Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis prain) ở Việt Nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGŨ TRƯỜNG NHÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội, 2019

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGŨ TRƯỜNG NHÂN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mã số chuyên ngành: 9.44.01.17

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường

2. TS. Đỗ Hữu Nghị

Hà Nội, 2019

i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... v

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................... vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... xi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .................................................................................. xiv

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ............................................................................... xv

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................................3

1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ ĐẬU (FABACEAE) VÀ CHI TRẮC (DALBERGIA) ................3

1.1.1. Khái quát về họ Đậu (Fabaceae) ............................................................. 3

1.1.2. Khái quát về chi Trắc (Dalbergia) .......................................................... 3

1.1.3. Tổng quan về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) .............................. 4

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI TRẮC

(DALBERGIA) TRÊN THẾ GIỚI ..............................................................................................5

1.2.1. Hợp chất khung flavan ........................................................................... 7

1.2.2. Hợp chất khung isoflavan ....................................................................... 8

1.2.3. Hợp chất khung neoflavan .................................................................... 10

1.2.4. Hợp chất khung flavanol ...................................................................... 10

1.2.5. Hợp chất khung flavanone .................................................................... 11

1.2.6. Hợp chất khung isoflavanone................................................................ 14

1.2.7. Hợp chất khung flavanonol ................................................................... 15

1.2.8. Hợp chất khung isoflavanonol .............................................................. 16

1.2.9. Hợp chất khung flavone ....................................................................... 17

1.2.10. Hợp chất khung isoflavone ............................................................... 18

1.2.11. Hợp chất khung neoflavone .............................................................. 21

1.2.12. Hợp chất khung 4-aryl-coumarin....................................................... 21

1.2.13. Hợp chất khung aurone ....................................................................... 23

ii

1.2.14. Hợp chất khung chalcone ................................................................... 23

1.2.15. Lớp chất diaryl propanoid .................................................................. 25

1.2.16. Lớp chất cumarin và dẫn xuất ............................................................. 25

1.2.17. Lớp chất lignan .................................................................................. 27

1.2.18. Lớp chất benzophenon........................................................................ 28

1.2.19. Lớp chất terpenoid ............................................................................. 28

1.2.20. Các lớp chất khác ............................................................................... 29

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI TRẮC

(DALBERGIA) Ở VIỆT NAM ................................................................................................ 30

1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHI TRẮC (DALBERGIA)........................................ 34

1.4.1. Hoạt tính chống oxi hóa ....................................................................... 34

1.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào ....................................................................... 37

1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn ......................................................................... 40

1.4.4. Hoạt tính kháng viêm ........................................................................... 41

1.4.5. Hoạt tính chống đái tháo đường ............................................................ 41

1.4.6. Hoạt tính chống dị ứng ......................................................................... 42

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 43

2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 43

2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu ............ 43

2.1.2. Các phương pháp nghiên cứu thực vật loài Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain) ............................................................................................................ 43

2.1.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ............................. 46

2.1.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ...................... 46

2.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học .................................................................... 46

2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ................. 46

2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase ...................... 48

2.3. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách ....................................................................................... 49

2.3.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561)..................................... 49

2.3.2. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612)..................................... 54

2.4. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập ................................................... 61

iii

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................... 67

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ VI PHẪU VÀ DNA CỦA CÂY SƯA (DALBERGIA

TONKINENSIS PRAIN) .......................................................................................................... 67

3.1.1. Kết quả nghiên cứu vi phẫu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ........ 67

3.1.2. Kết quả nghiên cứu DNA cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ........... 70

3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) (C-

561) ........................................................................................................................................ 74

3.2.1. Hợp chất pinocembrin (DT.01) ............................................................. 75

3.2.2. Hợp chất naringenin (DT.02) ................................................................ 78

3.2.3. Hợp chất 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03)................. 80

3.2.4. Hợp chất medicarpin (DT.04) ............................................................... 82

3.2.5. Hợp chất buteaspermanol (DT.05) ........................................................ 84

3.2.6. Hợp chất mới daltonkin A (DT.06) ....................................................... 85

3.2.7. Hợp chất mới daltonkin B (DT.07) ....................................................... 93

3.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) (C-

612) ...................................................................................................................................... 101

3.3.1. Hợp chất Dalbergin (DT.08) ................................................................ 101

3.3.2. Hợp chất isoliquiritigenin (DT.09) ....................................................... 102

3.3.3. Hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10) ...................................... 104

3.3.4. Hợp chất vestitone (DT.11) ................................................................. 106

3.3.5. Hợp chất calycosin (DT.12) ................................................................. 108

3.3.6. Hợp chất 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone (DT.13) ............................. 109

3.3.7. Hợp chất liquiritigenin (DT.14) ........................................................... 110

3.3.8. Hợp chất sativanone (DT.15) ............................................................... 112

3.3.9. Hợp chất 3'-O-methylviolanone (DT.16) .............................................. 112

3.3.10. Hợp chất sulfuretin (DT.17)............................................................... 114

3.3.11. Hợp chất formononetin (DT.18) ......................................................... 115

3.4. KẾT LUẬN VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ................................... 116

3.5. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC .......................................................................... 119

iv

3.5.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ cặn chiết

dichloromethane ........................................................................................... 119

3.5.2. Tác dụng ức chế enzyme -glucosidase của các cặn chiết và các hợp chất

phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ............................... 120

KẾT LUẬN ........................................................................................................ 129

KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 131

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............. 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 133

v

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa

được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Ngũ Trường Nhân

vi

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Với sự kính trọng, lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ

lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường và TS. Đỗ Hữu Nghị là những người

thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực

hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa

học các hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ Phòng Hoạt chất sinh học

và các đồng nghiệp Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình

trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi cũng cám ơn đề tài nghiên cứu số 104.01-2015.49 do quỹ Phát triển Khoa

học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) do PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường làm chủ

nhiệm đã tài trợ cho các nghiên cứu trong luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè gần xa đã cổ vũ, động

viên tôi hoàn thành tốt luận án này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi,

đến đấng sinh thành, những người đã không ngại khó khăn, vất vả, đã luôn giúp đỡ,

khích lệ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Ngũ Trường Nhân

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Diễn giải Tiếng Anh

D. Chi Trắc Dalbergia

Advanced glycosylation AGEs Các sản phẩm của quá trình glycat hoá end products

13C- NMR

Carbon -13 Nuclear

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13C Magnetic Resonance

Spectroscopy

Sắc ký cột CC Column Chromatography

Chi trắc D Dalbergia

Nồng độ hoạt chất bắt đầu bảo vệ được ED50 Effective Dose at 50% 50% sự sống sót

EN Phân hạng ở mức độ nguy cấp Endangered

EtOAc CH3COOC2H5 Ethyl acetate

EtOH C2H5OH Ethanol

Liver hepatocellular

Hep-G2 Dòng tế bào ung thư ở gan người carcinoma/Human

hepatoma

HeLa Ung thư cổ tử cung người Henrietta lacks

HTSH Hoạt tính sinh học

1H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Nuclear Magnetic

1H -1H - Correlation

1H-1H-COSY Phổ tương tác proton

Resonance Spectroscopy

Spectroscopy

Phổ tương tác dị nhân qua nhiều liên kết Heteronuclear Multiple HMBC (HMBC) Bond Correlation

Heteronuclear Single HSQC Phổ tương tác dị nhân qua 1 liên kết Quantum Coherence

viii

High Resolution Electron Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng HR-ESI-MS Spray Ionization Mass phun mù điện tử Spectroscopy

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Inhibitory concentration IC50 Nồng độ ức chế 50% 50%

Human epidermoid KB Dòng tế bào ung thư biểu mô carcinoma

LD50 Liều độc cấp tính Lethal dose 50

LU-1 Ung thư phổi người Human lung carcinoma

Cancer Foundation-7 MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú Michigan

MeOH CH3OH Methanol

Minimum Inhibitory MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Concentration

Human small cell lung NCI-H187 Dòng tế bào ung thư phổi cancer

NĐ- CP Nghị định- Chính phủ

NĐ/2006/NĐ- Nghị định 32/2006 của Chính phủ CP

RD Ung thư màng tim Rhabdosarcoma

SC50 Khả năng bẫy gốc tự do 50% Scavening capacity

SH-SY5Y Ung thư thần kinh người Human neurobastoma

STT Số thứ tự

UV Phổ tử ngoại Ultraviolet

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các loài đã được nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Trắc

(Dalbergia) trên thế giới (bao gồm tên loài, bộ phận và vùng lấy mẫu) ................... 6

Bảng 1.2. Các hợp chất flavan từ chi Trắc (Dalbergia) ........................................... 8

Bảng 1.3. Các hợp chất isoflavan từ chi Trắc (Dalbergia) ....................................... 9

Bảng 1.4. Các hợp chất neoflavan từ chi Trắc (Dalbergia) .................................... 10

Bảng 1.5. Các hợp chất flavanol từ chi Trắc (Dalbergia) ...................................... 11

Bảng 1.6. Các hợp chất flavanone từ chi Trắc (Dalbergia) .................................... 12

Bảng 1.7. Các hợp chất isoflavanone từ chi Trắc (Dalbergia) ............................... 14

Bảng 1.8. Các hợp chất flavanonol từ chi Trắc (Dalbergia).................................. 16

Bảng 1.9. Các hợp chất isoflavanonol từ chi Trắc (Dalbergia) .............................. 17

Bảng 1.10. Các hợp chất flavone từ chi Trắc (Dalbergia) ..................................... 18

Bảng 1.11. Các hợp chất isoflavone từ chi Trắc (Dalbergia) ................................. 19

Bảng 1.12. Các hợp chất neoflavone từ chi Trắc (Dalbergia) ................................ 21

Bảng 1.13. Các hợp chất chalcone từ chi Trắc (Dalbergia) ................................... 23

Bảng 1.14. Danh sách các loài Dalbergia đã được nghiên cứu về thành phần hóa học

ở Việt Nam ............................................................................................................ 30

Bảng 1.15. Giá trị ED50 của dịch chiết MeOH từ gỗ loài Trắc (D.

cochinchinensis) .................................................................................................... 35

Bảng 1.16. Giá trị IC50 của naringenin và eriodictoyl so với BTH ......................... 36

Bảng 2.1. Thông tin các cặp mồi sử dụng .............................................................. 45

Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền của từng vùng gen so sánh giữa 2 mẫu nghiên cứu

với 6 loài trên Genbank ......................................................................................... 72

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.01 và chất tham khảo ..................... 77

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.02 và chất tham khảo ..................... 79

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.03 và chất tham khảo ..................... 81

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.04 và chất tham khảo .................... 83

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.05 và chất tham khảo .................... 85

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin A .............................. 93

x

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin B ............................... 99

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.08 và chất tham khảo ................... 102

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.09 và chất tham khảo ................. 103

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.10 và chất tham khảo ................. 106

Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo ................. 107

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo ................. 109

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.14 và chất tham khảo ................. 111

Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.16 và chất tham khảo ................. 113

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.17 và chất tham khảo ................. 115

Bảng 3.17. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa..................... 117

(Dalbergia tonkinensis Prain) .............................................................................. 117

Bảng 3.18. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập từ loài

(Dalbergia tonkinensis Prain) .............................................................................. 120

Bảng 3.19. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain) ............................................................................. 121

Bảng 3.20. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn từ lõi gỗ ........ 123

Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ....................................................................... 123

Bảng 3.21. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của sativanone và formononetin so với

acarbose trên 4 nguồn enzyme khác nhau ............................................................ 125

Bảng 3.22. Hoạt tính ức chế α-glucosidase trên chuột của cao chiết các bộ phận và 2

hợp chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) .............................................. 127

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở TP. Buôn Ma Thuột .................. 3

Hình 1.2. Sản phẩm từ gỗ chi Trắc (Dalbergia) ...................................................... 4

Hình 1.3. Một phần lõi gỗ, rễ và lá loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu ở

Tp.BMT .................................................................................................................. 5

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung flavan ........................................................ 8

Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavan .................................................. 10

Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ khung neoflavan ............................... 10

Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất khung flavanol ................................................... 11

Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanone ............................................ 15

Hình 1.9. Cấu trúc các hợp chất khung flavanonol ............................................... 16

Hình 1.10. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanonol ......................................... 17

Hình 1.11. Cấu trúc các hợp chất khung flavone ................................................... 18

Hình 1.12. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavone ............................................... 21

Hình 1.13. Cấu trúc các hợp chất khung neoflavone.............................................. 21

Hình 1.14. Cấu trúc các hợp chất khung 4-aryl-coumarin...................................... 23

Hình 1.15. Cấu trúc các hợp chất khung aurone .................................................... 23

Hình 1.16. Cấu trúc các hợp chất khung chalcone ................................................ 25

Hình 1.17. Cấu trúc các hợp chất diaryl propanoid ................................................ 27

Hình 1.18. Cấu trúc các hợp chất cumarin và dẫn xuất .......................................... 27

Hình 1.19. Cấu trúc các hợp chất ligan .................................................................. 28

Hình1.20. Cấu trúc các hợp chất benzophenon ...................................................... 28

Hình 1.21. Cấu trúc các hợp chất terpenoid ........................................................... 29

Hình 1.22. Cấu trúc các hợp chất khác .................................................................. 30

Hình 1.23. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ chi Trắc (Dalbergia) ở Việt Nam .... 34

Hình 2.1. Hai mẫu Sưa được thu tại Buôn Ma Thuột (C-561-L) và Hà Nội (C-564-

L) .......................................................................................................................... 44

Hình 2.2. Mẫu lá Trắc được thu tại Buôn Ma Thuột (C-562-L) ............................. 44

Hình 3.1. Vi phẫu lá Sưa ....................................................................................... 68

xii

Hình 3.2. Phiến lá Sưa .......................................................................................... 68

Hình 3.3. Vi phẫu thân loài Sưa ............................................................................. 69

Hình 3.4. Đặc điểm bột lõi thân ........................................................................... 69

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% ................ 70

Hình 3.6. So sánh khả năng phân biệt giữa các loài Dalbergia của 3 vùng gen nghiên

cứu ........................................................................................................................ 74

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.01 ........................................................ 75

Hình 3. 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.01 ...................................................... 77

Hình 3. 9. Phổ DEPT của hợp chất DT.01 ............................................................. 77

Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất pinocembrin ............................................................ 77

Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.02 ....................................................... 78

Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.02 ..................................................... 79

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất naringenin ............................................................... 79

Hình 3.17. Phổ IR của hợp chất DT.06 ................................................................. 86

Hình 3.18. Phổ UV của hợp chất DT.06 ................................................................ 86

Hình 3.19. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.06 ................... 87

Hình 3.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.06....................................................... 88

Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.06 ..................................................... 88

Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất DT.06 ............................................................ 89

Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất DT.06 ........................................................... 89

Hình 3.24. Phổ COSY của hợp chất DT.06 .......................................................... 90

Hình 3.25. Phổ HMBC của hợp chất DT.06 .......................................................... 91

Hình 3.26. Phổ CD của hợp chất DT.06 ................................................................ 91

Hình 3.27. Phổ CD của hợp chất ........................................................................... 91

Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin A .......................................... 92

Hình 3.29. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin A .................. 92

Hình 3.30. Phổ khối phân giả cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.07 .................... 94

Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.07 ....................................................... 95

Hình 3.32. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.07 ...................................................... 95

Hình 3.33. Phổ DEPT của hợp chất DT.07 ........................................................... 96

xiii

Hình 3.34. Phổ HSQC của hợp chất DT.07 ........................................................... 97

Hình 3.35. Phổ COSY của hợp chất DT.07 ........................................................... 98

Hình 3.36. Phổ HMBC của hợp chất DT.07 .......................................................... 98

Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin B ........................................ 100

Hình 3.38. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin B ............... 100

Hình 3.39. Cấu trúc hợp chất Dalbergin ............................................................. 102

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học hợp chất isoliquiritigenin ........................................ 103

Hình 3.41. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.10 ..................................................... 104

Hình 3.43. Phổ DEPT của hợp chất DT.10 ......................................................... 105

Hình 3.44. Cấu trúc hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone ................................... 105

Hình 3.45. Cấu trúc hợp chất vestitone ............................................................... 107

Hình 3.46. Cấu trúc hợp chất calycosin ............................................................... 108

Hình 3.47. Cấu trúc hóa học hợp chất 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone ............. 110

Hình 3.48. Cấu trúc hợp chất liquiritigenin ......................................................... 111

Hình 3.49. Cấu trúc hợp chất sativanone ............................................................ 112

Hình 3.50. Cấu trúc hợp chất 3'-O-methylviolanone ........................................... 113

Hình 3.51. Cấu trúc hợp chất 7,3',4'-trihydroxyaurone ........................................ 114

Hình 3.52. Cấu trúc hợp chất fomononetin .......................................................... 116

Hình 3.53. Khả năng ức chế α-glucosidase của các bộ phận loài Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) ................................................................................................ 122

Hình 3.54. Độ bền pH (2-13) của cao chiết methanol lõi gỗ Sưa và tương quan hoạt

tính ức chế enzyme α-glucosidase........................................................................ 123

Hình 3.55. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao phân đoạn và hợp

chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ............................. 124

xiv

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-

561) ....................................................................................................................... 49

Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane 50

Sơ đồ 2.3. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết ethyl acetate ...... 51

Sơ đồ 2. 4. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cao nước đun sôi ..................... 53

Sơ đồ 2.5. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-

612) ....................................................................................................................... 54

Sơ đồ 2.6. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-2 .............. 56

Sơ đồ 2.7. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-3 ............. 58

Sơ đồ 2.8. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết HDT-4 .............. 60

xv

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các phổ của hợp chất pinocembrin (DT.01) ...................................... PL1

Phụ lục 2: Các phổ của hợp chất narigenin (DT.02) ............................................ PL2

Phụ lục 3: Các phổ của hợp chất 3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03) PL3

Phụ lục 4: Các phổ của hợp chất medicarpin (DT.04) ......................................... PL4

Phụ lục 5: Các phổ của hợp chất buteaspermanol (DT.05) .................................. PL5

Phụ lục 6: Các phổ của hợp chất daltonkin A (DT.06) ........................................ PL6

Phụ lục 7: Các phổ của hợp chất daltonkin B (DT.07) ........................................ PL7

Phụ lục 8: Các phổ của hợp chất dalbergin (DT.08) ............................................ PL8

Phụ lục 9: Các phổ của hợp chất isoliquiritigenin (DT.09) .................................. PL9

Phụ lục 10: Các phổ của hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10) ............ PL10

Phụ lục 11: Các phổ của hợp chất vestitone (DT.11) ........................................ PL11

Phụ lục 12: Các phổ của hợp ch ất calycosin (DT.12) ....................................... PL12

Phụ lục 13: Các phổ của hợp chất 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone (DT.13) .. PL13

Phụ lục 14: Các phổ của hợp chất liquiritigenin (DT.14) .................................. PL14

Phụ lục 15: Các phổ của hợp chất sativanone (DT.15) ...................................... PL15

Phụ lục 16: Các phổ của hợp chất 3'-O-methylviolanone (DT.16) .................... PL16

Phụ lục 17: Các phổ của hợp chất sulfuretin (DT.17) ........................................ PL17

Phụ lục 18: Các phổ của hợp chất formononetin (DT.18) ...................................PL18

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam có diện tích khoảng 330000 km2, trải dài 1650 km qua 15o vĩ, có khí

hậu nhiệt đới gió mùa, hai mùa nóng ẩm, độ ẩm tương đối lớn (trên 80%), lượng mưa

hàng năm dồi dào (trung bình 1200-2800 mm) [1]. Với đặc thù môi trường thiên nhiên

như thế đã tạo ra một hệ thực vật đa dạng phong phú về chủng loại, quanh năm xanh

tốt, và có nhiều công dụng phục vụ cuộc sống con người như là lương thực, chế biến

đồ dùng nội ngoại thất, làm cảnh, làm thuốc,… Theo số liệu thống kê, hệ thực vật bậc

cao Việt Nam có trên 10.000 loài [2], trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng

trong y học dân tộc làm thuốc chữa bệnh [3].

Trong hệ thực vật đó thì chi Trắc (Dalbergia) thuộc cây họ Đậu (Fabaceae) là

một trong ba chi có số loài đa dạng và phong phú nhất. Theo tìm hiểu qua tri thức bản

địa thì rất nhiều loài trong chi này như Trắc hoàng đàn Dalbergia assamica Bent, Trắc

lá Dalbergia foliacea Wall. ex Benth, Cẩm lai một hạt Dalbergia candenatenis,

Dalbergia rimosa, Dalbergia sissoo, Dalbergia odorifera.., được sử dụng rộng rãi trong

y học dân gian ở nhiều quốc gia để chữa nhiều bệnh như: đau đầu, chữa ung nhọt, ho

suyễn, gãy xương, phong thấp, chảy máu cam, nhiễm trùng, bệnh giang mai, tiêu chảy,

ghẻ, sốt rét, v/v [ 4]. Trong y học cổ truyền, chúng cũng được sử dụng như các thuốc

giảm đau, thuốc chống ho, tiêu chảy, chống viêm, chống ung thư, chống vi khuẩn, hạ

sốt, chống loét sinh dục, diệt tinh trùng, tim mạch [5, 6].

Lõi gỗ của cây Sưa ở Việt Nam có giá trị kinh tế cao và được cho là có được sử

dụng làm thuốc hiệu dụng. Đã có một số nghiên cứu ở Trung Quốc cho thấy lõi gỗ

của loài Sưa Hải Nam Dalbergia odorifera được sử dụng để điều trị các bệnh về tim

mạch như suy tim, viêm cơ tim, nhồi máu cơ tim và xơ vữa động mạch [7, 8].

Các nghiên cứu hóa học về các loài Dalbergia tập trung là nghiên cứu bộ phận

gỗ và lá. Thành phần hóa học của các loài Dalbergia rất đa dạng và phong phú, ngoài

lớp chất chính flavonoid như flavone, isoflavone, neoflavone, flavanone

isoflavanone, isoflavanone glycosid. Ngoài ra còn có các phenol, phytosterol,

sesquiterpen cùng các dẫn xuất của coumestan và coumaronochromone [9-12]. Ngoài

ra, các loài Dalbergia còn sở hữu các tác dụng sinh học quý khác như tái tạo xương,

2

làm giãn động mạch vành, chống bệnh than, chống dị ứng, chống androgen, kháng

viêm, gây độc tế bào ung thư, chống tia tử ngoại, kháng ký sinh trùng, chống oxy hóa,

điều hòa miễn dịch, diệt muỗi, ức chế enzyme Tyrosinase [12].

Loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) có hoa màu trắng, nhưng trong dân gian

thường được gọi là “Sưa Đỏ” do lõi gỗ cây nhiều năm tuổi có màu đỏ và lõi gỗ đỏ

này thường được buôn bán, săn lùng với giá trị cao bị khai thác quá mức, hiện có trong

danh mục sách Đỏ Việt Nam (2007), phân hạng ở mức nguy cấp [13].

Tuy nhiên, cho đến nay loài Sưa ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu đầy

đủ và toàn diện về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Về mặt

hóa học chỉ mới có một công trình nghiên cứu sơ bộ trong nước [14, 15].

Từ những cơ sở thực tiễn trên. Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu loài Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain) một cách hệ thống và đầy đủ, chúng tôi đã lựa chọn đề

tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) ở Việt Nam''

Với mục tiêu nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) về các mặt: thực

vật (vi phẫu, trình tự gen), thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.

Để đạt được các mục tiêu nêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau:

1. Thu mẫu của loài nghiên cứu.

2. Nghiên cứu về thực vật (vi phẫu và trình tự gen) của loài này

3. Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain):

điều chế cặn chiết và phân đoạn, phân lập các hợp chất từ cặn chiết bằng các

phương pháp sắc ký.

4. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương

pháp hóa lý hiện đại.

5. Đánh giá tác dụng sinh học: kháng khuẩn và ức chế enzym -glucosidase của cao

chiết tổng, cao chiết phân bố và một số hợp chất sạch phân lập từ cây Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) ở Việt Nam.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ ĐẬU (FABACEAE) VÀ CHI TRẮC (DALBERGIA)

1.1.1. Khái quát về họ Đậu (Fabaceae)

Theo định nghĩa của hệ thống APG (Angiosperm Phylogeny Group) thì họ

Đậu (danh pháp khoa học: Fabaceae), từ đồng nghĩa: Leguminosae (hay Fabaceae

sensu lato) là một họ trong bộ Đậu. Đây là họ thực vật có hoa lớn thứ ba, sau họ

Phong lan và họ Cúc, với khoảng 730 chi và 19.400 loài trên toàn thế giới. Các loài

đa dạng tập trung nhiều trong các phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) và phân họ Đậu

(Faboideae) [16].

Hình 1.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ở TP. Buôn Ma Thuột

1.1.2. Khái quát về chi Trắc (Dalbergia)

Theo cơ sở dữ liệu The Plant List, tính đến thời điểm 12/2018 chi Trắc

(Dalbergia) có đến 647 loài, trong đó 304 loài đã được công nhận. Ở Việt Nam hiện đã

thống kê được khoảng 27 loài [16]. Một số loài thuộc chi này có giá trị cao về gỗ như:

Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain), Trắc (Dalbergia cochinchinensis), Hồng sắc Ấn Độ

(Dalbergia latifolia) và Cẩm lai (Dalbergia oliveri).

Về mặt hình thái

Các loài thực vật thuộc chi Trắc (Dalbergia) là các cây có kích thước từ nhỏ

đến trung bình, cây gỗ, cây bụi hoặc dây leo thân gỗ. Lá kép lông chim 1 lần lẻ, mọc

cách. Hoa nhỏ, nhiều, có mùi thơm, hoa màu trắng hoặc màu kem, màu tím hoặc đôi

khi có màu đỏ, bầu có đế, noãn ít, ngắn, cong, đầu nhụy nhỏ. Quả thuôn dài hình mũi

mác, nhẵn, phẳng, lấy hạt. Hạt có hình bầu dục, dẹt và nhẵn, màu nâu sáng, không có

phôi nhũ. Rễ phổ biến là mấu nhỏ [17].

4

Về giá trị

Nhiều loài được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh khác nhau như: bệnh

phong, sốt rét, loét miệng, chảy máu cam, chảy máu nhiều, tiêu chảy, khó tiêu, xuất

huyết, bệnh thấp khớp, ghẻ lở, đau dạ dày, chấn thương, tăng chức năng của thận, làm

khai thông kinh mạch huyệt đạo, chống lão hóa, bệnh lậu, bệnh giang mai.

Một số loài được trồng vì mục đích thương mại, gỗ của chúng được sử dụng

trong các ngành công nghiệp đồ nội thất và ngoài ra chúng còn có mùi thơm.

Hình 1.2. Sản phẩm từ gỗ chi Trắc (Dalbergia)

Sự phân bố

Chi Dalbergia gồm nhiều loài phân bố chủ yếu ở Châu Á như vùng Đông Nam

Á, Tây Á, Nam Á và một phần ở Đông Bắc Á, ở Châu Mĩ, Châu Phi và một số khu vực

khác trên thế giới. Cụ thể, chúng phân bố nhiều ở các quốc gia: Indonesia, Trung Quốc,

Ấn Độ, Việt Nam, Myanmar, Brunei, Malaysia, Lào, Thái Lan, Singapore, Sri Lanka,

Brazil, Mexico, Madagascar, Costa Rica, Bolivia, Guatemala, Mexico và Panama,

Malawi, Mozambique, Tanzania, Zambia và Zimbabwe, Venezuela, Argentina,

Ethiopia, Bờ Biển Ngà, Kenya, v/v [18].

1.1.3. Tổng quan về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Được đặt tên bởi Prain, 1901. Tên khoa học (Dalbergia tonkinensis Prain). Tên

thường gọi là Sưa, Sưa trắng, Trắc bắc bộ, Trắc thối, Huỳnh đàn [17].

Về mặt hình thái

Cây gỗ trung bình hay lớn, cao 15-25 m, đường kính đạt 0,5-0,7 m. Vỏ màu

xám hay nâu xám, thịt vỏ nâu vàng, có mùi hơi tanh. Cây phân cành thấp, tán xòe

rộng. Cành dài và mảnh, khi non màu xanh, sau chuyển xám xanh. Lá kép lông chim

5

một lần lẻ, mọc cách, mang 7-17 lá chét hình trứng hay bầu dục, gốc tròn, đầu có

mũi nhọn ngắn, mặt trên xanh thẫm, dưới xanh nhạt, khi non màu xanh lá mạ, dài

4-5 cm, rộng 2,5-3 cm. Lá kép dài 15-30 cm, cuống chính màu xanh, gốc cuống hơi

phình. Cây rụng lá vào mùa đông, già chuyển màu vàng, mép lá hơi cong về phía

dưới. Cụm hoa là xim dạng chùy ở nách lá. Đài hoa hình chuông có 5 cánh xẻ thành

2 môi, đài màu xanh. Tràng hoa 5 cánh, có móng dài màu trắng. Nhị 10 hợp thành

2 bó. Ra hoa tháng 3-5, có quả tháng 9-11. Quả dẹt thuôn dài 5-7 cm, rộng 2-2,5

cm, bầu quả gần tròn, mỗi quả mang 1-2 hạt tròn dẹt nổi lên bề mặt vỏ quả. Gỗ thớ

mịn, màu sắc đỏ nâu hoặc lâu tím, vân đen bốn mặt (màu sắc rất ảo diệu), cứng,

thơm, không bị mối mọt [17, 19].

Hình 1.3. Một phần lõi gỗ, rễ và lá loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) thu ở Tp.BMT

Giá trị khoa học và bảo tồn

Đây là loài hiếm gặp trong rừng tự nhiên, được xếp vào nhóm sẽ nguy cấp

(V) theo Sách Đỏ Việt Nam (năm 1996). Được xếp vào nhóm IA, theo Nghị định

32/2006/NĐ-CP thực vật rừng nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương

mại [19].

Phân bố

Ở Việt Nam: cây Sưa phân bố chủ yếu ở Lạng Sơn, Phú Thọ, Hà Nội, Quảng Bình,

Nghệ An, Đắk Lắk [20].

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI

TRẮC (DALBERGIA) TRÊN THẾ GIỚI

Tính đến thời điểm này, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và xác

định thành phần hóa học của nhiều loài thuộc chi Trắc (Dalbergia) như: Dalbergia

6

oliveri, Dalbergia parvifolia, Dalbergia sisso, Dalbergia volubilis, Dalbergia

frutescens, Dalbergia odorifera, v/v. Trong số đó thì loài Dalbergia lanceolaria

(Pakistan và Bangladesh) được nghiên cứu đầu tiên vào năm 1967 bởi Malhotra và

cộng sự, đã phân lập được hợp chất lanceolarin từ rễ loài này. Có khoảng 17 loài đã

được nghiên cứu về hóa học (đã tìm thấy 235 hợp chất, trong đó có 40 chất mới từ

các loài thuộc chi này). Trong số đó loài Dalbergia odorifera (Trung Quốc) và loài

Dalbergia parviflora (Ấn Độ) được nghiên cứu nhiều nhất, bộ phận được nghiên cứu

nhiều nhất là lõi gỗ.

Hầu hết đại đa số các hợp chất được tách ra từ chi Dalbergia là các hợp chất

phenolic. Đặc biệt đại đa số các hợp chất phenolic đó thì phần lớn ở dạng khung

flavonoid (lớp chất chính, khoảng 142 chất thuộc lớp chất này đã được tách ra), bao

gồm nhiều loại khung đặc trưng như: isoflavone, isoflavanone, flavanone, isoflavan,

flavan, chalcon, uron. Ngoài ra còn có một số các lớp chất phenolic khác như: diary

propanoid, dẫn xuất coumarin và lignan.

Sau đây là bảng chúng tôi đã thống kê lại các loài trong chi Trắc (Dalbergia) trên thế

đã được nghiên cứu về thành phần hóa học tính đến 12/2018 (bảng 1.1).

Bảng 1.1. Các loài đã được nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Trắc

(Dalbergia) trên thế giới (bao gồm tên loài, bộ phận và vùng lấy mẫu)

Bộ phận Vùng lấy mẫu

Tên loài D. oliveri D. volubilis D. retusa D. odorifera D. coromandeliana D. nigra Vỏ Hoa Lõi gỗ Lõi gỗ Lá Lá

Stt 1 2 3 4 5 6 7 D. odorifera T. Chen Rễ, lõi gỗ Vỏ thân 8 D. frutescens East Indies Bangladesh Costa Rica China India Brazil China Argentina TLTK [21, 22] [23] [24] [12, 25, 26, 27, 28, 29] [29] [30] [31, 32] [33]

D. sissoo [34] Lá 9 Bangladesh and Pakistan

Vỏ D. cultrata India, Thai Lan [12,35] 10

Vỏ D. nigrescens India, Thai Lan [12, 35] 11

7

12 13 14 15 16 17 D. louveliti D. congestiflora D. candenatensis D.parviflora D. melanoxylon D. sissoides Lõi gỗ Lõi gỗ Lõi gỗ Lõi gỗ Lõi gỗ Lõi gỗ Madagascar Mexico Indonesia Borneo Angola India [36] [37] [38] [12, 39, 40, 41, 50] [43] [44]

Hợp chất phenolic thiên nhiên bao gồm một dãy lớn những hợp chất hữu cơ có

vòng benzene liên kết trực tiếp với một hay nhiều nhóm hidroxyl. Hợp chất phenolic

đơn giản nhất là phenol, còn lại là các polyphenol. Trong số các hợp chất phenolic

thì các hợp chất khung flavonoid chiếm phần lớn. Đơn vị cơ bản của flavonoid bao

gồm 15 carbon (C6-C3-C6 ). Tùy theo mức độ oxid hóa của mạch 3C, sự có mặt hay

khiếm diện của nối đôi giữa C-2 và C-3 và nhóm carbonyl ở C-4 mà người ta phân

biệt flavonoid thành các dạng khung sau: flavane, isoflavane, neoflavan, flavanone,

flavone, isoflavone, neoflavone, chalcon, auron [45].

Ngoài ra còn các hợp chất phenolic còn các dạng khung: lignan (C6-C3)2,

biflavonoid (C6-C3-C6)2, tannin (C6-C3-C6)n.

Dựa trên cơ sở phân loại đó, khoảng 200 hợp chất gồm các phenolic phân lập

từ chi Trắc (Dalbergia) có dạng khung C6-C3-C6 (flavonoid) cùng với các hợp chất

phenolic khác được được chúng tôi thống kê dưới đây:

1.2.1. Hợp chất khung flavan

Flavan là một trong những khung của lớp chất flavonoid. Các hợp chất này được

tách chiết chủ yếu từ lõi gỗ 2 loài như: D. odorifera và D. candenatensis.

Tác giả An và cộng sự trong bài công bố năm 2008 đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất từ lõi gỗ loài D. odorifera trong đó có 1 chất mới: (2S)-6,7,4′-

trihydroxyflavan (1) cùng với 1 hợp chất đã biết: (2S)-6,4′-dihydroxy-7- methoxyflavan (1a)].

Năm 2009, Cheenpracha và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp

chất từ lõi gỗ loài D. candenatensis trong đó có 1 chất mới: candenantein E (1b).

8

Bảng 1.2. Các hợp chất flavan từ chi Trắc (Dalbergia)

Kí hiệu Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK

(2S)-6,7,4′-trihydroxyflavan D. odorifera Lõi gỗ [46] 1

(2S)-6,4′- dihydroxy-7- D. odorifera Lõi gỗ [12] 1a methoxyflavan

Candenatenin E D. candenatensis Lõi gỗ [38] 1b

(2S)-6,7,4′-trihydroxyflavan (1)

R1=OH, R2=R3=H

(2S)-6,4-dihydroxy-7-methoxyflavan (1a)

R1=OCH3, R2=R3=H Candenantein E (1b) R1=H, R2=R3=OCH3

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung flavan

1.2.2. Hợp chất khung isoflavan

Các hợp chất isoflavan phân lập từ chi Dalbergia chủ yếu từ các loài như D. odorifera,

D. parviflora, D. congestiflora, v/v, khá phong phú. Tác giả Yahara và cộng sự trong bài

công bố năm 1989, phân tách trên cột silicagel với các dung môi rửa giải khác nhau đã phân

lập và xác định cấu trúc của 12 chất trong đó có 5 chất từ lõi gỗ loài D. odorifera: (3R)-

vestitol (2), (3R)-claussequinone (3), (3R)-5′-methoxyvestitol (4), (3R)-3′,8-

dihydroxyvestitol (5), (3R,4R)-trans-2′,3′,7-trihydroxy-4′-methoxy-4[(3R)-2′,7-

dihydroxy-4′-methoxyisoflavan-5′-y]isoflavan (6).

Còn từ rễ của loài D. odorifera, có 9 hợp chất đã được phân lập trong đó có 3

isoflavan: odoriflavene (7), (3R)-5′-methoxyvestitol (4), (3R)-vestitol (2).

Từ năm 2004 đến năm 2012, nhóm tác giả Yu, Huerta, Umehara, Songsiang và

cộng sự đã phát hiện được 6 hợp chất khung isoflavan trong đó có 1 chất mới là

vestitol [69′′, 7-O7′′] obtusaquinone (8) và 5 hợp chất đã biết: (3R)-vestitol (2),

(3R)-mucronulatol (9), (3R)-5′-methoxyvestitol (4), và duartin (10). Các isoflavan

chiết tách từ các loài thực vật chi Dalbergia được trình bày trong bảng 1.3.

9

Bảng 1.3. Các hợp chất isoflavan từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Bộ Tên hợp chất Loài thực vật TLTK phận hiệ u

D. parviflora (3R)-vestitol Lõi gỗ [25, 26, 31, 41] 2 D. odorifera

(3R)-claussequinone D. odorifera Lõi gỗ [25] 3

D. parviflora Lõi gỗ, (3R)-5′-methoxyvestitol [41, 47] 4 D. odorifera rễ

(3R)-3′,8-dihydroxyvestitol D. odorifera Lõi gỗ [25] 5

(3R, 4R)-trans-2′,3′,7- trihydroxy-4′-

methoxy-4[(3R)-2′,7- D. odorifera Lõi gỗ [25] 6 dihydroxy-4′-

methoxyisoflavan-5′-

yl]isoflavan

D. odorifera Rễ [47] 7 Odoriflavene

D. Lõi gỗ [12] 8 Vestitol[6  9′′,7-O 7′′]obtusaquinone congestiflora

D. oliveri (3R)-mucronulatol Lõi gỗ [20, 23, 40, 41] 9 D. parviflora

D. parviflora Lõi gỗ [40] 10 Duartin

(3R)-vestitol (2) (3R)-5′- (3R)-3′,8- Odoriflavene (3R)-

R1=OH methoxyvest dihydroxyves mucronul (7)

R2=R3=R4=H itol (4) titol (5) R1=OH atol (9)

R1=OH R1=R2=R4=O R2=OCH3 R1=OCH3,

R2=R4=H H R3= R4=H R2=OH

R3=OCH3 R3=H R3=R4=H

10

Duartin (10) R1=R4=O CH3 R2=OH, R3=H

(3R)- claussequinone (3)

vestitol[6  9′′,7-O 7′′]obtusaquino ne (8) (3R,4R)-trans-2′,3′,7- trihydroxy-4′-

methoxy-4[(3R)-2′,7- dihydroxy-4′- methoxyisoflavan-5′- yl]isoflavan (6)

Hình 1.5. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavan

1.2.3. Hợp chất khung neoflavan

Tác giả Bezuidenhoudt và cộng sự trong bài báo công bố năm 1984 đã phân lập và xác định cấu trúc của 1 hợp chất từ thân gỗ loài D. nitidula: 1-(3S,4S)-3,4- trans-2′,7-dihydroxy-4′-methoxy-4-[(3S)-2′,7-dihydroxy-4′-methoxyisoflavan-5′- yl]isoflavan (14) [12].

Bảng 1.4. Các hợp chất neoflavan từ chi Trắc (Dalbergia)

Tên hợp chất Bộ phận TLTK Loài thực vật Ký hiệu

D. nitidula Lõi gỗ [12] 11

1-(3S,4S)-3,4-trans-2′,7-dihydroxy- 4′-methoxy-4-[(3S)-2′,7-dihydroxy- 4′-methoxyisoflavan-5′-yl]isoflavan

1-(3S,4S)-3,4-trans-2′,7-dihydroxy-4′-methoxy-4-[(3S)- 2′,7- dihydroxy-4′-methoxyisoflavan-5′-yl]isoflavan (11)

Hình 1.6. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ khung neoflavan

1.2.4. Hợp chất khung flavanol

Qua tổng hợp tài liệu, có 2 chất thuộc nhóm này được báo cáo phân lập từ chi

Trắc (Dalbergia). Năm 1989, Nunes và cộng sự đã phân lập 2 flavanol từ vỏ loài D.

11

monetaria: epifisetinidol-(4→8)-epicatechin (12) và epiguibourtinidol-(4→8)-

epicatechin (13) [14].

Bảng 1.5. Các hợp chất flavanol từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

Epifisetinidol-(4→8)- 12 epicatechin D. monetaria Vỏ [12] Epiguibourtinidol-(4→8)- 13 epicatechin

Epifisetinidol-(4→8)-epicatechin (12)

R=OH Epiguibourtinidol-(4→8)-

epicatechin (13) R=H

Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất khung flavanol

1.2.5. Hợp chất khung flavanone

Flavanone là một trong những khung chính của lớp chất flavanoid, chúng được

tìm thấy chủ yếu ở các 2 loài D. odorifera và D. parviflora. Các hợp chất naringenin

(14), liquiritigenin (15), butin (16) được phân lập từ lõi gỗ loài D. odorifera. Bên

cạnh đó trong thành phần loài D. odorifera có chứa rất nhiều flavanone khác như:

4′,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavanone (17), (2S)-6,4′-dihydroxy-7-

methoxyflavanone (18), carthamidin (19), eriodictoyl (20), (2S)-3′,5,5′,7-

tetrahydroxyflavanone (21), (2S)-pinocembrin (22), (2S)-7-methoxy-4′,6-

dihydroxyisoflavanone (23) và (2S)-pinostrobin (24).

12

Ở một số bộ phân khác như lá, rễ và thân gỗ, 3 hơp chất: naringenin (14),

sophoraflavanone A (25), liquiritigenin (15) cũng được phân lập từ các loài D.

parviflora, D. candenatensis, D. stevensonii, v/v.

Các hợp chất naringenin (14), liquiritigenin (15), alpinetin (26), hesperetin

(27), (2S)-pinocembrin (22) cũng được phân tách từ lõi gỗ loài D. parviflora.

Các flavanone được tách ra từ các loài thực vật chi Dalbergia được trình bày

trên bảng 1.6 như sau:

Bảng 1.6. Các hợp chất flavanone từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

D. odorifera [40, Naringenin Lõi gỗ 14 D. parviflora 48]

D. oliveri [12, Liquiritigenin D. parviflora Lõi gỗ 15 40, 48] D. odorifera

Butin D. odorifera Lõi gỗ [48] 16

4′,5,7-trihydroxy-3- D. odorifera Lõi gỗ [12] 17 methoxyflavanone

(2S)-6,4′-dihydroxy-7- D. odorifera Lõi gỗ [12] 18 methoxyflavanone

Carthamidin D. odorifera Lõi gỗ [26] 19

Eriodictoyl D. odorifera Lõi gỗ [12] 20

(2S)-3′,5,5′,7- D. odorifera Lõi gỗ [49] 21 tetrahydroxyflavanone

D. parviflora [40, (2S)-pinocembrin Lõi gỗ 22 D. odorifera 49]

13

(2S)-7-methoxy-4′,6- D. odorifera Lõi gỗ [49] 23 dihydroxyisoflavanone

(2S)-pinostrobin D. odorifera Lõi gỗ [49] 24

sophoraflavanone A D. candenatensis Lõi gỗ [38] 25

Alpinetin D. parviflora Lõi gỗ [12] 26

Hesperetin D. parviflora Lõi gỗ [12] 27

Tên chất R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7

Naringenin (14) OH H OH H OH H H

Liquiritigenin (15) H H OH H H OH H

Butin (16) H H OH OH OH H H

4′,5,7-trihydroxy-3- OH H OH H H OH OCH3

methoxyflavanone (17)

(2S)-6,4′-dihydroxy-7- H OH OCH3 H OH H H

methoxyflavanone (18)

Carthamidin (19) OH OH OH H OH H H

Eriodictoyl (20) OH H OH OH OH H H

(2S)-3′,5,5′,7- OH H OH OH H OH H tetrahydroxyflavanone (21)

(2S)-pinocembrin (22) H H H OH H OH H

(2S)-7-methoxy-4′,6- H OH H H H OH OCH3 dihydroxyflavanone (23)

(2S)-pinostrobin (24) H H H OH H H OCH3

SophoraflavanoneA (25) H OH H OH H OH Geranyl

H H H H Alpinetin (26) OCH3 H OH

H H Hesperetin (27) OH H OH OCH3 OH

14

1.2.6. Hợp chất khung isoflavanone

Từ năm 1972 đến năm 2011, có 15 isoflavanone được được phân lập và xác định cấu trúc bởi nhóm tác giả Adinarayana, Donnelly, Chan, v/v. Các hợp chất được

tách ra chủ yếu từ lõi gỗ của 6 loài: D. parviflora, D. paniculata, D. louvelii, D.

odorifera, D. stevensonii và D. oliveri.

Có 4 hợp chất mới đã được thấy: tìm

(3R)-7,2′-dihyroxy-4′,5′- dimethoxyisoflavanone (28), dalparvin A (29), dalparvin B (30), (3R)-sativanone (31).

Bên cạnh đó một số hợp chất đã biết: 3′-O-methylviolanone (32), (3R)-violanone (33),

(3R)-vestitone (34), (3S)-secundiflorol H (35), (3R)-2′,3′,7-trihydroxy-4′-

methoxyisoflavanone (36), dalparvin (37), lanceolarin (38), kenusanone G (39) và (3R)-

4′-methoxy-2′,3,7-trihydroxyisoflavanone (40) cũng được phân lập.

Các isoflavanone này không chỉ được tách ra từ bộ phận lõi gỗ mà chúng còn

được tìm thấy ở hạt, vỏ và thân gỗ của các loài. Một số hợp chất đã được phân lập

như: dalpanin (41) và onogenin (42).

Bảng 1.7. Các hợp chất isoflavanone từ chi Trắc (Dalbergia)

Tên hợp chất

Loài thực vật

Bộ phận

TLTK

Ký hiệu

D. louvelii

Lõi gỗ

[12]

28

(3R)-7,2′- dihyroxy-4′,5′- dimethoxyisoflavanone Dalparvin A Dalparvin B (3R)-sativanone 3′-O-methylviolanone

Lõi gỗ Lõi gỗ Lõi gỗ Lõi gỗ

[39] [29] [26, 41] [41, 50]

29 30 31 32

(3R)-violanone

Lõi gỗ

[47, 48]

33

D. parviflora D. parviflora D. odorifera D. odorifera D. odorifera D. parviflora D. odorifera D. parviflora

Thân gỗ Vỏ

[26] [50]

34 35

[25]

D.odorifera T. Chen

Lõi gỗ

36

D. parviflora D. odorifera D. parviflora

Lõi gỗ Thân gỗ Lõi gỗ

[41] [12] [39]

37 38 39

D. odorifera

Lõi gỗ

[12]

40

(3R)-vestitone (3S)-Secundiflorol H (3R)-2′,3′,7-trihydroxy-4′- methoxyisoflavanone Dalparvin Lanceolarin Kenusanone G (3R)-4′-methoxy-2′,3,7- trihydroxyisoflavanone Dalpanin Onogenin

D. paniculata D. stevensonii

Hạt Lõi gỗ

[12] [12]

41 42

15

Tên chất

TLTK

R1

R2

R3

R4

R5

R6

(3R)-7,2′- dihyroxy-4′,5′-

H

OH

H

H

H

[12]

OCH3

dimethoxyisoflavanone (28)

H

Dalparvin A (29)

OH

H

OH

H

[39]

OCH3

Dalparvin B (30)

H

H

H

H

[39]

OH OCH3

H

(3R)-sativanone (31)

H

H

H

H

[26, 41]

OCH3

H

H

3-O-methylviolanone (32)

H

H

[41, 50]

OCH3 OCH3

(3R)-violanone (33)

H

H

H

H

[47, 48]

OCH3 OH

H

OH

(3R)-vestitone (34)

H

H

H

H

[12]

H

H

H

[50]

(3S)-Secundiflorol H (35)

OH

OCH3 OH

H

H

H

H

[25]

OH

OH

(3R)-2′,3′,7-trihydroxy-4′- methoxyisoflavanone (36)

H

H

H

[41]

OH

H

OCH3

OH

H

H

H

[12]

H

H

Dalparvin (37) Lanceolarin (38)

Kenusanone G (39)

H

H

H

H

[39]

OH

H

(3R)-4′-methoxy-2′,3,7-

H

H

H

H

[12]

OH

H

trihydroxyisoflavanone (40)

Onogenin (42)

Dalpanin (41)

Hình 1.8. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanone

1.2.7. Hợp chất khung flavanonol

Nhóm tác giả Donnelly, Umehara, Songsiang và cộng sự đã phân lập được 50

hợp chất trong đó đã phát hiện được 4 flavanonol bao gồm 1 hợp chất mới là:

dalparvinol C (43) và 3 hợp chất đã biết: 3,5,7-trihydroxyflavonol (44), ericibenin D

(45), alpinetin (46). Các flavanonol được tách từ các loài thực vật chi Dalbergia được

tóm tắt ở bảng 1.8.

16

Bảng 1.8. Các hợp chất flavanonol từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

D. parviflora Lõi gỗ [39] 43 Dalparvinol C

3,5,7-trihydroxyflavonol D. parviflora Thân gỗ [50] 44

D. parviflora Thân gỗ [41] 45 Ericibenin D

7-hydroxy-5- D. parviflora Thân gỗ [50] 46 methoxydihydroflavonol

Dalparvinol C (43)

R1= R5=OCH3, R2= R4=OH, R3=H

3,5,7-trihydroxyflavonol (44)

R1=R2=H, R3=OH, R4=OCH3

Ericibenin D (45)

R1=OCH3, R2=R5=OH, R3= R4=H

7-hydroxy-5-

methoxydihydroflavonol (46)

R1=R2= R4=H, R5=OH, R3=OCH3

Hình 1.9. Cấu trúc các hợp chất khung flavanonol

1.2.8. Hợp chất khung isoflavanonol

Các isoflavanonol được tách ra chủ yếu từ lõi gỗ của các loài D. odorifera, D.

parviflora và loài D. melanoxylon. Trong những năm gần đây từ 2008 đến 2013 đã

có 6 isoflavanonol được phân tách bởi nhóm tác giả Umehara, Zhao, Lee và Mutai

cùng các cộng sự bao gồm 1 hợp chất mới là dalparvin C (47) và các hợp chất đã biết:

(3R)-2′,3,7-trihydroxyisoflavanone (48), (3S)-2′,4′-dimethoxy-3,7-

dihydroxyisoflavanone (49), isodalparvinol B (50), kenusanone F7-methyl ether (50)

và sophoronol-7-methyl ether (51).

17

Bảng 1.9. Các hợp chất isoflavanonol từ chi Trắc (Dalbergia)

TLT Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận K hiệu

dalparvin C D. parviflora Lõi gỗ [ 39] 47

D. odorifera Lõi gỗ [26, (3R)-2′,3,7-trihydroxyisoflavanone 48 D. parviflora Thân gỗ 49]

(3S)-2′,4′-dimethoxy-3,7- D. odorifera Lõi gỗ [49] 49 dihydroxyisoflavanone

isodalparvinol B D. parviflora Lõi gỗ [39] 50

kenusanone F7-methyl ether D. melanoxylon Lõi gỗ [43] 51

sophoronol-7-methyl ether D. melanoxylon Lõi gỗ [43] 52

Dalparvin C (47) (3S)-2′,4′-dimethoxy-3,7- Kenusanone F 7- Sophoronol-7-

R=OCH3 dihydroxyisoflavanone methyl ether (51) methyl ether (52)

(49) R1=OCH3, R2=H

(3R)-2′,3,7- Isodalparvinol B (50)

trihydroxyisoflavan R1= R2=OH

one (48) R=H

Hình 1.10. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavanonol

1.2.9. Hợp chất khung flavone

Trong khoảng thời gian từ năm 1988 đến năm 2000, nhóm tác giả

Bezuidenhoudt, Borai, Wang và cộng sự đã phân lập được 3 flavone từ lõi gỗ, lá và

rễ của 3 loài: D. nitidula, D. stipulacea và D. odorifera.

Vestitol-(5′→2)-2′-hydroxyformononetin (53) là hợp chất đầu tiên phân lập và

xác định cấu trúc bởi Bezuidenhoudt và cộng sự.

18

Sau đó, luteolin (54) và 4′,5,7- trihydroxy-3-methoxyflavone (55) được phát

hiện từ các loài trên và chúng có cấu tạo chung như sau:

Bảng 1.10. Các hợp chất flavone từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

Vestitol-(5′→2)-2′- D. nitidula Lõi gỗ [12] 53 hydroxyformononetin

Luteolin D. stipulacea Lá [12, 51] 54

4′,5,7- trihydroxy-3- Rễ [12, 51] 55 methoxyflavone D. odorifera T chen

(53)

Luteolin (54) R1=OCH3, R2=H

4′,5,7- trihydroxy-3-methoxyflavone

(55) R1=H, R2=OH

Hình 1.11. Cấu trúc các hợp chất khung flavone

1.2.10. Hợp chất khung isoflavone

Qua tổng hợp tài liệu, có 36 hợp chất thuộc nhóm này được báo cáo phân lập từ

chi Trắc (Dalbergia) trong đó đã phát hiện được 3 chất mới là olibergin A (68),

dalparvone (84) và dalparvone B (85). Các chất được tách ra chủ yếu từ 9 loài khác

nhau như: D. volubilis, D. retusa, D. frutescens, D. odorifera, D. louvelii, v/v.

Ngoài bộ phận được nghiên cứu nhiều nhất là lõi gỗ, chúng còn được phân lập

từ hoa, lá, vỏ và thân gỗ các loài. Đây là một dạng khung chính của chi này.

19

Bảng 1.11. Các hợp chất isoflavone từ chi Trắc (Dalbergia)

R1

R2

R3

R4

R6

R7

R8

R5

OCH3

H

OH

H

OCH3 Rha

H

H

Volubilin (56)

OCH3

H

OH

Rha OCH3

H

H

H

Isovolubilin (57)

H

OCH3

H

OH

OH

H

H

H

Retusin (58)

H

OCH3

H

OH OCH3

H

H

H

H

H

OCH3

OH

H

OH

H

H

H

OH

H

H

OH

H

H

H

8-O-methylretusin (59) 3’-methoxydaidzein (60) Daidzein (61)

OH

OCH3

H

H

OH

H

H

H

Biochanin (A) (62)

H H H H

OH OCH3 OCH3 OH

OH OH OH OH OH OH

H H H H H H

OH H H H OCH3 OCH3 H OCH3 OH

OH

H OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 H

H H H H OCH3 OCH3

H H OH H H H

Genistein (63) Castanin (64) Odoratin (65) Glycitein (66) Caviunin (67) OliberginA (68)

H

OH

H

OCH3

H

H

H

H

Formononetin (69)

H

OH

H

OCH2O

H

H

H

H

TLT K [12, 23] [12, 23] [12, 24] [12, 24] [31, 41] [33, 49] [33, 34] [12] [33] [33] [33] [34] [49, 52] [33, 49] [33]

H

H H

OH OH

H H

OCH2O OH

H OCH3 H

OCH3 H

H H

[33] [12]

OCH3 OH

OCH3

H

H

H

OH

H

[21, 41]

Pseudobaptogenin (70) Cuneatin (71) 7,4′-dihydroxy-3′- methoxyisoflavone (72) 3′,7-dihydroxy-2′,4′- dimethoxyisoflavone (73) Khrinones A (74)

OH

H

OCH3

OH

H

H

OH

H

[41]

OCH3

H

OCH3

H

H

H

OH

H

20

2′-ethoxyformononetin (75) Calycosin (76) Khrinone B (77) Khrinone C (78)

OH H OH H OCH3 OH

OCH3 OCH3 OCH3

H H OH OH OH H

H H H

OH OH OH

H H H

[41, 49] [41] [41] [41]

Khrinone D (79)

OCH3

OCH2O

H

OH

H

OH

H

[41]

H

7-demethylrobustigenin

OCH3

OCH3 OCH3 OH

H

OH

H

[41]

H

(80)

Theralin (81)

OCH3

OH

H

OH

H

OH

H

[41]

H

2’-methoxybiochanin

OCH3

OCH3

H

OH

H

OH

H

[41]

H

A (82)

Pratensein (83)

H

H

OCH3

OH OH

H

OH

H

[34,

41]

Dalparvone (84)

OCH3

OCH3

OH OH

H

OH

H

[40]

H

Dalparvone B (85) OCH3

OH

OH OH

H

OH

H

[50]

H

5,7,3′,4′-

H

OH

OH

H

OH

H

OH

H

[50]

tetrahydroxyisoflavo

ne (86)

2′-hydroxybiochanin

OH

H

OCH3

H

OH

H

OH

H

[50]

A (87)

Tectorigenin (88)

H

OH

OCH3 H

OCH3

OH

H

[41]

H

Cajanin (89)

OH

OH

H

H

H

OH

H

[39]

H

Fujikinetin (90)

H

OCH2O

H

H

OCH3

OH

H

[33]

H

21

Olibergin B (91) 5-hydroxybowdichione (92) Bowdichione (93)

Hình 1.12. Cấu trúc các hợp chất khung isoflavone

1.2.11. Hợp chất khung neoflavone

Từ 2 loài D. sissoo và D. congestiflora 2 hợp chất neoflavone được phân lập.

Năm 1971, Mukerjee và cộng sự đã phân tách được hợp chất dalbergichromene (94)

từ vỏ và lõi gỗ loài D. sissoo. Đến năm 2004, Barragán- Huerta và cộng sự cũng

phân lập và xác định cấu trúc hóa học 1 hợp chất có cấu tạo phức tạp hơn là:

neocandenatone (95).

Bảng 1.12. Các hợp chất neoflavone từ chi Trắc (Dalbergia)

Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK

Dalbergichromene Neocandenatone D. sissoo D. congestiflora Lõi gỗ Lõi gỗ [12] [12] Ký hiệu 94 95

Dalbergichromene (94) Neocandenatone (95)

Hình 1.13. Cấu trúc các hợp chất khung neoflavone

1.2.12. Hợp chất khung 4-aryl-coumarin

Từ năm 1968 đến năm 2010, đã có 14 hợp chất thuộc khung 4-aryl-coumarin

được phân lập và xác định cấu trúc bởi nhóm tác giả Chan, Liu, Kite,v/v. Các chất

tách ra chủ yếu là từ bộ phận lõi gỗ, ngoài ra còn phân lập từ lá và thân gỗ.

Trong số các loài thuộc chi này, phải kể đến 7 loài được nghiên cứu nhiều như: D.

cultrata, D. nigra, D. volubilis, D. odorifera, D. sissoo, D. Baronii và D. stevensonii .

Các hợp chất được phân lập từ các loài này có cấu tạo chung như sau:

22

R4 R5 TLTK R2 R3 R1

Melannein (96) OCH3 OH [12] H OH H

4-Phenylcoumarin H H [12] H H H (97)

Isodalbergin (98) OCH3 OH H H [51] H

[12, Nordalbergin (99) H H OH OH H 53]

Dalbergin (100) H H [12] OH OCH3 H

Stevenin (101) H [12] OH OCH3 OH H

Volubolin (102) H OH OH OCH3 [12] H

Seshadrin (103) H OH OH OCH3 [12] OCH3

Voludal (104) OH CHO OH OCH3 [12] OCH3

7,3′-dihydroxy-5,4′-

dimethoxy-6-

formyl-4- OCH3 CHO OH OH OCH3 [12]

phenylcoumarin

(105)

7,3′-dihydroxy-4′-

methoxy-4- H H OH OH OCH3 [12] phenylcoumarin

(106)

23

3'-

Hydroxymelanettin OH OCH3 OH OH [12] H

(107)

Melanettin (108) H OH OCH3 H OH [12]

[51, Dalnigrin (109) H OH OCH3 H OCH3 53]

Hình 1.14. Cấu trúc các hợp chất khung 4-aryl-coumarin

1.2.13. Hợp chất khung aurone

Aurone là một dạng khung đặc biệt, chỉ tìm thấy 1 hợp chất duy nhất. Vào

năm 2011, Zhao và cộng sự đã phân lập được hợp chất sulfuretin (110) từ lõi gỗ

của loài D. odorifera có công thức cấu tạo như sau [12]:

Sulfuretin (110)

Hình 1.15. Cấu trúc các hợp chất khung aurone

1.2.14. Hợp chất khung chalcone

Qua tổng hợp tài liệu thấy rằng, các hợp chất thuộc khung chalcone được phân

lập tương đối ít, bộ phận nghiên cứu chủ yếu ở đây là lõi gỗ của loài D. odorifera.

Chỉ có 7 hợp chất được xác định công thức hóa học, trong số đó có 1 chất mới là

4,2′,5′-trihydroxy-4′-methoxychalcone (115).

Bảng 1.13. Các hợp chất chalcone từ chi Trắc (Dalbergia)

Ký Tên hợp chất Loài thực vật Bộ phận TLTK hiệu

α,2′,3,4,4′- [49] D. odorifera Lõi gỗ 111 pentahydroxydihydrochalcone

24

α,2′,4,4′- D. odorifera Lõi gỗ [49] 112 tetrahydroxydihydrochalcone

Butein D. odorifera Lõi gỗ [29, 49] 113

2′-O-methylisoliquilitigenin D. odorifera Lõi gỗ, rễ [25, 47] 114

4,2′,5′-trihydroxy-4′- D. odorifera Lõi gỗ [46] 115 methoxychalcone

D. oliveri

Isoliquiritigenin D. louvelii Lõi gỗ [12, 41] 116

D. odorifera

4′-hydroxy-2′-methoxychalcone D. cochinchinesis Lõi gỗ [17, 54] 117

Công thức cấu tạo của các hợp chất chalcone được mô tả chi tiết ở hình 1.16.

α,2′,3,4,4′-pentahydroxydihydrochalcone

(111)

α,2′,4,4′- tetrahydroxydihydrochalcone (112)

TLTK

R1

R2 R3

R4

R5

R6

Butein (113)

OH OH OH

OH

H

H

[29, 49]

2′-O-methylisoliquilitigenin

H

OH H

OH

[25, 47]

H OCH3

(114)

4,2′,5′-trihydroxy-4′-

H

H

[46]

OH OH OCH3 OH

methoxychalcone (115)

25

Isoliquiritigenin (116) 4′-hydroxy-2′-methoxychalcone

(117)

Hình 1.16. Cấu trúc các hợp chất khung chalcone

Để thấy được sự đa dạng về thành phần hóa học của chi Trắc (Dalbergia), bên

cạnh việc nghiên cứu lớp chất chính flavonoid, chúng tôi còn tìm hiểu một số hợp

chất được tách ra từ các khung khác như: diaryl propanoid, cumarin và dẫn xuất,

lignan, terpenoid, benzophenon và một số lớp chất khác.

1.2.15. Lớp chất diaryl propanoid

Trong những năm 1978 đến 2011, từ lõi gỗ của 7 loài: D. candenatensis, D.

odorifera, D. parviflora, D. cultrata, D. nigrescens, D. retusa, D. louvelii đã phát

hiện được 66 hợp chất trong đó có 19 diaryl propanoid. Một số hợp chất diaryl

propanoid đặc trưng như: dalberatin A (118), dalberatin B (119), dalberatin C (120),

dalberatin D (121) và dalberatin E (122). Trong đó dalberatin A (118) và dalberatin

B (119) là 2 hợp chất mới được tìm thấy [35].

Năm 2009 công bố của 4 tác giả Cheenpracha, Choi, Umehara, Songsiang và

cộng sự đã phân lập được 6 diaryl propanoid từ lõi gỗ các loài D. candenatensis, D.

odorifera, D. parviflora trong đó có 4 hợp chất mới là candenatenin A (123) [35],

candenatenin B (124), candenatenin C (125) và candenatenin D (126) [38] và 1 hợp

chất đã biết là hydroxyobustyrene (127) [41].

Ngoài ra, một số các hợp chất thuộc lớp chất này cũng được phân lập như:

isomucronustyrene (128), xenognosin A (129), obtusanstyrene (130), obtustyrene (131)

và dalparvinene B (132) cũng được tìm thấy [24, 50].

1.2.16. Lớp chất cumarin và dẫn xuất

26

Dalberatin A (118) Dalberatin B Dalberatin C Dalberatin E Dalberatin D

R1= R5=OCH3 (119) (121) (122) (120)

R2= R4=OH, R3=H R1= R4=OH R1= R5=OH R1=OCH3 R1=

R2=H R4=OCH3 R2=H R1=H

R3= R5=OCH3 R2= R5=OH R3= R2= R4=R5=OH

R3=H R4=OCH3

Candenatenin A( 123) Candenatenin B Candenatenin D (126)

(124) R=H

Candenatenin C(125)

R=OCH3

Hydroxyobustyrene (127) R1=H, R2=H2,

R3=OCH3, R4=OH

Isomucronustyrene Xenognosin A Obtusanstyrene Obtustyrene Dalparvinene

B (132) (128) (129) (130) (131)

R1= R2=H, R4=OH R1= R3=OH R1= R2= R4= R1= R2= R1= R4=H

R3= R5=OCH3 R2= R4=H R5=H R4=H R2=OCH3

R5=OCH3 R3=OH R3= R5=OH

27

R3=OH

R5=OCH3

Hình 1.17. Cấu trúc các hợp chất diaryl propanoid

Donnelly và cộng sự (1974) đã phân lập 5 hợp chất từ lõi gỗ loài D. oliveri, trong đó

có chất: 7,2′-dihydroxy-4′-methoxy-3-phenylcoumarin (133) [22].

Beldjoudi và cộng sự (2003) đã phân lập 1 hợp chất mới từ lõi gỗ loài D.

louvelii: 3-(2,4-dihidroxy-5-methoxy) phenyl-7-hydroxycoumarin (134) [12].

7,2′-dihydroxy-4′-methoxy-3-

phenylcoumarin

(133) R1=H, R2=OCH3

3-(2,4-dihidroxy-5-methoxy)phenyl-7-

hydroxycoumarin (134) R1=OCH3, R2=OH

Hình 1.18. Cấu trúc các hợp chất cumarin và dẫn xuất

1.2.17. Lớp chất lignan Lignan là một lớp chất tồn tại phổ biến trong tự nhiên. Về mặt cấu tạo chúng

được tạo bởi 2 đơn vị phenyl propanoid.

Donnelly và cộng sự (1973) đã phân lập 1 hợp chất từ lõi gỗ loài D.

stevensonii: medicarpin (135) [31, 40].

Chawla và cộng sự (1976) đã phân lập 1 hợp chất từ hoa và lõi gỗ loài D. volubilis

và D. congestiflora : (+)-(6aS,11aS)–3-acetoxy-9-methoxypterocarpan (136) [35].

Songsiang và cộng sự (2011), đã phân lập từ lõi gỗ loài D. parviflora được 15 hợp

chất, trong đó có 2 chất: 4-hydroxy-3-methoxy-8,9-methylenedioxypterocarpan

(137) và 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) [49].

Medicarpin (135)

28

4-hydroxy-3-methoxy- 3,8-dihydroxy-9-

8,9- methoxypterocarpan

methylenedioxypterocarp (138)

an (137) R1= R3=OH, R2=OCH3, (+)-(6aS, 11aS) –3-acetoxy-

R1= R3=OCH3, R2= R4=H 9-methoxypterocarpan (136)

R4=OH

Hình 1.19. Cấu trúc các hợp chất ligan

1.2.18. Lớp chất benzophenon

Qua tổng hợp tài liệu cho thấy các hợp chất benzophenon được tìm thấy rất ít.

Chỉ có 2 hợp chất được phân lập: 2,4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone (139), 2-

methoxy-3-hydroxyxanthone (140), chúng được tách ra từ rễ và lõi gỗ loài D.

odorifera [25, 48].

2,4-dihydroxy-5- methoxybenzophenone (139) 2-methoxy-3- hydroxyxanthone (140)

Hình1.20. Cấu trúc các hợp chất benzophenon

1.2.19. Lớp chất terpenoid

Terpenoid cũng được tìm thấy ở Chi này. Tao và cộng sự (2010) đã phân lập

2 hợp chất terpenoid từ loài D. odorifera T. Chen là (3S,6R,7R)-3,7,11-trimethyl-3,6-

epoxy-1,10-dodecadien-7-ol (141) và (3S,6S,7R)-3,7,11-trimethyl-3,6-epoxy-1,10-

dodecadien-7-ol (142) [56].

Songsiang và cộng sự (2011), đã phân lập từ lõi gỗ loài D. parviflora được 15

hợp chất, trong đó có chất: dalberpene (143) [50].

29

(3S,6R,7R)-3,7,11- (3S,6S,7R)-3,7,11- Dalberpene (143)

trimethyl-3,6-epoxy- trimethyl-3,6-epoxy-1,10-

1,10-dodecadien-7-ol dodecadien-7-ol (142)

(141)

Hình 1.21. Cấu trúc các hợp chất terpenoid

1.2.20. Các lớp chất khác

Bên cạnh những lớp chất phenol chính được liệt kê trong các nghiên cứu ở trên,

còn có rất nhiều hợp chất phenolic dạng khung khác từ các loài Dalbergia cũng được

phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Các hợp chất được phân lập bởi nhóm tác giả

Van Heerden, Songsiang, Cheenpracha, Dixit, Kuroyanagi, v/v có công thức cấu tạo

như sau:

3-hydroxy-2,4-dimethoxybenzaldehyde (145) [28, 50] (6aR,llaR)-3,8-dihydroxy-9- methoxyptcrocarpan (144) [12]

(3R)-calussequinone (146) [28] genistein-6-C-glucoside (147) [12]

Maackiain (148) [12] Obtusafuran (149) [12]

(S)-4-methoxydalbergione (151) [12] (R)-4-methoxydalbergione (150) [36]

Cearoin (152) [27] Nutiducol (153) [12] R=Geranyl

30

Geranyl

2,4,5-trimethoxy- 3’- hydroxydalbergiqui nol (155) [49, 53]

Latifolin (154) [[12, 49]] R1= R4=H R2=CH3, R3=OH 5-O- methoxylatifolin (156) [12] R1= R2=CH3 R3=OH, R4=H 4,5-dimethoxy-2- hydroxydalbergiquinol (157) [49] R1=CH3 R2= R3= R4=H

R1= R2=CH3 R3=H, R4=OH

Latinone (158) [54] Candenatenin F (159) [38]

(E)-4-methoxy-2-(3,4-dihydroxybenzylidene)-4-oxobutanoic acid (160) [12] Hình 1.22. Cấu trúc các hợp chất khác

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI

TRẮC (DALBERGIA) Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam có 27 loài và đã có 4 loài được nghiên cứu về mặt hóa học. Đã tách ra

26 chất, trong đó có 5 hợp chất mới được tách ra [15, 17, 51]. Các nghiên cứu được chúng

tôi thống kê cụ thể (bảng 1.14).

Bảng 1.14. Danh sách các loài Dalbergia đã được nghiên cứu về thành phần hóa

học ở Việt Nam

Stt Tên loài Bộ phận TLTK Vùng lấy mẫu

31

Thân gỗ (giác và lõi) Đăk Lăk 1 D. cochinchinensis (Trắc) [17, 54]

Chưa rõ bộ phận Miền Bắc [15] 2 D. tonkinensis (Sưa)

D. vietnamensis (Trắc Gai) Thân gỗ (giác và lõi) Đăk Lăk [70] 3

D. oliveri (Cẩm Lai) Thân gỗ (giác và lõi) Đăk Lăk [64] 4

Shirota và công sự (2003), đã phân lập được 6 hợp chất từ lõi gỗ loài D. cochinchinensis. Trong đó có 3 hợp chất mới: 2-[4,5-dimethoxy-5-(3-phenyl-trans-

allyl)cyclohexa-3,6-dien-2-on-1-ylmethyl]-5-hydroxy-6-methoxy-3-

phenylbenzofuran (161), 2-[4,5-dimethoxy-2-(3-phenyl-trans-allyloxy)benzyl]-5-

hydroxy-6-methoxy-3-phenylbenzofuran (162), 2-(2-hydroxyl-1-methyl-2 -

phenylethyl)-4,5-dimethoxyphenol (163) và 3 hợp chất đã biết: 4′-hydroxy-2′-

methoxychalcone (117), latinone (158) và dalbergiphenol (164) [54].

Trần Tuấn Anh và cộng sự (2009), đã phân lập được 3 hợp chất từ loài D.

tonkinensis : genistein (63), lanceolarin (38) và 9,10-threo-3-[7-(3,10-dihydroxy-9-

hydroxymethyl-2,5-dimethoxy)-9,10- dihydrophenanthrenyl]propenal (165) [15].

Phạm Thanh Loan và cộng sự (2012) đã phân lập được 4 hợp chất từ thân gỗ

của loài D. vietnamensis (Trắc Gai), trong đó có 2 hợp chất đã biết: caviunin (67) ,

caviunin [7-O--D- apiofuranosyl-(16)--D-glucopyranoside] (166) và 2 hợp chất

mới: dalspinosin 7-O-[-D-apiofuranosyl-(16)--D-glucopyranoside] (167) và

caviunin[7-O-(5-O-trans-p-coumaroyl)--D-apiofuranosyl-(16)--D-

glucopyranoside] (168) [70].

Cùng thời gian này, Phạm Thanh Loan và cộng sự (2012) đã phân lập được 9

hợp chất từ thân gỗ của loài D. oliveri (Cẩm Lai): liquiritigenin (15), (3R)-5′-

methoxyvestitol (4), (6aS,11aS)-medicarpin (169), (6aS,11aS)-8-hydroxymedicarpin

(170), maackiain (148), formononetin (67), (3R)-violanone (33) và isoliquiritigenin

(116) và 4 hợp chất từ thân gỗ của loài D. cochinchinensis (Trắc): 5-O-methyllatifolin

(156), 2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (171), (S)-4-methoxydalbergione (151) và

obtusafuran (149) [17, 51].

32

Dalbergia cochinchinensis

2-[4,5-dimethoxy-5-(3-phenyl-

2-[4,5-dimethoxy-2-(3-phenyl-

2-(2-hydroxyl-1-methyl-2 -

trans-allyl) cyclohexa-3,6-dien-

trans-allyloxy)benzyl]-5-

phenylethyl)-4,5-

2-on-1-ylmethyl]-5-hydroxy-6-

hydroxy-6-methoxy-3-

dimethoxyphenol

methoxy-3-phenylbenzofuran

phenylbenzofuran

(163)

(162)

(161)

4’-hydroxy-2’-methoxychalcone

latinone (158)

dalbergiphenol (164)

(117)

5-O-methyllatifolin

(S)-4-methoxydalbergione

2,4,5-

trimethoxydalbergiquinol

(156)

(151)

(171)

Obtoxafuran

(149)

Dalbergia tonkinensis (Sưa)

lanceolarin (38) R1=OCH3, R2= R4=H R3=-β-D-Apiofuranosyl- (16)-β-D-glucopyranoside

33

genistein (63) R1= R2= R4= R6= R8=H R3= R5= R7=OH

9,10-threo-3-[7-(3,10-dihydroxy- 9-hydroxymethyl-2,5-dimethoxy)- 9,10- dihydrophenanthrenyl]propenal (165)

Dalbergia vietnamensis (Trắc Gai)

Dalspinosin 7-O-[-D-apiofuranosyl-(16)-- D-glucopyranoside] (167)

Caviunin [7-O-(5-O-trans-p-coumaroyl) -- D- apiofuranosyl-(16)--D- glucopyranoside] (168)

Caviunin [7-O--D- apiofuranosyl-(16)-- D- glucopyranoside] (166)

Caviunin (67) R1= R3= R4= R6=OCH3 R2= R5= R8=H, R7=OH

Dalbergia oliveri (Cẩm Lai)

liquiritigenin (15)

(3R)-5′-methoxyvestitol (4)

(6aS,11aS)-medicarpin (169)

Maackiain (148)

(6aS,11aS)-8- hydroxymedicarpin (170)

Formononetin (67) R1= R2= R3= R4= R5= R6=H

(3R)-Violanone (33)

34

Isoliquiritigenin (116) Hình 1.23. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ chi Trắc (Dalbergia) ở Việt Nam

Qua các nghiên cứu hóa học ở Việt Nam về chi Trắc (Dalbergia), chúng tôi

nhận thấy: việc nghiên cứu thành phần hóa học các loài còn đang rất ít. Chỉ có 4 loài

trên tổng số 27 loài được nghiên cứu về mặt hóa học. Đặc biệt những nghiên cứu hóa

học về loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) vẫn còn khiêm tốn và chỉ mới phân lập

được 3 hợp chất.

1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHI TRẮC (DALBERGIA)

Từ năm 1967 đến nay, khoảng hơn 259 hợp chất đã được phân lập và xác định

cấu trúc từ các bộ phận của 21 loài thuộc chi Trắc (Dalbergia), trong đó có khoảng

42 hợp chất mới. Cùng với quá trình nghiên cứu về mặt hóa học, thì việc nghiên cứu

hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của các cặn chiết, các hợp chất tinh khiết từ

chi này luôn được phát triển và hoàn thiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy chi Trắc

Dalbergia có phổ hoạt tính sinh học rộng và mạnh [12]. Một số hoạt tính đáng quan

tâm như kháng u, kháng ung thư, kháng viêm, kháng dị ứng, kháng trùng sốt rét, chống

oxy hoá, kháng dị ứng, chống huyết khối, kìm hãm estrogen, hoạt tính giảm đau, kháng

vi sinh vật kiểm định. Trong đó, nổi bật là các hoạt tính kháng androgen, tác dụng tim

mạch, gây độc một số dòng tế bào ung thư khác nhau tập chung vào lớp chất flavone

và flavanone của loài D. odorifera [ 27, 58-60].

1.4.1. Hoạt tính chống oxi hóa

Năm 2006, Sofidiya và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống oxi hóa từ cao

chiết methanol của loài D. saxatilis, kết quả cho thấy cặn chiết này có tác dụng chống

oxi hóa trên hệ 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl [61]. Đến năm 2011, Khalid và cộng

sự đã nghiên cứu và đánh giá về khả năng chống oxi hóa của dịch chiết EtOH từ vỏ

của loài Hồng Sắc Ấn Độ D. latifolia bằng nhiều phương pháp khác nhau được tiến hành

trên hệ DPPH, NO, thiocyanate. Kết quả cho thấy chúng có khả năng chống oxi hóa [62].

35

Cũng trong thời gian này Bala và cộng sự cũng báo cáo dịch chiết methanol của vỏ loài

D. spinosa có khả năng chống lại gốc tự do DPPH rất tốt [63].

Ngoài một số kết quả nghiên cứu nước ngoài thì một số nghiên cứu được báo cáo

bởi trong nước bởi Phạm Thanh Loan (2014) và cộng sự, kết quả đánh giá hoạt tính chống

oxi hóa trên hệ DPPH từ dịch chiết MeOH của lá, cành và quả của loài Sưa (D. tonkinensis)

cho thấy: Dịch chiết MeOH từ quả loài Sưa (D. tonkinensis) có tác dụng quét gốc tự do

trên hệ DPPH ở mức trung bình với giá trị SC50 là 117,5 𝜇g/ml so với axit ascorbic (SC50

là 20,5 𝜇g/ml); Dịch chiết từ các bộ phận còn lại không thể hiện hoạt tính chống oxi hóa

trên hệ DPPH. Tiếp đó đánh giá khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tác nhân oxi hóa từ dịch

chiết MeOH của lá, cành loài Sưa (D. tonkinensis). Kết quả cho thấy chúng không có khả

năng bào vệ tế bào gan dưới tác động của tác nhân oxi hóa H2O2 tại nồng độ 100 𝜇g/ml.

Cũng nhóm tác giả này đã tiến hành đánh giá thêm khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tác

nhân oxi hóa từ dịch chiết MeOH của gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis).

Các hợp chất được sàng lọc ở nồng độ ban đầu là 100 𝜇g/ml. Kết quả cho thấy

dịch chiết MeOH từ gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) có khả năng bào vệ được trên

50% tế bào gan dưới tác động của tác nhân oxi hóa H2O2 tại nồng độ 100 𝜇g/ml. Vì

vậy, chúng được tiếp tục nghiên cứu và xác định giá trị ED50 (là giá trị hoạt chất tại

đó bảo vệ 50% sự sống sót của tế bào gan). Kết quả cho thấy dịch chiết MeOH của

gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) đã thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào gan mạnh với

giá trị ED50 là 9,39 𝜇g/ml tương đương với curcumin (ED50 là 8,99 𝜇g/ml) [17].

Bảng 1.15. Giá trị ED50 của dịch chiết MeOH từ gỗ loài Trắc (D.

cochinchinensis)

% sự sống sót

Nồng độ (𝜇g/ml) Curcumin

Dịch chiết MeOH từ gỗ loài Trắc (D. cochinchinensis) 62,35 53,53 45,19 33,27 9,39 88,20 71,66 22,54 0,78 8,99

100 20 4 0,8 ED50

36

Cùng với việc nghiên cứu hoạt tính oxi hóa các cặn chiết thì việc đánh giá hoạt

tính trên các chất sạch được thực hiện. Năm (1998) Cheng và cộng sự, đã đánh giá

hoạt tính chống oxi hóa của butein (113) được phân lập từ loài D. odorifera, kết quả

hợp chất này ức chế quá trình oxi hóa lipid do sắt gây ra ở chuột đồng với giá trị IC50

3,3 ± 0,4 μM tương đương với vitamin E trong việc dọn các gốc tự do trên hệ

diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) tự do ổn định với IC50 là 9,2μM. Nó cũng ức chế

hoạt động của xanthine oxidase với IC50, 5,9 ± 0,3 μM [42].

Năm (2000) Wang và cộng sự đã phân lập được 9 hợp chất từ Dalbergia odorifera

T. Chen, trong đó có 1 hợp chất mới là 2,4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone (139) và

8 hợp chất đã biết là 3R-2′,3′,7-trihydroxy-4′-methoxyisoflavanone (36), 3′-

methoxydaidzein (60), 4′,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavone (55), (3R)-vestitol (2),

medicarpin (135). Sau đó, nghiên cứu tiềm năng chống oxy hóa thì thấy các hợp

chất này có hoạt tính oxi hóa mạnh, đồng thời nếu các hợp chất này khi được trộn

với α-tocopherol thì các yếu tố bảo vệ của chúng tăng lên. Ngoài ra, các hợp chất

này còn được đánh giá trên hệ thống ổn định oxi hóa ở 100˚C. Kết quả cho thấy, 5 hợp

chất bao gồm 2,4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone (139), (3R)-2′, 3′, 7-trihydroxy-4′-

methoxyisoflavanone (36), 3′-methoxydaidzein (60), 4’,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavone

(55), (3R)-vestitol (2) và medicarpin (135) có hoạt tính chống oxi hóa mạnh [31].

Đến năm 2011, nhóm nghiên cứu của Hou và cộng sự đã phân lập được các hợp

chất từ lõi lõi gỗ của loài D. odorifera T.Chen, tuy nhiên trong số đó chỉ có 2 hợp chất là

naringenin (14) và eriodictoyl (20) có hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn BHT [32].

Nhận xét: theo như các công trình đã nghiên cứu trước đây thì các hợp chất có

hoạt tính chống oxi hóa hầu như được phân lập từ loài D. odorifera.

Bảng 1.16. Giá trị IC50 của naringenin và eriodictoyl so với BTH

Nồng độ Hợp chất

Naringenin 0,012% 4,20 ± 0,02 0,02% 5,57 ± 0,07

Eriodictoyl 6,48 ± 0,31 9,32 ± 0,28

BHT 3.61 ± 0.10 4.22 ± 0.48

37

Năm 2013, Phạm Thanh Loan và các cộng sự đã phân lập và nghiên cứu các hợp

chất trong gỗ loài Cẩm lai (D. oliveri), kết quả cho thấy trong 10 hợp chất được đánh giá

bằng thử nghiệm kiểm tra chống oxi hóa in invitro trên tế bào gan phân lập, chỉ có hoạt

chất (6aR, llaR)-3,8-dihydroxy-9-methoxyptcrocarpan (144) có khả năng bảo vệ hơn

50% tế bào gan chuột dưới tác động của tác nhân oxi hóa mạnh là H2O2, với ED50 là

31,46 𝜇g/ml so với chất đối chứng là curcumin với ED50 là 8,99 𝜇g/ml. Như vậy, hợp

chất này được đánh giá khả năng chống oxi hóa ở mức trung bình [64].

1.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào

Năm 2013, chiết xuất methanol của gỗ cứng của D. odorifera có khả năng ức

chế đáng kể và mạnh mẽ sự gia tăng các dòng tế bào khối u của con người, bao gồm

các tế bào kháng đa kháng thể in vitro [49].

Năm 2014, Phạm Thanh Loan và cộng sự đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

từ cặn MeOH của một số loài Dalbergia phân bố ở Việt Nam như: Dalbergia oliveri,

Dalbergia cochinchinensis, Dalbergia sp, Dalbergia discolor, Dalbergia aff,

Dalbergia burmanica, Dalbergia pierriana. Kết quả cho thấy, chỉ có mẫu loài trắc

Dalbergia cochinchinensis thể hiện hoạt tính kháng 2 dòng tế bào ung thư là ung thư

phổi (Lu) và ung thư màng tim (RD). Ở nồng độ 17,98 μg/ml có 50% dòng tế bào Lu

bị ức chế và ở nồng độ 15,76 μg/ml có 50% dòng tế bào RD bị ức chế. Các mẫu còn

lại đều không biểu hiện có hoạt tính gây độc tế bào. Còn loài Cẩm lai Dalbergia

oliveri cũng thể hiện hoạt tính gây độc trên dòng tế bào Hep-G2 với giá trị IC50 là

45,71 μg/ml [17].

Cùng với việc đánh giá hoạt tính từ cao chiết. Các hợp chất được phân lập từ

các loài Dalbergia trong chi này cũng được đánh giá hoạt tính gây độc trên một số

dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy khá nhiều các hợp chất thể hiện hoạt tính gây

độc tế bào.

Năm 2003 Ito và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng u của các hợp chất bằng

cách kích hoạt virus Epstein-Barr trên dòng tế bào Raij. Kết quả cho thấy, các hợp chất

olibergin B (91) từ gỗ loài Cẩm lai (D. oliveri), dalberatin A (118) và B (119) từ gỗ loài

Trắc dao (D. cultrata) và dalberatin C (120) và E (122) từ gỗ loài Trắc đen (D.

nigrescens) cho thấy có tác dụng kháng u. Hơn nữa, các nghiên cứu này cũng chỉ ra

38

nhóm prenyl và geranyl trong isoflavonoid có ảnh hưởng quan trọng trong việc ức chế

sự tiết ra quá trình khởi sinh kháng thể siêu vi Epstein-Barr [12, 52].

Năm 2007, Yu và cộng nghiên cứu hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư

thần kinh người SH-SY5Y của các hợp chất, formononetin (69), (3R)-5′-

methoxyvestitol (4), odoriflavene (7) và 2'-O-methylisoliquiritigenin (114) phân lập

từ rễ loài D. odorifera T.Chen. Kết quả, 4 hợp chất này đều ức chế mạnh sự phát triển

của dòng tế bào SH-SY5Y với IC50 lần lượt tương ứng là 13,4, 28,5, 11,2 và 32,5μM

[47].

Năm 2007, từ loài D. oliveri Gamble ex Prain, hợp chất (3R)-mucronulatol (9)

được phân lập cho thấy hoạt tính độc tế bào đáng kể đối với dòng tế bào bạch cầu

HBL100 với giá trị LC50 lên đến 5,7 μM [21].

Năm 2009, Choi và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất từ chiết xuất methanol

của cây gỗ của D. odorifera. Các hợp chất này ức chế đáng kể sự gia tăng của các

dòng tế bào khối u ở người, kể cả các tế bào kháng đa kháng sinh trong ống nghiệm.

7 flavonoid gồm medicarpin (135), 3-hydroxy-2,4-dimethoxybenzaldehyde (145),

formononetin (69), tectorigenin (88), (3R)-mucronulatol (9), (3R)-5′-methoxyvestitol

(4), hydroxyobustyrene (127) cùng 2 phenolic bao gồm liquiritigenin (15) và (3R) -

calussequinone (146) [28].

Kết quả, trong 9 hợp chất thì có 2 hợp chất là medicarpin (135) và

hydroxyobtustyrene (127) biểu hiện hoạt tính độc tế bào mạnh nhất với giá trị ED50

là 5,8-7,3 và 5,1-6,8 µg /ml.

Năm 2009, Cheenpracha cùng các cộng sự, tiến hành đánh giá hoạt tính gây

độc tế bào của 10 hợp chất phân lập được từ gỗ loài Trắc một hạt (D. candenatensis)

trên các dòng tế bào HT-29 (ung thư ruột kết), KB (ung thư biểu mô), MCF-7 (ung

thư vú), HeLa (ung thư cổ tử cung). Kết quả chỉ ra rằng, các hợp chất candenatenin

B (124) và candenatenin C (125) thể hiện hoạt tính mạnh với dòng tế bào HT-29 (IC50

lần lượt 17,8 và 19,7 μM), Ngoài ra, có hoạt tính trung bình với 3 dòng tế bào KB,

MCF-7 và HeLa (IC50 từ 48,8-83,7 so với chất đối chứng camptothecin IC50 từ 1,22-

2,44 μM) [38].

39

Theo Songsiang (2009), 2 hợp chất (3R)-mucronulatol (9) và dalparvinene B

(132) phân lập từ gỗ loài D. parviflora có khả năng phát triển thành thuốc để phòng ngừa

ung thư trên các dòng tế bào KB (ung thư biểu mô), NCI-H187 (ung thư phổi) với kết

quả đánh giá khả năng gây độc trên các dòng tế bào đó với IC50 trên 2 dòng tế bào của

từng hợp chất lần lượt là 0,53; 2,04 μg/ml và 9,89; 1,46 μg/ml [40].

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Songsiang đã thử hoạt tính của một hợp chất

isoflavanone (3S)-Secundiflorol H (35) được phân lập từ thân D. parviflora, cho thấy hoạt

tính độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào KB, MCF-7 và NCI-H187 với giá trị IC50 tương

ứng là 4,18, 5,37 và 3,47 μg/ml, so với chất đối chứng ellipticine (IC50 : 1,18-1,27.

Ngoài ra, các hợp chất còn lại dalparvone B (85), 5,7,3', 4'-tetrahydroxyisoflavone

(86), 2'-hydroxybiochanin A (87), 5– hydroxybowdichione (92), 3'-O-methylviolanone (32),

3,5,7-trihydroxyflavonol (44), eriodictoyl (20), isomucronustyrene (128), xenognosin A

(129), (3S)-Secundiflorol H (35), dalparvinene B (132), 4-hydroxy-3-methoxy-8,9-

methylenedioxypterocarpan (137),3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) và 3-

hydroxy-2,4-dimethoxybenzaldehyde (145) có hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung

bình (IC50 : 6,27-48,89 μg/ml) [50].

Cùng với các nghiên cứu về các hoạt chất gây độc tế bào của chi Dalbergia ở

nước ngoài thì trong nước cũng ghi nhận một vài báo cáo.

Theo đó, năm 2014 Phạm Thanh Loan và cộng sự khi nghiên cứu hoạt tính

sinh học của 10 hợp chất phân lập từ cao chiết MeOH của gỗ loài Cẩm lai Dalbergia

oliveri bao gồm: liquiritigenin (15), genistein-6-C-glucoside (147), maackiain (148),

formononetin (69), pratensein (83), (3R)-violanone (33), isoliquiritigenin (116),

(3R)-5'-methoxyvestiol (4), 3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) và

medicarpin (135). 8 hợp chất được tiến hành thử nghiệm, kết quả cho thấy hoạt chất

3,8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan (138) và hoạt chất medicarpin (135) có hoạt

tính gây độc tế bào rất tốt (IC50 nằm trong khoảng từ 3,76-7,09 μg/ml. Chất đối chứng

dương ellipticine). Hoạt tính này thể hiện trên một số các dòng tế bào ung thư như

LU-1 (ung thư phổi người), KB (ung thư biểu mô), MCF7 (ung thư vú) và Hep G2

(ung thư gan người) [64].

40

1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn

Năm (2000), Khan và cộng sự, tiến hành nghiên cứu khả năng kháng loài Trùng

roi gây bệnh tiêu chảy (Giardia intesstinalis) của 10 hợp chất isoflavone phân lập từ loài

D. Frutescens, kết quả chỉ ra rằng hợp chất formononetin kháng Giardia intesstinalis tốt,

với giá trị IC50: 30 µg/ml, so với chất đối chứng metronidazone, loại thuốc đặc trị amip

và tiêu diệt trùng roi Giardia sp (IC50: 100 µg/ml) [33].

Kết quả nghiên cứu của Beldjoudi và cộng sự (2003) cho thấy, 4 hợp chất được phân

lập từ gỗ loài D. louvelii: 7,4′-dihydroxy-3′-methoxyisoflavone (72), (R)-4-

methoxydalbergione (150), obtusafuran (149) và isoliquiritigenin (116) có tác dụng ức chế

mạnh sự phát triển của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum trong thử nghiệm in

vitro (IC50: 5,8-8,7 µg/ml) so với chất đối chứng chloroquine (IC50: 100 µg/ml ) [36].

Songsiang và cộng sự (2009), đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm

định của các hợp chất formononetin (69), biochanin A (62), dalparvone (84), (3R)-

violanone (33), (3R)-sativanone (31), liquiritigenin (15), (2S)-pinocembrin (22),

naringenin (14), (3R)-mucronulatol (9), duartin (13) và dalparvinene B (132) phân lập

từ gỗ loài D. Parviflora trên các chủng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, nấm

Cannida albicans và khuẩn Mycobacterium. Kết quả cho thấy, hợp chất dalparvinene B

(132) có tác dụng kháng C. albicans ở mức độ trung bình với (IC50: 25,32 µg/ml), so với

chất đối chứng amphotericin B(IC50: 0,034µg/ml), hợp chất dalparvone (84) có khả năng

kháng Plasmodium falciparum ở (IC50: 8,19µg/ml), chất đối chứng dihydroartemisinin

(IC50: 3,7µg/ml), hợp chất (2S)- pinocembrin (22) có tác dụng kháng M. Tuberculosis

với giá trị MIC là 12,5 µg/ml. Ngoài ra, 2 hợp chất dalparvone (84) và dalparvinene B

(132) đều có MIC là 50,0 µg/ml, so với chất đối chứng isoniazid (MIC là 0,02 µg/ml )

[40].

Năm 2011, Zhao cùng các cộng sự tiến hành đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn

gây bệnh khô héo Ralstonia solanacearum của 9 hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài D.

odorifera bao gồm (3R)-sativanone (31), (3R)-vestitone (34), (3R)-2′,3′,7-

trihydroxydroxy-4′-methoxyisoflavanone (36), liquiritigenin (15), carthamidin (19),

(3R)-vestitol (2), isoliquiritigenin (116) và sulfuretin (110). Kết quả thấy rằng, hợp chất

(3R)-vestitol (2) có tác dụng kháng khuẩn mạnh với đường kính vòng tròn vô khuẩn

41

đạt 16,62 mm, so với chất đối chứng streptomycin sulfate (16,80 mm). Các hợp chất

(3R)-vestitone (34), liquiritigenin (15) và isoliquiritigenin (116) có khả năng kháng

khuẩn ở mức trung bình với đường kính vòng tròn vô khuẩn tương ứng 11,9, 12,23 và

14,15 mm [26].

1.4.4. Hoạt tính kháng viêm

Năm 2013, Lee và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính ức chế sự sản sinh nitric

oxide (NO) trên đại thực bào RAW 264.7 của 24 hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài D.

odorifera. Kết quả cho thấy, hợp chất (2S)-pinocembrin (22) có khả năng ức chế

mạnh sự sản sinh nitric oxide (NO) trên đại thực bào RAW 264.7 với IC50 18,1 μM,

so với chất đối chứng aminoguanidime IC50 là 16,6 μM. Ngoài ra, 2 hợp chất olibergin

A (68) và butein (113) có khả năng ức chế ở mức trung bình với IC50 tương ứng 45,5

và 35,1 μM. Kết quả này mở ra tiềm năng trong việc tìm kiếm các flavonoid làm

thuốc kháng viêm [49].

1.4.5. Hoạt tính chống đái tháo đường

Như đã biết, quá trình glycat hóa protein là sự gắn kết của một phân tử glucose

với một protein mà không cần enzyme, làm thay đổi cấu trúc và chức năng của các

protein. Đường huyết càng tăng và sự tiếp xúc giữa đường và protein càng lâu thì quá

trình này càng lan rộng. Quá trình glycat hoá sản sinh ra các gốc tự do và các sản phẩm

được gọi chung là AGEs. AGEs có vai trò rất quan trọng trong cơ chế bệnh sinh các biến

chứng mạn tính của bệnh đái tháo đường.

Khi nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường gây ra đối với chuột ở liều 250

và 500 mg/kg, và so sánh với chất đối chứng là glibenclamide từ dịch chiết ethanol

của lá D. sissoo. Kết quả cho thấy. Dịch chiết có tác dụng làm giảm lượng đường

trong máu lên đến 189,2, 115,2 và 104,6 mg/dL sau 7,14 và 21 ngày, với liều 500

mg/kg, trong khi glibenclamide giảm tối đa 250,2, 141,2 và 120,4 mg/dL. So với

glibenclamide thì dịch chiết này cao hơn 12% trong việc giảm mức độ lượng đường

trong máu. Hoạt tính kháng tiểu đường cũng được nghiên cứu trên các chất tinh khiết

trong Chi này nhưng rất hiếm báo cáo. Theo đó, các thử nghiệm cho thấy. Các hợp

chất (3R)-sativanone (31) và formononetin (69) phân lập từ loài Dalbergia odorifera

T. Chen có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm men [12, 65].

42

1.4.6. Hoạt tính chống dị ứng

Năm 1998, Chan và cộng sự đã báo hợp chất (S) -4-methoxydalbergione (151)

và cearoin (152), phân lập từ lõi gỗ của loài D. odorifera, có hoạt tính kháng dị ứng đáng

kể với IC50 là 17,6 và 17,9 μM, kìm hãm sự giải phóng tác nhân trung gian gây dị ứng

là β-glucuronidase với IC50 là 20,0 và 16,3 μM đối với tác nhân gây dị ứng histamine

phóng thích ra từ tế bào. Ngoài ra hợp chất (S)-4-methoxydalbergione (151) cũng cho

thấy giá trị IC50 là 20,6 và 7,9 μM tương ứng với sự hình thành của β-glucuronidase và

giá trị IC50 > 30,0 và 11,7 μM tương ứng với sự giải phóng lysozyme khỏi bạch cầu trung

tính và bạch cầu trung tính được sử dụng làm kiểm soát dương tính [27].

Ngoài các hoạt tính sinh học đặc trưng chính nêu trên thì chi Dalbergia còn

có thêm một số hoạt tính sinh học khác: hoạt tính chống loãng xương [12], hoạt

tính bảo vệ [46], hoạt tính kháng androgen [57], hoạt tính chống côn trùng [65],

hoạt tính hạ sốt [66], hoạt tính liên quan đến huyết áp, chống huyết khối, chống

tập kết tiểu cầu và co giãn động mạch chủ [12, 36, 67], hoạt tính lợi tiểu [69] và

hoạt tính giảm đau [63, 71].

43

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) bao gồm các bộ phận vỏ thân, lá và lõi

được thu hái vào tháng 1/2015 và tháng 3/2016 tại đường Mai Hắc Đế, thành phố

Buôn Ma Thuột, tỉnh Đăk Lăk (12o45’59’’N-108o19’31’’E). Tên khoa học của cây

được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu

bản thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và tại phòng Hoạt chất sinh học,

Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-561 và C-612.

Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, chỉ lấy

phần thân lõi đỏ phơi khô. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều

lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân

đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexane, chloroform hoặc

dichloromethane, etyl acetat và nước. Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc

ký được làm khan, lọc và cất lại trước khi sử dụng.

2.1.2. Các phương pháp nghiên cứu thực vật loài Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain)

2.1.2.1. Nghiên cứu vi phẫu

Phương pháp nghiên cứu

a) Tiêu bản vi học thân và lá

- Làm tiêu bản bằng phương pháp cắt trực tiếp, tẩy và nhuộm kép.

- Hoá chất sử dụng: dung dịch javen thương phẩm; dung dịch acid acetic 5%; dung

dịch xanh methylene, dung dịch đỏ carmin.

- Dụng cụ quang học: Kính hiển vi màn hình kết nối camera Nikon Eclips Ci

b) Bột dược liệu

- Làm tiêu bản bằng phương pháp giọ tép.

- Dụng cụ quang học: Kính hiển vi màn hình kết nối camera Nikon NikonEclipsCi

2.1.2.2. Nghiên cứu DNA

44

 Nguyên liệu

01 mẫu lá Sưa được thu tại khu vực đường Mai Hắc Đế, thành phố Buôn Ma

Thuột, tỉnh Đăk Lăk (12o45’59’’N-108o19’31’’E), được ký hiệu mẫu C-561-L và C-

612.

01 mẫu lá Sưa được thu tại đường Hoàng Quốc Việt, Hà Nội (21o01’42’’N-

105o51’12’’E), ký hiệu mẫu C-564-L.

02 mẫu lá thu được kiểm tra hình thái và làm tiêu bản tại phòng thực vật, Bảo

tàng thiên nhiên Việt Nam và phòng thí nghiệm Hệ thống học phân tử và Di truyền

bảo tồn -Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật để phục vụ cho các phân tích

Hình 2.1. Hai mẫu Sưa được thu tại Buôn Ma Thuột (C-561-L) và Hà Nội (C-564-L)

Hình 2.2. Mẫu lá Trắc được thu tại Buôn Ma Thuột (C-562-L)

Phương pháp

Tách chiết DNA tổng số

Mẫu lá được tách chiết theo phương pháp CTAB của Doyle và cs (1987) có

cải tiến để phù hợp với điều kiện Việt Nam. Kiểm tra độ sạch và hàm lượng DNA

45

bằng đo quang phổ hấp thụ kết hợp với điện di trên gel agarose 1%. DNA tổng số

được pha loãng dùng cho phản ứng PCR ở nồng độ 10 ng/µl.

Trình tự các cặp mồi rpoB, rpoC và rbcL được tổng hợp dựa theo các nghiên

cứu của Kress vả cs 2007 [72], của Hasebe và cs (1994) [73] (bảng 2.1)

Bảng 2.1. Thông tin các cặp mồi sử dụng

Mồi xuôi

Mồi ngược

Tham khảo

Chiều dài vùng gen

Nhiệt độ bắt cặp mồi

Tên vùng gen

CTTCTGCGAAATCAG

CTTCTCCTTCCTC

50

600

[72]

rpoC

AGTGTTTG

TAAATGATAAG

CTTCGGCACAAA

TCTAGCACACGAAAG

[73]

rbcL

56

600

ATACGAAACG

TCGAAGT

ATCTCTCCA

GCC ACC ATC GAA

ACA CGA TCT

rpoB

52

600

[72]

TAT CTG GT

CGT CGC TAA CC

Tối ưu và nhân bản gen bằng phản ứng PCR

Phản ứng nhân gen được thực hiện trong tổng thể tích là 50µl với các thành

phần gồm có: 32 l H2O, 5 l đệm, 5 l dNTP, 3 l mồi xuôi F (30 pM), 3 l mồi

ngược R (30 pM), 1 l DNA tổng số, 1 l enzyme Taq polymerase. Chu trình nhiệt

được thực hiện trên máy PCR system 9700 với các chu kỳ như sau: biến tính ở 95oC

3 phút, sau đó là 35 chu kỳ lặp lại: 95oC 30 giây; bắt cặp ở 50oC, 52oC, 56oC trong 1

phút, kéo dài mạch ở 72oC trong 1 phút, cuối cùng là 72oC trong 10 phút để kết thúc

phản ứng và giữ mẫu ở 4oC.

Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm gel bằng

ethidium bromide và chụp ảnh trên hệ thống máy ảnh có chiếu ánh sáng UV.

Giải trình tự và xử lý số liệu

Giải mã trình tự nucleotide được thực hiện bằng kit BigDye terminator v3.1

trên máy đọc trình tự ABI 3100 Avant genetic analyzer (Applied Biosystems). Sản

phẩm PCR được tinh sạch bằng Sephadex G50 (Sigma) trước khi tiến hành đọc trình

46

tự. Phần mềm ClustalW (Thompsom và cs, 1994) [74], GenDoc (Nicholas và cs,

1997) [75] và MEGA5.2 (Tamura và cs, 2011) [76] được dùng để phân tích dẫn liệu,

xác lập bảng khoảng cách di chuyền.

2.1.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Các phương pháp sắc ký được sử dụng để chiết tách và phân lập các hợp chất

từ cặn chiết thô bao gồm: sắc ký bản mỏng TLC, sắc ký cột với chất hấp phụ là silica

gel pha thường (Merck loại 40-63 m) hoặc pha đảo (ODS, YMC (30-50 μm)), sắc

ký cột Dianion HP-20, Sephadex LH-20. Bên cạnh đó còn dùng phương pháp kết tinh

để thu chất sạch.

2.1.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết

hợp các phương pháp vật lý và hóa học, và sử dụng các phương pháp phổ

2.1.4.1. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS)

Phổ khối ion hóa bụi điện tử ESI-MS được ghi trên máy ghi Agilent 6310 Ion

Trap, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6510 Q-TOF

LC/MS hoặc máy MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany).

2.1.4.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C- và DEPT NMR) và hai chiều

(HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz đo

với TMS là chất chuẩn nội. Sử dụng các dung môi hòa tan được hoàn toàn mẫu thử

chủ yếu là DMSO-d6, MeOD-d4, CDCl3.

2.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp của

H. Xiong và cs (2009) [77].

 Chủng vi sinh vật kiểm định:

Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027

Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC

6538

47

Nấm sợi (mốc): Aspergillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum ATCC 48112

Nấm men: Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 16404

Chủng chuẩn (nguồn ATCC, Manassas, Mỹ) được cung cấp bởi Viện kiểm

nghiệm thuốc Trung ương và lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học

các hợp chất thiên nhiên).

Pha dịch vi sinh vật: Dùng que cấy vô trùng lấy 1 quai khuẩn lạc của chủng vi

sinh vật pha hòa tan vào 10 mL nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn

vortex được huyền dịch vi sinh vật. Đánh giá nồng độ vi sinh vật bằng cách so sánh với

chuẩn 0,5 McFarland (đo ở =550 nm) được huyền dịch nồng độ 150 x106 CFU/mL.

Môi trường: Saboraud 4% Dextrose Agar (SDA; Merck, Damstaadt, CHLB

Đức) cho nấm men và nấm mốc. Tryptic Soy Agar (TSB-Merck) cho vi khuẩn.

Các chất đối chứng dương là: Streptomycin (4 μM), Penicillin (50 μM ) cho vi

khuẩn Gr (+) và Nystatin cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh được cung cấp bởi Viện

kiểm nghiệm Tp. HCM.

Chất đối chứng âm là các vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử

 Thử nghiệm và đánh giá kết quả

Chuẩn bị mẫu thử: Hòa tan mẫu trong DMSO 100% bằng máy vortex với nồng

độ 4mg/mL với mẫu cao chiết và 1mg/mL với mẫu tinh.

Pha mẫu với DMSO 5% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ

giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ). Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng

(phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để dải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5

µL (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ). Để trong tủ ấm ở 37oC trong 24h đối với vi khuẩn

và 30oC/48h đối với nấm.

Mẫu được xác định có hoạt tính khi không có sự phát triển của vi sinh vật ở ít

nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng (-) (khi nuôi cấy lại ở nồng độ này

kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU<5). Mẫu biểu hiện hoạt tính được test ở dãy nồng

độ mẫu khác nhau để xác định được nồng ức chế tối thiểu MIC (g/mL) là nồng độ

thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật bị ức chế).

Mẫu được xác đinh có hoạt tính khi giá trị MIC 200 g/mL đối với mẫu cao

chiết và ≤ 50g/mL đối với mẫu tinh sạch.

48

2.2.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase

 PHƯƠNG PHÁP

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được thực hiện theo phương pháp của

N.V. Bon và cộng sự (2018) [78].

Phép thử dựa trên hoạt tính xúc tác của enzyme α-glucosidase chuyển hoá cơ chất

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid thành α-D-glucose và p-nitrophenol có màu vàng hấp

thụ ở =405 nm. Khi chất thử có hoạt tính ức chế enzyme, cường độ hấp thụ của hỗn hợp

phản ứng sẽ giảm và phần trăm (%) ức chế enzyme được xác định tương ứng với mỗi

nồng độ mẫu thử khi so sánh với đối chứng (-).

Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase được thực hiện trên

phiến vi lượng 96 giếng, thể tích phản ứng là 250 µL/giếng. Các thành phần phản ứng bao

gồm: 50µL cơ chất p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (pNPG), 100µL đệm phosphate (0,1

mol/L, pH 7), 50µL enzyme -glucosidase từ vi khuẩn, nấm men, và gạo ở các nồng độ lượt

là 1,0; 0,25 và 0,1 U/mL và mẫu thử (50 µL) ở các nồng độ khác nhau.

Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phosphate và acarbose được

sử dụng làm đối chứng (+). Hỗn hợp phản ứng enzyme được ủ ở nhiệt độ 37o C. Sau 30

phút (60 phút đối enzym từ chuột), phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3 0,1 M.

Độ hấp thụ của phản ứng được xác định ở bước sóng 405 nm trên máy đo quang Infinite

F50 (Tecan, Thụy Sỹ). Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase từ chuột được

thực hiện theo phương pháp của N.V.Bon và cộng sự (2017) [79].

Enzyme -glucosidase từ gạo, từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae), từ vi

khuẩn (B. stearothermophilus), từ chuột cùng với cơ chất p-nitrophenyl -D-

glucopyranoside (pNPG) và acarbose mua tại hãng Sigma Aldrich, St. Louis City, MO,

USA.

Khả năng ức chế enzyme -glucosidase của mẫu thử được xác định qua công

thức: Tỷ lệ ức chế (%) = [(A – B) /A] x 100% A giá trị quang của mẫu đối chứng B giá trị quang của mẫu thật

49

IC50 (half maximal inhibitory concentration), nồng độ của chất thử ức chế 50% hoạt động của enzyme -glucosidase, được xác định sử dụng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, USA). 2.3. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách

2.3.1. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561)

Lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (3,7 kg) đem phơi khô, nghiền

nhỏ được ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (5 lần x 7 lít ), lọc và cô cất trong

chân không. Phần cặn methanol (120g, M) được hòa vào hỗn hợp methanol/nước (tỉ

lệ 1/1) rồi chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-

hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước cho các cặn chiết tương ứng lần lượt

là cặn n-hexane (29,0 g, MH), dichloromethane (45,1 g, MD), ethyl acetate (11,1 g,

ME) và cặn nước (12,0 g, MW).

Bã sau khi chiết bằng methanol được đun nóng với nước (4 lần x 3,0 L), sau

12 giờ thu được cặn chiết nước (4,2 g, W) ( Sơ đồ 2.1).

Lõi gỗ (3,7 kg)

Ngâm MeOH (5 x 7,0 L)

Chú thích: M: methanol W: nước H: n-hexane D: dichloromethane E: ethyl acetate

Cao methanol (120 g, M)

Chiết phân bố

Đun nước (4 x 3,0L)

Bã sau khi chiết

nước ethyl acetate dichloromethane n-hexane

MW (12,0 g) W (4,2 g) MH (29,0 g) MD (45,1 g) ME (11,1 g)

Sơ đồ 2.1. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-561)

2.3.1.1. Phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane

Cặn dịch chiết dichloromethane (45,1 g, MD) được hoà tan bằng một lượng

methanol vừa đủ. Dung dịch thu được đem trộn với một lượng silicagel vừa đủ, cô quay

khô, nghiền thành dạng bột mịn. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được đưa lên cột sắc

ký, cột được nhồi bằng silicagel pha thường (Merck, loại 400 – 630 mesh). Cột sau khi

đã tương đối ổn định, bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên đầu cột, với hệ gradient

50

dung môi rửa giải là n-hexane/acetone (3/2-0/1) tăng dần độ phân cực thu được 6 phân

đoạn từ (MD1-MD6).

Phân đoạn MD2 (7,2 g) được tiếp tục phân tách trên cột CC, silicagel pha thường

với hệ dung môi rửa giải chloroform/acetone (99/1, v/v) thu được 7 phân đoạn được ký

hiệu từ (MD2.1-MD2.7). Phân đoạn MD2.3 (1,5 g) được phân tách trên cột sắc ký silicagel

pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (9/1, 8/1, v/v) được 4 phân đoạn ký hiệu từ

(MD2.3A-MD2.3D). Chạy tách chất phân đoạn MD2.3A (0,4 g) trên cột sắc ký silicagel pha

thường, làm sạch với hệ dung môi n-hexane/acetone (9/1, v/v) thu được 2 hợp chất sạch

DT.01 (30 mg) và DT.03 (20,5 mg). Phân đoạn MD2.6 (0,6 g) được chiết tách trên cột

sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường và rửa giải bởi hệ dung môi n-

hexane/acetone (5/1, v/v) được chất sạch DT.02 (25 mg) (Sơ đồ 2.2).

MD (45,1 g)

Chú thích: O.PC.C: Sắc khí cột, pha thường. SiO2: silicagel Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ CA: chloroform/acetone

SiO2, O.P C.C HA (3/2-0/1)

SiO2, O.P C.C CA (99/1, v/v)

MD2 7,2 g MD3 2,1 g MD4 3,0 g MD1 5,5 g MD5 0,8 g MD6 1,5 g

MD2.1 0,2 g MD2.2 0,5 g MD2.3 1,5 g MD2.4 1,1 g MD2.6 0,6 g MD2.7 0,8 g MD2.5 0,95 g

SiO2, O.P C.C HA (9/1, v/v) SiO2, O.P C.C HE (5/1, v/v)

MD2.3C 0,15 g MD2.3D 0,2 g MD2.3A 0,4 g MD2.3B 0,25 g

DT.02 25 mg

SiO2, O.P C.C HA (9/1, v/v)

DT.01 30 mg DT.03 20,5 mg

Sơ đồ 2.2. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết dichloromethane

51

2.3.1.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate

Cặn ethyl acetate (11,1 g, ME) được tiến hành phân tách trên sắc kí cột CC,

silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi dichloromethane/acetone theo tỷ lệ

(40/1, 30/1, v/v) thu được 11 phân đoạn ký hiệu từ (ME1-ME11). Phân đoạn ME1 (850

mg) tiếp tục được phân tách trên sắc kí cột CC, silicagel pha thường và giải hấp bởi

hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (5/1, v/v) tăng dần độ phần cực, thu được hợp

chất DT.04 (5,0 mg).

Phân tách phân đoạn ME9 (650 mg) trên cột silicagel pha thường với hệ dung

môi rửa giải n-hexane-aceton (3/1, v/v) thu được 2 phân đoạn ME9.1 (420 mg) và ME9.2

(120 mg). Tách tiếp phân đoạn ME9.1 trên cột silicagel bằng hệ chloroform/methanol

theo tỷ lệ (9/1, v/v) thu được hợp chất DT.05 (8 mg). (Sơ đồ 2.3).

SiO2, OP.CC DA (40/1, 30/1, v/v

ME (11,1 g)

Chú thích: O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. SiO2: silicagel Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ DA: dichloromethane/acetone Hệ HE: n-hexane/ethyl acetate Hệ MW: methanol/nước

ME1 850 mg ME2 370 mg ME3 900 mg ME4-6 4992 mg ME7-8 1000 mg ME9 650 mg

SiO2, O.P C. HE (5/1, v/v)

ME10-11 350.5 mg SiO2, O.P C.C HA (3/1, v/v)

ME9.1 420 mg

ME9.2 120 mg

SiO2,O.P C.C CM (9/1, v/v)

DT.04 5,0 mg

DT.05 8 mg

Sơ đồ 2.3. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết ethyl acetate

52

2.3.1.3. Phân lập các chất từ cặn chiết nước cao nước đun sôi

Cao nước đun sôi (4,2 g, W) được tách phân đoạn trên sắc ký cột HP-20 bằng

chất hấp phụ silicagel pha đảo với hệ dung môi rửa giải nước/methanol (1/0-0/1), thu

được 5 phân đoạn (W1-W5).

Phân đoạn W2 (210,0 mg) chạy tách chất trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel

pha thường, triển khai theo chế độ gradient dung môi dichloromethane/methanol/nước

(30/1/0,1, v/v/v), sau đó tiến hành sắc ký bản mỏng TLC thu được 2 phân đoạn (W2.1-

W2.2). Tinh chế phân đoạn W2.2 (150 mg) trên sắc ký cột CC với silicagel pha thường,

rửa giải với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate/ acid formic (130/80/2, v/v/v) thu được

chất sạch DT.06 (5,5 mg).

Phân đoạn W4 (800 mg) được phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường

với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol/nước (30/1/0,1, v/v/v), thu được

4 phân đoạn từ W4.1-W4.4. Tiến hành tách chất phân đoạn W4.1 (65 mg) trên cột sắc ký

với chất hấp phụ silicagel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/ethyl

acetate/ acid formic (80/80/2, v/v/v) thu được hợp chất sạch DT.07 (5,0 mg).

53

W (4,2 g)

HP-20,WM (1/0-0/1)

Chú thích: O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. HP-20: diaion HP-20 SiO2: silicagel Hệ WM: nước/methanol Hệ DMW: dichloromethane/methanol/nước Hệ HEF: n-hexane/ethyl acetate/ acid formic

SiO2, O.P C.C DMW (3/1/0,1, v/v/v)

SiO2, O.P C.C DMW (30/1/0,1, v/v/v)

SiO2, O.P C.C DMW (30/1/0,1, v/v/v)

W1 937,9 mg W2 210 mg W3 250 mg W4 800 mg W5 300 mg

SiO2, O.P C.C HEF (80/80/2, v/v/v)

SiO2, O.P C.C HEF (130/80/2, v/v/v)

W4.1 65 mg W4.3 102 mg W4.4 150 mg W4.2 106 mg W2.1 60 mg W2.2 150mg W1.3 66,6 mg W1.5-1.7 159 mg W1.8-1.9 292 mg W1.4 120 mg W1.1 70 mg W1.2 80 mg

DT.06 (5,0 mg)

DT.07 (5,5 mg)

Sơ đồ 2. 4. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cao nước đun sôi

54

2.3.2. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612)

Lõi gỗ cây Sưa (1,2 kg) đem phơi khô, nghiền nhỏ sau đó ngâm chiết với

methanol ở nhiệt độ phòng (5 lần x 3 lít), lọc và cô cất trong chân không thu được phần

cặn methanol (60,3 g, M). Phần cặn methanol này được hoà tan trong lượng nước vừa

đủ và chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate

và nước. Cho các cặn chiết tương ứng là các cặn n-hexane (1,6 g, HDT-1),

dichloromethane (27,2 g, HDT-2), ethyl acetate (2,6 g, HDT-3) và nước (3,7 g, HDT-

4) ( Sơ đồ 2.5).

Chú thích: H: Heartwood D: Dalbergia T: tonkinensis

Lõi gỗ (1,2 kg) Ngâm MeOH (5 x 3,0L)

Cao methanol (M, 60,3 g) Chiết phân bố

Nước ethyl acetate n-hexane dichloromethane

HDT-4 (3,7 g) HDT-2 (27,2 g) HDT-3 (2,6 g)

HDT-1 (1,6 g)

Sơ đồ 2.5. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612)

2.3.2.1. Phân lập các chất từ cặn chiết dichloromethane

Cặn dịch chiết dichloromethane (27,2 g, HDT-2) được tiến hành phân tách

trên sắc ký cột CC, silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone

theo tỷ lệ (3/2-0/1) thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ (C1-C14). Phân đoạn C1 (1560

mg) được tách trên cột sắc ký silicagel pha thường, triển khai theo chế độ gradient

dung môi chloroform/methanol (12/1, v/v) , sau đó sử dụng phương pháp sắc kí bản

mỏng TLC thu được 4 phân đoạn từ (C1.1-C1.4). Tinh chế phân đoạn C1.1 (95 mg) bằng

sắc ký cột silicagel pha thường, giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/2,

v/v…) thu được chất sạch DT.08 (9 mg). Phân đoạn C1.2 (280 mg) được chiết tách

55

trên cột silicagel bằng hệ dung môi chloroform/methanol theo tỷ lệ (10/1; 9/1, v/v…)

được hợp chất DT.10 (7 mg) và DT.11 (10 mg).

Chạy tách chất phân đoạn C1.3 (314 mg) trên cột sắc ký và được rửa giải bởi

hệ dung môi chloroform/methanol (10/1,5, v/v) tăng dần độ phân cực, thu được 3

phân đoạn được ký hiệu từ C1.3.1-C1.3.3. Từ phân đoạn C1.3.1 (95 mg) ta thu được chất

sạch DT.09 (10 mg) bằng phương pháp chạy pha đảo với chất hấp phụ silicagel, được

lọc rửa bằng hệ dung môi methanol/nước theo tỷ lệ (1,5/1, v/v). Phân đoạn C2 (4108

mg) tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột silicagel pha thường (230-400 mesh), rửa giải

với hệ dung môi n-hexane/acetone (30/5-0/10) thu được 5 phân đoạn (C2.1-C2.5). Tinh

chế phân đoạn C2.1 (173 mg) bằng phương pháp sắc khí cột silicagel pha thường với

hệ dung môi rửa giải là chloroform/acetone (3/1, v/v) được chất sạch DT.12 (8 mg).

Phân đoạn C2.7 (341 mg) sau khi cất loại bỏ dung môi, thu được tinh thể kết tinh màu

trắng, sấy khô, trích mẫu thử hòa tan trong trong hệ chloroform/acetone theo tỷ lệ

(3/1, v/v) thấy mẫu tan, tiếp tục sắc kí cột hệ chloroform/acetone (3/1, v/v) thu được

hợp chất DT.13 (7 mg) (Sơ đồ 2.6).

56

SiO2, O.P C.C HA (3/2-0/1)

HDT-2 27,2 g

Chú thích: O.PC.C: sắc khí cột, pha thường RP18: pha đảo SiO2: silicagel Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ CM: chloroform/methanol Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethylacetate

C1 1560 mg

C4 670 mg

C3 566 mg

C5 850 mg

C2 4108 mg

C9-C11 1151 mg

C12-C14 1235 mg

C6-C8 1247 mg

SiO2, O.P C.C CM (12/1, v/v)

SiO2, O.P C.C HA (30/5-0/10)

C1.1 95 mg C1.2 280 mg C1.3 314mg

SiO2, O.P C.C CM (10/1, v/v)

SiO2, O.P C.C HA (3/2, v/v)

C2.4-2.5 455 mg

C2.6 196 mg

C2.7 341 mg

C1.4-1.5 133 mg SiO2, O.P C.C CM (10/1,5, v/v)

C2.8 564 mg SiO2, O.P C.C CA (3/1, v/v)

Rửa tinh thể CA (3/1, v/v)

C2.1 173 mg C2.2-2.3 506 mg

DT.13 7 mg

DT.12 8 mg

DT.08 9 mg

DT.11 10 mg

DT.10 7 mg

SiO2, RP18 C.C MW (1,5/1, v/v)

DT.09 10 mg

C1.3.1 95 mg

C1.3.2 64 mg

C1.3.3 33,6 mg

Sơ đồ 2.6. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-2

57

2.3.2.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate

Cao ethyl acetate (2,6 g, HDT-3) được tiến hành phân tách trên cột sắc ký

silicagel pha thường (40-63 mesh) được rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone

theo tỷ lệ (99/1-0/1) tăng dần độ phân cực, thu được 12 phân đoạn ký hiệu từ (E1-

E12). Phân đoạn E1 (0,5 g) tiếp tục được tách phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột

với chất hấp phụ silicagel pha thường và làm sạch bởi hệ dung môi

chloroform/acetone (30/2-20/3) thu được 8 phân đoạn từ (E1.1-E1.8).

Phân đoạn E1.1 (178.6 mg) được chạy tách chất trên cột sắc ký silicagel pha

thường và giải hấp phụ bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/2, 3/3, v/v) thu được

chất sạch DT.14 (7 mg). Phân đoạn E1.2 (200 mg) được rửa giải với hệ dung môi

chloroform/ethyl acetate theo tỷ lệ (11/3, 10/3, v/v), sau đó thực hiện sắc kí bản mỏng

thu được hợp chất DT.15 (10,0 mg). Phân đoạn E2 (0,12 g) được phân tách trên cột

silicagel pha thường, sau đó giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/1, v/v) thu

được hợp chất DT.16 (6,0 mg).

Phân đoạn E4 được tách phân đoạn trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ

dung môi giải hấp chloroform/ethyl acetate (3/1, v/v) thu được 15 phân đoạn ký hiệu

từ (E4.1-4.15). Tiếp tục tinh chế phân đoạn E4.14 (100 mg) bằng cột silicagel và làm sạch

bởi hệ dung môi chloroform/ethyl acetate theo tỷ lệ (4/1, v/v) được chất sạch DT.17

(10 mg) (Sơ đồ 2.7).

58

HDT-3 (2,6 g)

SiO2, O.P C.C HA (99/1-0/1)

E1 0,5 g

E2 0,12 g

E3 0,15 g

Chú thích: O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. RP18: pha đảo SiO2: silicagel TLC: sắc kí bản mỏng Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ MW: methanol/nước Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethyl acetate Hệ MW: methanol/nước E11-12 0,3 g

E8-10 0,6 g

E4 0,42 g

SiO2, O.P C.C CA (30/2-20/3)

SiO2, O.P C.C HA (5/1, v/v)

E5-7 0,45 g SiO2, O.P, CC CE (3/1, v/v)

E4.14 100 mg E4.8-4.11 63 mg E4.12-4.13 20,5 mg E4.15 15 mg E4.3 70 mg E4.4-4.7 50 mg E4.1-4.2 30 mg

SiO2, O.P C.C CE (4/1, v/v)

E1.2 200 mg 0 E1.3-E1.8 110 mg TLC 0 CE (11/3, 10/3, v/v)

E1.1 178,6 mg 0 SiO2, O.P C.C HA (3/2-3/3)

DT.16 6 mg

DT.17 10 mg

DT.15 10 mg

DT.14 7 mg

Sơ đồ 2.7. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-3

59

2.3.2.3. Phân lập các chất từ cao nước

Tiến hành tách phân đoạn cao nước (3,7 g, HDT-4) theo phương pháp sắc ký

cột trên chất hấp phụ silicagel pha thường với hệ gradient dung môi rửa giải là

chloroform/ethyl acetate tăng dần độ phân cực theo tỷ lệ (3/1-0/1), thu được 8 phân

đoạn ký hiệu từ (W1-W8).

Phân đoạn W2 (0,42 g) được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel pha

thường với hệ dung môi chloroform/ethyl acetate (2/1-0/1) thu được 15 phân đoạn từ

(W2.1-2.15). Chạy tách phân đoạn W3 (0,8 mg) trên cột silicagel pha thường và được giải

hấp bởi hệ dung môi chloroform/acetone theo tỷ lệ (12/1, 11/1, v/v) thu được 6 phân

đoạn từ (W3.1-W3.6). Tinh chế phân đoạn W3.3 (110 mg) trên cột CC silicagel pha thường

và được làm sạch bằng hệ rửa giải chloroform/acetone (8/2, v/v…) thu được chất sạch

DT.18 (8,0 mg) ( Sơ đồ 2.8).

60

HDT-4 (3,7 g)

SiO2, O.P C.C CE (3/1-0/1)

Chú thích: O.PC.C: sắc khí cột, pha thường SiO2: silicagel Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethylacetate

W3 0,8 g W2 0,42 g W1-2 0,35 g

SiO2, O.P C.C 230-400 mesh CE (2/1-0/1)

W4-8 0,5 g SiO2, O.PC.C CA (12/1-0/1)

W2.1-2.3 31,2 mg W2.4- 2.7 42 mg W2.8-2.11 101 mg W2.12- 2.13 93,5 mg W2.14 80 mg W2.15 15 mg W3.1-3.2 300 mg W3.3 110 mg

CE (5/2, v/v),kết tinh chậm, rửa acetone 3 lần

W3.4-3.6 250 mg SiO2, O.PC.C CA (8/2, v/v)

DT.18 8 mg mg

MCNM-2 13 mg

Sơ đồ 2.8. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết HDT-4

61

2.4. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập

Pinocembrin (DT.01): chất bột màu vàng, (C15H12O4, M = 256), 1H-NMR (500

MHz, DMSO): 7,44 (2H, t, 8,3 Hz, H-2', H-6'), 7,52 (2H, t, 8,4 Hz, H-3', H-5'), 7,39 (1H,

t, 7,0 Hz, H-4'), 5,92 (1H, d, 2,0 Hz, H-6) 5,89 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 5,57 (1H, dd, 12,6,

13C-NMR (125 MHz, DMSO): 195,8 (s, C-4), 167,0 (s, C-7), 163,5 (s, C-5), 138,7

3,1, H-2), 3,24 (1H, dd, 17,1, 12,6 Hz, Hb-3), 2,77 (1H, dd, 17,1, 2,7 Hz, Ha-3), (PL-1).

(s, C-1'), 128,5 (d, C-3', C- 5'), 128,5 (d, C-4'), 162,7 (s, C-8a), 127,0 (d, C-2', C-6'),

101,7 (s, C-4a), 95,1 (d, C-6), 96,0 (d, C-8), 78,4 (d, C-2), 42,1 (t, C-3), (PL-1).

Naringenin (DT.02): bột màu vàng, (C15H12O5, M = 272), 1H-NMR (500

MHz, CD3OD): 7,34 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6'), 6,83 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5'), 5,91

(2H, d, 2,0 Hz, H-6, H-8), 5,36 (1H, dd, 13,0, 3,0 Hz, H-2), 3,13 (1H, dd, 17,0, 13,0

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 197,8 (s, C-4), 168,4 (s, C-7), 165,5 (s, C-5),

Hz, Hb-3), 2,72 (1H, dd, 17,0, 3,0 Hz, Ha-3), (PL-2).

164,9 (s, C-8a), 159,1 (s, C-4'), 131,8 (s, C-1'), 129,1 (d, C-2', C-6'), 116,4 (d, C-3', C-

5'), 103,4 (s, C-4a), 97,1 (d, C-6), 96,2 (d, C-8), 80,5 (d, C-2), 42,3 (t, C-3), (PL-2).

3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03): bột màu trắng

(C18H20O4, M = 300), 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7,14 (1H, t, 7,5 Hz, H-5'), 6,67

(1H, s, H-6), 6,54 (1H, s, H-3), 6,76 (1H, d, 7,5 Hz, H-6'), 6,64 (1H, s, H-2'), 6,65

(1H, s, H-4'), 6,24 (1H, ddd, 17,0, 10,5, 7,0 Hz, H-2''), 5,19 (1H, d,10,0 Hz, Ha-3),

5,04 (1H, d, 6,5 Hz, H-1''), 4,94 (1H, d, 17,0, Hz, Hb-3), 3,88 (3H, s, 4-OCH3), 3,73

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 155,5 (s, C-3'), 151,5 (s, C-2), 148,3 (s, C-4),

(3H, s, 2-OCH3), 3,77 (3H, s, 5-OCH3), (PL-3).

145,4 (s, C-1'), 143,0 (s,C-5), 140,2 (d, C-2''), 129,3 (d, C-5'), 123,0 (s, C-1), 121,1

(d, C-6'), 112,9 (d, C-4'), 116,3 (t, C-3''), 113,7 (s, C-6), 116,2 (d, C-2'), 98,5 (d, C-3),

56,8 (q, 2-OCH3), 56,7 (q, 5-OCH3), 56, 2 (q, 4-OCH3), 47,0 (d, C-1''), (PL-3).

Medicarpin (DT.04): dạng bột trắng, (C17H17O4, M = 285), 1H-NMR (500

MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,27 (1H, d, 8,5 Hz, H-1), 7,12 (1H, d, 8,0 Hz, H-7), 6,51

(1H, dd, 2,5, 8,0 Hz, H-2), 6,42 (1H, dd, 2,0, 8,0 Hz, H-8), 6,37 (1H, d, 2,5 Hz, H-

10), 6,33 (1H, d, 2,5 Hz, H-4), 5,41 (1H, t, 7,0 Hz, H-11a), 3,47 (1H, dd, 2,5, 10,5

62

Hz, H-6a), 3,71 (3H, s, 9-OCH3), 4,17 (1H, dd, 2,5, 10,5 Hz, H-6) 3,51 (1H, t, 10,5

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 162,5 (s, C-3), 161,9 (s, C-4a), 160,0 (s,

H-6) (PL-4).

C-9), 158,0 (s, C-10a), 133,2 (d, C-1), 125,9 (d, C-7), 120,8 (s, C-6b), 112,9 (s, C-

11b), 110,7 (d, C-2), 107,2 (d, C-8), 104,1 (d, C-4), 97,6 (d, C-10), 80,0 (d, C-11a),

67,5 (t, C-6), 55,9 (q, 9- OCH3), 40,8 (d, C-6a), (PL-4).

Buteaspermanol (DT.05): bột màu trắng, (C16H12O5, M = 284), 1H-NMR

(500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,56 (2H, t, J=7,0 Hz, H-2, H-6), 7,40-7,45 (3H, m,

H-3, H-4, H-5), 7,31 (1H, s, H-5), 6,43 (1H, s, H-8), 5,09 (1H, d, J=12,0 Hz, H-2),

13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 194,3 (s, C-4), 159,7 (s, C-8a), 156,8 (s,

4,53 (1H, d, J=12,0 Hz, H-3), 3,88 (3H, s, 7-OCH3), (PL-5).

C-7), 145,5 (s, C-1),138,8 (s, C-6), 129,8 (s, C-4), 129,3 (d, C-3, C-5), 128,9 (d, C-

2, C-6), 112,1 (s, C-4a), 108,2 (d, C-5), 104,5 (d, C-8), 85,9 (d, C-3), 74,6 (d, C-2),

56,6 (q, 7-OCH3), (PL-5).

Daltonkin A (DT.06): Chất rắn vô định hình màu trắng, tan tốt trong dung môi

metanol. Xác định định tính bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn

60 F254 (Merck), dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat/axit formic = 80/120/2; Rf

= 0,40; (C18H16O6, M = 328), IR (film, cm-1): 3354, 2947, 2835, 1701, 1637, 1610,

1452, 1022, 975, 689; UV λmax (MeOH): 293 nm; CD (c 0,4, MeOH): ∆ε288 (nm) 

10,43, ∆ε330 (nm) + 2,10; HR-ESI-MS: m/z 327,0868 [M  H] (tính toán C18H15O6 =

327,0868); 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) δH (ppm): 5,47 (1H, dd, J = 13,0, 3,0

Hz, H-2), 3,11 (1H, dd, J = 17,0, 13,0 Hz, H-3ax), 2,80 (1H, dd, J = 17,0 và 3,0 Hz,

H-3eq), 6,02 (1H, s, H-6), 7,52 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2′ và H-6′), 7,44 (2H, d, J = 7,5

Hz, H-3′ và H-5′), 7,39 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4′), 2,86 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-9), 2,49

13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) δC (ppm): 80,5 (C-2), 44,3 (C-3), 197,5 (C-

(2H, t, J = 8,0 Hz, H-10), (PL-6).

4), 103,3 (C-4a), 162,8 (C-5), 95,6 (C-6), 166,1 (C-7), 108,5 (C-8), 162,8 (C-8a), 18,7

(C-9), 34,1 (C-10), 177,7 (C-11), 140,5 (C-1′), 127,3 (C-2′ và C-6′), 129,6 (C-4′),

129,7 (C-3′ và C-5′), (PL-6).

63

Daltonkin B (DT.07): chất rắn vô định hình màu trắng, tan tốt trong dung môi

metanol. Xác định định tính bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn

60 F254 (Merck), dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat/axit formic = 80/80/2; Rf =

0,25; (C21H20O9, M = 415), IR (film, cm-1): 3369, 2987, 2864, 1751, 1676, 1575, 1411,

1022, 894, 754, 696; UV λmax (MeOH): 297 nm; CD (c 0,4, MeOH): ∆ε291 (nm)  8,29,

∆ε330 (nm) + 2,05; HR-ESI-MS m/z 415,1014 [M  H] (tính toán C21H19O9 415,1024);

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) δH (ppm): 5,39 (1H,

dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-2), 3,13 (1H, dd, J = 17,0, 13,0 Hz, H-3ax), 2,79 (1H, dd, J =

17,0, 3,0 Hz, H-3eq), 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′ và H-6′), 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz,

H-3′ và H-5′), 2,85 (2H, m, H-9), 2,55 (2H, m, H-10), 2,81 (2H, m, H-9′), 2,51 (2H,

13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) δC (ppm): 80,3 (C-2), 44,0 (C-3), 198,6 (C-

m, H-10′), (PL-7).

4), 103,4 (C-4a), 159,8 (C-5), 109,0 (C-6), 163,9 (C-7), 108,3 (C-8), 161,1 (C-8a),

18,8 (C-9), 34,4 (C-10), 179,1 (C-11), 19,4 (C-9′), 34,8 (C-10′), 179,2 (C-11′), 131,4

(C-1′), 128,8 (C-2′ và C-6′), 158,9 (C-4′), 116,4 (C-3′ và C-5′), (trang PL-7).

Dalbergin (DT.08): tinh thể màu vàng, (C16H12O4, M = 268), 1H-NMR (500

MHz, CD3OD): 7,57 (3H, m, H-3', H-4', H-5'), 7,51 (2H, m, H-2', H-6'), 7,06 (1H, s,

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 163,8 (s, C-2), 158,2 (s, C-4), 153,6 (s, C-7),

H-8), 6,88 (1H, s, H-5), 6,21 (1H, s, H-3), 3,99 (3H, s, 7-OCH3), (PL-8).

150,4 (s, C-4a), 145,2 (s, C-6), 137,1 (s, C-1'), 130,8 (d, C-4'), 129,9 (d, C-3', C-5'),

129,5 (d, C-2', C-6'), 112,3 (d, C-3), 111,9 (d, C-5), 113,1 (s, C-8a), 101,1 (d, C-8),

56,8 (q, 7-OCH3), (PL-8).

Isoliquiritigenin (DT.09): chất bột màu trắng, vô định hình, (C15H12O4, M =

316). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H ppm: 7,74 (4H, s, H-α, H-β, H-2, H-6), 6,84

(2H, d, J= 8,5 Hz, H-3, H-5), 6,27 (1H, d, J= 2,5 Hz, H-3'), 6,41 (1H, dd, J= 9,0, 2,5 Hz,

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C ppm: 191,5 (s, C-4), 144,3 (C- β), 117,5

H-5'), 8,14 (1H, d, J= 9,0 Hz, H-6'), (PL-9).

(C-α), 131,2 (d, C-2, C-6), 115,9 (d, C-3, C-5), 125,8 (s, C-1), 165,0 (s, C-2'), 102,6

(C-3'), 165,8 (s, C-4'), 108,2 (C-5'), 132,8 (C-6'), 113,0 (s, C-1'), (PL-9).

64

7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10): chất rắn không màu (C15H12O5, M =

272); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H: 7,64 (1H, d, 9,0Hz, H-5), 6,88 (1H, s, H-4'),

6,74 (2H, s, H-2', H-6'), 6,49 (1H, dd, 2,5, 9,0 Hz, H-6), 6,32 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 5,37

(1H, dd, 30; 12,5 Hz, H-2), 3,03 (1H, dd, 12,5; 17,0 Hz, H-3ax), 2,62 (1H, dd, 3,0, 17,0

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 190,0 (C-4), 164,6 (C-8a), 163,1 (C-7),

Hz, H-3eq), (PL-10).

145,1 (C-3'), 145,6 (C-5'), 129,9 (C-1'); 128,3 (C-5); 117,8 (C-4'), 114,2 (C-2', C-6'),

113,5 (C-10), 110,4 (C-6), 102,5 (C-8), 78,9 (C-2), 43,2 (C-3), (PL-10).

Vestitone (DT.11): chất bột màu trắng (C16H14O5, M = 286); 1H-NMR (500

MHz, DMSO-d6): 7,67 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,84 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,41 (1H, d,

2,0 Hz, H-8), 6.51 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-6), 6.31 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-5'), 6,29

(1H, d, 2,0 Hz, H-3'), 4,48 (1H, t, 11,0 Hz, Ha-2), 4,40 (1H, dd, 11,0, 5,5, Hb-2), 4,10

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): 190,5 (s, C-4), 164,2 (s, C-7), 163,2 (s, C-

(1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, H-3), 3,67 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-11).

8a), 158,1 (s, C-4'), 158,0 (s, C-2'), 130,5 (d, C-5), 128,9 (d, C-6'), 114,2 (s, C-1'),

99,4 (d, C-3'), 106,9 (d, C-5'), 103,6 (d, C-6), 114,1 (s, C-4a), 102,3 (d, C-8), 70,4 (t,

C-2), 56,0 (q, 4'-OCH3), 46,6 (d, C-3), (PL-11).

Calycosin (DT.12): chất bột màu vàng, vô định hình (C16H12O5, M = 287); 1H-

NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6): 8,28 (1H, s, H-2), 7,97 (1H, d, 8,5 Hz, H-5),

6,93 (dd, 9,0; 2,0 Hz, H-6), 6,92 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 7,05 (1H, s, H-2'), 6,94 ( 1H,

13C-NMR (125 MHz, 500 MHz, DMSO-d6): 174,5 (s, C-4), 162,5 (s, C-7),

d, 9,0 Hz, H-6'), 6,94 ( 1H, d, 9,0 Hz, H-5'), 3,79 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-12).

147,5 (s, C- C-4'), 157,3 (s, C-8a), 153,0 (d, C-2), 119,7 (d, C-6'), 127,3 (d, C-5),

123,3 (s, C-3), 124,7 (s, C-1'), 116,6 (s, C-4a), 116.4 (s, C-2'), 115,1 (d, C-6), 146,0

(d, C-3'), 112,0 (d, C-5'), 102,5 (d, C-8), 55,6 (q, 4'-OCH3), (PL-12).

4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone (DT.13): dạng bột màu trắng, (C16H12O4, M

= 268), 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 7,97 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,94 (1H dd, J=8,8,

2,1 Hz, H-6), 6,86 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,50, (2H, d, J=8,7 Hz, H-2', H-6'), 6,86 (2H,

d, J=8,7 Hz, H-3', H-5'), 3,78(3H, s, 3-OCH3), (PL-13).

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): 175,1 (s, C-4), 163,0 (s, C-7), 157,9 (s, C-4'),

65

159,4 (s, C-8a), 153,6 (s, C-2), 130,5 (d, C-2', C-6'), 124,7 (d, C-5), 127,8 (s, C-3), 123,6

(s, C-1'), 117,7 (s, C-4a), 115,7 (d, C-6), 114,1 (d, C-3', C-5'), 102,6 (d, C-8), 55,6 (q, 3-

OCH3), (PL-13).

Liquiritigenin (DT.14): chất bột màu vàng, (C15H12O4, M = 256), 1H-NMR

(500 MHz, methanol-d4): 7,65 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 7,32 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6'),

6,80 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5'), 6,51 (1H, dd, 2,5, 8,5 Hz, H-6), 6,33 (1H, d, 2,5 Hz,

H-8), 5,42 (1H, dd, 3,0, 13,0 Hz, H-2), 3,06 (1H, dd, 13,0, 17,0 Hz, Ha-3), 2,64 (1H,

13C-NMR (125 MHz, methanol-d4): 190,1 (s, C-4), 164,7 (s, C-8a), 163,6 (s,

dd, 3,0, 17,0, Hb-3), (PL-14)

C-7), 157,6 (s, C-4'), 131,4 (s, C-1'), 129,3 (s, C-5), 128,4 (d, C-2', C-6'), 115,2 (d,

C-3', C- 5'), 110,5 (s, C-4a), 114,8 (d, C-6), 102,8 (d, C-8), 79,0 (d, C-2), 43,2 (t,

C-3), (PL-14)

Sativanone (DT.15): chất bột màu trắng: (C17H16O5, M = 300); 1H-NMR (500

MHz, Acetone-d6) H: 9,40 (1H, br s, 7-OH), 7,77 (1H, d, 9,0 Hz, H-5), 7,01 (1H, d,

8,5 Hz, H-6'), 6,59 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 6,58 (1H, dd, 9,0, 2,5 Hz, H-6), 6,48 (1H,

dd, 8,5, 2,5 Hz, H-5'), 6,40 (1H, d, 2,5 Hz, H-3'), 4,56 (1H, t, 11,0 Hz, H-2ax), 4,45

(1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-2eq), 4,18 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-3), 3,79 (3H, s, 2'-OCH3),

13C-NMR (125 MHz, Acetone-d6) C: 190,7 (C-4), 164,5 (C-7), 164,3 (C-8a),

3,78 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-15).

161,1 (C-4'), 159,1 (C-2'), 131,2 (C-5), 129,7 (C-6'), 117,0 (C-1'), 115,6 (C-4a), 110,8

(C-6), 105,3 (C-5'), 103,1 (C-3'), 99,2 (C-8), 71,4 (C-2), 55,6 (4'-OCH3), 55,2 (2'-

OCH3), 47,6 (C-3), (PL-15).

3'-O-methylviolanone (DT.16): chất bột màu trắng, (C18H18O6, M = 330), 1H-

NMR (500 MHz, CD3OD): 6,54 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,86 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,36

(1H, d, 2,5 Hz, H-8), 6,54 (1H, dd, 8,5, 2,5 Hz, H-6), 6,75 (1H, d, 8,5 Hz, H-5'), 4,55

(1H, t, 11,5 Hz, Ha-2), 4,15 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, Hb-2), 4,44 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz,

H-3), 3,82 (3H, s, 4'-OCH3), 3,83 (3H, s, 2'-OCH3), 3,85 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-16).

13C-NMR (125MHz, CD3OD): 194,2 (s, C-4), 166,5 (s, C-7), 165,8 (s, C-8a),

66

155,1 (s, C-4'), 153,2 (s, C-2'), 130,4 (d, C-5), 126,0 (d, C-6'), 123,1 (s, C-1'), 143,6

(s, C-3'), 108,8 (d, C-5'), 111,8 (d, C-6), 115,6 (s, C-4a), 103,7 (d, C-8), 72,3 (t, C-2),

61,2 (q, 3'-OCH3), 61,0 (q, 2'-OCH3), 56,0 (q, 4'-OCH3), 49,5 (d, C-3), (PL-16).

Sulfuretin (DT.17): Chất bột màu vàng; (C15H10O5, M = 270); 1H-NMR (500

MHz, DMSO-d6) H: 7,60 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 7,44 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 7,23 (1H,

d, 2,0, 8,5 Hz, H-6), 6,83 (1H, d, 8,5 Hz, H-5'), 6,74 (1H, d, 2,0 Hz, H-2'), 6,69 (1H,

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 181,2 (C-4), 167,5 (C-7), 166,3 (C-

dd, 2,0, 8,5 Hz, H-6'), 6,62 (1H, s, H-2), (PL-17).

8a), 148,2 (C-4'), 145,7 (C-3), 145,6 (C-3'), 125,7 (C-5), 124,5 (C-1'), 123,4 (C-

6'), 117,9 (C-2'), 116,0 (C- 5'), 113,1 (C-4a), 112,9 (C-6), 111,9 (C-2), 98,4 (C-8),

(PL-17).

Formononetin (DT.18): chất bột màu vàng, vô định hình, (C16H14O4, M =

270), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 8,18 (1H, s, H-2), 8,06 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5),

6,99 (1H dd, J=8,5, 2,5 Hz, H-6), 6,90 (1H, d, J=2,5 Hz, H-8), 7,56, (2H, d, J=8,5 Hz,

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 178,1 (s, C-4), 164,9 (s, C-7), 161,1 (s, C-4'),

H-2', H-6'), 6,98 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3', H-5'), 3,83(3H, s, 4'-OCH3), (PL-18).

159,8 (s, C-8a), 154,8 (d, C-2), 131,4 (d, C-2', C-6'), 128,5 (d, C-5), 125,7 (s, C-3), 125,6

(s, C-1'), 118,1 (s, C-4a), 116,6 (d, C-6), 114,9 (d, C-3', C-5'), 103,3 (d, C-8), 55,7 (q, 4'-

OCH3), (PL-18).

67

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ VI PHẪU VÀ DNA CỦA CÂY SƯA

(DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN)

Cho đến thời điểm này, chỉ có một công trình nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) về mặt thực vật sinh học phân tích ADN trong nước [14] và ba

công trình ngoài nước [80-82]. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào đầy đủ và kỹ

lưỡng về mặt thực vật (đặc biệt là đặc điểm vi học chưa có một công bố nào). Trong

nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các đặc điểm vi học của thân, lá và vi học bột

thân của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) và sử dụng DNA Markers để hỗ trợ

cho phân loại hình thái cũng như bổ sung cơ sở dữ liệu di truyền cho loài này.

3.1.1. Kết quả nghiên cứu vi phẫu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

3.1.1.1. Vi phẫu lá Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Mặt cắt ngang qua lá cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) gồm 2 phần: phiến

lá và gân lá. Phần gân lá lồi lên rõ ràng ở mặt dưới của phiến lá. Biểu bì trên (2) là

một lớp tế bào có kích thước tương đối đồng đều nhau mang lông che chở (1); Mô

dày trên (3) gặp ở phần gân chính của phiến lá, gồm các tế bào đỏ đậm, có vách dày,

xếp thành hình trụ; Mô cứng gồm 3-5 lớp tế bào có vách dày, màu xanh, xếp thành

hình cung bao lấy phía trên (4) và phía dưới (7) của bó libe gỗ; Gỗ (5) gồm các bó

mạch gỗ có kích thước lớn ở phía dưới và nỏ ở phía trên, xếp xen kẽ với các cụm mô

mềm gỗ; Libe (6) gồm các nhóm tế bào có kích thước nhỏ, xếp thành cung phía trong

vòng mô cứng; Mô dày dưới (8) có khoảng 3-5 lớp tế bào vách dày, màu đỏ đậm;

Mô mềm (9) gồm các tế bào màu đỏ, vách mỏng, kích thước và hình thái thay đổi;

Biểu bì dưới (10) cấu tạo bởi một lớp tế bào có kích thước tương đối đều nhau, mỗi

tế báo có kích thước nhỏ hơn mỗi tế bào của biểu bì trên và không mang lông che

chở.

Cấu tạo phiến lá; Biểu bì trên và dưới tiếp nối từng phần gân lá (11), (12);

Mô giậu (13) gồm 1-2 hàng tế bào dài và hẹp xếp sít nhau. Hạ bì trên (12) gồm

vài tế bào có kích thước lớn, mỏng bắt màu hồng nhạt, sắp xếp không theo qui

luật.

68

Hình 3.1. Vi phẫu lá Sưa 1- Lông che chở;

2- Biểu bì trên;

3-Mô dày trên;

4; 7- Mô cứng;

5- Gỗ;

6- Libe;

8- Mô dày dưới;

9- Mô mềm;

10- Biểu bì dưới

Hình 3.2. Phiến lá Sưa 11- Biểu bì trên;

12- Hạ bì trên;

13- Mô giậu;

14- Mô khuyết;

15 – Biểu bì dưới.

3.1.1.2. Vi phẫu thân cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Mặt cắt ngang vi phẫu có hình tròn. Từ ngoài vào trong cấu tạo gồm có: Bần (1)

có khoảng 3-4 hàng tế bào hình chữ nhật xếp vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm; Tinh thể

calcioxalat (2) hình khối xếp thành vòng tròn trong mô mềm vỏ và bắt màu xanh; Mô

mềm vỏ (3) gồm các tế bào có vách mỏng, màu đỏ, hình thái thay đổi sắp xếp không

theo qui luật; Sợi libe là các đám tế bào có vách dày, màu xanh có thể tập chung thành

nhóm phía trên bó libe mô mềm; Vỏ (4) hoặc gồm các tế bào mô cứng xếp thành từng

cụm rời trong bó libe cấp hai (5); Libe cấp hai (6) gồm các tế bào có vách mỏng, xếp

thành dãy xuyên tâm; Tầng phát sinh libe-gỗ (7), là một lớp tế bào hình chữ nhật, màu

đỏ nằm ở giữa libe cấp 2 và gỗ cấp 2; Gỗ cấp 2 gồm các mạch gỗ lớn (8) và tế bào mô

mềm mỡ (10) có vách dày hóa gỗ, màu xanh; Sợi gỗ (9) là các cụm tế bào có vách dày,

màu xanh, xếp thành từng cụm rải rác ở gỗ cấp 2; Tia ruột hẹp.

69

Hình 3.3. Vi phẫu thân loài Sưa 1- Bần;

2- Tinh thể calcioxalat hình

khối;

3- Mô mềm;

4- Sợi vỏ;

5- Sợi libe;

6- Libe;

7- Tầng phát sinh libe-gỗ;

8- Mạch gỗ lớn ;

9- Sợi gỗ;

10- Mô mềm gỗ;

3.1.1.3. Đặc điểm bột lõi thân cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Hình 3.4. Đặc điểm bột lõi thân 1,2- Hạt tinh bột;

3a,3b- Mạch điểm;

4-Sợi

5- Tinh thế calcioxalat hình khối;

6- Tế bào cứng;

7- Mảnh mang màu.

Bột màu nâu, không mùi, không vị. Soi trên kính hiển vi có các đặc điểm sau:

hạt tinh bột đơn, hình tròn hoặc hình bẩu dục. Mảnh mạch điểm. Tinh thể calcioxalat

hình khối. Sợi dài rõ vách tế bào. Tế bào cứng và mảnh mang màu. Bột màu nâu,

không mùi, khôngvị. Soi trên kính hiển vi có các đặc điểm sau: Hạt tinh bột đơn, hình

tròn hoặc hình bầu dục. Mảnh mạch điểm. Tinh thể calcioxalat hình khối. Sợi dài rõ

vách tế bào. Tế bào cứng và mảnh mang màu.

Đặc điểm vi phẫu lá, thân và bột lõi thân từ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

được thu hái tại Đak Lak đã được nghiên cứu lần đầu tiên. Các đặc điểm giải phẫu học

này đã được miêu tả cụ thể, góp phần tiêu chuẩn hóa loài cây gỗ quý này.

70

3.1.2. Kết quả nghiên cứu DNA cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

3.1.2.1. Kết quả nhân bản vùng gen rpoC

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% cho thấy rõ một

băng DNA kích thước khoảng 600 bp tương ứng với kích thước vùng gen rpoC dự

kiến (hình 3.6)

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% 1. Mẫu Trắc, 2.Mẫu Sưa đỏ

3.1.2.2. Đặc điểm phân tử vùng gen rpoC

Kết quả cho thấy: Chỉ số tương đồng của vùng gen rpoC từ hai mẫu nghiên

cứu với trình tự tương đồng từ hai loài Trắc (Dalbergia cochinchinensis) và Sưa

(Dalbergia tonkinensis) tham khảo là 99%. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy

vùng gen rpoC có khả năng dùng trong phân loại các loài của chi Sưa (Dalbergia).

Đoạn gen rpoC dài 600 bp của hai loài Dalbergia cochinchinensis và

Dalbergia tonkinensis của Việt Nam đã được đăng kí tại Genbank với mã số lần lượt

là KY287755 và KY287750.

3.1.2.3. So sánh khả năng phân loại loài sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis) Việt Nam

của một số vùng gen lục lạp

3 đoạn gen rpoB, rbcL và rpoC có chiều dài 600bp đã được nhân bản và đọc trình tự

2 chiều. Kết quả giải trình tự hai chiều nhận được của mỗi đoạn gen sau đó được ghép nối

với nhau để thu về một trình tự duy nhất bằng phần mềm Chromas Pro. Trình tự thu được

sau hiệu chỉnh ở định dạng file fasta (.fas) được đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng

gen (NCBI) bằng công cụ BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

71

Công cụ BLAST cho phép chúng tôi định danh đến mức độ loài của các trình

tự thu được bằng cách xác định các trình tự tương đồng với trình tự này trong cơ sở

dữ liệu trên ngân hàng gen (GenBank). Sử dụng phương pháp tìm kiếm những trình

tự có điểm số bắt cặp cao giữa chuỗi truy vấn và các chuỗi trong cơ sở dữ liệu, công

cụ BLAST tìm những trình tự tương đồng thông qua việc phát hiện các đoạn bắt cặp

ngắn theo từng bộ 3 nulceotide gối lên nhau giữa trình tự cần truy vấn và trình tự có

sẵn trong cơ sở dữ liệu. Tiếp đó, nếu mỗi bộ 3 này đạt tới một ngưỡng T tối thiểu

được tính toán bằng ma trận điểm (scoring matrix), chúng sẽ được đưa vào sắp xếp

thẳng hàng (alignment) bởi thuật toán được sử dụng trong công cụ BLAST. BLAST

sẽ cho ra kết quả các trình tự tương đồng được thể hiện ở dạng bảng đi kèm với thông

tin của trình tự trên ngân hàng gen cùng với các chỉ số tương đồng (ident), độ dài của

chuỗi trình tự được bắt cặp ở dạng phần trăm (query cover), điểm số bắt cặp giữa 2

trình tự. Trình tự nào có điểm số tương đồng cao hơn sẽ có mức độ giống nhau cao

hơn. Dựa vào việc phân tích các chỉ số tương đồng của các trình tự sẽ giúp đưa ra

được kết quả giám định loài cho các mẫu vật nghiên cứu.

Kết quả so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ

Blast cho thấy 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC bắt cặp cao nhất với loài Dalbergia

tonkinensis với điểm số bắt cặp tương đồng (query cover) tương ứng lần lượt là 99%,

98% và 97%. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại và

giải mã đúng trình tự vùng gen đích.

Kết quả phân tích trình tự trên phần mềm Chromas Pro cho thấy đã giải mã tốt

được đoạn gen có chiều dài 511bp cho vùng gen rpoC, đoạn gen dài 563pb cho gen

rbcL và đoạn gen dài 565bp cho gen rpoB. Kết quả phân tích lần lượt 3 vùng gen này

trên phần mềm ClustalW, so sánh với 4 loài Dalbergia khác (bảng 2) cho thấy đoạn

gen rpoC dài 511bp của Sưa mã hoá được cho 170 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm

22,9%; Thymine chiếm 30,9%; Adenine chiếm 29,7%; Cytosine chiếm 16,4%. Thành

phần A và thành phần T không có sự dao động lớn. Thành phần C và G có khoảng dao

động lần lượt 16,4% đến 22,9% và 16,4% đến 23,5%. Phát hiện 8 vị trí biến đổi (variable)

tương ứng ở các vị trí 54 (G->A); 62 (A->G); 64(A->T); 70(A->G); 74(A->C); 238(A-

>G); 290(A->G); 369(C->T), trong đó giá trị mang thông tin (Parsimory informative)

chiếm 1 vị trí là 54 (G->A). Số cặp nucleotide tương đồng trung bình là 503. Hệ số trung

72

bình của cặp Si (Transition) và Sv (transversion) là 1.0. Hệ số này đối với vị trí codon

thứ nhất, thứ hai và thứ ba tương ứng là 1.

Đoạn gen rpoB dài 565bp của Sưa đỏ mã hoá được cho 197 acid amin. Tỷ lệ

Guanine chiếm 23,6%; Thymine chiếm 26,7%; Adenine chiếm 31,2%; Cytosine

chiếm 18,5%. Phát hiện 05 vị trí biến đổi (variable) tương ứng ở các vị trí 226 (G-

>A); 264 (T->A); 414(G->T); 563(C->T); 608(G->A) ở cả hai loài Sưa đỏ và Trắc),

trong đó có 1 vị trí là 563(C->T) có ý nghĩa Parsimony

Vùng gen rbcL của 2 mẫu nghiên cứu sau khi loại bỏ các vùng nhiễu rối thì

thu được đoạn gen dài 562bp. . Kết quả phân tích trên phần mềm Mega cho thấy đoạn

gen này mã hoá được cho 183 acid amin. Tỷ lệ Guanine chiếm 22,4%; Thymine

chiếm 29,3%; Adenine chiếm 27%; Cytosine chiếm 21,3%. Khi so sánh vùng gen

này với vùng gen rbcL tương ứng của 5 loài Dalbergia khác trên Genbank phát hiện

thấy có 14 vị trí biến đổi, trong đó có 11 vị trí Nu có ý nghĩa Parsimony.

Kết quả so sánh khả năng phân biệt ở cấp độ loài của 3 vùng gen này với 6

loài Dalbergia khác (sử dụng loài giáng hương Pterocarpus santalinus (KJ749960.1)

là loài ngoài nhóm) được thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền của từng vùng gen so sánh giữa 2 mẫu nghiên

cứu với 6 loài trên Genbank

rpoB rbcL

rpoC 0 0 0 0 0 0 0.0032 0.008 0.0024 0.003 0 0.003 0 0 0 0 0 0.01 0.0067 0.006 0.0032

C-561-L C-564-L D. tonkinensis (FR854140) D. cochinchinensis (FR854124) D. assamica (FR854122) D. sissoo (JX856444) D. odorifera (GQ435947.1) Pterocarpus santalinus (KJ749960.1) 0.0064 0.007 0.015

Gen rpoB và rpoC là gen mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase

lục lạp. Khi nghiên cứu các cây họ dầu (Dipterocarpaceae), đã nhận thấy gen rpoB là

thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài. Hiện nay rpoB là gen được sử dụng nhiều

trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên

cứu các chủng có quan hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong

73

nhiều nghiên cứu để xác định loài vi khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là

chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác. Trong các nghiên cứu gần

đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen

rpoC1 là thấp nhất (43%) [83].

Trong nghiên cứu này của chúng tôi, kết quả kiểm tra khả năng phân loại một

số loài sưa (bảng 3.1) của 3 vùng gen rpoB, rpoc và rbcL cho thấy đoạn gen rpoB dài

565bp nhưng chỉ chứa 5 vị trí Nu có khả năng biến đổi, trong đó có 1 Nu mang ý

nghĩa parsimony, trong khi đoạn gen rpoC dài 511bp chứa 8 vị trí Nu có khả năng

biến đổi, 1 vị trí Nu có ý nghĩa Parsimony, điều đó cho thấy gen rpoC có tiềm năng

phân loại các loài sưa tốt hơn so với gen rpoB, tuy nhiên khi so sánh các hệ số khoảng

cách di truyền giữa 2 vùng gen này thì cho thấy khả năng phân loại của 2 gen này khá

giống nhau.

Cụ thể vùng gen rpoC không chỉ ra được sự khác biệt giữa 3 loài D.

tonkinensis, D. sissoo và D. odorifera nhưng phân biệt khá rõ các loài còn lại. Trong

khi vùng gen rpoB không chỉ ra được sự khác biệt giữa là D. tonkinensis và D.

odorifera nhưng với các loài còn lại thì cho chỉ số về khoảng cách di truyền cũng

không cao. Như vậy có thể kết luận đối với 2 vùng gen rpoB và rpoC thì có khả năng

phân biệt được các loài sưa, tuy nhiên không phải là chỉ thị thích hợp nhất để sử dụng.

So sánh với 2 vùng gen rpoB và rpoC thì vùng gen rbcL đã thấy rõ khả năng

phân biệt các loài sưa tốt hơn hẳn so với 2 vùng gen rpoB và rpoC. Kết quả so sánh

vùng gen rbcL với 5 loài sưa khác (GB) thì phát hiện14 vị trí biến đổi, trong đó có

đến 11 vị trí Nu mang ý nghĩa Parsimony. Chỉ số khoảng cách di truyền khi so sánh

với 5 loài sưa khác của vùng gen này đều cho chỉ số tương đối cao hơn nhiều so với

2 vùng gen rpoB và rpoC.

Khả năng phân biệt các loài Sưa của 3 vùng gen rpoB, rpoC và rbcL được thể

hiện ở hình 3.6.

0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0

rpoB

rpoC

rbcL

74

Hình 3.6. So sánh khả năng phân biệt giữa các loài Dalbergia của 3 vùng gen nghiên cứu

Kết luận: 3 vùng gen rpoB, rpoC và rbcL là thích hợp để phân loại các loài

thuộc chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt tương ứng lần lượt là 99%, 98% và 97%.

Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại và giải mã đúng

trình tự vùng gen đích.

Trình tự 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC của loài sưa Việt Nam đã được đăng

ký trên Ngân hàng Gen với số hiệu lần lượt là KY283103, KY287755 và KY287750.

3.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS

PRAIN) (C-561)

Lõi gỗ Sưa (C-561) được chiết bằng methanol, sau đó cô quay đuổi dung

môi thu được cặn chiết. Cặn chiết được chiết với các dung môi có độ phân cực

tăng dần n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước. Phần chiết

dichloromethane được phân tách nhiều lần bằng các phương pháp sắc ký cột pha

thường thu được 3 hợp chất bao gồm 2 hợp chất flavanone là naringenin và

pinocembrin cùng 1 hợp chất neoflavonoid 3'-hydoxy-2,4,5-

trimethoxydalbergiquinol. Từ phần cặn chiết ethyl acetate phân tách được 2 hợp

chất gồm 1 hợp chất flavanonol là buteaspermanol và 1 hợp chất neoflavonoid là

medicarpin.

75

Từ cặn chiết nước đun sôi của bã sau khi chiết bằng methanol phân tách

được 2 hợp chất flavanone mới là (2S)-8-carboxyethylpinocemprin (daltonkin A)

và (2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin (daltonkin B).

3.2.1. Hợp chất pinocembrin (DT.01)

Hợp chất DT.01 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng, tan tốt trong

MeOH. Phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho

2 proton gép meta thuộc về vòng A tại vị trí H [5,92 (1H, d, 2,0 Hz, H-6) và 5,89

(1H, d, 2,0 Hz, H-8)]. Các tín hiệu của các proton thuộc về vòng B bao gồm 4 proton

được đặc trưng bởi hệ spin AA'BB' tại H 7,44 (2H, t, 8,3 Hz, H-2', H-6'), 7,52 (2H,

t, 8,4 Hz, H-3', H-5')] và 1 tín hiệu proton tại H 7,39 (1H, t, 7,0 Hz, H-4')]. Hệ vòng

C được nhận biết nhờ tín hiệu doublet của nhóm oxymethin ở H 5,57 (1H, dd, 12,6,

3,1 Hz, H-2) và 1 nhóm methylen tại H [2,77 (1H, dd, 17,1, 2,7 Hz, Ha-3) và tại H

3,24 (1H, dd, 17,1, 12,6 Hz, Hb-3)].

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.01

76

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT chứng minh phân tử có 15 nguyên tử

carbon bao gồm tín hiệu của 1 nhóm carbonyl tại [C 195,8 (s, C-4), tín hiệu của 1

carbon oxymethin cầu nối tại C 78,4 (d, C-2) và tín hiệu 1 carbon methylen tại C

42,1 (t, C-3)]. Các tín hiệu này được xem là ‘‘vân tay’’ gợi ý rằng hợp chất này có

dạng khung flavanone [84].

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT còn cho thấy có 4 nhóm methin thơm đối

xứng tại [C (ppm) 128,5 (d, C-3', C-5') và C 127,0 (d, C-2', C-6')] và 2 nhóm methin

thơm khác tại [C 95,1 (d, C-6), 96,0 (d, C-8)] cùng với tín hiệu của 3 nguyên tử carbon

thơm liên kết với oxy tại [C 163,5 (s, C-5), 167,0 (s, C-7) và 162,7 (s, C-8a )]. Cuối

cùng là 2 tín hiệu carbon thơm không liên kết hydro tại [C 101,7 (d, C-4a) và 138,7

(d, C-1')] với độ dịch chuyển hóa học nằm về phía trường cao.

Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.01

77

Hình 3. 8. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.01

Hình 3. 9. Phổ DEPT của hợp chất DT.01

Phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và so sánh với tài liệu tham

khảo, hợp chất DT.01 được xác định là pinocembrin [85]. Đã được phân lập từ lõi gỗ loài

D. odorifera [12], loài D. Parviflora [40], rễ loài Boesenbergia rotunda (L.) và từ lá loài

Glycyrrhiza glabra [ 86].

Hình 3.10. Cấu trúc hợp chất pinocembrin Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.01 và chất tham khảo

Vị trí

Pinocembrin

DT.01 (*)

δC (ppm) 78,4

δC [85] - 80,4

1 2

42,1

44,1

3

δH (ppm) 5,57 (dd, J =12,6, 3,1 Hz) 3,24(dd, J =17,1, 12,6 Hz) 2,77 (dd, J =17,1, 2,7 Hz) -

195,8

197,3

δH [85] - 5,33 (dd, J =12,8, 3,6 Hz) 2,98 (dd, J =17,4, 12,9 Hz) 2,67 (dd, J =17,0, 3,6 Hz) -

4

- - 5,92 (d, J =2,0 Hz) - 5,89 (d, J =2,0 Hz) - - 7,44 (t, J =8,3 Hz) 7,52 (t, J =8,4 Hz) 7,39 (t, J =7,0 Hz) 7,52 (t, J =8,4 Hz) 7,44 (t, J =8,3 Hz)

101,7 163,5 95,1 167,0 96,0 162,7 138,7 127,0 128,5 128,5 128,5 127,0

103,3 165,4 96.2 168,3 97,2 164,6 140,3 127,3 129,6 129,7 129,6 127,3

- - 5,87 (d, J =1,84 Hz) - 5,87 (d, J =1,84 Hz) - - 7,34, m 7,34, m 7,34, m 7,34, m 7,34, m

4a 5 6 7 8 8a 1' 2' 3' 4' 5' 6'

(*)1H-NMR (500 MHz, DMSO), 13C-NMR (125 MHz, DMSO)

78

3.2.2. Hợp chất naringenin (DT.02)

Hợp chất DT.02 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng, tan tốt trong MeOH. So sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT của hợp chất này thì thấy hoàn toàn

tương tự hợp chất pinocembrin. Chỉ có sự khác biệt duy nhất khi proton methin thơm

H-4' của hợp chất pinocembrin được thay thế bởi một nhóm hydroxy. Do vậy, sẽ xuất

hiện thêm tín hiệu 1 carbon thơm liên kết với oxy tại C 165,5 (s, C-5) trên vòng C

trong hợp chất DT.02.

Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.02

79

Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.02

Phân tích, kết hợp các dữ kiện phổ và đối chứng với tài liệu tham khảo đã công

bố. Hợp DT.02 được xác định là naringenin đã được phân lập từ lõi gỗ loài D.

parviflora [40] và loài Swatzia polyphylla [87, 88].

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất naringenin

Vị

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.02 và chất tham khảo

Naringenin [87]

DT.02 (*)

trí

δH (ppm)

δC (ppm)

δC (ppm)

δH (ppm)

1

-

-

-

-

5,47 (1H, dd, J = 12,6; 2,7

2

5,36 (1H, dd, J = 13,0; 3,0 Hz)

80,5

78,9

Hz)

2,71 (1H, dd, J = 17,0; 3,0

2,72 (1H, dd, J =17,0, 3,0 Hz)

Hz)

3

3,13 (1H, dd, J =17,0, 13,0 Hz

44,1

42,3

3,30 (1H, dd, J =17,0; 12,9

)

Hz)

4

-

-

196,9

197,8

4a

-

-

102,6

103,4

5

-

-

164,2

165,5

6

5,91 (1H, d, J =2,0 Hz)

5,91 (1H, s)

96,6

97,1

7

-

-

167,3

168,4

8

5,91 (1H, d, J =2,0 Hz )

5,91 (1H, s)

95,5

96,2

8a

-

-

163,2

164,9

1'

-

-

130,9

131,8

2'

7,34 (1H, d, J =8,5 Hz)

7,35 (1H, d, J =8,4 Hz)

129,2

129,1

3'

6,84 (1H, d, J =8,5 Hz)

6,82 (1H, d, J =8,4 Hz)

115,9

116,4

4'

-

-

158,6

159,1

5'

6,83 (1H, d, J =8,5 Hz)

6,82 (1H, d, J =8,4 Hz)

115,9

116,4

6'

7,34 (1H, d, J =8,5 Hz)

7,35 (1H, d, J =8,4 Hz)

129,2

129,1

80

(*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

3.2.3. Hợp chất 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03)

Hợp chất DT.03 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR cho

thấy 2 tín hiệu tại [H 6,67 (1H, s, H-6), 6,54 (1H, s, H-3) ] đặc trưng cho hai proton ở vị trí

para của vòng benzen ABCX của vòng A. 4 tín hiệu proton tại [H 7,14 (1H, t, 7,5 Hz, H-

5'), 6,76 (1H, d, 7,5 Hz, H-6'), 6,64 (1H, s, H-2'), 6,65 (1H, s, H-4')] của vòng thơm 2 nhóm

thế, 1 tín hiệu của nhóm vinyl [H 6,24 (1H, ddd, 17,0, 10,5, 7,0 Hz, H-2''), 5,19 (1H, d, 10,0

Hz, Ha-3) và 4,94 (1H, d, 17,0 Hz, Hb-3)]. Ngoài ra còn có 1 tín hiệu của 1 proton nối với

carbon sp3 tại H 5,04 (1H, d, 6,5 Hz, H-1''). Quan sát trên phổ 1H-NMR còn có sự xuất

hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của 3 nhóm thế methoxy tại [H 3,88 (3H, s, 4-OCH3),

3,73 (3H, s, 2-OCH3) và 3,77 (3H, s, 5-OCH3)].

Các tín hiệu trên phổ 13C-NMR và DEPT khẳng định hợp chất DT.03 cho tín

hiệu 18 carbon bao gồm 4 carbon thơm liên kết với oxy tại C [148,3 (s, C-4), 151,5 (s,

C-2), 143,0 (s, C-5) và 155,5 (s, C-3')], 2 carbon thơm không liên kết hydro tại [C

123,0 (s, C-1) và 145,4 (s, C-1')] cùng với 6 tín hiệu carbon methine vòng thơm trong

81

khoảng [C (98,5-129,3)], 2 tín hiệu của carbon nhóm vinyl tại [C 140,2 (d, C-2'') và

116,3 (t, C-3'')]. 1 tín hiệu của carbon sp3 tại C (47,0, d). Cuối cùng là tín hiệu 3 nhóm

methoxy tại [C 56,8 (q, 2-OCH3), 56,7 (q, 5-OCH3) và 56,2 (q, 4-OCH3)].

Tổng hợp các dữ liệu phổ đã phân tích trên đồng thời kết hợp đối chiếu với tài

liệu tham khảo. Chúng tôi kết luận hợp chất DT.03 là 3'-hydoxy-2,4,5-

trimethoxydalbergiquinol được tìm thấy ở loài D. odorifera. Hợp chất này có tác dụng

ức chế NO sản sinh trong dòng tế bào RAW 264,7 với IC50 là 70,3 μM [49, 53].

Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất 3'-hydoxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.03 và chất tham khảo

Vị trí

3'-hydoxy-2,4,5-

DT.03 (*)

trimethoxydalbergiquinol [53]

δC

δC

δH (ppm)

δH (ppm)

(ppm)

(ppm)

-

123,2

1

-

123,0

-

151,2

2

-

151,5

3,71, s

56,8

2-

3,73, s

56,8

OCH3

6,52, s

98,3

3

6,54, s

98,5

-

148,2

4

148,3

3,75, s

56,1

4-

3,88, s

56,2

OCH3

-

143,0

5

-

143,0

3,75, s

56,7

5-

3,77, s

56,7

OCH3

6,66, s

113,6

6

6,67, s

113,7

-

145,2

1'

-

145,4

6,62 (d, J =2,0 Hz)

115,4

2'

6,64, s

116,2

-

155,4

155,5

3'

-

6,64 (dd, J =8,0, 2,0 Hz)

112,9

112,9

4'

6,65, s

7,11 (dd, J =8,0, 7,6 Hz)

129,2

129,3

5'

7,14 (t, J =7,5 Hz)

6,64 (d, J =7,6 Hz)

120,9

121,1

6'

6,76 (d, J =7,5 Hz)

5,03 (d, J =6,7 Hz)

46,9

47,0

1''

5,04 (d, J =6,5 Hz)

6,24 ( ddd, J =17,0, 10,5, 7,0

6,22 (ddd, J =17,1, 10,2, 1,6

140,1

140,2

2''

Hz)

Hz)

4,92 (dd, J =17,1, 1,6 Hz)

4,94 (d, J =17,0 Hz)

116,3

3''

5,17 (dd, J =10,2, 1,6, Hz)

116,1

5,19 (d, J =10,0 Hz)

82

(*)1H-NMR (500 MHz, chloroform-d); 13C-NMR (125 MHz, chloroform-d)

3.2.4. Hợp chất medicarpin (DT.04)

1H kết hợp với 13C-NMR và DEPT xác định giả thiết về một hợp chất thuộc lớp chất

Hợp chất DT.04 thu được dưới dạng bột trắng. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

pterocarpanoid phytoalexin, là dẫn xuất của isoflavonoid với bộ khung Benzo-

pyrano-furano-benzene. Kết hợp phổ 13C-NMR và DEPT thấy xuất hiện 16 tín hiệu

tương ứng với số nguyên tử carbon trong phân tử, trong đó bao gồm tín hiệu của 1

nhóm methoxy tại δC 55,9 (9-OCH3), 1 nhóm oxymethylen δC 67,5 (C-6), 1 nhóm

oxymethin δC tại 80,0 (C-11a), 6 tín hiệu carbon của nhóm metin hệ vòng thơm và

một 1 tín hiệu carbon methin CH bão hòa nằm trong vùng trường cao tại δC 40,8 (C-

6a) cùng với 4 tín hiệu nguyên tử carbon thơm liên kết với oxy và 2 tín hiệu nguyên

tử carbon thơm không liên kết hydro.

Phổ 1H-NMR, nhóm methoxy (9-OCH3) liên kết trực tiếp với nhân thơm đặc

trưng với tín hiệu singlet tại 3,71ppm. Hai proton methylen multilet H-6 (δH 4,17 và

3,51) trong phổ 1H-NMR tạo vòng pyran liên kết trực tiếp với dị tố oxy. Hai tín hiệu

nằm trong vùng trường thấp dạng doublet H-1 (δH 7,27, d, 8,5 Hz) và H-4 (δH 6,33,

d, J = 2,5 Hz) và một peak doublet-doublet H-2 (δH 6,51, dd, J = 8,5, 2,5 Hz) cấu

thành nên vòng benzo (hệ vòng chromene). Tương tự, proton dạng doublet - doublet

H-8 (δH 6,42, dd, J = 8,0, 2,0 Hz), cặp proton doublet H-7 (δH 7,12, d, J = 8,0 Hz) và

H-10 (δH 6,37, d, J = 2,5 Hz) chứng minh sự tồn tại của một vòng benzo khác (Hệ

vòng benzofuran). Hai proton dạng peak doublet-doublet H-6a (δH 3,47, dd, J = 10,5,

83

6,0, 2,5 Hz) và triplet H-11a (δH 5,41, t, J = 7,0 Hz) thuộc về một liên kết chung giữa

hai dị vòng pyran và furan. Cặp nguyên tử cacbon bất đối C-6a, 11a với hằng số tách

J = 6,5 Hz và [α]D = + 225,2 (c = 0,60, MeOH) xác định tính chất lập thể với cấu hình

tuyệt đối dạng R và đồng phân hình học dạng cis. Do vậy chúng tôi xác định đây là

hợp chất (+)-(6aR, 11aR)-cis-3-hydroxy-9-methoxypterocarpan (medicarpin). Hợp

chất này được phân lập từ lõi gỗ loài Dalbergiacongestiflora Pittier, Dalbergia

odorifera và Dalbergia oliveri và có các hoạt tính chống oxi hóa, gây độc tế bào [89,

90].

Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất medicarpin

Medicarpin [ 89]

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.04 và chất tham khảo

DT.04 (*)

Vị trí

δH (ppm)

δH (ppm)

1

7,27 (d, 8,5 Hz)

7,37 (d,8,5 Hz)

δC (ppm) 133,2, d

δC (ppm) 132,2

2

6,51 (dd, 2,5, 8,5 Hz)

6,54 (dd, 8,5, 2,5 Hz)

110,7, d

109,8

3

162,5, s

161,0

-

-

3-OH

5,52 (s)

-

-

-

4

6,33 (d, 2,5 Hz)

6,40 (d, J = 2,5 Hz)

104,1, d

103,6

4a

161,9, s

160,6

-

-

5

-

-

-

-

6

67,5, t

66,5

3,51 (t, 10,5 Hz) 4,17 (dd, 10,5, 2,5, Hz)

3,62 (t, 11 Hz) 4,22 (ddd, 11,0, 5,0, 0,5 Hz)

6a

3,47 (ddd, 2,5, 6,0, 10,5 Hz) 40,8, d

39,4

3,52 (ddd,11,0, 6,5, 5,0 Hz)

6b

-

-

120,8, s

119,1

7

7,12 (d, 8,0 Hz)

7,12 (d, 9,0 Hz)

125,9, d

124,8

8

6,42 (dd, 8,0, 2,0 Hz)

6,46 (dd, 9,0, 2,0 Hz)

107,2, d

106,4

9

-

-

160,0, s

157,0

3,71 (s)

55,9, q

55,5

3,70 (s)

9- OCH3 10

6,37 (d, 2,5 Hz)

97,6, d

96,9

6,45 (s)

10a

-

158,0, s

156,6

-

11

-

-

-

-

11a

5,41 (d, 7,0 Hz)

80,0, d

78,5

5,48 (d, 6,5 Hz)

112,9, s

112,6

-

-

11b (*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

84

3.2.5. Hợp chất buteaspermanol (DT.05)

1H-NMR xác định bộ khung dạng dihydroflavanol. Các tín hiệu doublet thuộc về

Hợp chất DT.05 thu được dưới dạng bột trắng. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton H-2 (δH 5,09) và H-3 (δH 4,53) với giá trị hằng số tương tác J = 12,0 Hz chứng

minh tính chất lập thể trans-diaxial giữa hai nhóm oxymethin. Tín hiệu dạng singlet

xác định proton H-5 (δH 7,31) và H-8 (δH 6,43), 7-OCH3 (δH 3,88) chứng minh hệ

vòng benzo (vòng A) thế hai lần. Hệ vòng cơ sở B được chứng minh bởi các tín hiệu

dạng multilet và triplet nằm trong vùng trường thấp H-2, H-6 [(δH 7,56, 2H, t, J=7,0

Hz)] và H-3, H-4, H-5 [(δH 7,40-7,45, 3H, m)].

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT xác định một

hợp chất có 17 nguyên tử carbon trong đó gồm 1 nhóm carbonyl C=O liên hợp tại δC

194,3 (C-4), 7 nhóm methin vòng thơm, 3 tín hiệu carbon thơm liên kết với oxy, 2 tín

hiệu carbon thơm không liên kết hydro. Ngoài ra còn có 2 tín hiệu của carbon nhóm

oxymethin -OCH [δC 74,6 (C-2), δC 85,9 (C-3)] và 1 tín hiệu carbon nhóm methoxy

7-OCH3 (δC 56,6, q). So sánh với các công trình đã được công bố chúng tôi kết luận

đây là một hợp chất dạng khung flavanol có tên buteaspermanol được phân lập từ cây

Butea monosperma có hoạt tính chống estrogen, ức chế sự sinh sản và tác dụng tạo

mô xương [91, 92].

Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất buteaspermanol

85

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.05 và chất tham khảo

Vị trí Buteaspermanol [92] DT.05 (*)

δH (ppm) δC (ppm) δC (ppm) δH (ppm)

1 - -

5,09 (1H, d, J = 12,0 5,14 (1H, dd, J = 11,6 2 74,6 72,9 Hz) Hz)

4,53 (1H, d, J =12,0) 4,53 (1H, dd, J = 11,6, 3 85,9 84,0 3,7 Hz)

4 194,3 192,5 - -

4a 112,1 111,0 - -

5 7,31,s 108,2 107,6 7,19 (1H, s)

6 138,8 137,9

7- 3,88, s 56,6 56,2 3,80 (1H, s) OCH3

8 6,43,s 104,5 103,6 6,43 (1H, s)

8a 159,7 157,5 - -

1' 145,5 144,3 - -

2' 7,56 (1H, t, J =7,0 Hz) 128,9 128,8 7,55, m

3' 7,40-7,45, m 129,3 128,5 7,41-7,48, m

4' 7,40-7,45, m 129,8 128,3 7,41-7,48, m

5' 7,40-7,45, m 129,3 128,5 7,41-7,48, m

6' 7,56 (1H, t, J =7,0 Hz) 128,9 128,5 7,55, m

(*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

3.2.6. Hợp chất mới daltonkin A (DT.06)

Hợp chất DT.06 được phân lập dưới dạng chất rắn vô định hình, tan tốt trong

dung môi methanol. Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất DT.06 xuất hiện các cực đại

hấp thụ tại vị trí νmax tại 3354 và tại νmax 1701 cm-1 đặc trưng cho các dao động của

nhóm hydroxyl OH và nhóm carbonyl C=O cùng các dao động của liên kết C=C

(benzene) tại (νmax: 1701, 1637, 1610, 1452).

86

Hình 3.17. Phổ IR của hợp chất DT.06

Trên phổ tử ngoại UV của hợp chất này xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối

đôi liên hợp ở UV (MeOH) λmax nm (logε): 293 nm.

Hình 3.18. Phổ UV của hợp chất DT.06

Phổ khối phun bụi điện tử (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử ở m/z =

327,0868 [M – H]– (theo lý thuyết là 327,0863). Từ đó suy ra công thức phân tử của

hợp chất DT.06 là C18H16O6.

87

Hình 3.19. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.06

Kết hợp phân tích các tín hiệu trên phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HSQC (tương

tác trực tiếp carbon với proton) cho thấy, ngoài các tín hiệu đặc trưng cho 2 vòng

benzen A và B còn xuất hiện thêm các tín hiệu của 1 carbon methylen tại δC 44,3 (C-

3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethin ở vị trí δC 80,5 (C-2) và tín hiệu 1 carbon của

nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) của vòng C trong phổ 13C-NMR. Điều này cho phép

kết luận hợp chất này là một flavanone [93].

Khi so sánh phổ 1H và 13C-NMR của DT.06 cho thấy các tín hiệu hoàn toàn

tương tương tự phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất pinocembrin, ngoại trừ sự thay thế 1

proton thơm H-8 trong hợp chất pinocembrin bởi 1 nhóm carboxyethyl

(CH2CH2COOH) (H-9 [δH 2,86, t, 8,0 Hz]/C-9 [δC 18,7], H-10 [δH 2,49, t, 8,0

Hz]/C-10 [δC 34,1] và C-11 [δC 177,7]) [85].

88

Hình 3.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.06

Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.06

89

Hình 3.22. Phổ DEPT của hợp chất DT.06

Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất DT.06

Mạch nhánh carboxyethyl được chứng minh thông qua các tương quan giữa

proton methylen H-9 và H-10 trong phổ COSY, cũng như các tương quan giữa proton

H-9 và H-10 với carbon C-11 của nhóm carbonyl trong phổ (HMBC).

90

Hình 3.24. Phổ COSY của hợp chất DT.06

Phân tích kỹ trên phổ HMBC sẽ thấy các tương quan của proton H-9 với các

carbon C-7, C-8 và C-8a. Điều này cho phép xác định nhóm carboxyethyl gắn vào vị

trí C-8 của vòng A. Như vậy vị trí mạch nhánh đã được xác định.

91

Hình 3.25. Phổ HMBC của hợp chất DT.06

Các nghiên cứu trước đây cho thấy các flavanone cấu hình 2S trên phổ CD

(lưỡng sắc vòng - circular dichroism) thường có hiệu ứng Cotton dương trong vùng

gần 330 nm (n–*) và hiệu ứng Cotton âm ở vùng 270–290 nm.

Phổ CD (c 0,4, MeOH) của hợp chất DT.06 (hình 3.26) cho thấy có hiệu ứng

Cotton dương tại 330 + 2,10 (n–*) và hiệu ứng Cotton âm tại 288 – 10,43 (–* ).

Kết hợp các thông tin trên phổ CD và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác

định cấu hình của C-2 trong hợp chất DT.06 là 2S [84].

Hình 3.27. Phổ CD của hợp chất (2S)-pinocembrin tham khảo

Hình 3.26. Phổ CD của hợp chất DT.06

92

Qua phân tích tổng hợp các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất DT.06

là (2S)-8-carboxyethylpinocembrin, đây là một hợp chất mới lần đầu tiên phân lập từ

thiên nhiên và được chúng tôi đặt tên là daltonkin A. Các phổ đầy đủ của hợp chất

daltonkin A (DT.06) được trình bày ở phần phụ lục (PL-6).

Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin A

Hình 3.29. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin A

93

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin A

daltonkin A

Vị trí

HMBC (HC)

COSY (HH)

δC (ppm) (125 MHz) (methanol-d4)

2

80,5, d

C-4 C-1'; C-4; C-4a

H-3 H-2

3

44,3, t

4 4a 5

197,5, s 103,3, s 162,8, s

δH (ppm) (500 MHz) ( methanol-d4) (J, Hz) 5,47( dd, 13,0, 3,0) 2,80 (dd, 17,0, 3,0, H-3eq) 3,11 (dd, 17,0, 13,0, H-3ax) 6,02, s

6

95,6, d

7 8 8a

166,1, s 108,5, s 162,8, s

H-10

2,86 ( t, 8,0)

9

18,7, t

10 11 9' 10' 11' 1' 2',6'

34,1, t 177,7, s 140,5, s 127,3, d

C-5; C-7; C-8; C-4a C-11; C-7; C-8; C-8a C-8a; C-11 C-2

2,49 (t, 8,0) 7,52 (d, 7,5) 7,39 (t, 7,5)

4'

129,6, d

H-9 H-3'; H-4'; H-5' H-3'; H-5'; H-2'; H-6' H-4'; H-2'; H-6'

3',5'

7,44 (d, 7,5)

129,7, d

3.2.7. Hợp chất mới daltonkin B (DT.07)

Hợp chất DT.07 được phân lập dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng.

Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất DT.07 xuất hiện các cực đại hấp thụ đặc trưng cho

nhóm hydroxyl OH (νmax 3369 cm-1) và nhóm carbonyl C=O (νmax 1751 cm-1) và dao

). Phổ tử ngoại UV tương

động các liên kết C=C (benzen) (νmax, 1751, 1676, 1575 cm-1

tự hợp chất DT.07 cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng cho nối đôi liên hợp ở UV

(MeOH) λmax nm (logε): 297 nm.

94

Phổ khối phun bụi điện tử (HR-ESI-MS) cho pic ion giả phân tử ở m/z =

415,1014 [M – H]– (tính toán là 415,1024).Từ đó suy ra công thức phân tử của hợp

chất DT.07 là C21H19O9.

Hình 3.30. Phổ khối phân giả cao HR-ESI-MS của hợp chất DT.07

Tương tự như hợp chất DT.06, các tín hiệu carbon của hợp chất DT.07 đặc

trưng cho một khung flavanone bao gồm: 1 tín hiệu của carbon methylen tại δC 44,0

(C-3), 1 tín hiệu carbon nhóm oxymethin ở vị trí δC 80,3 (C-2) và 1 tín hiệu carbon

của nhóm carbonyl tại δC 197,5 (C-4) trong phổ 13C-NMR [93].

Phổ 1H và 13C-NMR của DT.07 có các tín hiệu tương tự như của flavanone

narigenin đã được phân lập từ loài Dalbergia odorifera, ngoại trừ sự thay thế tín hiệu

2 proton của vòng benzen (H-6 và H-8) trong hợp chất narigenin bởi tín hiệu của 2

nhóm carboxyethyl (H-9 [δH 2,85, m]/C-9 [δC 18,8], H-10 [δH 2,55, m]/C-10 [δC 34,4]

và C-11 [δC 179,1]) và (H-9' [δH 2,81, m]/C-9' [δC 19,4], H-10' [δH 2,51, m]/C-10' [δC

34,8] và C-11' [δC 179,2]) [87, 88].

95

Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.07

Hình 3.32. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.07

96

Hình 3.33. Phổ DEPT của hợp chất DT.07

97

Hình 3.34. Phổ HSQC của hợp chất DT.07

Các dữ kiện phổ 2 chiều HSQC, HMBC, COSY được sử dụng để xác định cấu

trúc khung flavanone, 2 nhóm carboxyethyl và vị trí của gắn của chúng với vòng A

của DT.07.

Trên phổ COSY ta thấy rõ tương quan giữa các proton methylen H-9/H-10 và

H-9'/H-10' trong phổ COSY cũng như các tương tác giữa các proton H-9 và H-10 với

C-11 cùng các tương tác của proton H-9' và H-10' với carbon C-11'. Phổ HMBC

khẳng định có hai nhóm carboxyethyl qua các tương tác giữa các proton methylen H-

9 và H-10 với carbonyl carbon C-11 cũng như tương tác của proton H-9' và H-10' với

carbon C-11'.

Vị trí gắn kết của hai nhóm carboxyethyl được xác định qua tương tác giữa

proton H-9' với các carbon C-5, C-6 và C-7, và các tương tác của proton H-9 với C-

7, C-8 và C-8a trên phổ HMBC. Các tương tác đó cho phép kết luận hai nhóm

carboxyethyl gắn vào vị trí C-6 và C-8 của vòng A.

98

Hình 3.35. Phổ COSY của hợp chất DT.07

Hình 3.36. Phổ HMBC của hợp chất DT.07

99

Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất daltonkin B

daltonkin B

HMBC COSY

δH (ppm) (500 MHz) ( methanol-d4) (J, Hz)

δC (ppm) (125 MHz) (methanol -d4)

Vị trí

C-4; C-3; C-1'; H-3 2 5,39 (dd, 13,0, 3,0) 80,3, d C-2'; C-6'

2,79 (dd, 17,0, 3,0 Hz, H-3eq) H-2 3 44,0, t 3,13 (dd, 17,0, 13,0 Hz, H-3ax)

4 198,6, s

4a 103,4, s

5 159,8, s

6 109,0, s

7 163,9, s

8 108,3, s

8a 161,1, s

9 18,8, t C-7; C-8; C-11 H-10 2,85, m

10 34,4, t C-8; C-11 H-9 2,55, m

11 179,1, s

C-6; C-5; C-7; H-10' 9' 19,4, t 2,81, m C-11'

10' 34,8, t C-6; C-11' H-9' 2,51, m

11' 179,2, s

1' 131,4, s

2',6' 128,8, d H-3'; H-5' 7,36 (d, 8,5)

4' 158,9, s

3',5' 116,4, d H-2'; H-6' 6,85 (d, 8,5)

100

Tương tự DT.06, hợp chất DT.07 được xác định có cấu hình 2S. Như vậy, cấu

trúc của hợp chất mới daltonkin B được xác định.

Hợp chất dicarboxyethylflavanone mới này có tên thường gọi là (2S)-6,8-

dicarboxyethylnaringenin, lần đầu được phân lập trong tự nhiên (chúng tôi đặt tên là

daltonkin B). Các phổ đầy đủ của hợp chất daltonkin B (DT.07) được trình bày trong

phụ lục (PL-7).

Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất daltonkin B

Hình 3.38. Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất daltonkin B

Kết luận về cấu trúc 2 hợp chất mới: cho đến nay rất hiếm các báo cáo về

các hợp chất thiên nhiên có mạch nhánh acid propanoic và carboxyethyl trong tự

nhiên. Một vài báo cáo cho thấy dẫn xuất của acid pheylpropanoic được tìm thấy từ

lõi gỗ loài Cordia trichotoma và loài Streptomycetes strain [95].

Carboxyethylchromanone từ loài Calophyllum papuanum [96].

Đặc biệt, chỉ có hợp chất L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) được phân

lập từ hạt loài D. retusa and D. glabra thuộc Chi Dalbergia [97]. Đây là lần đầu tiên

các hợp chất mono và dicarboxyflavanone được tìm thấy trong tự nhiên từ loài Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain).

101

3.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS

PRAIN) (C-612)

Lõi gỗ sưa đỏ được chiết bằng methanol, sau đó cô quay đuổi dung môi thu

được cặn chiết. Cặn chiết được chiết phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng

dần n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước. Các phần chiết tiến hành phân

lập đã được trình bày chi tiết ở phần thực nghiệm, mục 2.3.2. Kết quả đã phân lập

được 11 hợp chất. Cấu trúc các hợp chất sạch được xác định bằng việc phân tích các

dữ liệu phổ 1D và 2D được trình bày dưới đây.

3.3.1. Hợp chất Dalbergin (DT.08)

Hợp chất DT.08 được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng, tan tốt trong MeOH.

Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR cho thấy đặc trưng của khung coumarin thế 3 lần tại [H

7,06 (1H, s, H-8), 6,88 (1H, s, H-5) và 6,21 (1H, s, H-3)], thêm vào đó là 2 tín hiệu của

vòng benzen thế một lần [H 7,57 (3H, m, H-3', H-4', H-5') và 7,51 (2H, m, H-2', H-6')], 1

tín hiệu của 3 proton nhóm methoxy tại H 3,99 (3H, s, 7-OCH3).

Phổ 13C-NMR kết hợp DEPT khẳng định sự hiện hiện của 16 carbon bao gồm

1 carbon nhóm carbonyl tại C 163,8 (s, C-2), 8 tín hiệu của carbon thơm (3 carbon

thơm không liên kết với hydro, 3 carbon thơm liên kết với oxy) trong khoảng C

(113,1-158,2 ppm), 2 carbon methin thơm [C 112,3 (d, C-5) và 101,1 (d, C-8)] cùng

với 3 tín hiệu của carbon nhóm phenyl [C (129,5-129,9 ppm)].

Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thầy xuất hiện thêm tín hiệu

của 1 carbon olefin ở vị trí C 112,3 (d, C-3). Cuối cùng là một tín hiệu 1 carbon

nhóm methoxy tại C (56,8 q, 7-OCH3). Từ những lập luận trên cho phép xác định

DT.08 là một neoflavanon. So sánh với dữ kiện phổ của hợp chất này với tài liệu

tham khảo, xác định hợp chất DT.08 là Dalbergin, đã được tìm thấy ở loài Dalbergia

rubiginosa [98].

102

Vị trí

Dalbergin [98]

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.08 và chất tham khảo

DT.08 (*)

δH - - 6,26, s - - 6,99, s - - 3,96,s 6,90, s - - 7,48, m 7,48, m 7,48, m 7,48, m 7,48, m

δH - - 6,21, s - - 6,88, s - - 3,99, s 7,06, s - - 7,51, m 7,57, m 7,57, m 7,57, m 7,51, m

δC - 161,0 111,7 155,3 110,8 112,1 149,6 141,9 56,0 110,0 148,9 135,1 127,8 128,4 129,1 128,4 127,8

1 2 3 4 4a 5 6 7 7-OCH3 8 8a 1' 2' 3' 4' 5' 6'

δC - 163,8 111,9 158,2 113,1 112,3 153,6 145,2 56,8 101,1 150,4 137,1 129,5 129,9 130,8 129,9 129,5 (*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

Hình 3.39. Cấu trúc hợp chất Dalbergin 3.3.2. Hợp chất isoliquiritigenin (DT.09)

Chất DT.09 phân lập được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Tín hiệu của 15 nguyên tử carbon ở vùng trường thấp trên phổ 13C-NMR và các tín hiệu xuất hiện ở vùng proton của nhân thơm quan sát trên phổ 1H-NMR cho thấy DT.09 cũng

thuộc lớp chất flavonoid. Các cặp tín hiệu C-β (H 7,74; C 144,3), C-α (H 7,74; C

117,5), C=O (C 191,5) gợi ý chất DT.09 là 1 chalcon. Hệ tương tác spin ABX quan

sát được trên phổ 1H-NMR (H 8,14, d, J =9,0 Hz; 6,41, dd, J = 2,5, 8,0 Hz; và 6,27

d, J = 2,0 Hz) cho thấy vòng A của chalcon DT.09 bị thế tại hai vị trí C-5 và C-7.

Thêm vào đó là tín hiệu các proton thuộc vòng benzen thế para tại 6, 84 (2H, J = 8,5

Hz) cùng với tín hiệu của 4 proton chập nhau tại H 7,74.

103

Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy xuất hiện tín hiệu 15 carbon, bao gồm 1 tín

hiệu nhóm carbonyl tại C 191,5, tín hiệu 3 carbon thơm liên kết với oxi tại C 160,3,

165,0, 165,8, tín hiệu của 2 carbon thơm không liên kết với hydro tại C 125,8, 113,0

cùng với 9 carbon methine trong khoảng C (102,6-144,3). Ngoài ra các tín hiệu cộng

hưởng thuộc hệ AA’BB’ quan sát được trên phổ 1H và 13C-NMR đã khẳng định vòng

B trong cấu trúc của DT.09 bị thế para.

Cuối cùng, kết hợp sự phân tích giữa các phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT,

HSQC và HMBC của hợp chất DT.09 và đối chiếu với tài liệu tham khảo cho phép

xác định cấu trúc hóa học của hợp chất này là isoliquiritigenin đã được phân lập từ

gỗ cây Cẩm lai (Dalbergia oliveri) [51].

Vị trí

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học hợp chất isoliquiritigenin Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.09 và chất tham khảo

DT.09 (DMSO-d6)

Isoliquiritigenin [51] δC

δH

δC (125MHz)

δH (500 MHz) (J, Hz)

7,75*

117,4

117,5

7,74*

7,74* - 7,74* 6,84 (d, 8,5) -

144,3 191,5 125,8 131,2 115,9 160,3 113,0 165,0 102,6 165,8

6,27 ( d, 2,0) -

144,2 192,4 125,7 131,1 115,8 160,3 112,9 165,2 102,6 165,8 108,2

108,2

6,41 (dd, 2,5, 9,0)

5’

132,8

7,75* 7,75* 6,84 (d, 8,5) 6,27 (d, 2,5) 6,40 (dd, 2,5, 8,0) 8,15 (d, 8,0)

132,8

6’

8,14 (d, 9,0)

α β C=O 1 2, 6 3, 5 4 1’ 2’ 3’ 4’

(*) Tín hiệu bị chồng chập

104

3.3.3. Hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10)

Hợp chất DT.10 phân lập dưới dạng tinh thể hình kim không màu. Phổ 1H và 13C

-NMR của DT.10 tương tự như của liquiritigenin. Sự khác biệt là ở vòng B thế 3 lần ở

các vị trí 1',3',5'. Do đó trên vòng B của hợp chất DT.10 xuất hiện các tín hiệu của 3

proton tại [δH 6,88 (1H, s, H-4') và 6,74 (2H, s, H-2', H-6').

Hình 3.41. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.10

Hình 3.42. Phổ 13C-NMR của hợp chất DT.10

105

Hình 3.43. Phổ DEPT của hợp chất DT.10

Kết hợp phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT đồng thời so

sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định hợp chất này là 7,3',5'-

trihydroxyflavanone [102]. Hợp chất này đã được phân lập từ vỏ thân của loài

Caesalpinia decapetala. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên được phát hiện từ chi Dalbergia

và có hoạt tính bảo vệ tế bào gan [103].

Hình 3.44. Cấu trúc hợp chất 7,3',5'-trihydroxyflavanone

106

Vị trí

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.10 và chất tham khảo

DT.10 (DMSO-d6)

δH (500 MHz), (J, Hz)

δC (125MHz)

-

1 2

- 78,9

5,37 (dd, 3,0, 12,5) 3,03 (dd, 12,5, 17,0)

δC (125MHz) - 81,2 44,8

3

43,2

2,62 (dd, 3,0, 17,0)

4 4a 5 6 7 8 8a 1' 2' 3' 4' 5' 6'

- - 7,64 (d, 9,0) 6,49 (dd, 2,5, 9,0) - 6,32 (d, 2,0) - - 6,74, s - 6,88, s - 6,74, s

7, 3', 5'-trihydroxyflavanone (DMSO-d6) [86 ] δH (250 MHz) - 5,36 (dd, 3,0, 12,5) 3,02 (dd, 12,5, 16,5) 2,61 (dd, 3,0, 16,5) - - 7,74 (d, 8,5) 6,48 (dd, 2,5, 8,5) - 6,31 (d, 2,5) - - 6,74, s - 6,88, s 6,74, s

193,8 114,8 129,8 111,8 164,9 103,8 165,7 131,8 115,2 146,2 119,4 146,2 115,2

190,0 113,5 128,3 110,4 163,1 102,5 164,6 129,9 114,2 145,1 117,8 145,6 114,2

3.3.4. Hợp chất vestitone (DT.11)

Hợp chất DT.11 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Phổ 1H-NMR

của hợp chất này được đặc trưng bởi các tín hiệu các proton thuộc vòng benzen bao

gồm: tín hiệu 3 proton thơm dạng ABX của hệ vòng A tại H [7,67 (1H, d, 8,5 Hz, H-

5), 6,51 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-6) và 6,41 (1H, d, 2,0, H-8)] cùng với tín hiệu 3

proton thơm hệ ABX của hệ vòng B tại H [6,84 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,31 (1H, dd,

8,5, 2,0 Hz, H-5') và 6,29 (1H, d, 2,0 Hz, H-3')].

Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn xác định sự có mặt của 1 nhóm oxymethylen [H 4,48

(1H, t, 11,0 Hz, H-2ax), 4,40 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-2eq)] và 1 nhóm methin H 4,1 (1H,

dd, 11,5, 5,5 Hz, H-3). Còn lại là 1 nhóm methoxy tại H 3,67 (3H, s, 4'-OCH3).

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT.11 xuất hiện 16 tín hiệu carbon bao

gồm tín hiệu 1 carbon carbonyl tại C 190,5 (s, C-4), 1 carbon oxymethylen tại δC

70,4 (C-2), 1 carbon methin tại δC 46,6 (C-3) gợi ý hợp chất có dạng khung

isoflavanone [104].

107

Trên phổ phổ 13C-NMR và DEPT cũng cho thấy tín hiệu 6 carbon methin

thơm tại δC [130,5 (C-5), 128,9 (C-6'), 103,6 (C-6), 106,9 (C-5'), 99,4 (C-3'), 102,3

(C-8)], 4 tín hiệu carbon thơm liên kết với oxy tại δC 164,2 (C-7), 163,2 ( C-8a), 158,1

(C-4'), 158,0 (C-2')], 2 tín hiệu carbon thơm không liên kết hydro tại δC [114,2 (C-

1'), 114,1 (C-4a)]. Cuối cùng là tín hiệu của 1 nhóm methoxy 56,0 ( 4'-OCH3).

Kết hợp dữ kiện phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học

của hợp chất DT.11 được xác định là một isoflavanone có tên là vestitone, được phân

lập từ lõi gỗ loài D. odorefira và có hoạt tính kháng khuẩn [26].

Hình 3.45. Cấu trúc hợp chất vestitone Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo

vestitone [26]

DT.11 (DMSO-d6)

Vị trí

δC (125MHz)

δH

δC

-

1

-

δH (500 MHz) (J, Hz) - 4,40 ( dd, 11,0, 5,5)

72,0

2

70,4

4,48 ( t, 11,0)

48,7 194,7 115,7 130,4 111,7 166,4 103,6 165,8 115,8 157,6 102,7 161,8

- 4,40 ( dd, 11,0, 5,5) 4,56 ( d, 11,0) 4,12 ( dd, 11,0, 5,5) - - 7,74 ( d, 8,8) 6,48 ( d, 2,2, 8,8) - 6,31 (d, 2,2 ) - - - 6,38 (d, 2,4) -

4,10 ( dd, 11,5, 5,5) - - 7,67 ( d, 8,5) 6,51 (dd, 8,5, 2,0) - 6,41 ( d, 2,0) - - - 6,29 (d, 2,0) -

46,6 190,5 114,1 130,5 103,6 164,2 102,3 163,2 114,2 158,0 99,4 158,1

55,7

3,70, s

3,67

56,0

106,0 131,8

6,34 (dd, 8,4) 6,88 (d, 8,4)

3 4 4a 5 6 7 8 8a 1' 2' 3' 4' 4'- OCH3 5' 6'

6,31 (dd, 8,5, 2,0) 6,84 (d, 8,5)

106,9 128,9

108

3.3.5. Hợp chất calycosin (DT.12)

Hợp chất DT.12 thu được dạng chất bột màu vàng. Phổ 1H-NMR cho thấy

các tín hiệu của 6 proton vòng benzen. Trong đó 3 tín hiệu proton đặc trưng bởi hệ

ABX thuộc vòng A cộng hưởng tại H [7,97 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), H ), 6,93 (dd, 9,0;

2,0 Hz, H-6) và H 6,92 (1H, d, 2,5 Hz, H-8)] và các tín hiệu của 3 proton cộng hưởng

tại H [7,05 (1H, s, H-2'), 6,94 ( 1H, d, 9,0 Hz, H-6') và 6,94 (1H, d, 9,0 Hz, H-5')]

thuộc vòng B. Ngoài ra, còn có 1 tín hiệu của proton oxymethin cầu nối tại 8,28 (1H,

s, H-2) và tín hiệu của proton thuộc nhóm methoxy ở H 3,79 (3H, s, 4'-OCH3).

Kết hợp phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy hợp chất có 16 carbon bao gồm

bao gồm 1 nhóm carbonyl tại C 174,5 (s, C-4), 6 nhóm methin thơm tại C [127,3 (d,

C-5), 115,1 (d, C-6), 102,5 (d, C-8), 116,4 (s, C-2'), 112,0 (d, C-5') và 119,7 (d, C-

6')] cùng với tín hiệu 2 carbon thơm không liên kết hydro tại C [124,7 (s, C-1' và

116,6 (s, C-4a)], 4 carbon thơm liên kết với oxi tại C [162,5 (s, C-7), 157,3 (s, C-8a),

146,0 (d, C-3') và 147,5 (s, C- C-4')] cùng với 1 nhóm oxymethin tại C 153,0 (s, C-

2). Cuối cùng là tín hiệu 1 nhóm methoxy tại C 55,6 (q, 4'-OCH3).

Từ các dữ kiện phổ 1D, 2D và kết hợp với tài liệu tham khảo, hợp chất DT.11

được xác định là calycosin đã được phân lập từ loài D. parviflora và loài Astraglus

Membranaceus [41, 109].

Hình 3.46. Cấu trúc hợp chất calycosin

109

Vị trí

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.11 và chất tham khảo

Calycosin [109] (DMSO-d6)

DT.11 (DMSO-d6)

δC (125MHz)

δH (500 MHz), (J, Hz)

δC (125MHz)

1 2 3 4 4a 5

- 8,28 (1H, s0 - - - 7,97 (1H, d, 8,5)

- 153,0 123,3 174,5 116,6 127,3

δH (250 MHz) - 153,3 123,6 174,8 116,9 127,5

6

6,93 (1H, dd, 9,0, 2,0)

115,1

115,4

- 6,92 (1H, d, 2,5) - - 7,05 (1H, s) - 3,79 (3H, s) 6,94 (1H, d, 9,0) 6,94 (2H, d, 9,0)

162,5 102,5 157,3 124,7 116,4 146,0 147,5 55,6 112,0 119,7

162,8 102,4 157,6 125,0 116,7 146,3 147,8 54,6 112,3 119,9

- 8,30 (1H, s0 - - - 7,97 (1H, d, 8,8) 6,90 (1H, dd, 8,8, 2,0) - 6,95 (1H, br.s) - - 7,06 (1H, br.s) - 3,80 (3H, s) 6,95 (1H, br.s) 6,95 9 (1H, br.s)

7 8 8a 1' 2' 3' 4' 4'-OCH3 5' 6'

3.3.6. Hợp chất 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone (DT.13)

Hợp chất DT.13 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ 1H-NMR của hợp

chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho một isoflavone thế hai lần, hệ spin

ABX 7,97 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,94 (1H dd, J=8,8, 2,1 Hz, H-6), và H 6,86 (1H, d,

J=2,0 Hz, H-8)] thuộc về vòng A. Vòng B được đặc trưng bởi hệ spin AA'BB' [H 7,50,

(2H, d, J=8,7 Hz, H-2', H-6') và H 6,86 (2H, d, J=8,7 Hz, H-3', H-5')]. Ngoài ra còn có

thêm tín hiệu proton của 1 nhóm methoxy H 3,78 (3H, s, 3-OCH3).

Phổ 13C-NMR chứng minh phân tử có 16 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm

carbonyl tại [C 175,1 (s, C-4), 4 nhóm methin thơm đối xứng dạng vạch chập tại [C

130,5 (d, C-2', C-6') và C 114,1 (d, C-3', C-5')] cùng với 3 nhóm methin thơm khác

tại [C 124,7 (s, C-5), C 115,7 (d, C-6) và C 102,6 (d, C-8)]. Thêm vào đó là tín hiệu

của 5 nguyên tử carbon thơm tại C [123,6 (s, C-1'), 157,9 (s, C-4'), 163,0 (s, C-7),

159,4 (s, C-8a) và 117,7 (s, C-4a)] cùng với tín hiệu của 2 carbon oxyolefin tại C

110

[153,6 (s, C-2) và 127,8 (s, C-3)] và tín hiệu của 1 carbon methoxy tại C 55,6 (q, 3-

OCH3).

Phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp đối chiếu và so sánh

với tài liệu tham khảo, hợp chất DT.13 được xác định là flavone đã được phân lập từ

loài Trifolium repens có tên là 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone [107].

Hình 3.47. Cấu trúc hóa học hợp chất 4',7-dihidroxy-3-methoxyflavone

3.3.7. Hợp chất liquiritigenin (DT.14)

Hợp chất DT.14 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng, tan tốt trong

MeOH. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.14 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng

cho một flavanone thế hai lần, hệ spin ABX tại [H 7,65 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), H 6,51

(1H, dd, 2,5, 8,5 Hz, H-6), và H 6,33 (1H, d, 2,5 Hz, H-8)] thuộc về vòng A. Vòng

B được đặc trưng bởi hệ spin AA'BB' tại [H 7,32 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6') và H

6,80 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5')], hệ vòng C được nhận biết nhờ tín hiệu doublet của

nhóm oxymethin H 5,42 (1H, dd, 3,0, 13,0 Hz, H-2) và nhóm methylen tại [H 3,06

(1H, dd, 13,0, 17,0 Hz, Ha-3) và H 2,64 (1H, dd, 3,0, 17,0 Hz, Hb-3)].

Phổ 13C-NMR và DEPT chứng minh phân tử có 15 nguyên tử carbon, bao gồm

1 nhóm carbonyl tại [C 190,1 (s, C-4)], 1 carbon oxymethin cầu nối tại C 81,0 (d, C-

2) và 1 carbon methylen tại C 43,2 (t, C-3) gợi ý hợp chất này có dạng khung flavanone

115,2 (d, C-3', C-5') và C 128,4 (d, C-2', C-6')], 3 nhóm methin thơm khác tại [C 129,3

[93]. Thêm vào đó là tín hiệu 4 nhóm methin thơm đối xứng dạng vạch chập tại [C

(s, C-5), C 114,8 (d, C-6), và C 102,6 (d, C-8)], 5 nguyên tử carbon thơm trong khoảng C 110,5-164,7 ppm. Phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và đồng thời so sánh với tài liệu tham khảo, hợp chất DT.14 được xác định là flavanone có tên là

liquiritigenin [99]. Hợp chất này đã được phân lập từ lõi gỗ loài D. odorifera [26].

Liquiritigenin có hoạt tính bảo vệ gan và tế bào thần kinh [100, 101].

111

Vị trí

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.14 và chất tham khảo

Liquiritigenin

DT.14 (*)

δH (ppm) (J, Hz)

δC (ppm)

δC [99]

δH [99]

-

1

-

-

-

5,42 (dd, 3,0, 13,0)

80,8

5,35 (dd, 3,0, 13,0)

2

79,0

3,06 (dd, 3,0, 17,0)

3,01 (dd, 13,0, 16,9)

3

44,9

43,2

2,64 (dd, 3,0, 17,0)

2,66 (dd, 3,0, 16,9)

-

4

-

193,3

190,1

-

4a

-

113,7

110,5

7,65 (d, 8,5)

7,68 ( d, 8,8)

5

129,8

129,3

6,51 (dd, 2,5, 8,5)

113,1

6,43 (dd, 2,3, 8,8)

6

114,8

-

7

-

165,7

163,6

6,33, d, 2,5

6,27, d, 2,3

8

104,2

102,6

-

8a

-

169,9

164,7

-

-

131,1

131,4

7,32 (d, 8,5)

7,31 (d, 8,6)

128,8

128,4

1'

6,80 (d, 8,5)

6,81 (d, 8,6)

116,2

115,2

2'

-

-

159,0

157,6

3'

6,80 (d, 8,5)

6,81 (d, 8,6)

116,2

115,2

4'

7,32 (d, 8,5)

7,31 (d, 8,6)

128,8

128,4

5'

6'

(*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

Hình 3.48. Cấu trúc hợp chất liquiritigenin

112

3.3.8. Hợp chất sativanone (DT.15)

Hợp chất DT.15 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Quan sát trên phổ 1H-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự hiện diện của 1 nhóm oxymethylen

[δH 4,56 (1H, t, 11,0 Hz, H-2ax) và 4,45 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-2eq)/δC 71,4 (C-2)],

1 nhóm methin tại [δH 4,18 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-3)/δC 47,6 (C-3)] và 1 nhóm

carbonyl tại δC 190,7 (C-4). Các tín hiệu này gợi ý đây là một isoflavanone [104].

Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR của hợp chất này đặc trưng cho vòng benzen

thế ở vị trí 1,2,4 (vòng A và B) bởi các tương tác của 2 hệ spin ABX tại [δH 7,77 (1H,

d, J = 9,0 Hz, H-5), 6,58 (1H, dd, J = 9,0, 2,5 Hz, H-6) và 6,59 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-

8); δH 7,01 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,48 (1H, dd, 8,5, 2,5 Hz, H-5') và 6,40 (1H, d, 2,5

Hz, H-3')]. Thêm vào đó là tín hiệu của 2 nhóm methoxy tại δH 3,79 (3H, s, 2'-OCH3) và 3,78 (3H, s, 4'-OCH3). Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 4 carbon

thơm liên kết với oxy tại δC l164,5 (C-7), 164,3 (C-8a), 161,1 (C-4'), 159,1 (C-2')] và

2 carbon thơm không liên kết với hydro tại δC l17,0 (C-1'), 115,5 (C-4a)], 6 carbon

methin thơm tại δC [131,2 (C-5), 129,7 (C-6'), 110,8 (C-6), 105,3 (C-5'), 103,1 (C-

3'), 99,2 (C-8)], 2 nhóm methoxy tại δC 55,6 (4'-OCH3) và δC 55,2 (2'-OCH3). Dựa

trên những bằng chứng phổ phân tích trên cùng với tài liệu tham khảo đã công bố

[26]. Hợp chất này được xác định là sativanone, đã phân lập từ lõi gỗ loài D.

parviflora và D. odorifera [26, 41]. Sativanone có hoạt tính kháng khuẩn và chống

oxi hóa [12, 105].

Hình 3.49. Cấu trúc hợp chất sativanone

3.3.9. Hợp chất 3'-O-methylviolanone (DT.16)

Hợp chất DT.16 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng, tan tốt trong

MeOH. Phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất DT.16 thì thấy các tín

tương đồng với hợp chất sativanone (DT.15), sự khác biệt được xác định khi tín hiệu

của nhóm methin proton thơm H-3' của hợp chất DT.16 bị thay thế bởi 1 nhóm

methoxy tại C 61,2 (q, 3'-OCH3). Do vậy, dẫn đến xuất hiện thêm một tín hiệu carbon

thơm liên kết với oxy tại C 143,6 (s, C-3') ở hợp chất DT.16. Điều này được chứng

113

minh trên phổ 1H-NMR của vòng C hợp chất DT.16 chỉ còn hai tín hiệu của proton

thơm gép ortho tại H [6,75 (1H, dd, 8,5 Hz, H-5') và 6,86 (1H, d, 8,5 Hz, H-6')]. So

sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định được hợp chất này là 3'-O-

methylviolanone, một isoflavanone đã được phân lập từ lõi gỗ loài Dalbergia

odorifera và rễ loài Belamcanda chinensis, có hoạt tính kháng viêm [27, 106].

Vị trí

3'-O-methylviolanone [106]

Hình 3.50. Cấu trúc hợp chất 3'-O-methylviolanone Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.16 và chất tham khảo

DT.16 (*)

δH (ppm) (J, Hz)

δC (ppm)

δH (ppm)

δC (ppm)

-

-

1

71,1

2

72,3

47,8 190,9 114.3 129,4 111,1 164,8 102,8 163,7 122,1 151,9

- 4,14 (dd, 12,0, 5,5) 4,57 ( t, 11,5) 4,43 (dd, 11,0, 5,5) - - 7,79 (d, 8,5) 6,54 (dd, 8,5, 2,0) - 6,37 (d, 2,0) - - -

- 4,52 (dd, 11,2, 11,2) 4,15 (dd, 11,2, 5,2) 4,45 (dd, 11,2, 5,2) - - 7,69 (d, 8,8) 6,54 (dd, 8,8, 2,4) - 6,36 (d, 2,4) - - -

49,5 194,2 115.5 130,4 111,8 166,5 103,7 165,8 123,1 153,2

3,83, s

3,74, s

61,0

60,6

143,6

-

-

142,2

3,82, s

3,71, s

61,2

60,9

155,1

-

-

153,5

3,86, s

3,78, s

56,6

56,3

6,75 (d, 8,5) 6,86 (d, 9,0)

6,76 (d, 8,8) 6,85 (d, 8,8)

108,8 126,0

108,2 124,9

3 4 4a 5 6 7 8 8a 1' 2' 2'- OCH3 3' 3'- OCH3 4' 4'- OCH3 5' 6' (*)1H-NMR (500 MHz, methanol-d4); 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4)

114

3.3.10. Hợp chất sulfuretin (DT.17)

Hợp chất DT.17 được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng. Các tín hiệu trên

phổ 1H-NMR cho thấy đặc trưng của các proton thế 1,2,4 của hai vòng benzen A và

B.Trong đó vòng A đặc trưng bởi 3 proton tương tác hệ ABX tại H [7,60 (1H, d, 8,4

Hz, H-5), 7,44 (1H, d, 2,0 Hz, H-8) và 7,23 (1H, d, 2,0, 8,3 Hz, H-6]. Các tín hiệu

của 3 proton trên vòng B cũng được đặc trưng cho hệ ABX cộng hưởng ở các vị trí

H [6,83 (1H, d, 8,2 Hz, H-5'), 6,74 (1H, d, 1,7 Hz, H-2') và 6,70 (1H, dd, 1,8, 8,4 Hz,

H-6')] cùng với tín hiệu của 1 proton olefin ở vị trí H [6,62 (1H, s, H-2)].

Phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy tại C 167,5

(C-7), 166,3 (C-8a), 148,2 (C-4'), 3 carbon thơm không liên kết với hydro tại C 145,6

(s, C-3'), 124,5 (s, C-1'), 113,1 (C-4a) và 6 carbon methin vòng thơm tại δC 125,7 (C-

5), 123,4 (C-6'), 117,9 (C-2'), 116,0 (C-5'), 112,9 (C-6) và 98,4 (C-8).

Hơn nữa, trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu 1 carbon carbonyl tại δC

181,2 (C-4) cùng với 1 nhóm carbon olefin tại [δC 145,7 (C-3) và 111,9 (C-2)] gợi ý

hợp chất có dạng khung aurone [99, 100]. Từ những lập luận trên và kết hợp với tài

liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất DT.17 có tên 7,3',4'-trihydroxyaurone

(sunfuretin) đã được phân lập từ loài Dalbergia odorifera [110, 113]. Sulfuretin có

tác dụng kháng viêm [111] và gây độc tế bào ung thư [112].

Hình 3.51. Cấu trúc hợp chất 7,3',4'-trihydroxyaurone

115

Position

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất DT.17 và chất tham khảo

Sulfuretin [113]

DT.17 (DMSO-d6)

δH (500 MHz) (J, Hz) - 6,62, s 7,60 (d, 8,4) 7,23 (dd, 2,0, 8,3) 7,44 (d, 2,0) - 6,74 (d, 1,7)

δC (125MHz) - 111,9 145,7 181,2 125,7 112,9 167,5 98,4 113,1 166,3 124,5 117,9

δH [1] - 6,73, d 7,63 (d, 8,0) 7,26 (d, 8,6) 7,55, s - 6,73, d

1 2 3 4 5 6 7 8 4a 8a 1' 2'

145,6

6,83 (d, 8,2) 6,70 (dd, 1,8, 8,4)

148,2 116,0 123,4

3'

δC [1] - 113,4 146,3 183,1 125,5 113,3 168,4 98,0 115,3 167,0 125,0 112,7 148,0 145,3 117,5 124,1

6,87 (d, 8,0) 6,73 (d, 8,0)

4' 5' 6'

3.3.11. Hợp chất formononetin (DT.18)

Hợp chất DT.18 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, tan tốt

trong MeOH. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT.18 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng

cho một isoflavone với hệ spin ABX [H 8,08 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), H 6,97 (1H, dd, 8,5,

2Hz, H-6) và H 6,88 (1H, d, 2,0 Hz, H-8)] thuộc về vòng A. Vòng B được đặc trưng bởi

hệ spin AA'BB' [H 7,49 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6') và H 7,01 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-

5')]. Hệ vòng C được nhận biết nhờ tín hiệu singlet của nhóm oxymethin cầu nối tại H

8,17 (1H, s, H-2), còn lại là tín hiệu của proton nhóm methoxy H 3,85 (3H, s, 4'-OCH3).

Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT chứng minh phân tử có 16 nguyên tử

carbon, bao gồm 1 nhóm carbonyl tại [C 178,1 (s, C-4), 4 nhóm methin thơm đối xứng

dạng vạch chập [C 131,4 (d, C-2', C-6') và C 114,9 (d, C-3', C-5')] cùng với 3 nhóm

methin thơm khác [C 128,5 (s, C-5), C 116,6 (d, C-6) và C 103,3 (d, C-8)], 5 nguyên

tử carbon vòng thơm trong khoảng C 118,1-164,9 ppm. Cuối cùng là 1 carbon oxyolefin

cầu nối tại C 154,8 (d, C-2) và 1 carbon methoxy tại C 55,7 (q, 4'-OCH3) với độ dịch

116

chuyển hóa học nằm về phía trường cao. Phân tích các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-

NMR, DEPT đồng thời kết hợp đối chứng với tài liệu tham khảo. Hợp chất DT.18

được xác định là isoflavone có tên gọi formononetin đã được phân lập từ loài D.

odorifera, D. parviflora và loài Euchresta formosana [12, 108].

Hình 3.52. Cấu trúc hợp chất fomononetin

3.4. KẾT LUẬN VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

Như vậy, từ phân đoạn dichloromethane, ethyl acetate, nước và cao chiết nước

đun sôi sau khi chiết methanol từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã

phân lập được 18 hợp chất flavonoid bao gồm 10 flavanone, 02 neoflavonoid, 03

flavone, 01 aurone, 01 chalcone và 01 aryl-coumarin. Trong số các hợp chất đó, có

02 hợp chất mới là daltonkin A và daltonkin B lần đầu tiên phân lập từ thiên nhiên.

Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định bằng các phương pháp phổ

NMR (1D, 2D), ESI-MS, HR-ESI-MS. Cấu trúc của các hợp chất được liệt kê ở bảng

3.17 dưới đây:

117

Bảng 3.17. Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain)

Pinocemprin Naringenin

Medicarpin 3'-hydoxy-2,4,5-

trimethoxydalbergiquinol

Buteaspermanol

Daltonkin A

(2S)-8-carboxyethylpinocemprin

(Chất mới)

Daltonkin B

Dalbergin (2S)-2,6-dicarboxyethylnaringenin

(Chất mới)

118

7,3',5'-trihydroxyflavanone Liquiritigenin (Chất lần đầu phân lập từ Chi)

Vestitone Sativanone

3'-O-methylviolanone 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone

Calycosin Formononetin

Isoliquiritigenin

7,3',4'-trihydroxyaurone

(Sulfuretin)

119

Nhận xét: kết quả các hợp chất được phân lập từ loài Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) đã góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về hợp chất thiên nhiên được

phân lập từ các cây ở Việt Nam. Đặc biệt các kết quả về thành phần hóa học này cũng

cho thấy sự tương đồng nhất định về lớp chất chính flavonoid của chi Dalbergia ở

Việt Nam với chi này trên thế giới.

3.5. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC

3.5.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ cặn chiết

dichloromethane

Các hợp chất pinocembrin, naringenin và 3'-hydroxy-2,4,5-

trimethoxydalbergiquinol phân lập từ cặn chiết dichloromethane của lõi gỗ loài Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain) được thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

trên một số chủng: Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Aspergillus niger,

Fusarium oxyporum, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans.

Kết quả thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được trình

bày ở bảng 3.18.

Từ bảng 3.18 cho thấy, trong số các hợp chất thử nghiệm, hợp chất pinocembrin

biểu hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với hai chủng nấm mốc và Fusarium oxyporum và

Aspergillus niger với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 50 µg/mL. Loài nấm Fusarium

oxyporum là loại gây bệnh thối cổ rễ. Một trong các bệnh gây hại nhiều đến mùa màng

nước ta. Còn đối với các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans

và vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus thì hợp chất pinocembrin cho thấy

khả năng ức chế trung bình với giá trị MIC=100µg/mL. Hợp chất naringenin có tác

dụng ức chế vửa phải đối với chủng vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus và

chủng nấm mốc Aspergillus niger. Trong khi đó hợp chất 3'-hydroxy-2,4,5-

trimethoxydalbergiquinol không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật trên các chủng thử

nghiệm.

120

Bảng 3.18. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập từ

loài (Dalbergia tonkinensis Prain)

Vi khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn (MIC: µg/mL) Nấm mốc (sợi)

Nấm men

Hợp chất

Bacillus subtillis (-) (-) (-)

Staphylococcus aureus 100 100 (-)

Aspergillus niger 50 100 (-)

Fusarium oxyporum 50 (-) (-)

Saccharomyces cerevisiae 100 (-) (-)

Candida albicans 100 (-) (-)

pinocembrin naringenin 3'-hydroxy- 2,4,5- trimethoxydalbe rgiquinol (-): IC50 ≥ 200 µg/mL

3.5.2. Tác dụng ức chế enzyme - glucosidase của các cặn chiết và các hợp chất

phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Bệnh đái tháo đường (diabetes mellitus), một trong những bệnh được quan tâm

toàn cầu, đã và đang gia tăng nhanh chóng và làm giảm chất lượng sống của con người

trên toàn thế giới. Năm 2013, số người mắc đái tháo đường được báo cáo là 382 triệu

người. trong số này thì 90% bị bệnh đái tháo đường loại 2, số người mắc bệnh đái tháo

đường ước tính sẽ là 592 triệu vào năm 2035. Biến chứng của bệnh này vô cùng nghiêm

trọng. Người bị đái tháo đường rất dễ có nguy cơ mắc các bệnh khác như suy thận,

bệnh tim mạch, huyết áp và các bệnh khác. Các báo cáo cho thấy, số người tử vong do

bệnh đái tháo đường chiếm 8,4% tổng số người chết trong năm 2013 [114, 115].

Do đó, bệnh đái tháo đường luôn là mối quan tâm đặc biệt trên toàn thế giới.

Một số phương pháp điều trị cho bệnh đái tháo đường loại 2 đã được nghiên cứu.

Trong số này, việc sử dụng tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase aGIs cũng được

coi là một liệu pháp hiệu quả cho căn bệnh toàn cầu này [116].

Tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase được thu được từ nhiều nguồn, bao

gồm quá trình tổng hợp hóa học, các loại thảo dược, từ vi sinh vật và từ nấm men.

Trong số này, aGIs có nguồn từ thảo dược đã được quan tâm nhiều để bởi tính an

toàn của chúng trong việc điều trị và kiểm soát đái tháo đường loại 2 [117-124].

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và là quốc gia đa dạng sinh học thứ 16

trên thế giới với 4.000 loài đã được sử dụng làm nguồn dược liệu. Do đó, việc nghiên

121

cứu sàng lọc và phân lập các hợp chất hoạt tính sinh học từ thảo dược luôn được quan

tâm trong những năm gần đây [125-127].

Trong nghiên cứu này, các cao chiết và các hợp gỗ loài Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) thu tại tỉnh Đăk Lăk, đã được khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-

glucosidase ở nồng độ thử nghiệm mạnh hơn acarbose (một loại thuốc điều trị đái

tháo đường). Do đó, việc nghiên cứu theo định hướng hoạt tính ức chế enzyme α-

glucosidase của loài này mở ra tiềm năng phát triển thành thực phẩm chức năng trong

việc kiểm soát bệnh tiểu đường loại 2.

3.5.2.1. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain)

Lõi gỗ cây Sưa được chiết bằng methanol sau đó được thử hoạt tính ức chế

enzyme α-glucosidase. Hoạt tính ức chế được tính bằng giá trị IC50. Kết quả cho thấy

cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm

men với giá trị (IC50 = 0,17 mg/mL) mạnh hơn acarbose (IC50 = 1,21 mg/mL) và hoạt

tính ức chế enzyme α-glucosidase cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa cũng mạnh hơn

cao chiết methanol các bộ phận khác của một số cây thuốc thu ở tỉnh Đăk Lăk (IC50

= 0,25- 4,0 mg/mL) [123-124].

Bảng 3.19. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa

(Dalbergia tonkinensis Prain)

STT Tên loài Bộ phận IC50

(mg/mL)

0,17 ± 0,013 Dalbergia tonkinensis Lõi gỗ 1

1,21 ± 0,103 Acabose (đối chứng dương) 2

Định hướng kế tiếp là xác định xem bộ phận nào của loài Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh nhất: vỏ, lõi gỗ hay

lá. Các bộ phận này được chiết với methanol và được thử hoạt tính. Kết quả thử hoạt tính

chế enzyme α-glucosidase được trình bày ở hình 3.53.

IC50 (mg/mL)

Hoạt tính ức chế (%)

Lõi gỗ Vỏ Lá Acarbose

Lõi gỗ Vỏ Lá Acarbose

Nồng độ (mg/mL)

122

Hình 3.53. Khả năng ức chế α-glucosidase của các bộ phận loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Từ hình 3.53, cho thấy tất cả các bộ phận của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain) đều có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase mạnh (ức chế 98-100%) hơn cả

chất đối chứng dương acarbose (ức chế 62%). Trong các cao chiết methanol của các

bộ phận (lõi gỗ, vỏ và lá) thì giá trị (IC50 = 0,17 mg/mL) của cao chiết lõi gỗ là nhỏ

nhất, kế tiếp là cao chiết vỏ (IC50 = 0,57 mg/mL) rồi đến cao chiết lá (IC50 = 0,78

mg/mL. Cuối cùng là chất đối chứng dương acarbose (IC50 = 1,25 mg/mL). Kết quả

này chỉ ra rằng cao chiết methanol bộ phận lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase mạnh nhất.

Kết quả này giúp định hướng phân lập các hoạt chất có tiềm năng ức chế

enzyme α-glucosidase từ cao chiết methanol của bộ phận lõi gỗ cây Sưa.

3.5.2.2. Kết quả nghiên cứu độ bền pH (2-13) của cao chiết methanol và tương quan

hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng ức chế enzyme

α-glucosidase của cao chiết methanol lõi gỗ cây Sưa trong môi trường pH từ 2 đến

13. Kết quả được trình bày trong hình 3.54

Hoạt tính ức chế (%)

123

pH

Hình 3.54. Độ bền pH (2-13) của cao chiết methanol lõi gỗ Sưa và tương quan hoạt

tính ức chế enzyme α-glucosidase

Kết quả cho thấy hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm men của cao

chiết methanol thay đổi không đáng kể trong khoảng pH từ 2 đến 13. Tỉ lệ ức chế ức

chế enzyme α-glucosidase của cao chiết từ 80-98%

3.5.2.3. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các phân đoạn cao chiết

methanol lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Tiến hành tạo cao chiết methanol tổng (HDT) của lõi gỗ cây Sưa và các cao chiết

phân bố hexane (HDT-1), dichloromethane (HDT-2), ethyl acetate (HDT-3) và cao nước

(HDT-4). Kết quả thử hoạt tính ức chế chế enzyme α-glucosidase từ nấm men của các

phân đoạn cao chiết được trình bày bảng 3.20.

Bảng 3.20. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các cao phân đoạn từ lõi gỗ

Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Khả năng ức chế enzyme α-

Kí hiệu Mẫu cao chiết glucosidase

IC50 (mg/mL) Ức chế (%)*

HDT (cao chiết methanol) 0,172±0,011 98±3,2

HDT-1 (cao phân đoạn hexane) 1,712±0,210 73±4,1

HDT-2 (cao phân đoạn dichloromethane ) 0,124±0,003 90±2,5

HDT-3 (cao phân đoạn ethyl acetate) 0,069±0,001 95±3,7

HDT-4 (cao phân đoạn nước) 0,513±0,051 82±2,3

Acarbose (đối chứng dương) 1,357±0,03 62±1,8

124

nồng độ 0,1-5 mg/mL

(*): Khả năng ức chế của acarbose và các phân đoạn được xác định trong khoảng

Từ bảng 3.20 cho thấy cao chiết ethyl acetate (HDT-3) có hoạt tính ức chế

enzyme α-glucosidase mạnh nhất (95% và giá trị IC50 = 0,069 mg/mL). Dựa trên đánh

giá sắc ký lớp mỏng. Chúng tôi chọn cao chiết phân đoạn này và cao chiết nước để

phân lập các hợp chất theo định hướng tác dụng sinh học.

3.5.2.4. Kết thử nghiệm hoạt tính ức enzyme α-glucosidase các phân đoạn của cao

chiết ethyl acetate (HDT-3), cao chiết nước (HDT-4) và các hợp chất phân lập

Các kết quả thử nghiệm hoạt tính chế ức chế enzyme α-glucosidase từ nấm

men của các phân đoạn con từ cao ethyl acetate (HDT-3), các phân đoạn con từ cao

nước (HDT-4) và 2 hợp chất được tinh sạch của các cao chiết này được trình bày

Hoạt tính ức chế (%)

Các phân đoạn HDT-3

Các phân đoạn HDT-4

Các phân đoạn HDT-3.1

Hoạt tính ức chế (%)

Sativanone Formononetin Acarbose

Nồng độ (mg/mL)

Các phân đoạn HDT-4.3

trong hình 3.55.

Hình 3.55. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các cao phân đoạn và hợp

chất phân lập từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Phân tích các kết quả trên hình 3.55 cho thấy khả năng ức chế enzyme α-

glucosidase của các cao phân đoạn ethyl acetate (HDT-3.1 và HDT-3.1.2) rất mạnh

(ức chế 98-99%) cao hơn các phân đoạn còn lại chỉ ức chế (2-36%) ở cùng nồng độ

125

thử là 0,1 mg/mL. Trong số 8 phân đoạn của cao nước được thử nghiệm thì phân đoạn

(HDT-4.3) cho kết quả ức chế enzyme α-glucosidase tốt và được tiến hành sắc kí bản

mỏng để chia thành 6 phân đoạn con và các phân đoạn con này được tiếp tục thử

nghiệm. Kết quả cho thấy phân đoạn con (HDT-4.3.3) có hoạt tính ức chế enzyme α-

glucosidase cao nhất trong 6 phân đoạn đem đánh giá (98,5%). Tác dụng ức chế

enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất sativanone và formononetin phân lập theo các

phép thử hoạt tính dẫn đường đã cho thấy khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của

2 hợp chất này mạnh hơn acarbose (chất đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế và giá trị

IC50 tương ứng lần lượt sativanone (90%, IC50 =0,23 mg/mL) và formononetin (98%,

IC50 = 0,059 mg/mL) so với acarbose (62%, IC50 =1,321 mg/mL). Sativanone và

formononetin đã được báo cáo tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase phân lập từ

nấm men [65]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi khẳng định hoạt tính ức

chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất này là mạnh hơn và lần đầu tiên phân lập

từ lõi gỗ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain).

3.5.2.5. Kết quả thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất phân

lập từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trên các enzyme α-glucosidase từ các

nguồn khác nhau

Để các nghiên cứu thực hiện một cách đầy đủ và toàn diện hơn so với nghiên

cứu trước đó, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase

của 2 hợp chất trên 4 nguồn enzyme α-glucosidase khác nhau bao gồm (nấm men,

chuột, vi khuẩn và gạo) nhằm đánh giá tiềm năng của chúng trong việc kháng tiểu

đường. Hoạt tính ức chế được đánh giá bằng giá trị IC50. Kết quả được trình bày trong

bảng 3.21.

Bảng 3.21. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của sativanone và formononetin so

với acarbose trên 4 nguồn enzyme khác nhau

STT Nguồn enzyme Khả năng ức chế tính theo IC50 (mg/mL)

α-glucosidase Sativanone Formononetin Acarbose

1 Nấm men 0,23±0,012 0,06±0,002 1,321±0,048

2 Chuột 0,37±0,022 0,23±0,037 0,121±0,001

3 Vi khuẩn 0,07±0,001 0,03±0,002 0,001±0,000

Tất cả thử nghiệm được tiến hành 3 lần

4 Gạo 0,81±0,023 0,98±0,029 0,031±0,005

126

Nhận xét: trong thí nghiệm này enzyme α-glucosidase từ nấm men, từ chuột,

từ vi khuẩn và từ gạo đã được sử dụng để đánh giá tác dụng chống đái tháo đường in

vitro của các hoạt chất phân lập từ lõi gỗ cây Sưa. Kết quả cho thấy 2 hợp chất này

đều có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ 4 nguồn enzyme α-glucosidase của

nấm men, chuột, vi khẩn và gạo.

Cụ thể, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của sativanone đối với enzym

từ nấm men và chuột cao nhưng lại ức chế yếu trên nguồn enzyme từ vi khuẩn và

gạo. Trong khi đó formononetin biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase yếu

từ gạo và biểu hiện hoạt tính ức chế tốt từ chuột, nấm men và vi khuẩn. Khả năng

biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 2 hợp chất này trên enzyme từ

vi khuẩn và chuột tương đương với acarbose. Đối với nấm men thì 2 hợp chất này

biểu hiện khả năng ức chế mạnh hơn so với acarbose còn đối với enzym từ gạo thì

biểu hiện khả năng ức chế yếu so với acarbose.

Mặc dù enzyme từ nấm men đã được sử dụng trong thử nghiệm in vitro chống

đái tháo đường đã được báo cáo [65]. Tuy nhiên, enzyme α-glucosidase từ chuột được

cho là nguồn enzyme tốt hơn để đánh giá tác dụng kháng tiểu đường của các hợp chất

thiên nhiên vì enzyme này gần với enzyme của người. Trong nghiên cứu này, cả

sativanone và formononetin đã được chứng minh khả năng ức chế enzyme α-

glucosidase từ nấm men mạnh hơn so với acarbose và có tác dụng ức chế enzyme α-

glucosidase tương đương so với acarbose khi thử nghiệm với enzyme α-glucosidase

của chuột.

3.5.2.6. Kết quả thử hoạt tính chức chế enzyme α-glucosidase từ chuột của cao chiết

các bộ phận và 2 hợp chất phân lập từ lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Tất cả cao chiết của lõi gỗ, vỏ và lá của và 2 hợp chất được tiến hành thử

nghiệm khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ chuột. Kết quả thử nghiệm thể hiện

được trình bày ở bảng 3.22.

127

Bảng 3.22. Hoạt tính ức chế α-glucosidase trên chuột của cao chiết các bộ

phận và 2 hợp chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)

Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase

trên chuột Thành phần IC50 (mg/mL)

1,72±0,116 Cao chiết (HDT) Ức chế cực đại (%) 61±3,46

2,91±0,289 Cao chiết vỏ 51±4,62

Cao chiết lá 54±4,60

HDT-3 68±5,77

HDT-3.1 75±5,20

HDT-3.1.2 77±5,18

Sativanone

HDT-4

HDT-4.3

HDT-4.3.3

Formononetin

Acarbose 2,78±0,173 1,31±0,057 1,13±0,057 0,92±0,023 0,357±0,006 1,43±0,115 0,87±0,035 0,55±0,012 0,251±0,006 0,119±0,005 91±4,61 67±2,89 78±4,61 84±6,42 94±5,11 93±2,50

Kết quả cho thấy rằng các cao chiết, cao phân bố, các phân đoạn và 2 hợp

chất từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) là các tác nhân ức chế enzyme α-

glucosidase mạnh và có tiềm năng phát triển thành chế phẩm hỗ trợ điều trị đái

tháo đường trong tương lai. Trong số cao chiết các bộ phận (lõi gỗ, vỏ và lá) thì

cao chiết lõi gỗ (HDT) biểu hiện hoạt tính mạnh nhất với khả năng ức chế và giá

trị IC50 tương ứng (61%, 1,27 mg/mL). Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

128

tăng dần từ cao chiết tổng (HDT) qua đến các cao chiết phân đoạn (HDT-3, HDT-

4) kế tiếp là các cao phân đoạn con (HDT-3.1, HDT-3.1.2, HDT-4.3, HDT4.3.3)

và cuối cùng đến các chất tinh sạch sativanone và fomononetin với tỉ lệ ức chế và

IC50 tương ứng (91%, 94%, 0,357 mg/mL, 0,251 mg/mL) so với chất đối chứng

dương acarbose (93%, 0,119 mg/mL).

Kết luận về đánh giá tác dụng sinh học của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain): các hợp chất phân lập từ loài Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã được đánh

giá tác dụng sinh học. Kết quả thử nghiệm cho thấy các hợp chất có tác dụng kháng

khuẩn, hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh. Các kết quả này bước đầu cho thấy mối

liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất thuộc nhóm flavonoid

của chi Dalbergia.

129

KẾT LUẬN

Luận án thực hiện nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) họ Đậu

Fabaceae về các mặt: thực vật, hóa học và tác dụng sinh học.

1. Về kết quả nghiên cứu thực vật

 Các đặc điểm vi phẫu của lá, thân và bột lõi thân của cây Sưa đã được miêu tả

cụ thể, góp phần tiêu chuẩn hóa loài cây gỗ quý này.

Đã xác định trình tự 3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC của 2 mẫu Sưa và

so sánh khoảng cách di truyền của từng vùng gen đó với 5 loài Dalbergia khác

đã công bố trình tự trên GenBank.

 3 vùng gen lục lạp rbcL, rpoB và rpoC có khả năng phân biệt các loài thuộc

chi Sưa (Dalbergia) với tỉ lệ phân biệt cao tương ứng lần lượt là 99%, 98% và

97%.

 Trình tự 3 vùng gen rbcL, rpoB và rpoC của loài Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain) ở Việt Nam đã được đăng ký trên ngân hàng gen với số hiệu lần lượt là

KY283103, KY287755 và KY287750.

2. Về mặt hóa học

 Lần đầu tiên từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) đã phân lập và xác

định cấu trúc hóa học của 18 hợp chất flavonoid: pinocembrin, naringenin,

3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol, medicarpin, buteaspermanol,

daltonkin A [(2S)-8-carboxyethylpinocembrin], daltonkin B [(2S)-2,6-

dicarboxyethylnaringenin],

dalbergin,

isoliquiritigenin,

7,3',5'-

trihydroxyflavanone,

vestitone,

calycosin,

4',7-dihydroxy-3-

methoxyflavone, liquiritigenin, sativanone, 3'-O-methylviolanone, 7,3',4'-

trihydroxyaurone và formononetin.

 02 hợp chất daltonkin A và daltonkin B là các hợp chất mono- và di-

carboxyethylflavanone mới.

130

3. Tác dụng sinh học của các cao chiết và chất phân lập được

3.1. Tác dụng kháng khuẩn

Hợp chất pinocembrin biểu hiện hoạt tính ức chế trên nấm sợi (với nồng

độ ức chế tối thiểu [MIC] là 50 µg/mL), trong khi đó đối với nấm men và

vi khuẩn Gram dương staphylococcus aureus thì hợp chất pinocembrin và

naringenin cho thấy khả năng ức chế trung bình với giá trị MIC là 100

µg/mL.

3.2. Tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase

- Cao chiết methanol của lõi gỗ, vỏ và lá của loài Sưa (Dalbergia

tonkinensis Prain) đã được đánh giá hoạt tính ức chế enzyme -

glucosidase, trong đó cao chiết methanol của lõi gỗ có tác dụng mạnh nhất

với giá trị IC50 là 0,17 mg/mL, so với chất đối chứng dương là acabose

(IC50 là 1,21 mg/mL).

- Phân lập theo định hướng ức chế enzyme α-glucosidase đã xác định 2 hợp

chất sativanone và formononetin có khả năng mạnh hơn acarbose (chất

đối chứng dương) với tỉ lệ ức chế và giá trị IC50 lần lượt của sativanone

(90%, 0,23 mg/mL) và của formononetin (98%, 0,06 mg/mL) so với

acarbose (62%, 1,32 mg/mL).

- Cao chiết methanol từ lõi gỗ Sưa (HDT) có tác dụng ức chế enzyme α-

glucosidase trên chuột mạnh hơn của vỏ và lá với IC50 là 1,72 mg/ mL.

- Sativanone và formononetin có tác dụng ức chế enzyme α-

glucosidase của chuột với tỉ lệ ức chế và giá trị IC50 lần lượt (91%,

0,357 mg/mL) và (94%, 0,251 mg/mL).

131

KIẾN NGHỊ

Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên loài Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain), đã dẫn đến việc phân lập và xác định nhiều hợp chất có cấu trúc lý thú và có

hoạt tính sinh học như kháng khuẩn và ức chế mạnh đối với enzyme α-glucosidase

cùng với các dẫn liệu phong phú về mặt thực vật (vi phẫu và DNA).

- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các bộ

phận gỗ, rễ và lá của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) nhằm tạo dữ

liệu đầy đủ và hệ thống của loài Sưa ở Việt Nam.

- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và

khả năng trị bệnh đái tháo đường của cao chiết methanol, cùng 2 hoạt chất

sativanone và formononetin từ lõi gỗ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain).

132

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Daltonkins A and B, Two New Carboxyethylflavanones from the Heartwood of

Dalbergia tonkinensis, Korean Chemical Society, 2017, 38 (12), 1511–1514

(SCI, IF: 0.76).

2. New Records of Potent In-Vitro Antidiabetic Properties of Dalbergia tonkinensis

Heartwood and the Bioactivity-Guided Isolation of Active Compounds,

Molecules, 2018, 23 (7), 1589-1600 (SCI-E, IF: 3.098).

3. Further study on chemical constituents from the heartwood of Dalbergia

tonkinensis, Vietnam Journal of Science and Technology, 2018, 56 (4A), 252-

258 (ACI).

4. So sánh khả năng phân loại loài sưa đỏ (Dalbergia tonkinensis) Việt Nam của

một số vùng gen lục lạp, Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn Quốc, Hà

Nội, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2018, 100-106, ISBN: 978-604-

913-759-4.

5. Tổng quan về lớp chất flavonoid phân lập từ chi Dalbergia, họ Đậu (Fabaceae),

Tạp chí Dược học, 2018, 505 (58), 16-21.

133

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Đình Đại, Khái quát về hệ thực vật Việt Nam. Hội thảo Việt- Đức về Hóa học

các hợp chất thiên nhiên, Hà Nội, 1998, 16-18 April, 17-27.

2. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển I. NXB Trẻ, Tp. HCM, 1999, 878-889.

3. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, Tp. Hồ Chí Minh, 1999,

1252-1255.

4. N. Vasudeva, M. Vats, S.K. Sharma, S. Sardana, Chemistry and biological activities

of the genus Dalbergia - A review, Pharmacognosy Reviews, 2009, 3, 307-319.

5. S.-M. Yu, Z.-J. Cheng, S.-C. Kuo, Endothelium-dependent relaxation of rat aorta

by butein, a novel cyclic AMP-specific phosphodiesterase inhibitor, European

Journal of Pharmacology, 1995, 280, 69-77.

6. S.-M. Yu, S.-C. Kuo, Vasorelaxant effect of isoliquiritigenin, a novel soluble

guanylatecyclase activator, in rat aorta, British Journal of Pharmacology, 1995,

114, 1587-1594.

7. A. Sugiyama, B.-M. Zhu, A. Takahara, Y. Satoh, K. Hashimoto, Cardiac effects of

Salvia miltiorrhiza/Dalbergiaodorifera mixture, an intravenously applicable

Chinese medicine widely used for patients with ischemic heart disease in China,

Circulation Journal, 2002, 66, 182-184.

8. L. Wu, Y. Wang, Z. Li, B. Zhang, Y. Cheng, X. Fan, Identifying roles of “Jun-Chen-

Zuo-Shi” component herbs of QiShenYiQi formula in treating acute myocardial

ischemia by network pharmacology, Chinese Medicine, 2014, 9, 24.

9. J.P. Abdou, J. Momeni, A. Adhikarid, N. Tsabang, A.T. Tchinda, M.I. Choudhary,

A.E. Nkengfack, New coumestan and coumaronochromone derivatives from

Dalbergia boehmiiTaub. (Fabaceae), Phytochemistry Letters, 2017, 21, 109-113.

10. S. Kaennakam, P. Siripong, S. Tip-Pyang, Dalvelutinoside, a new isoflavone

glycoside from the methanol extract of Dalbergiavelutina roots, Natural Products

Research, 2016, 30, 1493-1498.

134

11. J.P. Abdou, J. Momeni, A. Adhikarid, N. Tsabang, A.T. Tchinda, M.I. Choudhary,

A.E. Nkengfack, New coumestan and coumaronochromone derivatives from

Dalbergia boehmiiTaub. (Fabaceae), Phytochemistry Letters, 2017, 21, 109-113.

12. S. Saha, J.A. Shilpi, H. Mondal, F. Hossain, M. Anisuzzman, M.M. Hasan, G.A.

Cordell, Ethnomedicinal, phytochemical, and pharmacological profile of the genus

Dalbergia L. (Fabaceae), Phytopharmacology, 2013, 4 (2), 297-324.

13. Chính phủ, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP: Nghị định về quản lý thực vật rừng, động

vật rừng nguy cấp. Quý, hiếm, 2006.

14. Vũ Thị Thu Hiền, Lưu Đàm Cư, Đinh Thị Phòng, Xác định trình tự đoạn gen tRNA-

LEU cho hai loài cây gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) và cây gỗ Trắc đỏ (Dalbergia

conchinchinensis) phục vụ việc phân loại mẫu vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam,

Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2009, 7 (4), 471-477.

15. Trần Anh Tuấn, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn Quang Hưng, Trần

Minh Hợi, Trần Huy Thái, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Các hợp chất isoflavon

và dihydrophenanthren từ cây Sưa Bắc Bộ (Dalbergia tonkinensis), Tạp chí Hóa

học, 2009, 47 (6), 716-719.

16. Nguyễn Đăng Khôi (Nguyễn Tiến Bân- chủ biên), Chi Dalbergia L. f. (họ Fabaceae).

Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Tập II, NXB Nông nghiệp, 2003, 779-786.

17. Phạm Thanh Loan, Một số đặc điểm sinh học, sinh thái và hoạt tính sinh học của một

số loài chi Trắc (Dalbergia L.f.) ở Việt Nam. Hội nghị Khoa học toàn Quốc về Sinh

thái Tài nguyên và Sinh vật lần thứ 4, Hà Nội, 2014, 1201-1206.

18. The Plant List. Available: http://www.theplantlist.org/tpl1.1/search?q=dalbergia,

(Accessed, July 29, 2018).

19. Trần Ngọc Hải, Bảo tồn và phát triển loài quý hiếm Sưa (Dalbergia tonkinensis

Prain). Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ hai,

Hà Nội, 2010, 34–36.

20. Đỗ Xuân Cẩm, Cây Sưa ở Huế và các loài Sưa ở Việt Nam, Tạp chí nghiên cứu và

phát triển, 2013, 1 (99), 95-100.

135

21. S. Deesamer, U. Kokpol, W. Chavasiri, S. Douillard, V. Peyrot, N. Vidal, S. Combes,

J.-P. Finet, Synthesis and biological evaluation of isoflavone analogues from

Dalbergiaoliveri, Tetrahedron, 2007, 63, 12986-12993.

22. D.M.X. Donnelly, P.J. Kavanagh, Isoflavanoid of Dalbergia oliveri, Phytochemistry,

1974, 13, 2587-2591.

23. H.M. Chawla, S.S. Chibber, T.R. Seshadri, Volubilinin, a new isoflavone-C-

glycoside from Dalbergia volubilis flowers, Phytochemistry,1976, 15, 235-237.

24. M. Gregson, W.D. Ollis, B.T. Redman, I.O. Sutherland, H.H. Dietrichs, O.R.

Gottlieb, Obtusastyrene and obtustyrene, cinnamylphenol from Dalbergia retusa,

Phytochemistry, 1978, 17, 1395-1400.

25. M. Yahara, T. Ogata, R. Saijo, K. Yoshi, J. Yamahara, K. Miyahara, T. Nohara,

Isoflavan and related compounds from Dalbergia odorifera, Chem. Pharm. Bull,

1989, 37 (4), 979-987.

26. X. Zhao, W. Mei, M. Gong, W. Zuo, H. Bai, H. Dai, Antibacterial Activity of

Flavonoids from Dalbergia odorifera on Ralstoniasolanacearum, Molecules, 2011,

16, 9775-9782.

27. S.-C. Chan, Y.-S. Chang, J.-P. Wang, S.-C. Chen, S.-C. Kuo, Three new flavonoids

and antiallergic, anti-inflammatory constituents from the heartwood of Dalbergia

odorifera, Planta Medica, 1998, 64, 153-158.

28. C.W. Choi, Y.H. Choi, M.-R. Cha, Y.S. Kim, G.H. Yon, Y.-K. Kim, S.U. Choi, Y.H.

Kim, S.Y. Ryu, Antitumor components isolated from the heartwood extract of

Dalbergia odorifera, Journal of the Korean Society for Applied Biological

Chemistry, 2009, 52, 375-379.

29. P. Ramesh, C.R. Yuvarajan, Coromandelin, a new isoflavanoneapioglucoside from

the leaves of Dalbergia coromandeliana, Journal of Natural Products, 1995, 58,

1240-1241.

30. L.Mathias, I.J.C. Vieira, R. Braz-Filho, E. Rodrigues-Filho, A new isoflavone

glycoside from Dalbergia nigra, Journal of Natural Products, 1998, 61, 1158-1161.

31. W. Wang, X. Weng, D. Cheng, Antioxidant activities of natural phenolic components

from Dalbergia odorifera T. Chen, Food Chemistry, 2000, 71, 45-49.

136

32. J.-P. Hou, H. Wu, C.-T. Ho, X.-C. Weng, Antioxidant activity of polyphenolic

compounds from Dalbergia odorifera T. Chen, Pakistan Journal of Nutrition, 2011,

10, 694-701.

33. I.A. Khan, M.A. Avery, C.L. Burandt, J.R. Mikell, T.E. Nash, A. Azadegan, L.A.

Walker, Antigiardial activity of isoflavones from Dalbergia frutescens Bark, Journal

of Natural Products, 2000, 63, 1414-1416.

34. P. Dixit, R. Chillara, V. Khedgikar, J. Gautam, P. Kushwaha, A. Kumar, D. Singh,

R. Trivedi, R. Maurya, Constituents of Dalbergia sissoo Roxb. Leaves with

osteogenic activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22, 890-897.

35. C. Ito, M. Itoigawa, T. Kanematsu, N. Ruangrungsi, H. Higashihara, H. Tokuda, H.

Nishino, H. Furukawa, New Cinnamylphenols from Dalbergia Species with Cancer

Chemopreventive activity, Journal of Natural Products, 2003, 66, 1574-1577.

36. N. Beldjoudi, L. Mambu, M. Labaied, P. Grellier, D. Ramanitrahasimbola, P.

Rasoanaivo, M.T. Martin, F. Frappier, Flavanoids from Dalbergia louveliti and

antiplasmodial activity, Journal of Natural Products, 2003, 66, 1447-1450.

37. B. Huertaa, J.P. Peralta-Cruz, R. Laredob, J. Karchesyc, Neocandenatone, an

isoflavan-cinnamylphenolquinonemethide pigment from Dalbergiacongestiflora,

Phytochemistry, 2004, 65, 925-928.

38. S. Cheenpracha, C. Karalai, C. Ponglimanont, A. Kanjana-Opas, Candenatenins A-

F, phenolic compounds from the heartwood of Dalbergiacandenatensis, Journal of

Natural Products, 2009, 72, 1395-1398.

39. K. Umehara, K. Nemoto, K. Kimijima, A. Matsushita, E. Terada, O. Monthakantirat,

W. De-Eknamkul, T. Miyase, T. Warashina, M. Degawa, H. Noguchi, Estrogenic

constituents of the heartwood of Dalbergiaparviflora, Phytochemistry, 2008, 69,

546-552.

40. U. Songsiang, S. Wanich, S. Pitchuanchom, S. Netsopa, K. Uanporn, C. Yenjai,

Bioactive constituents from the stems of Dalbergia parviflora, Fitoterapia, 2009, 80,

427-431.

41. K. Umehara, K. Nemoto, A. Matsushita, E. Terada, O. Monthakantirat, W. De-

Eknamkul, T. Miyase, T. Warashina, M. Degawa, H. Noguchi, Flavonoids from the

137

heartwood of the Thai medicinal plant Dalbergia parviflora and their effects on

estrogenic-responsive human breast cancer cells, Journal of Natural Products, 2009,

72, 2163-2168.

42. Z.-J. Cheng, S.-C. Kuo, S.-C. Chan, F.-N. Ko, C.-M. Teng, Antioxidant properties of

butein isolated from Dalbergia odorifera, Biochimicaet Biophysica Acta, 1998,

1392, 291-299.

43. P. Mutai, M. Heydenreich, G. Thoithi, G. Mugumbate, K. Chibale, A. Yenesew, 3-

Hydroxyisoflavanones from the stem bark of Dalbergia melanoxylon: Isolation,

antimycobacterial evaluation and molecular docking studies, Phytochemistry

Letters, 2013, 6, 671-675.

44. S. Kavimani, R. Ilango, G. Krishnamoorthy, J.B. Tamizhmozhi, N.S. Nagarajan, C.

Manoj, Antiinflammatory activity of biochanin-A isolated from Dalbergiasissoide,

Indian Journal of Heterocyclic Chemistry, 1997, 6, 235-236.

45. Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. NXB Đại học Quốc

Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2007.

46. R.-B. An, G.-S. Jeong, Y.-C Kim, Flavonoids from the heartwood of

Dalbergiaodorifera and their protective effect on glutamate-induced oxidative

injury in HT22 cells, Chem. and Pharm. Bull, 2008, 56 (12), 1722-1724.

47. X. Yu, W. Wang, M. Yang, Antioxidant activities of compounds isolated from

Dalbergiaodorifera T. Chen and their inhibition effects on the decrease of

glutathione level of rat lens induced by UV irradiation, Food Chemistry, 2007, 104,

715-720.

48. R.-X. Liu, Q. Wang, H.-Z. Guo, L. Li, K.-S. Bi, D.-A. Guo, Simultaneous

determination of 10 major flavonoids in Dalbergiaodorifera by high performance

liquid chromatography, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005,

39, 469-476.

49. C. Lee, J.W. Lee, Q. Jin, D.S. Jang, S.J. Lee, D. Lee, J.T. Hong, Y. Kim, M.K. Lee,

B.Y. Hwang, Inhibitory constituents of the heartwood of Dalbergia odorifera on

nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages, Bioorganic & Medicinal

Chemistry Letters, 2013, 23, 4263-4266.

50. U. Songsiang, C. Hahnvajanawong, C. Yenjai, Cytotoxicity of chemical constituents

138

from the stems of Dalbergia parviflora, Fitoterapia, 2011, 82(8), 1169-1174.

51. Phạm Thanh Loan, Hoàng Lê Tuấn Anh, Bùi Hữu Tài, Phạm Hải Yến, Đan Thị Thúy

Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị Dung, Nguyễn Xuân

Nhiệm, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Nguyễn Thị Hiền, Các

hợp chất flavonoid phân lập từ gỗ cây Cẩm lai (Dalbergia oliveri), Hội nghị khoa

học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, 2013, 1140-1146.

52. C. Ito, M. Itoigawa, T. Kanematsu, N. Ruangrungsi, T. Mukainaka, H. Tokuda, H.

Nishino, H. Furukawa, Isoflavonoids from Dalbergia oliveri, Phytochemistry, 2003,

64(67), 1265-1268.

53. S.-C. Chan, Y.-S. Chang, S.-C. Kuo, Neoflavonoids from dalbergia odorifera,

Phytochemistry, 1997, 46(5), 947-949.

54. O. Shirota, V. Pathak, S. Sekita, M. Satake, Y. Nagashima, Y. Hirayama, Y.

Hakamata, T. Hayashi, Phenolic constituents from Dalbergia cochinchinensis, J.

Nat. Prod, 2003, 66 (8), 1128-1131.

55. S.F. Farag, A.S. Ahmed, K. Terashima, Y. Takaya, M. Niwa, Isoflavonoid glycosides

from Dalbergia sissoo, Phytochemistry, 2001, 57(8), 1263-1268.

56. Y. Tao, Y. Wang, Bioactive sesquiterpenes isolated from the essential oil of

Dalbergia odorifera T. Chen, Fitoterapia, 2010, 81(5), 393-396.

57. K. Masanori, U. Akira, H. Yutaka, H. Yusuke, G. Tomoo, I. Takako, K. Syoji, Y.

Takuma, S. Motoyoshi, S. Setsuko, Anti-androgen active constituents from

Dalbergia cochinchinensis Pierre, Natural Medicines, 1996, 50, 408-412.

58. S. Saha, Md. Aniuzzman, M.K. Islam, H. Mondal, C. Talukder, Anitibacterial and

cytotoxic potential of Dalbergia spinosa Roxb Leaves, International Journal of

Pharmaceutical Sciences and Research, 2013, 4, 512-515.

59. S.W. Hajare, S. Chandra, J. Sharma, S.K. Tandan, J. Lal, A.G. Telang, Anti-

inflammatory activity of Dalbergia sisso leaves, Fitoterapia, 2001, 72, 131-139.

60. R.B. Ganga, K.P. Madhu, R.A.D. Vijaya, Investigation og antioxidant and anti-

inflammatory activity of leaves of Dalbergia paniculata (Roxb), Asian Pacigic

Journal of Tropical Medicine, 2012, 455-458.

139

61. M.O. Sofidiya, O.A. Odukoya, O.B. Familoni, S.I. Inya-Agha, Free radical

scavenging activity of some Nigerian medicinal plant extracts, Pakistan Journal of

Biological Sciences, 2006, 9, 1438-1441.

62. M. Khalid, H.H. Siddiqui, S. Freed, In-vitro assessment of antioxidant activity of

Dalbergia latifolia barks extract against free radicals, American-Eurasian Journal

of Scientific Research, 2011, 6, 172-177.

63. V. Bala, M.R. Karim, A.K. Shill, I.Z. Shahid, Antinociceptive, antioxidant and cytotoxic

activity of Dalbergia spinosa spike, Pharmacologyonline, 2011, 1, 560-566.

64. P.T. Loan, T.H. Thái, P.V. Kiệm, C.V. Minh, Đ.T. Thảo, T.T. Sửu, Hoạt tính sinh

học của một số hợp chất phân lập từ gỗ cây cẩm lai Dalbergia oliveri Gamble

exPrain, Tạp chí sinh học, 2013, 34 (4), 439-444.

65. C. Zhao, Y. Liu, D. Cong, H. Zhang, J. Yu, X. Cui, J. Sun, Screening and

determination for potential α-glucosidase inhibitory constituents from

Dalbergia odorifera T. Chen using ultrafiltration-LC/ESI-MSn, Biomedical

Chromatography, 2013, 27(12), 1621-1629.

66. S.W. Hajare, S. Chandra, S.K. Tandan, J. Sarma, J. Lal, A.G. Telang, Analgesic and

antipyretic activities of Dalbergia sissoo leaves, Indian Journal of Pharmacology,

2000, 32, 357-360.

67. S. Wang, Z. Zheng, Y. Weng, Y. Yu, D. Zhang, W. Fan, R. Dai, Z. Hu, Angiogenesis

and antiangiogenesis activity of Chinese medicinal herbal extracts, Life Sciences,

2004, 74, 2467-2478.

68. S.K. Okwute, R. Onyia, C. Anene, O.P. Amodu, Protectant insecticidal and

antimicrobial potentials of Dalbergia saxatilis Hookf. (Fabaceae), African Journal

of Biotechnology, 2009, 8, 6556-6560.

69. K.P. Jaiganesh, S. Akilandeshwari, R. Senthamarai, Diuretic activity of root extracts

of Dalbergia spinosa Roxb, Ancient Science of life, 2009, 28, 11-13.

70. P.T. Loan, H.T.L. Anh, N.T. Cuc, D.T. Yen, D.T. Hang, T.M. Ha, N.X. Nhiem, N.V.

Du, T.H. Thai, C.V. Minh, P.V. Kiem, New Isolavone Glycosides from the Stems of

Dalbergia vietnamesis, Natural Product Comumnication, 2014, 9 (6), 809-810.

140

71. M. Asif, A. Kumar, Anti-inflammatory activity of ethanolic extract of Dalbergia

sissoo (roxb.) bark, Malaysian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2009, 7, 39-50.

72. J.W. Kress, K.J. Wurdack, E.A. Zimmer, L.A. Weigt, D.H. Janzen, Use of DNA

barcodes to identify flowering plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102, 8369–

8374.

73. M. Hasebe, T. Omori, M. Nakazawa, T. Sano, M. Kato, K. Iwatsuki, rbcL Gene

Sequences Provide Evidence for the Evolutionary Lineages of Leptosporangiate

Ferns, PNAS, 1994, 91(12), 5730-5734.

74. J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson, CLUSTAL W: Improving the sensitivity

of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-

specific gap penalties and weight matrice choice. Nucleic Acids Research, 1994, 22,

4673-4680.

75. K.B Nicholas, H.B. Nicholas, D.W. Deerfield, GeneDoc: Analysis and Visualization

of Genetic Variation. Embnew News, 1997, 4, 14.

76. K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei, S. Kumar, MEGA5:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood,

Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Method. Molecular Biology and

Evolution, 2011, 28, 2731-2739.

77. H. Xiong, S. Qi, Y. Xu, L. Miao, P. Y. Qian, Antibiotic and antifouling compound

production by the marine-derived fungus Cladosporium sp. F14 Journal of Hydro-

Environ Research, 2009, 2(4), 264-270.

78. N.V. Bon, S.L. Wang, New novel α-glucosidase inhibitors produced microbial

conversion, Process.Biochem, 2018, 65, 228-232.

79. N.V. Bon, N.A. Dzung, Y.H. Kuo, S.L. Wang, Biosynthesis of α-glucosidase

inhibitors by a newly isolated bacterium, Paenibacillus sp. TKU042 and its

effect on reducing plasma glucose in mouse model, Int.J.Mol.Sci, 2017, 18,

700.

80. D.T. Phong, V.T.T. Hien, T.T.V. Thanh, N.T. Van, N.Q. Binh, Genetic diversity on

tropical rare species of Dalbergia in Viet Nam revealed by inter-simple sequence

141

repeat (ISSR) markers, African journal of Biotechology, 2011, 10 (55), 11397-

11408.

81. T. Li-Bo, L. Li, L. Wei-Jian, H. Yao, Q. Ming-Yan, F. Min, L. Cui-Zhen, DNA

Barcoding the plants of Dalbergia odorefira, Journal of Plant Genetic Resources,

2013, 14 (6), 1147-1152.

82. M. Yu, K. Liu, L. Zhou, L. Zhao, S. Liu, Testing three proposed DNA barcodes for

the wood indentification of Dalbergia odorefira T. Chen and Dalbergia tonkinensis

Prain. Holzforschung, 2016, 70 (2), 127-136.

83. Tsumura Y, Kawahara T, Wickneswari R, and Yoshimura K, Molecular phylogeny

of Dipterocarpaceae in Southeast Asia using RFLP of PCR-amplified chloroplast

genes. Theoreticaland Applied Genetics, 1996, 93, 22-29.

84. L. Guo, X. Chen, N. Li, W. Tang, Y.T. Pan, J.Q. Kong, Transcriptome-enabled

discovery and functional characterization of enzymes related to (2S)-pinocembrin

biosynthesis from Ornithogalum caudatum and their application for metabolic

engineering, Microb Cell Fact, 2016, 15 (27),1-19.

85. A.Y.L. Ching, T.S. Wah, M.A. Sukari, G.E.C. Lian, M. Rahmani, K. Khalid,

Characterization of flavonoid derivatives from Boesenbergia rotunda (L.), The

Malaysian Journal of Analytical Sciences, 2007, 11, 154-159.

86. H. Fukui, K. Goto, M. Tabata, Two Antimicrobial Flavanones from the Leaves of

Glycyrrhiza glabra, Chem. Pharm. Bull, 1988, 36 (10),4174-4176.

87. F. Maltese, C. Erkelens, F. Kooy, Y.H. Choi, R. Verpoorte, Identification of

natural epimeric flavanone glycosides by NMR spectroscopy, Food Chemistry,

2009, 116, 575-579.

88. K. Osawa, H. Yasuda, T. Maruyama, H. Morita, K. Takeya, H. Itokawa,

Isoflavanones from Heartwood of Swatzia Polyphylla and Their Antibacterial

Activity against Cariogenic Bacteria, Chem. Pharm. Bull, 1992, 40 (11), 2970-2974.

89. C. Martisnez-Sotres, P. Lospez-Albarrán, J. Cruz-de-León, T. García-Moreno, J.G.

Rutiaga-Quinones, G. Vázquez-Marrufo, J. Tamariz-Mascarúa, R. Herrera-Bucio,

Medicarpin, an antifungal compound identified in hexane extract of Dalbergia

142

congestiflora Pittier heartwood, International Biodeterioration and Biodegradation,

2012, 69, 38-40.

90. H. Wang, W.-L. Mei, Y.-B. Zeng, W.-J. Zuo, Z.-K. Guo, L.-L. Chen, H.-M. Zhong,

H.-F. Dai, Phenolic compound from Dalbergia odorifera, Phytochemistry Letters,

2014, 9, 168-173.

91. V.R. Sindhia, R. Bairawa, Plant review: Butea monosperma, International Jounal of

Pharmaceutical and clinical Search, 2010, 2 (2), 90-94.

92. R. Maurya, D.K. Yadav, G. Singh, B. Bhargavan, P.S.N. Murthy, M. Saha, M.M.

Singh, Osteogenic activity of constituent from Butea monosperma, Bioorganic and

Medicinal Chemistry Letters, 2008, 19(3), 610-613.

93. M. Furukawa, H. Suzuki, M. Makino, S. Ogawa, T. Ida, Y. Fujimoto, Studies on

the constituents of Lagochilus leiacanthus (Labiate), Chem. Pharm. Bull, 2011, 59,

1535-1540.

94. W. Gaffield, Circular dichroism, oftiacl rotatory dispersion andabsolute

configuration of flavanones, 3-hydroxyflavanones and their glycosides Tetrahedron,

1970, 26, 4093-4018.

95. J. E. S. A. Menezes, F. E. A. Machado, T. L. G. Lemos, E. R. Silveira, R. B. Filho,

O. D. L. Pessoa, Sesquiterpenes and a Phenylpropanoid from Cordia trichotoma, Z.

Naturforsch, 2004, 59, 19-22.

96. G. H. Stout, G. K. Hickernell, K. D. Sears, Calophyllum products. IV. Papuanic and

isopapuanic acids, J. Org. Chem, 1968, 33 (11), 4191-4200.

97. J. Durbin, L. E. Fellows, C. R. Dykes, L-DOPA in Seed of Dalbergia retusa

Leguminosae-Papilionoideae, Kew Bull. 1984, 39 (4), 799-801

98. M. Jansirani, R. Gandhidasan, Phytochemistry Investigation of Dalbergia

rubiginosa, Joural of Natural Product and Resources, 2015, 1 (1), 10-12.

99. S. Khamsan, S. Liawruangrath, A. Teerawutkulrag, S. Pyne, M. Garson, B.

Liawruangrath, The isolation of bioactive flavonoids from Jacaranda obtusifolia H.

B. K. ssp. rhombifolia (G. F. W. Meijer) Gentry, Acta Pharm, 2012, 62 181190.

143

100. R. Gaur, S. Kumar, P. Trivedi, R.S. Bhakuni, D.U. Bawankule, A. Pal, K. Shanker,

Liquiritigenin derivatives and their hepatoprotective activity, Nat. Prod. Commun,

2010, 5(8), 1243–1246.

101. E.-J. Yang, G.H. Park, K.-S. Song, Neuroprotective effects of liquiritigenin isolated

from licorice roots on glutamate-induced apoptosis in hippocampal neuronal cells,

Neurotoxicology, 2013, 39, 114–123.

102. Q. Zhang, L. Xue-Ting, J.-Y. Liang, M. Zhi-Da, Chemical constituents from the

stems of Caesalpinia decapetala, Chinese J. Nat. Med, 2008, 6(3), 168–172.

103. Y. Lin, Y. Kuang, K. Li, S. Wang, S. Ji, K. Chen, W. Song, X. Qiao, M. Ye, Nrf2

activators from Glycyrrhiza inflata and their hepatoprotective activities against

CCl4-induced liver injury in mice, Bioor. Med. Chem, 2017, 25(20), 5522–5530.

104. P.K. Agrawal, Carbon-13 NMR of Flavonoids, Studies in Organic Chemistry,

Amsterdam-Oxford-NewTork-Tokyo, 1989, 39,189–191.

105. G. Castellano, F. Torrens, Quantitative structure-antioxidant activity models of

isoflavonoids: a theoretical study, Int. J. Mol. Sci, 2015, 16(6), 12891–12906.

106. J.W. Lee, C. Lee, Q. Jin, M.-S. Lee, Y. Kim, J.T. Hong, M.K. Lee, B.Y. Hwang,

Chemical constituents from Belamcanda chinensis and their inhibitory effects on

nitric oxide production in RAW 264.7 macrophage cells, Arch. Pharm. Res, 2014,

38(6), 991997.

107. M.A. Ponce, J.M. Servino, R.E. Balsells, J.A. Ocampo, A.M Godeas, Flavonoids

from shoots and roots of Trifolium repens (white clover) grown in precence of

absence of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices, Elsevier, 2004,

65, 1925-1930.

108. W.-L. Lo, F.-R. Chang, T.-J. Hsieh, Y.-C. Wu, The constituents of Euchresta

formosana, Journal of the Chinese Chemical Society, 2002, 49(3), 421-426.

109. C.-Q. Song, Z.-R. Zheng, L. Di, Z.-B. Hu, Isoflavones from Astraglus

Membranaceus, Acta Botanica Sinica, 1997, 39 (8), 764-768.

144

110. H. Chen, C. Wang, Y. Ye, H. Zhou, R. Tao, Isolation of sulfuretin and butin from

Rhus verniciflua Stokes using medium-pressure liquid chromatography and their

tyrosinase inhibitory effects, BioResources, 2016, 11(1), 759771.

111. D.-S. Lee, G.-S. Jeong, B. Li, H. Park, Y.-C. Kim, Anti-inflammatory effects of

sulfuretin from Rhus verniciflua Stokes via the induction of heme oxygenase-1

expression in murine macrophage, Int. Immunopharmacol, 2010, 10(8), 850858.

112. K.-W. Lee, K.-S. Chung, J.-H. Seo, S.-V. Yim, H.-J. Park, J.-H. Choi, K.-T. Lee,

Sulfuretin from heartwood of Rhus verniciflua triggers apoptosis through

activation of Fas, Caspase, and the mitochondrial death pathway in HL‐60 human

leukemia cells, J.Cell. Biochem, 2012, 113(9), 28352844.

113. C.P.D. Cunha, C.P, R.L.O. Godoy, R.B. Filho, Isolation of flavonoids from rmance

Liquid Chromatography, Rev.Virtual Quim, 2016, 8(1), 43-56.

114. H.C. Gerstein, M.E. Miller, R.P. Byington, D.C. Jr. Goff, J.T. Bigger, J.B. Buse,

W.C. Cushman, S. Genuth, F. Ismail-Beigi, R.H.J. Grimm, Effects of intensive

glucose lowering in type 2 diabetes, N. Engl. J. Med, 2008, 358, 2545–2559.

115. S.H. Ley, O. Hamdy, V. Mohan, F.B. Hu, Prevention and management of type 2

diabetes: Dietary components and nutritional strategies, The Lancet, 2014,

383(9933), 1999–2007.

116. E.B. Melo, A.S. Gomes, I. Carvalho, α-and β-Glucosidase inhibitors: Chemical

structure and biological activity, Tetrahedron, 2006, 62(44), 10277–10302.

117. G. Wang, Z. Peng, J. Wang, X. Li, J. Li, Synthesis, in vitro evaluation and

molecular docking studiensicannees of novel triazine-triazole derivatives

as potential α-glucosidase inhibitors, Eur. J. Med. Chem, 2017, 125, 423–429.

118. U. Ghani, Re-exploring promising a-glucosidase inhibitors for potential

development into oral anti-diabetic drugs: Finding needle in the haystack,

Eur. J. Med. Chem, 2015, 103, 133–162.

119. N.V. Bon, N.A. Dung, S.-L. Wang, Utilization of fishery processing by-

product squid pens for α-glucosidase inhibitors production by

Paenibacillus sp, Mar. Drugs, 2017, 15(9), 274.

145

120. C.-H. Hsu, N.A. Dung, S.-L. Wang, Conversion of shrimp heads to α-

glucosidase inhibitors via co-culture of Bacillus mycoides TKU040 and

Rhizobium sp. TKU041, Res. Chem. Intermed, 2018, 1-11.

121. H. Nam, H. Jung, S. Karuppasamy, Y.S. Park, Y.S. Cho, J.Y. Lee, S. Seong,

J.G. Suh, Anti-diabetic effect of the soybean extract fermented by Bacillus

subtilis MORI in db/db mice, Food Sci. Biotechnol, 2012, 21(6),1669–1676.

122. P. McCue, Y.-I. Kwon, K. Shetty, Anti-diabetic and antihypertensive

potential of sprouted and solid-state bioprocessed soybean, Asian Pac. J.

Clin. Nutr, 2005, 14(2), 145–152.

123. N.Q. Vinh, N.A. Dung, S.-L. Wang, Screening and evaluation of α-glucosidase

inhibitors from indigenous medicinal plants in Dak Lak Province, Vietnam,

Res. Chem. Intermed, 2017, 43(6), 3599-3612.

124. N.Q. Vinh, J.-B. Eun, S.-L. Wang, N.D. Hoang, T.H. Nhung, N.A. Dung, Anti-

oxidant and antidiabetic effect of some medicinal plants belong to Terminalia

species collected in Dak Lak Province, Vietnam, Res. Chem. Intermed, 2016,

42(6), 5859–5871.

125. N.A. Dung, N.Q. Vinh, S.-L. Wang, Porcine pancreatic α-amylase inhibitors

from Euonymus laxiflorus Champ, Res. Chem. Intermed, 2017, 43(1), 259–269.

126. N.Q. Vinh, S.-L. Wang, N.A. Dung, In vitro α-glucosidase and α-amylase

inhibition, and in vivo anti-hyperglycemic effects of Psidium littorale Raddi

leaf extract, Res. Chem. Intermed, 2018, 44(3), 1745–1753.

127. S.-L. Wang, New novel α-glucosdase inhibitors produced by microbial

conversion, Process Biochemistry, 2018, 65, 228–232.