T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br />
<br />
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ<br />
SITAGLIPTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP<br />
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br />
Nguyễn Ngọc Nhã Thảo*; Phạm Thị Mỹ Lệ*<br />
Phạm Thành Suôl*; Nguyễn Thị Ngọc Vân*<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và sitagliptin (SG) trong<br />
chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: tiến hành phân<br />
tích “Viên nén bao phim Janumet” do Công ty Merck Sharp and Dohme sản xuất trên hệ thống<br />
HPLC với cột: RP8 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 265 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích<br />
tiêm 20 µl, pha động là hỗn hợp methanol-nước chứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40). Kết quả:<br />
phương pháp định lượng đã xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính,<br />
độ đúng và độ lặp lại. Áp dụng xác định hàm lượng metformin và SG trên 3 lô “Viên nén bao<br />
phim Janumet”. Kết luận: đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời metformin và SG<br />
đảm bảo đơn giản, tiết kiệm thời gian, không sử dụng hệ đệm vô cơ như phosphat gây đóng<br />
muối hệ thống sắc ký và giảm tuổi thọ của thiết bị.<br />
* Từ khóa: Metformin hydrochlorid; Sitagliptin; HPLC; Định lượng.<br />
<br />
Study of Simultaneous Measurement of Metformine and Sitagliptin<br />
by HPLC Method<br />
Summary<br />
Objectives: To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC)<br />
method for simultaneous measurement of metformine hydroclorid (MH) and sitagliptin (SG) in<br />
film coated tablet. Subjects and methods: Film coated Janumet tablet was analyzed on a<br />
Phenomenex Luna RP - C8 column (250 x 4.6 mm, 5 µm) with mobile phase in isocratic mode<br />
consisting of methanol - water 60:40 v/v containing 0.3% v/v triethylamine and was adjusted to<br />
the pH of 9.5 with formic acid with DAD detector highly selective to HPLC system. The flow rate<br />
was 1 mL min-1 and the photodiod - array detection wave length was 265 nm. Result: This<br />
method ensures the specificity, system suitability, linearity, accuracy and repeatability. The<br />
proposed method was successfully applied for the analysis of MH and SG in film coated<br />
Janumet tablet. Conclusion: A simple, rapid, and non-inorganic buffer HPLC method for<br />
simultaneous determination of MH and SG phosphate, in tablet dosage form has been<br />
developed and validated.<br />
* Key words: Metformine hydrochloride; Sitagliptin; HPLC; Measurement.<br />
* Trường Đại học Y Dược Cần Thơ<br />
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Ngọc Vân (ntnvan@ctump.edu.vn)<br />
Ngày nhận bài: 24/06/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/09/2016<br />
Ngày bài báo được đăng: 16/09/2016<br />
<br />
21<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Metformin hydroclorid (MH) là thuốc<br />
điều trị đái tháo đường, dùng đường uống,<br />
ưu tiên được lựa chọn trong điều trị khởi<br />
đầu đái tháo đường týp 2. MH giúp hạ<br />
đường huyết thông qua cơ chế giảm tổng<br />
hợp glucose ở gan. Sitagliptin phosphat<br />
monohydrat là thuốc điều trị đái tháo<br />
đường týp 2 thuộc nhóm ức chế DPP-4<br />
(dipeptidyl peptidase-4), có tác dụng giảm<br />
phân hủy GLP-1 và tăng bài tiết insulin,<br />
giảm tiết glucagon từ tuyến tụy, dẫn đến<br />
giảm đường huyết. Việc kết hợp 2 thành<br />
phần này trong chế phẩm đã có trên thị<br />
trường ở dạng viên bao phim phóng thích<br />
tức thời, dạng phóng thích kéo dài này<br />
vẫn chưa có ở Việt Nam. Trên thế giới,<br />
sử dụng các phương pháp để định lượng<br />
đồng thời hai hoạt chất trên như quang<br />
phổ tử ngoại khả kiến, sắc ký lỏng hiệu<br />
năng cao; sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao<br />
và điện di mao quản… [1, 2, 4, 8]. Tuy<br />
nhiên, các phương pháp này sử dụng hệ<br />
pha động phức tạp, thời gian phân tích<br />
dài [5, 6, 7, 9]. Tại Việt Nam, chưa có đề<br />
tài nào nghiên cứu định lượng đồng thời<br />
MH và SG bằng phương pháp sắc ký<br />
lỏng hiệu năng cao (HPLC). Do đó, nghiên<br />
cứu này thực hiện với mục tiêu: Xây dựng<br />
và thẩm định quy trình định lượng đồng<br />
thời MH và SG trong chế phẩm bằng<br />
phương pháp HPLC-DAD với hệ pha<br />
động đơn giản, thời gian phân tích ngắn.<br />
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ<br />
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Nguyên liệu và thiết bị.<br />
* Nguyên liệu:<br />
- Mẫu thử.<br />
Chế phẩm thử: viên nén bao phim<br />
Janumet® (Công ty Merck Sharp và<br />
22<br />
<br />
Dohme) chứa MH 500 mg và SG 50 mg.<br />
Số đăng ký: VN1-694-12. Số lô: J001206.<br />
- Hóa chất - dung môi.<br />
+ Chất chuẩn đối chiếu: MH có hàm<br />
lượng 99,54% (tính trên chế phẩm nguyên<br />
trạng), số kiểm soát: QT 168 050413 do<br />
Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM cung<br />
cấp. SG phosphat monohydrat có hàm<br />
lượng 99,15% (tính trên chế phẩm<br />
nguyên trạng, số kiểm soát): WS/STP<br />
13012, do Công ty Glenmark Generics<br />
Ltd., Ấn Độ cung cấp.<br />
+ Dung môi: methanol (MeOH) đạt tiêu<br />
chuẩn dùng cho HPLC (Baker, Mỹ) và<br />
axít formic, triethylamin dùng trong phân<br />
tích kiểm nghiệm (Merck, Đức).<br />
- Thiết bị.<br />
Hệ thống HPLC Hitachi L-2000 với đầu<br />
dò dãy diod quang Hitachi L-2455, bể<br />
siêu âm Elmasoonic S70H, cân phân tích<br />
ABT 220-5DM, máy đo pH HANNA<br />
pH 211.<br />
2. Phương pháp nghiên cứu.<br />
* Chuẩn bị dung dịch:<br />
- Dung dịch chuẩn gốc:<br />
+ Dung dịch MET chuẩn gốc 2 mg/ml<br />
(dung dịch C1): cân chính xác 50 mg<br />
MET chuẩn cho vào bình định mức 25 ml,<br />
hòa tan với vài ml methanol, bổ sung vừa<br />
đủ với methanol, lắc đều.<br />
+ Dung dịch SIT chuẩn gốc 200 µg/ml<br />
(dung dịch C2): cân chính xác 12,85 mg<br />
SIT chuẩn (tương ứng 10 mg SIT dạng<br />
base) cho vào bình định mức 50 ml, hòa<br />
tan với vài ml methanol, bổ sung vừa đủ<br />
với methanol, lắc đều.<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br />
- Dung dịch chuẩn định lượng: hút<br />
chính xác 5 ml dung dịch C1 và 5 ml dung<br />
dịch C2 vào bình định mức 100 ml, bổ<br />
sung vừa đủ với pha động, lọc qua màng<br />
lọc 0,45 µm, được dung dịch chuẩn làm<br />
việc chứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml.<br />
- Dung dịch thử: cân 20 viên, xác định<br />
khối lượng trung bình viên, cho vào cối<br />
nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một<br />
lượng bột tương ứng 100 mg MET và 10<br />
mg SIT cho vào bình định mức dung tích<br />
50 ml. Cho vào bình khoảng 30 ml<br />
methanol, siêu âm trong 15 phút. Bổ sung<br />
vừa đủ với methanol, lắc đều. Hỗn hợp<br />
chứa trong bình được đem quay ly tâm<br />
với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 5 phút.<br />
Lấy dung dịch lớp trên. Hút chính xác<br />
5 ml dung dịch cho vào bình định mức<br />
100 ml, bổ sung vừa đủ bằng pha động.<br />
Lọc qua màng lọc 0,45 µm.<br />
* Điều kiện sắc ký:<br />
- Hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000,<br />
DAD L-2455.<br />
- Pha tĩnh: cột Phenomenex Luna RPC8 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm, 110 Å).<br />
Pha động: hỗn hợp MeOH:đệm (60:40,<br />
tt/tt), dung dịch đệm là TEA 0,3%, pH 9,5<br />
điều chỉnh bằng axít formic.<br />
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.<br />
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.<br />
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng.<br />
- Bước sóng phát hiện: 265 nm.<br />
* Thẩm định quy trình định lượng:<br />
Tiến hành khảo sát tính phù hợp hệ<br />
thống và thẩm định quy trình định lượng<br />
theo tiêu chuẩn của ICH [3]. Đánh giá 5<br />
chỉ tiêu của một quy trình định lượng bao<br />
<br />
gồm: tương thích hệ thống, tính đặc hiệu,<br />
tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính<br />
xác, độ đúng.<br />
Ứng dụng quy trình định lượng trên để<br />
định lượng đồng thời MH và SG trong 3 lô<br />
chế phẩm nghiên cứu.<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br />
1. Kết quả khảo sát tính tương thích<br />
của hệ thống sắc ký.<br />
Thực hiện sắc ký hỗn hợp 2 chất với<br />
hệ pha động gồm 2 thành phần với tỷ lệ<br />
thay đổi của MeOH từ 90 - 40% (∆C = 5%),<br />
tốc độ dòng 1 ml/phút. Dựa vào cấu trúc<br />
hóa học của hai chất phân tích, MH và<br />
SG đều là những chất phân cực, đồng<br />
thời tham khảo một số công trình đã công<br />
bố [1, 2, 4, 5], kỹ thuật sắc ký pha đảo với<br />
hệ dung môi phân cực đã áp dụng. Trong<br />
quá trình thực nghiệm, đã khảo sát các<br />
yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách tính<br />
chọn lọc của phương pháp như pH và tỷ<br />
lệ dung môi pha động. Cho thêm TEA vào<br />
pha động nhằm làm giảm hệ số bất đối,<br />
giảm hiện tượng kéo đuôi của píc MH.<br />
Ghi phổ hấp thụ UV trong khoảng 200<br />
- 400 nm. Tại thời gian lưu của píc MH và<br />
SG trên sắc ký đồ thu được, kết quả cho<br />
thấy: cực đại hấp thụ của MH 235 nm,<br />
của SG 265 nm. Nhằm ưu tiên định lượng<br />
hoạt chất có hàm lượng thấp trong chế<br />
phẩm, nên bước sóng chọn để phân tích<br />
đồng thời MET và SIT là 265 nm.<br />
Từ kết quả khảo sát bằng thực<br />
nghiệm, chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc<br />
ký để định lượng đồng thời MH và SG<br />
như trình bày ở phần phương pháp<br />
nghiên cứu.<br />
23<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br />
8<br />
<br />
8<br />
<br />
6<br />
<br />
6<br />
<br />
4<br />
<br />
4<br />
<br />
2<br />
<br />
mAU<br />
<br />
mAU<br />
<br />
Metformin HCl<br />
<br />
2<br />
<br />
Sitagliptin<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3<br />
<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
7<br />
<br />
8<br />
<br />
9<br />
<br />
10<br />
<br />
Minutes<br />
<br />
Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml.<br />
Chương trình sắc ký trên tách được píc MH và SG khỏi píc dung môi và các píc tạp<br />
phân hủy do tác nhân nhiệt, ẩm, axít base, oxy hóa... Píc thu được có hình dáng cân<br />
đối, gọn; thời gian phân tích < 10 phút. Vì vậy, điều kiện sắc ký đạt yêu cầu phân tích.<br />
2. Thẩm định phương pháp định lượng.<br />
- Tính phù hợp hệ thống:<br />
Tính phù hợp hệ thống được xác định bằng cách tiêm 6 lần liên tiếp dung dịch<br />
chuẩn.<br />
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp trên mẫu chuẩn<br />
(n = 6).<br />
Hoạt chất<br />
MH<br />
SG<br />
<br />
Giá trị thống kê<br />
<br />
tR (phút)<br />
<br />
S (mV x giây)<br />
<br />
AS<br />
<br />
RS<br />
<br />
N<br />
<br />
Trung bình<br />
<br />
2,85<br />
<br />
145754,60<br />
<br />
1,40<br />
<br />
1,49<br />
<br />
58044,60<br />
<br />
RSD<br />
<br />
0,00<br />
<br />
0,97<br />
<br />
1,27<br />
<br />
0,53<br />
<br />
0,58<br />
<br />
Trung bình<br />
<br />
6,34<br />
<br />
100028,40<br />
<br />
1,13<br />
<br />
17,49<br />
<br />
10372,00<br />
<br />
RSD<br />
<br />
0,17<br />
<br />
0,79<br />
<br />
1,05<br />
<br />
0,17<br />
<br />
0,69<br />
<br />
(tR: thời gian lưu, S: diện tích đỉnh, As: hệ số đối xứng, Rs: độ phân giải, N: số đĩa lý<br />
thuyết).<br />
RSD các thông số sắc ký của chất phân tích trong mẫu chuẩn đều < 2%, độ phân<br />
giải giữa píc MH và SG > 1,5, hệ số đối xứng của cả 2 píc đều nằm trong khoảng 0,8 1,5. Như vậy, quy trình định lượng đồng thời MH và SG đạt tính phù hợp của hệ thống.<br />
- Tính đặc hiệu:<br />
Kết quả khảo sát cho thấy các píc trong mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian<br />
lưu píc trong mẫu chuẩn. Khi thêm chuẩn vào mẫu thử chiều cao và diện tích píc tăng<br />
lên ở các píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của píc trong mẫu chuẩn.<br />
Điều đó chứng tỏ quy trình phân tích đúng hoạt chất là MH và SG.<br />
24<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br />
<br />
Metformin HCl<br />
Sitagliptin<br />
Metformin HCl<br />
<br />
Sitagliptin<br />
<br />
Metformin HCl<br />
<br />
Sitagliptin<br />
<br />
Hình 2: Sắc ký đồ mẫu pha động (1), mẫu trắng B1 (2), mẫu chuẩn (3), mẫu thử (4),<br />
mẫu thử thêm chuẩn (5).<br />
<br />
Metformin HCl<br />
<br />
Metformin HCl<br />
<br />
Metformin HCl<br />
<br />
Sitagliptin<br />
<br />
Sitagliptin<br />
<br />
Sitagliptin<br />
<br />
Hình 3: Sắc ký đồ mẫu thử (1), mẫu trắng B2 (2), mẫu thử phân hủy trong NaOH 0,1N<br />
sau 36 giờ (3), mẫu trắng B3 (4), mẫu thử phân hủy trong HCl 0,1N sau 36 giờ (5).<br />
25<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
