kết quả chính

xác và có ưu điểm là không cần mẫu đo phải ở dạng tinh thể, lượng mẫu đo nhỏ và

không bị phá hủy. Vì thế, ngày nay phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ đã trở thành

một nhánh độc lập của chuyên ngành sinh học cấu trúc (structural biology), được sử

dụng rộng rãi để xác định kích thước, hình dạng, tương tác liên phân tử và một số

đặc trưng cấu trúc khác của các đại phân tử sinh học.

Sơ đồ nguyên lý của một máy đo tán xạ tia X góc nhỏ được trình bày trên

Hình 4.42. Thực nghiệm tán xạ tia X góc nhỏ thường sử dụng tia X cứng có bước

145

sóng nằm trong khoảng 0,07 - 0,2 nm. Các mẫu đo thường được pha với nồng độ

thấp dung môi nước. Kết quả đo là cường độ của tia tán xạ (ký hiệu là I) đo được

tại một góc tán xạ xác định (ký hiệu là 2). Biểu diễn kết quả đo trên đồ thị Kratky

(Hình 4.44.) và đồ thị Guinier (Hình 4.45) cho phép rút ra các kết luận về hình dạng

và kích thước của các polysaccharide phân bố trong mẫu đo

Hình 4.43. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo tán xạ tia X góc nhỏ

Dưới sự hướng dẫn và hợp tác của GS. Yuguchi thuộc Đại học điện và thông tin

Osaka Nhật Bản, trong nội dung nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành khảo sát

một số mẫu fucoidan chiết xuất từ rong nâu của Việt Nam bằng phương pháp tán xạ

tia X góc nhỏ. Các mẫu nghiên cứu bao gồm fucoidan phân lập từ các loài rong nâu

 Sargassum polycystum (Ký hiệu là Fsp)

 Sargassum mcclurei (Ký hiệu là Fsm)

 Sargassum oligocystum (Ký hiệu là Fso)

 Sargassum denticarpum (Ký hiệu là Fsd)

 Sargassum swatzii (Ký hiệu là Fss)

 Turbinaria ornata (Ký hiệu là Fto)

Hiệu suất thu hồi, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các fucoidan

phân lập từ các loài rong nâu nêu trên được xác định và trình bày trên bảng 4.23.

146

Bảng 4.17. Hiệu suất, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu

fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam.

HS

GlucA

Sulfate

Thành phần đường trung tính

Tên loài (ký hiệu mẫu

MW

(% mol)

fucoidan)

(kDa)

KL)

Fuc Man Gal Xyl Glc

S. polycystum (Fsp)

2,70

32,4

2,7

36,3 11,1 10,2

6,8

25,7

S. mcclurei (Fsm)

2,10

40,0

2,1

33,1 6,2

20,6

5,2

26,5

S. oligocystum (Fso)

1,60

37,6

1,6

37,0 10,7 7,1

6,5

24,9

S. denticarpum (Fsd)

2,20

42,1

2,2

38,9 15,9 2,0

5,8

25,2

S. swatzii (Fss)

0,68

37,0 0,68 34,8 15,5 6,5

7,4

23,4

T. ornata (Fto)

2,75

30,3

vết

9,0

vết

7,8

25,6

Thực nghiệm tán xạ tia X góc nhỏ được thực hiện với nguồn bức xạ gia tốc

đồng bộ tại trạm BL10C, trung tâm synchrotron Photon Factory, Tsukuba, Nhật

Bản. Tia X được lọc đơn sắc ở bước sóng  = 0,149 nm. Các mẫu fucoidan được đo

với nồng độ 1% trong nước và trong NaCl 0,5M trong nước. Mẫu đo được bơm vào

cuvet thạch anh phẳng dày 0,2 cm. Tia tán xạ được phát hiện và cường độ tán xạ I

tại mỗi góc tán xạ 2 được đo bởi một phiến hiện ảnh IP (imaging plate) đặt cách

buồng mẫu 1 m. Tín hiệu đo được tích lũy trong tổng số 600 giây đủ dài để đảm bảo

độ đúng về xác suất thống kê và cũng không kéo dài để mẫu không bị ảnh hưởng

bởi tia X trong quá trình đo.

Kết quả đo biểu diễn dưới dạng đường cong tán xạ trên đồ thị Kratky (Hình

4.44) thể hiện sự biến thiên của cường độ tán xạ theo góc tán xạ. Trên các đồ thị ở

Hình 4.44., trục hoành là q = (4)sin( (với  là bước sóng của tia X và 2 là góc

tán xạ) đại diện cho sự độ lớn của góc tán xạ, trục tung là ln(q2I(q)) (với I(q) là

cường độ tán xạ tại q) đại diện cho sự biến thiên của cường độ tán xạ.

Sự xuất hiện một ở vùng góc nhỏ q = 0.7 – 0.8 nm-1 trên tất cả các đồ thị ở

Hình 4.44., trừ đồ thị của Fsw, cho thấy có sự tương tác tĩnh điện giữa các phân tử

polys trong dung dịch là một đặc trưng cho polyelectrolyte có nhóm mang điện

Cường độ của cực đại này giảm trong môi trường NaCl 0,5M điều này có nghĩa là

các nhóm mang điện bị che phủ (screening) dẫn đến tương tác tĩnh điện giảm và

cường độ cực đại giảm Fucoidan là một sulfated polysaccharide với hàm lượng

sulfate cao, do vậy sự xuất hiện của peak này là một minh chứng về cấu trúc mang

147

diện của phân tử fucoidan Trong khi hình dáng của đường cong tán xạ của Fsw khá

phẳng, không có một cực đại rõ rệt, đồ thị của Fto lại có một peak nhọn và rất

mạnh, điều này cho thấy Fto có hàm lượng sulfate cao nhất còn Fsw có hàm lượng

sulfate thấp nhất, ngoài ra cũng có thể gợi ý rằng có KLPT thấp, hay có cấu trúc với

các mạch nhánh. Dấu hiệu cho thấy các fucoidan này, hoặc có cấu trúc phân nhánh,

hoặc tập hợp với nhau thành các hạt lớn. Tuy nhiên, nguyên nhân sau bị loại trừ bởi

hàm lượng sulfate cao của các chuỗi fucoidan ngăn cản chúng tập hợp với nhau.

Hình 4.44. Đồ thị Kratky cho các kết quả đo SAXS của 6 mẫu fucoidan trong nước

và trong dung dịch NaCl 0,5M.

148

Đặt tất cả các đường cong tán xạ của các mẫu vào cùng một đồ thị (Hình

4.45) để so sánh ta thấy: Trong khi đường cong tán xạ của mẫu Fto có một peak

nhọn và rất mạnh, đồ thị của mẫu Fsw lại khá phẳng, không có một cực đại rõ rệt,

gợi ý rằng polysaccharide này, hoặc là có KLPT trung bình thấp, hoặc là có cấu trúc

là một chuỗi mạch phân nhánh ngắn, hoặc là có cả hai yếu tố cấu trúc này. Các mẫu

còn lại có tính chất nằm giữa tính chất của hai mẫu trên.

Hình 4.45. Đồ thị Kratky cho tất cả các kết quả đo tán xạ tia X góc nhỏ của 6 mẫu

fucoidan trong nước.

Áp dụng công thức gần đúng của Guinier cho các phân tử có hình dáng kiểu

2/2), trong đó Rgc là bán kính hồi chuyển (radius of

que (rod-like), qI(q) ~ exp(-q2Rgc

gyration) của mặt cắt ngang cấu trúc hình que của phân tử, đồ thị Guinier của mặt

cắt ngang (cross-sectional Guinier plot) được xây dựng cho các mẫu đo và biểu diễn

trên Hình 4.46. với trục tung là ln(qI(q)) và trục hoành là q2.

Từ độ dốc (slope) của phần tuyến tính của đồ thị Guinier ta tính ra được giá

trị của bán kính hồi chuyển Rgc của mặt cắt ngang phân tử cho mỗi mẫu đo. Các kết

quả thu được được trình bày trên Bảng 4.18. cùng với hàm lượng sulfate và KLPT

trung bình của các mẫu.

149

Hình 4.46. Đồ thị Guinier của mặt cắt ngang cho các kết quả đo tán xạ tia X góc

nhỏ của 6 mẫu fucoidan trong dung dịch NaCl 0,5M trong nước.

Bảng 4.18. Bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc ước lượng từ đồ thị Guinier

của các mẫu fucoidan đo trong NaCl 0,5M..

Mẫu Fucoidan Fsp Fsm Fso Fsd Fsw Fto

Sulfate (%) 25,7 26,5 24,9 25,2 23,4 25,6

KLPT (kDa) 52 26 38 41 41 88

Rgc (nm) 1,51 1,22 1,31 1,47 0,78 1,3

Các kết quả ước lượng cho thấy Rgc của các mẫu nằm trong khoảng 0,78 đến

1,51 nm, gợi ý cho một cấu trúc phân nhánh với các mạch nhánh có độ dài khác

nhau đối với mỗi mẫu. Thêm vào đó, các đồ thị trên Hình 4.46. có đoạn tăng lên đột

ngột (up-turn behavior) khi tiến về phía góc tán xạ nhỏ cũng chứng minh cho cấu

trúc phân nhánh hoặc gợi ý cho sự có mặt của các thành phần có kích thước lớn

hơn, hoặc gợi ý cho cả hai nguyên nhân này.

Trong một công bố độc lập với luận án này [92], các tác giả Thành Thị Thu

Thủy, Yuguchi và cs. đã tiến hành các nghiên cứu sâu về cấu trúc của mẫu Fto bằng

150

các phương pháp ESI-MS/MS và SAXS. Các kết quả nghiên cứu bằng các phương

pháp hóa học kết hợp với phương pháp phổ ESI-MS/MS cho thấy Fto có mạch

chính là các gốc 3)-fucose-(1 liên kết nối tiếp nhau, mạch nhánh là các gốc

4)-galactose-(1 và 4)-fucose-(1 liên kết với mạch chính ở vị trí O-4 của

fucose (Hình 4.47). Các nhóm sulfate gắn chủ yếu ở vị trí số 2 và một phần ở vị trí

số 4 của cả fucose và galactose.

Hình 4.47: Cấu trúc dựa trên các dữ kiện hóa học và phổ được đề xuất cho Fto bởi

Thành Thị Thu Thủy và Yuguchi [92].

Trong cấu trúc được đề xuất dựa trên các dữ kiện hóa học và phổ nêu trên,

các câu hỏi về độ dài và cách sắp xếp của các mạch nhánh còn chưa được làm rõ.

Để giải quyết vấn đề này và xây dựng nên một "cấu trúc trung bình" cho Fto, các

tác giả đã thiết kế 4 mô hình phân tử với các cấu trúc mạch nhánh khác nhau (Hình

4.48).

Hình 4.48. Mô hình cấu trúc cho các mạch nhánh của Fto [92].

Để xác định mô hình phù hợp nhất, các đường cong tán xạ lý thuyết được

tính cho mỗi mô hình và so sánh với đường cong thực tế. Kết quả cho thấy đường

151

cong tán xạ lý thuyết của mô hình (d) là phù hợp nhất với thực nghiệm (Hình 4.48).

Điều đó cho phép rút ra kết luận là Fto có cấu trúc cồng kềnh với các mạch nhánh

cấu tạo từ galactose và fucose khá dài nằm kề bên nhau.

Hình 4.49. Đồ thị Kratky của Fto so sánh với các đồ thị lý thuyết ước lượng được từ

4 mô hình cấu trúc trên Hình 4.48 [92].

Các kết quả nêu trên cho phép kết luận rằng phần lớn các mẫu fucoidan được

chúng tôi nghiên cứu có hình dáng kiểu que và có cấu trúc phân nhánh cồng kềnh.

Các mẫu có thể có các mạch nhánh có tới 5 gốc đường đơn nằm kề bên các mạch

nhánh khác.

4.6.2. Liên hệ giữa các đặc điểm cấu trúc của các mẫu fucoidan với hoạt tính gây

đốc tế bào.

Các fucoidan được thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu vì có nhiều

hoạt tính sinh học đầy hứa hẹn. Các hoạt tính được nghiên cứu nhiều nhất là hoạt

tính chống đông máu, chống huyết khối, chống khối u, chống virus và giảm mỡ

máu. Vấn đề đặt ra là dựa vào đâu để chọn được các cấu trúc fucoidan có hoạt tính

vượt trội. Đây là bài toán về quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của các fucoidan mà

các nhà khoa học rất quan tâm và bỏ ra nhiều công phu nhưng đến nay chưa có một

đáp án thật thuyết phục [93].

152

Trong nội dung nghiên cứu về các fucoidan của rong nâu S. aquifolium (Nội

dung 4.4.) chúng tôi đã có nhận xét rằng hàm lượng sulfate cao có liên hệ với hoạt

tính gây độc tế bào và hoạt tính chống khối u cao. Tuy nhiên, trong một công bố

độc lập với luận án này [93] Thành Thị Thu Thủy và cs. nghiên cứu các fucoidan có

hoạt tính chống HIV cao là Fsm, Fsp và Fto (có các giá trị IC50 tương ứng là 0,7;

0,33; và 0,40 µg/mL) và 10 phân đọan fucoidan tinh sạch từ các mẫu đó lại không

tìm thấy có sự liên hệ giữa hoạt tính với hàm lượng cũng như với vị trí của các

nhóm sulfate. Điều đó gợi ý rằng ở đây có sự tham gia của các thông số cấu trúc

khác của fucoidan.

Để góp phần tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm hoạt

tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan Fsp, Fsm, Fso, Fsd, Fsw và Fto trên các

dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. Các thử nghiệm được

thực hiện theo phương pháp hiện hành của Viện nghiên cứu ung thư quốc gia USA.

Các kết quả thử nghiệm được trình bày trên Bảng 4.19. cho thấy các mẫu nghiên

cứu đều thể hiện hoạt tính. Ta cũng thấy rằng, các mẫu khác nhau có hoạt độ khác

nhau, và cùng một mẫu có thể có hoạt độ khác nhau trên các dòng tế bào khác nhau.

Bảng 4.19. Hoạt tính độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư

gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD.

Hep-G2 RD

Mẫu Fucoidan

CS% IC50 (µg/ml) CS% IC50 (µg/ml)

29.7 5.5 11.8 5.7

S. polycystum (Fsp)

S. mcclurei (Fsm)

39.3 14.2 64.8 > 20

35.3 15.8 11.2 11.4

S. oligocystum (Fso)

S. denticarpum (Fsd)

37.5 7.3 27.9 15.9

31.1 5.8 16.5 18.7

S. swatzii (Fss)

T. ornata (Fto)

21.8 3.1 4.5 1.6

Các kết quả thử nghiệm hoạt tính nêu trên cho phép đưa ra một số nhận xét

về mối tương quan giữa hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu nghiên cứu với một số

153

đặc điểm cấu tạo và cấu trúc của chúng. Trước hết, Bảng 4.20. trình bày mối liên hệ

giữa hoạt tính với KLPT trung bình của các mẫu fucoidan. Các kết quả cho thấy có

sự tương quan rõ rệt giữa khối lượng phân tử trung bình với hoạt tính gây độc tế

bào. Mẫu Fto và Fsp có khối lượng phân tử trung bình cao nhất (88 và 52 kDa) có

hoạt tính cao nhất trên cả hai dòng tế bào. Mẫu Fsm có khối lượng phân tử trung

bình thấp nhất (26 kDa) có hoạt tính thấp nhất trên cả hai dòng tế bào.

Bảng 4.20. Liên hệ giữa hoạt tính với KLPT trung bình của các mẫu fucoidan

Mẫu Fucoidan

Fsp

Fsm

Fsd

Fsw

Fso

Fto

KLPT (kDa)

29,7

39,3

35,3

37,5

31,1

21,8

CS% (Hep-2)

11,8

64,8

11,2

27,9

16,5

4,5

CS% (RD)

5,5

14,2

15,8

7,3

5,8

3,1

IC50 (Hep-2) (µg/mL)

5.7

> 20

11.4

15.9

18.7

1.6

IC50 (RD) (µg/mL)

Bảng 4.21. dưới đây trình bày mối liên hệ giữa hoạt tính với hàm lượng

sulfate và tỉ lệ sulfate/đường của các mẫu fucoidan. Các dữ kiện trên bảng không

cho thấy có tương quan trực tiếp giữa hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan,

nhưng lại cho thấy một tương quan khá rõ giữa tỉ lệ sulfate/đường với hoạt tính gây

độc tế bào. Các mẫu Fto và Fsp có tỉ lệ sulfate/đường cao nhất (54,4% và 25,8%)

cũng thể hiện hoạt tính cao nhất, trong khi các mẫu Fsd và Fsm có tỉ lệ

sulfate/đường vào loại thấp (23,6% và 24,7%) cũng thể hiện hoạt tính thấp nhất.

Bảng 4.21. Liên hệ giữa hoạt tính với hàm lượng sulfate và tỉ lệ sulfate/đường của

các mẫu fucoidan.

Mẫu Fucoidan

Fsp

Fsm

Fso

Fsd

Fsw

Fto

25,7

26,5

24,9

25,2

23,4

25,6

Sulfate (% khối lượng)

25,8

24,7

24,8

23,6

23,0

54,4

Tỉ lệ SO3/đường

29,7

39,3

35,3

37,5

31,1

21,8

CS% (Hep-2)

11,8

64,8

11,2

27,9

16,5

4,5

CS% (RD)

5,5

14,2

15,8

7,3

5,8

3,1

IC50 (Hep-2) (µg/mL)

5.7

> 20

11.4

15.9

18.7

1.6

IC50 (RD) (µg/mL)

Bảng 4.22. dưới đây trình bày mối liên hệ giữa hoạt tính với bán kính hồi

chuyển Rgc của các mẫu fucoidan. Mẫu Fsm có Rgc nhỏ nhất (1,22 nm) thể hiện

154

hoạt tính thấp nhất. Mẫu Fsp có Rgc lớn nhất (1,51 nm) thể hiện hoạt tính vào loại

cao nhất trong số các mẫu. Tuy nhiên, Fto có hoạt tính cao nhất lại chỉ có Rgc bằng

1,30 nm. Fso có Rgc gần bằng như vậy (1,31 nm) lại chỉ có hoạt tính vào loại trung

bình. Fsd có Rgc lớn thứ nhì lại có hoạt tính thuộc loại thấp.

Dựa trên các dữ kiện trên chúng tôi đề xuất rằng một cấu trúc phân nhánh

với nhiều nhóm thế sulfate là cần thiết để các fucoidan có hoạt tính đáng kể. Tuy

nhiên chúng tôi không nhận thấy có mối tương quan rõ rệt giữa độ dài của mạch

nhánh và hoạt tính gây độc tế bào.

Bảng 4.22. Liên hệ giữa hoạt tính với bán kính hồi chuyển Rgc của các mẫu

fucoidan.

Mẫu Fucoidan

Fsp

Fsm

Fso

Fsd

Fsw

Fto

1,51

1,22

1,31

1,47

0,78

1,3

Rgc (nm)

29,7

39,3

35,3

37,5

31,1

21,8

CS% (Hep-2)

11,8

64,8

11,2

27,9

16,5

4,5

CS% (RD)

5,5

14,2

15,8

7,3

5,8

3,1

IC50 (Hep-2) (µg/mL)

5.7

> 20

11.4

15.9

18.7

1.6

IC50 (RD) (µg/mL)

Tóm tắt các nội dung và kết quả nghiên cứu của phần 4.6.:

 Đã chiết xuất, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lượng phân tử

trung bình của các fucoidan từ 06 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum

(Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii

(Fss), và T. ornata (Fto).

 Hình dáng và kích thước của các mẫu fucoidan được nghiên cứu bằng phương

pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X

góc nhỏ cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các

mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính toán cho

các mô hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có

độ dài tới 5 gốc đường.

 Kết quả phân tích đồ thị Guinier cho phép ước lượng bán kính hồi chuyển của

mặt cắt ngang phân tử cho mỗi mẫu fucoidan. Rgc nằm trong khoảng 0,78 - 1,51

nm đại diện cho mức độ cồng kềnh của các mạch nhánh.

155

 Đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên hai dòng tế

bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu

đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-

G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7

µg/mL).

 Khảo sát mối liên hệ giữa hoạt tính gây độc tế bào với một số đặc điểm cấu tạo

và cấu trúc của các mẫu fucoidan sơ bộ cho thấy: a) khối lượng phân tử trung

bình có tương quan rõ rệt nhất với hoạt tính gây độc tế bào. Các mẫu có khối

lượng phân tử trung bình cao nhất cũng có hoạt tính cao nhất. Các mẫu có khối

lượng phân tử trung bình thấp nhất cũng có hoạt tính thấp nhất; b) Mức độ

sulfate hóa của các đường cũng thể hiện ở một mức độ nhất định tương quan với

hoạt tính gây độc tế bào. Tỉ lệ sulfate/đường cao gắn liền với hoạt tính cao và

ngược lại; c) Không thấy có biểu hiện tương quan rõ rệt giữa mức độ cồng kềnh

(độ dài) của các mạch nhánh (thể hiện qua bán kính hồi chuyển của mặt cắt

ngang Rgc) với hoạt tính gây độc tế bào. Các dữ kiện trên gợi ý rằng khối lượng

phân tử cao và cấu trúc phân nhánh với tỉ lệ sulfate/đường cao là các yếu tố cần

thiết cho hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan.

Thảo luận:

 Việc kết hợp phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ với các phương pháp phân tích

hóa học và các phương pháp phổ hiện đại là một công cụ đầy hứa hẹn để giải

quyết các khó khăn trong việc xác định các cấu trúc phức tạp của fucoidan.

 Ảnh hưởng của các đặc điểm cấu trúc của các fucoidan đến các hoạt tính khác

nhau là khác nhau, thậm chí có thể ngược lại với nhau.

 Việc thiết lập mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính của các fucoidan cần có

một kế hoạch nghiên cứu tốt hơn và đặc biệt cần phải áp dụng phương pháp

phân tích tương quan trên một số lượng dữ kiện lớn hơn và có độ tin cậy cao

hơn.

 Trong các nghiên cứu về quan hệ cấu trúc với hoạt tính của các fucoidan trong

tương lai, chúng ta nên chú trọng tới hoạt tính chống khối u, chống đông máu và

chống huyết khối hơn là hoạt tính gây độc tế bào.

156

KẾT LUẬN

Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong

nâu Việt Nam, chúng tôi đã thu được kết quả như sau:

1. Đã khảo sát hàm lượng và thành phần hóa học của fucoidan từ 11 loài rong nâu

thuộc hai chi Sargassum và Turbinaria sinh trưởng ở vùng biển Nha Trang. Kết

quả này cho thấy cái nhìn tổng thể hơn về thành phần hóa học và đặc điểm

cấu trúc của fucoidan. Dựa trên các kết quả này, các fucoidan phân lập từ

Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens đã được lựa chọn để nghiên cứu

sâu về cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học.

2. Đã nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ hai loài rong Sargassum

duplicatum và Sargassum binderi. Kết quả cho thấy các fucoidan từ hai loài

rong này là các galactofucan sulfatee. Kết quả này một lần nữa góp phần

khẳng định đại đa số các fucoidan tách từ các loài rong nâu sinh trưởng ở vùng

nhiệt đới hay gặp dạng galactofucan sulfate.

3. Từ rong nâu Sargassum aquifolium đã phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính

sinh học của các fucoidan FSA-0.5M, FSA-1.0M, deS-1, deS-2, deS-3, deS-4,

deS-5, deS-6, FSA-1.5M và FSA-2.0M.

- Cấu trúc của fucoidan lần đầu tiên trên thế giới và Việt Nam đã được nghiên

cứu là xylo(fuco)galactan (deS-2), fuco(xylo)glucuronomannan (deS-4) và

xylo(fuco)glucuronan (deS-6). Đặc biệt cấu trúc của mạch chính của các

phân đoạn của fucoidan có manose (deS-4), uronic acid (de-S6) và mạch

nhánh có xylose (de-S2). Đây là một điểm mới trong cấu trúc của fucoidan

tách chiết từ các loài rong nâu ở biển Nha Trang, các nghiên cứu trên các đối

tượng rong khác cho thấy đa số fucoidan là galactofucan.

- Kết quả về hoạt tính sinh học: Các phân đoạn FSA-0.5M, FSA-1.0M,

FSA-1.5M, FSA-2.0M chiếm hữu hoạt tính chống đông tụ máu, gây độc tế

bào và ngăn ngừa phát triển của khối u. Đặc biệt là hoạt tính chống đông tụ

máu, lần đầu tiên fucoidan tách chiết từ rong nâu Việt Nam được khảo

sát hoạt tính này.

4. Fucoidan FTD2.0N đã được phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens là một

galactofucan sulfate tạo thành từ 2 loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế

157

sulfate tại vị trí C-2 và α-D-galactose bị sulfate tại vị trí C-6 với tỷ lệ mol L-Fuc

: D-Gal = 1: 0,65. Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4.

Fucoidan FTD2.0N từ rong nâu này cũng có khả năng ức chế sự hình thành khối

u của tế bào dòng Hep-G2. Galactofucan sulfate (FTD2.0N) là fucoidan lần

đầu tiên phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens.

5. Bằng phương pháp phổ SAXS đã xác định được mối quan hệ giữ cấu trúc

nhánh và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan được phân lập từ 6

loài rong nâu Việt Nam. Kết quả chỉ ra rằng cấu tạo nhánh của fucoidan cùng

nhiều nhóm sulfate, cho thấy fucoidan có hoạt tính sinh học mạnh hơn những

fucoidan khác. Đã nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số cấu trúc (hàm lượng

sulfate, trọng lượng phân tử trung bình và mạch nhánh) đến hoạt tính sinh học

của fucoidan. Đây là một điểm mới so với các nghiên cứu cùng lĩnh vực ở

trong nước.

Các kết quả nêu trên cho phép đưa ra các nhận xét sau:

1. Khác với các fucoidan có xuất xứ ở biển ôn đới, phần lớn các fucoidan phân

lập từ rong nâu của Việt Nam có cấu tạo và cấu trúc rất phức tạp. Tuy nhiên,

bằng sự kết hợp khéo léo giữa các phương pháp nghiên cứu kinh điển với các

phương pháp công cụ hiện đại, đặc biệt là các phương pháp CHTHN hai

chiều, các phương pháp phổ khối lượng nhiều lần MS/MS và phương pháp

tán xạ tia X góc nhỏ, khoa học hiện nay cho phép ngày càng làm rõ hơn các

yếu tố cấu trúc tinh vi của chúng.

2. Các kết quả nghiên cứu của luận án này cũng như của nhiều công trình khoa

học công bố gần đây ở Việt Nam cho thấy, các loài rong nâu của Việt Nam

không chỉ là là một nguồn tài nguyên biển có giá trị sử dụng cao mà còn là

một kho tàng các hợp chất thiên nhiên có các kiểu cấu trúc mới, phức tạp và

đa dạng, rất đáng để tiếp tục đi sâu nghiên cứu.

158

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Lần đầu tiên các thành phần fucoidan có trong 2 loài rong nâu Sargassum

aquifolium và Turbinaria decurrens của Việt Nam được chiết xuất, phân lập và

xác định cấu trúc bằng các phương pháp hiện đại của hóa học carbohydrat. Các

phương pháp tách fucoidan thành các phân đoạn trên cột trao đổi anion, phương

pháp tách loại sulfat, và phương pháp phân tích methyl hóa cho phép thu được

các phân đoạn đồng nhất hơn, đơn giản hơn, phù hợp với việc xác định cấu trúc

tinh vi bằng các phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối phân giải

cao.

2. Từ tổng fucoidan FSA của rong nâu S. aquifolium đã phân lập và xác định được

cấu trúc của 6 phân đoạn có 3 dạng cấu trúc cơ bản gồm xylo(fuco)galactan

(deS-2), fuco(xylo)glucuronomannan (deS-4) và xylo(fuco)glucuronan (deS-6)

với cấu trúc mạch khác với cấu trúc galactofucan thường gặp trong các loài rong

nâu khác ở biển Nha Trang.

3. Từ tổng fucoidan FTD của rong nâu T. decurrens đã phân lập được galactofucan

sulfate FTD2.0N với cấu trúc cơ bản như sau:

-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3

-)-1→]n

[→3-α-L-Fucp2(OSO3

4. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ lần đầu tiên được áp dụng để nghiên cứu cấu

dạng của các fucoidan tách chiết từ 5 loài rong nâu Việt Nam. Kết quả phân tích

đồ thị Guinier cho phép ước lượng bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang phân

tử Rgc nằm trong khoảng 0,78 - 1,51 nm. Kết quả phân tích đồ thị Kratky cho

thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que, mạch ngắn, phân nhánh.

5. Các kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy các phân đoạn fucoidan

FSA-2,0M và FTD2,0N có hàm lượng sulfat cao nhất phân lập được từ rong nâu

S. aquifolium và T. decurrens có hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế

khối u. Phân đoạn FSA-2,0M có hoạt tính chống đông máu khá cao khi so sánh

với chất chuẩn heparin.

6. Kết quả khảo sát sơ bộ mối liên hệ giữa hoạt tính gây độc tế bào với một số đặc

điểm cấu tạo và cấu trúc của 5 mẫu fucoidan gợi ý rằng khối lượng phân tử cao,

cấu trúc phân nhánh và tỉ lệ sulfat / đường cao là các yếu tố cần thiết cho hoạt

tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan.

159

KIẾN NGHỊ

Trên cơ sở các kết quả thu được từ luận án, chúng tôi có một số kiến nghị

như sau:

1. Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của sulfated

polysaccharide (fucoidan) từ các loài rong nâu khác của Việt Nam nhằm tìm kiếm

các hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử

dụng hiệu quả nguồn tài nguyên biển Việt Nam.

2. Tiếp tục nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính để làm rõ hơn sự ảnh

hưởng của cấu trúc polysaccharide và các dẫn xuất đến hoạt tính sinh học, làm cơ

sở để tạo ra các dẫn xuất có hoạt tính cao hơn mẫu tự nhiên.

160

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Maria I. Bilan, Nadezhda E. Ustyuzhanina, Alexander S. Shashkov,

Thanh Thi Thu Thuy, Bui Minh Ly, Tran Thi Thanh Van, Bui Van

Nguyen, Anatolii I. Usov , Sulfated polysaccharides of the Vietnamese

brown

alga

Sargassum

aquifolium

(Fucales,

Sargassaceae),

Carbohydrate Research, Volume

449 (2017)

PP

23-31,

https://doi.org/10.1016/j.carres.2017.06.016 (SCI)

2. Yoshiaki Yuguchi, Bui Minh Ly, Bui Van Nguyen, Tran Thi Thanh Van

and Thanh Thi Thu Thuy, Study on branched structure-physiological

activity relationship of fucoidan, Chemistry letter, Vol.45. No.7. 2016

p.840-842. doi:10.1246/cl.160189 (SCI)

3. Bui Van Nguyen, Tran Thi Thanh Van, Bui Minh Ly, Nguyen Quyet

Chien, Thanh Thi Thu Thuy, Maria. I. Milan, Anatolii. I. Usov,

Structural characteristics and anticoagulant activity of

sulfate

polysaccharide from the brown alga sargassum aquifolium , Journal of

Science and Technology 54 ( 2C) (2016) 360-365.

4. Bùi Văn Nguyên, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Minh Lý, Nguyễn Quyết

Chiến, Thành Thị Thu Thủy, Study on structure and cytotoxic activity of

fucoidan extracted from brown seaweed Sargassum aquifolium, Vietnam

journal of chemistry 54(6e2)(2016)215-218.

5. Bùi Văn Nguyên, Bùi Minh Lý, Võ Mai Như Hiếu, Đặng Vũ Lương,

Trần Thị Thanh Vân và Thành Thị Thu Thủy, Xác định cấu trúc của

fucoidan tách chiết từ rong nâu Turbinaria decurents bằng các phương

pháp phổ IR, NMR và ESIMS, Tạp chí Khoa học và công nghệ T.52 (5B),

2014 (637-642).

6. Bui Van Nguyen, Cao Thi Thuy Hang, Tran Thi Thanh Van, Nguyen

Thi Hai Au, Dang Xuan Cuong, Natalia M. Shevchenko, Svetlana P.

Ermakova, T.N. Zvyagintseva and Pham Duc Thinh, The content and

chemical composition of water-soluble polysaccharides isolated from

161

some sargassum seaweed species in viet nam, Journal of Science and

Technology 54 (2B ) (2016), pp 84-90

162

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phạm Hoàng Hộ, Rong biển Việt Nam - Phần III. Phaeophyceae, NXB Trung

tâm học liệu Sài Gòn, 1969, Sài Gòn.

2. Nguyễn Hữu Đại, Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam: Nguồn lợi và sử dụng,

NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 1997, 198 trang.

3. Nguyễn Hữu Dinh và Huỳnh Quang Năng, Năm loài mới thuộc chi rong Mơ -

Sargassum ở ven biển Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 2001, 23 (1), 1-10.

4. Nguyễn Hữu Đĩnh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến.

Rong biển miền Bắc Việt Nam, Nhà XB KHKT, 1993, Hà Nội.

5. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh, Tiềm năng rong biển Việt Nam, NXBKHKT,

2004, Hà Nội.

6. Li Bo, Fei Lu, Xinjun Wei and Ruixiang Zhao, Fucoidan: Structure and

Bioactivity, Molecules, 2008, 13, 1671-1695.

7. Usov. A. I, Bilan. M. I, Fucoidans-sulfated polysaccharides of brown algae,

Russian Chemical Reviews, 2009, 78 (8), 785-799.

8. M.I.Bilan, E.V.Vinogradova, E.A.Tsvetkova, A.A.Grachev, A.S.Shashkov, N.E,

A.I.Usov, A sulfated glucuronofucan containing both fucofuranose and

fucopyranose residues from the brown alga Chordaria flagelliformis.

Carbohydrate Research, 2008, 343 (15), 2605-2612.

9. Li, B.; Xu, S.Y, Structural investigation of oligosaccharides in partial acid

hydrolyzed products of fucoidan isolated from Hizikia fusiforme, Nat. Prod. Res.

Dev, 2007, 19, 550-553.

10. Bilan. M.I., Grachev. A.A., Shashkov. A.S, Thuy. T.T.T, Van. T.T.T, Ly. B.M,

Nifantiev. N.E, Usov. A.I, Preliminary investigation of a highly sulfateed

galactofucan fraction isolated from the brown alga Sargassum polycystum,

Carbohydrate Research, 2013, 377, 48-57.

11. Chevolot, L.; Mulloy, B.; Racqueline, J, A disaccharide repeat unit is the

structure structure in fucoidans from two species of brown algae, Carbohydr.

Res, 2001, 330, 529-535.

12. Chizhov, A.O.; Dell, A; Morris, H.R, A study of fucoidan from the brown

seaweed Chorda filum, Carbohydr. Res. 1999, 320, 108-119.

163

13. Li, B.; Xu, S.Y, Structural investigation of oligosaccharides in partial acid

hydrolyzed products of fucoidan isolated from Hizikia fusiforme, Nat. Prod. Res.

Dev, 2007, 19, 550-553.

14. Mulloy B., Moura˜o P.A.S., Gray E, Structure: function studies of anticoagulant

sulphated polysaccharides using NMR, Journal of Biotechnology, 2000, 77, 123-

135.

15. Huynh QN, Nguyen HD, The seaweed resources of Vietnam. In Critchley AT,

Ohno M, Seaweed Resources of the World. Japan International Cooperation

Agency, Yokosuka, 1998, 62-69.

16. Ngô Quốc Bưu, Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Bùi Minh Lý và cs,

Báo cáo nghiệm thu đề tài Điều tra cơ bản: “Hiện trạng và nguồn lợi rong biển

kinh tế ven biển phía Nam Việt Nam”, Nghiệm thu tại Hội đồng cấp Trung tâm

KHTN và CNQG Hà Nội, 1999, 1-41.

17. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Nguyễn Mạnh Cường,

Trần Văn Sung, Nghiên cứu fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tách từ rong

nâu Sargasum swartzii bằng phương pháp phổ khối nhiều lần, Tạp chí Hóa học,

2009, T. 47 (3), Tr. 300 - 307.

18. Nguyễn Duy Nhứt, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

polysacarit từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa, Luận án tiến sỹ Hóa học,

Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2008, Hà Nội.

19. Hồ Đức Cường, Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của

fucoidan và aginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianun và

Sargassum swartzii của Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội, 2014.

20. Phạm Đức Thịnh, Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của

fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở Vịnh Nha Trang, Luận

án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, 2015, Hà Nội.

21. Bùi Minh Lý, Lê Như Hậu, Đánh giá hiện trạng và Nghiên cứu giải pháp bảo vệ

nguồn lợi rong Mơ (Sargassum) tại Khánh Hòa, Đề tài cấp tỉnh Khánh Hòa,

2010, Khánh Hòa.

164

22. Zvyagintseva Tatiana. N, Nataliya M. Shevchenko, Alexander O. Chizhov,

Tatiana N. Krupnova, Elena V. Sundukova, Vladimir V. Isakov, Water-soluble

polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure,

and their dependence on the developmental conditions, J. Exp. Mar. Biol. Ecol.

2003, 294, 1-13.

23. Kylin, H, Zur biochemie der Meersalgen, Z. Physiol. Chem, 1913, 83, 171 -197.

24. Ejaz Hussain, Li-Jun Wang, Bo Jiang, Saba Riaz, Ghazala Yasmeen Buttd and

Da-Yong Shia, Components of brown seaweeds are potential candidate for

cancer therapy - a review, RSC Advances, 2015, 00, 1-22.

25. Marcel Tutor Ale, Jørn D. Mikkelsen and Anne S. Meyer, Important

Determinants for Fucoidan Bioactivity: A Critical Review of Structure-Function

Relations and Extraction Methods for Fucose-Containing Sulfateed

Polysaccharides from Brown Seaweeds, Mar. Drugs, 2011, 9, 2106-2130.

26. Park, Y.H., Jang D.S. and Kim S.B, Utilization of marine products (2nd

edition); Chapter 4, Seaweed composition, Hyoungsul press, 1997, a, 283-336.

27. Koo Jae-Geun , Structural Characterization of Purified Fucoidan from

Laminaria religiosa, Sporophylls of Undaria pinnatifida, Hizikia fusiforme and

Sagassum fulvellum in Korea, Korean Journal of Fisheries and Aquatic

Sciences, Volume 30, Issue 1, 1997, 128-131.

28. Percival, E. and McDowell, R.H, Chemistry and enzymology of marine algal

polysaccharides, Academic Press, London and NEW YORK, 1967, 6-28 & 73-

96 &157-174.

29. Percival, E.G.V. and Ross, A.G, Fucoidin Part I: The isolation and purification

of fucoidin from brown seaweeds. Journal of the Chemical Society, 1950, 717-

720.

30. Dillon T., Kristensen, K. and O'hEcoha, C, The seed mucilage of Ascophyllum

nodosum, Proceedings of the Royal Irish Academy, Section B: Biological,

Geological, and Chemical Science, 1953, 55, 189-194.

31. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Ustuzhanina, N.E.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.;

Usov, A.I, A Highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed

Fucus distichus L, Carbohydr. Res, 2004, 339, 511-517.

165

32. Patankar Manish s., Sergio Oehninger, Townsend Barnett, Roy L. Williams and

gary f. Clark, a revised structure for fucoidan may explain some of its biological

activities, The journal of biological chemistry, 1993, 268, (29), 21770-21776.

33. Rioux, L.E., Turgeon, S.L. and Beaulieu, M, Characterization of

polysaccharides extracted from brown seaweeds, Carbohydrate Polymers, 2007a,

69, 530–537.

34. Lee, J.B.; Hayashi, K.; Hashimoto, M.; Nakano, T.; Hayashi, T, Novel antiviral

fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu), Chem. Pharm. Bull.

2004, 52, 1091-1094.

35. Nishino, T., Nishioka, C., Ura, H. and Nagumo, T, Isolation and partial

characterization of a novel amino sugar-containing fucan sulfatee from

commercial Fucus vesiculosus fucoidan, Carbohydrate Research, 1994, 255,

213-224.

36. Nishino, T.; Nagumo, T, Anticoagulant and antithrombin activities of

oversulfated fucans, Carbohydr. Res, 1992, 229, 355-362.

37. Qiu, X.D.; Amarasekara, A.; Doctor, V, Effect of oversunphation on the

chemical and biological properties of fucoidan, Carbohydrate Polymers, 2006,

63, 224-228.

38. Zhang, Q.B.; Yu, P.Z.; Zhou, G.F.; Li, Z.E.; Xu, Z.H, Studies on antioxidant

activities of fucoidan from Laminaria japonica, Chin. Trad. Herbal Drugs, 2003,

34, 824-826.

39. Chevolot, L.; Foucault, A.; Chauber, F, Further data on the structure of brown

seaweed fucans: relationships with anticoagulant activitity, Carbohydr. Res.

1999, 319, 154-165.

40. Silva, T.M.A.; Alves, L.G.; Queiroz, K.C.S.; Santos, M.G.L.; Marques, C.T.;

Chavante, S.F.; Rocha, H.A.O.; Leite, E.L, Partial characterization and

anticoagulant activity of a heterofucan from the brown seaweed Padina

gymnospora, Braz. J. Med. Biol. Res, 2005, 38, 523-533.

41. Chandía, N.P.; Matsuhiro, B, Characterization of a fucoidan from Lessonia

vadosa (Phaeophyta) and its anticoagulant and elicitor properties, Int. J. Biol.

Macromol, 2008, 42, 235-240.

166

42. Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M, Isolation and preliminary

characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides with blood-

anticoagulant activity from seaweed Hizikia fusiforme, Carbohydr. Res, 1989,

194, 315-320.

43. Nishino, T.; Yokoyama, G.; Dobahi, K, Isolation, purification and

characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides from the

brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities,

Carbohydr. Res, 1989, 186, 119-129.

44. Pereira, M. S., Melo, F. R. and Mourão, P. A. S, Is there a correlation between

structure and anticoagulant action of sunphated galactans and sunphated

fucans?, Glycobiology, 2002, 12 (10), 573-580.

45. Pereira, M.S., Mulloy, B. and Mourao, P.A.S, Structure and anticoagulant

activity of sunphated fucans: Comparison between the regular, repetitive, and

linear fucans from echinoderms with the more heterogeneous and branched

polymers from brown algae, The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274

(12), 7656-7667.

46. Pereira, M.S.; Vilela-Silva A.E.S.; Valente, A.; Mourão, P.A.S, A 2-sunphated,

3-linked α-L-galactan is an anticoagulant polysaccharide, Carbohydr. Res, 2002,

337, 2231-2238.

47. Mourão, P.A.S, Use of sunphated fucans as anticoagulant and antithrombotic

agents: future perspectives, Curr. Pharmaceut. Des, 2004, 10, 967-981.

48. Rocha, H.A.O.; Moraes, F.A.; Trindade, E.S.; Franco, C.R.C.; Torquato R.J.S.;

Veiga, S.S.; Valente, A.P.; Mourão, P.A.S.; Leite, E.L.; Nader, H.B.; Dietrich,

C.P, Structural and hemostatic activities of a sunphated galactofucan from the

brown alga Spatoglossum schroederi, J. Biol. Chem, 2005, 280, 1278-41288.

49. Ponce, N.M.A.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B, Fucoidans from the brown seaweed

Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural

studies, Carbohydr. Res, 2003, 338, 153-165.

50. Hemmingson, J.A.; Falshaw, R.; Furneaux, R.H.; Thompson, K, Structure and

antiviral activity of the galactofucan sunphates extracted from Undaria

pinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol, 2006, 18, 185-193.

167

51. Mandal, P.; Mateu, C.G.; Chattopadhyay, K.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B.; Ray,

B, Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown

seaweed Cystoseira indica. Antivir, Chem. Chemother, 2007, 18, 153-162.

52. Hayashi, K.; Nakano, T.; Hashimoto, M.; Kanekiyo, K.; Hayashi, T, Defensive

effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes

simplex virus infection, Int. Immunopharmacol, 2008, 8, 109-116.

53. Doh-ura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.; Iha, M,

Prophylactic effect of dietary seaweed fucoidan against enteral prion infection,

Antimicrob. Agents Chemother, 2007, 51, 2274-2277.

54. Shi, Z.Y.; Guo, Y.Z.; Wang, Z, Pharmacological activity of fucoidan from

Laminaria japonic, J. Shanghai Fish. Univ, 2000, 9, 268-271.

55. Aisa, Y.; Miyakawa, Y.; Nakazato, T.; Shibata, H.; Saito, K.; Ikeda, Y.; Kizaki,

M, Fucoidan induces apoptosis of human HS-Sultan cells accompanied by

activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways, Am. J. Hematol.

2004, 78, 7-14.

56. Cumashi, A.; Ushakova, N.A.; Preobrazhenskaya, M.E.; D'Incecco, A.; Piccoli,

A.; Totani, L.; Tinari, N.; Morozevich, G.E.; Berman, A.E.; Bilan, M.I.; Usov,

A.I.; Nadezhda E.; Grachev, A.A.; Sanderson, C.J.; Kelly, M.; Rabinovich,

G.A.; Iacobelli, S, A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant,

antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from

brown seaweeds, Glycobiology, 2007, 17, 541-552.

57. Haneji, K.; Matsuda, T.; Tomita, M.; Kawakami, H.; Ohshiro, K.; Uchihara, J.;

Masuda, M.; Takasu, N.; Tanaka, Y.; Ohta, T.; Mori, N, Fucoidan extracted

from Cladosiphon okamuranus Tokida induces apoptosis of human T-Cell

leukemia virus type 1-infected T-Cell lines and primary adult T-Cell leukemia

cells, Nutrit. Cancer, 2005, 52, 189-201.

58. Maruyamaa, H.; Tamauchib, H.; Iizuka, M.; Nakano, T, The role of NK cells in

antitumor activity of dietary fucoidan from Undaria pinnatifida Sporophylls

(Mekabu), Planta Med, 2006, 72, 1415-1417.

168

59. Wijesinghe, W. A. J. P., & Jeon, Y. J, Biological activities and potential

cosmeceutical applications of bioactive components from brown seaweeds: a

review, Phytochemistry Reviews, 2011b, 10, 431–443.

60. Wu, X.W.; Yang, M.L.; Huang, X.L.; Yan, J.; Luo, Q, Effect of fucoidan on

splenic lymphocyte apoptosis induced by radiation, Chin. J. Radiol. Med. Prot.

2003, 23, 430-432.

61. Wu, X.W.; Yang, M.L.; Huang, X.L.; Yan, J.; Luo, Q, Effect of Laminaria

japonica polysaccharides on radioprotection and splenic lymphocyte apoptosis,

Med. J. Wuhan Univ. 2004, 25, 239-241.

62. Shimizu, J.; Wada-Funada, U.; Mano, H.; Matahira, Y.; Kawaguchi, M.; Wada,

M, Proportion of murine cytotoxic T cells is increased by high molecular-weight

fucoidan extracted from Okinawa mozuku (Cladosiphon okamuranus), J. Health

Sci. 2005, 51, 394-397.

63. Kima, M.H.; Joo, H.G, Immunostimulatory effects of fucoidan on bone marrow-

derived dendritic cells, Immunol. Lett, 2008, 115, 138-143.

64. Choi, E.M.; Kim, A.J.; Kim, Y.; Hwang, J.K, Immunomodulating activity of

arabinogalactan and fucoidan in vitro, J. Med. Food, 2005, 8, 446-453.

65. Zhang, Q.B.; Yu, P.Z.; Zhou, G.F.; Li, Z.E.; Xu, Z.H, Studies on antioxidant

activities of fucoidan from Laminaria japonica, Chin. Trad. Herbal Drugs, 2003,

34, 824-826.

66. Micheline, R.S.; Cybelle, M.; Celina, G.D.; Fernando, F.S.; Hugo, O.R.; Edda, L,

Antioxidant activities of sunphated polysaccharides from brown and red

seaweeds, J. Appl. Phycol, 2007, 19, 153-160.

67. Zhao X; Xue C.H; Cai, Y.P; Wang, D.F; Fang, Y, The study of antioxidant

activities of fucoidan from Laminaria japonica, High Tech Lett, 2005, 11, 91-94.

68. Bilan, M.I, Grachev A.A., Ustuzhanina N.E, Structure of a fucoidan from the

brown seaweed Fucus evanescens C. Ag, Carbohydrate Research, 2002, 337,

719-730.

69. Li, D.Y.; Xu, Z.; Huang, L.M.; Wang, H.B.; Zhang, S.H, Effect of fucoidan of L.

japonica on rats with hyperlipidaemia, Food Sci, 2001, 22, 92-95.

169

70. Li, D.Y.; Xu, Z.; Zhang, S.H, Prevention and cure of fucoidan of L. japonica on

mice with hypercholesterolemia, Food Sci, 1999, 20, 45-46.

71. Fu, X.Y.; Xue, C.H.; Ning, Y.; Li, Z.J.; Xu, J.C, Acute antihypertensive effects

of fucoidan oligosaccharides prepared from Laminaria japonica on

renovascular hypertensive rat, J. Ocean Univ. Qingdao, 2004, 34, 560-564.

72. Yang, J.W.; Se, Y.Y.; Soo, J.O.; Sang, K.K.; Keon, W.K, Bifunctional effects of

fucoidan on the expression of inducible nitric oxide synthase, Biochem. Biophys.

Res, 2006, 346, 345-350.

73. Shibata, H.; Kimura-Takagi, I.; Nagaoka, M.; Hashimoto, S.; Aiyama, R.; Iha,

M.; Ueyama, S.; Yokokura, T. Properties of fucoidan from Cladosiphon

okamuranus tokida in gastric mucosal protection, BioFactors, 2000, 11, 235-245.

74. Kawamoto, H.; Miki, Y.; Kimura, T.; Tanaka, K.; Nakagawa, T.; Kawamukai,

M.; Matsuda, H, Effects of fucoidan from Mozuku on human stomach cell lines.

Food Sci. Technol. Res, 2006, 12, 218-222.

75. Saito, A.; Yoneda, M.; Yokohama, S.; Okada, M.; Haneda, M.; Nakamura, K,

Fucoidan prevents concanavalin A-induced liver injury through induction of

endogenous IL-10 in mice, Hepatol. Res,. 2006, 35(3), 190-198.

76. Kawano, N.; Egashira, Y.; Sanada, H, Effect of dietary fiber in edible seaweeds

on the development of D-galactosamine-induced hepatopathy in rats, J. Nutr.

Sci. Vitaminol. (Tokyo), 2007, 53, 446-450.

77. Hayashi, K.; Nakano, T.; Hashimoto, M.; Kanekiyo, K.; Hayashi, T, Defensive

effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes

simplex virus infection, Int. Immunopharmacol, 2008, 8, 109-116.

78. M. I. BilanA. N. ZakharovaA. A. GrachevA. S. ShashkovN. E. NifantievA. I.

Usov, Polysaccharides of algae: 60. Fucoidan from the pacific brown alga

Analipus japonicus (Harv.) winne (Ectocarpales, Scytosiphonaceae), Russian

Journal of Bioorganic Chemistry, 2007, Volume 33, Issue 1, pp 38–46.

79. Marais Marie-France , Jean-Paul Joseleau, A fucoidan fraction from

Ascophyllum nodosum, Carbohydrate Research, 2001, 336 (2), 155-159.

170

80. Usov A. I. ; Smirnova G. P. ; Bilan M. I., Polysaccharides of algae. 53. brown

alga laminaria saccharina (l.) lam. asa source of fucoidan, Bioorganic

chemistry, 1998, 24 (6), 437-445.

81. Adhikari Utpal Cecilia, G.Mateu, KausikChattopadhyay, Carlos A.Pujol, Elsa

B.Damonte, BimalenduRay, Structure and antiviral activity of sulfated fucans

from Stoechospermum marginatum, Phytochemistry, 2006, 67(22), 2474-2482.

82. Daniel, R., Berteau, O., Chevolot, L., Varenne, A., Gareil, P. and Goasdoue, N.,

Regioselective desulfation of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase

from the marine mollusk Pecten maximus, European Journal of Biochemistry,

2001, 268, 5617–5626.

83. T.NishinoY.AizuT.Nagumo, The influence of sulfate content and molecular

weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its

antithrombin activity, Thrombosis Research, 1991, 64(6), 723-731.

84. Seng Joe Lim, Wan Mustapha, Wan AidaMohamad Yusof Maskat Jalifah Latip

Khairiah Haji Badri Osman Hassan Bohari M.Yamin, Characterisation of

fucoidan extracted from Malaysian Sargassum binderi, Food Chemistry, 2016,

209(15), 267-273.

85. Stanislav D. Anastyuk, Tatyana I. Imbs, Pavel S. Dmitrenok, and Tatyana N.

Zvyagintseva, Rapid Mass Spectrometric Analysis of a Novel Fucoidan,

Extracted from the Brown Alga Coccophora langsdorfii, The Scientific World

Journal, Volume 2014 (2014), Article ID 972450, 9 pages.

86. Pham D. Thinh, Roza V. Menshova, Svetlana P. Ermakova, Stanislav D.

Anastyuk, Bui M. Ly and Tatiana N. Zvyagintseva, Structural Characteristics

and Anticancer Activity of Fucoidan from the Brown Alga Sargassum mcclurei,

Mar.Drugs., 2013, 11, 1456-1476.

87. Anastyuk S.D.; Shevchenko N.M.; Dmitrenok P.S.; Zvyagintseva T.N.,

Anticancer activity in vitro of a fucoidan from the brown alga Fucus evanescens

and its low-molecular fragments, structurally characterized by tandem mass-

spectrometry, Carbohydrate Polymers, 2012, 87, 186– 194.

171

88. Anastyuk, S. D., Imbs, T.M., Shevchenko, N.M., Dmitrenok, P.S., Zvyagintseva,

T.N, ESIMS analysis of fucoidan preparations from Costaria costata, Chem.

Nat. Comp, 2009, 45, 79-86.

89. Anastyuk, S. D., Shevchenko, N. M., Nazarenko, E. L., Dmitrenok, P. S., and

Zvyagintseva, T. N. Structural analysis of a fucoidan from the brown alga Fucus

evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry, Carbohydrate

Research. 2009, 344(6), 779-787.

90. Anastyuk, S.D.; Shevchenko, N.M.; Nazarenko, E.L.; Imbs, T.I.; Gorbach, V.I.;

Dmitrenok, P.S.; Zvyagintseva, T.N, Structural analysis of a highly sunphated

fucan from the brown alga Laminaria cichorioides by tandem MALDI and ESI

mass spectrometry, Carbohydr. Res, 2010, 345, 2206-2212.

91. Nguyễn D. Nhứt, Bùi M. Lý, Thành T. T. Thủy, Nguyễn M. Cường, Trần V.

Sung, Nghiên cứu fucoidan có hoạt tính gây độc tế bào tách từ rong nâu

Sargasum swartzii bằng phương pháp phổ khối nhiều lần, Tạp chí Hóa học,

2009, 47 (3), 300– 307.

92. Thuy Thi Thanh Thu, Van Thi Thanh Tran, Yoshiaki Yuguchi, Ly Minh Bui and

Tai Tien Nguyen, Structure of fucoidan from brown seaweed Turbina ornata as

Studied by Electrospray ionization Mass spectrometry (MSIMS) and Small

Angle X-ray Scattering (SAXS) Techniques, Mar.Drugs, 2013, 11, 2431-2443.

93. Thanh Thi Thu Thuy, Bui Minh Ly, Tran Thi Thanh Van, Ngo Van Quang, Ho

Cam Tu, Yue Zheng, Carole Seguin-Devaux, Bilan Mi Usov Ai, Anti-HIV

activity of fucoidans from three brown seaweed species, Carbohydrate Polymers,

2015, 115, 122-128.

94. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., and Smith, F.

Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal.

Chem, 1956, 28, 350-6.

95. Olesya S. Vishchuk, Svetlana P. Ermakova, Tatyana N. Zvyagintseva,

Sunphated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and

Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics, and antitumor activity,

Carbohydrate Research, 2011, 346, 2769-2776.

172

96. Trần Thị Thanh Vân, Nghiên cứu cấu trúc polysacarit dạng agar chiết từ một số

loài rong biển Việt Nam, Luận án tiến sỹ Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, 2007, Hà Nội.

97. Peter N. Pusey, Dennis E. Koppel, Dale E. Schaefer, Rafael D. Camerini-Otero,

and Seymour H. Koenig, Intensity fluctuation spectroscopy of laser light

scattered by solutions of spherical viruses, R17, Q.beta., BSV, PM2, and T7. I.

Light-scattering technique, Biochemistry, 1974, 13 (5), 952–960.

98. Daniel, R.; Chevolot L.; Carrascal M.; Tissot, B.; Mourão, P.A.S.; Abian, J,

Electrosprayionization mass spectrometry of oligosaccharides derived from

fucoidan of Ascophyllum nodosum, Carbohydr. Res, 2007, 342, 826-834.

99. Yoshiaki Yuguchi, Van Thi ThanhTran, Ly Minh Bui, Shizuka Takebe, Shiho

Suzuki, Nobukazu Nakajima, Shinichi Kitamura, Thuy Thi Thu Thanh, Primary

structure, conformation in aqueous solution, and intestinal immunomodulating

activity of fucoidan from two brown seaweed species Sargassum crassifolium

and Padina australis, Carbohydrate Polymers, 2016, 147, 69–78.

100. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D.,

Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R., New colorimetric cytotoxicity

assay for anticancer agents. Eur J Cancer, 1991, 27, 1162–1168.

101. Likhitayawuid K., Angerhofer C.K., Cytotoxic and antimalarial

bisbenzylisoquinoline alkaloids from Sephania evecta, Jounal of Natural

Products, 1993, 56 (1), 30-38.

102. Gao, H., Masonori K., Wu L, Nobuo K, Takeaki Y, Yoshiyuki N, Antitumor-

promoting consitents from Dioscora bulbofera L., in JB6 mouse epidermal

cells, Biol Pharm Bull, 2002, 25(12), 1241-1243.

103. Gao, F. H., Hu, X. H., Li, W., Liu, H., Zhang, Y. J., Guo, Z. Y., Wu, Y. L,

Oridonin induces apoptosis and senescence in colorectal cancer cells by

increasing histone hyperacetylation and regulation of p16, p21, p27 and c-myc,

BMC cancer, 2010, 10(1), 610.

104. Skehan, P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D.,

Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R, New colorimetric cytotoxicity

assay for anticancer agents, Eur J Cancer, 1991, 27, 1162–1168.

173

105. Zhao, J., Wang, J., Chen, Y., & Agarwal, R, Anti-tumor-promoting activity

of a polyphenolic fraction isolated from grape seeds in the mouse skin two-stage

initiation–promotion protocol and identification of procyanidin B5-3′-gallate as

the most effective antioxidant constituent. Carcinogenesis, 1999, 20(9), 1737-

1745.

106. Lau, A.-J., et al., Antiplatelet and anticoagulant effects of Panax

notoginseng: Comparison of raw and steamed Panax notoginseng with Panax

ginseng and Panax quinquefolium, Journal of Ethnopharmacology, 2009.

125(3), 380-386.

107. Dang, X., et al., The antithrombotic effect of RSNK in blood-stasis model

rats, J Ethnopharmacol, 2015, 173, 266-72 .

108. Wang, J., et al., Screening of anti-platelet aggregation agents from Panax

notoginseng using human platelet extraction and HPLC–DAD–ESI-MS/MS,

Journal of Separation Science, 2008. 31(6-7), 1173-1180.

109. Zvyagintseva, T.N.; Shevchenko, N.M.; Popivnich, I.B, A new procedure for

the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds,

Carbohydr. Res, 1999, 322, 32-39.

110. Bilan M.I.; Grachev A.A.; Shashkov A.S.; Kelly M.; Sanderson C.J.;

Nifantiev N.E.; Usov A.I, Further studies on the composition and structure of a

fucoidan preparation from the brown alga Saccharina latissima, Carbohydr

Res, 2010, 345, 2038-2047.

111. Dodgson, K. S.; Price, R. G. A Note on the Determination of the Ester

Sulphate Content of Sulphated Polysaccharides, Biochem. J, 1962, 84, 106 -

110.

112. Bitter, T.; Muir, H.M, A modified uronic acid carbazole reaction, Anal.

Biochem, 1962, 4, 330–334.

113. Usoltseva RV, Anastyuk SD, Shevchenko NM, Surits VV, Silchenko AS,

Isakov VV, Zvyagintseva TN, Thinh PD, Ermakova SP., Polysaccharides from

brown algae Sargassum duplicatum: the structure and anticancer activity in

vitro, Carbohydr Polym, 2017,175, 547-556.

174

114. A.I. Usov, G.P. Smirnova, M.I. Bilan, A.S. Shashkov, Polysaccharides of

Algae: 53. Brown Alga Laminaria saccharina (L.) Lam. as a Source of

Fucoidan, Russ. J. Bioorg. Chem, 1998, 24, 382-389.

115. J.-B. Lee, K. Hayashi, M. Hashimoto, T. Nakano, T. Hayashi, Novel

antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu), Chem.

Pharm. Bull, 2004, 52, 1091-1094.

116. J.A. Hemmingson, R. Falshaw, R.H. Furneaux, K. Thompson, Structure and

Antiviral Activity of the Galactofucan Sulfates Extracted from

UndariaPinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol, 2006, 18, 185-193.

117. A. Synytsya, R. Bleha, A. Synytsya, R. Pohl, K. Hayashi, K. Yoshinaga, T.

Nakano, T. Hayashi, Mekabu fucoidan: Structural complexity and defensive

effects against avian influenza A viruses, Carbohydr. Polym, 2014, 111, 633-

644.

118. J. Wang, Q. Zhang, Z. Zhang, H. Zhang, X. Niu, Int, Structural studies on a

novel fucogalactan sulfate extracted from the brown seaweed Laminaria

japonica, J. Biol. Macromol, 2010, 47, 126-131.

119. Z. Peng, M. Liu, Z. Fang, Q. Zhang, Int, In vitro antioxidant effects and

cytotoxicity of polysaccharides extracted from Laminaria japonica, J. Biol.

Macromol, 2012, 50, 1254-1259.

120. P. Skehan, R. Storeng, D. Scudiero, A. Monks, J. McMahon, D. Vistica, J.T.

Warren, H. Bokesch, S. Kenney, M.R. Boyd, New colorimetric cytotoxicity

assay for anticancer-drug screening, J. Natl. Cancer Inst, 1990, 82, 1107-1112.

121. K. Likhitwitayawuid, C.K. Angerhofer, G.A. Cordell, J.M. Pezzuto,

Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania

erecta, J. Nat. Prod, 1993, 56, 30-38.

122. N.E. Ustyuzhanina, M.I. Bilan, A.G. Gerbst, N.A. Ushakova, E.A.

Tsvetkova, A.S. Dmitrenok, A.I. Usov, N.E. Nifantiev, Anticoagulant and

antithrombotic activities of modified xylofucan sulfate from the brown alga

Punctaria plantaginea, Carbohydr. Polym, 2016, 136, 826-833.

175

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Bảng đồ phân bố rong ..............................................................................

Phụ lục 2: Bảng đồ phân bố rong nâu tại Khánh Hòa .................................................

Phụ lục 3. Hình một số loài rong nâu .........................................................................

Phụ lục 4. Thành phần loài và phân bố rong nâu Khánh Hòa ....................................

Phụ lục 5. Hình dạng rong Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens..............

Phụ lục 6. Vị trí địa lý nơi thu thập mẫu rong nâu .....................................................

Phụ lục 7. Rong nâu Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens ........................

Phụ lục 8. Rong nâu Turbinaria decurrens ................................................................

Phụ lục 9. Phổ 13C-NMR của fucoidan phân đoạn F2 từ rong Sargassum binderi ......

Phụ lục 10. Phổ IR của phân đoạn fucoidan chiết từ rong nâu Sargassum

duplicatum.................................................................................................................

Phụ lục 11. Phổ 1H-NMR của fucoidan chiết từ rong nâu S. duplicatum ....................

Phụ lục 12. Sắc ký đồ của GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum aquifolium ......

Phụ lục 13. Hiệu suất và thành phần hóa học các phân đoạn .....................................

Phụ lục 14. Kết quả phân tích methyl hóa các mẫu FSA-1.0M , 1.0МdeS, FSA-

1.5M và 1.5MdeS. ....................................................................................................

Phụ lục 15. Bảng giá trị độ dịch chuyển hóa học của 13C và 1H – NMR .....................

Phụ lục 16. Phổ 13C NMR của phân đoạn FSA-2.0M .................................................

Phụ lục 17. Phổ 13C NMR của phân đoạn FSA-1.5M .................................................

Phụ lục 18. Phổ 13C NMR của phân đoạn FSA-1.0M .................................................

Phụ lục 19. Phổ HSQC của deS-2 ..............................................................................

Phụ lục 20. Phổ HSQC của deS-4 ..............................................................................

Phụ lục 21. Phổ HSQC của deS-6 ..............................................................................

Phụ lục 22. Phổ HMBC của deS-2 .............................................................................

Phụ lục 23. Phổ HMBC của deS-4 .............................................................................

Phụ lục 24. Phổ HMBC của deS-6 .............................................................................

Phụ lục 25. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]- với m/z 243 .......................................

Phụ lục 26. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- với m/z 389 .....................................

Phụ lục 27. Phổ ESIMS/MS của ion [FucGalSO3]- với m/z 405 .................................

Phụ lục 28. Sắc ký đồ GPC của Turbinaria decurrens ...............................................

176

Phụ lục 29. Sắc ký đồ GPC của Turbinaria decurrens ...............................................

Phụ lục 30. Phổ IR của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens ...........................

Phụ lục 31. Phổ 1H-NMR của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens ................

Phụ lục 32. Phổ 13C-NMR của fucoidan từ rong nâu Turbinaria decurrens ...............

Phụ lục 32. Phổ ESIMS/MS của ion a) [FucSO3]- và b) [FucGalSO3]- fucoidan từ

rong nâu Turbinaria decurrens ..................................................................................

Phụ lục 33. Phổ SAXS của fucoidan từ một số loài rong nâu .....................................

Phụ lục 34. Phổ SAXS của fucoidan từ rong nâu Turbinaria ornata ..........................