Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ; đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn nội sinh và xác định sự có mặt của ba gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases I (PKS-I), polyketide synthases II (PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS). Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh Phú Thọ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- Nguyễn PhúTâm PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG TẠI TỈNH PHÚ THỌ Chuyên ngành vi sinh vật học Mãsố: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. PhíQuyết Tiến HÀ NỘI - 2016
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu vàkết quả đƣợc công bố trong luận văn làhoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào khác. HàNội, ngày 9 tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn PhúTâm
ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. PhíQuyết Tiến chủ nhiệm đề tài VAST04.07/16-17 đã hết lòng giúp đỡ, động viên vàtạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tiếp theo, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, côcủa trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái vàTài Nguyên sinh vật và các thầy, cô của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tì nh giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS. Vũ Thị Hạnh Nguyên, NCS. Quách Ngọc Tùng vàcác cán bộ phòng Công nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo nhiệt tình, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã giúp đỡ, động viên vàtạo điều kiện cho tôi trong suốt quátrì nh học tập. HàNội, ngày 9 tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn PhúTâm
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................... viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu ...................................... 3 1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh .......................................................... 3 1.1.2. Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh ................................ 4 1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ............................... 5 1.1.3.1. Kháng ung thƣ, kháng viêm ................................................. 5 1.1.3.2. Kiểm soát sinh học ............................................................... 7 1.1.3.3. Một số dƣợc chất khác từ xạ khuẩn nội sinh ....................... 7 1.1.4. Tình hì nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh ......................................... 9 1.1.4.1. Tì nh hình nghiên cứu trên thế giới ...................................... 9 nh hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................... 10 1.1.4.2. Tì 1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ................................... 12 1.3. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu15 1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh ........................................... 15 1.3.2. Các gen tham gia vào quátrình tổng hợp kháng sinh vàcác hợp chất trao đổi thứ cấp ................................................................................ 17 1.3.2.1. Gen chức năng pks-I, pks-II tham gia tạo polyketide đa vòng thơm ....................................................................................... 17 1.3.2.2. Gen chức năng nrps ........................................................... 18 1.3.2.3. Đánh giá đa dạng gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS ....... 18 1.3.3. Chất kháng sinh và kháng sinh điều trị ung thƣ nhóm anthracycline ........................................................................................... 20
iv 1.4. Cây Màng tang vàtiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang .................................................................................................................. 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 24 2.1.1. Mẫu cây Màng tang, chủng giống vi sinh vật ............................... 24 2.1.2. Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu.......................................... 24 2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy...................................................................... 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 25 2.2.1. Lấy mẫu cây Màng tang ................................................................ 25 2.2.2. Phƣơng pháp xử lýbề mặt mẫu .................................................... 25 2.2.4. Khuếch đại gen mãhóa PKS-I, PKS-II, NRPS của xạ khuẩn ...... 26 2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT28 ....... 26 2.2.5.1. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin ............................................................................................ 26 2.2.5.2. Quan sát đặc điểm cuống sinh bào tử vàbề mặt bào tử .... 27 2.2.5.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................. 27 2.2.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT28 dựa trên phân tích trì nh tự gen 16S rDNA................................................................................................ 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 30 3.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh PhúThọ ........... 30 3.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang .................................. 32 3.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang....... 32 3.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trƣờng phân lập 33 3.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty .... 34 3.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ................... 35 3.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ................... 35 3.3.2. Xác định gen mãhóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh ....................................................................................... 39
v 3.3.3. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline .............. 41 3.4. Đặc điểm sinh học vàphân loại của chủng xạ khuẩn MPT28 ................. 42 3.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT28 ................................. 43 3.4.1.1. Đặc điểm hình thái vàbề mặt chuỗi bào tử ....................... 43 3.4.1.2. Đặc điểm sinh hóa.............................................................. 44 3.4.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ muối, pH, nhiệt độ tới khả năng sinh trƣởng của xạ khuẩn ................................................................ 45 3.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT28 .......................................................................... 46 3.4.2.1. Khuếch đại gen 16S rDNA ................................................ 46 nh tự đoạn gen 16S rDNA ..................................... 46 3.4.2.2. Giải trì CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 48 4.1. Kết luận .................................................................................................... 48 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 48 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 57
vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hì nh thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI vàIDA ......................................................... 21 Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập trên một số môi trƣờng đặc hiệu sau 6 tuần nuôi cấy....................................................30 Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân bố trên các bộ phận của cây Màng tang .................................................................................................................. 32 Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang đƣợc phân lập trên các loại môi trƣờng khác nhau .............................................................................. 33 Hình 3.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh đƣợc phân theo nhóm màu ...... 35 Hình 3.5. Hoạt tí nh kháng Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh ............... 37 Hình 3. 6. Sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I, pks-II của một số chủng xạ khuẩn nội sinh đại diện ................................................................................... 39 Hình 3. 7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps của một số chủng xạ khuẩn nội sinh đại diện .................................................................................................... 40 Hình 3. 8. Hình thái khuẩn lạc (A) trên môi trƣờng ISP1 vàbề mặt chuỗi bào tử (B) dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 7.500 lần của chủng MPT28 ............................................................................................................. 44 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0% ................................................................................................... 46
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ............................................................................................... 9 Bảng 1.2. Xạ khuẩn mới đƣợc phân lập từ các cây dƣợc liệu ........................ 14 Bảng 1.3. Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh ...................................... 16 Bảng 1.4. Tần xuất xuất hiện gen pks-I, nrps trong các phân nhóm xạ khuẩn khác nhau.........................................................................................................19 nh tự cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.1. Trì 16S rDNA………………………………………………………………........28 Bảng 3.1. Đặc điểm hì nh thái của các chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ mẫu cây Màng tang...............................................................................31 Bảng 3.2. Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 25 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang ...................................... 36 Bảng 3.3. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn .... 37 Bảng 3.4. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh anthracycline của 14 chủng xạ khuẩn nội sinh ............................................... 41 Bảng 3.5. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng MPT28 ............ 42 Bảng 3.6. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT28 khi nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau ............................................................................................. 43 Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nitơ của chủng xạ khuẩn MPT28 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C ....................................................................... 44 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng của chủng MPT28 .................................................................................................. 45 Bảng 3.9. Trì nh tự gen mãhóa 16S rDNA của chủng MPT28 ....................... 47
viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Tên đầy đủ 1 ACCd Aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase 2 ACP Acyl carrier protein 3 AT Acyl transferase 4 CA Citrate acid-agar 5 DAB Deacetil baceatin 6 DNA Deoxyribonucleotide acid 7 DNR Daunorubicin 8 DOX1 Doxorubicin 9 EPI Epirubicin 10 HGT Horizontal gene transfer 11 HV Humic acid-agar 12 IAA Indol-3-acetic acid 13 IDA Idarumycin 14 KS Ketosynthase 15 MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 16 NaOCl Sodium hypochlorite 17 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 18 PKS Ppolyketide synthase 19 PKS-I Polyketide synthase I 20 PKS-II Polyketide synthase II 21 RNA Ribonucleic acid 22 RA Raffinose-histidine agar 23 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar 24 VSV Vi sinh vật
1 MỞ ĐẦU Vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh là vấn đề nghiêm trọng vàthu hút mối quan tâm rất lớn của cộng đồng. Vìvậy, việc nghiên cứu, lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ƣu tiên hàng đầu của các nhàkhoa học vàcác công ty dƣợc phẩm trên thế giới. Cho đến nay, các nhàkhoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng nhƣ các loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của ngƣời bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra. Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật là một nguồn tự nhiên quan trọng trong điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật vàhỗ trợ điều trị chống ung thƣ. Chẳng hạn, cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) làcây bụi thuộc họ Lauraceae, trong quả Màng tang rất giàu tinh dầu, lƣợng tinh dầu tối đa trong quả làkhoảng 5% trọng lƣợng tƣơi. Thành phần chính của tinh dầu làcitral cóhoạt tính sinh học nhƣ chống viêm, chống oxy hóa, diệt côn trùng, kháng khuẩn, chống ung thƣ. Cây quế (Cinamomum loureiri) chứa dƣợc chất trong tinh dầu của lá, vỏ cây vàquả với 90% làcinnamaldehyde cóhoạt tí nh kháng khuẩn cao đối với cả vi khuẩn Gram (+) vàvi khuẩn Gram (-). Ngoài giá trị khoa học, thành phần của cây mang lại, cây dƣợc liệu còn là môi trƣờng cho các xạ khuẩn nội sinh (sống trong các loại mô thực vật) có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh. Theo các nghiên cứu, ƣớc tí nh khoảng 70% các kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên đƣợc sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay đƣợc sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Gần đây, một số công bố cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội sinh tạo ra trên cây dƣợc liệu không chỉ có số lƣợng phong phú màcòn có sự đa dạng về chức năng nhƣ tính kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát sinh học. Tuy nhiên, số lƣợng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang nói riêng và cây dƣợc liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Xuất phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề
2 tài: “Phân lập, đánh giá đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang tại tỉnh PhúThọ”. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm 3 nội dung chính: - Phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ. - Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn nội sinh và xác định sự có mặt của ba gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases I (PKS-I), polyketide synthases II (PKS-II) vànonribosomal peptide synthetase (NRPS). - Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao.
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dƣợc liệu 1.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh nh nghiên cứu trên thế giới công bố về tƣơng Hiện nay, nhiều công trì tác giữa thực vật vàvi sinh vật (VSV), trong đó VSV đóng vai trò nhƣ tác nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật, phân giải phospho khóhoàtan, cố định nitơ tự do, tăng độ phìcủa đất... [16], [53]. Phần lớn các VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc vàxạ khuẩn đƣợc phân lập từ đất, vùng rễ, bề mặt hoặc trong các môthực vật. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh đƣợc đƣa ra khi Smith và cộng sự (1957) phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp. có khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong môcây càchua không nhiễm bệnh [58]. Từ đó, đã có nhiều định nghĩa khác nhau về VSV nội sinh nhƣng định nghĩa của Bacon vàWhite (2000): „„VSV nội sinh lànhững VSV sinh trƣởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ‟‟ đã đƣợc các nhàVSV học thừa nhận [11]. Theo tài liệu, định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hƣởng màcòn tăng cƣờng khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trƣởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất... [9]. Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn đƣợc chú ý bởi khả năng tổng hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [39]. Song song với tác dụng dƣợc lý thu nhận từ xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh vật học đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học (biocontrol) của xạ khuẩn nội sinh trong suốt hai thập kỷ qua [61], [62]. Xạ khuẩn đã đƣợc chứng minh khả năng tăng cƣờng, thúc đẩy tăng trƣởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cƣờng khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [4]. Những hiểu biết về sinh lý vàmối tƣơng tác phân tử giữa xạ khuẩn vàthực vật lànhững đặc tí nh quan trọng để khai thác những đặc tí nh cólợi của xạ khuẩn nội sinh trong kích thích sinh trƣởng thực vật và lĩnh vực khác.
4 Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định vai tròquan trọng của xạ khuẩn trong sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong môthực vật làrất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất cóhoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh đƣợc chứng minh làrất đa dạng về mặt số lƣợng vàhoạt tính sinh học nhƣ: các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thƣ, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng... [11], [51]. Vìvậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất cóhoạt tính sinh học nói chung vàhoạt tí nh kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu tự nhiên đang là hƣớng nghiên cứu triển vọng của các nhàkhoa học trên thế giới. 1.1.2. Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn cƣ trú trong mô thực vật bị ảnh hƣởng lớn bởi các yếu tố môi trƣờng nhƣ: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lƣợng mƣa, cƣờng độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ... Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực vật [50]. Theo các công trình công bố, quátrình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần xử lýbề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt. Do đó, phải khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trƣớc khi phân lập. Sodium hypochlorite (NaOCl) làmột trong những tác nhân oxy hóa phổ biến đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt. Mẫu thực vật đƣợc ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nƣớc vô trùng nhằm loại bỏ lƣợng NaOCl còn dƣ. Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng đƣợc sử dụng nhƣ chất khử trùng bề mặt hiệu quả [43]. Năm 1992, Sardi và cộng sự công bố sử dụng hơi của propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vìhóa chất khử trùng dạng lỏng [62]. Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với qua trì nh phân lập VSV nội sinh. Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bƣớc khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp
5 ethanol vàmột số chất khử trùng khác thìkhông phân lập đƣợc xạ khuẩn nội sinh. Hiệu quả khử trùng bề mặt đƣợc tăng cƣờng bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt nhƣ Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật [13]. Phần mẫu đã khử trùng đƣợc đặt vào trên môi trƣờng thạch thí ch hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C. Trong quátrì nh phân lập, các nhà nghiên cứu thƣờng gặp phải làVSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu tiên là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật. Để ngăn chặn sự sinh trƣởng của vi khuẩn vànấm không mong muốn cũng nhƣ tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, một số môi trƣờng chọn lọc đã đƣợc sử dụng nhƣ: môi trƣờng thạch humic acid-vitamin, môi trƣờng thạch casein tinh bột, cao nấm men, môi trƣờng S… [14], [35], [39]. Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh nhƣ acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh vànâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn vànấm [30], [51]. 1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật Phần lớn xạ khuẩn nội sinh cóthể sống trong các môthực vật vàkhông gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quátrình phát triển bình thƣờng của cây. Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn đƣợc nhiều nhàkhoa học nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thƣ, enzyme, chất kí ch thích sinh trƣởng thực vật, ức chế vàkiểm soát bệnh thực vật... 1.1.3.1. Kháng ung thư, kháng viêm Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tí nh kháng, ức chế tế bào ung thƣ từ xạ khuẩn nội sinh đang là hƣớng nghiên cứu mới của các nhàkhoa học trên thế giới. Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội sinh có mối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với cây chủ. Một số giả thuyết nhận định nh sinh học đƣợc tiếp rằng gen liên quan tới tổng hợp các hợp chất cóhoạt tí nhận từ quá trình trao đổi chất giữa VSV và thực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT). Nhờ đó các nhà VSV học đã mở ra triển vọng sản xuất các hợp chất sinh học cónguồn gốc từ thực vật
6 nh nuôi cấy VSV, vídụ nhƣ chất kháng tế bào ung thƣ paclitaxel nhờ quátrì phổ biến trên cây thông đỏ (Taxus sp.) đƣợc tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatospora sp. vàmột số nấm cộng sinh khác [39]. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra các kháng sinh mới trên xạ khuẩn nội sinh có tỷ lệ khácao so với xạ khuẩn phân lập từ đất hoặc bề mặt thực vật. Chẳng hạn kháng sinh mới cótên naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) đƣợc phát hiện lần đầu tiên từ Streptomyces sp. CS nội sinh trong cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại cây thuốc cótác dụng điều trị ung thƣ, hoạt huyết... Kết quả kiểm tra hoạt tí nh sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc ức chế dòng tế bào P388 vàA-549 ở nồng độ ức chế lần lƣợt là0,07 và 3,17 µM, nhƣng không có hoạt tí nh kháng Staphylococcus aureus và vi khuẩn lao [40], [72]. Ngoài ra, năm chất mới thuộc phân lớp 16 của nhóm macrolide đƣợc tách chiết vàcho kết quả ức chế mạnh dòng tế bào MDA-MB-435 trong điều kiện in vitro [72]; hai chất mới thuộc nhóm macrolide thu nhận từ Streptomyces sp. ls9131 gần đây đƣợc phân lập trên cây mỹ đăng mộc (M. hookeri), trong đó hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thƣ mạnh vàhoạt tính kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao [40]. Trƣớc đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7- dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh, thƣờng thu nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau. Nhƣng gần đây, nh công bố rằng hai hợp chất này cũng đƣợc tìm thấy trong S. nhiều công trì aureofaciens CMUAc130 nội sinh [63], [64]. Hoạt tính kháng ung thƣ của hai chất trên không chỉ hì nh thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 và tác nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà còn cảm ứng nitric oxide synthase và cyclooxygenase-2 trong lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW 264,7. Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất vàức chế sự hì nh thành TNF-α [63].
7 Do vậy, hiện nay xạ khuẩn nội sinh lànguồn tiềm năng cần đƣợc quan nh sinh học mới và thúc đẩy tìm kiếm tâm nhằm khai thác các chất cóhoạt tí các loại thuốc mới. 1.1.3.2. Kiểm soát sinh học Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của các nhàVSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do đặc tí nh nội sinh và tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh. Nhiều nghiên cứu chứng minh đặc tính bảo vệ cây chủ của xạ khuẩn nội sinh chống lại các VSV gây bệnh từ đất nhƣ Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var. tritici, F. oxysporum, Pythium aphanidermatum và Colletotrichum orbiculare [13], [18], [23], [24]. Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi chất nhƣ chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone... Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kí ch thích các thụ thể tế bào. Vídụ nhƣ chủng S. galbus R-5 không chỉ sinh cellulase, pectinase mà còn sản xuất actinomycin X2 và fungichromin giúp tăng cƣờng sức đề kháng trong cây đỗ quyên, tăng cƣờng sản sinh jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [57]. Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm Streptomyces sp. EN27 và Micromonospora sp. EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia carotovora vàF. oxysporum; kí ch hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid jasmonic, acid salicilic vàetylen [17]. Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với nh sinh học đƣợc sinh ra bởi các cây chủ vàcác sản phẩm tự nhiên cóhoạt tí xạ khuẩn nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu cótiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng. 1.1.3.3. Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh Ngoài đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh đã
8 đƣợc khoa học biết đến từ lâu. Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn phát hiện ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của nhóm VSV này có ý nghĩa rất quan trọng đối với sức khỏe con ngƣời. Một số chủng xạ khuẩn cókhả năng sinh chất pháhủy tế bào hồng cầu của động vật (nhƣ haemolysin ở Rhodococcus equi). Các nhà khoa học đã phát hiện tiềm năng rất lớn của các hợp chất này trong xạ khuẩn cótác dụng làm tan những phần máu đông tụ ở những ngƣời bị bệnh tim mạch. Trong phòng thínghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt tính chống đông máu (phá hủy hồng cầu) từ xạ khuẩn đƣợc tiến hành trên mẫu máu động vật nhƣ máu ngựa, máu thỏ [53]. Một vídụ khác làviệc tạo ra các hợp chất cókhả năng chống lại các tác nhân gây oxy hóa, làm tăng tuổi thọ của tế bào. Nguyên lýhoạt động của các chất chống ôxy hóa tìm thấy ở xạ khuẩn cũng tƣơng tự nhƣ axit ascorbic (vitamin C) hay tocopherol (vitamin E), tức làtrung hòa thể oxy hóa rất cao của các hợp chất oxy hóa (đƣợc tạo ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào hay dƣới tác dụng của tia cực tím) vàlàm giảm tác dụng oxy hóa của chúng [61]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Sri đã phân lập 65 xạ khuẩn nội sinh trên 13 cây dƣợc liệu chữa bệnh tiểu đƣờng nhƣ cây lô hội (Alloe vera), dây ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ xanh (Curcuma aeruginosa), rau má(Centela asiatica)... Trong đó, các chủng thể hiện hoạt tính alpha glucosidase ức chế quátrì nh thủy phân tinh bột thành glucose thẩm thấu vào ruột non. Kết quả nghiên cứu trên đã tuyển chọn đƣợc nh ức chế alpha glucosidase gấp hơn hai lần so với chủng BWA65 có hoạt tí chất cóhoạt tính tƣơng tự thu đƣợc từ dịch chiết cây dây kýninh [60]. Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với sự sinh trƣởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên còn chƣa rõ ràng nhƣng tác dụng màchúng mang lại trong lĩnh vực y dƣợc, dƣợc phẩm, nông nghiệp đã đƣợc chứng minh. Chính vìlý do này, các nhàkhoa
9 học hiện nay rất quan tâm tới việc sàng lọc các hợp chất cóhoạt tí nh sinh học cao từ xạ khuẩn nói chung vàxạ khuẩn nội sinh nói riêng. 1.1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trong vài thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều thành tựu trong tìm kiếm các loài xạ khuẩn vàcác hợp chất mới cóhoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong môtế bào thực vật. Do tiềm năng ứng dụng lớn của xạ khuẩn nội sinh nên đối tƣợng VSV này đang đƣợc quan tâm vànghiên cứu ở nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản… Sơ lƣợc về tì nh nh nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây hì đƣợc thể hiện trong bảng 1.1 [51]. Bảng 1.1. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội sinh trên thực vật Loài thực vật Chi xạ khuẩn Tài liệu tham khảo Cây trồng Lúa mì Streptomyces, Microbispora, [18] (Triticum aestivum) Micromonospora, Nocardioides Dƣa leo Streptomyces [57] (Cucumis sativus) Ngô Microbispora, Streptomyces, [10] (Zea mays) Streptosporangium Cây dƣợc liệu Cơm cháy Glycomyces [51] (Sambucus adnata) Riềng nếp Streptomyces, Nocardia, Microbispora, [64] (Alpinia galangal) Micromonospora Mộc lan Streptomyces [14] (Kennedia nigricans) Sầu đâu Streptomyces, Streptosporangium, [31] (Azadirachta indica) Microbispora, Streptoverticillium, Saccharomonospora, Nocardia
10 Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong môthực vật rất phong phúhứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tí nh sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực đời sống. Tuy nhiên, so với sự đa dạng của giới thực vật, số lƣợng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật vẫn còn rất hạn chế. Trong hơn 10 năm gần đây (2001-2012), các nhàkhoa học thuộc Viện VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ƣu hóa các điều kiện phân lập và đƣa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ hơn 100 loài thực vật [50]. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn này sinh ra cũng đƣợc chứng minh làrất đa dạng về mặt số lƣợng vàhoạt tính sinh học nhƣ các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng tế bào ung thƣ, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trƣởng… Khi nghiên cứu về đa dạng sinh học xạ khuẩn nội sinh, nhóm nghiên cứu của Chen và cộng sự thuộc Viện VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã khẳng định xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu tại rừng nhiệt đới vô cùng phong phú. Theo đó, Chen vàcộng sự đã thu nhận 2174 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau từ 90 loại cây dƣợc liệu tại rừng nhiệt đới Xishuangbanna và xác định đƣợc có 19 loài xạ khuẩn mới [15]. Cũng từ những chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập trên các cây dƣợc liệu tại vùng Vân Nam, Trung Quốc nói trên, rất nhiều hợp chất mới đã đƣợc phát hiện nhƣ: 9-hydroxybaﬁlomycin D, 29-hydroxybaﬁlomycin D, baﬁlomycin D, baﬁlomycin E, baﬁlomycin A1, baﬁlomycin B1, baﬁlomycin B2, baﬁlomycin C1, baﬁlomycin C2, baﬁlomycin C1 amide, baﬁlomycin C2 amide; caryolane- 1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8- (hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, Tripstretine … [12]. 1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu về VSV nội sinh nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Một số nghiên cứu khác về vi khuẩn, nấm nội sinh có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
11 Nhóm nghiên cứu của Lê Mai Hƣơng tại Viện Hóa hợp chất thiên nhiên đã thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ (Taxus sp.) ở Việt Nam và tách chiết một chất gần giống 10-deacetil baceatin III (10-DAB)-chất chuyển hóa thành taxol. Từ thân cây, nhóm nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng nấm, trong đó một chủng thuộc loài Mucor circinolloides var. tieghem. Chất tách chiết từ dịch lên men của chủng nấm nội sinh có đặc điểm gần giống với 10-DAB từ cây thông đỏ. Từ kết quả đó, có thể khẳng định những sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học không chỉ đƣợc tạo ra từ cây chủ mà còn có thể tạo ra bởi VSV nội sinh [3]. Từ 54 mẫu cây lúa (Oryza sativa L.) trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa, Phú Yên, nhóm nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp đã phân lập 191 chủng vi khuẩn nội sinh, trong đó 27 chủng thuộc các chi Burkholderia, Enterobacter, Bacillus có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) tốt [7]. Năm 2013, Hoàng Hoa Long và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. B55 trên cây thuốc lá (Nicotiana attenuata) làm tăng khả năng sống sót và kích thích sinh trƣởng của cây chủ trong điều kiện tự nhiên có thể thông qua một số cơ chế nhƣ tổng hợp IAA, 1-aminocyclopropane-1- carboxylic acid deaminase (ACCd) và hòa tan phosphat vô cơ. Ngoài ra, đặc tính kích thích sinh trƣởng cây chủ của chủng vi khuẩn này có quan hệ mật thiết đối với mật độ chúng bên trong mô cây chủ [5]. Năm 2014, Quách Ngọc Tùng và cộng sự đã phân lập đƣợc 78 chủng xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây quế thu thập tại xã Thung Nai, huyện Cao Phong, tỉnh Hòa Bình. Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của 78 chủng xạ khuẩn nội sinh cho thấy 16 chủng có khả năng sinh kháng sinh [8]. Năm 2015, Khieu Thi Nhan và cộng sự đã phân lập đƣợc 98 chủng xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Cúc Phƣơng, Ninh Bình và 33 chủng xạ khuẩn nội sinh trên mẫu cây Long huyết thu thập tại Bạch Mã, Thừa Thiên Huế [33].