Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quá trình lên men FED-BATCH Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thanh Hương

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN

FED-BATCH Corynebacterium glutamicum

THU NHẬN L-LYSINE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh-2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thanh Hương

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN

FED-BATCH Corynebacterium glutamicum

THU NHẬN L-LYSINE

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh-2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực.

Việc tham khảo nghiên cứu của các tác giả khác đều được trích dẫn rõ ràng.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Thanh Hương

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành được luận văn và được bảo vệ luận văn, em xin gửi đến Cô,

PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương lời cảm ơn sâu sắc nhất. Em xin cảm ơn Cô.

Con cảm ơn Mẹ đã cho con một chỗ dựa vững chắc để con có thể vượt qua mọi

khó khăn.

Em xin cảm ơn chị hai, anh rể và các cháu đã luôn ủng hộ em cả về tinh thần

và vật chất để em có được ngày hôm nay. Em cảm ơn chị hai đã luôn ở bên em.

Em cảm ơn Cô Minh Tâm đã giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn.

Em xin gửi lời cảm ơn đến Cô Ly Tao, cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công

nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho

em trong quá trình em tiến hành thực nghiệm tại đây.

Em xin cảm ơn các Thầy, Cô đã tham gia giảng dạy lớp Cao học Sinh học Thực

nghiệm K23, Trường Đại học Sư phạm TP. HCM.

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã ở bên tôi.

Xin chân thành cảm ơn.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Thanh Hương

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 3

1.1. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine ............................................................................ 3

1.1.1. Khái niệm ...................................................................................................... 3

1.1.2. Quá trình lên men .......................................................................................... 3

1.1.3. Các hình thức lên men ................................................................................... 3

1.2. Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum .................................................................... 11

1.2.1. Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại ......................................................... 12

1.2.2. Đặc điểm sinh lý .......................................................................................... 13

1.2.3. Đặc điểm sinh hóa ....................................................................................... 13

1.2.4. Đặc điểm di truyền ...................................................................................... 14

1.3. Amino acid L-lysine .................................................................................................... 16

1.3.1. Đặc điểm ...................................................................................................... 16

1.3.2. Vai trò và ứng dụng ..................................................................................... 17

1.3.3. Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn .................................................................... 19

1.3.4. Bản chất quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở vi khuẩn

Corynebacterium glutamicum ...................................................................... 20

1.3.5. Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium

glutamicum ................................................................................................... 23

1.4. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài ................ 26

Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 29

2.1. Nguyên liệu .................................................................................................................. 29

2.2. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................................... 33

2.2.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống ............................................ 33

2.2.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu

nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm .......................... 33

2.2.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu

nhận L-lysine ................................................................................................ 35

2.3. Phương pháp phân tích thí nghiệm ............................................................................. 36

2.3.1. Phương pháp vi sinh .................................................................................... 36

2.3.2. Phương pháp hóa sinh ................................................................................. 38

2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 39

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...................................................................... 40

3.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống ........................................................... 40

3.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine

bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm ............................................................ 42

3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine . 50

3.3.1. Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất ............................................... 50

3.3.2. Khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất ................................................................. 53

3.3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu

nhận L-lysine ................................................................................................ 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 65

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích ............................................................................... 29

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài ................................................................ 30

Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài ........................................... 31

Bảng 2.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc ..................................................................... 34

Bảng 2.5 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu ........... 34

Bảng 3.1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 ............... 40

Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc ...................................................................... 42

Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát .................................................... 43

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khởi đầu ...................................................................... 44

Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu .................................................. 45

Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD .......... 46

Bảng 3.7 Khả năng sử dụng đường của Corynebacterium glutamicum ................... 52

Bảng 3.8 So sánh lên men batch và fed-batch........................................................... 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên

môi trường phức hợp. (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử

quét . ............................................................................................................. 12

Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 . .......................... 15

Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα và lysCβ

được cấu tạo bởi bốn chuỗi poplypeptide giống hệt nhau . ......................... 16

Hình 1.4 Cấu trúc không gian và cấu tạo phân tử của lysine . .................................... 17

Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine ở vi khuẩn. ................ 20

Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine ở Corynebacterium glutamicum .............. 21

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ......................................................................... 32

Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) và hình

dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b). .................. 41

Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể hiện sự ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp

lên lượng L-lysine ........................................................................................ 48

Hình 3.3 Đồ thị tối ưu ................................................................................................. 49

Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong lên men

batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine ............................... 50

Hình 3.5 Khả năng hình thành sinh khối, L-lysine và lượng đường sót khi nuôi

cấy Corynebacterium glutamicum ở các nồng độ glucose khác nhau ......... 54

Hình 3.6 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong quá

trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum-B-0632 .................. 57

Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine trong lên men batch và fed-batch ................ 58

Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả năng sinh trưởng của Corynebacterium glutamicum

trong lên men batch và fed-batch ................................................................. 59

Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót trong lên men batch và fed-batch ............. 60

1

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Amino acid rất cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của người và động vật, đặc

biệt là các amino acid không thay thế. Sự thiếu hụt amino acid nói chung và các amino

acid không thay thế nói riêng sẽ dẫn đến tình trạng bệnh lý. L-lysine là một amino acid

thuộc nhóm không thay thế được quan tâm nhiều hơn cả, vì có nhu cầu khá cao, nhưng

lại thường bị thiếu hụt nhất trong khẩu phần ăn. Mặt khác, L-lysine dễ bị phân hủy trong

quá trình chế biến thức ăn và cơ thể tuyệt đối không tổng hợp được. Do đó, thiếu L-

lysine rất phổ biến, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Thiếu L-lysine làm giảm tổng hợp protein cơ

thể, trẻ biếng ăn, chậm lớn, thiếu men tiêu hóa….

Hiện nay, việc sử dụng công nghệ vi sinh để sản xuất L-lysine là hướng đang được

quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, quy trình sản xuất vẫn còn ở quy mô phòng thí

nghiệm, số lượng các nghiên cứu về sản xuất L-lysine còn ít, chủng giống chưa đạt

chuẩn, năng suất thấp [1].

Với mục tiêu cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine, chúng tôi chọn giải

pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch. Đây là lý do chúng

tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium

glutamicum thu nhận L-lysine”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine từ chủng vi khuẩn Corynebacterium

glutamicum-B-0632.

3. Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống

Đại học Quốc Gia Hà Nội.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu

1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống.

2. Tối ưu hóa môi trường lên men thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch

thực nghiệm.

3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine.

2

5. Phạm vi nghiên cứu

Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng trong lên men batch, tạo tiền đề cho bước đầu

khảo sát lên men fed-batch gián đoạn thu nhận L-lysine ở quy mô phòng thí nghiệm.

6. Đóng góp của luận văn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các thông số tối ưu của quá trình lên

men batch và bước đầu thử nghiệm lên men fed-batch. Kết quả này sẽ là tiền đề cho các

nghiên cứu tiếp theo.

7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

Về mặt khoa học: đề tài góp phần khẳng định ưu điểm của phương pháp lên men

fed-batch trong lên men tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thu nhận amino

acid L-lysine.

Về mặt thực tiễn: cải thiện quá trình lên men thu nhận L-lysine.

3

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine

1.1.1. Khái niệm

“Lên men” là thuật ngữ được sử dụng từ khá lâu, có nguồn gốc từ tiếng La tinh

“fervere” có nghĩa là “làm chín” để chỉ hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây

hoặc ngũ cốc. Trong lĩnh vực hóa sinh, lên men được hiểu là sự tạo thành năng lượng từ

các quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, trong lĩnh vực vi sinh vật học, cụm

từ này lại được dùng để chỉ chung cho quá trình tạo ra sản phẩm bằng cách nuôi cấy vi

sinh vật thích hợp [28].

1.1.2. Quá trình lên men

Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kỵ khí. Quá

trình lên men bắt đầu từ sự phân giải các hợp chất chứa carbohydrate thành đường

glucose và kết thúc là sự tạo thành CO2 và một số hợp chất chứa carbon chưa được oxy

hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic,... Người ta thường dùng tên sản phẩm điển hình

tích lũy trong từng loại lên men để gọi quá trình lên men ấy. Ví dụ, quá trình lên men

tích lũy chủ yếu acid lactic thì gọi là lên men lactic (muối dưa, cà, làm sữa chua). Tuy

nhiên, có nhiều vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa không hoàn toàn cơ chất tạo ra

những sản phẩm giống như lên men kỵ khí, quá trình này cũng được gọi là lên men mà

thực chất là oxy hóa hiếu khí. Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa

quan trọng trong công nghiệp lên men, vì đã tạo ra những sản phẩm có giá trị [2].

1.1.3. Các hình thức lên men

Tùy theo cách phân loại mà có nhiều hình thức lên men khác nhau:

Theo tính chất môi trường: lên men dạng lỏng, lên men dạng rắn và bán rắn.

Theo đặc tính sử dụng oxy của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí và lên men kỵ

khí.

Theo trạng thái: lên men tĩnh (không khuấy trộn hay sục khí) và lên men động (có

khuấy trộn hoặc sục khí).

Theo mức độ kiểm soát của quy trình: lên men có kiểm soát (kiểm soát độ tạp

nhiễm, nồng độ cơ chất, pH…) và lên men không kiểm soát (tự nhiên).

4

Theo kỹ thuật lên men: lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục (continous) và

lên men dạng bán liên tục (fed-batch hay dạng mẻ có bổ sung).

Trong phần này, chúng tôi sẽ đề cập sâu hơn đến ba kỹ thuật lên men, đó là lên

men theo mẻ (batch), lên men liên tục và lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-

batch).

1.1.3.1. Lên men theo mẻ

Lên men theo mẻ hay còn gọi là lên men batch. Đây là phương pháp nuôi cấy mà

trong suốt thời gian nuôi cấy, ta không thêm vào chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ

các sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất, ngoại trừ ammoniac được thêm vào

để điều chỉnh pH (nếu có) [12], quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng không

gian nhất định. Vi sinh vật bắt buộc phải trải qua các pha sinh trưởng: pha lag, pha log,

pha ổn định và pha suy vong [2, 28].

Trong giai đoạn đầu (pha lag), gần như không có sự tăng trưởng đáng kể nào xảy

ra, chủ yếu là sự thích nghi của tế bào với môi trường mới. Trong thực tế sản xuất, cần

phải rút ngắn thời gian của pha này càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh

chóng bước vào pha tăng trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn.

Sau giai đoạn thích nghi là giai đoạn tăng trưởng và dần đạt đến tốc độ tối đa (pha

log) [28]. Sự tăng trưởng trong pha log được biểu diễn theo phương trình sau:

dx/dt = µx (1.1)

Trong đó: x là sinh khối vi sinh vật tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc độ

tăng trưởng (/giờ). Hằng số µ khác nhau tùy vào từng giai đoạn trong chu kỳ tăng

trưởng.

Từ phương trình (1.1) ta có:

dx/x = µdt

𝑡 𝑡  lnxt – lnxto = µ(t-to) 𝑡𝑡 𝑡𝑡 ∫ 𝑑𝑑/𝑑 µ ∫ 𝑑𝑑 Trong đó, xto là lượng sinh khối ban đầu, xt là lượng sinh khối sau khi nuôi cấy t

 =

giờ.

Trong pha log, chất dinh dưỡng còn nhiều, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật

trong điều kiện tối ưu nhất sẽ có µmax khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc rất lớn

5

vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và các sản phẩm do quá trình sinh

trưởng của chính vi sinh vật tạo ra. Nếu duy trì việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường

nuôi cấy ở pha log thì tăng trưởng vẫn đạt được tốc độ cao.

Sự tăng số lượng tế bào trong pha log diễn ra theo cấp số nhân với cơ số 2 theo

phương trình sau:

N = N0. 2n

Với N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ

 lg(N/N0) = n.lg2

 n = lg(N/N0). 1/0,301  n = lg(N/N0). 3,32

Thời gian thế hệ được tính bằng công thức sau:

tg = t/n

với t là thời gian vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ.

Hằng số tốc độ phân chia K là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy:

K = n/t

Pha cân bằng, lượng sinh khối tạo thành có thể được tính bằng công thức:

x = Y.(si – sr)

Trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm

lượng cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại. Sự tăng trưởng sẽ ngừng lại (µ

=0) khi sr = 0 hoặc trong môi trường nuôi cấy có sự tích lũy những chất độc đối với vi

sinh vật. Giá trị Y giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một đơn vị cơ chất thành sinh

khối vi sinh vật. Có thể dùng Y để tính toán một lượng cơ chất cần thiết để thu được

một lượng sinh khối nhất định. Y thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy như: nhiệt

độ, pH, lượng oxy, giới hạn nồng độ cơ chất…Theo Monod (1942), sự suy giảm tăng

trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào hàm lượng cơ chất được thể hiện qua phương

trình:

µ = µmax. sr/(Ks+sr)

Trong đó, Ks là hằng số sử dụng cơ chất. Khi sr = 0 thì µ = 0, nghĩa là vi sinh vật

bước vào giai đoạn cân bằng trong chu kỳ sinh trưởng. Đối với một cơ chất nhất định,

mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau [28].

6

Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa. Nguyên nhân

là do điều kiện bất lợi của môi trường như: nguồn dinh dưỡng cạn kiệt làm giảm quá

trình trao đổi chất, sự tích lũy một số sản phẩm trao đổi chất gây độc cho vi sinh vật

(acid) và một số enzyme (amilaza, proteinaza…) ngoài chức năng xúc tác các quá trình

tổng hợp còn tham gia vào quá trình phân giải tế bào vi sinh vật. Các nguyên nhân trên

dẫn đến sự chết của hàng loạt các tế bào [2].

Kỹ thuật lên men theo mẻ (batch) được sử dụng để sản xuất sinh khối, sản phẩm

sơ cấp và sản phẩm thứ cấp. Hiện nay, phương pháp này vẫn đang được sử dụng phổ

biến do có một số ưu điểm sau: đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổ sung thêm bất

kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, vì vậy, giảm khả năng bị nhiễm cũng như

chi phí. Tuy nhiên, phương pháp này cho sản lượng thấp do vi sinh vật không được

cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanh chóng bước vào pha suy vong khi nguồn

cơ chất cạn kiệt. Để nâng cao sản lượng, ta cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng trong

suốt pha sinh trưởng của vi sinh vật. Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch)

và lên men liên tục đã khắc phục được nhược điểm của lên men theo mẻ.

1.1.3.2. Lên men liên tục

Trong nuôi cấy theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua 4 pha tuần tự: pha thích nghi (pha

lag), pha tăng trưởng (pha log), pha cân bằng và pha suy vong, nhưng đối với nuôi cấy

liên tục, pha log được duy trì bằng cách bổ sung liên tục nguồn dinh dưỡng vào nồi lên

men và một lượng dịch chứa vi khuẩn tương ứng được lấy ra. Khi đó, tốc độ nạp liệu và

tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ

nạp liệu [28]. Dòng chất dinh dưỡng nạp vào nồi lên men có liên quan đến thể tích nồi

lên men theo tốc độ pha loãng giới hạn (D) theo công thức sau:

D = F/V

Trong đó, F là tốc độ nạp liệu (L/giờ), V là thể tích nồi lên men (L), D là tốc độ

pha loãng hay hệ số pha loãng. Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ [2].

Tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong nồi lên men được biểu diễn qua phương

trình:

v+ = dx/dt = µx

7

Nếu vi sinh vật ngừng sinh trưởng, phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi nồi lên men với

tốc độ:

v− = - dx/dt = Dx

Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi sinh vật trong nồi lên men

trong nuôi cấy liên tục là sự chênh lệch giữa tốc độ tăng v+ và tốc độ giảm v−:

v = v+ - v− = (µ-D)x

Nếu µ>D thì v mang giá trị dương, nghĩa là mật độ vi sinh vật tăng. Ngược lại, nếu

µ

0, nghĩa là mật độ tế bào không tăng cũng không giảm, quần thể vi sinh vật ở trạng thái

cân bằng động học. Nếu nồi lên men có thiết bị giúp duy trì cho µ = D ta sẽ thu được

quần thể vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa thường xuyên ở một mật độ

tế bào không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Làm được như vậy, không những

trạng thái sinh lý tế bào mà cả môi trường nuôi cấy đều ổn định và không phụ thuộc vào

thời gian. Điều này tạo điều kiện cho nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý tế bào [2].

Trong nuôi cấy liên tục còn chia thành nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:

Nuôi cấy dạng đa hệ thống: dịch chiết ra từ hệ thống lên men này sẽ được đưa

ngay vào một hệ thống lên men khác. Như vậy, có thể thay đổi được nguồn nguyên liệu

trong các giai đoạn khác nhau trong quá trình nuôi cấy.

Hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: dịch chiết ra trong quá trình lên

men, ngoài sản phẩm còn có một lượng lớn tế bào vi khuẩn. Nếu lượng tế bào này được

thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ làm tăng sản lượng lên men. Có thể

dùng phương pháp lọc hoặc ly tâm tách tế bào rồi bổ sung ngược lại vào nồi lên men.

Tuy nhiên, vấn đề chống tạp nhiễm là một trở ngại lớn khi thực hiện kiểu nuôi cấy này.

Kỹ thuật lên men liên tục bắt đầu bằng một mẻ (batch), khi tế bào vi sinh vật bước

vào pha log, quá trình lên men được chuyển từ nuôi cấy theo mẻ sang liên tục [12].

Nuôi cấy liên tục làm tăng đáng kể sản lượng mà không cần thêm nhiều bình lên

men. Điều này không những giảm chi phí sản xuất mà còn giảm chi phí đầu tư. Hirao và

cộng sự (1989) đã nuôi cấy liên tục chủng Corynebacterium glutamicum B-6 thu nhận

L-lysine. Chủng có thể sản xuất L-lysine ổn định trong 300 giờ với sản lượng 105g/L và

năng suất 5,6g/L/giờ. Trong đó, với hình thức lên men theo mẻ có bổ sung, sản lượng L-

8

lysine chỉ đạt 100g/L trong 48 giờ, năng suất không vượt quá 2,1g/L/giờ. Nghĩa là năng

suất khi lên men liên tục gấp 2,5 lần lên men theo mẻ có bổ sung [12].

Mặc dù cho năng suất cao hơn hẳn nhưng nuôi cấy liên tục vẫn có những hạn chế

sau:

Vấn đề tạp nhiễm là một trở ngại lớn trong suốt quá trình vận hành.

Nuôi cấy liên tục diễn ra trong một thời gian dài nên dễ xảy ra hiện tượng đột biến

ngẫu nhiên ở vi sinh vật. Các chủng đột biến phát triển nhanh hơn chủng bố mẹ trong

cùng điều kiện nuôi cấy nên cạnh tranh dinh dưỡng, dẫn đến giảm năng suất.

Một số quá trình lên men thu nhận amino acid (lysine) chia thành 2 pha rõ rệt: pha

tăng trưởng và pha sinh tổng hợp. Nuôi cấy liên tục có thể đạt năng suất không cao bằng

nuôi cấy theo mẻ hoặc theo mẻ có bổ sung do tế bào luôn bị giữ ở pha tăng trưởng [12].

Ngoài ra, quá trình lên men diễn ra trong thời gian dài sẽ tiêu tốn nhiều công sức

và nguyên liệu, do đó, năng suất cao nhưng chưa phải hiệu suất đã cao. Vì vậy cần cân

nhắc kỹ trước khi lựa chọn phương pháp này.

1.1.3.3. Lên men fed-batch

Lên men fed-batch còn gọi lên men theo mẻ có bổ sung, là hình thức trung gian

giữa lên men theo mẻ (batch) và lên men liên tục, trong đó, nguyên liệu được nạp vào

nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, sản phẩm chỉ được lấy ra khi quá trình kết thúc.

Tuy nhiên, dịch lên men cũng có thể được chiết ra trong quá trình vận hành.

Fed-batch ban đầu cũng như lên men batch nhưng sau một thời gian sẽ bổ sung

thêm môi trường mới với hàm lượng chất dinh dưỡng được kiểm soát trong suốt quá

trình nuôi cấy cho đến khi đạt được lượng sản phẩm tối đa [12]. Nguồn dinh dưỡng nạp

vào có thể giống môi trường nuôi cấy ban đầu hoặc là nguồn cơ chất. Đối với cơ chất,

nồng độ có thể tương đương môi trường ban đầu, hoặc cao hơn hoặc rất đậm đặc. Vì

vậy, lên men fed-batch thường cho năng suất cao hơn lên men batch trong cùng thời

gian và điều kiện lên men. Có thể chia hình thức lên men này thành 2 kiểu: lên men theo

mẻ bổ sung thay đổi thể tích và lên men theo mẻ bổ sung không thay đổi thể tích.

9

a. Lên men theo mẻ có bổ sung thay đổi thể tích

Hình thức lên men này, nguồn dinh dưỡng bổ sung có thể là môi trường lên men

ban đầu hoặc cơ chất có nồng độ tương đương môi trường ban đầu, khi bổ sung vào sẽ

làm thay đổi thể tích dịch lên men. Sinh khối tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình lên

men được trình bày theo phương trình:

xt = x0 + Y(si – sr)

trong đó, x0 là nồng độ giống nạp vào ban đầu. Khi sr = 0 và xt = xmax do x0<< xmax thì:

xmax = Y.si

Nếu tại thời điểm sr = 0, môi trường được bổ sung vào với D < µmax thì toàn bộ cơ

chất mới bổ sung vào được sử dụng ngay. Ta có:

F.si = µ.(X/Y) với X = x.V (X là tổng sinh khối)

Có thể thấy, tổng sinh khối tăng dần nhưng nồng độ tế bào hầu như không tăng.

Do vậy, µ = D. Đây được xem là trạng thái cân bằng. Khi thể tích dịch lên men tăng, tỷ

lệ pha loãng giảm thì:

D = F/(V0 + F.t)

Theo phương trình Monod, khi sr giảm thì D cũng giảm nên x sẽ tăng. Tuy nhiên,

trong hệ thống nuôi cấy theo mẻ bổ sung, ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si>> Ks nên trong

thực tế, sr thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái cân bằng ổn định, D < µmax và Ks << si

[28].

b. Lên men theo mẻ có bổ sung không thay đổi thể tích

Đối với hình thức lên men theo mẻ có bổ sung thay đổi thể tích, cơ chất được bổ

sung với nồng độ cao nên không làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men. Động học

hệ thống này được thể hiện qua phương trình:

dx/dt = G.Y

trong đó, G là tốc độ nạp cơ chất.

Do dx/dt = µx nên:

µx = GY

 µ = GY/x

Nếu GY/x <µmax thì khi nạp thêm cơ chất sẽ được sử dụng ngay. Tuy nhiên, do

dx/dt > 0 nên:

10

xt = x0 +G.Y.t

Ngoài cách phân loại trên thì lên men theo mẻ có bổ sung còn được phân loại

theo kiểu nạp cơ chất, đó là lên men theo mẻ bổ sung liên tục và bổ sung gián đoạn. Đối

với lên men theo mẻ bổ sung liên tục, chất dinh dưỡng trong bình dự trữ được nạp vào

bình lên men với tốc độ không đổi. Nhờ hệ thống thông khí và khuấy cơ học, bình lên

men được cung cấp đầy đủ oxy, đảm bảo việc phân bố nhanh và đồng đều chất dinh

dưỡng trong dòng môi trường đi vào. Đối với lên men theo mẻ bổ sung gián đoạn, chất

dinh dưỡng mới được bổ sung vào bình lên men theo từng thời điểm đã được khảo sát.

Hình thức lên men theo mẻ có bổ sung đã giải quyết được một số nhược điểm của

lên men theo mẻ:

Trong công nghệ lên men amino acid thường đòi hỏi hàm lượng cơ chất cao để thu

được sản lượng cao. Hàm lượng đường cao trong dịch nuôi cấy ban đầu sẽ ức chế sự

sinh trưởng của tế bào vi khuẩn hoặc làm giảm lượng sản phẩm do sự hình thành các

sản phẩm khác như acetate và lactate. Nếu bắt đầu quá trình nuôi cấy với hàm lượng

đường thấp và bổ sung theo thời điểm thì pha lag có thể được rút ngắn, từ đó làm tăng

sản lượng.

Đối với những chủng đột biến khuyết dưỡng, nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu

quá cao sẽ làm tế bào sinh trưởng quá mức hoặc gây ra ức chế ngược, làm giảm sản

lượng. Trong trường hợp này, việc bổ sung chất dinh dưỡng theo mẻ với tỷ lệ nhất định

sẽ giúp thu được sản lượng tối đa. Hình thức này đã được sử dụng trong nuôi cấy chủng

Corynebacterium glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng thu L-phenylalanine và L-

tyrosine.

Nồng độ chất dinh dưỡng ban đầu cao gây ra sự phát triển quá nhanh của vi sinh

vật ở pha log, dẫn đến nhu cầu oxy của chúng vượt quá lượng oxy hiện có trong bình

lên men, làm giảm sản lượng. Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung giúp giữ hàm lượng

cơ chất ở mức dưới ngưỡng ức chế để cấp cho vi sinh vật trong quá trình sinh tổng hợp.

Lên men theo mẻ có bổ sung giúp giảm được vấn đề về nhiễm và đột biến so với

lên men liên tục, đạt năng suất cao hơn so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất.

Có nhiều nghiên cứu sản xuất amino acid được tiến hành bằng hình thức lên men vi sinh

11

vật theo mẻ có bổ sung. Kết quả cho thấy, lượng amino acid thu được bằng hình thức

này cao hơn nhiều so với lên men theo mẻ không bổ sung cơ chất [12].

Tuy nhiên, lên men fed-batch dạng liên tục đòi hỏi phải có thiết bị để kiểm soát

các yếu tố trong quá trình lên men, đồng thời đòi hỏi kỹ năng vận hành thiết bị lên men,

điều khiển quá trình. Các yếu tố cần được kiểm soát trong khi vận hành hệ thống là: tạp

nhiễm, sự tăng trưởng tế bào, pH, nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan, kiểm soát bọt, tốc

độ nạp liệu.

Có thể nói, hình thức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) đã khắc phục được

một số nhược điểm của lên men dạng mẻ và lên men liên tục. Bên cạnh đó, qua tổng

quan tài liệu, chúng tôi nhận thấy hình thức này phù hợp với mục đích thu nhận amino

acid L-lysine từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum. Vì vậy, chúng tôi chọn hình

thức lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) để nâng cao năng suất thu nhận L-lysine

trong đề tài này.

1.2. Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium glutamicum được biết đến đầu tiên với vai trò là chủng chuyên

sản xuất acid glutamic, được phát hiện bởi một nhóm các nhà nghiên cứu người Nhật

vào giữa những năm 1950. Đầu tiên, Corynebacterium glutamicum có tên gọi

Micrococcus glutamicus No.534, sau này đổi thành Corynebacterium glutamicum [9].

Nghiên cứu sâu hơn về Corynebacterium glutamicum, các nhà khoa học đã khám phá ra

rằng, ngoài khả năng tiết acid glutamic, Corynebacterium glutamicum còn tiết nhiều

loại amino acid khác vào môi trường nuôi cấy như: lysine, methionine, arginine,

threonine…

Ngày nay, Corynebacterium glutamicum là một trong những vi khuẩn quan trọng

trong công nghiệp, sản xuất 2 triệu tấn amino acid mỗi năm, trong đó có khoảng 0,6

triệu tấn L-lysine [9]. Các nghiên cứu về Corynebacterium glutamicum vẫn đang được

các nhà khoa học trong và ngoài nước thực hiện với mục đích nâng cao năng suất thu

nhận amino acid, chủ yếu dựa trên kỹ thuật di truyền.

12

1.2.1. Đặc điểm hình thái và vị trí phân loại

Dưới kính hiển vi phóng đại 400-1000 lần, tế bào Corynebacterium glutamicum có

dạng hình que ngắn điển hình, không đều. Tế bào sắp xếp dạng hình chữ V, một số xếp

song song, không di động, không hình thành bào tử [9].

Tế bào bắt màu tím khi nhuộm Gram và cho hiện tượng kéo sợi khi phản ứng với

dung dịch KOH 3%, chứng tỏ Corynebacterium glutamicum thuộc nhóm vi khuẩn

Gram (+).

Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch có dạng tròn đầy, trơn bóng, màu vàng nhạt,

kích thước 1-1,5 mm (sau một ngày nuôi cấy).

(a) (b)

Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng trên môi trường

phức hợp. (b) Tế bào quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét [9].

Cấu tạo tế bào vi khuẩn có một lớp peptidoglycan dày, vách tế bào chứa arabino

galactan và acid mycolic có 26-36 carbon. Hàm lượng G:C là 54,1% [12].

Vị trí trong hệ thống phân loại của Corynebacterium glutamicum [37]:

Giới (kingdom): Bacteria

Ngành (phylum): Actinobacteria

Lớp (class): Actinobacteria

Bộ (order): Actinomycetales

Họ (family): Corynebacteriaceae

Chi (genus): Corynebacterium

Loài (species): Corynebacterium glutamicum

13

1.2.2. Đặc điểm sinh lý

Corynebacterium glutamicum thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí, cần oxy hòa tan để

sinh trưởng và sinh L-lysine. Trong quá trình sống, vi khuẩn hiếu khí và hiếu khí tùy

tiện sản sinh ra hydroxygen peroxide (H2O2). Chất này gây độc cho hệ enzyme của vi

khuẩn. Để tồn tại, vi khuẩn tiết ra enzyme catalase phân hủy H2O2 thành H2O và O2 gây

hiện tượng sủi bọt khí. Đây là cơ sở để xác định vi khuẩn hiếu khí bằng cách cho phản

ứng với H2O2. Dựa vào đặc điểm này để có biện pháp cung cấp lượng oxy đầy đủ cho

chủng sinh trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm.

Corynebacterium glutamicum có giới hạn nhiệt độ rộng, khoảng 28-400C nhưng

sinh trưởng tốt nhất ở 300C [7].

Chủng nghiên cứu có khả năng sinh trưởng ở điều kiện pH 6,5-8 nhưng pH thích

hợp cho sự sinh L-lysine là 7,0 [7].

1.2.3. Đặc điểm sinh hóa

Corynebacterium glutamicum có thể sinh trưởng và sinh L-lysine trên nhiều nguồn

carbon khác nhau: glucose, sucrose, fructose, acid acetic, ethanol… Các tác giả Kiefer

(2002, 2004) [20, 21], Stefan (2011) [16] đã nuôi cấy Corynebacterium glutamicum trên

3 nguồn cơ chất khác nhau: glucose, sucrose và fructose. Các tác giả thấy rằng trên

những nguồn cơ chất này, Corynebacterium glutamicum đều sinh trưởng và sinh L-

lysine, tuy nhiên, khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine trên môi trường glucose là

mạnh nhất.

Nghiên cứu của J. Pelechova (1980) cho thấy, Corynebacterium glutamicum còn

có khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine trên nguồn cơ chất là ethanol và acid acetic

[26].

Gluconate cũng được Corynebacterium glutamicum sử dụng như nguồn carbon

thứ hai khi nuôi cấy trong môi trường chứa hỗn hợp glucose và gluconate [23].

Ngoài ra, Corynebacterium glutamicum còn có khả năng sử dụng mật rỉ đường và

tinh bột bắp thô làm cơ chất để sản sinh L-lysine [31, 35].

Hàm lượng carbon trong môi trường nuôi cấy dao động xung quanh 10% (w/v) là

thích hợp nhất. Hàm lượng quá thấp hay quá cao đều ức chế sự sinh trưởng và sản sinh

L-lysine của vi khuẩn.

14

Về nhu cầu nitơ, Corynebacterium glutamicum có khả năng đồng hóa nguồn nitơ

vô cơ như urê, muối amoni và nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men, pepton. Muối

amoni thường được sử dụng cho nuôi cấy Corynebacterium glutamicum thu L-lysine

với hàm lượng 1-4%.

Trong quá trình sinh trưởng cũng như sinh L-lysine, Corynebacterium glutamicum

cần cung cấp một số loại khoáng vô cơ như K, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn…, các nguồn này

được cung cấp từ các loại muối khoáng như KH2PO4, MgSO4, FeSO4, CuSO4,

ZnSO4...Nhu cầu của vi khuẩn về những nguyên tố này rất ít, chỉ vài mg/L.

Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn khuyết dưỡng biotin, cần biotin và cả

thiamine cho quá trình sinh trưởng và sinh L-lysine. Người ta đã chứng minh được rằng

một lượng nhất định biotin sẽ làm tăng sự sản sinh L-lysine do tăng cường hoạt động

của pyruvate carboxylase, một trong hai enzyme phụ thuộc biotine [27]. Peter và

Wendisch (2012) đã tăng cường biểu hiện gen BirA (được coi là biotin protein ligase) ở

chủng Corynebacterium glutamicum 13032 đã thu được lượng L-lysine cao gấp hai lần.

Tuy nhiên, hàm lượng biotine quá cao sẽ tạo thành alanin, aspartic và acid lactic nhiều,

ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận L-lysine.

Trong công nghiệp lên men, người ta sử dụng mật rỉ đường hay dịch bắp để làm

nguồn cung cấp carbon rẻ tiền, vừa làm nguồn cung cấp nitơ và các vitamin.

1.2.4. Đặc điểm di truyền

Trình tự gen của Corynebacterium glutamicum bắt đầu được nghiên cứu vào

khoảng giữa những năm 1980, khi mà một vài gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp

amino acid của vi khuẩn này được tạo dòng và phân tích. Những hiểu biết về bộ gen của

Corynebacterium glutamicum sẽ là nguồn thông tin giá trị cho khoa học cơ bản cũng

như ứng dụng công nghiệp [9].

15

Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 [9].

Bằng việc sử dụng kỹ thuật di truyền phân tử và phần mềm tin sinh học, nhóm

nghiên cứu thuộc khoa Di truyền học trường Đại học Bielefeld, Đức hợp tác với công ty

Degussa, Đức đã giải mã hoàn chỉnh bộ gen của Corynebacterium glutamicum. Bộ gen

là phân tử DNA dạng vòng, đơn, gồm 3.282.708 bp với 3.002 gen mã hóa protein [9,

20]. Trong số những gen này có hai gen quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp L-

lysine, đó là: gen lysC mã hóa enzyme aspartate kinase (enzyme chìa khóa trong chuỗi

phản ứng sinh tổng hợp L-lysine) và gen lysE mã hóa cho enzyme permease có vai trò

giải phóng lysine nội bào ra ngoài.

16

Tiểu phần β

Tiểu phần α

Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα và lysCβ được cấu tạo

bởi bốn chuỗi poplypeptide giống hệt nhau [12].

Như vậy, có nhiều chủng có khả năng tham gia tổng hợp L-lysine nhưng

Corynebacterium glutamicum là chủng được nghiên cứu và sử dụng trong công nghiệp

nhiều hơn cả do dễ nuôi cấy, chịu được nhiệt độ cao trong điều kiện nuôi cấy công

nghiệp, có khả năng sinh trưởng tốt trên những nguồn nguyên liệu tự nhiên rẻ tiền.

Trong phạm vi đề tài, chúng tôi sử dụng chủng Corynebacterium glutamicum -B- 0632

từ trung tâm lưu giữ giống Đại học Quốc Gia Hà Nội đã được sàng lọc để sản xuất L-

lysine [29, 30].

1.3. Amino acid L-lysine

1.3.1. Đặc điểm

Lysine là một α-amino acid thuộc nhóm aspartate. Công thức hóa học của lysine là

C6H14N2O2, khối lượng phân tử 146 g/mol. Codon mã hóa cho lysine là AAA và AAG.

Lysine còn có tên gọi khác là 2,6-diaminohexanoic acid.

17

Hình 1.4 Cấu trúc không gian và cấu tạo phân tử của lysine [36].

Lysine có hai dạng đồng phân quang học là D và L, trong đó cơ thể sinh vật chỉ

hấp thụ được dạng L.

L-lysine tồn tại ở dạng tinh thể trong điều kiện bình thường, có màu xanh tím khi

tương tác với ninhydrin.

Trong dịch lên men, L-lysine dễ bị phân hủy, vì thế dịch sau khi ly tâm thường

được bổ sung đệm citrate pH 5 nhằm mục đích bảo quản L-lysine.

1.3.2. Vai trò và ứng dụng

1.3.2.1. Vai trò

Lysine là thành phần không thể thiếu của các protein trong cơ thể, đóng vai trò

quan trọng trong việc hấp thụ canxi, tạo cơ bắp, phục hồi sau chấn thương hay sau phẫu

thuật. Lysine còn tham gia vào quá trình tổng hợp enzyme, hormone và kháng thể.

Cơ thể người và động vật, đặc biệt là trẻ em và động vật còn non nếu thiếu lysine

sẽ chậm lớn, trí não kém phát triển. Do đó, lysine thường được bổ sung vào khẩu phần

ăn của trẻ và của gia súc [4].

Lysine thuộc nhóm amino acid không thay thế, nghĩa là cơ thể người và động vật

không tự tổng hợp được mà phải lấy từ thức ăn. Nguồn thức ăn chứa nhiều lysine là thịt

(thịt cừu, thịt gia cầm), trứng, sữa, pho mát và một vài loại cá. Lysine cũng có nhiều

trong ngũ cốc, đậu nành. Tuy nhiên, lysine dễ bị phân hủy trong quá trình chế biến.

18

1.3.2.2. Ứng dụng

Hàng năm, lượng L-lysine được sản xuất trên toàn thế giới lên tới 600.000 tấn.

Vào năm 2000, lượng L-lysine được sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm đạt xấp xỉ

550.000 tấn và hứa hẹn tiềm năng tăng trưởng mỗi năm sẽ đạt 7-10% [12].

Có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước được tiến hành để đánh giá ảnh hưởng

của việc bổ sung L-lysine vào thức ăn chăn nuôi.

R.M. Gous và T.R. Morris (1985) đã tiến hành thí nghiệm trên những con gà trống

thịt ở độ tuổi từ 1-3 tuần để xác định phản ứng của chúng đối với hàm lượng lysine. Kết

quả cho thấy lysine trong khẩu phần ăn làm tăng trọng lượng của những con gà này, cụ

thể 65 mg/g protein tăng trọng [14].

Vào năm 1990, tác giả D. Hickling và cộng sự đã tìm hiểu ảnh hưởng của lysine

lên năng suất thịt ức của các con gà trống thịt (Ross x Arbor Acress). Lysine được bổ

sung vào khẩu phần ăn trong giai đoạn 0-3 tuần và 3-6 tuần tuổi. Từ kết quả thu được,

tác giả kết luận rằng, việc tăng 12% lysine (tương ứng 4g) trong khẩu phần ăn sẽ làm

tăng 15-20g thịt ức [18].

B.Leclercq (1998) đã nghiên cứu ảnh hưởng của L-lysine đối với sản lượng thịt

gia cầm. Tác giả thấy rằng lysine cần cho sự tăng sản lượng thịt ức ở gia cầm [22].

Trong nước cũng có một số nghiên cứu về vấn đề này, tiêu biểu phải kể đến hai

nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Hoa Lý, Lê Đức Ngoan và Lê Khắc Huy

(1996). Để nâng cao khả năng sản xuất trứng của giống gà Brown Nick, các tác giả trên

đã nghiên cứu bổ sung L-lysine vào khẩu phần ăn của giống gà này. Đối tượng nghiên

cứu là giống gà đẻ Brown Nick 29 tuần tuổi ở Xí nghiệp gà đẻ Thanh Vinh (Quảng

Nam-Đà Nẵng). Tỉ lệ bổ sung L-lysine là 0,05%; 0,1% và 0,15%. Kết quả thu được như

sau:

- Tỉ lệ đẻ và sản lượng trứng tăng 2,6 - 5,9%.

- Trọng lượng trứng, hiệu quả sử dụng proterin tăng 7,08 -14,7%.

- Giảm tiêu tốn thức ăn cho sản xuất trứng 3,3 - 8,4%.

- Giảm chi phí protein cho tạo trứng 7,8 - 13,7%.

- Giảm giá thành cho sản xuất 1 kg trứng 5,28 – 7,3% [5].

19

Nhằm tăng trọng lượng thịt ở gà thịt AE, các tác giả trên cũng đã nghiên cứu bổ

sung L-lysine và DL-methionine vào khẩu phần ăn của giống gà này. Đối tượng nghiên

cứu là giống gà thịt AE từ 0-9 tuần tuổi nuôi tại Xí nghiệp gà Quân khu V (Quảng Nam-

Đà Nẵng). Kết quả thu được như sau:

- Bổ sung L-lysine và DL-methionine với các mức 0,04 – 0,19% và 0,08 – 0,13%

(giai đoạn gà 0-4 tuần tuổi), 0,12 -0,27% và 0,06 -0,12% (giai đoạn 5-9 tuần tuổi) làm

tăng trọng lượng gà từ 10,24 – 11,43%, giảm tiêu tốn thức ăn 7,2-10,4%, tăng hiệu quả

sử dụng protein 7,03-10,5%, giảm chi phí thức ăn 4,75-5,31%.

- Mức bổ sung L-lysine 0,19% và DL-methionine 0,13% (0-4 tuần tuổi), 0,27% L-

lysine và 0,12% DL- methionine (5-9 tuần tuổi) đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất.

- Tỉ lệ lysine và methionine tối ưu cho gà thịt AE là 1,25:0,5 (0-4 tuần tuổi);

1,1:0,44 (5-9 tuần tuổi) [6].

Ngoài ra, L-lysine cũng được sản xuất thương mại dưới dạng viên uống bổ sung

cho trẻ em giúp tăng khả năng tiêu hóa, ăn ngon miệng.

1.3.3. Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn

Có nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh L-lysine như:

- Micrococcus glutamicum

- Brevibacterium flavum

- Brevibacterium lactofermentum

- Corynebacterium acetophilum

- Corynebacterium glutamicum [4]

Tuy nhiên, Corynebacterium glutamicum là chủng được sử dụng rộng rãi trong

nghiên cứu thực nghiệm cũng như trong công nghiệp do dễ nuôi cấy, sinh trưởng tốt và

sinh L-lysine trên nguồn cơ chất rẻ tiền như rỉ đường, dịch bắp.

20

Glucose Con đường EMP

Pyruvate

ATC

Oxaloacetate

Aspartate

β - Aspartyl- phosphate

Aspatate -β- semialdehyte

Homogerin

Lysine Isoleucine Threonine Methionine

Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine ở vi khuẩn [4].

Lysine được tạo thành đồng thời với methinonine và threonine, đây là hai chất ức

chế ngược quá trình sinh tổng hợp lysine. Sự ức chế này khá nhạy, vì thế lượng lysine

được tạo ra rất ít, chỉ vừa đủ cho vi sinh vật sử dụng. Những vi sinh vật được con người

sử dụng để sinh tổng hợp thừa L-lysine là những chủng được gây đột biến, thường là

đột biến khuyết dưỡng methionine và threonine để không có khả năng tổng hợp hai chất

này, từ đó sinh tổng hợp thừa L-lysine.

1.3.4. Bản chất quá trình sinh tổng hợp L-lysine ở vi khuẩn Corynebacterium

glutamicum

Các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp L-lysine đều đồng hóa được glucose,

sucrose, fructose, saccharose. Tuy nhiên, chúng không đồng hóa được lactose, rafinose

và pentose [4]. Con đường chuyển hóa cơ chất thành L-lysine được thể hiện ở sơ đồ

dưới đây.

21

Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine ở Corynebacterium glutamicum [13].

22

Cơ chất được vận chuyển từ môi trường ngoài vào trong cytosol nhờ các kênh

protein vận chuyển. Tại đây, cơ chất được biến đổi thành glucose. Trải qua một loạt các

phản ứng, pyruvate được hình thành, sau đó biến đổi thành oxaloacetate. Oxaloacetate

biến đổi thành aspartate - tiền chất trong quá trình sinh tổng hợp L-lysine. Phản ứng mở

đầu cũng là phản ứng quan trọng nhất trong quá trình này là từ aspartate thành aspartyl

phosphate dưới sự xúc tác của enzyme aspartate kinase do gen lysC mã hóa [12]. Vì lý

do nào đó, phản ứng đầu tiên không diễn ra thì cả quá trình cũng không thể diễn ra. Vì

vậy, enzyme aspartate kinase trở thành enzyme then chốt trong con đường sinh tổng hợp

L-lysine. Aspartyl phosphate tiếp tục được biến đổi thành aspartate semialdehyte. Từ

đây, con đường tổng hợp được chia thành hai nhánh: một nhánh tổng hợp methionine và

threonine, một nhánh tổng hợp lysine. Theo nhánh thứ nhất, methionine và threonine

được hình thành từ homoserine. Nhánh thứ hai tổng hợp lysine xảy ra đồng thời với

nhánh thứ nhất. Sau khi L-lysine nội bào hình thành sẽ được tiết ra ngoài gọi là L-lysine

ngoại bào nhờ enzyme permease do gen lysE mã hóa. Như vậy, sản phẩm cuối cùng của

quá trình sinh tổng hợp L-lysine không chỉ có L-lysine mà còn có methionine và

threonine, đây là hai chất ức chế ngược đối với quá trình này. Cụ thể, methionine và

threonine sẽ ức chế sự hoạt động của enzyme aspartate kinase bằng cách thay đổi cấu

trúc trung tâm hoạt động của enzyme, khiến enzyme không gắn được với cơ chất, phản

ứng đầu tiên không diễn ra. Kết quả là quá trình sinh tổng hợp dừng lại, không tiếp tục

sản sinh L-lysine. Đây là cơ chế vi sinh vật sản xuất vừa đủ lượng amino acid cần cho

hoạt động sống của chúng. Khi methionine và threonine được vi sinh vật sử dụng hết,

nhân tố ức chế không còn, quá trình sinh tổng hợp lại tiếp tục. Tuy nhiên, lượng L-

lysine sinh ra từ cơ chế này rất ít.

Để tạo ra chủng có khả năng sinh tổng thừa L-lysine, một số nghiên cứu đã gây

đột biến khuyết dưỡng homoserine đối với Corynebacterium glutamicum. Từ đó,

methionine và threonine không được tạo thành, con đường sinh tổng hợp chỉ đi theo

nhánh hai. Một hướng khác là tạo ra chủng đột biến mang gen lysC kháng ức chế

ngược hay không nhạy cảm với tín hiệu ức chế ngược. Năm 1990, gen lysC hoàn toàn

không nhạy cảm với ức chế ngược của chủng DM 58-1 đã được phân lập. Nghiên cứu

này đồng thời đưa ra mô hình cấu trúc chồng lấp của gen lysC bao gồm 2 tiểu đơn vị

23

lysCα và lysCβ, trong đó lysCβ chịu trách nhiệm kháng ức chế ngược. Việc tạo dòng

gen lysC kháng ức chế ngược trong chủng Corynebacterium glutamicum ATCC13032

hoang dại đã thu được lượng L-lysine 38mM, trong khi chủng bố mẹ cho sản lượng

không đáng kể [12]. Jetten và cộng sự (1995) đã phân tích ảnh hưởng của số lượng bản

sao gen lysC đột biến đến khả năng sinh trưởng và sinh L-lysine của chủng

Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799. Kết quả cho thấy, chủng mang hai bản

sao gen lysC đột biến đã sản xuất một lượng L-lysine lớn hơn nhiều so với chủng bố mẹ

[12].

Như vậy, để tăng khả năng sản xuất L-lysine của vi sinh vật, đa số tác giả chọn

giải pháp can thiệp vào hệ gen. Tuy nhiên, chủng đột biến có nhược điểm là dễ thoái

hóa, sản lượng không ổn định, gen đột biến dễ phát tán. Trong nghiên cứu này, chúng

tôi chọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch để nâng

cao năng suất thu nhận L-lysine.

1.3.5. Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium

glutamicum

1.3.5.1. Thiết kế môi trường lên men

Thiết kế môi trường lên men là bước rất quan trọng quyết định sự thành công

trong lên men vi sinh vật. Thành phần môi trường phải đảm bảo đủ lượng để phục vụ

cho việc tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp đủ năng lượng cho việc duy trì

mật độ tế bào cũng như sinh tổng hợp. Môi trường lên men được thiết kế tùy thuộc vào

yêu cầu của chủng vi sinh vật, phương pháp lên men và sản phẩm mục tiêu.

Phương trình cân bằng vật chất trong lên men được thể hiện như sau:

C + N + O2 + các yếu tố khác = sinh khối + sản phẩm + CO2 + H2O + nhiệt

Thành phần môi trường bao gồm các yếu tố đa lượng (C, N) và các yếu tố vi lượng

(muối khoáng, vitamine, chất kiểm soát…).

Dựa vào thành phần và hàm lượng các chất trong tế bào vi sinh vật để thiết kế

thành phần môi trường lên men. Trong tế bào vi sinh vật, C chiếm khoảng 50% trọng

lượng khô của tế bào. Các nguyên tố C, N, H, O chiếm tổng cộng khoảng 92%, còn lại

là các yếu tố vi lượng [2]. Những yếu tố có hàm lượng cao là những yếu tố ảnh hưởng

24

lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Vì vậy trong môi trường lên men,

hàm lượng C, N thường cao hơn rất nhiều so với các nguyên tố vi lượng.

1.3.5.2. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên men

Nước: tế bào vi sinh vật chứa 70% là nước [2], mọi hoạt động sống của vi sinh vật

như đồng hóa, dị hóa đều diễn ra trong môi trường nước. Do vậy, nước là yếu tố quan

trọng không thể thiếu trong các quá trình lên men. Ngoài ra, nước còn cần thiết cho

những hoạt động khác trong quá trình lên men như: gia nhiệt, giải nhiệt…Nước sử dụng

trong môi trường lên men phải là nước đã được loại bỏ hoàn toàn các ion khoáng để

không làm thay đổi hàm lượng khoáng trong môi trường lên men.

Nguồn carbon: carbon có ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối, các sản phẩm sơ

cấp và thứ cấp của vi sinh vật. Sản xuất L-lysine bởi Corynebacterium glutamicum ở

quy mô phòng thí nghiệm, nguồn carbon được chọn thường tinh khiết (glucose), nhưng

trong sản xuất công nghiệp thường dùng nguồn carbon rẻ tiền có nguồn gốc tự nhiên

như: bột ngô, bột ngũ cốc, mật rỉ đường mía hoặc củ cải. Những nguồn carbon này chứa

nhiều tạp chất nên cần chế biến loại bỏ các thành phần tạp chất có ảnh hưởng không tốt

đến vi sinh vật trước khi đưa vào sử dụng. Khi khử trùng môi trường lên men cần tách

riêng nguồn đường khử và nguồn nitơ hữu cơ vì phân tử đường glucose sẽ dễ dàng phản

ứng với gốc –NH2 trong amino acid (phản ứng caramen hóa) tạo ra hợp chất có màu nâu

đen, gây ức chế sinh trưởng tế bào.

Nguồn nitơ: nitơ có vai trò quan trọng trong giai đoạn hình thành sinh khối, tham

gia vào nhiều cấu trúc tế bào. Ở quy mô phòng thí nghiệm, nguồn nitơ vô cơ được lấy từ

các muối ammonium, muối nitrate, nitrite, nitơ hữu cơ được lấy từ cao nấm men,

peptone, dịch chiết bắp…Trong đó, dịch bắp là nguồn cung cấp carbon, nitơ và các

amino acid nên thường được dùng trong công nghiệp. Đối với chủng Corynebacterium

glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng methionine và threonine, người ta sử dụng

dịch thủy phân đậu nành để bổ sung methionine và threonine thay vì nguyên liệu tinh

khiết, đắt tiền.

Các nguyên tố vi lượng: các nguyên tố vi lượng được sử dụng với hàm lượng vô

cùng ít trong môi trường lên men nhưng lại có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật, vì

tham gia vào cấu trúc một số enzyme hô hấp (Cu, Fe), hoạt hóa nhiều enzyme (Mn). Zn

25

tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme như DNA polymerase, RNA polymerase, nối

các tiểu đơn vị protein trong việc hình thành cấu trúc đặc biệt cho hoạt động của

enzyme. Photpho là một trong những nguyên tố khoáng quan trọng vì tham gia vào liên

kết cao năng lượng và vận chuyển glucose qua màng tế bào [4].

pH: ion H+ trong môi trường lên men có thể làm thay đổi trạng thái điện tích của tế

bào, làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với một số ion nhất định và

gây ức chế các enzyme có mặt trên màng tế bào. pH 7,0 là điều kiện tối ưu nhất để

Corynebacterium glutamicum sản sinh L-lysine [7], vì thế, môi trường nuôi cấy cần

được duy trì ở mức pH này. Việc bổ sung CaCO3 sẽ giúp pH môi trường ổn định. Khi

pH giảm, gốc -CO3 bị phân hủy để hiệu chỉnh pH ổn định. Ngoài ra, việc bổ sung

CaCO3 vào môi trường lên men còn có vai trò đối với khả năng thẩm thấu của tế bào.

Lượng oxy: oxy là chất nhận H+ cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Oxy có thể được

cung cấp bằng cách lắc đảo bình lên men, khuấy trộn hoặc dẫn khí vô trùng vào bình lên

men. Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn hiếu khí, vì vậy, việc cung cấp oxy với

nồng độ thích hợp là yếu tố quan trọng quyết định năng suất L-lysine.

1.3.5.3. Những yếu tố cần kiểm soát trong lên men fed-batch

Kiểm soát pH: trong quá trình lên men, pH môi trường có thể giảm do sự có mặt

của các sản phẩm trao đổi chất được sinh ra. Vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi

pH môi trường nên cần phải kiểm soát pH trong suốt quá trinh lên men để đảm bảo mọi

hoạt động sinh lý trong tế bào diễn ra bình thường. pH tối thích của môi trường là pH

tối thích cho hệ enzyme của chủng nuôi cấy. Trong lên men fed-batch sản xuất amino

acid, dung dịch ammoniac NH3 thường được chọn để hiệu chỉnh pH vì khi bổ sung vào

canh trường không những đưa pH về mức ban đầu mà còn là nguồn cung cấp nitơ cho

vi khuẩn. Trong lên men công nghiệp, người ta sử dụng hệ thống kiểm soát pH tự động.

Kiểm soát lượng oxy hòa tan: đối với lên men thu nhận amino acid, nếu sự thiếu

oxy xảy ra trong pha log sẽ hình thành nên các sản phẩm phụ như acid lactic gây ảnh

hưởng đến hiệu suất lên men, đồng thời gây ức chế, ảnh hưởng đến hoạt tính của chủng.

Vì vậy cần phải sục khí, khuấy trộn để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho hô hấp của chủng

nghiên cứu.

26

Kiểm soát tốc độ bổ sung cơ chất: nồng độ cơ chất là yếu tố quan trọng trong lên

men fed-batch. Vì vậy cần phải kiểm soát nồng độ cơ chất trong nồi lên men không quá

cao cũng không quá thấp. Có thể bổ sung cơ chất theo kiểu liên tục hoặc gián đoạn.

Kiểm soát sự tạo bọt: trong điều kiện lên men có sục khí, lắc đảo hoặc sử dụng

mật rỉ đường thường gây hiện tượng tạo bọt. Bọt tách tế bào vi khuẩn ra khỏi dịch lên

men làm giảm sinh khối, tế bào không được tiếp xúc với điều kiện dinh dưỡng nên giảm

hoạt tính ảnh hưởng đến năng suất lên men. Để kiểm soát bọt, có thể dùng phương pháp

hóa học hoặc cơ học. Nghiên cứu này sử dụng Tween 20 để kiểm soát sự tạo bọt trong

bình lên men.

1.4. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài

Những nghiên cứu về lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận

L-lysine chưa được nghiên cứu nhiều trong nước. Vì vậy, chúng tôi chỉ đề cập đến

những nghiên cứu của các tác giả nước ngoài.

Tác giả Jianzhong Xu (2014) tiến hành lên men fed-batch chủng Corynebacterium

glutamicum Lys5-8 trong môi trường có nguồn cơ chất là glucose, rỉ đường củ cải và

dịch bắp. Sau 36 giờ nuôi cấy, lượng L-lysine thu được đạt 896 ± 33,41mM, tương

đương 131 ± 4,8g/L. Dung dịch bổ sung trong quá trình lên men fed-batch bao gồm:

glucose 800g/L, (NH4)2SO4 400g/L. Nồng độ glucose duy trì trong dịch lên men khoảng

20-30g/L. Điều chỉnh pH ở mức 7,0 bởi dung dịch NH4OH [34].

Cùng tác giả Jianzhong Xu (2013), quá trình lên men fed-batch được thực hiện

trong fermentor 7L chứa 3L môi trường lên men. Tốc độ dòng không khí đi vào được

cài đặt với tốc độ 2,5L/phút. Điều chỉnh pH tự động, sử dụng dung dịch NH4OH 25% để

duy trì pH 6.9. Tốc độ hòa tan oxy trên 10%/phút. Dịch fed-batch gồm: 800g/L glucose

và 400g/L (NH4)2SO4 vô trùng. Tốc độ nạp được điều chỉnh sao cho nồng độ glucose

trong dịch lên men ở khoảng 20-30g/L bằng cách kiểm tra mỗi 4 giờ. Trong thí nghiệm

này, tác giả thu được L-lysine với năng suất 2,6g/L/giờ, tương đương 96,8g/L sau 36

giờ nuôi cấy [33].

Nghiên cứu lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu L-lysine của

Judith Becker (2011) sử dụng hệ thống Biostat với bình lên men 5L, thể tích môi trường

lên men 1L. Tốc độ dòng không khí đi vào được cài đặt với tốc độ 2,5L/phút. Điều

27

chỉnh pH tự động, sử dụng dung dịch NH4OH 25% để duy trì pH 6.9. Tốc độ hòa tan

oxy trên 10%/phút. Dịch bổ sung bao gồm: 200g rỉ đường và 800g glucose được hòa tan trong 1,8L nước, hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. 200mL (NH4)2SO4 (40%) được

hấp riêng. 0,8 mL dịch vitamine và 2mL antifoam được bổ sung sau. Dịch vitamine bao

gồm: 300mg/L biotin, 500mg/L thiamin.HCl, 2g/L pantothenic acid và 600mg/L

nicotinamide. Năng suất L-lysine thu được 4g/L/giờ, tương đương 120g/L sau 30 giờ

nuôi cấy [8].

Zhen Chen và cộng sự (2011) tiến hành lên men fed-batch Corynebacterium

glutamicum ATCC 13032 và Corynebacterium glutamicum LC 198 trong fermentor 2L ở 340C. Dung dịch bổ sung bao gồm: 50% (w/v) glucose, 4,5% (w/v) NH4Cl và

0,5mg/L biotin. Việc bổ sung dinh dưỡng bắt đầu sau khi lượng đường ban đầu được sử

dụng hết. Tốc độ nạp được điều khiển sao cho nồng độ glucose dưới 10g/L. Tốc độ

khuấy được thay đổi trong suốt quá trình lên men để đảm bảo cung cấp lượng oxy đầy

đủ. pH được duy trì ở 7,3 bằng dung dịch NH4OH. Kết quả thu được 58g/L L-lysine sau

30 giờ lên men [10].

Tateno và cộng sự (2007) đã khảo sát khả năng hình thành L-lysine của

Corynebacterium glutamicum trên nguồn cơ chất là tinh bột bắp thô. Với hình thức lên men liên tục và lên men fed-batch, lượng L-lysine đã tăng gấp 2,5 lần ở nhiệt độ 340C,

72 giờ lên men so với lên men theo mẻ [32].

Tác giả Ohnishi và cộng sự (2006) đã tiến hành lên men fed-batch sáu chủng

Corynebacterium glutamicum mang đột biến đồng gen lysC. Môi trường lên men sử

dụng là LPG1. Glucose được chọn là nguồn cơ chất bổ sung trong quá trình lên men

fed-batch. Kết quả, lượng L-lysine thu được thấp nhất là 33g/L, cao nhất là 59g/L sau

35 giờ lên men [25].

Tác giả Ohnishi (2002) đã khảo sát khả năng sinh L-lysine của 4 chủng

Corynebacterium glutamicum: HD1, AK1, AHD2 và AHP3. Đây là những chủng đã

được gây đột biến để tăng khả năng sinh tổng hợp L-lysine. Quá trình lên men được

thực hiện theo hình thức fed-batch trong môi trường LPG có nồng độ glucose 50g/L ở

quy mô 5L. Kết quả, các chủng đều cho sản lượng L-lysine trên 80g/L chỉ sau 27 giờ

nuôi cấy [24].

28

Có thể thấy rằng, ở nước ngoài, các nghiên cứu về sản xuất L-lysine khá phong

phú. Ở quy mô phòng thí nghiệm, glucose là nguồn cơ chất được sử dụng nhiều và cho

năng suất L-lysine cao. Những nghiên cứu trên cho thấy, dịch bổ sung có thể là nguồn

carbon, nguồn nitơ hay vitamine hoặc hỗn hợp cả ba nguồn. Nồng độ glucose bổ sung

khoảng 400-800g/L. Tốc độ nạp tuy không nói rõ nhưng đều duy trì nồng độ glucose

trong môi trường lên men khoảng 10-20%.

Qua tổng quan tài liệu, chúng tôi rút ra một số các vấn đề chính như sau:

- L-lysine là một trong những amino acid quan trọng đối với người và động vật,

thuộc nhóm amino acid không thay thế.

- Corynebacterium glutamicum là chủng vi khuẩn được sử dụng nhiều trong

nghiên cứu sản xuất L-lysine. Những chủng cho năng suất cao thường là những chủng

đột biến.

- Kỹ thuật lên men fed-batch thể hiện nhiều ưu điểm trong việc nghiên cứu thu

nhận L-lysine.

Tuy nhiên, trước khi lên men fed-batch cần tối ưu hóa môi trường lên men, đồng

thời xác định thời điểm bổ sung cơ chất, tốc độ bổ sung cũng như nồng độ cơ chất bổ

sung để duy trì nồng độ đường tối ưu trong canh trường.

Đây là tiền đề cho phần thực nghiệm của chúng tôi.

29

Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Giống vi sinh vật

Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống vi sinh

vật Đại học Quốc gia Hà Nội.

• Hóa chất sử dụng cho môi trường nuôi cấy

2.1.2. Các loại hóa chất và thiết bị

Nguồn gốc Trung Quốc: glucose, sucrose, fructose, maltose, ethanol, (NH4)2SO4,

KH2PO4, urê (NH2)2CO, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, tween 20.

Nguồn gốc Mỹ: biotine, thiamine dạng ống.

• Hóa chất phân tích

Nguồn gốc Việt Nam: rỉ đường, dịch bắp (nguồn bắp Mỹ).

Các hóa chất sử dụng trong đề tài được thống kê trong bảng 2.1.

Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích

Mục đích Hóa chất Nguồn gốc

Ninhydrin Ấn Độ

FeCl Trung Quốc

HCl Trung Quốc

Định lượng L-lysine KCl Trung Quốc

DMSO (Demethyl Merk

Sulfoxide)

Methyl cellosolve Merk

Định lượng đường DNS Merk sót (3,5 dinitrosalicylic acid)

Crystal Merk

Nhuộm Gram Iot Merk

Fuchin Merk

• Thiết bị

30

Ngoài những thiết bị cơ bản (que cấy, đèn cồn…), đề tài còn sử dụng các thiết

khác được thống kê ở bảng 2.2.

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Nhà sản xuất

Trung Quốc Tủ cấy vô trùng

Shellab, Đức Tủ ấm

Trung Quốc Tủ sấy

Hirayama, Nhật Nồi hấp

DO6-DAVS, Đức Máy lắc tròn

Toshiba, Nhật Tủ lạnh

Trung Quốc Bếp điện

Trung Quốc Kính hiển vi

CP22025 Sartorias, Nhật Cân kỹ thuật

Eutech pH 510, Singapore pH kế

Hermle Z 233M-2, Đức Máy ly tâm

Geresys, Mỹ Máy UV-vis

Đức Máy đo độ ẩm

2.1.3. Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài bao gồm môi trường giữ giống và môi

trường nhân giống nhằm bảo quản và hoạt hóa giống trước khi lên men.

Các môi trường nuôi cấy được thể hiện ở bảng 2.3.

31

Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài

Ký hiệu Môi trường Thành phần

Peptone 10g/L

Cao nấm men 5g/L

Glucose 5g/L M1 Giữ giống NaCl 5g/L

Agar 18g/L

pH 7,2

Dịch chiết bắp 50g/L

Glucose 20g/L

Peptone 10g/L M2 Nhân giống Cao nấm men 5g/L

NaCl 5g/L

pH 7,2

Chủng giống trước khi đưa vào lên men được nhân giống cấp 2 cấp. Một khuẩn

lạc thuần được đưa vào ống nghiệm chứa 10mL môi trường nhân giống cấp 1. Sau 24

giờ, toàn bộ sinh khối được đưa vào bình chứa 100mL môi trường nhân giống cấp 2.

Sau 24 giờ, lượng giống này được đưa vào bình lên men với tỷ lệ 7%, chất lượng giống

là 2,4 tỷ tế bào/mL.

32

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT

Kiểm tra vi thể, đại thể, sinh lý, sinh hóa Corynebacterium glutamicum

VTCC-B-0632

Kiểm tra khả năng đồng hóa một số nguồn carbon và nguồn nitơ

Thí nghiệm sàng lọc

Thí nghiệm khởi đầu Tối ưu hóa môi trường lên men

Thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu

trúc tâm xoay (RSM-CCD)

Xác định thời điểm bổ sung

cơ chất Thử nghiệm lên men fed-batch thu

Xác định ngưỡng ức chế cơ chất nhận L-lysine

Thử nghiệm lên men fed-batch

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Sau khi nhận giống từ trung tâm lưu trữ giống, chúng tôi tiến hành hoạt hóa giống,

kiểm tra độ thuần, kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Với chủng giống đã thuần,

chúng tôi thực hiện tối ưu hóa môi trường lên men bằng phương pháp quy hoạch thực

nghiệm. Thu được các thông số tối ưu của môi trường lên men, tiến hành lên men batch,

phân tích động học quá trình lên men batch, từ đó xác định thời điểm bổ sung cơ chất và

nồng độ cơ chất bổ sung. Tiến hành khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất đối với khả năng

hình thành L-lysine của chủng giống. Cuối cùng, thử nghiệm lên men fed-batch thu

nhận L-lysine.

33

2.2. Bố trí thí nghiệm

2.2.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống

Kiểm tra đại thể: quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa.

Kiểm tra vi thể: quan sát hình dạng và cách sắp xếp tế bào dưới kính hiển vi ở vật

kính 100X.

Kiểm tra vi sinh vật có enzyme catalase giúp xác định vi sinh vật thuộc nhóm hiếu

khí hay kỵ khí: dùng H2O2 3% và quan sát sự sủi bọt khí.

Kiểm tra khả năng đồng hóa một số nguồn carbon và nguồn nitơ: chúng tôi chọn

những nguồn carbon và nitơ sau để khảo sát: glucose (5% w/v), sucrose (5% w/v),

maltose (5% w/v), fructose (5% w/v), ethanol (2,5% v/v), acid acetic (2,5% v/v), dịch

bắp (5% w/v), rỉ đường (5% v/v), (NH4)2SO4 (1% w/v), urê (1% w/v) và peptone (1%

w/v). Thí nghiệm sử dụng môi trường lên men trong nghiên cứu của tác giả Trần Thị

Minh Tâm, Nguyễn Thúy Hương (2009) [7]. Đối với thí nghiệm khảo sát khả năng

đồng hóa nguồn carbon, thành phần dịch bắp và glucose trong môi trường lên men được

thay thế bằng những nguồn carbon khảo sát. Đối với thí nghiệm khảo sát khả năng đồng

hóa nitơ, thành phần urê và dịch bắp trong môi trường lên men được thay thế bằng

những nguồn nitơ khảo sát. Sau 48 giờ, đo OD 470nm kiểm tra sự hình thành L-lysine.

2.2.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận

L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

2.2.2.1. Thực nghiệm sàng lọc

Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chủng thu nhận

L-lysine được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman với 8 yếu tố [3]. Chỉ tiêu theo dõi

(Y) là lượng L-lysine (g/L). Qua tổng quan tài liệu, chúng tôi chọn thời điểm ngừng lên

men thu mẫu là 48 giờ [35], đồng thời xác định các mức thí nghiệm cho từng yếu tố.

Các mức thí nghiệm và ma trận được thể hiện ở bảng 2.4 và 2.5. Thí nghiệm sàng lọc

được bố trí với 2 mức: mức dưới (-1) và mức trên (+1) đối với các yếu tố khảo sát.

34

Bảng 2.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc

Yếu tố khảo sát Ký hiệu Các mức

Dưới (-1) Trung tâm (0) Trên (+1)

50 80 20 Glucose g/L X1

30 40 20 X2 (NH4)2SO4 g/L

1 1,5 0,5 X3 KH2PO4 g/L

Hỗn hợp muối khoáng mL/L 5 8 2 X4

20 30 10 Biotin µg/L X5

150 200 100 Thiamin µg/L X6

5 8 2 Tween 20 mL/L X7

100 150 50 Dịch bắp mL/L X8

Bảng 2.5 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu

Y (L-lysine ) TN X8 X6 X2 X3 X4 X5 X7 X1

1 1 1 -1 1 -1 1 1 1

-1 -1 1 1 1 1 1 -1 2

1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 3

-1 1 -1 1 -1 -1 1 1 4

-1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 5

-1 1 -1 1 1 1 -1 1 6

1 -1 1 1 -1 -1 -1 1 7

1 1 1 1 -1 1 -1 -1 8

-1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 9

1 -1 -1 1 1 1 -1 1 10

-1 -1 1 1 -1 1 1 1 11

1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 12

35

2.2.2.2. Thí nghiệm khởi đầu

Thí nghiệm khởi đầu được bố trí với 2 mức: mức dưới (-1) và mức trên (+1) đối

với các biến có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu. Các biến còn lại được bố trí ở mức

trung tâm. Bổ sung thêm 5 thí nghiệm mức trung tâm.

2.2.2.3. Thiết kế thí nghiệm bề mặt đáp ứng

Từ những số liệu thu được, chúng tôi tiến hành thiết kế thí nghiệm bề mặt đáp ứng

để mô tả chính xác mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và các thông số thí nghiệm. Ở đây,

chúng tôi chọn dạng thiết kế hỗn hợp tâm xoay (CCD-Central Composite Design).

Từ kết quả hàm mục tiêu của thí nghiệm RSM-CCD, chúng tôi xây dựng được

phương trình hồi quy bậc cao của hàm mục tiêu. Phân tích phương sai đánh giá mức độ

phù hợp của hàm mục tiêu với các thông số thí nghiệm. Xác định cực trị hàm mục tiêu

và thành phần môi trường lên men tối ưu.

2.2.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận

L-lysine

2.2.3.1. Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất

Nguyên tắc: thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất là thời điểm mà tại đó lượng cơ

chất trong môi trường bị thiếu hụt. Xác định thời điểm bổ sung cơ chất giúp duy trì ổn

định lượng cơ chất trong môi lên men.

Bố trí thí nghiệm: trên môi trường tối ưu, tiến hành lên men dạng batch trong bình

500mL với thể tích môi trường 250mL. Điều kiện lên men: nhiệt độ phòng, pH ban đầu

dao động 7-7,2, chế độ lắc vòng 150 vòng/phút. Lấy mẫu tại các thời điểm: 0, 2, 4, 6, 8,

12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 giờ. Phân tích các chỉ tiêu: mật độ tế bào (log

CFU/mL), lượng đường sót trong canh trường (g/L) và lượng L-lysine (g/L).

Kết quả dự kiến: xác định biến động sinh trưởng, khả năng sử dụng cơ chất và khả

năng sinh L-lysine theo thời gian. Từ đó, xác định được thời điểm bắt đầu bổ sung cơ

chất.

2.2.3.2. Xác định ngưỡng ức chế cơ chất

Nguyên tắc: ngưỡng ức chế cơ chất là ngưỡng mà tại đó nồng độ cơ chất ức chế sự

hình thành L-lysine. Trong môi trường lên men, nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn đến

khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng. Nồng độ cơ chất quá cao trong dịch lên

36

men sẽ ức chế sự sinh trưởng của chủng giống, làm giảm khả năng hình thành sản

phẩm. Nhưng nồng độ cơ chất quá thấp sẽ không đủ cho chủng sử dụng, dẫn đến hạn

chế sinh trưởng, từ đó hạn chế lượng sản phẩm tạo thành.

Bố trí thí nghiệm: lên men chủng trong bình 250mL, thể tích môi trường 100mL.

Điều kiện lên men: nhiệt độ phòng, pH ban đầu dao động 7-7,2, chế độ lắc vòng 150

vòng/phút. Các nồng độ carbon khảo sát là: 10g/L, 75g/L và 100g/L. Mẫu đối chứng:

50g/L. Các chỉ tiêu theo dõi: lượng L-lysine, mật độ tế bào và đường sót.

Kết quả dự kiến: xác định mức giới hạn trên và dưới, là cơ sở để duy trì nồng độ

cơ chất phù hợp trong môi trường lên men.

2.2.3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch

Nguyên tắc: việc bổ sung cơ chất trong suốt quá trình lên men sẽ duy trì nồng độ

cơ chất trong canh trường ổn định, tạo điều kiện thuận lợi cho chủng giống sinh trưởng

và sinh tổng hợp sản phẩm.

Bố trí thí nghiệm: lên men fed-batch ban đầu được bố trí giống lên men batch, thể

tích môi trường nuôi cấy 250mL. Dựa vào khả năng sử dụng đường của chủng và

ngưỡng ức chế cơ chất để đưa ra chế độ fed-batch hợp lý. Cuối mỗi thời điểm, lấy 5mL

mẫu phân tích các chỉ tiêu: lượng L-lysine, mật độ tế bào và lượng đường sót trong canh

trường.

2.3. Phương pháp phân tích thí nghiệm

2.3.1. Phương pháp vi sinh

2.3.1.1. Kiểm tra hình thái vi sinh vật

Quan sát đại thể: cấy trang, cấy ria vi khuẩn trên thạch đĩa để quan sát đặc điểm

hình thái và màu sắc khuẩn lạc.

Quan sát vi thể: nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi ở vật

kính 100x. Dùng que cấy ria lấy một lượng giống vừa đủ đặt lên lam kính đã nhỏ sẵn

một giọt nước cất, hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn đến khi khô. Phủ hoàn toàn

lên mẫu bằng thuốc nhuộm crystal violet (tím), để 30 giây, rửa nhẹ nhàng bằng nước

cất. Tiếp theo, phủ lên mẫu dung dịch Iot, để 30 giây, rửa lại bằng nước cất. Rửa mẫu với cồn 700, tuy nhiên, không nên để cồn tiếp xúc với mẫu quá 5 giây vì cồn có thể khử

toàn bộ màu. Rửa lại mẫu với nước cất rồi phủ lên mẫu thuốc nhuộm fuchsin (hồng), để

37

trong 30 giây. Rửa mẫu bằng nước cất một lần nữa. Dùng giấy thấm khô lam kính, nhỏ

một giọt dầu soi kính lên mẫu và quan sát ở vật kính 100X.

2.3.1.2. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên

môi trường thạch

Nguyên tắc: mỗi tế bào vi khuẩn phân chia hình thành một khuẩn lạc. Số lượng

khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa tương đương với lượng tế bào vi khuẩn sống trong

dịch lên men.

Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ khác nhau (10-1 – 10-7), hút 0,1mL ở 3 nồng độ: 10-5, 10-6, 10-7 cấy trang lên thạch đĩa (lặp lại 3 lần). Ủ ở nhiệt độ 300C

trong 24h, đếm khuẩn lạc. Tính số tế bào vi khuẩn/mL theo công thức:

a+b+c

3 x 10 Số khuẩn lạc/mL =

10-n Trong đó:

a là số khuẩn lạc ở đĩa thứ nhất

b là số khuẩn lạc ở đĩa thứ 2

c là số khuẩn lạc ở đĩa thứ 3 10-n là nồng độ pha loãng huyền phù tế bào

(số khuẩn lạc chấp nhận được phải nằm trong khoảng 50-150 khuẩn lạc/đĩa).

2.3.1.3. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang

Dựa vào đường chuẩn sinh khối và độ đục huyền phù tế bào để xác định mật độ tế

bào/mL.

Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở những nồng độ thích hợp sao cho chỉ số OD

nằm trong giới hạn OD đường chuẩn. Thế giá trị OD của từng mẫu dịch huyền phù vào

phương trình đường chuẩn sinh khối. Ghi nhận kết quả.

2.3.1.4. Xác định Gram bằng phản ứng String Test

Nguyên tắc: phản ứng string test dựa trên sự khác nhau về cấu trúc hóa học của

vách tế bào. Vách tế bào vi khuẩn Gram (-) dễ bị vỡ khi tiếp xúc với dung dịch kiềm do

vách peptidoglycan mỏng. Phản ứng string test bước đầu giúp phân biệt vi khuẩn Gram

(-) và Gram (+).

38

Tiến hành: nhỏ một giọt KOH 3% lên lam kính. Dùng que cấy ria chấm khuẩn lạc

Corynebacterium glutamicum khuấy đều lên giọt KOH. Quan sát sự kéo sợi trong 60

giây. Phản ứng dương tính thì kết luận là Gram (+), phản ứng âm tính thì kết luận là

Gram (-).

2.3.1.5. Xác định vi khuẩn hiếu khí nhờ H2O2

Nguyên tắc: hầu hết các vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử

có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các hợp chất có độc

tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo

phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo

H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 (hydroxygen peroxide) thành H2O và O2 gây

hiện tượng sủi bọt khí.

Tiến hành: nhỏ một giọt H2O2 lên lam kính. Dùng que cấy chấm khuẩn lạc

Corynebacterium glutamicum lên giọt H2O2. Quan sát sự sủi bọt khí, phản ứng dương

tính là hiếu khí, âm tính là kỵ khí.

2.3.2. Phương pháp hóa sinh

2.3.2.1. Định lượng amino acid L-lysine bằng phương pháp đo mật độ quang

L-lysine được định lượng theo phương pháp của Chung Lung Hsieh (1995) [19].

Nguyên tắc: Thuốc thử ninhydrin phản ứng cao với L-lysine ở pH =1. Ion sắt sẽ

hạn chế sự phản ứng của ninhydrin với proline, nithine, glycine, arginine và histidine.

Chinard (1952) thấy rằng ninhydrin phản ứng cao và có khả năng chọn lysine, proline,

nithine ở pH =1. Bổ sung ion sắt sẽ hạn chế phản ứng của ninhydrin với proline ở pH=1,

tăng độ nhạy cảm của ninhydrin với lysine. Phương pháp này có thể sử dụng để định

lượng mẫu lysine không cần pha loãng. Dimethyl sulfoxide bổ sung vào để hòa tan

phức hợp ninhydrin – lysine, tăng phản ứng của thuốc thử ninhydrin với lysine.

Chuẩn bị hóa chất: FeCl3 50% (w/v), KCl 0,1M, HCl 1N, dung dịch DMSO

(Demethyl Sulfoxide), dung dịch methyl cellosolve, ninhydrin.

Pha dung dịch:

Dung dịch A gồm: methyl cellosolve 46,625 mL, FeCl3 50% 3,75mL, KCl 0,1M

75mL, điều chỉnh pH=1 bằng HCl 1N.

39

Dung dịch B gồm: ninhydrin 0,5g, KCl 0,1M 50mL, điều chỉnh pH =1 bằng HCl

1N.

Phản ứng: hút 20µL dịch lên men đã ly tâm (13000 vòng/10 phút) vào ống nghiệm

sạch, bổ sung 660µL dung dịch A và 370µL dung dịch B. Lắc đều, đậy kín miệng ống

nghiệm, đun cách thủy trong 20 phút. Sau đó làm lạnh các ống nghiệm dưới vòi nước.

Bổ sung thêm 4mL dung dịch DMSO và 6mL nước cất. Lắc đều và đo ở bước sóng

470nm.

2.3.2.2. Định lượng đường khử bằng DNS (3,5 dinitrosalicylic acid)

Nguyên tắc: nhờ đặc tính khử của đường, DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm

sẽ bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.

Tiến hành: dịch lên men ly tâm loại bỏ sinh khối, pha loãng ở nồng độ thích hợp.

Hút 3mL dịch vào ống nghiệm, sau đó bổ sung 1mL thuốc thử DNS. Đậy kín miệng ống nghiệm và đun cách thủy ở 1000C trong 5 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng, đo mật độ

quang ở bước sóng 560nm.

2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Minitab 16 để bố trí thí nghiệm và phân tích kết quả thí

nghiệm tối ưu. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý

số liệu.

40

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống

Trong nghiên cứu vi sinh, giống là một trong những yếu tố quan trọng. Đề tài này,

chúng tôi sử dụng chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ Trung tâm lưu

giữ giống vi sinh vật Đại học Quốc Gia Hà Nội. Đây là chủng tự nhiên đã được sàng lọc

để sản xuất L-lysine.

Khảo sát đặc điểm đại thể, vi thể, sinh lý, sinh hóa của Corynebacterium

glutamicum VTCC-B-0632 làm tiền đề cho các thí nghiệm sau được trình bày ở bảng

3.1.

Bảng 3.1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632

Đại thể

Vi thể

Sinh lý, sinh hóa

Kích thước Hình dạng Màu sắc Kích thước Hình dạng Cách sắp xếp tế bào Bào tử Gram Catalase Glucose Sucrose Fructose Maltose Ethanol Acid acetic Dịch bắp Rỉ đường Urê (NH4)2SO4 Peptone 1-1,5mm Tròn đầy, trơn bóng Vàng nhạt 1x1,5µm Que ngắn Hình chữ V hoặc song song Không hình thành bào tử Dương (+) Có enzyme catalase + + + + + + + + + + +

(+): có khả năng đồng hóa.

41

(a) (b)

Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) và hình dạng tế

bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b).

Những khảo sát tiền đề cho thấy, chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (+).

Dưới kính hiển vi ở vật kính 100X, quan sát thấy tế bào có dạng que ngắn, xếp hình chữ

V hoặc song song, bắt màu tím của thuốc nhuộm crystal. Tuy nhiên, chủng là vi khuẩn

Gram biến đổi nên khi tế bào già chuyển sang Gram âm (-), bắt màu hồng của thuốc

nhuộm fuchsin.

Trên môi trường thạch đĩa, khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu vàng nhạt, trơn

bóng, kích thước 1-1,5 mm sau một ngày nuôi cấy.

Chủng có khả năng đồng hóa nhiều nguồn carbon như glucose, sucrose, fructose,

maltose…và một số nguồn carbon tự nhiên như dịch bắp, rỉ đường do trong hệ gen có

những gen tham gia tổng hợp enzyme phân giải những nguồn carbon này [13, 35].

Urê, peptone và (NH4)2SO4 là những nguồn nitơ phổ biến được đưa vào môi + là nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất. Urê được trường lên men chủng thu nhận L-lysine. NH4

phân giải thành NH3 và CO2 nhờ enzyme urease. Peptone là nguồn nitơ hữu cơ, nhờ hoạt

động của enzyme deaminase biến đổi thành NH3. NH3 xâm nhập qua thành tế bào và

tham gia vào quá trình hình thành amino acid [4].

42

3.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-

lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

3.2.1. Thí nghiệm sàng lọc

Trong quá trình lên men thu nhận L-lysine, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả

năng sinh trưởng và sinh L-lysine của chủng. Trong đó, môi trường lên men có ảnh

hưởng trực tiếp. Tuy nhiên, không phải tất cả các thành phần trong môi trường lên men

đều có ảnh hưởng như nhau đến lượng L-lysine. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm

sàng lọc để tìm ra những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu là lượng L-lysine.

Kết quả thí nghiệm sàng lọc thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm sàng lọc

Y TN X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 (L-lysine )

1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 34,296

2 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 24,508

3 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 35,284

4 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 34,316

5 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 26,836

6 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 32,25

7 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 24,79

8 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 27,41

9 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 24,34

10 1 -1 -1 1 1 1 1 -1 25,16

11 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 33,89

12 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 26,37

Từ bảng kết quả cho thấy, ở thí nghiệm thứ 3, glucose (-), biotine (-), dịch bắp (+),

cho lượng L-lysine cao nhất, đạt 35,284g/L. Thí nghiệm thứ 9, muối khoáng (+), các

yếu tố còn lại ở mức (-) cho lượng L-lysine thấp nhất, đạt 24,34g/L trong cùng điều kiện

và thời gian lên men (48 giờ). Để đánh giá chính xác ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm

mục tiêu, tiến hành phân tích hồi quy-phương sai.

43

Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát

Các yếu tố khảo sát Ký hiệu Mức ảnh hưởng Giá trị P

Glucose 3,3257 0,066 X1

5,2223 0,021 (NH4)2SO4 X2

-0,9983 0,458 KH2PO4 X3

Hỗn hợp muối khoáng -1,6937 0,245 X4

Biotin -1,7683 0,229 X5

Thiamin -0,4717 0,715 X6

Tween 20 1,2590 0,362 X7

Dịch bắp 4,6463 0,029 X8

Giá trị P là giá trị xác suất thống kê về mức độ quan trọng của từng yếu tố thí

nghiệm đối với hàm mục tiêu. Những yếu tố có giá trị P tương ứng nhỏ hơn mức ý

nghĩa α (α = 0,05) là những yếu tố có ý nghĩa thống kê về mức độ ảnh hưởng. Nói cách

khác, yếu tố có giá trị P <α thì ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu, và ngược lại.

Quan sát cột giá trị P trong bảng 3.3 cho thấy, yếu tố X2 và X8 là hai yếu tố có giá

trị P tương ứng nhỏ hơn 0,05, chứng tỏ đây là hai yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hàm mục

tiêu. Các yếu tố còn lại có giá trị P lớn hơn nhiều so với mức ý nghĩa α, cho thấy các

yếu tố này không gây ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu.

Độ lớn của các hệ số ảnh hưởng (hay giá trị tuyệt đối của các hệ số) cho biết mức

độ ảnh hưởng của các yếu tố đối với hàm mục tiêu. Dấu (+) hay (-) của hệ số cho biết

tác động của yếu tố đối với hàm mục tiêu là dương hay âm. Dấu (+) biểu thị sự tác động

dương, dấu (-) biểu thị sự tác động âm. Nghĩa là, những yếu tố có hệ số ảnh hưởng (+)

nếu được nhận giá trị cao hơn mức trung tâm sẽ làm tăng giá trị hàm mục tiêu. Tương

tự, những yếu tố có hệ số ảnh hưởng (-) nếu được nhận giá trị cao hơn mức trung tâm sẽ

làm giảm giá trị hàm mục tiêu.

Hệ số ảnh hưởng của yếu tố X2 và X8 có giá trị lớn nhất trong 8 yếu tố khảo sát và

đều mang giá trị (+) cho thấy, nếu hai yếu tố này nhận được giá trị cao hơn mức trung

tâm thì sẽ làm tăng giá trị hàm mục tiêu. Chứng tỏ, lượng L-lysine phụ thuộc lớn vào

44

hai yếu tố này. Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2 (R-Sq) = 94,32% chứng tỏ mô

hình tìm được khá phù hợp với dữ liệu.

Như vậy, qua sàng lọc, chúng tôi xác định được hai yếu tố có ảnh hưởng lớn đến

khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng giống, đó là (NH4)2SO4 và dịch bắp. Trên cơ

sở này, tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình và

các thông số thí nghiệm.

3.2.2. Thí nghiệm khởi đầu

Sau khi sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu, tiếp tục tiến hành

một số thí nghiệm với các yếu tố này, có bổ sung 5 thí nghiệm ở mức trung tâm. Giá trị

trung tâm cho phép đánh giá mức độ phù hợp (Lack of fit) của mô hình hồi quy bậc nhất

đã xây dựng. Đây là thông tin quan trọng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Kết

quả thí nghiệm khởi đầu được thể hiện trong bảng 3.4.

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khởi đầu

Y TN Dịch bắp (NH4)2SO4 (L-lysine g/L)

1 -1 -1 37,69

2 0 0 33,20

3 0 0 33

4 -1 1 32

5 0 0 33,80

6 1 1 32,59

7 1 -1 36,80

8 0 0 33,70

9 0 0 33,50

Kết quả thí nghiệm cho thấy, lượng L-lysine đạt cao nhất 37,69g/L khi hai yếu tố

ảnh hưởng được bố trí ở dưới mức trung tâm (thí nghiệm 1). Tuy nhiên, lượng L-lysine

sẽ giảm còn 32g/L nếu tăng lượng dịch bắp lên trên mức trung tâm (thí nghiệm 4).

Thông số quan trọng để đánh giá mức độ phù hợp của mô hình hồi quy là giá trị P

của “Lack of fit”. Nếu giá trị P của “Lack of fit” lớn hơn mức ý nghĩa α thì chấp nhận

45

mô hình hồi quy bậc nhất, nghĩa là hàm mục tiêu còn xa vùng cực trị. Ngược lại, nếu giá

trị P nhỏ hơn α thì mô hình hồi quy bậc nhất không được chấp nhận, nghĩa là hàm mục

tiêu được mô tả bằng mô hình hồi quy bậc cao hơn.

Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu

Chỉ tiêu Giá trị P

Lack of fit 0,003

Main Effects 0

Ct Pt 0,007

Curvature 0,007

r2 (R-Sq) = 96,61%

Phân tích hồi quy-phương sai thu được giá trị P của “Lack of fit” là 0,003, nhỏ hơn

nhiều so với mức ý nghĩa α, điều này nghĩa là mô hình hồi quy bậc nhất không phù hợp.

Các ảnh hưởng chính (Main Effects) có giá trị P bằng 0 chứng tỏ các yếu tố ảnh hưởng

chính có ý nghĩa về mặt thống kê. Giá trị P của các điểm trung tâm (Ct Pt) là 0,007; nhỏ

hơn α chứng tỏ các điểm trung tâm có ảnh hưởng đáng kể đến mô hình hồi quy. Giá trị

P của “Curvature” (đường cong) bằng 0,007, nhỏ hơn nhiều so với α cho thấy khả năng xuất hiện dạng cong của bề mặt chỉ tiêu là rất lớn. Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2

(R-Sq) = 96,61% cho thấy mô hình tìm được khớp với số liệu thực nghiệm.

Để tìm chính xác điểm cực trị của hàm mục tiêu, cần tiến hành thêm các thí

nghiệm mà ở đó, mỗi yếu tố phải được bố trí nhiều hơn 3 mức giá trị. Đây là cơ sở để

tiến hành thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay (RSM-CCD).

3.2.3. Thí nghiệm bề mặt đáp ứng RSM-CCD

Thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay sẽ bổ sung thêm các điểm thí

nghiệm nhằm xây dựng mô hình hồi quy bậc 2 mô tả hàm mục tiêu.

Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.5.

Từ bảng kết quả cho thấy, lượng L-lysine đạt cao nhất 38g/L (thí nghiệm 11) khi

(NH4)2SO4 ở mức trung tâm và dịch bắp ở mức giá trị biên –α. Thí nghiệm 4, lượng L-

lysine thu được thấp nhất (31g/L) khi (NH4)2SO4 ở mức trung tâm và dịch bắp ở mức

giá trị biên +α.

46

Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD

TN Dịch bắp Y (L-lysine g/L) (NH4)2SO4

1 0 0 33,20

2 0 0 33

3 0 0 33,80

4 0 +1,41 31,31

5 -1 1 32,37

6 0 0 33,70

7 0 0 33,50

8 -1,41 0 34,88

9 -1 -1 37,32

10 1 -1 37,17

11 0 -1,41 38,24

12 +1,41 0 34,67

13 1 1 32,22

1,41: mức giá trị biên (α)

2

Phân tích hồi quy-phương sai cho thấy, phương trình hồi quy có dạng:

2 + 0,0003X8

Y (L-lysine) = 47,234 – 0,4065X2 – 0,1025X8 +0,0067X2

Trong đó, X2 là (NH4)2SO4, X8 là dịch bắp. Thông số đánh giá mô hình hồi quy r2 (R-Sq) đạt 99,17%, giá trị P của “Lack of

fit” bằng 1,0 chứng tỏ mô hình tìm được khớp với dữ liệu.

Dấu (+) của hệ số trong phương trình thể hiện ảnh hưởng dương của yếu tố đối với

hàm mục tiêu, dấu (-) thể hiện ảnh hưởng âm đối với hàm mục tiêu.

Qua phương trình hồi quy ta thấy, ở dạng hàm bậc nhất, X2 mang hệ số(-0,4065), 2) mang hệ số (+0,0067), ảnh hưởng âm đến hàm mục tiêu. Còn ở dạng hàm bậc hai (X2

ảnh hưởng dương đến giá trị hàm mục tiêu, tuy nhiên, hệ số này rất nhỏ nên ảnh hưởng

47

là không đáng kể. Như vậy, nếu tăng lượng (NH4)2SO4 lên trên mức trung tâm sẽ làm

giảm giá trị hàm mục tiêu. Kết quả thí nghiệm trong bảng 3.5 cho thấy, khi lượng

(NH4)2SO4 ở mức giá trị biên –α, lượng L-lysine đạt 34g/L, mức trung tâm (0) đạt cao

nhất 38g/L. Tuy nhiên, khi tăng yếu tố X2 lên mức giá trị biên +α thì lượng L-lysine

giảm còn 34g/L. Hàm lượng (NH4)2SO4 cao trong canh trường không thích hợp cho

chủng sản sinh L-lysine. Hàm lượng thích hợp là từ 1-4%. Bên cạnh đó, dịch bắp cũng

là nguồn chứa nitơ nên làm tăng lượng nitơ trong canh trường.

Phương trình hồi quy cho thấy, ở dạng hàm bậc nhất, yếu tố X8 mang hệ số (- 2) mang 0,1025), ảnh hưởng âm đến giá trị hàm mục tiêu. Còn ở dạng hàm bậc hai (X8

hệ số (+0,0003), ảnh hưởng dương đến hàm mục tiêu, tuy nhiên, hệ số này rất nhỏ nên

không ảnh hưởng đáng kể đến giá trị hàm mục tiêu. Như vậy, nếu tăng lượng dịch bắp

lên trên mức trung tâm sẽ làm giảm giá trị hàm mục tiêu. Kết quả thí nghiệm cho thấy,

khi lượng dịch bắp ở mức biên –α đã thu được sản lượng L-lysine cao nhất, đạt 38g/L

(thí nghiệm 11). Khi tăng lượng dịch bắp lên mức giá trị biên +α thì lượng L-lysine

trong canh trường giảm, thấp hơn so với mức trung tâm và mức (-1) (thí nghiệm 4).

Dịch bắp là nguồn nguyên liệu chứa nhiều thành phần: carbon, nitơ, biotine, thiamine,

muối khoáng và một số amino acid. Một lượng vừa đủ sẽ thúc đẩy quá trình sinh trưởng

và sinh tổng hợp sản phẩm của chủng giống, nâng cao năng suất. Tuy nhiên, hàm lượng

cao các thành phần này trong dịch lên men có thể gây tác dụng ngược lại, làm ức chế

quá trình sinh trưởng và sinh L-lysine của chủng thông qua việc gây ảnh hưởng đến khả

năng thẩm thấu của màng tế bào và hoạt động của các enzyme ngoại bào.

48

Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp lên lượng L-lysine được thể hiện qua đồ

thị đường mức hình 3.2.

Contour Plot of Lysine_CCD vs Dich chiet bap, (NH4)2SO4 (NH4)2SO4

150

32 34 36

Lysine_CCD < 32 34 – 36 – 38 – 38 >

125

i

100

p a b t e h c h c i D

75

50

20

25

40

35

30 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4

Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể hiện sự ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và dịch bắp lên lượng

L-lysine

Qua đồ thị ta thấy, giá trị tối ưu của hàm mục tiêu lớn hơn 38g/L tương ứng với

vùng màu xanh đậm phía ngoài cùng.

Tuy nhiên, để xác định chính xác cực trị hàm mục tiêu, ta dựa vào đồ thị tối ưu

trong hình 3.3.

49

Hình 3.3 Đồ thị tối ưu

Đồ thị cho thấy, cực trị hàm mục tiêu đạt 39,6881g/L khi (NH4)2SO4 ở mức giá trị

biên –α, tương đương 15,8579g/L và dịch bắp cũng ở mức giá trị biên –α, tương đương

29,2893 mL/L.

Như vậy, thông số tối ưu của 2 yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu, đó là

(NH4)2SO4 15,8579g/L và dịch bắp 29,2893 mL/L. Các yếu tố còn lại bố trí ở mức trung

tâm, bao gồm: glucose 50g/L, KH2PO4 1g/L, hỗn hợp muối khoáng 5mL/L, biotine

20µg/L, thiamine 150µg/L, tween 20 5mL/L. Sau 48 giờ lên men, lượng L-lysine thu

được theo lý thuyết là 39,6881g/L. Tiến hành thực nghiệm để đánh giá, lượng L-lysine

đạt 34g/L sau cùng thời gian lên men, chênh lệch không nhiều so với lý thuyết.

Tóm lại, bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được

thông số tối ưu môi trường lên men chủng bao gồm các thành phần sau: (NH4)2SO4

15,8579g/L, dịch bắp 29,2893mL/L, glucose 50g/L, KH2PO4 1g/L, hỗn hợp muối

khoáng 5mL/L, biotine 20µg/L, thiamine 150µg/L, tween 20 5mL/L. Sau 48 giờ lên men,

lượng L-lysine đạt 34g/L. Trên môi trường này, tiến hành thử nghiệm lên men fed-batch

nhằm nâng cao năng suất thu nhận L-lysine.

50

3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine

3.3.1. Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất

Trên môi trường tối ưu, tiến hành lên men dạng batch. Chất lượng giống bổ sung

vào môi trường lên men là 2,4 tỷ tế bào/mL. Lượng giống bổ sung là 7%. Kết quả thí

nghiệm được thể hiện qua các đồ thị trong hình 3.4.

Mật độ tế bào Log CFU/mL

g/L

9,5

70,0

9

60,0

8,5

50,0

8

Đường sót (g/L)

40,0

7,5

Lysine (g/L)

30,0

7

Mật độ TB (log CFU/mL)

20,0

6,5

10,0

6

0,0

5,5

0

20

40

60

Thời gian (giờ)

Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong lên men batch

Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine

Trên môi trường tối ưu, chủng thể hiện khả năng tăng sinh mạnh. Pha lag bắt đầu

từ 0 giờ đến 5 giờ, tế bào tăng trưởng chậm do đây là giai đoạn thích nghi, cảm ứng một

số enzyme để chuẩn bị bước vào pha tăng trưởng. Giai đoạn này, L-lysine đã bắt đầu

được hình thành.

Sau 5 giờ, tế bào bước vào pha tăng trưởng, trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ, mật độ

tế bào tăng nhanh. Mật độ tế bào tăng vọt từ 6,3 Log CFU/mL thời điểm 5 giờ lên 9,13

Log CFU/mL ở thời điểm 20 giờ. Giai đoạn này, chủng sử dụng cơ chất cho sự hình

51

thành sinh khối và tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, trong đó có L-lysine. L-lysine

tiếp tục tăng tuyến tính theo thời gian. Lượng đường giảm nhanh, chỉ còn 30g/L ở thời

điểm 20 giờ.

Qua 20 giờ, tế bào bước vào pha cân bằng, mật độ tế bào không tăng do lượng tế

bào sinh ra bằng lượng tế bào chết đi. Cơ chất lúc này được sử dụng cho sự hình thành

sản phẩm. L-lysine vẫn tăng cho đến 48 giờ, đạt 34g/L. Tuy nhiên, ở thời điểm 32 giờ

trở đi, lượng đường sót trong canh trường còn ít. Đến 48 giờ, lượng đường chỉ còn

10g/L nên lượng L-lysine trong giai đoạn này tăng rất chậm (2g/L). Vì thế, thời điểm 32

giờ là thích hợp cho ngừng lên men thu sản phẩm. Kéo dài thời gian lên men, lượng L-

lysine sinh ra không đáng kể mà lại tốn thêm chi phí, tính về mặt kinh tế không mang lại

hiệu quả.

Qua 40 giờ, tế bào bước vào pha suy vong. Lượng cơ chất cạn kiệt, một số sản

phẩm sinh ra trong quá trình trao đổi chất (acid) gây độc cho tế bào, gây hiện tượng chết

tế bào, làm giảm mật độ tế bào.

Lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine được nghiên cứu khá

nhiều trong và ngoài nước. Công trình nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài như

Jong W. Oh (1993) [11], Hadj Sassi (1988) [15] cho sản lượng L-lysine xấp xỉ 30g/L.

Một số tác giả trong nước như Hồ Sưởng (1980-1985), Nguyễn Thùy Châu (2006) [1],

Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Minh Tâm (2009) [7] nghiên cứu lên men trên

Corynebacterium glutamicum cũng cho sản lượng tương tự.

Dựa vào lượng đường sót trong canh trường, tiến hành tính toán khả năng sử dụng

đường của chủng giống, trên cơ sở này, tính toán lượng đường bổ sung từng giai đoạn

trong lên men fed-batch.

52

Bảng 3.7 Khả năng sử dụng đường của chủng trong lên men batch

Thời gian khảo sát Khả năng sử dụng đường Đường sót (g/L) (giờ) (g/L/giờ)

0 59,1

2 57,2 0,95

4 55,4 0,9

5 52 3,4

6 51 1

8 48,7 1,15

12 47,6 0,3

16 43,3 1,1

20 31,3 3

24 25,5 1,5

28 19,9 1,4

32 16,8 0,78

36 15,2 0,4

40 15 0,1

44 12,7 0,58

48 10,9 0,45

Qua bảng 3.6 ta thấy, lượng đường sót trong canh trường giảm theo thời gian do

chủng sử dụng để tăng sinh khối và hình thành các sản phẩm trao đổi chất. Tuy nhiên,

khả năng sử dụng đường ở mỗi giai đoạn khác nhau không giống nhau.

Khả năng sử dụng đường từng giai đoạn của chủng được tính như sau:

[đường sót (t2) – đường sót (t1)]/ (t2 – t1)

Trong đó, t1, t2 là thời điểm khảo sát.

Thời điểm 20 giờ là thời điểm cuối pha tăng trưởng, đầu pha cân bằng, lượng

đường trong canh trường chỉ còn 30g/L. Đồng thời, đây cũng là giai đoạn chủng sinh

tổng hợp L-lysine nên chúng tôi chọn thời điểm 20 giờ là thời điểm bắt đầu bổ sung cơ

chất.

53

Với hình thức fed-batch gián đoạn, chúng tôi chọn chu kỳ bổ sung cơ chất là 2 giờ

để phù hợp với công việc trong phòng thí nghiệm.

Chúng tôi chọn glucose là nguồn cơ chất bổ sung trong lên men fed-batch. Do cấu

tạo phân tử đơn giản, glucose là nguồn đường dễ sử dụng nhất, được vi sinh vật đồng

hóa đầu tiên khi vào môi trường nội bào. Các nguồn đường khác như sucrose,

maltose…phải được biến đổi thành glucose nhờ các enzyme đặc hiệu được mã hóa bởi

các gen tương ứng trong hệ gen của vi khuẩn rồi mới được đồng hóa. Ngoài ra, đây là

nguồn carbon tinh nên dễ dàng kiểm soát lượng đường trong canh trường. Việc sử dụng

rỉ đường hay dịch bắp có thể cho sản lượng L-lysine cao hơn nhưng đây là hai nguồn

nguyên liệu chứa nhiều thành phần và có tạp chất nên khó kiểm soát hàm lượng các chất

dinh dưỡng trong quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để so sánh khả

năng hình thành L-lysine của glucose với các đường khác. Kết quả, glucose cho sản

lượng cao hơn. Tác giả Tobias Georgi (2005) đã nuôi cấy Corynebacterium glutamicum

thu L-lysine trên ba nguồn cơ chất: glucose, fructose và sucrose. Tác giả thu được lượng

L-lysine cao hơn trên môi trường glucose [13]. Kiefer (2002) cũng thu được kết quả

tương tự khi nuôi cấy Corynebacterium glutamicum trên các nguồn đường này [20].

Căn cứ vào khả năng sử dụng đường của chủng (bảng 3.6), chúng tôi xác định

lượng đường cần bổ sung từng giai đoạn trong lên men fed-batch (Phụ lục 9). Tuy

nhiên, từ thời điểm 20 giờ, khả năng sử dụng đường của chủng giảm nên chúng tôi chọn

nồng độ dịch glucose bổ sung là 25%.

Tóm lại, lên men batch chủng Corynebacterium glutamicum -B-0632 thu nhận L-

lysine, chúng tôi thu được một số kết quả như sau:

• Thời điểm sinh khối cao nhất: 20 giờ

• Thời điểm thu L-lysine: 32 giờ

• Chu kỳ bổ sung cơ chất: 2 giờ

• Thời điểm bắt đầu bổ sung glucose cho lên men fed-batch: 20 giờ

3.3.2. Khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất

Nồng độ cơ chất trong môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm

hình thành. Nồng độ cơ chất quá cao sẽ gây áp lực thẩm thấu lên thành tế bào vi khuẩn,

54

ức chế khả năng hấp thụ các thành phần dinh dưỡng khác. Kết quả khảo sát ngưỡng ức

chế glucose đối với chủng được thể hiện qua đồ thị trong hình 3.5.

Mật độ tế bào Log CFU/mL

9,12

9,11

9,11

9,13

g/L 35

9,00

31,83

30,65

8,00

30

25,52

7,00

24,69

25

6,00

21,57

19,7

20

5,00

16,78

Lysine

4,00

15

3,00

Đường sót

10

2,00

5

1,00

0,09

Sinh khối (log CFU/mL)

0

0,00

10

50

75

100

Các nồng độ đường khảo sát (g/L)

Hình 3.5 Khả năng hình thành sinh khối, L-lysine và lượng đường sót khi nuôi cấy

chủng ở các nồng độ glucose khác nhau

Đồ thị cho thấy, các nồng độ đường khảo sát cho lượng sinh khối tương đương

nhau và tương đương với mẫu đối chứng, chứng tỏ các nồng độ này chưa phải là nồng

độ ức chế đối với sự hình thành sinh khối của chủng nghiên cứu.

Tuy nhiên, sự khác biệt về nồng độ đường ban đầu gây ảnh hưởng rõ rệt đến lượng

L-lysine. Đồ thị cho thấy, ở nồng độ glucose 10g/L, lượng L-lysine thu được là thấp

nhất (21,5g/L). Lượng L-lysine đạt cao nhất ở mẫu đối chứng, xấp xỉ 32g/L. Nồng độ

glucose cao hơn (75g/L, 100g/L) không làm tăng lượng L-lysine mà thậm chí còn làm

giảm, chứng tỏ khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng đã bị ức chế. Nồng độ đường

cao gây áp lực thẩm thấu lên màng tế bào, ảnh hưởng đến sự vận chuyển các chất qua

màng [2], dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, từ đó ảnh hưởng đến

khả năng sinh tổng hợp L-lysine. Tuy nhiên, nồng độ đường thấp sẽ không đáp ứng

55

được nhu cầu về dinh dưỡng của chủng, làm giảm khả năng hình thành sản phẩm. Có

thể thấy, nồng độ đường 10g/L đã được chủng đã sử dụng triệt để cho giai đoạn hình

thành sinh khối và một phần cho sản sinh L-lysine. Bước vào pha cân bằng, đây là giai

đoạn sinh tổng hợp L-lysine, lúc này nguồn cơ chất đã cạn kiệt, không đủ để chủng tiếp

tục hình thành L-lysine, dẫn đến lượng L-lysine sinh ra ít hơn. Do đó, việc khảo sát

nồng độ đường tối ưu cho quá trình lên men là cần thiết. Với mục đích thu nhận L-

lysine, nồng độ glucose trong canh trường cần duy trì trong giới hạn cho phép trên

10g/L và dưới 100g/L, tốt hơn là dao động xung quanh mức 50g/L. Việc tăng hay giảm

lượng đường ban đầu đều làm giảm lượng L-lysine.

Nghiên cứu của tác giả Hadj Sassi (1988) về sản xuất L-lysine ở chủng

Corynebacterium glutamicum sp. cho thấy, nồng độ glucose trong khoảng 60-233g/L

gây ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành L-lysine của chủng, nhưng nồng độ 65g/L

của glucose cho sản lượng L-lysine cao nhất [15].

Các tác giả Jong W. Oh, Seoung J.Kim, Young J. Cho, Nai H. Park, Jae H. Lee

(1993) đã so sánh khả năng tổng hợp L-lysine của hai chủng vi khuẩn Corynebacterium

glutamicum YJ 150 và Corynebacterium glutamicum CS 755. Trong đó, YJ 150 là

chủng ban đầu, sau khi gây đột biến tạo ra chủng CS 755 mang gen kháng S-(β-

aminoethyl)-L-cystein (AEC), arginine, methyl lysine, α-amino-β-hydroxyvaleric acid.

Để chứng minh vai trò của các đột biến đối với sản lượng L-lysine, các tác giả đã nuôi

cấy hai chủng này trên môi trường có hàm lượng glucose 75g/L, kết quả L-lysine thu

được: 30 g/L (chủng YJ 150) và 34 g/L (chủng CS 755) [11].

Tác giả Nguyễn Thùy Châu (2006) nghiên cứu khả năng sản xuất L-lysine của

chủng Corynebacterium glutamicum CM24, đây là chủng đột biến dị dưỡng

homoserine. Lên men trên môi trường có hàm lượng glucose 100g/L, hình thức lên men

chìm có sục khí đã thu được sản lượng L-lysine 22-25g/L. Lên men trên môi trường rỉ

đường, tác giả thu được sản lượng cao hơn (30g/L) [1].

Từ những nghiên cứu trên cho thấy, nguồn đường và nồng độ đường trong môi

trường có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình lên men. Tuy nhiên, chủng giống khác

nhau có yêu cầu về hàm lượng đường trong môi trường khác nhau. Ngoài ra còn phụ

thuộc vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.

56

Như vậy, trong môi trường lên men chủng Corynebacterium glutamicum-B-0632

thu nhận L-lysine, nồng độ glucose cần duy trì trong giới hạn: trên 10g/L và dưới

100g/L, mẫu đối chứng với nồng độ glucose 50g/L cho lượng L-lysine cao nhất, đạt xấp

xỉ 32g/L ở thời điểm 32 giờ.

Tóm lại, sau khi tiến hành một số thí nghiệm khảo sát, chúng tôi đưa ra được chế

độ fed-batch như sau:

- Nguồn cơ chất bổ sung: glucose

- Thời điểm bổ sung cơ chất: 20 giờ

- Chu kỳ bổ sung cơ chất: 2 giờ

- Nồng độ cơ chất bổ sung: 25%

Trên cơ sở này, tiến hành thử nghiệm lên men fed-batch thu nhận L-lysine.

3.3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận

L-lysine

Công nghệ lên men amino acid thường đòi hỏi nồng độ đường cao để thu được

nhiều sản phẩm. Tuy nhiên, lượng đường ban đầu cao trong môi trường nuôi cấy sẽ ức

chế khả năng sinh trưởng của tế bào, giảm khả năng trao đổi chất, từ đó làm giảm sản

lượng. Vì vậy, bắt đầu nuôi cấy với hàm lượng đường vừa đủ và bổ sung theo từng giai

đoạn sẽ cải thiện đáng kể sản lượng amino acid.

Giai đoạn đầu, lên men fed-batch được bố trí giống lên men batch. Tỷ lệ giống bổ

sung 7%, điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng, pH môi trường lên men 7-7,2, chế độ lắc

vòng 150 vòng/phút.

Thời điểm 20 giờ bắt đầu bổ sung glucose, chu kỳ bổ sung là 2 giờ giúp ổn định

lượng đường trong môi trường để chủng hoạt động tốt. Lên men trong 48 giờ, bổ sung

glucose 14 lần. Thể tích môi trường ban đầu là 250mL. Cuối mỗi thời điểm, lấy 5mL

mẫu để phân tích các chỉ tiêu: mật độ tế bào/mL, lượng L-lysine và đường sót, đồng

thời bổ sung 5mL dung dịch đường glucose 25%.

57

Kết quả lên men fed-batch được thể hiện qua đồ thị hình 3.6.

Mật độ tế bào Log CFU/mL

10

9,5

60,0

9

50,0

8,5

Đường sót (g/L)

40,0

8

Lysine (g/L)

7,5

30,0

Mật độ TB (log CFU/mL)

7

20,0

6,5

10,0

6

0,0

5,5

0

4

8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60

g/L 70,0

Thời gian (giờ)

Hình 3.6 Khả năng sinh trưởng, sinh L-lysine và lượng đường sót trong quá trình lên

men fed-batch chủng Corynebacterium glutamicum-B-0632

Việc bổ sung glucose trong suốt thời gian lên men đã làm tăng đáng kể lượng L-

lysine. Thời điểm 48 giờ, L-lysine đạt 43g/L, tăng đáng kể so với lên men batch ở thời

điểm 48 giờ với 34g/L. Khả năng sinh trưởng của chủng cũng mạnh hơn so với lên men

batch. Với hình thức lên men batch, qua 20 giờ nuôi cấy, sinh khối không tăng, sau đó

có xu hướng giảm. Đối với fed-batch, sinh khối vẫn tiếp tục tăng đến 48 giờ, đồ thị

không có biểu hiện đi xuống. Lượng đường sót trong canh trường có sự tăng giảm do

glucose được bổ sung thêm trong suốt quá trình lên men.

Các đồ thị 3.7, 3.8 và 3.9 thể hiện rõ hơn sự khác nhau giữa lên men batch và fed-

batch.

50

58

L-lysine g/L

45

40

35

30

25

fed-batch

batch

20

15

10

5

0

0

10

20

30

40

50

60

Thời gian (giờ)

Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine trong lên men batch và fed-batch

Trong 20 giờ đầu, lượng L-lysine là tương đương ở hai hình thức lên men. Đối với

fed-batch, sau 20 giờ, glucose bắt đầu được bổ sung vào môi trường lên men làm lượng

L-lysine ở những thời điểm sau cao hơn so với L-lysine cùng thời điểm thu được bằng

lên men batch. Nguyên nhân do nồng độ đường luôn được giữ ở mức phù hợp, hoạt

động trao đổi chất của chủng nghiên cứu luôn ở mức cao nên sinh ra nhiều sản phẩm.

Kết thúc quá trình, tại thời điểm 48 giờ, L-lysine đạt được ở lên men batch là 34g/L và

lên men fed-batch là 43g/L, tăng 21% so với dạng batch.

59

Mật độ tế bào Log CFU/mL

10

9,5

9

8,5

8

Fed-batch

7,5

Batch

7

6,5

6

5,5

5

0

10

20

30

40

50

60 Thời gian (giờ)

Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả năng sinh trưởng của chủng trong lên men batch

và fed-batch

Mật độ tế bào ở 20 giờ đầu lên men ở mức tương đương giữa hai hình thức lên

men. Sau khi được bổ sung thêm glucose từ giai đoạn 20 giờ trở đi, mật độ tế bào trong

lên men fed-batch cao hơn, chứng tỏ chủng tăng sinh mạnh hơn, lượng cơ chất bổ sung

đã được sử dụng. Cuối quá trình lên men, mật độ tế bào ở hình thức lên men batch bắt

đầu giảm (thời điểm 40 giờ), trong khi đó, ở hình thức fed-batch, mật độ tế bào vẫn

tăng, đồ thị biểu diễn không có xu hướng đi xuống.

70,0

60

Đường sót g/L

60,0

50,0

40,0

Fed-batch

30,0

Batch

20,0

10,0

0,0

0

10

20

30

40

50

60

Thời gian (giờ)

Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót trong lên men batch và fed-batch

Lượng đường sót trong canh trường có sự khác biệt rõ ở hai hình thức lên men.

Đối với batch, lượng đường sót giảm tuyến tính theo thời gian. Đối với fed-batch, lượng

đường sót có sự tăng giảm không đi theo đường tuyến tính do glucose được bổ sung

trong quá trình lên men. Tuy nhiên, lượng đường trong canh trường từ thời điểm 20 giờ

trở đi luôn được duy trì ở nồng độ thích hợp nên quá trình trao đổi chất của chủng diễn

ra mạnh, làm tăng khả năng sinh tổng hợp L-lysine.

Các công trình nghiên cứu của các tác giả nước ngoài về lên men fed-batch

Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine hầu hết đều thực hiện theo hình thức

fed-batch liên tục trên hệ thống tự động. Việc kiểm soát nồng độ oxy hoàn tan và pH

trong suốt quá trình lên men đều được tự động hóa. Lượng L-lysine thu được của những

nghiên cứu này rất cao, gấp đôi thậm chí gấp 3 lần so với lên men batch.

Tác giả J. Xu và M. Han (2013) lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum

trong fermentor 7L. Dung dịch bổ sung gồm glucose 800g/L và (NH4)2SO4 400g/L.

Lượng L-lysine thu được 96,8g/L chỉ sau 36 giờ lên men [33].

61

Tác giả Judith Becker (2011) lên men Corynebacterium glutamicum trên hệ thống

Biostat với bình lên men 5L. Dịch fed-batch bao gồm: 200g rỉ đường và 800g glucose được hòa tan trong 1,8L nước, hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. 200mL (NH4)2SO4

(40%) được hấp riêng. 0,8 mL dịch vitamine và 2mL antifoam được bổ sung sau. Lượng

L-lysine thu được là 120g/L sau 30 giờ nuôi cấy [8].

Tác giả Zhen Chen (2011) tiến hành lên men Corynebacterium glutamicum trên

fermentor 2L. Dịch bổ sung bao gồm glucose 50%, NH4Cl 4,5% và biotine 0,5mg/L.

Lên men trong 30 giờ thu được lượng L-lysine 58g/L [10].

Tác giả Mikiro Hayashi (2006) lên men fed-batch hai chủng Corynebacterium

glutamicum ADL-3 và AHD-2 trong fermentor 5L. Sau 30 giờ, lượng L-lysine thu được

lần lượt là 83g/L và 73g/L. Nguồn cơ chất được chọn để bổ sung trong suốt quá trình

lên men là glucose [17].

Từ những nghiên cứu trên cho thấy, lượng L-lysine thu nhận được khác nhau tùy

chủng giống, tùy môi trường lên men, thành phần cũng như nồng độ những chất bổ

sung. Nhưng có một điều không thể phủ nhận đó là, hình thức lên men fed-batch luôn

thu được lượng L-lysine cao hơn nhiều so với lên men batch.

Bảng 3.8 So sánh lên men batch và fed-batch

Hình thức lên Tổng thời gian L-lysine Năng suất

men lên men (giờ) (g/L) (g/L/giờ)

Fed-batch 48 43 0,9

Batch 48 34 0,7

Từ những số liệu trên cho thấy, lên men fed-batch cho sản lượng cao hơn hẳn lên

men batch trong cùng thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, lên men fed-batch dạng liên tục

cần có hệ thống lên men cùng các thiết bị hỗ trợ kiểm soát môi trường trong suốt quá

trình vận hành. Đây là những thiết bị đắt tiền, người vận hành cần có những kiến thức

nhất định để điều khiển hệ thống. Đây là nguyên nhân khiến hình thức lên men batch

hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi hơn trong công nghiệp lên men sản xuất amino acid.

62

Tóm lại, sau khi lên men fed-batch chủng Corynebacterium glutamicum-B-0632,

bắt đầu bổ sung glucose tại thời điểm 20 giờ, nồng độ glucose bổ sung 25%, chúng tôi

thu được lượng L-lysine cao hơn 21% so với dạng batch sau 48 giờ. Kết quả khả quan

này cho phép làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo với quy mô lớn hơn trên nguồn

cơ chất ít tốn kém hơn để tiết kiệm chi phí và nâng cao năng suất.

63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

A. Kết luận

Qua những thí nghiệm khảo sát, đề tài có những kết luận sau:

- Chủng nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (+), có khả năng đồng hóa

nhiều nguồn carbon và nitơ khác nhau.

- Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được môi

trường tối ưu lên men theo mẻ (batch) chủng Corynebacterium glutamicum -B-0632 thu

nhận L-lysine: (NH4)2SO4 15,8579g/L, dịch bắp 29,2893mL/L, glucose 50g/L, KH2PO4

1g/L, hỗn hợp muối khoáng 5mL/L, biotine 20µg/L, thiamine 150µg/L, tween 20

5mL/L. Lượng giống bổ sung 7%, điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, pH 7-7,2, chế

độ lắc vòng 150 vòng/phút. Kết quả, sau 48 giờ lên men, sản lượng L-lysine thu được

trên môi trường này đạt 34g/L. Tuy nhiên, nên thu nhận L-lysine ở thời điểm 32 giờ

(32g/L) để tiết kiệm chi phí kéo dài thời gian lên men.

- Chế độ fed-batch:

Nguồn cơ chất bổ sung: glucose

Thời điểm bổ sung cơ chất: 20 giờ

Chu kỳ bổ sung cơ chất: 2 giờ

Nồng độ cơ chất bổ sung: 25%

- Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) chủng Corynebacterium

glutamicum -B-0632 trên môi trường tối ưu, sau 48 giờ, lượng L-lysine đạt 43g/L, tăng

21% so với lên men theo mẻ (batch).

64

B. Kiến nghị

Với những kết quả đề tài đã đạt được, chúng tôi kiến nghị một số hướng như sau

• Bố trí thí nghiệm khảo sát ngưỡng ức chế sâu hơn.

để góp phần hoàn thiện đề tài:

• Tối ưu điều kiện lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine.

• Tối ưu quá trình lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium

glutamicum.

• Định lượng amino acid L-lysine bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC) ở thí nghiệm tối ưu.

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo tiếng Việt

1. Nguyễn Thùy Châu (2006), Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản

xuất chế phẩm axit amin và enzim từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải sản ở quy

mô bán công nghiệp, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp nhà nước.

2. Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục, Việt Nam.

3. Nguyễn Văn Dự; Nguyễn Đăng Bình (2011), Quy hoạch thực nghiệm trong kỹ

thuật, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

4. Nguyễn Đức Lượng (2010), Vi sinh vật học công nghiệp, Nxb Đại học Quốc gia,

TP. Hồ Chí Minh.

5. Nguyễn Thị Hoa Lý; Lê Đức Ngoan; Lê Khắc Huy (1996), Hiệu quả bổ sung chế

phẩm L.lysine trong khẩu phần gà đẻ giống Brown Nick, Tạp chí NN& CNTP, 11,

p. 742-744.

6. Nguyễn Thị Hoa Lý; Lê Đức Ngoan; Lê Khắc Huy (1996), Hiệu quả bổ sung chế

phẩm L-lysine và DL-methionine trong khẩu phần gà thịt AE ở Quảng Nam-Đà

Nẵng, Tạp chí NN& CNTP, 4, p. 172-174.

7. Trần Thị Minh Tâm; Nguyễn Thúy Hương (2009), Tối ưu quá trình lên men thu

nhận amino acid L-lysine từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-656,

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 25, p. 172-178.

Tài liệu tham khảo tiếng Anh

8. Becker Judith, et al. (2011), From zero to hero design-based systems metabolic

engineering of Corynebacterium glutamicum for l-lysine production, Metabolic

engineering, 13, (2), p. 159-168.

9. Bott Michael and Eggeling, Lothar (2005), Handbook of Corynebacterium

glutamicum, Taylor & Francis Group, United State of America.

10. Chen Zhen, et al. (2011), Coevolutionary analysis enabled rational deregulation of

allosteric enzyme inhibition in Corynebacterium glutamicum for lysine production,

Applied and environmental microbiology, 77, (13), p. 4352-4360.

66

11. Cho Young J, et al. (1993), Strain of Corynebacterium glutamicum and method for

producing L-lysine, Google Patents.

12. Faurie Robert (2003), Advances in biochemical engineering/Biotechnology 79, Vol.

79, Springer, Berlin.

13. Georgi Tobias, Rittmann, Doris, and Wendisch, Volker F (2005), Lysine and

glutamate production by Corynebacterium glutamicum on glucose, fructose and

sucrose: Roles of malic enzyme and fructose-1, 6-bisphosphatase, Metabolic

engineering, 7, (4), p. 291-301.

14. Gous Rm and Morris, Tr (1985), Evaluation of a diet dilution technique for

measuring the response of broiler chickens to increasing concentrations of lysine,

British poultry science, 26, (2), p. 147-161.

15. Hadj Sassi A, et al. (1988), Optimisation of L-lysine production by

Corynebacterium sp in fed-batch cultures, Biotechnology letters, 10, (8), p. 583-

586.

16. Haefner Stefan, et al. (2011), Methods for the preparation of lysine by fermentation

of Corynebacterium glutamicum, Google Patents.

17. Hayashi Mikiro, et al. (2006), A leuC mutation leading to increased L-lysine

production and rel-independent global expression changes in Corynebacterium

glutamicum, Applied microbiology and biotechnology, 72, (4), p. 783-789.

18. Hickling D, Guenter, W, and Jackson, Me (1990), The effects of dietary methionine

and lysine on broiler chicken performance and breast meat yield, Canadian Journal

of Animal Science, 70, (2), p. 673-678.

19. Hsieh Chung-Lung, Hsiung, Kuang-Pin, and Su, Jong-Ching (1995), Determination

of lysine with ninhydrin-ferric reagent, Analytical biochemistry, 224, (1), p. 187-

189.

20. Kiefer P, Heinzle, E, and Wittmann, C (2002), Influence of glucose, fructose and

sucrose as carbon sources on kinetics and stoichiometry of lysine production by

Corynebacterium glutamicum, Journal of Industrial Microbiology and

Biotechnology, 28, (6), p. 338-343.

67

21. Kiefer Patrick, et al. (2004), Comparative metabolic flux analysis of lysine-

producing Corynebacterium glutamicum cultured on glucose or fructose, Applied

and environmental microbiology, 70, (1), p. 229-239.

22. Leclercq Bernard (1998), Lysine: Specific effects of lysine on broiler production:

comparison with threonine and valine, Poultry Science, 77, (1), p. 118-123.

23. Lee H-W, Pan, J-G, and Lebeault, J-M (1998), Enhanced L-lysine production in

threonine-limited continuous culture of Corynebacterium glutamicum by using

gluconate as a secondary carbon source with glucose, Applied microbiology and

biotechnology, 49, (1), p. 9-15.

24. Ohnishi J, et al. (2002), A novel methodology employing Corynebacterium

glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant,

Applied microbiology and biotechnology, 58, (2), p. 217-223.

25. Ohnishi Junko and Ikeda, Masato (2006), Comparisons of potentials for L-lysine

production among different Corynebacterium glutamicum strains, Bioscience,

biotechnology, and biochemistry, 70, (4), p. 1017-1020.

26. Pelechová J, et al. (1980), Biosynthesis of L-lysine in Corynebacterium glutamicum

on sucrose, ethanol and acetic acid, Folia microbiologica, 25, (4), p. 341-346.

27. Peters-Wendisch Petra, et al. (2012), Biotin protein ligase from Corynebacterium

glutamicum: role for growth and L-lysine production, Applied microbiology and

biotechnology, 93, (6), p. 2493-2502.

28. Stanbury Peter F, Whitaker, Allan, and Stephen, J (1994), Principles of

Fermentation Technology, Butterworth-Heinemann (Elsevier).

29. Tam Tran Thi Minh and Huong, Nguyen Thuy (2014), Optimization of

Corynebacterium glutamicum immobilization process on bacterial cellulose carrier

and its application for lysine fermentation, Journal of engineering (IOSRJEN), 4,

(07), p. 33-38.

30. Tam Tran Thi Minh and Huong, Nguyen Thuy (2014), Optimization of

Corynebacterium glutamicum Immobilization on Alginate and Investigation into its

Storage Conditions, International journal of modern engineering research, p. 66-71.

68

31. Tateno Toshihiro, Fukuda, Hideki, and Kondo, Akihiko (2007), Direct production

of L-lysine from raw corn starch by Corynebacterium glutamicum secreting

Streptococcus bovis α-amylase using cspB promoter and signal sequence, Applied

microbiology and biotechnology, 77, (3), p. 533-541.

32. Tateno Toshihiro, Fukuda, Hideki, and Kondo, Akihiko (2007), Production of L-

Lysine from starch by Corynebacterium glutamicum displaying α-amylase on its

cell surface, Applied microbiology and biotechnology, 74, (6), p. 1213-1220.

33. Xu Jianzhong, et al. (2013), Improvement of L lysine production combines with

minimization of by products synthesis in Corynebacterium glutamicum, Journal of ‐

Chemical Technology and Biotechnology, p. ‐

34. Xu Jianzhong, et al. (2014), Metabolic engineering Corynebacterium glutamicum

for the l-lysine production by increasing the flux into l-lysine biosynthetic pathway,

Amino Acids, p. 1-11.

35. Xu Jianzhong, et al. (2013), Improvement of cell growth and l-lysine production by

genetically modified Corynebacterium glutamicum during growth on molasses,

Journal of industrial microbiology & biotechnology, 40, (12), p. 1423-1432.

36. http://biomatics.org/index.php/The_Amino_Acid_Code (19h, 23/7/2014).

37. http://bacmap.wishartlab.com/organisms/485 (21h, 23/7/2014).

69

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Đường chuẩn sự tương quan giữa OD 560nm và lượng đường

Phương pháp dựng đường chuẩn đường khử: hòa tan 1g đường glucose trong

200mL nước cất. Pha loãng ở những nồng độ thích hợp. Hút 3mL dịch ở mỗi nồng độ

pha loãng vào ống nghiệm và bổ sung 1mL thuốc thử DNS. Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy ở 1000C trong 5 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở

0,0006

y = 0,00059x + 0,00002 R² = 0,99499

bước sóng 560nm.

đường khử g/L

0,0005

0,0004

0,0003

đường khử

0,0002

Linear (đường khử)

0,0001

0

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1 OD

Ph ụ lục 2. Ph ản ứn g mà u của đư ờng kh

ử và DNS

70

300.000.000

Phụ lục 3. Đường chuẩn sự tương quan giữa OD 600nm và mật độ tế bào

Mật độ tế bào TB/mL

250.000.000

y = 662.567.036,43111x - 1.180.605,86170 R² = 0,99998

200.000.000

150.000.000

mật độ tb

100.000.000

Linear (mật độ tb)

50.000.000

0

0

0,1

0,2

0,3

0,4

-50.000.000

OD

Phụ lục 4. Phương pháp dựng đường chuẩn L-lysine

Khối lượng L-lysine Nước cất bổ sung Mẫu L-lysine Ký hiệu (mL) tương đương (g/L)

50 2g 40 A

40 8 mL A 2 B

30 6 mL A 4 C

25 5 mL A 5 D

20 4 mL A 6 E

15 3 mL A 7 F

10 2 mL A 8 G

5 1 mL A 9 H

0 0 mL A 10 I

Hút 20µL dịch từ mỗi mẫu A, B…cho vào ống nghiệm sạch, bổ sung 660µL

dung dịch A và 370µL dung dịch B. Lắc đều, đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy

trong 20 phút. Sau đó làm lạnh các ống nghiệm dưới vòi nước. Bổ sung thêm 4mL dung

dịch DMSO và 6mL nước cất. Lắc đều và đo ở bước sóng 470nm.

71

60

Phụ lục 5. Đường chuẩn sự tương quan giữa OD 470nm và lượng L-lysine

L / g

y = 3946x - 2,099 R² = 0,918

e n i s y L

50

40

duong chuan lysine

30

Linear (duong chuan lysine)

20

10

0

0

0,005

0,01

0,015

OD

Phụ lục 6. Phương pháp chế biến rỉ đường

Rỉ đường được chế biến theo phương pháp của Amin (2007) như sau: 1 kg rỉ

đường, bổ sung thêm 3mL H2SO4 đậm đặc, cho thêm nước cất đủ 1L. Đun hỗn hợp trên ở 1000C trong 30 phút, sau đó để nguội trong 24 giờ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/20

phút, thu phần dịch. Sử dụng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 560nm, xác định

lượng đường trong rỉ đường.

Phụ lục 7. Phương pháp chế biến dịch bắp

Dịch bắp được thu nhận như sau: 400g bắp khô (tương đương 1500g bắp tươi, độ ẩm trung bình của hạt bắp 72,37%), thêm 3L nước cất, đun ở 1000C đến khi thể tích

dịch còn 1L, thu phần dịch. Xác định lượng đường trong dịch bắp sử dụng phương pháp

đo quang phổ ở bước sóng 560nm.

72

Phụ 8. Thành phần hỗn hợp muối khoáng trong môi trường tối ưu

MgSO4: 1g

FeSO4: 100mg

MnSO4: 100mg

ZnSO4: 100mg

CuSO4: 10mg

Hòa tan hỗn hợp trên trong 50mL nước cất.

Phụ lục 9. Thành phần dịch bắp

Tổng lượng đường tự do 6,8% (w/v) Sodium 0,3-1%

Tổng lượng nitrogen: % (w/v) 0,003-0,3% Mg

Alanine 0,01-0,3% Fe 4

Arginine 0,01-0,03% Ca 25

Acid glutamic 0,001-0,003% Cr 8

Leucine Vitamine 41-49mg/g 8

Proline Biotine 14,5-21,5mg/g 6

Isoleucine Ca-pantothenate 0,26-0,6mg/g 5

Threonine Acid folic 30-40mg/g 3,5

Valine Nicotinamid 3,9-4,7mg/g 3,5

Phenylalanine 3,5

Methionine 2

Cysteine 1

Phụ lục 10. Tính nồng độ dịch glucose bổ sung từng thời điểm trong lên men fed-

batch

Hình thức lên men: fed-batch gián đoạn, không thay đổi thể tích.

Thể tích dịch glucose bổ sung từng thời điểm: 5 mL.

Thể tích dịch lên men: 250 mL.

Thời điểm 20 giờ:

Nồng độ đường sót: 31,3 g/L, tương đương 7,825g.

Nồng độ đường tối ưu: 50g/L, tương đương 12,5g.

73

Gọi a là lượng glucose có trong 5mL dịch bổ sung.

Ta có: a + 7,825 = 12,5

a = 4,675 (g)

Vậy, nồng độ dịch glucose bổ sung thời điểm 20 giờ là 4,675 x 1000 : 5 = 935 g/L,

nghĩa là 93,5%.

Tương tự, xác định được nồng độ glucose bổ sung cho các giai đoạn tiếp theo.

Thời điểm (giờ) Nồng độ dịch glucose bổ sung (%)

20 93,5

24 122,5

28 150,5

32 166

36 174

40 175

44 186,5

48 195,5

Tuy nhiên, từ thời điểm 20 giờ, khả năng sử dụng đường của chủng giảm nên cần

giảm nồng độ dịch glucose bổ sung.