Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tách, thủy phân glucomannan từ cây Amorphophallus Konjac K.Koch định hướng ứng dụng hạ đường huyết của sản phẩn tạo thành

BỘ GIÁO DỤCVÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

TRẦN THỊ NỮ

NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN

GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJACK.

KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số:9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2020

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và

Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Đỗ Trường Thiện

Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Trần Thị Ý Nhi

Phản biện 1: …

Phản biện 2: …

Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận

án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công

nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào

hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Tính cấp thiết của đề tài

Glucomannan là một polysacarit gồm các mắt xích D-

mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4)

glucozit. Các mạch nhánh có thể chiếm khoảng 8% thông qua

liên kết β-1,3-glucozit và β-1,6-glucozit. Đây là một chất xơ

hòa tan nghèo năng lượng được dùng làm thực phẩm trong khẩu

phần ăn của người ăn kiêng để giảm cân, làm giảm cholesterol

trong máu, mỡ máu, giảm hấp thu đường huyết. Ngoài ra

glucomannan còn có nhiều tính chất quý như có khả năng hấp

thụ nước trương nở tốt tạo dung dịch có độ nhớt cao nên được

ứng dụng trong nhiều lĩnh vực tạo độ ổn định cho thực phẩm,

tạo gel, tạo màng.

Glucomannan có trong nhiều loài nưa, ở mỗi loài cấu

trúc và tính chất khác nhau, trong đó Nưa Konjac

(Amorphophalus konjac K.Koch) là loài có hàm lượng

glucomannan cao và là cây trồng chủ lực để phát triển ngành

Nưa ở một số nước Đông Á và Đông Nam Á như: Trung Quốc,

Nhật Bản, Thái Lan. Việt Nam có khoảng trên 25 loài Nưa phân

bố rải rác khắp các vùng miền trong cả nước.Cây Nưa

Amorphophallus konjac K.Koch mới được tìm thấy vào năm

2012 tại một số tỉnh miền núi phía Bắc.

Do khối lượng phân tử lớn (khối lượng phân tử trung bình của glucomannan dao động trong khoảng 1.9  106÷ 2  106Da [10], độ nhớt cao nên khả năng tan trong nước của glucomannan kém (độ tan khoảng 30%), do đó làm hạn chế một

phần hiệu quả và phạm vi ứng dụng của glucomannan trong

1

một số lĩnh vực. Để tăng khả năng hòa tan, quá trình thủy phân

glucomannan để thu được glucomannan có khối lượng phân tử

nhỏ hơn mà vẫn giữ được những tính chất quý của

glucomannan thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều

nhà khoa học. Ngoài tính chất chung của glucomannan (KGM),

glucomannan thủy phân (LKGM) còn có nhiều hoạt tính sinh

học như lợi khuẩn, chống oxy hóa, điều hòa miễn

dịch, ….Glucomannan thủy phân còn được sử dụng để vận

chuyển thuốc. Với các tiềm năng ứng dụng của LKGM trong lĩnh vực

thực phẩm và dược phẩm, các nghiên cứu về phương pháp điều

chế glucomannan khối lượng phân tử thấp gần đây được nhiều

tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym

[13]–[23], enzym kết hợp với chiếu xạ [24]thủy phân bằng axit

HCl [14][25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay

chiếu xạ tia gamma kết hợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp

nhiệt [28]...Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới mới chỉ tập

trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khối

lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính

chất, cấu trúc hóa học, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt

tính sinh học của chúng, đặc biệt khả năng giảm hấp thu đường

huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu. Những nghiên

cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại

càng ít và hầu như chưa có.

Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ

bản về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp

2

phần nâng cao giá trị sử dụng của glucomannan nhằm tạo ra

những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị

thực tiễn cao t cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt

Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, thủy phân

glucomannan từ cây Amorphophallus Konjac K.Koch định

hướng ứng dụng hạ đường huyết của sản phẩn tạo thành”.

2. Mục tiêu của luận án:

- Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc cùa

glucomannan t củ của cây Amorphophallus Konjac K.Koch

thu nhận tại Việt Nam.

- Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân

Konjac glucomannan để chế tạo các loại glucomannan với khối

lượng phân tử thấp bằng các phương pháp khác nhau.

- Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ

đường huyết của sản phẩm thủy phân.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

* Nghiên cứu thành phần hóa học chính của củ cây

A.Konjac K.Koch: Xác định tỷ lệ manose/glucose, cấu trúc hóa

học, khối lượng phân tử bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

(IR, NMR, TGA, …)

* Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân

konjac glucomannan bằng phương pháp hóa học và phương

pháp enzym, xác định cấu trúc, tính chất của sản phẩm thủy

phân.

* Nghiên cứu ảnh hưởng của konjac glucomannan và

konjac glucomannan thủy phân đến khả năng hấp thu và dung

nạp glucozơ máu của chuột nhắt trắng. Xác định khả năng kích

3

hoạt enzym AMPK của konjac glucomannan thủy phân.

4. Ý nghĩa khoa học và đóng góp mới của luận án.

1-Đã nghiên cứu đầy đủ về glucomannan t cây nưa

Amorphophallus Konjac K.Koch t tách chiết đến nghiên cứu

cấu trúc và thủy phân bằng các phương pháp khác nhau.

2-Sử dụng quy hoạch hóa thực nghiệm bậc 2 của Box-

Benh Ken, xác định được điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy

phân glucomannan và bằng enzym. Sản phẩm thủy phân tạo

thành là oligome có khối lượng phân tử giảm t 1598 kDa

xuống còn 2051,77 Da, tan tốt trong nước độ tan 92,5% mà vẫn

giữ được cấu trúc, tính chất của polime ban đầu.

3-Đã đánh giá khả năng kích hoạt enzym AMPK trên

invitro và khả năng giảm sự hấp thu và tăng khả năng dung nạp

glucose trên chuột nhắt trắng của glucomannan và glucomannan

thủy phân. Kết quả nghiên cứu cho thấy glucomannan thủy

phân có khả năng kích hoạt enzym AMPK và làm hạ glucose

huyết trên chuột nhắt trắng..

5. Bố cục của luận án.

Luận án gồm 124 trang với 29 bảng số liệu, 33 hình và

9 sơ đồ. Bố cục của luận án: Mở đầu: 2 trang, chương 1 - Tổng

quan: 40 trang; chương 2 - Đối tượng và phương pháp nghiên

cứu: 18 trang; chương 3 - Kết quả và bàn luận 53 trang; kết luận

chung - 2 trang. Danh mục các công trình khoa học đã công bố

4

liên quan đến luận án: 1 trang.

B. NỘI DUNG LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về glucomannan

1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan

1.1.2. Tính chất vật lý của glucomannan.

1.1.3. Tính chất hóa học của glucomannan

1.1.4. Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của

glucomannan

1.2. Cây nưa A.konjac K.Koch và quy trình tách chiết

glucomannan

1.2.1. Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch

1.2.2. Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac

1.3. Phản ứng cắt mạch glucomannan

1.3.1. Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học

1.3.2. Thủy phân với xúc tác enzym

1.4. Enzym AMPK và vai trò của nó trong hạ đường huyết

1.4.1. Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể

1.4.2. Khái quát về enzym Adenoidin 5'-monophosphat kích

hoạt protein kinase (AMPK )

1.4.3. Các phương pháp kích hoạt AMPK

1.5. Tính hình nghiên cứu glucomannan từ cây nưa

A.konjac tại Việt Nam

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu được dùng cho nghiên cứu là củ Nưa (thân

5

củ) Amorphophallus Konjac K.Koch được trồng tại tỉnh Lâm

Đồng trong 3 năm, được thu vào tháng 10 năm 2016. Mẫu được

giám định tên khoa học bởi TS Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật, tiêu bản được lưu giữ tại nhà lưới lưu

mẫu ở tỉnh Đắc Nông của Trung tâm phát triển công nghệ cao -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Vi khuẩn Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis

Trong nghiên cứu này đã sử dụng khuẩn lạc của 2 chủng

Bacillus substilis và Bacillus lichenifomis được cung cấp bởi

phòng thí nghiệm nuôi giữ chủng vi sinh vật gốc để sản xuất

chế phẩm sinh học AT- BiO của Công ty TNHH Sản xuất &

Dịch vụ An Thái. Cả 2 chủng này đều là những vi khuẩn có lợi,

an toàn sinh học và nguồn gốc xuất xứ rõ ràng và có bản giải

trình tự gen của chủng gốc kèm theo phụ lục của luận án này.

Các vi sinh vật hữu ích được mua chủng gốc t Công ty cổ phần

Công nghệ vi sinh và Môi trường.

- Enzym endo-1,4 β-Mannanase (Bacillus sp.) EC

3.2.1.78Cazy Family: GH26CAS: 37288-54-3 của công ty

Megazyme.

-Tế bào C2C12 (tế bào cơ vân nguyên phát của chuột

nhắt, CRL-1772) được cung cấp bởi hệ thống chủng chuẩn của

Mỹ

- Động vật: chuột nhắt trắng, cả hai giống, khoẻ mạnh,

trọng lượng t 20-30g, do học viện Quân y cung cấp

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng glucomannan.

Được thực hiện theo phương pháp DNS: Thủy phân

6

glucomannan sau đó cho dịch thủy phân tác dụng với axit 3,5-

dinitrosalicylic axit tạo sản phẩm có màu nâu đỏ. Xác định hàm

lượng mono saccharide bằng đường chuẩn glucose.

2.2.2. Tách glucose từ củ nưa A.Konjac.

Sử dụng phương pháp kết hợp khô, ướt có cải tiến để

tách glucomannan t củ nưa A.Konjac K.Koch.

Bước 1: Củ nưa Konjac được rửa sạch, loại bỏ tạp chất,

thái lát nhỏ, ngâm vào dung dịch NaHSO3 0,25 ‰.

Bước 2: Thêm dung dịch etanol/nước tỷ lệ 1,5:1với tỷ

lệ củ/dung môi là 1:2.Thời gian xay nghiền 20 phút.

Bước 3: Ly tâm thu tủa (dạng sệt).

Bước 4: Sấy khô hỗn hợp sản phẩm thu được bột

konjac glucomannan (KGM).

Bước 5: Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan bột

KGM vào dung dịch etanol 40% gia nhiệt, khuấy đều, ly tâm

thu tủa, bỏ phần dịch lọc. Lặp lại quá trình 3 lần thu được KGM

tinh chế.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên

cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương

pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với

phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo.

2.2.2.1. Phổ hồng ngoại IR

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng t nhân (NMR)

2.2.2.3.Giản đồ phân tích nhiệt

7

2.2.2.4. Thiết bị đo áp suất thẩm thấu OSMOMAT 090

Tỷ lệ đơn vị cấu trúc manose/glucose được xác định dựa vào giá trị tích phân trên phổ cộng hưởng t hạt nhân proton 1H-



H1

Man

NMR, theo công thức sau:



R

Man/Glu

(2.3)

I I



H1

Glu

Trong đó: RGlu/Man là tỷ lệ glucose/mannose

IH1-Glu là giá trị tích phân proton H1 của glucose.

IH1 -Man là giá trị tích phân proton H1 của mannose.

* Xác định độ axetyl hóa

Độ axetyl hóa DA được xác định dựa vào giá trị tích

phân trên phổ cộng hưởng t hạt nhân proton 1H-NMR, theo

CH

3





DA

%100

3

1

I  H  I

công thức sau:

(2.4)

Trong đó: ICH3 là giá trị tích phân của H trong nhóm CH3

IH1 là giá trị tích phân của proton liên kết với C1.

2.2.3. Thủy phân glucomannan

2.2.3.1. Thủy phân bằng axit

- Lấy vào mỗi cốc một thể tích chính xác dung dịch hỗn hợp

axit CH3COOH và axit HCl. Cân 10g glucomannan, phân tán

vào dung dịch hỗn hợp axit, khuấy dung dịch đến đồng nhất đối

với cả 2 phương pháp thủy phân bằng axit và bằng axit kết hợp

sóng siêu âm.

- Tiến hành siêu âm mẫu ở nhiệt độ thường trong khoảng 30

phút sau đó khuấy t có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân kết

8

hợp sử dụng sóng siêu âm với cường độ 20 Hz và chỉ khuấy t

có gia nhiệt đối với mẫu thủy phân bằng axit. Tiến hành phản

ứng tại các nồng độ xác định ở một nhiệt độ, thời gian nhất định. Đo độ nhớt của hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm nghiên cứu. - Kết thúc phản ứng, rửa hỗn hợp bằng etanol, sấy khô hỗn hợp phản ứng ở 60oC đến khối lượng không đổi nhận được sản

phẩm glucomannan thủy phân. Phương pháp thủy phân bằng

axit kết hợp sóng siêu âm cho sản phẩm LKGM-1. Phương

pháp thủy phân bằng axit thu được sản phẩm LKGM-2.

- Khảo sát các điều kiện của phản ứng bằng phương pháp

truyền thống: nồng độ axit HCl thay đổi lần lượt là: 0,05M; 0,1M; 0,15M, 0,2M, 0,25M. Các mức nhiệt độ là: 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC, Sau các khoảng thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, Tỉ lệ rắn/lỏng được thay đổi: 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 (g/ml)

Hiệu quả thủy phân được đánh giá thông qua độ nhớt của

hỗn hơp phản ứng. 2.2.3.2. Thủy phân bằng enzym

* Định tính xác định khả năng phân huỷ glucomannan

của các enzym t vi khuẩn.Chúng tôi lựa chọn 2 loại vi khuẩn

có sản sinh enzym β-mannanase là bacillus substilis và bacillus

lichenifomis để phân hủy Konjac glucomannan.

* Thủy phân Konjac Glucomannan xúc tác enzym

Sau khi định tính xác định được loại enzym có khả

năng phân hủy glucomannan, chúng tôi sử dụng enzym t vi

khuẩn đã thương mại hóa của công ty Megazyme đã được tiêu

chuẩn hóa trong các thực nghiệm tiếp theo.

Khảo sát điều kiện tối ưu của phản ứng bằng kế hoạch

9

hóa thực nghiệm bậc 2 của Box Behken 4 yếu tố 3 mức độ

Bảng 2.1. Các mức của các yếu tố ảnh hưởng

Các mức -1 0 +1

Các yếu tố Nhiệt độ (X1, oC) 30 40 50

Thời gian (X2, h) 4 6 8

pH (X3) 5 7 9

Tỉ lệ E/S (v/w), X4 0,1 0,4 0,7

Chuẩn bị 27 bình phản ứng 500ml. Lần lượt phân tán 10g

glucomannan trong 300ml H2O vào mỗi bình, pH của dung dịch

điều chỉnh pH 5÷9 bằng axit HCl. Thêm vào các dung dịch

lượng enzym (w/w) t0,1÷0,7%, lắc và khuấy dung dịch đến

đồng nhất. Ủ hỗn hợp trong tủ ấm trong các khoảng thời gian 4  8 giờ. Tiến hành phản ứng tại nhiệt độ30  50oC. Kết thúc phản ứng, đo độ nhớt của hỗn hợp phản ứng, thêm dư dung môi

EtOH tuyệt đối vào hỗn hợp, ly tâm tốc độ 9000 vòng/phút. Loại bỏ dung dịch, sấy khô chân không ở nhiệt độ 50oC đến

khối lượng không đổi nhận được sản phẩm glucomannan thủy

phân LKGM-2. Xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert.

2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học

2.2.3.1. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của Konjac

glucomannan

Đánh giá khả năng hoạt hóa AMPK của mẫu thử thông

qua đánh giá mức độ biểu hiện của AMPK đã phosphoryl hóa ở

phân tử threonin 172 (kí hiệu là p-AMPK). Phương pháp được

10

sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của các enzym này dùng

kỹ thuật lai Western plot. Quá trình được thực hiện tại bộ môn

Dược lực Trường Đại học Dược Hà Nội.

2.2.3.1. Hoạt tính hạ đường huyết của Konjacglucomannan trên

chuột nhắt trắng.

Khả năng kích thích sự dung nạp glucose huyết của sản

phẩm thủy phân được xác định trên mô hình chuột bình thường,

khỏe mạnh bằng nghiệm pháp xét nghiệm dung nạp glucose qua

đường uống (Oral glucose tolerance test - OGTT). Nghiệm

pháp trên được thực hiện tại trường Đại học Dược Hà Nội.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Nghiên cứu tách, tinh chế và đặc điểm cấu trúc, tính

chất của glucomannan trong củ nưa A.konjac

3.1.1. Hàm lượng glucomannan trong củ Nưa A.Konjac

Bột glucomannan t củ nưa Amorphophallus Konjac là

chất bột màu trắng tan trong nước với độ tan 32% hàm lượng

12,26% trong củ tươi. hàm lượng tro 4,17%, độ hút ẩm 9%,

hàm lượng Asen 0,208 ppm, hàm lượng chì 0,184 ppm. So sánh

với kết quả các nghiên cứu trước, hàm lượng glucomannan

trong củ nưa Konjac cao hơn so với các loài nưa chuông

(Paeonnifolius) hàm lượng 1,67% và nưa đầu nhăn (Corrugatus)

6%. Điều này khẳng định vai trò của cây Amorphophallus

Konjac trong định hướng phát triển các loài Nưa ở Việt Nam.

3.1.2. Cấu trúc của Konjac glucomannan.

Để xác định cấu trúc của KGM, chúng tôi đã tiến hành ghi phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng t hạt nhân 1H, 13C và phổ

HSQC của KGM. Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của

11

KGM được quy kết như ở bảng 3.5.

Bảng 3.5: Độ dịch chuyển hóa học của proton (1H) của KGM

Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm)

H1 5,30; 5,60 5,65;5,04

H2 4,24;4,29 3,94÷3,99

H3 4,32÷4,69 4,20÷4,23

H4 3,80÷3,89 3,79

H5 3,65÷3,65 4,06÷4,08

H6 4,29;4,27 4,18÷4,19

H của CH3CO- 2,52

Kết quả phân tích phổ cho thấy glucomannan tách t

cây A.konjac, có cấu trúc vô định hình, có tỷ lệ manose/glucose

là 1,6/1, độ axetyl hóa ≈8%, khối lượng phân tử 1.598 kDa,

phân nhánh tại vị trí C6. So với các loại Nưa khác đã tìm thấy

tại Việt Nam, glucomannan thu được t cây nưa A, Konjac có

độ acetyl hóa lớn nhất (nưa chuông; nưa thái có DA =0; nưa

trạm trổ có DA = 7,22; nưa đầu nhăn có DA = 7,57)[9]. Khối

lượng phân tử của glucomannan được xác định bằng phương

848

)







M

597.1

910.

(

g

/

mol

598.1)

kDa

n



d

 ( KT  C

pháp áp suất thẩm thấu

lim  0 C

Kết quả này chứng minh Konjac glucomannan có khả

năng hòa tan trong nước lớn hơn nhiều loại nưa khác đã được

tìm thấy tại Việt Nam. Nhờ có tính chất này, Konjac

glucomannan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực

12

phẩm, dược phẩm và các lĩnh vực khác.

Trên phổ hai chiều 1H-13C-HSQC-NMR, mỗi tương tác

C/H được đặc trưng bằng một tín hiệu, các liên kết trực tiếp C-

H trong vòng pyranose được quy kết chính xác như sau:

Manose: C1/H1 (94.71;94.33/5.30; 5.60), C2/H2

(71.04/4,24;4.29), C3/H3(71.45/4.32÷4.69),

C4/H4(76.76/3.80÷3.89), C5/H5(74.976/3.651÷3.658),

C6/H6(61.97/4.29;4.27).

(96.68;92.78/5.65;5.04), C2/H2 Glucose: C1/H1

(72,27;72,18/3,94÷3,99), C3/H3(73,12/4,20÷4,23),

C4/H4(76,60; 76,56/3,79), C5/H5(73.82/4.06÷4.08),

C6/H6(61.63; 61.54/4.18÷4.19).

3.2. Thủy phân Glucomannan bằng xúc tác axit

Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng

thủy phân glucomannan xúc tác axit đã xác định được điều kiện

thích hợp để thủy phân glucomannan xúc tác axit kết hợp sóng

siêu âm là: nồng độ axit CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt

độ phản ứng là 50oC, thời gian phản ứng 4 giờ, tỷ lệ KGM/dd

axit 1/10(g/ml). Đối với phản ứng thủy phân glucomannan xúc

tác axit không kết hợp sóng siêu âm thực hiện ở: nồng độ axit

CH3COOH 10%, axit HCl 0,15M, nhiệt độ phản ứng là 50oC,

thời gian phản ứng 6 giờ, tỷ lệ KGM/dd axit 1/10 (g/ml).

Sản phẩm thủy phân có khối lượng phân tử giảm t

1598kDa xuống 88,561kDa. Độ tan trong nước của LKGM-1

đạt 82,6% . Cấu trúc mạch oligome của sản phẩm được xác

13

định bằng phổ IR, phổ NMR 1H, 13C và giản đồ phân tích nhiệt.

Hình 3.17: Phổ 1H của LKGM-1

Kết quả phân tích cho thấy, với việc sử dụng hỗn hợp

axit CH3COOH và HCl nhóm axetyl trong phân tử

glucomannan được bảo vệ nên độ DA của sản phẩm thủy phân

giảm không đáng kể. Cấu trúc mạch của LKGM-1 ít thay đổi so

với glucomannan ban đầu: tỷ lệ M/G là 1,51, DA của LKGM-1

là 7,03%,

3.3. Thủy phân Konjac glucomannan bằng enzym

3.3.1. Định tính xác định khả năng phân huỷ glucomannan

của các enzym từ vi khuẩn

Kết quả thực nghiệm cho thấy, enzym sinh ra t 2 loại

vi khuẩn Bacillus subtilis và bacillus licheniformis đều có khả

năng phân hủy glucomannan. Khác biệt có ý nghĩa thống kê so

với lô chứng. Trong đó chủng vi khuẩn bacillus subtillis có khả

năng phân hủy tốt hơn với P<0,05 so với mẫu bacillus

14

licheniformis.

T kết quả định tính trên chúng tôi lựa chọn enzym t

vi khuẩn Bacillus subtilis đã thương mại hóa của công ty

Megazyme được sử dụng làm thí nghiệm tiếp theo trong luận án.

3.3.2.Phản ứng thủy phân Konjac Glucomannan bằng enzym

từ vi khuẩn bacillus subtilis

Mô hình quy hoạch hóa thực nghiệm của Box Behnken

đã được áp dụng để nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của các

yếu tố nhiệt độ, thời gian phản ứng, độ pH và tử lệ enzym/cơ

chất đến độ nhớt của sản phẩm phản ứng. Kết quả được xử lý

bằng phần mềm Design Expert thu được phương trình hồi quy

như sau:

Y = 62.21 – 12.81X1 – 6.85X2 – 25.03X3–14.95 X4 +

2 + 94.30 X3

2 + 27.20 X2

2

20.02 X1X2 + 8.01X1X3 – 10.02 X1X4 + 3.75 X2X3 + 3.72 2+ 38.45 X2X4 – 17,34 X3X4 + 46.94 X1

X4

Kết quả phân tích phương sai (ANOVA) cho thấy mô

hình và các hệ số hồi qui đều phù hợp và có ý nghĩa thống kê

(được đánh giá qua p-value đều nhỏ hơn 0,05). Thêm vào đó sự

không tương hợp (Lack of fit) của mô hình là 78,77 có

P=0,1021 > 0,05) cho thấy giá trị này không có ý nghĩa thống

kê. Điều đó chứng tỏ mô hình thực nghiệm là hoàn toàn tin cậy. Giá trị hệ số xác định R2 phản ánh độ phù hợp của phương trình hồi quy so với thực tế. Hệ số xác định R2 bằng 0,9988, là rất

cao xấp xỉ 1. Điều đó chứng tỏ phương trình hồi qui hoàn toàn

phù hợp với kết quả thực nghiệm.

Phân tích sự phù hợp và sự có nghĩa của mô hình thực

nghiệm được đánh giá bằng phần mềm phân tích Design Expert.

15

Kết quả được chỉ ra ở bảng ANOVA (Bảng 3.20)

Bảng 3.20. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản

ứng thủy phân

Yếu tố Giá trị F Giá trị P Tổng bình phương Trung bình bình phương

Bậ c tự do 14 1 1 65344,95 1915,47 563,07 4667,50 1915,47 563,07 695,95 < 0,0001 285,61 < 0,0001 83,96 < 0,0001

1105,29 < 0,0001 399,82 < 0,0001 239,17 < 0,0001 33,30 < 0,0001 59,94 < 0,0001 0,0130 8,50 0,0140 8,25 179,02 < 0,0001 1739,02 < 0,0001 592,44 < 0,0001 7044,76 < 0,0001 1181,01 < 0,0001

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 10 7412,76 2681,43 1604,00 223,35 402,00 57,00 55,35 1200,62 11662,98 3973,30 47246,57 7920,57 80,48 78,77 7412,76 2681,43 1604,00 223,35 402,00 57,00 55,35 1200,62 11662,98 3973,30 47246,57 7920,57 6,71 7,88 9,19 0,1021

Mô hình A-Nhiệt độ B-Thời gian C-pH D-tỷ lệ E/S AB AC AD BC BD CD A² B² C² D² Phần dư Lack of fit R2 0,9988

Ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp

16

phản ứng được biểu diễn trên hình 3.23.

Design-Expert® Software

Design-Expert® Software

Factor Coding: Actual

Factor Coding: Actual

Y (mpa.s)

Y (mpa.s)

Design points above predicted value

Design points above predicted value

Design points below predicted value

Design points below predicted value

61.15

250.15

61.15

248

250

300

X1 = A: Temperature

X1 = A: Temperature

X2 = D: E/S

X2 = C: pH

250

200

Actual Factors

Actual Factors

B: Time = 6

200

B: Time = 6

150

C: pH = 7

D: E/S = 0.4

150

) s . a p m

100

(

Y

) s . a p m

(

100

Y

50

50

0.7

50

0.6

45

9

50

0.5

0.4

40

8

45

0.3

35

D: E/S

A: Temperature (oC)

0.2

7

40

0.1

30

6

35

C: pH

A: Temperature (oC)

5

30

b)Tỷ lệ E/S và nhiệt độ

Design-Expert® Software

Factor Coding: Actual

Design-Expert® Software

Factor Coding: Actual

a) Độ pH và nhiệt

Y (mpa.s)

Design points above predicted value

Y (mpa.s)

Design points below predicted value

Design points above predicted value

61.15

250.15

Design points below predicted value

61.15

250.15

300

300

X1 = A: Temperature

X1 = B: Time

X2 = B: Time

250

X2 = C: pH

250

Actual Factors

200

Actual Factors

C: pH = 7

200

A: Temperature = 40

D: E/S = 0.4

D: E/S = 0.4

150

150

) s . a p m

(

) s . a p m

100

Y

(

100

Y

50

50

8

50

9

8

7

45

8

7

6

40

7

6

5

35

6

5

B: Time (h)

A: Temperature (oC)

C: pH

B: Time (h)

5

4

4

30

d)Thời gian phản ứng và độ pH c)Thời gian phản ứng và nhiệt độ

Hình 3.23. Đường mức và mặt đáp ứng 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng Chúng tôi đã sử dụng chương trình tính FLEXI viết bằng ngôn ngữ thuật toán FORTRAN để tìm điều kiện tối ưu của phản ứng. Kết quả của bài toán tối ưu tìm được điều kiện của phản ứng thủy phân xúc tác enzym là: nhiệt độ= 42,376oC, thời gian = 5,681h, pH = 7,241,tỉ lệ E/S = 0,536. Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân là 2051,28 Da

Cấu trúc của sản phẩm thủy phân được khảo sát bằng

phổ proton 1H, 13C, HSQC.

17

Bảng 3.23: 1H NMR độ dịch chuyển hóa học của LKGM-E

Proton Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm)

H1 5,26 5,03;5,02

H2 4,41 3,87

H3 4,30 4,22

H4 4,32 4,16

H5 4,01 4,08

H6 4,49 4,28; 4,20

H của CH3CO- 2,70

Bảng 3.24: Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR của LKGM-E

Tín hiệu Mannose (δ ppm) Glucose (δ ppm)

C1 102,15;101,99 104,45

C2 72,52;72,18 75,35;75,11

C3 73,63; 73,15 76,19

C4 77,79÷78,90 80,86

C5 77,26 76,97;76,83

C6 62,92;62,78 62,57;62,45

22,17; 176,80 C của CH3CO-

71,77 β-Man(14)-β-Glc

71,56 β-Man(14)-β-Man

Phổ hai chiều HSQC của LKGM-E các tương tác đặc

18

trưng cho vòng pyranose được quy kết chính xác như sau:

Mannose: C1/H1 (102,15; 101,99/5,26), C2/H2 (72,52;

72,18/4,41), C3/H3 (73,63; 73,15/4,30), C4/H4

(77,79;78,90/4,32), C5/H5 (77,26/4,01), C6/H6 (62,92;

62,78/4,28; 4,20).

Glucose: C1/H1 (104,45/5,03; 5,02), C2/H2 (75,35;

75,11/3,87), C3/H3 (76,19/4,22), C4/H4 (80,86/4,16), C5/H5

(76,97; 76,83/4,08), C6/H6 (62,57; 62,45/4,49).

Qua các phương pháp phổ cho thấy KGM-E có cấu trúc

không thay đổi nhiều so với glucomannan ban đầu. . Tỷ lệ M/G

Tỷ lệ M/G là 1,2, độ acetyl hóa DA là 7,56 % và độ tan 92,5%.

3.4. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E

3.4.1. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình

in vitro

chứng AICAR m100 m50 m25 m12,5 m6,25

actin

p-AMPK

Hình 3.31. Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin thu

được bằng kĩ thuật Western

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tác dụng hoạt hóa

AMPK của glucomannan thủy phân được tiến hành đánh giá

trên tế bào cơ vân chuột nhắt nguyên phát (C2C12) sau khi đã

được biệt hóa thành tế bào trưởng thành bằng phương pháp

Western lot. Đây là phương pháp hiện đại có độ nhạy cao, phát

hiện protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể

19

tương ứng nên cho kết quả có độ tin cậy cao

So sánh tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK/ β-actin của lô

tế bào có ủ mẫu thử với lô chứng để đánh giá tác dụng hoạt hóa

AMPK của mẫu thử.

Kết quả thực nghiệm cho thấy Konjac glucomannan

thủy phân ở các nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml làm

tăng đáng kể mức độ biểu hiện của p-AMPK (lần lượt là 1,47

lần và 1,81 lần so với lô chứng, p<0,05), glucomannan thủy

phân ở nồng độ thấp hơn 25 µg/ml, 12,5 µg/ml và 6,25 µg/ml

không làm tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK so với lô chứng.

Điều đó chứng tỏ glucomannan thủy phân nồng độ 100μg/ml và

nồng độ 50μg/ml có khả năng kích hoạt enzym AMPK.

3.4.2. Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình

in vivo

Kết quả nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống được thể

hiện trên hình 3.29. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và

sau cho uống glucose so với thời điểm ban đầu được trình bày

trong hình 3.32.

Hình 3.32. Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau cho

20

uống glucose so với thời điểm ban đầu

Kết quả nghiên cứu cho thấy, tại thời điểm mới cho uống

glucose, do đã được uống chế phẩm trước 2 giờ và để nhịn đói

nên tất cả các lô đều có hàm lượng glucose giảm. Lô uống

gliclazide có độ hạ glucose huyết mạnh hơn rõ rệt so với lô

chứng (P<0,01). Điều này là phù hợp với sự hấp thu glucose

của cơ thể. Sau khi uống glucose được hấp thụ qua thành ruột

vào máu rất nhanh nên hàm lượng glucose trong máu tăng dần

và đạt nồng độ cao nhất trong máu sau khi uống 30 phút ở tất cả

các mẫu thử nghiệm.

Ở thời điểm này các lô 3 và 5 có tỷ lệ ％ tăng glucose huyết thấp hơn so với lô 1 (lô đối chứng), sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê (P≤ 0,05). Điều này có thể thấy glucomannan

thủy phân với liều 6g/kg cân nặng có khả năng giảm hấp thu

glucose ở ruột. Điều này được giải thích do glucomannan là

chất xơ hòa tan có độ nhớt cao, khả năng trương nở lớn làm

tăng cảm giác no và làm giảm hấp thu đường huyết giúp ổn

định đường huyết.

Thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose, ở

tất cả các lô hàm lượng glucose máu đều giảm so với ban đầu.

Các lô glyclazide vì glyclazide là thuốc hạ đường huyết nên tỷ

lệ % hạ glucose huyết mạnh nhất. Các lô 3,4 được cho uống chế

phẩm glucomannan và glucomannan thủy phân hàm lượng

6g/kg có tỷ lệ % hạ glucose huyết lớn hơn so với lô 1, khác biệt

có ý nghĩa P<0,05. Điều này chứng tỏ các chế phẩm t

glucomannan với liều 6g/kg ngoài việc có tác dụng làm giảm sự

hấp thu glucose ở ruột còn có khả năng kích thích sự chuyển

21

hóa tiêu thụ glucose.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của KGM và LKGM-E

đến khả năng dung nạp glucose được trình bày ở hình 3.33.

Hình 3.33: Glucose huyết trước và sau khi cho uống

LKGM-E và KGM

Tại thời điểm 60 phút và 120 phút sau khi uống glucose,

tỷ lệ hạ glucose huyết ở lô uống glucomannan thủy phân cao

hơn so với lô uống glucomannan cùng liều lượng 6g/kg cân

nặng. Khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Điều này

chứng tỏ sản phẩm thủy phân có khả năng kích thích sự dung

nạp glucose tốt hơn so với glucomannan ban đầu. Kết quả này

là phù hợp với kết quả thực nghiệm trên invivo. Vì LKGM-E có

khả năng kích hoạt enzym AMPK, là enzym hoạt hóa kích thích

các quá trình sinh ra năng lượng [84–88]. Chính vì vậy lượng

glucose khi hấp thu vào máu được vận chuyển nhiều vào tế bào

và chuyển hóa thành Glucose-6-phosphat được đốt cháy tạo

22

năng lượng cung cấp cho các hoạt động của tế bào

KẾT LUẬN

T các kết quả thu được, chúng tôi rút ra các kết luận

chung sau:

1. Đã tách, tinh chế và xác định được cấu trúc, tính chất

của glucomannan t củ nưa A.konjac ( Amorphophallus Konjac

K.Koch):

- Hàm lượng glucomannan trong củ A.konjac K.Koch

tại Lâm Đồng, Việt Nam là 12,26% trong củ tươi. Bột KGM đạt

độ sạch 92%, hàm lượng tro 4,17%, độ hút ẩm 9%, hàm lượng

Asen 0,208 ppm, hàm lượng chì 0,184 ppm.

- Glucomannan tách t cây A.konjac có cấu trúc vô

định hình, được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose và D-

glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, phân

nhánh tại vị trí C6, tỷ lệ manose/glucose là 1,6/1, độ axetyl hóa

≈8%, độ tan 32%, khối lượng phân tử 1.598 kDa.

2. Đã nghiên cứu phản ứng thủy phân KGM xúc tác axit

và xác định được cấu trúc tính chất của sản phẩm LKGM-1:

- Phản ứng thủy phân glucomannan bằng hỗn hợp axit

thực hiện ở điều kiện: tỷ lệ KGM/dd axit: 1/10 (g/ml); [HCl]

0,15M; CH3COOH 10%; nhiệt độ phản ứng 50oC; thời gian

phản ứng 6 giờ khi không kết hợp sóng siêu âm và trong 4 giờ

khi có kết hợp sóng siêu âm.

- LKGM-1 có khối lượng phân trung bình 88,561 kDa,

độ tan trong nước 82,6%. LKGM-1 cấu tạo bởi các mắt xích D-

mannose và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4)

23

glycosid , tỷ lệ M/G là 1,51, DA của LKGM-1 là 7,03%.

3. Đã nghiên cứu phản ứng thủy phân KGM xúc tác

enzym β-mannanase và xác định được cấu trúc tính chất của sản

phẩm LKGM-E.

- Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm loại kế

hoạch bậc hai Box-Behnken đã tìm được chế độ thủy phân tối

ưu ở: nhiệt độ= 42,376oC, thời gian = 5,681 giờ, pH = 7,241, tỉ

lệ E/S = 0,536.

- LKGM-E được cấu tạo bởi các mắt xích D-mannose

và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid,

có khối lượng phân tử trung bình 2051,28 Da với hiệu suất thu

hồi 75,6%. Tỷ lệ M/G là 1,2, độ acetyl hóa DA là 7,56 % và độ

tan 92,5%.

4. Đã nghiên cứu được khả năng kích hoạt enzym

AMPK của LKGM-E:

LKGM-E ở các nồng độ 100μg/ml và nồng độ 50μg/ml

có khả năng kích hoạt enzym AMPK. Mức độ biểu hiện của p-

AMPK ở nồng độ 100μg/ml là 1,47 lần và ở nồng độ 50μg/ml

là 1,81 lần so với lô chứng (p<0,05)

5. Đã đánh giá được ảnh hưởng của KGM và LKGM-E đến

khả năng hấp thu và dung nạp glucose của chuột nhắt trắng.

LKGM-E với liều 6g/kg cân nặng có khả năng làm

giảm sự hấp thu glucose ở ruột (p<0,05). Glucomannan thủy

phân có khả năng kích thích sự dung nạp glucose tốt hơn so với

glucomannan (p<0,05).

Với các kết quả nhận được của nghiên cứu cho thấy

glucomannan t cây Amorphophallus konjac K.Koch và sản

phẩm thủy phân của nó có nhiều tiềm năng ứng dụng, đặc biệt

24

là trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe.

“Response surface methodology

glucomannan producing flour for

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 1. Do Truong Thien, Tran Thi Nu, Nguyen Hong Vinh, “Preparation of Low Molecular Weight Glucomannan from A. Konjac K. Koch in Vietnam by Enzyme Catalyzed Hydrolysis Reaction and its Prospective use to Lower Blood Sugar Levels”, Academic journal of polymer science, Volume 2 - issue 2- January 2019. 2. Tran Thi Nu, Tran Thi Y Nhi, Do Truong Thien, “Chemical structure of Konjac glucomannano oligosaccharides prepared by endo-1-4 β mannanase” Tạp chí Hóa học, Vol 57 (4e3,4), p.291-295, 2019. 3. Tran Thi Y Nhi, Tran Thi Nu, Do Truong Thien, Lai Thi Thuy, Le Thi Thanh Ha, Pham Thi Bich Hanh, Le Quang Tuan, Trinh Duc Cong, for hydorolysis parameter optimization of Konjac glucomannan using endo-1,4 β mannanase” Tạp chí Hóa học, Vol 57 (4e3,4), p.296-300, 2019. 4. Trần Thị Nữ, Trần Thị Ý Nhi, Đỗ Trường Thiện, Phạm Thị Bích Hạnh, “Nghiên cứu phản ứng thủy phân glucomannan bằng axit kết hợp sử dụng sóng siêu âm và khảo sát cấu trúc của sản phẩm”, Tạp chí Hóa học, 54 (6e1), trang 61-66, 2016 5. Nguyen Van Minh Khoi, Do Truong Thien, Le Minh Ha, Tran Van Thanh, Le Ngoc Hung, Tran Thi Nu, “New lab-scale process from Amorphophallus plant in Viet Nam and their characterization, part 2”, proceedings of scientific workshop on progress and trends in science and technology, p.225-232, 2016. 6. Trần Thị Ý Nhi, Trần Thị Nữ, Lại Thị Thúy, Đỗ Trường Thiện, Nguyễn Văn Dư, Phạm Thị Bích Hạnh, “Nghiên cứu cấu trúc hóa học của glucomannan từ củ cây Nưa Amorphophallus Konjac K. Koch thu tại Hà Giang Việt Nam”, Tạp chí Hóa học 52(6A), p.228-232, 2014