Nghiên cứu hàm lượng lipit protein và nhân gen chịu hạn chaperonin tế bào chất đơn vị và ỏ một số giống đậu tương nhập từ Úc

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007<br /> <br /> NGHIÊN CỨU HÀM LƯỢNG LIPIT, PROTEIN VÀ NHÂN GEN<br /> CHNU HẠN CHAPERONIN TẾ BÀO CHẤT ĐƠN VN δ<br /> Ở MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NHẬP TỪ ÚC<br /> Nguyễn Văn Phú - Hoàng Thị Thu Yến (Khoa KH Tự nhiên & Xã hội – ĐH Thái Nguyên)<br /> Luân Thị Đẹp (Trường ĐH Nông lâm – ĐH Thái Nguyên)<br /> <br /> 1. Đặt vấn đề<br /> Đậu tương là giống cây trồng công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao và có tác<br /> dụng nhiều mặt trong sản xuất nông nghiệp. Ở nước ta, diện tích trồng cây đậu tương còn chưa<br /> phổ biến mới chỉ đạt khoảng 200000 ha và năng suất bình quân đạt khoảng 1,4 tấn/ha. So với<br /> các nước như Trung Quốc, Ấn Độ hay Mỹ và Braxin, tình hình sản xuất đậu tương ở nước ta<br /> vẫn ở mức thấp [3], [11].<br /> Hiện nay, để tăng năng suất và chất lượng đậu tương chúng ta đã tiến hành cải tạo giống,<br /> đưa những giống có chất lượng vào sản xuất, chủ yếu là giống đột biến, giống lai và giống nhập<br /> ngoại. Tại Thái Nguyên nhóm nghiên cứu do PGS.TS. Luân Thị Đẹp, Trưởng Khoa Nông học,<br /> ĐHNL, ĐH Thái Nguyên làm chủ đề tài đã trồng thử nghiệm một số giống đậu tương được nhập<br /> từ Úc và đã cho năng suất khá cao [8]. Vấn đề đặt ra cho nghiên cứu này là xác định hàm lượng<br /> lipit, protein và nhân gen chịu hạn Chaperonin tế bào chất đơn vị δ ở một số giống đậu tương<br /> nhập từ Úc để góp phần chọn tạo giống đậu tương.<br /> 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> * Vật liệu, hóa chất, thiết bị<br /> Hạt của các giống đậu tương DT84(6), E085 -10, E085 -3, E036 - b(6), do cô giáo PGS.TS.<br /> Luân Thị Đẹp, Trưởng Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chọn tạo các<br /> giống nhập từ Úc cung cấp. Giống đối chứng Bắc Kạn (BK) do cô giáo ThS. Nguyễn Thu Hiền,<br /> Khoa Khoa học cơ bản, Trường ĐH Y Khoa Thái Nguyên cung cấp để sử dụng nghiên cứu.<br /> Các hóa chất và thiết bị sử dụng được lưu giữ ở Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự<br /> nhiên và Xã hội; Phòng Di truyền học hiện đại, Khoa Sinh - KTNN, ĐHSP Thái Nguyên; Phòng<br /> Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học.<br /> * Phương pháp nghiên cứu<br /> - Phương pháp xác định hàm lượng lipit, protein được tiến hành theo tài liệu của Phạm<br /> Thị Trân Châu [2].<br /> - ADN tổng số được tách chiết và tinh sạch từ lá theo phương pháp của Becker và các<br /> cộng sự (1998) [1].<br /> - Nhân gen chaperonin tế bào chất đơn vị δ bằng kỹ thuật PCR theo Karry Mulis (1985)<br /> với cặp mồi:<br /> + Mồi xuôi (forward primer) chap_N: 5’- GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C- 3’<br /> + Mồi ngược (reverse primer) chap_C: 5’- CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA<br /> ATA TCA TC-3’.<br /> - Phân tích sản phNm PCR bằng enzyme giới hạn theo Sambrook và cộng sự 2001 [9].<br /> 101<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007<br /> <br /> 3. Kết qủa và thảo luận<br /> * Hàm lượng lipit và protein<br /> Chỉ tiêu về hình dạng, kích thước hạt chỉ là những đánh giá sơ bộ bên ngoài, chưa phản<br /> ánh được chính xác chất lượng của hạt. Nghiên cứu hàm lượng protein, lipit sẽ đánh giá được<br /> chất lượng của hạt. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipit trong hạt của 5 giống đậu tương<br /> được trình bày ở bảng 3.1 .<br /> Bảng1. Hàm lượng protein và lipit của các giống đậu tương<br /> <br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> <br /> Tên giống<br /> BK<br /> E085 -3<br /> E085 -10<br /> DT84(6)<br /> E036 -b(6)<br /> <br /> Hàm lượng lipit % so khối<br /> lượng chất khô<br /> 20,70 ±<br /> 21,35 ±<br /> 24,67 ±<br /> 24,87 ±<br /> 22,78 ±<br /> <br /> 0,18<br /> 0,32<br /> 0,72<br /> 0,34<br /> 0,51<br /> <br /> Hàm lượng protein % so<br /> khối lượng chất khô<br /> 33,82<br /> 27,34<br /> 29,57<br /> 30,04<br /> 28,49<br /> <br /> ±<br /> ±<br /> ±<br /> ±<br /> ±<br /> <br /> 0,25<br /> 0,34<br /> 0,46<br /> 0,64<br /> 0,43<br /> <br /> Qua bảng 3.1 cho thấy hàm lượng lipit của các<br /> giống đậu tương dao động trong khoảng (20,70 ± 0,3)%<br /> đến (24,87 ± 0,34)% giống có hàm lượng lipit cao nhất<br /> là DT84(6) và thấp nhất là BK. Thứ tự sắp xếp các<br /> giống lần lượt theo thứ tự là: BK < E085 -3 < E036 b(6) < E085 -10 < DT84(6). Hàm lượng protein là yếu<br /> tố quan trọng hàng đầu trong đánh giá chất lượng hạt,<br /> hạt càng nhiều protein thì sẽ cho đậu phụ với tỷ lệ đạm<br /> càng cao. Bảng 3.1 cho thấy hàm lượng protein tan của<br /> 5 giống đậu tương dao dộng trong khoảng 27,34% đến<br /> Hình 1: Ảnh điện di tinh sạch ADN tổng số<br /> M. Maker 1 kb<br /> 3. DT84(6)<br /> 33,82%. Trong đó giống có hàm lượng protein cao nhất<br /> 1. BK<br /> 4. E036- b(6)<br /> là BK và thấp nhất là E085 - 3. Hàm lượng protein được<br /> 2. E085- 3<br /> 5. E085- 10<br /> sắp xếp theo thứ tự tăng dần là: E085 -3 < E085 -10 <<br /> E036 -b(6) < DT84(6) < BK<br /> So với các tác giả khác nghiên cứu về đậu tương thì hàm lượng protein và lipit của các giống<br /> được chúng tôi nghiên cứu phù hợp với các tài liệu về hàm lượng trong hạt đậu tương [3], [6],[7].<br /> * Tách chiết ADN tổng số từ các giống đậu tương<br /> Dựa trên chỉ tiêu hóa sinh: lipit, protein; năng suất của các giống đậu tương E085-3, E08510, E036-b(6), DT84(6) và BK. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phân tích di truyền ở mức độ phân tử<br /> các giống đậu tương này.<br /> Mẫu lá được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng để kìm hãm hoạt động phân hủy của<br /> nuclease, ADN tổng số được chiết ra khỏi tế bào bằng dung dịch đệm có chứa Tris HCl 10 mM<br /> pH=8,0; EDTA 10 mM; NaCl 10 mM; SDS 2,1%; và proteinase K với nồng độ 10 µg/ml. Ngay<br /> sau khi nghiền, protein và các phức enzym trong tế bào chịu sự tác động của các chất hoạt hóa<br /> bề mặt có trong dung dịch đệm và bị proteinase K phân huỷ. Vì vậy, ADN tổng số ít bị phân<br /> hủy, đặc biệt đối với đậu tương, tế bào của chúng chứa nhiều protein nên chúng tôi xử lý dịch<br /> 102<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007<br /> <br /> chiết nhận được bằng chlorofom và isoamyl ancohol để đảm bảo loại protein ra khỏi chế phNm<br /> ADN. Thêm cồn tuyệt đối (100%) và để ở nhiệt độ thấp, hầu như toàn bộ ADN và ARN đều kết<br /> tủa. Sau khi rửa lại bằng cồn 70% và làm khô mẫu, chúng tôi đã hòa mẫu trong nước khử ion vô<br /> trùng, sau đó lấy một lượng chế phNm thích hợp đem điện di kiểm tra ADN thu được trên gel<br /> agarose. Từ kết quả điện di thu được ADN tổng số có kích thước và trọng lượng phân tử lớn<br /> nhất. Các phân tử ADN bị đứt gãy và ARN sẽ di chuyển nhanh hơn tạo thành vệt sáng cách xa về<br /> phía dưới băng ADN tổng số. Vì vậy, để đảm bảo cho những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi tiến<br /> hành tinh sạch ADN, và thu được kết quả trên hình 1.<br /> * Nhân gen chaperonin tế bào chất đơn vị δ các giống đậu tương nghiên cứu<br /> Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, và chu trình nhiệt 94oC: 3 phút, 32 chu kỳ<br /> o<br /> (94 C: 1 phút; 55oC: 1 phút 10 giây; 72oC: 1 phút 20<br /> giây) kéo dài 8 phút ở 72oC sau đó giữ ở 4oC. Sau 32<br /> chu kỳ phản ứng, sản phNm của phản ứng được bảo<br /> quản ở 4oC và được kiểm tra bằng điện di trên gel<br /> agarose 0,8% hình 2:<br /> Trên ảnh điện di đồ cho thấy, sản phNm PCR<br /> chỉ xuất hiện một băng ADN đặc hiệu có kích thước<br /> khoảng 1,6 kb. Kết quả này tương tự với kết quả mà<br /> Trần Thị Phương Liên và cộng sự (1998) Hoàng Thị<br /> Thu Yến và cộng sự (2003, 2004) đã công bố khi<br /> Hình 2: Ảnh điện di sản ph/m<br /> nghiên cứu nhân gen chaperonin ở một số giống đậu<br /> PCR các giống đậu tương nghiên cứu<br /> tương khác của Việt Nam [5], [10]. Đồng thời sản<br /> M. Maker 1 kb<br /> 3. DT84(6)<br /> 1. BK<br /> 4. E036- b(6)<br /> phNm PCR nhận được có kích thước phân tử giống<br /> 2. E085- 3<br /> 5. E085- 10<br /> với đoạn tương ứng cDNA của gen chaperonin giống<br /> đậu tương Nhật Bản [4]. Điều đó chứng tỏ sản phNm<br /> PCR chúng tôi thu được có thể chính là gen chaperonin mã hóa tiểu đơn vị δ. Như vậy kết quả sản<br /> phNm PCR chúng tôi thu được phù hợp với tính toán lý thuyết.<br /> * Phân tích sản ph/m PCR bằng enzim giới hạn<br /> Sau khi sử dụng phần mềm Bioedit để phân tích các trình tự gen chaperonin đơn vị δ đã công bố<br /> [5], [10], chúng tôi nhận thấy trình tự gen chaperonin có các điểm nhận biết cho enzyme giới hạn SacI.<br /> Như vậy, để có thể khẳng định sản phNm PCR thu được là gen chaperonin và nghiên cứu sự sai khác<br /> trình tự nucleotit ở trình tự nhận biết của enzyme SacI giữa gen chaperonin tiểu đơn vị δ thu được với<br /> các trình tự đã công bố, chúng tôi tiến hành xử lý sản phNm PCR bằng enzyme cắt SacI, sau đó điện di<br /> trên gel agarose 1,5% và thu được kết quả trên hình 3.<br /> Kết quả điện di cho thấy 3 giống nhập ngoại DT84(6), E036- b(6) và E085- 10 cho 5 băng AND<br /> tương ứng 5 đoạn ADN có kích thước tương ứng khoảng 260, 189, 198, 630, 387 bp.<br /> Kết quả này tương tự với các giống M103 và ML61 đã được đánh giá là có khả năng chịu nóng<br /> và chịu hạn. Trong khi đó kết quả cắt bằng enzim SacI ở giống đậu tương BK chỉ thấy xuất hiện<br /> 4 băng có kích thước tương ứng khoảng 260, 323, 387, 630. Kết quả này tương tự với giống Cúc<br /> Vàng và Bonminori. Như vậy, sản phNm PCR chúng tôi thu được chính là gen mã hóa<br /> chaperonin tế bào chất đơn vị δ.<br /> 103<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> - Hàm lượng lipit 5 giống đậu tương nghiên<br /> cứu dao động từ 20,7% tới 24,87%. Giống có hàm<br /> lượng lipit thấp nhất đạt 20,7 là BK, cao nhất đạt<br /> 24,87% là DT84(6).Giống có hàm lượng protein cao<br /> nhất là BK, giống có hàm lượng protein thấp nhất là<br /> E085 -3<br /> - Đã nhân được gen chaperonin tế bào chất<br /> đơn vị δ có kích thước phân tử khoảng 1,6 kb từ<br /> các giống đậu tương nhập ngoại và giống nội BK<br /> bằng kỹ thuật PCR.<br /> - Đã phân tích sản phNm PCR thu được<br /> bằng enzyme giới hạn SacI.<br /> <br /> Hình 3: Ảnh điện di sản ph/m cắt<br /> các giống đậu tương nghiên cứu<br /> M. Maker 1 kb 3. DT84(6)<br /> 1. BK<br /> 4. E036- b(6)<br /> 2. E085- 3 5. E085- 10<br /> <br /> ĐỀ NGHN<br /> Để có thể đưa ra những kết luận đầy đủ và chính xác về cấu trúc gen chaperonin của các<br /> giống đậu tương nhập từ Úc, cần phải xác định trình tự nucleotit của gen.<br /> Cần có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu<br /> tương nhập từ Úc.<br /> SUMMARY<br /> Study Lipit and Protein content, multiply Chaperonin drought -resistant gene in<br /> several kinds of bean imported from Australia.<br /> The lipid content is from 20,7% to 24,87% of dry weight. The cultivars which had the<br /> lowest content of lipid were E085- 5 reaching 20,7%, the highest was DT84 (6) which reached<br /> 24.87%. The protein content of these cultivars ranged from 24, 11 to 33, 82% of dry weight. The<br /> cultivars that had the highest content of protein were BK. The cultivars that had the lowest<br /> content of protein were E085-3.<br /> The complete coding region of a cytosolic chaperonin gene was amplified by polymerase<br /> chain reaction (PCR) using the total genomic DNAs isolated from the leaves of soybean<br /> cultivars E085-3, E085-10, E036-b(6), DT84(6) and native cultivars (BK).<br /> These PCR products were analysed by enzyme SacI.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Becker., Shutov A. D., Nong Van Hai, Senyuk V. I., Jung R., Horstmann C., Fischer J., Nielsen<br /> N. C., Muntz K (1995), Purification, cDNA cloing and characterization of prsoteinase B an asparagine specific endopeptidase, Eur. J. Biochem, vol. 288, pp. 456-463.<br /> [2]. Phạm Thị Trân Châu (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội.<br /> <br /> 104<br /> <br /> T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007<br /> <br /> [3]. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu<br /> tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.<br /> [4]. Nong Van Hai, Arahia M. Phan Van Chi, Zhang D., Fukazawa C.Eur.(1998), Cloning and<br /> characterization of soybean cytosolic chaperonin, a δ-subunit homologue ofchperonin containing tcomplex polypeptide-1(CCT), European Juournal of Biochemistry.<br /> [5].Tran Thi Phuong L., Le Thi Thu H., Nguyen Dang T., Cao Xuan H., Nong Van H. and Le Thi<br /> M., Cloning of a cytosolic chaperonin gene from high-temperature tolerant soybean cultivar M103,<br /> Submitted (28-OCT-1998) Nong V., Applied DNA Technology Lab, Institute of Biotechnology (IBT),<br /> NCST, Nghiado, Caugiay, Hanoi, Viet Nam (AJ012318).<br /> [6]. Chu Hoàng Mậu (2001), Luận án Tiến sĩ Sinh học,.<br /> [7]. Trần Quang Minh (2004), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hoá sinh hạt và đặc điểm phản<br /> ứng của kiểu gen một số giống đậu tương trồng tại Nam Định, Khoá luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm<br /> Thái Nguyên,.<br /> [8]. Nguyễn Văn Nam (2006), Khảo nghiệm một số giống đậu tương vụ xuân trồng tại Đại học<br /> Nông lâm Thái Nguyên, Khóa luận tốt nghiệp.<br /> [9].Sambrook, Russell D.W., Maniatis T. (2003), Molecular cloning, A labotatory manual. Cold<br /> sping Harbor laboratory press, 2001.<br /> [10]. Hoàng Thị Thu Yến, Nghiêm Ngọc Minh, Nông Văn Hải, Chu Hoàng Mậu, Trịnh Đình Đạt,<br /> Phân lập gen chaperonin ở các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và ML61, Báo cáo khoa học Hội nghị<br /> toàn quốc, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB khoa học kỹ thuật, tr: 1073-1076.<br /> [11]. www.google/Fao/faostap.<br /> <br /> 105<br /> <br />