Luận văn:Nghiên cứu điều kiện chiết tách asiaticoside từ rau má (centella asiatica) và ứng dụng trong sản xuất trà chức năng từ rau má

Chia sẻ: Nguyen Vang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST

Báo xấu

320
lượt xem 51
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

với thành phần gồm nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, rau má là một nguyên liệu tốt để sản xuất trà chức năng. Tuy nhiên, cần bổ sung một lượng asiaticoside nhất định để trà rau má đạt được tính chất chức năng hữu hiệu hơn như chống suy nhược, chống stress, hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer, bệnh ung thư, bệnh khớp v..v. Bài báo này trình bày quá trình nghiên cứu thử nghiệm và đánh giá chất lượng trà rau má khi bổ sung hoạt chất asiaticoside....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu điều kiện chiết tách asiaticoside từ rau má (centella asiatica) và ứng dụng trong sản xuất trà chức năng từ rau má

1 2 Công trình ñã ñư c hoàn thành t i B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG Đ I H C ĐÀ N NG NGUY N TH VÂN ANH Ngư i hư ng d n khoa h c: TS. Trương Th Minh H nh Ph n bi n 1: PGS. TS. Lê Th Liên Thanh Ph n bi n 2: TS. Đ ng Minh Nh t NGHIÊN C U ĐI U KI N CHI T TÁCH ASIATICOSIDE T RAU MÁ (CENTELLA ASIATICA) VÀ NG Lu n văn s ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n văn t t D NG TRONG S N XU T TRÀ nghi p Th c sĩ Công ngh Th c ph m và Đ u ng h p t i Đ i CH C NĂNG T RAU MÁ h c Đà N ng vào ngày 31 tháng 8 năm 2010. Chuyên ngành: Công ngh Th c ph m và Đ u ng Mã s : 60.54.02 TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ K THU T Có th tìm hi u lu n văn t i: CÔNG NGH TH C PH M VÀ Đ U NG - Trung tâm Thông tin – H c li u, Đ i h c Đà N ng - Trung tâm Thông tin Tư li u, Đ i h c Đà N ng. Đà N ng – Năm 2010
3 4 và ng d ng trong s n xu t trà ch c năng t rau má”. M Đ U 2. M c ñích nghiên c u - Thu nh n asiaticoside d ng thô t rau má 1. Tính c p thi t c a ñ tài - Nghiên c u ñi u ki n chi t ñ thu ñư c asiaticoside cao nh t trên Rau má (Centella Asiatica) là loài thân th o m c ph bi n các b Soxhlet qui mô phòng thí nghi m qu c gia vùng nhi t ñ i: n Đ , Madagascar, Indonesia, Vi t Nam. Ngư i - S n xu t trà rau má túi l c có b sung asiaticoside (trà ch c năng) dân các vùng này s d ng làm th c ph m như m t lo i rau. Ngoài ra, do 3. Đ i tư ng và ph m vi nghiên c u nó có nhi u ñ c tính quí nên rau má ñư c s d ng làm thu c trong y h c c Đ i tư ng nghiên c u c a ñ là rau má (Centella asiatica) l y t làng truy n c a các nư c n Đ , Đông Nam Á và Trung Qu c. Rau má có tính rau má Phư c Yên, huy n Qu ng Đi n, t nh Th a Thiên Hu . Trong ph m vi hàn nên thư ng ñư c dùng trong nhi u bài thu c ch a b nh: phong, cùi, nghiên c u, chúng tôi ch chi t tách ho t ch t sinh h c trong rau má asiticoside c m cúm, s t, nh c ñ u, t c s a... Y h c hi n ñ i các nư c phương Tây và s n xu t trà rau má túi l c ch c năng qui mô phòng thí nghi m. cũng ch ng minh rau má có kh năng ch a lành v t thương, giúp c i thi n 4. Phương pháp nghiên c u trí nh , h tr vi tu n hoàn, ch ng l i m t s b nh ung thư. Tuy nhiên, Phương pháp v t lý nư c ta rau má v n chưa ñư c các nhà nghiên c u chú ý. - Phương pháp ñ nh tính và ñ nh lư ng asiaticoside b ng s c kí Ngoài ra, rau má cũng ñư c s d ng trong ngành dư c ph m và l ng cao áp v i detector diod array. m ph m. Ngư i ta ñã dùng rau má ñ s n xu t lo i kem bôi da, thu c thú - Xác ñ nh ñ m y . S dĩ v y là do trong rau má có các h p ch t có ho t tính sinh h c cao - Xác ñ nh hàm lư ng tro toàn ph n như: asiaticoside, madecasside và acid asiatic, acid madecassic (ñ c bi t là Phương pháp hóa sinh h c asiaticoside) và ch t ch ng oxi hóa phenolic, saponin… Do v y, vi c tách - Phương pháp c m quan chi t h p ch t này t rau má ñ có th b sung vào th c ph m, t o ra s n - Phương pháp vi sinh ph m m i v a ñ m b o giá tr dinh dư ng v a có tác d ng ngăn ng a b nh Phương pháp x lý s li u t t mang l i s c kh e cho con ngư i là c p thi t. 5. Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a ñ tài nư c ta, vùng tr ng rau má phân b r t r ng t B c vào Nam v i 5.1.Ý nghĩa khoa h c c a ñ tài di n tích ñáng k . Đ c bi t Th a Thiên Hu và các t nh duyên h i mi n - Xác ñ nh thành ph n hóa h c và hàm lư ng m t s ch t có trong Trung, nơi khí h u có ñ m khá cao và thư ng có lo i ñ t sét pha cát nên cây rau má vùng Phư c Yên, huy n Qu ng Đi n, t nh Th a Thiên Hu r t thích h p cho lo i cây này. Tuy v y, rau má cũng ch ñư c s d ng làm - Xác ñ nh ñi u ki n chi t tách asiaticoside t rau má. lo i rau ăn tươi, ho c làm nư c ép gi i khát vào mùa hè ho c là phơi khô - Xác ñ nh ñư c lư ng asiasiticoside b sung vào quy trình ch bi n s c làm nư c u ng các h gia ñình. Các th c ph m ch bi n t rau má trà ch c năng t rau má qui mô phòng thí nghi m. ch y u mang tính th công và không ñư c ki m duy t v v n ñ v sinh 5.2. Ý nghĩa th c ti n c a ñ tài và an toàn th c ph m. Hi n nay, chưa có nhi u s n ph m t rau má qui - Góp ph n ñưa rau má Phư c Yên, Qu ng Đi n, Th a Thiên Hu mô công nghi p. thành s n ph m công nghi p ñ ng th i ña d ng hóa s n ph m t rau má. T nh ng lý do trên, chúng tôi nh n th y rau má là m t lo i dư c- - Tăng ngu n l i cho ngư i tr ng rau má th c ph m quí ñư c tr ng nhi u nư c ta. Nhưng vi c tách chi t h p ch t - Đưa ra ngu n th c ph m ch c năng h tr s c kh e cho ngư i s d ng. có ho t tính sinh h c cao asiaticoside v n chưa ñư c các nhà nghiên c u 6. C u trúc lu n văn trong nư c chú ý nhi u. Ngay c các nghiên c u ngoài nư c, k t qu công Lu n văn g m 81 trang, ngoài ph n m ñ u, k t lu n, tài li u tham b v ñi u ki n tách chi t cũng khác nhau, th m chí trái ngư c nhau. Do v y, kh o và các ph l c còn có các chương sau: ñ t n d ng ch t dinh dư ng cũng như các dư c tính quí c a rau má, góp Chương 1: T ng quan tài li u, g m 23 trang. ph n ña d ng hóa các s n ph m, nâng cao giá tr thương m i c a rau má Chương 2: Đ i tư ng và phương pháp nghiên c u, g m 11 trang. nh m mang l i l i ích cho ngư i nông dân, chúng tôi quy t ñ nh ch n ñ tài: Chương 3: K t qu nghiên c u và th o lu n, g m 27 trang. "Nghiên c u ñi u ki n chi t tách asiaticoside t rau má (Centella asiatica)
5 6 nghiên c u khá nhi u trong lĩnh v c y dư c nh m ph c v vi c ch a b nh cho con ngư i. CHƯƠNG 1 1.1.5. Tác d ng dư c lý và công d ng c a cây rau má T NG QUAN Rau má là lo i rau tương ñ i ph bi n thư ng thu hái lo i c lá và 1.1. T NG QUAN V CÂY RAU MÁ dây. Nó ñư c dùng như th c ph m và thu c trong dân gian. Theo y h c c Rau má là loài rau d i m c tương ñ i ph bi n các vùng ñ t nhi t truy n, rau má là v thu c mát, v ng t, hơi ñ ng, tính bình, không ñ c vào ñ i ñ c bi t là Châu Á. Nó ñư c bi t ñ n v i nhi u tên g i khác nhau như: Can, Tỳ V có tác d ng dư ng âm, thanh nhi t, nhu n gan, gi i ñ c, l i Tích tuy t th o (Trung Qu c), Phanok (Lào), Trachiek-kranh (Miên), và Gotu- ti u. Rau má thư ng dùng ñ làm thu c b dư ng, sát trùng, ch a th kola (SriLanka), Pegagan (Indonesia), Takip-kohol (Philippine), hay Bua-bok huy t, t l , khí hư, b ch ñ i, m n nh t, rôm s y. (Thái Lan), Gotu kola ( n Đ ). Tên khoa h c là Centella asiatica (L.) Urb. Y h c hi n ñ i b t ñ u nghiên c u v rau má t nh ng năm 60 c a th k (Hydrocotyle asiatica L. Trisanthus cochinensis Lour) thu c h Hoa tán trư c. Nh ng nghiên c u lâm sàng v tác d ng ch a b nh c a d ch chi t rau má Apiaceae (Umbelliferae) và có nhi u tác d ng t t ñ i v i con ngư i. và các h p ch t trong rau má ñư c ch ng minh và công b . 1.1.1. V trí phân lo i Rau má có tác d ng t t ñ i v i th n kinh, tim m ch, da và b nh Theo phân lo i khoa h c: ung thư. 1.2. T NG QUAN V HO T CH T SINH H C ASIATICOSIDE Gi i: Plantae B : Apiales H : Apiaceae Phân h : Mackinlayoideae 1.2.1. Khái ni m v asiaticoside Theo nhi u ngu n tài li u nghiên c u thì rau má có ch a r t nhi u Chi : Centella Loài : C. asiatica ho t ch t sinh h c có l i cho con ngư i trong ñó asiaticoside ñư c xem 1.1.2. Đ c ñi m phân b m t ch t ñi n hình v i nhi u công d ng. Rau má Centella asiatica là loài th c v t m c bò lan trên m t ñ t Asiaticoside có công th c phân t : C48H78O19 có lá trông gi ng như nh ng ñ ng ti n tròn ñư c x p n i ti p nhau nên còn Kh i lư ng phân t : 959,12 g/mol g i là Liên ti n th o, thích h p m c nh ng nơi m ư t như thung l ng, C u trúc phân t ñư c cho hình 1.3. b mương, ru ng thu c nh ng vùng ñ t nhi t ñ i. 1.1.3. Đ c ñi m hình thái 1.1.4. Thành ph n hóa h c M t s nghiên c u phân tích cho th y thành ph n hóa h c c a rau má g m r t phong phú (b ng 1.1). STT Tên thành ph n hóa h c Đơn v Hàm lư ng 1 Nư c % kh i lư ng 88,20 Hình 1.3. C u trúc phân t c a asiaticoside 2 Protein % ch t khô 3,20 Asiaticoside tan t t trong c n, s n ph m tinh th hình kim màu 3 Cacbonhydrat % ch t khô 1,80 tr ng, nhi t ñ nóng ch y là 230÷233oC. 4 Cellulose % ch t khô 4,50 1.2.2. Tác d ng dư c h c c a asiaticoside 5 Vitamin C mg% 3,70 Nhóm h p ch t có ho t tính sinh h c n i b t nh t trong rau má là 6 Vitamin B1 mg% 0,15 nhóm terpene. Asiaticoside là m t triterpene glycoside chi m hàm lư ng 7 Calcium mg% 2,29 nhi u nh t. Asiaticoside là 1-O-acyl-D-glucose pyranose ñư c tìm th y trong t nhiên, nó là trisacharide ester c a acid asiatic. Ngư i ta cho r ng, 8 Phosphorus mg% 2,00 trong cơ th asiaticoside th y phân thành ñư ng và asiatic acid- s n ph m 9 iron mg% 3,10 trao ñ i ch t ch u trách nhi m trong vi c ch a b nh. 10 β-caroten mg% 1,30 Asiaticoside có kh năng kháng khu n và ho t tính di t n m ch ng l i Ngoài ra trong rau má còn ch a m t s acid béo và h p ch t ñư c m m b nh và n m. saponin, ñ c bi t là nhóm terpenoid. Đây là nhóm nh ng ho t ch t ñư c
7 8 T nh ng năm 1940, y h c hi n ñ i b t ñ u nghiên c u nh ng tác Khi n ng ñ các ch t hòa tan trong dung môi th p thì lư ng ch t d ng c a rau má. Nh ng h p ch t chính có giá tr rau má là asiaticoside, trích ly t nguyên li u tăng, th i gian trích ly gi m. Vì v y ñ ñ m b o quá madecassoside và asiatic acid ñã ñư c phát hi n, nghiên c u và ng d ng. trình trích ly t t ngư i ta thư ng th c hi n tăng t l dung môi so v i Asiaticoside giúp ch a lành v t thương nhanh chóng nh vào cơ ch kích nguyên li u. thích t o collagen và s t ng h p glycosaminoglycan. 1.3.4.2. Đ c ñi m c a nguyên li u Ho t ch t asiaticoside cũng ñã ñư c ng d ng trong ñi u tr b nh 1.3.4.3. Nhi t ñ phong và b nh lao. Ngư i ta cho r ng trong nh ng b nh này, vi khu n 1.3.4.4.Th i gian ñư c bao ph b i m t màng ngoài gi ng như sáp khi n cho h kháng 1.3.4.5. Khu y tr n nhi m c a cơ th không th ti p c n. Ch t asiaticoside trong d ch chi t rau 1.3.5. M t s phương pháp chi t xu t dư c li u má có th làm tan l p màng bao này ñ h th ng mi n d ch c a cơ th tiêu 1.3.5.1. Phân lo i phương pháp chi t xu t di t chúng. 1.3.5.2. M t s phương pháp chi t xu t ñi n hình Năm 1990, Maquart và c ng s ñã công b công trình nghiên c u 1.4. M T S NGHIÊN C U TRONG VÀ NGOÀI NƯ C V TÁCH CHI T v kh năng làm lành v t thương b l loét c a asiaticoside. Dư c tính ñáng ASIATICOSIDE TRONG RAU MÁ k c a ho t ch t này là gi m b t kích thư c c a vùng v t thương trên da Vi c nghiên c u quá trình chi t ñ thu nh n asiaticoside có trong lưng chu t sau 9 ngày th nghi m. rau má ñã ñư c khá nhi u nhà nghiên c u nư c ngoài ti n hành và công Theo nghiên c u c a Inhee và c ng s (1999) cho th y, các d n b . Tuy nhiên, Vi t Nam v n ñ nghiên c u v rau má và tách chi t xu t c a ch t asiaticoside có kh năng b o v th n kinh, ch ng l i ñ c t β- asiaticoside chưa v n chưa ñư c chú tr ng. amyloid gây h i ñ i v i nơtron th n kinh.. Nh ng nghiên c u v tách chi t asiaticoside ñươc m t s tác gi Asiaticoside kích thích h reticuloendothelial nên s c mi n nhi m nghiên c u nh ng k t qu v n chưa th ng nh t.Tóm l i, vi c l a ch n c a cơ th ñư c m nh hơn. Asiaticoside giúp t bào da ch ng oxy hóa, dung môi t i ưu cho quá trình chi t asiaticosiie v n chưa th ng nh t. phát tri n mô liên k t, nên làm m nh t bào da, mô da căng tr , và giúp cho Bên c nh các nghiên c u v s nh hư ng c a các y u t trong quá v t m , v t loét mau lành. trình chi t m t s nhà nghiên c u cũng ñã ti n hành nghiên c u hàm lư ng Trong k t qu nghiên c u c a Boiteau và c ng s (2001), tác d ng asiticoside trong rau má các b ph n khác nhau. Năm 2003 Kim Tae và c a asiaticoside ñư c tìm th y ñó là ti m năng làm gi m tr m c m chu t. các ñ ng s ñã công b k t qu v ñ tài này v i hàm lư ng asiaticoside K t qu th nghi m cho th y r ng asiaticoside có ho t ñ ng gi ng như ch t ph n lá chi m 82,6%, ph n r 1,5%, ph n cu ng lá 15,9% còn các m u ch ng tr m c m, giúp chu t ho t ñ ng, nh n và x lý thông tin nhanh hơn. thân 0% so v i hàm lư ng asiaticoside t ng s . Qua k t qu này thì các Nghiên c u c a Mahato (2000) và c ng s ñã thí nghi m tác d ng ông ñã kh ñ nh hàm lư ng asiaticoside trong ph n lá chi m t l cao nh t c a asiaticoside trên ch ng b nh sưng phù và viêm kh p. Asiaticoside có so v i các ph n khác. Năm 2008 m t k t qu tương t do nhà nghiên c u trong d ch chi t ñã làm gi m b t bàn chân phình c a chu t th nghi m. Cơ Zainol N.A. và c ng s ti n hành cũng ñã ñư c công b . ch tích c c c a asiaticoside có th liên quan ñ n vi c ngăn ch n s tăng Ngoài ra, s nh hư ng c a các khu v c tr ng khác nhau t i s nhanh c a b ch c u. tích lũy c a asiaticoside trong rau má cũng ñã ñư c nhóm nghiên c u c a 1.3. T NG QUAN V CHI T TÁCH HO T CH T SINH H C Denis Randriamampionoma th c hi n Madagascar. Các k t qu ñưa ra 1.3.1. Khái ni m cho th y các vùng có khí h u khác nhau thì hàm lư ng asiaticoside tích Tách chi t còn g i là trích ly là quá trình tách m t hay m t s ch t lũy trong rau má s khác nhau. Theo các tác gi này thì nh ng vùng có tan trong ch t l ng hay ch t r n b ng m t ch t l ng khác còn g i là dung nhi t ñ và ñ m l n, hàm lư ng asiaticoside trong rau má cao hơn các môi. vùng có nhi t ñ và ñ m th p. 1.3.2. M c ñích c a quá trình chi t tách Trái ngư c v i các tác gi nư c ngoài, s quan tâm c a các nhà 1.3.3. Yêu c u c a dung môi trong trích ly khoa h c trong nư c ñ i v i rau má còn r t ít. Ch có m t vài nghiên c u 1.3.4. Các y u t nh hư ng ñ n quá trình chi t tách phân tích hàm lư ng vitamin trong rau má và nghiên c u ng d ng rau má 1.3.4.1. N ng ñ c a d ch trích ly làm dư c ph m. Vi c s n xu t rau má như lo i th c ph m ch c năng, th c
9 10 ph m b sung v n chưa ñư c chú ý. M c dù rau má ñư c tr ng ho c m c hoang g n như trên toàn lãnh th nư c ta, nhưng giá tr c a nó hình như chưa ñư c bi t ñ n. 1.5. SƠ LƯ C V TRÀ DƯ C T xa xưa dân gian ñã bi t s d ng các lo i th o m c ñ u ng d ng nư c s c hay trà ñ ch a b nh. Nhi u bài thu c có thành ph n chính t g ng, s , lá l t, lá mơ, rau má, rau ngót…ch a c m m o, sưng viêm, sót nhau, gi i ñ c… Ngày nay, ngư i ta s d ng các lo i dư c th o như ch t b sung vào th c ph m nh m h tr phòng ch ng và ñi u tr b nh. Nhi u nhóm Hình 2.9. Sơ ñ nguyên lí c a máy s c kí l ng cao áp th c ph m ch c năng ñã ra ñ i: th c ph m ch c năng h tr tim m ch, h i M u sau khi chi t ñư c x lý qua các công ño n s ti n hành ñ nh tr ñi u tr ung thư, h tr bênh ñái tháo ñư ng, h tr gi m cân (hình tính và ñ nh lư ng asiaticoside b ng HPLC pha ngư c. 1.5.)… Tuy nhiên, v n ñ s d ng th c ph m ch c năng, ñ c bi t là trà Đi u ki n ch y HPLC như sau: c t C18 (150×4.6mm), pha ñ ng ch c năng Vi t Nam v n còn chưa ph bi n. Hơn n a, r t ít b ng ch ng methanol:nư c (1%TFA) = 60:40, t c ñ dòng 1,5ml/phút, ñ h p th lâm sàng v tác d ng c a trà ch c năng. quang ñư c ño bư c sóng 220nm, nhi t ñ c t là nhi t ñ phòng. M u CHƯƠNG 2 asiaticoside chu n có n ng ñ 0,496 mg/ml pha trong methanol. Đ I TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U M u ñư c phân tích trên h th ng HPLC LC-20 Prominence c a Shimadzu (Nh t B n) V i detector diod array (DAD), s d ng ph n m m 2.1. Đ I TƯ NG NGHIÊN C U LC- Solution. Hóa ch t ñ ch y s c kí HPLC là hóa ch t c a Merck (Đ c) 2.1.1. Rau má và ch t chu n c a hãng Sigma (Singapore). Đ i tư ng nghiên c u c a chúng tôi là cây rau má (Centella Đ nh tính asiaticoside: S t n t i c a asiaticoside trong m u ñư c asiatica L.) ñư c tr ng làng Phư c Yên, xã Qu ng Th , huy n Qu ng ghi nh n khi th i gian lưu và hình d ng ph tương ñ ng v i th i gian lưu Đi n, t nh Th a Thiên Hu . và hình d ng ph c a asiaticoside chu n (hình 2.11). 2.1.2. Thi t b , d ng c và hóa ch t trong quá trình nghiên c u 2.1.2.1. Thi t b , d ng c s d ng trong quá trình nghiên c u 2.1.3.2. Hóa ch t s d ng trong quá trình nghiên c u 2.1.3. Qui trình s n xu t trà rau má túi l c 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1. Phương pháp hóa lý 2.2.1.1. Phương pháp ñ nh tính và ñ nh lư ng asiaticoside b ng HPLC (s c kí l ng cao áp) Sơ ñ nguyên lí c a máy s c kí l ng cao áp ñư c cho hình 2.9. Hình 2.11. Hình d ng không gian ba chi u c a ph asiaticoside chu n Đ nh lư ng asiaticoside: Hàm lư ng asiaticoside (X) c a m u s ñư c tính d a vào n ng ñ c a asiaticosdie chu n thông qua di n tích peak chu n và di n tích peak ghi nh n ñư c c a m u công th c sau: S x = M AK S AS Trong ñó: SAS: di n tích peak c a asiaticoside chu n.
11 12 SM: di n tích peak c a asiaticoside trong m u. X lý s li u b ng chương trình Microsoft Excel và v ñ th b ng A: n ng ñ m u asiaticoside chu n (mg/ml). ph n m m Matlab 7.10. K: th tích c a d ch chi t asiaticoside (ml). 2.2.1.2. Phương pháp xác ñ nh hàm m CHƯƠNG 3 2.2.1.3. Phương pháp xác ñ nh hàm lư ng tro t ng s K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 2.2.1.4. Phương pháp chi t b ng Soxhlet 3.1. XÁC Đ NH M T S THÀNH PH N HÓA H C C A RAU MÁ Nguyên lý: Dung môi ñư c ñun sôi ñ n nhi t ñ bay hơi lên trên 3.1.1. Thành ph n hóa h c c a rau má Phư c Yên, Qu ng Th , Qu ng g p ng sinh hàn thì hơi ñư c làm l nh và ngưng t l i ng m d n vào Đi n, Th a Thiên Hu nguyên li u trích li các ch t trong nguyên li u. N ng ñ c a d ch trích ly M t s thành ph n hóa h c trong rau má có th gây b t l i cho quá tăng d n theo th i gian nh h th ng thông nhau gi a ph n tr chi t và trình chi t, tinh ch asiaticoside cũng như quá trình b o qu n s n ph m thu bình c u. Khi d ch chi t ñ t ñ cao nh t ñ nh s ch y tr l i bình c u và h i sau này. Do v y, chúng tôi ti n hành xác ñ nh m t s thành ph n hóa ti p t c ñư c ñun sôi ñ bay hơi. Quá trình này tu n hoàn liên t c trong h c có trong rau má Phư c Yên, Qu ng Th , Qu ng Đi n, Th a Thiên Hu th i gian kh o sát. D ch chi t thu ñư c l y ra bình c u. t ñó có bi n pháp x lý và lo i tr s nh hư ng x u c a các thành ph n Ti n hành: Cân 3g b t rau má cho vào gi y l c bu c kĩ ñ tránh này ñ i v i quá trình trích ly asiaticoside trong nguyên li u và k t qu cho b t rau ch y ra ngoài. Sau ñó cho gói b t vào ph n thân c a bình soxhlet, b ng 3.1. còn dung môi cho kho ng 250ml vào bình c u bên dư i r i ti n hành tách B ng 3.1. Thành ph n hóa h c có trong rau má Phư c Yên chi t nhi t ñ sôi c a dung môi. Sau khi chi t xong ph n d ch chi t s STT Tên thành ph n hóa h c Đơn v Hàm lư ng ñư c cho vào bình tam giác, r i ti n hành l c thô, l c tinh. Cu i cùng d ch 1 Nư c % kh i lư ng 88,10 chi t ñư c ch a trong effendorf ñem ñi phân tích s c kí. Đánh d u m c d ch chi t bình tam giác và xác ñ nh th tích d ch chi t. 2 Đ m t ng s % ch t khô 0,249 2.2.2. Phương pháp hóa sinh 3 Đư ng kh % ch t khô 8,590 2.2.2.1. Xác ñ nh hàm lư ng nitơ t ng s b ng phương pháp Kjeldahl 4 Lipid % ch t khô 6,611 2.2.2.2. Xác ñ nh hàm lư ng ñư ng kh b ng phương pháp Bertrand 5 Vitamin C % ch t khô 0,456 2.2.2.3. Xác ñ nh hàm lư ng lipid b ng phương pháp Soxhlet] 2.2.2.4. Xác ñ nh hàm lư ng vitamin C b ng phương pháp chu n ñ I2 6 Tanin % ch t khô 3,273 2.2.2.5. Xác ñ nh hàm lư ng tanin theo phương pháp Leventhal 7 Cenlulose % ch t khô 13,960 2.2.2.6. Xác ñ nh hàm lư ng cellulose 8 Tro t ng s % ch t khô 10,700 2.2.2.7. Xác ñ nh hàm lư ng pectin b ng phương pháp pectate calci 9 Pectin % ch t khô 1,410 2.2.3. Phương pháp ñánh giá c m quan 2.2.3.1. Phép th so sánh c p ñôi th hi u T nh ng k t qu phân tích thành ph n hóa h c, chúng tôi nh n 2.2.3.2. Phép th 2-3 th y nư c, cellulose, ch t béo là nh ng thành ph n chính gây c n tr quá 2.2.4. Phương pháp vi sinh trình tách chi t. Do v y, c n x lý nh ng ch t này ñ t o ñi u ki n thu n 2.2.4.1. Phương pháp xác ñ nh t ng vi khu n hi u khí l i cho ho t ch t sinh h c mong mu n trích li vào dung môi. Đ tách m Phân tích vi sinh v t t ng s b ng phương pháp ñ m khu n l c. chúng tôi ti n hành s y khô rau má. Nh m gi m t i thi u nh hư ng c a 2.2.4.2. Phương pháp xác ñ nh Coliform nhi t ñ ñ n quá trình chi t tách sau này, chúng tôi ch n nhi t ñ s y là Phân tích Coliform b ng phương pháp MPN. 500C. nhi t ñ này, ch t nguyên sinh trong rau s b phá v , t o ñi u 2.2.4.3. Phương pháp xác ñ nh Samonella: g i m u Trung tâm Ki m ki n thu n l i hơn cho quá trình chi t. Hơn n a, vi c x lý nguyên li u s nghi m Thu c, M ph m, Th c ph m, t nh Th a Thiên Hu . h n ch s th y phân ho t ch t sinh h c chính trong rau má. B i vì, 2.2.5. Phương pháp th ng kê và x lí s li u asiaticoside là m t glucoside, g m g c triterpene g n v i ba g c ñư ng B trí thí nghi m theo qui ho ch th c nghi m các y u t toàn ph n 23 . (hai g c glucose và m t g c rhamnose) cho nên nhi t ñ và ñ m thích h p, chúng d b enzyme th y phân m t ph n ho c toàn b . Đi u này làm
13 14 gi m ñáng k hàm lư ng asiaticoside thu nh n sau này. Sau khi tách m, Tóm l i, k t qu kh o sát cho th y r ng ñ tăng hi u qu chi t c n chúng tôi xay nh r i dùng n-hexane ñ tách béo. Quá trình ñư c th c hi n s d ng ph n lá rau má. Do v y, chúng tôi s d ng lá rau má trong các trên máy l c (8h x 3 l n). nghiên c u chi t asiaticoside ti p theo. Sau quá trình tách chi t, m t s t p ch t b k t t b i nhi t t o nên 3.2. NGHIÊN C U NH HƯ NG C A DUNG MÔI, TH I GIAN, pH Đ N nh ng t p ch t khá l n. Đi u này s gây c n tr ñ chính xác khi ñ nh tính và HÀM LƯ NG ASIATICOSIDE THU NH N TRONG QUÁ TRÌNH CHI T ñ nh lư ng ho t ch t sinh h c chính asiaticoside. Do v y, c n ti n hành l c thô 3.2.1. Nghiên c u nh hư ng c a dung môi ñ n lư ng asiaticoside thu (0,05 mm) và l c tinh (0,45 µm) nh m tách lo i t p ch t kh i d ch chi t. nh n trong quá trình chi t 3.1.2. Xác ñ nh hàm lư ng asiaticoside trong các b ph n c a cây rau má Dung môi là m t y u t có vai trò quy t ñ nh trong quá trình chi t. Các ho t ch t quí trong nguyên li u th c v t thư ng phân b trong M i dung môi có kh năng hòa tan các h p ch t khác nhau các m c ñ toàn cây ho c t p trung trong b ph n nào ñó (r , thân ho c lá) c a th c khác nhau. Vi c l a ch n dung môi có nh hư ng r t l n ñ n hi u su t thu v t. Do v y chúng tôi ti n hành ñánh giá hàm lư ng asiaticoside trong các h i các h p ch t. Đ phân c c c a dung môi, ñ nh t và s c căng b m t b ph n c a cây rau má, nh m có s l a ch n nguyên li u h p lí ñ tách c a dung môi là nh ng y u t nh hư ng ñ n quá trình chi t xu t. Do ñó, chi t asiaticoside. chúng tôi ti n hành kh o sát hi u qu chi t asiaticoside c a m t s lo i Rau má sau khi ñã x lý sơ b , cân 3 g b t rau/ 1 m u (r , than và dung môi: ethanol, methanol, và ethyl acetate v i cùng ñi u ki n chi t như lá) và ti n hành kh o sát ñi u ki n chi t như sau: dung môi chi t là sau: nhi t ñ chi t là nhi t ñ sôi c a m i dung môi và th i gian chi t là ethanol:nư c = 75:25, nhi t ñ chi t là nhi t ñ sôi và th i gian chi t là 5h. 5h. K t qu kh o sát th hi n hình 3.3. Sau ñó chúng tôi ti n hành phân tích b ng s c kí l ng cao áp. K t qu ñư c th hi n hình 3.1. 7,252 Hàm lư ng asiaticoside (mg/g) 8 10 8,728 6 Hàm lư ng asiaticoside (mg/g) 4,635 8 4 5,053 6 4,408 2 4 0,000 2 0 Ethyl acetate Ethanol Methanol Dung môi 0 R Thân Lá B ph n Hình 3.3. nh hư ng c a lo i dung môi ñ n hàm lư ng Hình 3.2. Hàm lư ng asiaticoside các b ph n c a cây rau má asiaticoside thu nh n T hình 3.2 và ph l c 2 chúng tôi nh n th y asiaticoside t n t i K t qu phân tích cho th y, methanol có kh năng chi t asiaticoside trong t t c các b ph n kh o sát c a cây rau má. Tuy nhiên, hàm lư ng t t hơn ethanol. Ethyl acetate hòa tan asiaticoside r t kém .Nhưng methanol thu nh n ñư c các b ph n r , thân, lá hoàn toàn không gi ng nhau. có tính ñ c m nh ñ i v i con ngư i nên chúng tôi quy t ñ nh ch n ethanol ph n lá, lư ng asiaticoside tích lũy là cao nh t (8,728 mg/g), cao hơn r t làm dung môi chi t xu t. Ethanol l i có nhi u ưu ñi m hơn như: không gây nhi u so v i ph n r 5,053 mg/g và ph n thân 4,408 mg/g. K t qu này ñ c nên an toàn cho s c kh e con ngư i, l i d ki m, r ti n. Hơn n a, hàm gi ng v i k t qu nghiên c u c a N.A.Zainol và Tae Kim, hai tác gi này lư ng asiaticoside thu nh n t hai dung môi này chênh l ch không quá l n. cũng cho r ng lá là b ph n ch a nhi u asiaticoside nh t. Tuy nhiên, Ngoài ra, có th gi m ñ nh t c a dung môi ethanol b ng h dung môi lư ng asiaticoside thu ñư c th p hơn công b c a các tác gi này. Đi u ethanol-nư c ñ thu nh n lư ng asiticoside cao hơn. này ch có th là do s khác nhau v ñi u ki n canh tác, th như ng và 3.2.2. Nghiên c u nh hư ng c a t l dung môi ñ n lư ng asiaticoside khí h u t o nên. thu nh n trong quá trình chi t
15 16 M c ñ hòa tan c a m t ch t trong các h dung môi khác nhau là ho t ch t trong nguyên li u. Trong quá trình chi t, lúc ñ u các phân t nh khác nhau. M t ch t có th hòa tan r t t i trong m t lo i dung môi nguyên (thư ng là ho t ch t) s ñư c hòa tan và khu ch tán vào dung môi trư c ch t, nhưng l i có th hòa tan t t trong h dung môi b c hai c a chính nó. sau ñó m i t i các h p ch t phân t l n (thư ng là h p ch t keo, nh a…). Do ñó vi c l a ch n h dung môi trong tách chi t ho t ch t cũng có vai trò Do ñó n u th i gian chi t ng n s không chi t ñư c h t ho t ch t. Nhưng quan tr ng. Như chúng ta ñã bi t, nư c là m t dung môi r ti n, ph bi n n u th i gian chi t quá dài d ch chi t có nhi u t p ch t s gây khó khăn cho và có kh năng hòa tan không h n ch trong alcohol. Vi c s d ng h dung quá trình tinh ch sau này. Ngoài ra, th i gian chi t dài còn gây tiêu phí môi alcohol - nư c ñ chi t xu t asiaticoside có th mang l i hi u qu t t. năng lư ng. Vì v y, v n ñ kh o sát ñ l a ch n th i gian chi t là r t quan Do v y, c n kh o sát kh năng chi t asiaticoside trong rau má c a h dung tr ng. môi ethanol – nư c theo các t l khác nhau nh m tăng hi u qu quá trình Chúng tôi ti n hành kh o sát các kho ng th i gian chi t khác chi t. nhau 3h, 4h, 5h, 6h, 7h và 8h v i dung môi chi t là ethanol:nư c = 80:20 Chúng tôi chi t hành chi t theo các t l ethanol: nư c = 90:10, nhi t ñ sôi c a h dung môi. Sau khi ti n hành x lý nguyên li u, chúng 80:20, 70:30. 60:40, 50:50 và c n tuy t ñ i. Quá trình chi t ti n hành trong tôi ti n hành chi t v i các kho ng th i gian khác nhau trên h th ng 5h, nhi t ñ sôi c a dung môi. Sau khi chi t, d ch chi t ñư c x lý theo Soxhlet. D ch chi t thu ñư c ñem x lý r i phân tích HPLC ñ xác ñ nh sơ ñ hình 3.1. D ch asiaticoside thu ñư c ñem ñ nh tính và ñ nh lư ng hi u su t thu h i ho t ch t. K t qu kh o sát th i gian chi t ñư c th hi n b ng HPLC. K t qu ñư c th hi n hình 3.4. hình 3.5. 5,987 1 9,307 6 Hàm lư ng asiaticoside (mg/g) Hàm lư ng asiaticoside 8 5 4,296 5,876 5,987 4 6 3,229 3,014 3,138 2,896 4,426 4,635 3 4 2 (mg/g) 2 1,087 1 0 0 5 6 7 8 9 Tuy t ñ i 3 4 5 6 7 8 Đ c n h Hình 3.5. nh hư ng c a th i gian chi t ñ n Hình 3.4. nh hư ng c a t l ethanol:nư c hàm lư ng asiaticoside thu nh n ñ n hàm lư ng asiaticoside thu nh n Như v y, th i gian có nh hư ng r t l n ñ n hi u su t tách chi t. Qua k t qu kh o sát hình 3.4, chúng tôi nh n th y hàm lư ng Theo các kho ng th i gian mà chúng tôi ñã kh o sát thì hàm lư ng asiaticoside thu ñư c tuân theo qui lu t nh t ñ nh khi t l dung môi ethanol : asiaticoside thu nh n s tăng lên và t i ngư ng cao nh t (5h) s thu ñư c nư c thay ñ i. ñ c n 90 hàm lư ng asiaticoside thu ñư c là cao nh t 9,307 hàm lư ng ho t ch t l n nh t. Khi ñã vư t qua ngư ng này thì hi u su t thu mg/g. các ñ c n 50, 60, 70 và 80 hàm lư ng asiaticoside thu ñư c m c h i ho t ch t ngh ch bi n v i s tăng c a th i gian chi t. th p t 1,087 – 5,987 mg/g. Đ c bi t, ñ c n 50, khi t l nư c:ethanol = 1:1 Như v y, v i th i gian chi t 5h thì hàm lư ng thu nh n thì hàm lư ng asiaticoside thu ñư c r t th p. asiaticoside t rau má cao nh t trên h th ng Soxhlet. Như v y, ñ c n 90 là ñ c n thích h p ñ thu ñư c asiaticoside cao 3.2.4. nh hư ng c a pH ñ n lư ng asiaticoside thu nh n trong quá nh t khi chi t b ng h th ng Soxhlet. trình chi t 3.2.3. Nghiên c u nh hư ng c a th i gian ñ n hàm lư ng asiaticoside M t y u t có nh hư ng không nh ñ i v i s hòa tan c a ho t thu h i trong quá trình chi t ch t vào dung môi là pH. Do v y, chúng tôi kh o sát nh hư ng c a pH Th i gian cũng là m t y u t có tính quy t ñ nh trong vi c thu h i
17 18 c a nư c các giá tr 2, 3,4, 5, 6 và 7. Chúng tôi s d ng acetic acid ñ Ba y u t th c nghi m (t l dung môi, th i gian chi t, pH chi t) thay ñ i pH c a nư c. Sau ñó chúng tôi ti n hành chi t v i ñi u ki n ñư c kí hi u: ethanol:nư c = 80:20 (t i các giá tr pH khác nhau). X1: t l c n : nư c (%) ; X2: th i gian chi t (h) ; X3: pH chi t Sau khi phân tích HPLC chúng tôi thu ñư c ph s c kí và hàm Y: hàm lư ng asiaticoside thu nh n ñư c (mg/g) lư ng asiaticoside c a các m u kh o sát nh hư ng c a pH. K t qu th c nghi m ñư c th hi n hình 3.6. M c bi n thiên và kho ng bi n thiên ñư c th hi n b ng 3.2. 4,959 Hàm lư ng asiaticoside (mg/g) 5 4,425 4,296 4 3,536 3,277 3,364 3 2 1 0 2 3 4 5 6 7 pH Hình 3.6. nh hư ng c a pH ñ n hàm lư ng asiaticoside thu nh n Tóm l i, trong quá trình chi t asiaticoside b ng h dung môi ethanol: nư c, thì pH = 5 là pH thích h p. 3.3. NGHIÊN C U NH HƯ NG Đ NG TH I C A T L DUNG MÔI, TH I GIAN VÀ pH CHI T Đ N HÀM LƯ NG ASIATICOSIDE THU NH N TRÊN H TH NG CHI T SOXHLET 3.3.1. Thi t l p mô hình thí nghi m và thí nghi m theo mô hình Sau khi kh o sát nh hư ng ñơn l c a các y u t t l dung môi, th i gian và pH chi t ñ n hàm lư ng asiaticoside thu nh n, chúng tôi nh n th y c ba y u t ñ u có nh hư ng l n ñ n lư ng asiaticoside thu nh n. Đ ch n ñư c các y u t phù h p cũng như xem xét ñ n s tương tác gi a các y u t trong quá trình chi t, chúng tôi ti n hành b trí các thí nghi m theo mô hình quy ho ch th c nghi m v i m c ñích mô t ñư c s nh hư ng ñ ng th i c a các y u t ñ n lư ng asiaticoside thu nh n thông qua phương trình h i quy th c nghi m. T ñó làm cơ s ñi ñ n vi c tìm ra thông s t i ưu. Đ th c hi n m c ñích này, chúng tôi ch n mô hình quy ho ch th c nghi m là mô hình th c nghi m các y u t toàn ph n v i s y u t là 3: TYT 23. Phương trình h i qui th c nghi m mô t tương tác gi a các y u t có d ng như sau: Y^ = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x2x2x3
19 20 B ng 3.2. M c, kho ng bi n thiên c a các y u t b23 = -0,008; b123 = 0,014. M c cơ Kho ng bi n M c cao M c th p 3.3.2.2. Ki m tra ý nghĩa c a các h s b trong phương trình h i qui Y ut Do ma tr n tương quan là ma tr n ñư ng chéo, có nghĩa là các h b n (0) thiên (λ) (+1) (-1) X1, % 90 5 95 85 s trong phương trình h i qui ñ c l p v i nhau. Cho nên vi c ki m tra ý X2, h 5 1 6 4 nghĩa c a h s b trong phương trình h i qui theo chu n Student cũng như X3, 5 1 6 4 vi c lo i b h s không có nghĩa không nh hư ng ñ n các h s còn l i. Ma tr n quy ho ch th c nghi m y u t toàn ph n TYT 23 v i các Đ ki m tra ý nghĩa c a các h s b trong phương trình h i c n y u t (các bi n) ñã ñư c mã hóa và k t qu thí nghi m th hi n trên tính phương sai tái hi n. Đ xác ñ nh phương sai tái hi n, chúng tôi làm 3 b ng 3.3. thí nghi m tâm phương án. B ng 3.3. B ng ma tr n quy ho ch th c nghi m y u t toàn ph n TYT 23 Sau khi tính và ki m tra ý nghĩa c a các h s b, chúng tôi thu ñư c phương trình h i quy th c có d ng như sau là: N X1, ñ c n X2, h X3 Xo x1 x2 x3 Y(mg/g) Y^ = 9,71800 - 0,01150x1 -0,04150x2 + 0,02875x3 -0,01450x1x 2 + 0,01425x1x2x3 1 95 6 6 + + + + 9,690 3.3.2.3. Ki m tra s tương thích c a phương trình h i qui tìm ñư c v i 2 85 6 6 + - + + 9,705 th c nghi m 3 95 4 6 + + - + 9,789 S tương thích c a phương trình h i quy v i th c nghi m ñư c 4 85 4 6 + - - + 9,803 ki m ñ nh theo tiêu chu n Fisher: 5 95 6 4 + + + - 9,612 2 6 85 6 4 + - + - 9,701 S tt F= 2 7 95 4 4 + + - - 9,735 S th 8 85 4 4 + - - - 9,709 Vì F tn = 6,6731 < F b = 19,00 nên phương trình h i quy tìm 9 90 5 4 + 0 0 0 9,713 ñư c tương thích v i th c nghi m và có d ng sau: 10 90 5 5 + 0 0 0 9,699 Y^ = 9,71800 - 0,01150x1 -0,04150x2 + 0,02875x3 -0,01450x1x 2 + 11 90 5 5 + 0 0 0 9,709 0,01425x1x2x3 3.3.2. Tính các h s h i qui và ki m tra s tương thích c a phương T phương trình h i quy, chúng tôi th y h s b2 là l n nh t trình h i qui tìm ñư c v i th c nghi m nên ñ thu nh n ñư c hàm lư ng asiaticoside cao thì c n gi m th i Sau khi ti n hành th c nghi m chúng tôi xác ñ nh các h s c a gian chi t trong gi i h n thí nghi m. H s b 1 cho th y c n gi m ñ phương trình h i qui và ki m tra s tương thích c a phương trình tìm ñư c c n ñ thu asiaticoside nhi u hơn. Vi c tăng pH chi t cũng s góp v i th c nghi m. ph n tăng hàm lư ng asiaticoside. nh hư ng tương tác c a ñ c n 3.3.2.1. Tính các h s b c a phương trình h i qui và th i gian chi t, pH chi t cũng góp ph n tăng hi u su t tách chi t. S d ng phương pháp bình phương nh nh t ñ xác ñ nh h s bj Còn tương tác gi a th i gian và ñ c n l i gi m hi u su t. Như v y, c a phương trình h i qui. Phương pháp này cho phép xác ñ nh các h s có th nh n th y r ng khi tăng th i gian chi t và/ho c ñ c n thì nh c a phương trình h i qui ñã ch n sao cho ñ l ch c a h s này so v i s hư ng c a tương tác càng l n và hi u su t thu h i ho t ch t càng li u th c nghi m là nh nh t. Ma tr n trong phương án qui ho ch TYT23 là nh . ma tr n ñư ng chéo nên nó có tính tr c giao. Do v y, các h s c a 3.3.3. Th hi n phương trình h i qui th c nghi m trên ñ th b ng phương trình h i qui ñư c tính theo công th c: chương trình Matlab phiên b n 7.10 1 N Đ th hi n rõ hơn s tương tác c p c a các y u t nh hư ng t bj = ∑ x ji yi N i=1 l dung môi, th i gian và pH chi t chúng tôi s d ng chương trình Matlab 7.10. B ng cách c ñ nh m t y u t tương tác, chúng tôi tìm Ta có: hi u nh hư ng tương tác c a hai y u t còn l i ñ n hàm lư ng b0 = 9,718; b1 = -0,012; b2 = -0,041; asiaticoside thu nh n. b3 = 0,029; b12 = -0,015; b13 = 0,004;
21 22 Sau khi l n lư t c ñ nh các y u t nh hư ng t l dung môi, th i gian và pH chi t thì phương trình h i qui th c nghi m bi u di n nh hư ng tương tác c a các y u t ñư c mô t d ng m t ph ng, và ñư c th bi u di n Asiaticoside (mg/g) các hình 3.7, hình 3.8 và hình 3.9. Asiaticoside Đ c n Th i gian chi t (h) Th i gian chi t pH chi t Hình 3.9. S ph thu c hàm lư ng asiaticoside thu nh n Hình 3.7. S ph thu c hàm lư ng asiaticoside thu nh n vào ñ c n và th i gian chi t vào th i gian và pH chi t các hình 3.8 và 3.9, khi l n lư t c ñ nh th i gian và pH chi t, Hình 3.7 th hi n nh hư ng tương tác c a th i gian và pH chi t ñ n hi u qu chi t asiaticoside s cao n u gi m ñ ng th i c hai y u t nh hàm lư ng asiaticoside thu ñư c khi c ñ nh ñ c n. Có th th y r ng, khi hư ng còn l i và ngư c l i. Do v y, n u mu n thu ñư c asiaticoside nhi u ñ ng th i tăng th i gian và pH chi t lư ng asiaticoside thu ñư c s th p. Do thì ho c gi m pH và ñ c n n u c ñ nh th i gian chi t, ho c gi m th i v y, khi không mu n thay ñ i ñ c n n u mu n tăng hi u qu thu nh n gian chi t và ñ c n n u mu n gi nguyên pH. asiaticoside thì c n gi m c th i gian và pH chi t trong kho ng gi i h n. 3.3.4. L a ch n các thông s chi t ñ thu nh n asiaticoside v i hàm lư ng cao Asiaticoside Qua nh ng thí nghi m qui ho ch th c nghi m và các thí nghi m t i tâm, chúng tôi l a ch n ñi u ki n chi t trên h th ng Soxhlet ñ có th thu ñư c asiaticoside cao nh t trong gi i h n nghiên c u. T nh ng t k t qu th c nghi m chúng tôi nh n th y ñ c n 85, th i gian chi t là 4h, pH = 6 thì thu ñư c asiaticoside cao nh t là 9,803 mg/g. Do v y, chúng tôi l a ch n ñi u ki n chi t này ñ thu nh n asiaticoside qui mô phong thí nghi m. 3.4. S N XU T ASIATICOSIDE QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHI M Đ c n pH chi t T nh ng k t qu ph n 3.1, 3.2 và 3.3, ñ ñ m b o thu h i asiaticoside v i hàm lư ng cao chúng tôi xin ñ xu t quy trình chi t như sơ ñ hình 3.10. Hình 3.8. S ph thu c hàm lư ng asiaticoside thu nh n vào ñ c n và pH chi t
23 24 Rau má Sau khi s n xu t ñư c hai lo i trà rau má, chúng tôi ti n hành ñánh giá ch t lư ng trà thành ph m trên các phương di n: ch t lư ng c m quan, các ch tiêu vi sinh v t, m t s ch tiêu hóa lý và ñánh giá ch t lư ng thông Làm s ch qua hàm lư ng asiaticoside c a trà thành ph m. 3.5.2. Đánh giá ch t lư ng c m quan c a trà ch c năng thành ph m S y khô (500C,12h ) 3.5.2.1. Đánh giá m c ñ ưa thích c a trà rau má túi l c s n xu t phòng thí nghi m và trà rau má túi l c Vĩnh Ti n Làm nh Trà là m t s n ph m th c ph m do v y vi c ñánh giá, l a ch n và s d ng nó trư c h t ph i b ng tr c quan. Do v y chúng tôi ñánh giá c m Tách béo b ng n- hexan (3l n x 8h) quan m c ñ ưa thích c a trà thành ph m chưa b sung asiaticoside và trà rau má ñư c bán trên th trư ng b ng phép th c p ñôi th hi u. V i 10 ngư i tham gia ñánh giá 2 m u A (trà rau má túi l c Vĩnh Chi t Soxhlet Ti n) và B (trà rau má túi l c s n xu t t i phòng thí nghi m) v m c ñ ưa (Ethanol:nư c= 85:15 810C, 4h, pH=6) thích ñ i v i s n ph m. M i ngư i ñánh giá 4 l n (4 l n l p). S câu tr l i là 40. K t qu ñánh giá ñư c t p h p trong b ng 3.4. L c thô (0,05mm) B ng 3.4. B ng t ng h p câu tr l i c a phép th c p ñôi th hi u L c tinh (0,45µm) M u S l n m u ñư c ñánh giá là Tách b ng HPLC Thích hơn Ít thích hơn (MeOH:H2O (1% TFA) = Thu nh n d ch chi t A 13 27 60:40, 220nm, 1,5ml/phút) B 27 13 2 D a vào chu n χ ñ xác ñ nh m c ñ ưa thích. K t qu là m u B B c hơi dư i áp su t gi m D ch asiaticoside (trà rau má túi l c thành ph m) ñư c ưa thích hơn m u A (trà rau má túi l c Vĩnh Ti n). Asiaticoside thô 3.5.2.2. Đánh giá s khác bi t c a trà rau má b sung và không b sung asiaticoside s n xu t phòng thí nghi m Hình 3.10. Sơ ñ thu nh n asiticoside qui mô phòng thí nghi m Trong k t qu nghiên c u ph n trên chúng tôi nh n th y r ng hàm lư ng asiaticoside t i ña trong 3g rau má khô (tương ñương v i m i túi trà) vào kho ng 24mg. Tuy nhiên, hàm lư ng asiaticoside trong m i túi 3.5. NGHIÊN C U NG D NG ASIATICOSIDE TRONG CH trà th p hơn r t nhi u. Theo kh o sát c a chúng tôi trên trà rau má túi l c BI N TRÀ RAU MÁ TÚI L C s n xu t phòng thí nghi m và trà rau má Vĩnh Ti n thì hàm lư ng ch ñ t 3.5.1. S n xu t trà rau má túi l c có và không có b sung asiaticoside 2,85 mg/1 túi trà th trư ng và 6,30 mg/ túi trà s n xu t t i phòng thí qui mô phòng thí nghi m nghi m. Nguyên nhân là do trong công ño n lên men, ñi u ki n nhi t ñ và Qua nghiên c u chúng tôi ti n hành s n xu t trà rau má túi l c theo ñ m thích h p, asiaticoside b th y phân m t ph n ho c hoàn toàn b i qui trình hình 2.8. Đ i v i trà rau má túi l c có b sung asiaticoside chúng enzyme. tôi b sung asiaticoside giai ño n ph i tr n. Asiaticoside (d ng d ch chi t) b Trong quá trình s d ng trà, lư ng asiaticoside không ñư c trích li sung vào trà v i n ng ñ 1mg asiaticoside/1g trà. Sau ñó, ti n hành s y khô và tri t ñ trong nư c pha trà. Qua kh o sát, chúng tôi nh n th y lư ng ñóng gói v i tr ng lư ng 3g / túi b ng máy d p trà túi l c th công ñ thu asiticoside trong nư c trà ch chi m 0,166 mg/ túi trà Vĩnh Ti n và 0,383 thành ph m. mg/ túi trà s n xu t t i phòng thí nghi m. Đi u này phù h p v i nh ng nghiên c u v t l dung môi chi t c a chúng tôi m c 3.2.2. Khi tăng hàm
25 26 lư ng nư c trong h dung môi chi t thì lư ng asiaticoside thu nh n gi m. T k t qu phân tích vi sinh b ng 3.12 cho th y trà rau má túi l c Vì nư c là dung môi có kh năng trích li asiaticoside là không cao. M t lí ch c năng thành ph m không ch a các vi sinh v t gây ñ c như E.Coli, do khác làm gi m lư ng asiaticoside trong nư c trà là do s hình thành Samonella... Như v y, s n ph m ñ t ch t lư ng v phương di n vi sinh theo nhi u h p ch t như pectin, polyphenol và m t s s n ph m caramen khác QD s 867/1998 QĐ c a B Y t v ch t lư ng v sinh. trong quá trình ch bi n trà. Chính nh ng ch t này ñã “gi ” asiaticoside l i 3.5.4. Đánh giá m t s ch tiêu hóa h c c a trà ch c năng thành ph m trong bã trà làm gi m hàm lư ng asiaticoside. Vì nh ng lý do ñó, chúng tôi quy t ñ nh b sung b t asiaticoside vào trà nh m làm giàu lư ng S n ph m ñ t ch t lư ng ngoài an toàn v vi sinh v t, thích h p asiaticoside trong trà ñ ñưa trà rau má tr thành m t s n ph m ch c năng. v i ngư i tiêu dùng còn ph i ñ m b o thành ph n dinh dư ng, ñ c bi t là Tuy nhiên, Vi t Nam chưa có b t c qui ñ nh nào v hàm lư ng nh ng thành ph n quí c a s n ph m, nh t là ñ i v i s n ph m ch c năng. asiaticoside cho phép trên ngư i. Qua nh ng k t qu nghiên c u lâm sàng Do v y, chúng tôi ti n hành phân tích m t s ch tiêu hóa lý nh m ñánh giá trên ngư i c a các tác gi nư c ngoài, chúng tôi ch n b sung b t ch t lư ng trà ch c năng thành ph m. K t qu phân tích ñư c t ng h p asiaticoside v i t l 1mg asiaticoside/1g trà. Sau ñó ti n hành ñánh giá trong b ng 3.6. c m quan ñ xem li u vi c b sung asiaticoside có làm nh hư ng ñ n ch t B ng 3.6. Thành ph n hóa h c s n ph m lư ng trà rau má hay không. Chúng tôi l a ch n phép th 2-3 ñ ñánh giá s sai khác gi a m u STT Tên thành ph n Đơn v Hàm lư ng trà có b sung và không b sung asiaticoside s n xu t phòng thí nghi m. S thành viên là 10 ngư i, v i 4 l n l p. S câu tr l i chúng tôi nh n ñư c 1 Đ m % kh i lư ng 6.90 là 40. Sau ñó, chúng tôi s d ng “B ng s lư ng câu tr l i ñúng c a phép th 2-3” ñ x lý k t qu . 2 Tanin % ch t khô 2.34 K t qu thu ñư c 15/40 câu tr l i ñúng. So sánh v i “B ng s 3 Asiaticoside trong s n ph m mg/g 3.10 lư ng câu tr l i ñúng c a phép th 2-3” thì c n có 26/40 câu tr l i chính xác m i k t lu n ñư c s khác bi t. Do v y, chúng tôi k t lu n không có s 4 Asiaticoside trong nư c pha trà mg/g 0.24 khác nhau gi a hai m u trà rau má b sung và không b sung asiaticoside m c ý nghĩa 5%. Như v y, v i hàm lư ng asiaticoside b sung là 1 mg/ g trà thì T k t qu phân tích b ng 3.6, chúng tôi nh n th y hàm lư ng ngư i s d ng không nh n th y s khác bi t gi a m u trà có b sung và asiaticoside trong trà ch c năng thành ph m khá cao. Đ i v i nư c pha trà, không b sung asiaticoside. hàm lư ng asiaticoside tương ñ i phù h p v i hàm lư ng asiaticoside cho 3.5.3. Đánh giá ch t lư ng c a trà ch c năng trên phương di n vi sinh phép (ñã ñư c th nghi m lâm sàng trên ngư i). Tuy nhiên, hàm lư ng M t s n ph m th c ph m mu n ñ t tiêu chu n ch t lư ng, trư c tanin hơi th p so v i yêu c u k thu t c a chè túi l c (10 TCN 459-2001). h t ph i ñ m b o an toàn v phương di n vi sinh v t. Do v y, chúng tôi Hàm m ñ t m c an toàn theo quy ñ nh ñ i v i s n ph m trà (< 7%) và ti n hành xác ñinh m t s ch tiêu vi sinh v t trong s n ph m. K t qu th thích h p cho quá trình b o qu n. hi n b ng 3.5. Tóm l i, v i nh ng ñánh giá trên chúng tôi có th k t lu n trà ch c B ng 3.5. S lư ng m t s vi sinh v t có trong s n ph m năng rau má túi l c ñ m b o ch t lư ng và an toàn trên các phương di n Các ch tiêu phân tích K t qu c m quan, vi sinh v t và dinh dư ng. Tuy nhiên, ñ trà rau má ch c năng có th ng d ng r ng rãi như m t lo i th c ph m ch c năng c n có nh ng T ng s vi khu n hi u khí /g 26 nghiên c u lâm sàng ñ có b ng ch ng c th hơn v dư c tính c a nó ñ i E.Coli /g 0 v i s c kh e con ngư i. Samonella /g 0 Coliform /g 0
27 K T LU N VÀ KI N NGH I. K T LU N T nh ng k t qu thu ñư c trong quá trình nghiên c u, chúng tôi ñưa ra m t s k t lu n chính như sau: 1. Đã xác ñ nh ñư c thành ph n hóa h c c a rau má thu c thôn Phư c Yên, xã Qu ng Th , huy n Qu ng Đi n, t nh Th a Thiên Hu , k t qu như sau: - Đ m: 88,100% - Hàm lư ng ñư ng kh : 8,59% - Hàm lư ng lipid: 6,611% - Hàm lư ng vitamin C: 0,456% - Hàm lư ng tanin: 3,273% - Hàm lư ng ñ m t ng s : 0,249% - Hàm lư ng khoáng: 10,700% - Pectin: 1,410 % 2. Trong rau má thôn Phư c Yên, xã Qu ng Th , huy n Qu ng Đi n, t nh Th a Thiên Hu hàm lư ng asiaticoside trong lá cao hơn so v i ph n r và thân. 3. Dung môi methanol tách chi t asiaticoside trong rau má có hi u qu hơn ethanol, nhưng ñ i v i nghiên c u v th c ph m nên ch n ethanol. 4. Đi u ki n tách chi t asiticoside t t nh t trên h th ng Soxhlet, ñ i v i h dung môi ethanol: nư c qui mô phòng thí nghi m là: Nhi t ñ : 810C Th i gian: 4h T l dung môi: ethanol/ nư c= 85/15 pH c a nư c: 6 v i hàm lư ng asiaticoside thu ñư c là 9,803 mg/g. 5. S n xu t thành công d ch asiaticoside thô qui mô phòng thí nghi m. 6. S n xu t thành công trà rau má ch c năng túi l c qui mô phòng thí nghi m ñ t tiêu chu n v phương di n dinh dư ng, c m quan và vi sinh v t. II. KI N NGH Sau quá trình nghiên c u, chúng tôi có ki n ngh như sau: 1. T i ưu hóa quá trình tách chi t asiaticoside trên h th ng Soxhlet b ng phương pháp leo d c. 2. Đánh giá ch t lư ng d ch asiaticoside thô trên các phương di n: dinh dư ng, vi sinh v t, c m quan… nh m làm ngu n b sung cho các lo i th c ph m ch c năng trong tương lai. 3. Th nghi m lâm sàng tác d ng c a d ch asiaticoside và trà rau má ch c năng trên ñ ng v t mô hình và ngư i ñ có nh ng công b mang tính pháp lí. 4. S n xu t th nghi m b t asiaticoside thô và trà rau má ch c năng qui mô pilot. Tóm l i, rau má (Centella asiatica) là m t lo i th o dư c có ch a nhi u ho t ch t sinh h c có th ch a ñư c nhi u b nh cho con ngư i. Do v y, vi c nghiên c u thu nh n các ch t có ho t tính sinh h c m ra m t hư ng ng d ng m i vào s n xu t các s n ph m ch c năng trong tương lai. Tuy nhiên, vì h n ch th i gian và ñi u ki n thí nghi m nên nh ng k t qu trên ch gi i h n qui mô phòng thí nghi m. Đ phát tri n k t qu qui mô công nghi p c n nh ng nghiên c u sâu hơn trong tương lai.