intTypePromotion=3

Nghiên cứu định lượng đồng thời metformin và sitagliptin trong chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

0
40
lượt xem
2
download

Nghiên cứu định lượng đồng thời metformin và sitagliptin trong chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và sitagliptin (SG) trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: tiến hành phân tích “Viên nén bao phim Janumet” do Công ty Merck Sharp and Dohme sản xuất trên hệ thống HPLC với cột: RP8 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 265 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha động là hỗn hợp methanol-nước chứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40).

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu định lượng đồng thời metformin và sitagliptin trong chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ<br /> SITAGLIPTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP<br /> SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Nguyễn Ngọc Nhã Thảo*; Phạm Thị Mỹ Lệ*<br /> Phạm Thành Suôl*; Nguyễn Thị Ngọc Vân*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và sitagliptin (SG) trong<br /> chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: tiến hành phân<br /> tích “Viên nén bao phim Janumet” do Công ty Merck Sharp and Dohme sản xuất trên hệ thống<br /> HPLC với cột: RP8 (250 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 265 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích<br /> tiêm 20 µl, pha động là hỗn hợp methanol-nước chứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40). Kết quả:<br /> phương pháp định lượng đã xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính,<br /> độ đúng và độ lặp lại. Áp dụng xác định hàm lượng metformin và SG trên 3 lô “Viên nén bao<br /> phim Janumet”. Kết luận: đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời metformin và SG<br /> đảm bảo đơn giản, tiết kiệm thời gian, không sử dụng hệ đệm vô cơ như phosphat gây đóng<br /> muối hệ thống sắc ký và giảm tuổi thọ của thiết bị.<br /> * Từ khóa: Metformin hydrochlorid; Sitagliptin; HPLC; Định lượng.<br /> <br /> Study of Simultaneous Measurement of Metformine and Sitagliptin<br /> by HPLC Method<br /> Summary<br /> Objectives: To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC)<br /> method for simultaneous measurement of metformine hydroclorid (MH) and sitagliptin (SG) in<br /> film coated tablet. Subjects and methods: Film coated Janumet tablet was analyzed on a<br /> Phenomenex Luna RP - C8 column (250 x 4.6 mm, 5 µm) with mobile phase in isocratic mode<br /> consisting of methanol - water 60:40 v/v containing 0.3% v/v triethylamine and was adjusted to<br /> the pH of 9.5 with formic acid with DAD detector highly selective to HPLC system. The flow rate<br /> was 1 mL min-1 and the photodiod - array detection wave length was 265 nm. Result: This<br /> method ensures the specificity, system suitability, linearity, accuracy and repeatability. The<br /> proposed method was successfully applied for the analysis of MH and SG in film coated<br /> Janumet tablet. Conclusion: A simple, rapid, and non-inorganic buffer HPLC method for<br /> simultaneous determination of MH and SG phosphate, in tablet dosage form has been<br /> developed and validated.<br /> * Key words: Metformine hydrochloride; Sitagliptin; HPLC; Measurement.<br /> * Trường Đại học Y Dược Cần Thơ<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Ngọc Vân (ntnvan@ctump.edu.vn)<br /> Ngày nhận bài: 24/06/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/09/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 16/09/2016<br /> <br /> 21<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Metformin hydroclorid (MH) là thuốc<br /> điều trị đái tháo đường, dùng đường uống,<br /> ưu tiên được lựa chọn trong điều trị khởi<br /> đầu đái tháo đường týp 2. MH giúp hạ<br /> đường huyết thông qua cơ chế giảm tổng<br /> hợp glucose ở gan. Sitagliptin phosphat<br /> monohydrat là thuốc điều trị đái tháo<br /> đường týp 2 thuộc nhóm ức chế DPP-4<br /> (dipeptidyl peptidase-4), có tác dụng giảm<br /> phân hủy GLP-1 và tăng bài tiết insulin,<br /> giảm tiết glucagon từ tuyến tụy, dẫn đến<br /> giảm đường huyết. Việc kết hợp 2 thành<br /> phần này trong chế phẩm đã có trên thị<br /> trường ở dạng viên bao phim phóng thích<br /> tức thời, dạng phóng thích kéo dài này<br /> vẫn chưa có ở Việt Nam. Trên thế giới,<br /> sử dụng các phương pháp để định lượng<br /> đồng thời hai hoạt chất trên như quang<br /> phổ tử ngoại khả kiến, sắc ký lỏng hiệu<br /> năng cao; sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao<br /> và điện di mao quản… [1, 2, 4, 8]. Tuy<br /> nhiên, các phương pháp này sử dụng hệ<br /> pha động phức tạp, thời gian phân tích<br /> dài [5, 6, 7, 9]. Tại Việt Nam, chưa có đề<br /> tài nào nghiên cứu định lượng đồng thời<br /> MH và SG bằng phương pháp sắc ký<br /> lỏng hiệu năng cao (HPLC). Do đó, nghiên<br /> cứu này thực hiện với mục tiêu: Xây dựng<br /> và thẩm định quy trình định lượng đồng<br /> thời MH và SG trong chế phẩm bằng<br /> phương pháp HPLC-DAD với hệ pha<br /> động đơn giản, thời gian phân tích ngắn.<br /> NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> * Nguyên liệu:<br /> - Mẫu thử.<br /> Chế phẩm thử: viên nén bao phim<br /> Janumet® (Công ty Merck Sharp và<br /> 22<br /> <br /> Dohme) chứa MH 500 mg và SG 50 mg.<br /> Số đăng ký: VN1-694-12. Số lô: J001206.<br /> - Hóa chất - dung môi.<br /> + Chất chuẩn đối chiếu: MH có hàm<br /> lượng 99,54% (tính trên chế phẩm nguyên<br /> trạng), số kiểm soát: QT 168 050413 do<br /> Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM cung<br /> cấp. SG phosphat monohydrat có hàm<br /> lượng 99,15% (tính trên chế phẩm<br /> nguyên trạng, số kiểm soát): WS/STP<br /> 13012, do Công ty Glenmark Generics<br /> Ltd., Ấn Độ cung cấp.<br /> + Dung môi: methanol (MeOH) đạt tiêu<br /> chuẩn dùng cho HPLC (Baker, Mỹ) và<br /> axít formic, triethylamin dùng trong phân<br /> tích kiểm nghiệm (Merck, Đức).<br /> - Thiết bị.<br /> Hệ thống HPLC Hitachi L-2000 với đầu<br /> dò dãy diod quang Hitachi L-2455, bể<br /> siêu âm Elmasoonic S70H, cân phân tích<br /> ABT 220-5DM, máy đo pH HANNA<br /> pH 211.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Chuẩn bị dung dịch:<br /> - Dung dịch chuẩn gốc:<br /> + Dung dịch MET chuẩn gốc 2 mg/ml<br /> (dung dịch C1): cân chính xác 50 mg<br /> MET chuẩn cho vào bình định mức 25 ml,<br /> hòa tan với vài ml methanol, bổ sung vừa<br /> đủ với methanol, lắc đều.<br /> + Dung dịch SIT chuẩn gốc 200 µg/ml<br /> (dung dịch C2): cân chính xác 12,85 mg<br /> SIT chuẩn (tương ứng 10 mg SIT dạng<br /> base) cho vào bình định mức 50 ml, hòa<br /> tan với vài ml methanol, bổ sung vừa đủ<br /> với methanol, lắc đều.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> - Dung dịch chuẩn định lượng: hút<br /> chính xác 5 ml dung dịch C1 và 5 ml dung<br /> dịch C2 vào bình định mức 100 ml, bổ<br /> sung vừa đủ với pha động, lọc qua màng<br /> lọc 0,45 µm, được dung dịch chuẩn làm<br /> việc chứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml.<br /> - Dung dịch thử: cân 20 viên, xác định<br /> khối lượng trung bình viên, cho vào cối<br /> nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một<br /> lượng bột tương ứng 100 mg MET và 10<br /> mg SIT cho vào bình định mức dung tích<br /> 50 ml. Cho vào bình khoảng 30 ml<br /> methanol, siêu âm trong 15 phút. Bổ sung<br /> vừa đủ với methanol, lắc đều. Hỗn hợp<br /> chứa trong bình được đem quay ly tâm<br /> với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 5 phút.<br /> Lấy dung dịch lớp trên. Hút chính xác<br /> 5 ml dung dịch cho vào bình định mức<br /> 100 ml, bổ sung vừa đủ bằng pha động.<br /> Lọc qua màng lọc 0,45 µm.<br /> * Điều kiện sắc ký:<br /> - Hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000,<br /> DAD L-2455.<br /> - Pha tĩnh: cột Phenomenex Luna RPC8 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm, 110 Å).<br /> Pha động: hỗn hợp MeOH:đệm (60:40,<br /> tt/tt), dung dịch đệm là TEA 0,3%, pH 9,5<br /> điều chỉnh bằng axít formic.<br /> - Tốc độ dòng: 1 ml/phút.<br /> - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.<br /> - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng.<br /> - Bước sóng phát hiện: 265 nm.<br /> * Thẩm định quy trình định lượng:<br /> Tiến hành khảo sát tính phù hợp hệ<br /> thống và thẩm định quy trình định lượng<br /> theo tiêu chuẩn của ICH [3]. Đánh giá 5<br /> chỉ tiêu của một quy trình định lượng bao<br /> <br /> gồm: tương thích hệ thống, tính đặc hiệu,<br /> tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính<br /> xác, độ đúng.<br /> Ứng dụng quy trình định lượng trên để<br /> định lượng đồng thời MH và SG trong 3 lô<br /> chế phẩm nghiên cứu.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kết quả khảo sát tính tương thích<br /> của hệ thống sắc ký.<br /> Thực hiện sắc ký hỗn hợp 2 chất với<br /> hệ pha động gồm 2 thành phần với tỷ lệ<br /> thay đổi của MeOH từ 90 - 40% (∆C = 5%),<br /> tốc độ dòng 1 ml/phút. Dựa vào cấu trúc<br /> hóa học của hai chất phân tích, MH và<br /> SG đều là những chất phân cực, đồng<br /> thời tham khảo một số công trình đã công<br /> bố [1, 2, 4, 5], kỹ thuật sắc ký pha đảo với<br /> hệ dung môi phân cực đã áp dụng. Trong<br /> quá trình thực nghiệm, đã khảo sát các<br /> yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách tính<br /> chọn lọc của phương pháp như pH và tỷ<br /> lệ dung môi pha động. Cho thêm TEA vào<br /> pha động nhằm làm giảm hệ số bất đối,<br /> giảm hiện tượng kéo đuôi của píc MH.<br /> Ghi phổ hấp thụ UV trong khoảng 200<br /> - 400 nm. Tại thời gian lưu của píc MH và<br /> SG trên sắc ký đồ thu được, kết quả cho<br /> thấy: cực đại hấp thụ của MH 235 nm,<br /> của SG 265 nm. Nhằm ưu tiên định lượng<br /> hoạt chất có hàm lượng thấp trong chế<br /> phẩm, nên bước sóng chọn để phân tích<br /> đồng thời MET và SIT là 265 nm.<br /> Từ kết quả khảo sát bằng thực<br /> nghiệm, chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc<br /> ký để định lượng đồng thời MH và SG<br /> như trình bày ở phần phương pháp<br /> nghiên cứu.<br /> 23<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> 8<br /> <br /> 8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4<br /> <br /> 4<br /> <br /> 2<br /> <br /> mAU<br /> <br /> mAU<br /> <br /> Metformin HCl<br /> <br /> 2<br /> <br /> Sitagliptin<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> Minutes<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn chứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml.<br /> Chương trình sắc ký trên tách được píc MH và SG khỏi píc dung môi và các píc tạp<br /> phân hủy do tác nhân nhiệt, ẩm, axít base, oxy hóa... Píc thu được có hình dáng cân<br /> đối, gọn; thời gian phân tích < 10 phút. Vì vậy, điều kiện sắc ký đạt yêu cầu phân tích.<br /> 2. Thẩm định phương pháp định lượng.<br /> - Tính phù hợp hệ thống:<br /> Tính phù hợp hệ thống được xác định bằng cách tiêm 6 lần liên tiếp dung dịch<br /> chuẩn.<br /> Bảng 1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp trên mẫu chuẩn<br /> (n = 6).<br /> Hoạt chất<br /> MH<br /> SG<br /> <br /> Giá trị thống kê<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> S (mV x giây)<br /> <br /> AS<br /> <br /> RS<br /> <br /> N<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 2,85<br /> <br /> 145754,60<br /> <br /> 1,40<br /> <br /> 1,49<br /> <br /> 58044,60<br /> <br /> RSD<br /> <br /> 0,00<br /> <br /> 0,97<br /> <br /> 1,27<br /> <br /> 0,53<br /> <br /> 0,58<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 6,34<br /> <br /> 100028,40<br /> <br /> 1,13<br /> <br /> 17,49<br /> <br /> 10372,00<br /> <br /> RSD<br /> <br /> 0,17<br /> <br /> 0,79<br /> <br /> 1,05<br /> <br /> 0,17<br /> <br /> 0,69<br /> <br /> (tR: thời gian lưu, S: diện tích đỉnh, As: hệ số đối xứng, Rs: độ phân giải, N: số đĩa lý<br /> thuyết).<br /> RSD các thông số sắc ký của chất phân tích trong mẫu chuẩn đều < 2%, độ phân<br /> giải giữa píc MH và SG > 1,5, hệ số đối xứng của cả 2 píc đều nằm trong khoảng 0,8 1,5. Như vậy, quy trình định lượng đồng thời MH và SG đạt tính phù hợp của hệ thống.<br /> - Tính đặc hiệu:<br /> Kết quả khảo sát cho thấy các píc trong mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian<br /> lưu píc trong mẫu chuẩn. Khi thêm chuẩn vào mẫu thử chiều cao và diện tích píc tăng<br /> lên ở các píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của píc trong mẫu chuẩn.<br /> Điều đó chứng tỏ quy trình phân tích đúng hoạt chất là MH và SG.<br /> 24<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016<br /> <br /> Metformin HCl<br /> Sitagliptin<br /> Metformin HCl<br /> <br /> Sitagliptin<br /> <br /> Metformin HCl<br /> <br /> Sitagliptin<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ mẫu pha động (1), mẫu trắng B1 (2), mẫu chuẩn (3), mẫu thử (4),<br /> mẫu thử thêm chuẩn (5).<br /> <br /> Metformin HCl<br /> <br /> Metformin HCl<br /> <br /> Metformin HCl<br /> <br /> Sitagliptin<br /> <br /> Sitagliptin<br /> <br /> Sitagliptin<br /> <br /> Hình 3: Sắc ký đồ mẫu thử (1), mẫu trắng B2 (2), mẫu thử phân hủy trong NaOH 0,1N<br /> sau 36 giờ (3), mẫu trắng B3 (4), mẫu thử phân hủy trong HCl 0,1N sau 36 giờ (5).<br /> 25<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản