Luận văn Thạc sỹ: Nghiên cứu khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp của một số loài vi khuẩn vibrio trên tôm nuôi nước lợ tại một số tỉnh phía Bắc

............(cid:1)(cid:2)............ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN ANH TUẤN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP CỦA MỘT SỐ LOÀI

VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM NUÔI NƯỚC LỢ

TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC

.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

............(cid:1)(cid:2)............

TRẦN ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP CỦA MỘT SỐ LOÀI VI

KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM NUÔI NƯỚC LỢ TẠI

MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC

CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN

MÃ SỐ: 60.62.03.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHAN THỊ VÂN

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii

HÀ NỘI - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã

được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page i

Trần Anh Tuấn

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo, Phòng Hợp

tác Quốc tế và Đào tạo - Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1, Ban Giám

hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Cơ quan Thú y vùng III đã ủng

hộ, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt khóa học này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới cô giáo hướng dẫn, TS. Phan

Thị Vân, người đã tận tình định hướng, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện luận văn.

Qua đây, tôi xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Quan

trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực phía Bắc – Viện

nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 và các cán bộ thuộc đề tài “Tôm khẩn cấp

năm 2013” đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài.

Lời cảm ơn chân thành xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp,

những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong học tập cũng như trong

cuộc sống.

Hà Nội 20 tháng 11 năm 2014

Tác giả luận văn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii

Trần Anh Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii

MỤC LỤC ....................................................................................................................iii

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... vi

DANH MỤC VIẾT TẮT.............................................................................. vii

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

1 Tính cấp thiết của đề tài .................................................................... 1

2 Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................... 2

3 Nội dung nghiên cứu ......................................................................... 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3

1.1 Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu ......................................... 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái vi khuẩnVibrio ............................... 3

1.1.2 Đặc tính phân bố và nuôi cấy ............................................................ 4

1.1.3 Đặc tính sinh hóa .............................................................................. 5

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Vibrio spp trên tôm ............. 8

1.2.1 Trên thế giới ..................................................................................... 8

1.2.2 Ở Việt Nam ..................................................................................... 15

1.3 Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ .................. 18

1.3.1 Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên thế giới ................................. 18

1.3.2 Tình hình hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở Việt Nam ...................... 18

1.4 Các nghiên cứu liên quan đến hiện tượng hoại tử gan tụy ở tôm nuôi ........ 20

1.4.1 Hoại tử gan tụy tôm do MBV và HPV ............................................ 20

1.4.2 Hoại tử gan tụy tôm do vi khuẩn ký sinh nội bào (Necrotizing

Hepatopancreatitic, NHP) ............................................................... 20

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii

1.4.3 Hoại tử gan tụy do vi bào tử trùng ................................................... 21

1.4.4 Hoại tử gan tụy do độc chất ............................................................ 21

1.4.5 Bệnh hoại tử gan tụy cấp ................................................................. 23

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 27

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu .................................................. 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 27

2.1.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 27

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu ....................................................... 27

2.2.1 Thời gian nghiên cứu ...................................................................... 27

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 27

2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................... 27

2.3.1 Xác định AHPND ........................................................................... 27

2.3.2 Phân lập và định danh vi khuẩn (Frerichs và Millar (1983, 1993) ......... 30

2.3.3 Xác định độc lực của vi khuẩn: ....................................................... 33

2.3.4 Thử kháng sinh đồ (Kibry-Bauer) ................................................... 36

2.4 Phương pháp xử lí số liệu ................................................................ 36

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................... 37

Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND .................... 37 3.1

Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực ................................... 40 3.2

Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được ..... 46 3.3

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 51

Kết luận .......................................................................................... 51 1.

Đề xuất ........................................................................................... 51 2.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

STT TÊN BẢNG TRANG

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác

DANH MỤC BẢNG

nhân gây bệnh ở động vật thuỷ sản (Buller, 2004) ............................ 7

Bảng 2.1 Cách thực hiện và đọc các phản ứng sinh hóa................................ 32

Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ............................................................. 37

Bảng 3.2 Kết quả phân tích mẫu theo phương pháp mô ................................ 39

Bảng 3.3 Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 1 ..... 41

Bảng 3.4 Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 2 ..... 42

Bảng 3.5 Kết quả tái phân lập vi khuẩn thí nghiệm 3.................................... 44

Bảng 3.6 Kết quả phân tích mô bệnh học thí nghiệm 3 ................................. 45 Bảng 3.7 Tính nhạy, trung bình của một số loài vi khuẩn đối với một số

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v

loại kháng sinh ................................................................................ 47

STT TÊN HÌNH TRANG

Hình 1.1:Vi khuẩn V. parahaemolyticus ......................................................... 3

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2: Vi khuẩn V. vulnificus..................................................................... 3

Hình 1.3: Vi khuẩn V. harveyi ........................................................................ 4

Hình 1.4: Vi khuẩn V. alginolyticus ................................................................ 4

Hình 1.5: Khuẩn lạc vi khuẩn V. harveyi ....................................................... 5

Hình 1.6: Khuẩn lạc vi khuẩn V. Parahaemolyticus ...................................... 5

Hình 1.7: Nhuộm gram vi khuẩn V.Vulnificus ............................................... 5

Hình 1.8: Phản ứng Indol trên V. parahaemolyticus ...................................... 5

Hình 1.9: Dấu hiệu nhận biết AHPND theo phương pháp mô bệnh học ....... 24

Hình 2.1: Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 36

Hình 3.1: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nghệ An ..................................... 38

Hình 3.2: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nam Định

Hình 3.3: Hình ảnh soi vi khuẩn trên kính hiển vi ........................................ 39

Hình 3.4: Thử sinh hóa V. paraheamolyticus tái phân được ......................... 45

Hình 3.5: Tổ chức mô của tôm bị AHPND ................................................... 46

Hình 3.6: Kháng sinh đồ V.paraheamolyticus (12.020) ................................ 49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi

Hình 3.7: Kháng sinh đồ V. vulnificus và V.paraheamolyticus (13.014) ....... 49

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

Acute Hepatopancreatic Necrosis Dsease

AHPND:

CTVK: Công thức vi khuẩn

ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long

Early Mortality Syndrome EMS:

Hepatopancreatic Pavovirrus HPV:

IHHNV: Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus

Infectious Myonecrosis Virus IMNV:

Monodon Baculovirus MBV:

Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific NACA:

Necrotizing Hepatopancreatitis NHP:

Nuôi Trồng Thủy Sản NTTS:

Polymerase Chain Reaction PCR:

Thuốc BVTV: Thuốc Bảo vệ thực vật

TSV: Taura Syndrome Virus

Viện NCNTTS: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii

YHV: Yellow Head Virus

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nuôi tôm nước lợ là một hình thức nuôi quan trọng đem lại giá trị kinh

tế cao, chiếm hơn 40% tổng giá trị sản phẩm nuôi trồng thủy sản ở nước ta.

Trong các loài được nuôi ở nước lợ, tôm sú và tôm thẻ chân trắng là những

loài được nuôi phổ biến trên địa bàn cả nước ta với gần 80% tổng diện tích

nuôi trồng nước lợ (FAO, 2012). Hình thức nuôi này đóng một vai trò to lớn

trong tổng giá trị nuôi trồng thủy sản tiêu thụ trong nước cũng như giá trị xuất

khẩu sang nhiều nước trên thế giới.

Tuy nhiên, người nuôi tôm nước lợ đang phải đối mặt với nhiều loại

dịch bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn, trong đó phải kể đến bệnh hoại tử gan

tụy cấp (AHPND). Đây là một loại dịch bệnh mới xuất hiện ở nước ta từ

giữa năm 2010, gây chết tôm sú và tôm thẻ chân trắng hàng loạt trên địa bàn

Đồng bằng song Cửu Long. Trong 2 năm tiếp theo, 2011 và 2012, dịch bệnh

tiếp tục lan rộng ra nhiều tỉnh khác, tập trung tại Trà Vinh, Sóc trăng, Kiên

Giang và ở một số tỉnh ven biển phía Bắc: Hải Phòng và Quảng Ninh, Bắc

Trung bộ: Thanh Hóa và Nghệ An, Nam Trung bộ: Quảng Ngãi, Bình Định,

Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận. Do diện tích tôm mắc bệnh rất lớn

và tôm chết tập trung chủ yếu ở giai đoạn 20 - 30 ngày tuổi, đây là cỡ tôm

khi phát hiện bệnh người nuôi thường xử lý và xả bỏ nên gây thiệt hại rất

lớn. Đặc biệt trong năm 2012, cả nước có khoảng 100.776 ha diện tích nuôi

tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh thì có tới 46.093 ha diện tích nuôi tôm

nước lợ được xác định là bị chết do hội chứng hoại tử gan tụy (Tổng cục

Thủy sản, 2012).

Trong thời gian qua, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm xác

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1

định nguyên nhân gây dịch bệnh. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng hội chứng

này có liên quan trực tiếp đến thuốc bảo vệ thực vật và tảo độc, trong khi đó,

một số nghiên cứu khác lại cho rằng có mối quan hệ chặt chẽ giữa việc sử

dụng thức ăn và các chế phẩm sinh học trong nuôi trổng thủy sản với hội

chứng hoại tử gan tụy. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây tìm thấy nhiều

loại vi khuẩn ở tôm bị hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở tất cả các vùng nuôi

tôm trong đó vi khuẩn Vibrio chiếm thành phần chủ yếu và phổ biến nhất là

các loài V. parahaemolyticus, V. vulnificus,V. harveyi. Cụ thể là, một nghiên

cứu của giáo sư Lightner và cộng sự (2013) đã chỉ ra một chủng vi khuẩn V.

parahaemolyticus là tác nhân gây ra hội chứng này.

Với mục đích làm rõ sự liên quan của nhóm vi khuẩn Vibrio đến bệnh

hoại tử gan tụy cấp, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng gây

bệnh hoại tử gan tụy cấp của một số loài vi khuẩn vibrio trên tôm nuôi

nước lợ tại một số tỉnh phía Bắc”. Đây là một đề tài nhỏ thuộc đề tàii

“Nghiên cứu nguyên nhân, tác nhân gây hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm sú

và tôm thẻ chân trắng và biện pháp khắc phục” của Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn giao cho Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1 chủ trì trong

năm 2013.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định các loài vi khuẩn Vibrio độc lực trên tôm sú, tôm thẻ chân

trắng bị AHPND.

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND

- Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2

- Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái vi khuẩnVibrio

Hệ thống phân loại (Ackermann, 1984):

Ngành Proteobacteria

Lớp Gammaproteobacteria

Bộ Vibrionales

Họ Vibrionaceae Veron, 1965

Giống Vibrio Pacini, 1854

Loài Vibrio spp

Hình thái:

Đặc điểm chung của các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm,

hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5x1,4-2,6 µm; chúng

không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm

mao mảnh.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 3

Hình 1.1:Vi khuẩn V. parahaemolyticus Hình 1.2: Vi khuẩn V. vulnificus

(Buller, 2004) (Buller, 2004)

Hình 1.3: Vi khuẩn V. harveyi Hình 1.4: Vi khuẩn V. alginolyticus

(Buller, 2004) (Buller, 2004)

1.1.2 Đặc tính phân bố và nuôi cấy

Ngoài tự nhiên vi khuẩn Vibrio phân bố rất phổ biến trong môi trường

nước biển và vùng nước lợ ven biển; có thể tìm thấy chúng trong các tầng

nước, vùi trong trầm tích đáy hoặc bám trên bề mặt của các sinh vật sống

trong vùng nước đó. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 20-300C (Bùi Quang Tề và cộng sự, 2004).

Trong môi trường nuôi cấy tất cả các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio

đều cần muối NaCl để phát triển, nồng độ muối cho phép trong môi trường

nuôi cấy thường là 1-2 %.

TCBS là môi trường chọn lọc của các loài vi khuẩn Vibrio, sau 18-24h

nuôi cấy hình thành khuẩn lạc với kích thước khoảng 2–5mm, có màu vàng

(V. cholerae, V. alginolyticus, V. fluvialis) hoặc xanh (V. parahaemolyticus,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4

V. harveyi, V. vulnificus).

Hình 1.5: Khuẩn lạc vi khuẩn V. harveyi (Buller, 2004) Hình 1.6: Khuẩn lạc vi khuẩn V. Parahaemolyticus (Buller, 2004)

1.1.3 Đặc tính sinh hóa

Các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều yếm khí tuỳ tiện, hầu hết là

oxy hoá và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh

H2S và mẫn cảm với Vibriostat (0/129) (Bùi Quang Tề và cộng sự, 2004).

Hình 1.7: Nhuộm gram vi khuẩn Hình 1.8: Phản ứng Indol trên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 5

V.Vulnificus (Buller, 2004) V. parahaemolyticus (Buller, 2004)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6

Bên trái: (-); Bên phải: (+)

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác nhân gây bệnh ở động vật thuỷ sản (Buller, 2004)

4 - + + - - + - + - S S

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7

1 Đặc điểm sinh hóa Nhuộm Gram - Di động + Phản ứng Oxydase + + Phát sáng Phát triển ở nhiệt độ 40C - Phát triển ở 370C + Phát triển ở 0%NaCl - Phát triển ở 3%NaCl + Phát triển ở 7%NaCl + Nhậy cảm 0/129 (10 µg) S Nhậy cảm 0/129(150 µg) S Màu khuẩn lạc trênTCBS xanh Thử O/F Glucose +/+ β galactosidase Arginine dihydrolase - Lysine Decarboxylase + Orinithine Decarboxylase + Phản ứng Citrate + Phản ứng Urease - + Khử Nitrate NO3→NO2 + Indol - Sinh H2S - Methyl red - Voges-Proskauer (V-P) Dịch hóa Gelatin + d Axit hoá¸ Arabinose + Axit hoá¸ Glucose - Axit hoá¸ Inositol + Axit hoá¸ Mannitol - Axit hoá¸ Salicin - Axit hoá¸ Sorbitol - Axit hoá¸ Sucrose 3 - + + - - + - + + R S vàng vàng +/+ - - + + d - + + - - + + - + - + - - + +/+ + - - - + - + + - d + + + + - + - + + 5 - + + - - + - + - S S xanh +/+ + - + - + - + - - - - + - + - - - - - 6 - + + - + - - + - S S - +/+ - - - - - - - - - - - - + - D - - - 2 - + + + - + - + + S S xanh +/+ - + - - - + + - + - + - + - + - -

Chú thích:

1 - Vibrio parahaemolyticus 4 - Vibrio anguillarum

2 - Vibrio harveyi 5 - Vibrio vulnificus

3 - Vibrio alginolyticus 6 - Vibrio salmonicida

" + " > 90 % các chủng phản ứng dương

" - " < 90 % các chủng phản ứng âm

“ d " 11 - 89 % các chủng phản ứng dương

“ R ": Không mẫn cảm

“ S ": Mẫn cảm

n: Chưa có số liệu.

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Vibrio spp trên tôm

1.2.1 Trên thế giới

Dịch bệnh xảy ra và những thiệt hại to lớn của nó là động lực thúc đẩy

sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học và cùng với nhu cầu cấp thiết

của nền sản xuất mà trong một thời gian ngắn, hàng loạt các thành tựu nghiên

cứu bệnh tôm đã được công bố và áp dụng. Dựa vào tác nhân gây bệnh, các

nhà khoa học chia bệnh thủy sản ra thành những bệnh chủ yếu sau: Bệnh do

virus, bệnh do vi khuẩn, bệnh do nấm, bệnh do ký sinh trùng và một số bệnh

do các yếu tố vô sinh gây ra ở tôm.

Trong số các tác nhân gây bệnh ở tôm nuôi thì vi khuẩn là một trong

những tác nhân thường gặp, được coi là có ảnh hưởng kinh tế rất lớn tới các

trang trại nuôi tôm trên toàn thế giới (Venkateswara Rao và cộng sự, 2010).

Trong điều kiện ao nuôi có mật độ cao, đầu tư thức ăn lớn, hiện tượng ô

nhiễm thường xuyên xảy ra tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và

gây tác hại. Theo thống kê của Sindermann và Lighter (1988), các bệnh ở tôm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8

do vi khuẩn gây ra chiếm 45,5% trong tổng số các loại bệnh, trong khi virus

chỉ chiếm 25,3%, nấm chiếm 2,7%, ký sinh trùng chiếm 26,5%. Bệnh do vi

khuẩn chủ yếu là các bệnh do Vibrio gây ra, chúng được báo cáo trong các hệ

thống nuôi tôm trên toàn thế giới gồm có ít nhất 14 loài: Vibrio harveyi, V.

splendidus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum, V.

vulnificus, V. campbelli, V. fischeri, V. damsella, V. pelagicus, V. orientalis,

V. ordalii, V. mediterrani và V. logei.

Theo Venkateswara Rao và cộng sự, 2010, Vibriosis là bệnh vi khuẩn

có liên quan đến tỉ lệ chết ở tôm nuôi trên toàn thế giới. Sự nhiễm vi khuẩn

Vibrio thường xuất hiện trong các trại sản xuất giống, nhưng dịch bệnh lại hay

xảy ra ở ao nuôi tôm. Sự bùng phát dịch bệnh có thể xảy ra khi các yếu tố môi

trường gây nên sự nhân lên nhanh chóng mật độ vi khuẩn đã nhiễm ở mức

thấp trong máu tôm hoặc do sự xâm nhập của vi khuẩn vào rào cản vật chủ

(Sizemore và Davis, 1985).

Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh Vibrio ở tôm sú (P. monodon),

Jiravanichpaisal (1995) cho rằng có 2 con đường xâm nhập của vi khuẩn là

xâm nhập vào gan tụy và xâm nhập vào biểu mô phụ. Sự xâm nhập theo con

đường gan tụy lại rất mạnh và thường xảy ra ở giai đoạn ấu trùng và tôm

giống, trong khi đó sự xâm nhập theo đường biểu mô phụ xảy ra chủ yếu trên

tôm trưởng thành. Điều này là bởi vì ở giai đoạn tôm trưởng thành, hoạt động

kháng khuẩn có thể mạnh ở ống gan tụy (Stewart, 1980). Theo Anderson

(1988), khi bề mặt cơ thể tôm bị tổn thương sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho vi

khuẩn Vibrio xâm nhập qua con đường này.

Khi nghiên cứu về bệnh do Vibrio trong các trại sản xuất tôm giống,

Adam (1991) và nhiều tác giả khác cho rằng: Tôm ấu trùng và hậu ấu trùng

khi bị nhiễm khuẩn nặng có thể gây hiện tượng phát sáng và chết hàng loạt.

Lightner và cộng sự (1996) cũng đã thông báo, trong số các bệnh gây ra ở ấu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9

trùng tôm, bệnh phát sáng là bệnh nhiễm trùng toàn thân và gây thiệt hại lớn

nhất, hiện tượng phát sáng trong bóng tối là dấu hiệu đặc thù của bệnh này.

Ngoài ra, theo Tonguthai (1995), ấu trùng tôm bị bệnh phát sáng thì cơ thể trở

nên yếu ớt, chuyển màu trắng nhợt và lắng xuống đáy, tỷ lệ chết có thể lên tới

100% trong 1 đến 2 ngày, khi bệnh phát sáng xuất hiện trong trại sản xuất thì

việc ngăn ngừa giữa các bể ương nuôi là rất khó khăn và có thể đợt sản xuất

đó bị thất bại hoàn toàn. Tiến hành giải phẫu ấu trùng tôm bị nhiễm bệnh phát

sáng và quan sát dưới kính hiển vi cho thấy vi khuẩn nhiễm dày đặc trong

khoang máu của ấu trùng phát quang đã gần chết (Pitogo, 1995).

Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm sú,

Baticados (1988) và nhiều tác giả khác đều có chung nhận định: V. harveyi

được coi là vi khuẩn chủ yếu gây ra bệnh phát sáng. Tác nhân gây bệnh V.

harveyi tồn tại tự nhiên trong môi trường nước biển, ở đó có thể tìm thấy

chúng trong những thành viên bậc thấp (Ruby and Nealson, 1978). Khi bệnh

phát sáng xảy ra trong bể ương ấu trùng tôm, số lượng vi khuẩn Vibrio tăng

dần theo thời gian. Tuy vậy, Lightner (1996) cho rằng ấu trùng tôm sú có thể

bị phát sáng khi nhiễm ở mật độ cao các loại vi khuẩn V. harveyi, V.

parahaemolyticus và V. vulnificus. Theo Pẽna và cộng sự (2001), vi khuẩn

gây bệnh phát sáng V. harveyi đã gây ra tỉ lệ chết cao trên tôm sú (Penaeus

monodon) nuôi ở Philippin và là loài hiện diện trong ao nuôi với tỷ lệ rất cao,

chiếm 65,5%. Liên quan tới tần số xuất hiện Vibriosis trên tôm nuôi tại một

số trang trại ở Ấn Độ, theo Otta và cộng sự (2000) thì V. alginolyticus chiếm

tỉ lệ cao nhất từ 7,8% đến 50%, sau đó là V. harveyi 13% - 23%, V.

parahaemolyticus 6,6% - 11,5% và một số loài khác.

Khi nghiên cứu về khả năng gây bệnh do vi khuẩn Vibrio trên tôm,

nhiều tác giả đã khẳng định hầu hết vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh

thứ cấp. Theo Lightner (1998), cơ thể tôm có khả năng đề kháng với vi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 10

khuẩn Vibrio, cho nên ngay cả trên tôm khỏe vẫn tồn tại một lượng vi

khuẩn này, chúng chờ cơ hội để tăng số lượng và độc lực gây bệnh cho

tôm. Các nghiên cứu về bệnh tôm ở Châu Á cho thấy có sự kết hợp giữa vi

khuẩn Vibrio với các tác nhân khác như virus, ký sinh trùng... gây tác hại

tổng hợp trên tôm. Theo Chanratchakool (1995), vi khuẩn Vibrio là tác

nhân cơ hội tấn công vào tôm nuôi khi tôm bị nhiễm virus đốm trắng,

nghiên cứu mẫu bệnh phẩm thì ngoài việc tìm thấy các tiểu thể virus còn có

một số lượng lớn vi khuẩn Vibrio.

Theo nhiều báo cáo nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn Vibrio nhiễm trên

tôm ở Châu Á thì dịch bệnh ngày càng trở nên phổ biến ở các trang trại nuôi

tôm thuộc các quốc gia này; Theo Daud (1992), mầm bệnh vi khuẩn phổ biến

nhất trên tôm he ở Philippine là V. ordalii, V. anguillarum, V. vulnificus, V.

harveyi và V. splendilus . Theo Kou và cộng sự (1998) ở Đài Loan những loài

vi khuẩn Vibrio được tìm thấy gồm: V. tubiashii, V. anguillarum, V. harveyi,

V. mereis hoặc V. damsela. Ruangpan và Kitao (1991) đã phân lập và xác

định được 5 loài Vibrio (V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus,

V. fluvialis và Vibrio spp) từ tôm sú bị bệnh nuôi ở Thái Lan.

Nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn Vibrio trong tự nhiên cho thấy,

một lượng đáng kể vi khuẩn Vibrio tồn tại trong nước biển, trong các bể ương

ấp và đặc biệt là trong ruột tôm bố mẹ. Trong ruột tôm bố mẹ, vi khuẩn Vibrio có thể nhiễm với mật độ 2x109 cfu/g, chiếm từ 63 - 67% và khoảng 16 - 18%

trong tổng số vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh phát sáng (Pitogo, 1998).

Ruangpan (1995) cho rằng, số lượng vi khuẩn Vibrio tồn tại và phát triển

trong bể ấp và ao nuôi phụ thuộc vào mật độ nuôi, ao nuôi tôm mật độ cao thì

số lượng vi khuẩn này luôn cao hơn so với ao nuôi mật độ thấp.

Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho tôm

nuôi, chúng là vi khuẩn cơ hội vì bình thường chúng luôn tồn tại trong môi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11

trường ương nuôi. Khi điều kiện sống có những thay đổi bất lợi như các yếu

tố về khí hậu, môi trường, dinh dưỡng... hoặc do mắc các bệnh gây trạng thái

“stress” làm giảm sức đề kháng của tôm nuôi, lúc đó chúng mới tấn công gây

nên bệnh. Theo Pitogo (1995), bệnh vi khuẩn ở tôm nuôi luôn xuất hiện cùng

với những quá trình bệnh lý khác hoặc phản ánh hậu quả của việc phá vỡ cân

bằng sinh thái trong bể hoặc ao nuôi. Theo Chanratchakool (1995), tôm nuôi

trước khi cảm nhiễm bệnh vi khuẩn Vibrio đã có sự thay đổi màu sắc tự nhiên

sang màu đỏ, điều đó chứng tỏ là tôm nuôi bị “stress”. Sự suy giảm môi

trường ao nuôi đóng một vai trò quan trọng trong việc gây stress này của tôm,

dẫn đến vi khuẩn Vibrio nhiễm thứ phát.

Để giảm thiểu tác hại của các bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm

nuôi, người ta đã sử dụng một số loại hóa chất và thuốc kháng sinh trong công

tác phòng trị bệnh. Hóa chất thường được sử dụng rộng rãi là Chlorin A, tuy

nhiên chúng luôn có tác dụng hai mặt; theo Pitogo (1995) Chlorin chỉ có tác

dụng kìm hãm vi khuẩn ở nồng độ 15 - 30 ppm và vi khuẩn xuất hiện lại trong

12 giờ sau khi ngừng khử trùng bằng hóa chất này; ngoài ra khi sử dụng

Chlorin còn kích thích sự phát triển của gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn và

tiêu diệt tảo (David, 1999)

Một số loại kháng sinh đã được sử dụng nhiều trong các trại nuôi tôm

trên thế giới như Chloramphenicol, Furazolidone, Oxytetracycline và

Streptomycin... Tuy nhiên việc sử dụng thuốc kháng sinh chỉ có hiệu quả

trước mắt nhưng để lại hậu quả về hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn, đồng

thời thị trường tiêu thụ của một số nước nhập khẩu không chấp nhận do sự tồn

dư thuốc trong sản phẩm dẫn đến sự ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng.

Nhằm hạn chế nhược điểm của thuốc kháng sinh, đã có một số nghiên

cứu với nhiều giải pháp thay thế như: Dùng chế phẩm sinh học để bổ sung

vào ao nuôi hoặc vào thức ăn cho tôm được cho là rất an toàn và có hiệu quả.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12

Theo David (1999), tôm nuôi ở một số nông trại thuộc Negros – Philippines

đã bị bệnh do vi khuẩn phát sáng Vibrio, thay vì sử dụng kháng sinh người ta

đã bổ sung vi khuẩn có ích vào ao nuôi tôm và kết quả cho thấy số lượng lớn

vi khuẩn phát sáng giảm khi bổ sung dòng chọn lọc Bacillus. Thử nghiệm bổ

sung probiotic Arthrobacter XE – 7 vào thức ăn cho tôm chân trắng (Penaeus

vannamei), sau đó cảm nhiễm V. parahaemolyticus bằng cách tắm, kết quả

cho thấy tỉ lệ chết của tôm giảm đáng kể so với lô đối chứng (Li và cộng sự,

2008). Hiện nay một số nước Châu Á như Philippin, Trung Quốc, Việt Nam

đã sử dụng chế phẩm sinh học như một chất không thể thiếu để bổ sung vào

thức ăn hoặc cho vào môi trường ao nuôi nhằm phòng và trị bệnh do Vibrio

gây ra trên tôm, hiệu quả là giảm thiểu bệnh xảy ra và tăng tỉ lệ sống cho tôm,

một số chế phẩm sinh học được sử dụng: ES 2A Aquakit, EMS và Bio – DW.

Việc nghiên cứu sử dụng các chất kích thích hệ miễn dịch cho tôm

cũng đã được quan tâm như: Felix và cộng sự (2004), thử nghiệm nâng cao

khả năng miễn dịch của tôm sú (P. monodon) đối với vi khuẩn V.

parahaemolyticus bằng cách sử dụng các hợp chất chiết xuất từ một loại tảo

biển (Sargassum wightii) phối hợp vào thức ăn cho tôm, kết quả cho thấy tôm

có khả năng miễn dịch cao (tỉ lệ sống 83%), đây là nghiên cứu mở đầu để sử

dụng nguồn thực vật tự nhiên dồi dào ở biển thay thế cho một số chất kích

thích miễn dịch được lấy từ động vật. Chen (2008) đã thử nghiệm dùng các

hợp chất chiết xuất từ cây cỏ biển (Chondrus crispus) để tiêm cho tôm chân

trắng (Litopenaeus vannamei), sau đó cảm nhiễm V. alginolyticus lên tôm, kết

quả cho thấy tôm có khả năng miễn dịch với loại vi khuẩn này.

Ngoài ra, người ta cũng đã nghiên cứu các hình thức nuôi ghép để hạn

chế mật độ vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm như: Eleonor (2007) nuôi ghép

tôm sú (P. monodon) với vẹm hoặc hầu đã làm giảm mật độ vi khuẩn phát

sáng V. harveyi; thí nghiệm của ông chỉ ra rằng khi nuôi ghép vẹm xanh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13

(Perna viridis), vẹm nâu (Perna indica) hoặc hàu (Crassostrea sp) với tôm sú

theo mật độ phù hợp đã làm giảm mật độ vi khuẩn phát sáng trong ao từ 104 cfu/ml xuống còn 101 cfu/ml, ngoài ra động vật thân mềm còn góp phần làm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14

sạch môi trường ao nuôi.

1.2.2 Ở Việt Nam

Tình hình dịch bệnh đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở

Việt Nam, đây là vấn đề đặt ra cho các nhà nghiên cứu khoa học Thuỷ sản.

Để giải quyết vấn đề thực tiễn này đã có nhiều đề tài nghiên cứu khoa học về

bệnh tôm sú và tôm thẻ chân trắng của Việt Nam được tiến hành:

Lý Thị Thanh Loan (2003), đã nghiên cứu một cách có hệ thống các vi

sinh vật gây bệnh quan trọng như nhóm Vibrio, MBV, WSSV trên tôm sú

nuôi ở các mô hình khác nhau tại các tỉnh ĐBSCL. Khi xác định tần số xuất

hiện của Vibriosis trong các hệ thống nuôi, kết quả cho thấy các loài gây bệnh

thường gặp gồm: V. parahaemolyticus, V. harveyi và V. alginolyticus chiếm tỉ

lệ cao hơn hẳn những loài khác trong các mẫu phân tích.

Nghiên cứu về bệnh Vibriosis ở tôm thì theo một số tác giả, những loài

gây bệnh cho tôm là: Vibrio parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V.

splendidus, V. alginolyticus, V. anguilarum và V. damsela gây bệnh phát

sáng, đỏ thân và ăn mòn vỏ ki tin. Những loài này thường là tác nhân cơ hội;

khi tôm bị sốc do môi trường biến đổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác như

virus, nấm, ký sinh trùng thì chúng sẽ tấn công gây bệnh, làm tôm chết rải rác

tới hàng loạt. Tôm bị bệnh phát sáng thường biểu hiện yếu, lờ đờ, kém bắt

mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục; bệnh

xảy ra ở trong các trại giống tác hại thường lớn, đặc biệt ở các giai đoạn tiền

ấu trùng như Zoea, Mysis. Nếu bệnh xảy ra ở dạng cấp tính, có thể làm tôm

ấu trùng chết hàng loạt, tỷ lệ chết có thể lên đến 100% trong bể ấp do sự

nhiễm khuẩn toàn thân; đặt ấu trùng bị phát sáng lên kính hiển vi ở độ phóng

đại > 400X có thể quan sát thấy từng đám vi khuẩn đang họat động chiếm chỗ

ở một số nội quan như: máu, gan tụy, mang... Bệnh phát sáng thường gây tác

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15

hại lớn ở giai đoạn ấu trùng và hậu ấu trùng, giai đoạn ấu niên trong ao nuôi

thịt cũng có thể bị ảnh hưởng nhưng tác hại thấp hơn. Từ mẫu tôm bị phát

sáng, người ta đã phân lập được V. harveyi, V. vulnificus, và V.

Parahaemolyticus (Bùi Quang Tề và cộng sự, 2004).

Theo Bùi Quang Tề và cộng sự (2004), tôm nuôi ngoài ao khi bị bệnh do

Vibrio thì có hiện tượng: Nổi lên mặt ao, dạt bờ, kéo đàn bơi lòng vòng. Tôm

ở trạng thái hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Có sự biến đổi màu đỏ hay

màu xanh, vỏ mềm và xuất hiện các vết hoại tử, ăn mòn trên vỏ, các phần phụ

bị mòn gẫy hoặc cụt dần; ông cho rằng tác nhân gây ra là do các loài V.

parahaemolyticus, V. harveyi, V. Vulnificu và V. anguillarum. Còn ở tôm sú

ấu trùng V. alginolyticus gây ra bệnh đỏ thân, với các dấu hiệu xuất hiện các

điểm đỏ ở gốc râu, vùng đầu ngực, thân và các phần phụ của ấu trùng.

Trong các hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể

theo một số con đường bao gồm nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ, tôm

giống và thức ăn tươi sống; hoặc chúng có thể nằm sẵn trên thành bể, dưới

đáy ao. Trong bể ương ấu trùng thì mật độ Vibrio tăng theo thời gian nuôi,

tầng đáy cao hơn tầng mặt, do đó khi xiphông tầng đáy có tác dụng giảm mật

độ Vibrio trong bể ương.

Xác định mức độ nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio trên tôm thông qua

định lượng, Đỗ Thị Hòa và cộng sự (1994) đưa ra các thông số:

Tôm ấu trùng: Tôm khỏe trung bình nhiễm 358 khuẩn lạc/cá thể, tôm

bệnh trung bình nhiễm 3.255 khuẩn lạc/cá thể.

Tôm giống: Tôm khỏe trung bình nhiễm 3.008 khuẩn lạc/cá thể, tôm

bệnh trung bình nhiễm 14.450 khuẩn lạc/cá thể.

Nhằm hạn chế tác hại của bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm nuôi,

các tác giả đã khuyến cáo việc áp dụng các biện pháp phòng trị thích hợp như:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 16

Để phòng bệnh, cần áp dụng biện pháp phòng bệnh tổng hợp như sát trùng ao

bể, dụng cụ, nguồn nước, tôm bố mẹ, rửa trứng hoặc rửa Nauplius, thức ăn

tươi sống bằng các thuốc diệt khuẩn như: Benzalkonium chloride (BKC),

Iodine và Formalin. Ngoài ra cần thường xuyên xiphông, thay nước để loại bỏ

các chất hữu cơ trong ao bể nuôi, quản lý thức ăn tốt, dùng chế phẩm vi sinh

(Probiotic), bổ sung các loại vitamin để tăng cường khả năng miễn dịch của

tôm. Để trị bệnh do Vibrio gây ra trên tôm thì các tác giả đã đưa ra 2 giải

pháp: (1) Dùng thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulphamid, Oxytetracyline,

Erythromycin... trộn vào thức ăn để diệt vi khuẩn cảm nhiễm bên trong cơ thể

tôm. (2) Giảm mật độ vi khuẩn trong nước và cải thiện điều kiện môi trường

bằng một số biện pháp kỹ thuật như xiphông và thay nước đáy, dùng một số

loại thuốc diệt khuẩn như trên, sau đó thay một phần nước trong ao, gây lại

màu nước. Tuy nhiên, họ cũng cho rằng, ở giai đoạn tôm tiền ấu trùng và hậu

ấu trùng, do sức chịu đựng của chúng với thuốc rất kém và khi bệnh đã xảy

ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn, do vậy dùng thuốc khó khăn

và ít có hiệu quả; ngoài ra việc sử dụng thuốc kháng sinh hiện nay đã bộc lộ

nhiều nhược điểm, đó là tạo sự kháng thuốc và tồn dư thuốc trong sản phẩm.

Để hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong công tác phòng trị bệnh cho

tôm nuôi, đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thay thế: như

sử dụng Ozon giúp làm giảm mật độ vi khuẩn Vibrio trong bể ương nuôi ấu

trùng và tăng tỷ lệ sống cho tôm (Trần Thị Kiều Trang, 2004). Phòng và trị

bệnh Vibrio spp bằng thảo dược cho tôm được coi là một cách an toàn và hiệu

quả có thể thay thế kháng sinh như: Ekavari và Microcin. Dùng dịch chiết từ

lá trầu không, với tên thương mại là chế phẩm sinh học Bokashi để phòng và

trị một số bệnh do vi khuẩn gây ra trên tôm, trong đó có vi khuẩn Vibrio spp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 17

cho hiệu quả tốt (Nguyễn Quang Linh, 2010)

1.3 Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ

1.3.1 Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên thế giới

Vào khoảng cuối năm 2009, hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính

(AHPND) hay hội chứng chết sớm (EMS) đã bắt đầu gây thiệt hại nghiêm

trọng đến sản lượng tôm ở phía Nam Trung Quốc. Đến giữa năm 2010, dịch

bệnh bắt đầu được ghi nhận có xảy ra ở Việt Nam. Sau đó, năm 2011, dịch

bệnh tương tự cũng được báo cáo ở Malaysia và từ đầu năm 2012 cũng được

thông báo ở Thái Lan (Flegel, 2012).

Ở Trung Quốc, sự xuất hiện của EMS/AHPND được thông báo đầu tiên

ở Hainan năm 2009 nhưng lúc đó đã không được quan tâm. Đến năm 2011 sự

xuất hiện của dịch bệnh đã trở nên trầm trọng đặc biệt đối với những trang trại

đã từng nuôi tôm trên 5 năm và đối với những trang trại nằm gần biển do sử

dụng nước nuôi cá độ mặn cao hơn (độ mặn trên 20ppt). Trong 6 tháng đầu

năm 2011, khoảng 80% sản lượng tôm đã bị thiệt hại ở các trang trại nuôi tôm

thuộc Hainan, Guangdong, Fujian và Guangxi.

Ở Malaysia, EMS/AHPND được thông báo lần đầu tiên vào cuối năm

2010 ở Johor, sau đó tiếp tục xuất hiện ở Pahang, Perak và Penang trong năm

2011. EMS/AHPND đã gây ra sự suy giảm đáng kể sản lượng tôm thẻ chân

trắng, từ 87,000 triệu tấn năm 2010 xuống còn 67,000 triệu tấn năm 2011.

Ở Thái Lan, đến năm 2012 khoảng 0,7% tổng số ao nuôi tôm đã bị

nhiễm bởi EMS/AHPND, hầu hết xảy ra ở vùng bờ biển thuộc các tỉnh

Rayong, Chantaburi, Trat và Chacheongsao (Flegel, 2012).

1.3.2 Tình hình hội chứng hoại tử gan tụy cấp ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hiện tượng tôm chết với các biểu hiện bất thường trên gan

tụy đã được thông báo chính thức bằng văn bản tại tỉnh Sóc Trăng tháng 5

năm 2011, mặc dù hiện tượng tôm chết tương tự đã được ghi nhận tại một số

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 18

tỉnh ĐBSCL như Sóc Trăng, Bạc Liêu từ cuối năm 2010. Từ đó đến nay dịch

bệnh tiếp tục xảy ra trên diện rộng ở cả mức độ nông hộ và trang trại với mức

độ thiệt hại cao. Dịch bệnh xảy ra trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng.

Theo báo cáo “Tình hình nuôi tôm nước lợ năm 2012 và giải pháp thực

hiện kế hoạch năm 2013” của Tổng cục Thủy sản ngày 12 tháng 12 năm

2012. Năm 2012 cả nước có khoảng 100.776 ha diện tích tôm nước lợ bị thiệt

hại do dịch bệnh (trong đó 91.174 ha nuôi tôm sú và 7.068 ha nuôi tôm thẻ)

bao gồm dịch bệnh đốm trắng, đầu vàng và dịch bệnh gan tụy chưa rõ nguyên

nhân mà sau này được gọi là dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND). Các

tỉnh bị thiệt hại nhiều nhất là: Sóc Trăng thiệt hại 23.371,5 ha (chiếm 56,6%

diện tích thả); Bạc Liêu thiệt hại 16.919 ha (chiếm 41,9% diện tích thả); Bến

Tre thiệt hại 2.237 ha (chiếm 29,06% diện tích thả); Trà Vinh thiệt hại 12.200

ha tôm sú (chiếm 49,3% diện tích thả) và 24,2 ha tôm thẻ chân trắng; Cà Mau

diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh là 958,58 ha, tăng nhiều hơn so với

năm 2011 là 420,02 ha.

Cũng theo báo cáo này, trong 100.776 ha nuôi tôm bị dịch bệnh, tổng

diện tích bị hội chứng hoại tử gan tụy ở tôm nuôi xảy ra ở 19 tỉnh thành ven

biển miền Bắc, miền Trung và Nam Bộ là 46.093 ha (chiếm 45,7%). Các tỉnh

bị bệnh nặng nhất là Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liệu, Cà Mau, Bến Tre và

Kiên Giang. Tuy nhiên diện tích nuôi tôm báo cáo bị AHPND này chủ yếu

mới chỉ được căn cứ vào dấu hiệu hình thái bệnh, phần lớn chưa được kiểm

chứng bằng phương pháp mô học đặc trưng. Do vậy, diện tích tôm nuôi ở

nước ta bị AHPND có thể sẽ ít hơn (46.093 ha) số liệu đã được báo cáo.

Hội chứng hoại tử gan tụy cấp (AHPND) xảy ra ở cả tôm sú và tôm thẻ

chân trắng, chủ yếu ở các vùng nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh ở giai

đoạn 15-45 ngày sau khi thả nuôi. Tôm bệnh có biểu hiện ngừng ăn, bơi

chậm, vỏ mỏng, màu tôm nhợt nhạt, gan tụy có biểu hiện sưng, nhũn, teo và

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 19

dịch bệnh xảy ra ở hầu hết các tháng trong năm.

1.4 Các nghiên cứu liên quan đến hiện tượng hoại tử gan tụy ở tôm nuôi

Các bệnh do vi khuẩn và vi rút gây ảnh hưởng đến gan tụy của tôm như

bệnh còi do MBV, bệnh gan tụy do HPV hay bệnh hoại tử gan tụy NHP và

gần đây nữa là dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp chưa rõ nguyên nhân. Ngoài ra

độc chất cũng làm ảnh hưởng đến hệ thống gan tụy trên tôm, đặc biệt là hiện

tượng hoại tử gan tụy.

1.4.1 Hoại tử gan tụy tôm do MBV và HPV

MBV và HPV ký sinh trong tổ chức mô gan tụy làm ảnh hưởng đến hệ

thống gan tụy, gây hội chứng chậm lớn mà không gây chết tôm hàng loạt.

Theo Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2004), tôm bị nhiễm MBV trong nhân gan tụy

thường có màu đen tối, kém ăn, còi cọc, chậm lớn. Tôm nhiễm bệnh sau 3-4

tháng nuôi vẫn có kích thước rất nhỏ còn gọi là “tôm kim”. Cũng theo tác giả

này, HPV kí sinh trong nhân tế bào gan tụy làm cho gan tụy teo và có màu

trắng nhạt, tôm nhiễm bệnh sinh trưởng chậm, kém ăn và tăng sinh vật cơ hội

bám trên mang và cơ thể tôm.

1.4.2 Hoại tử gan tụy tôm do vi khuẩn ký sinh nội bào (Necrotizing

Hepatopancreatitic, NHP)

NHP là bệnh nhiễm khuẩn cấp tính trên họ tôm he gây chết đến 95%,

đã gây chết tôm hàng loạt ở nhiều nước như Mỹ, Peru, Ecuador, Colombia,

Brazil, Panama và Mexico (Loy và cộng sự, 1996; Aranguren và cộng sự,

2006; del Rio-Rodriguez và cộng sự, 2006; Ibarra-Gamez và cộng sự, 2007).

Dấu hiệu trên tôm bệnh như giảm ăn, mềm vỏ, thịt mềm nhũn, mang đen sậm

màu và gan tụy bị teo (Lightner, 1996).

Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn thuộc lớp alpha-proteobacteria, gram

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 20

âm, ký sinh nội bào bắt buộc thuộc nhóm Rickettsia. Vi khuẩn gây bệnh có 2

hình thái khác nhau: dạng trực khuẩn (0,25 x 0,9 µm) và dạng sợi xoắn (0,25

x 2-3,5 µm) (Frelier và cộng sự, 1992; Lightner và cộng sự, 1992).

1.4.3 Hoại tử gan tụy do vi bào tử trùng

Vi bào tử trùng Microsporidia là ký sinh trùng nội bào bắt buộc lây

nhiễm trên nhiều ký chủ khác nhau. Có rất nhiều Microsporidia được cho

là lây nhiễm trên giáp xác bao gồm Agmasoma, Amecon, Nosema,

Pleistophora, Tuzetia, Thelohania, Flabelliforma, Glugoides, Ordospora,

Nadelspora và Enterospora (Lightner, 1996; Refardt và cộng sự., 2002;

Amogan và cộng sự, 2006).

Vi bào tử trùng Enterocytozoan hepatopenaei ký sinh trong tế bào của

mô gan tụy được báo cáo có liên quan đến bệnh tôm sú ở Việt Nam (Nguyễn

Thị Hà và cộng sự, 2011) và tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan (Flegel, 2012).

Theo Flegel (2012), nhu cầu năng lượng cung cấp cho sự phát triển của vi bào

tử trùng trong gan tụy làm tôm chậm lớn và dẫn đến tình trạng nhiễm vi

khuẩn thứ cấp, đặc biệt khi tôm bị sốc do môi trường nuôi không thuận lợi.

1.4.4 Hoại tử gan tụy do độc chất

Điều kiện môi trường có tác động đến sức khỏe tôm một cách trực tiếp

hoặc gián tiếp. Trong nuôi tôm, cùng với các yếu tố gây ô nhiễm môi trường

không tránh khỏi do các hoạt động sinh hoạt và sản xuất của con người tạo ra,

các yếu tố kỹ thuật như xử lý, cải tạo trước khi nuôi, chăm sóc sức khỏe cho

tôm trong quá trình nuôi cũng góp phần vào việc đưa vào ao nuôi các yếu tố

bất lợi.

Vấn đề tồn lưu và thời gian phân hủy của các độc tố và các chất gây ô

nhiễm môi trường cần được quan tâm trong nuôi trồng thủy sản nói chung và

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 21

đặc biệt quan trọng trong mô hình nuôi thâm canh và bán thâm canh. Hiện tại

việc sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật được gọi là thuốc diệt giáp xác trong

xử lý ao nuôi tôm là phổ biến.

Trong số các loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV), nhóm pyrethroid có

cấu trúc hóa học giống với pyrethrins, hợp chất diệt côn trùng tự nhiên có

nguồn gốc từ những cây thuộc họ cúc. Perythrins là các hợp chất không bền

trong môi trường, không tồn tại đủ lâu để tiêu diệt côn trùng nhưng các hợp

chất pyrethroid tổng hợp có tính bền hơn, tồn tại trong nhiều ngày hoặc trong

nhiều tuần đủ để tiêu diệt côn trùng (Brown, 2006; Cox, 1996).

Cypermethrin nằm trong nhóm perythroid tổng hợp, giống với các hợp

chất pyrethroid khác, tiêu diệt côn trùng bằng cách phá vỡ chức năng bình

thường của hệ thần kinh. Ở côn trùng cũng như các động vật khác, xung thần

kinh di chuyển dọc theo dây thần kinh khi dây thần kinh thẩm thấu với các

nguyên tử natri cho natri chạy dọc dây thần kinh. Các hợp chất pyrethroid làm

chậm quá trình đóng cửa kênh natri. Kết quả là có nhiều xung thần kinh thay

vì thông thường chỉ có một xung thần kinh được kích thích. Các xung thần

kinh này khiến cho dây thần kinh phóng thích chất dẫn truyền thần kinh

acetylcholine và kích thích các dây thần kinh khác, từ đó dẫn đến chấn động

và cuối cùng là chết (Brown, 2006; Cox, 1996).

Nghiên cứu của Cox (1996) cũng chỉ ra rằng các thuốc trừ sâu

pyrethroid bị phá vỡ bởi các enzyme gọi là esterase. Tuy nhiên các enzyme

này lại bị ức chế bởi các thuốc trừ sâu nhóm Organophosphate. Vì vậy, nếu

hai loại thuốc trừ sâu này cùng có mặt một lúc, chúng có tính hỗ trợ nhau và

độc tính sẽ trở nên lớn hơn độc tính của từng loại thuốc trừ sâu riêng lẻ.

Đối với động vật thủy sản, cụ thể là giáp xác, Cypermethrin đã được

chứng minh là chất cực độc đối với tôm sú thông qua các thí nghiệm của

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 22

Flegel và cộng sự, (1992). Các triệu chứng ghi nhận được gồm tôm hoạt động

không ngừng, xoay vòng không định hướng, bơi gần mặt nước rồi chìm

xuống đáy, thân co cứng và chết (Flegel và cộng sự, 1992).

Trong báo cáo “Kết quả nghiên cứu xác định nguyên nhân và đề xuất

các biện pháp khắc phục trong chương trình khẩn cấp phòng chống dịch bệnh

trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long” tại hội

nghị giao ban phòng chống dịch bệnh tôm tại Bạc Liêu đã khẳng định

Cypermethrin là một trong những nguyên nhân gây ra hội chứng gan tụy

(Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2, 2011).

1.4.5 Bệnh hoại tử gan tụy cấp

Trước tình hình diễn biến dịch bệnh phức tạp và chưa xác định rõ

nguyên nhân, định nghĩa về bệnh đã được xây dựng và ở Việt Nam định nghĩa

này đã chính thức được ban hành bởi Cục Thú y làm cơ sở cho việc xác định

chính xác bệnh và phân biệt với các hiện tượng bệnh ảnh hưởng đến gan tụy

khác (Cuc Thú y, 2012).

Định nghĩa hội chứng hoại tử gan tụy cấp (AHPND) bao gồm các tiêu

chí như sau:

- Hội chứng gan tụy cấp gây chết tôm sú và tôm thẻ chân trắng ở giai

đoạn 15-45 ngày tuổi sau khi thả nuôi.

- Tôm bệnh biểu hiện các dấu hiệu như ngừng ăn, bơi chậm, vỏ mỏng,

màu tôm nhợt nhạt, và gan tụy có biểu hiện sưng, nhũn, teo.

- Dựa trên biến đổi cấu trúc mô học, các tiêu chí để xác định AHPND:

1) Thoái hóa cấp gan tụy; 2) Thiếu hoạt động phân bào đẳng nhiễm của tế bào

có nguồn gốc từ mô phôi (tế bào E, Embryonalzellen); 3) Rối loạn chức năng

các tế bào trung tâm tổ chức gan tụy: tế bào tiết B (Basenzellen), tế bào xơ F

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 23

(Fibrillenzellen), tế bào dự trữ R (Restzellen); 4) Các tế bào gan tụy có nhân

lớn bất thường và sự bong tróc tế bào; 5) Giai đoạn cuối các tế bào máu tập

hợp giữa các ống gan tụy và nhiễm khuẩn

Hình 1.9: Dấu hiệu nhận biết AHPND theo phương pháp mô bệnh học

(Cục Thú y, 2012)

Để xác định được nguyên nhân, tác nhân gây AHPND, nhiều xét nghiệm

và thử nghiệm đã được tiến hành. Trước thực tế dịch bệnh đã xảy ra ở nhiều

quốc gia khu vực Đông Nam Á, một giả thuyết rằng một tác nhân truyền nhiễm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 24

hay ít nhất một tác nhân sinh học đã gây ra AHPND. Tuy nhiên, thí nghiệm

gây nhiễm thực nghiệm trong phòng thí nghiệm với dịch lọc của tôm nhiễm

bệnh đã không xác định được tác nhân vi rút, hay tác nhân truyền nhiễm khác

hay độc tố. Phân tích mô học cho thấy tôm bị AHPND có thể gây ra bởi độc tố

(Lightner và cộng sự, 2012). Độc tố có thể từ môi trường nước, thức ăn hoặc từ

vi khuẩn. Mặc dù vậy, phân tích thức ăn dùng cho tôm và thuốc diệt giáp xác

bao gồm Cypermethrin đã không thể hiện các dấu hiệu đặc trưng của AHPND.

Bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR) cũng có nhận định ban đầu

một số tác nhân vi rút thường gặp như WSSV, YHV, IMNV và TSV không

phải là tác nhân gây AHPND. Bên cạnh đó, theo kết quả phân tích mẫu tôm

bệnh được thực hiện bởi Cơ quan Thú y vùng VI cho thấy sự hiện diện của

WSSV (30% mẫu thu ở Tiền Giang), IHHNV (30-40% mẫu thu ở Bến Tre và

Tiền Giang), không phát hiện thấy sự có mặt của WSSV, YHV và TSV.Kết

quả xét nghiệm của trường Đại học Cần Thơ trên mẫu tôm thu tại Kiên Giang

cho thấy có dấu hiệu nhiễm NHP đồng thời có sự xuất hiện của IMNV và

TSV. Kết quả phân tích của Viện NCNTTS 2 trên mẫu tôm thu tại Sóc Trăng,

Bạc Liêu cho thấy tỷ lệ nhiễm WSSV và YHV không quá 15%, MBV xuất

hiện với tỷ lệ 20-30%, IHHNV khoảng 30%. Những kết quả phân tích này

cho thấy tác nhân gây bệnh không phải là những vi rút gây bệnh tôm đã từng

được công bố như WSSV, YHV, TSV, IHHNS, MBV, HPV và IMNV.

Kết quả kiểm tra sự hiện diện của vi bào tử trùng bằng 04 quy trình

phản ứng PCR dựa trên các cặp mồi được công bố bởi OIE và các bài báo

quốc tế đều cho kết quả âm tính. Đồng thời, kiểm tra sự hiện diện của NHP

bằng phương pháp PCR cũng cho kết quả âm tính.

Ngoài ra, cũng có một vài nghiên cứu trước có liên quan đến bệnh gan tụy

trên tôm như nghiên cứu bệnh phân trắng, teo gan trên tôm sú nuôi thương phẩm

tại Ninh Thuận (Nguyễn Khắc Lâm, 2004; Nguyễn Khắc Lâm và Đỗ Thị Hòa,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 25

2007). Trong những nghiên cứu này cũng ghi nhận các biến đổi trên gan tụy tôm

như teo hoặc nhũn. Tác nhân gây bệnh được xác định có liên quan đến HPV,

nguyên sinh động vật (Gregarin) và vi khuẩn thuộc giống Vibrio. Nghiên cứu

của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2008) về bệnh phân trắng ở tôm cũng có

nhắc đến dấu hiệu “teo gan” trên tôm nuôi ở Đồng bằng song Cửu Long. Thực tế

là các nghiên cứu đều chưa chỉ ra được tác nhân cụ thể.

Tuy nhiên theo đề tài nghiên cứu xác định nguyên nhân bệnh hoại tử

trên tôm tại phía Bắc của Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, (2012),

phát hiện nhiều vi khuẩn ở tôm bị hội chứng hoại tử gan tụy ở tất cả các vùng

nuôi tôm, trong đó vi khuẩn Vibrio chiếm thành phần chủ yếu và phổ biến

nhất là các loài V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus.

Nghiên cứu khả năng lây nhiễm hội chứng hoại tử gan tuỵ ở tôm,

một loạt các thực nghiệm cảm nhiễm bệnh đã được tiến hành. Tôm giống

khoẻ được thí nghiệm lây nhiễm thông qua nuôi chung với tôm bệnh, cho

ăn thức ăn có trộn gan tuỵ thu từ tôm bệnh, ngâm tôm trong môi trường có

gan tuỵ thu từ tôm bệnh, tiêm dịch chiết gan tuỵ tôm bệnh. Các thực

nghiệm đã được tiến hành ở các nồng độ gây nhiễm khác nhau, thời gian

khác nhau. Kết quả cho thấy, có hiện tượng lây nhiễm xảy ra ở tôm thí

nghiệm, tuy nhiên mức độ lây nhiễm không cao, dường như mức độ lây

nhiễm phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Tôm bị hội chứng hoại tử gan

tụy khi được chuyển tới môi trường nước sạch đã giảm tỷ lệ chết, có khả

năng phục hồi.

Tháng 5 năm 2013, nhóm nghiên cứu do Giáo sư Donald Lightner

thuộc Đại học Arizona (Mỹ) đứng đầu xác định một dòng vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus, khi bị nhiễm virus được gọi là thực khuẩn thể (Phase) sẽ

tạo ra độc tố cực mạnh, tương tự hiện tượng bệnh dịch tả ở người, là tác nhân

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 26

gây bệnh hoại tử gan tuy cấp (AHNPD).

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tôm sú và Tôm thẻ chân trắng

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND

- Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực

- Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Thực hiện từ ngày 4/2013 đến tháng 4/2014

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu mẫu: Nghệ An và Nam Định

- Địa điểm phân tích mẫu bệnh: Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh

báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Bắc – Viện

nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.

2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định AHPND

- Dấu hiệu lâm sàng (Cục Thú y, 2012):

o Hội chứng gan tụy cấp gây chết tôm sú và tôm thẻ chân trắng ở

giai đoạn 15-45 ngày tuổi sau khi thả nuôi.

o Tôm bệnh biểu hiện các dấu hiệu như ngừng ăn, bơi chậm, vỏ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 27

mỏng, màu tôm nhợt nhạt, và gan tụy có biểu hiện sưng, nhũn, teo.

- Kỹ thuật mô bệnh học (Lightner, 1996)

Các bước trình tự theo sơ đồ sau:

Lấy mẫu: Cố định bằng dung dịch Davison (12-72h) Chuyển sang cồn 700C để bảo quản

Xử lý mẫu Cắt mẫu 0,2-0,5cm cho vào trong cassette Xử lý bằng máy xử lý mẫu tự động

Đúc và cắt mẫu Đúc mẫu: Đổ parafin và tạo khuôn Cắt mẫu: máy cắt microtom

Nhuộm màu Hematocyline-Mayer và Eosin.

Đọc kết quả

Quan sát kính hiển vi

Bước1: Lấy mẫu

+ Đối với tôm Post

Ngâm toàn bộ con tôm trực tiếp trong dung dịch cố định với tỉ lệ

mẫu/dung dịch cố định là 1/10 trong vòng 12-24h.

+ Đối với tôm lớn hơn

Dùng kéo cắt và tách lớp vỏ giáp ở phần đầu ngực để có thể lấy được

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 28

các nội quan. Với những cơ quan có kích thước nhỏ chỉ cần dùng kéo và panh

tách ra rồi bỏ vào chai đựng dung dịch cố định Davidson, với những cơ quan

có kích thước lớn, dùng xilanh tiêm dung dịch cố định vào mô của cơ quan đó

rồi mới bỏ vào dung dịch cố định Davidson. Để dung dịch cố định ngấm tốt

vào các tổ chức mô nên dùng tỉ lệ giữa thể tích tôm và dung dịch cố định là

1/10. Giữ mẫu trong dung dịch cố định 12-72h.

Tất cả các mẫu thu đều phải được ghi nhãn về thông tin mẫu đầy đủ,

sau giữ trong dung dịch cố định 12-72h (tùy mẫu) sẽ được chuyển sang dung

dịch cồn 70 độ để bảo quản.

Bước 2: Xử lý mẫu:

+ Chuẩn bị mẫu để xử lý: Dùng panh gắp mẫu ra khỏi lọ đựng dung

dịch bảo quản mẫu, sau đó lấy dao sắc cắt mẫu thành những miếng có kích

thước từ 0,2 – 0,5cm cho vào trong cassette.

+ Qui trình xử lý mẫu: xử lý bằng máy xử lý mẫu tự động (xếp cassette

có chứa mẫu vào giỏ đựng mẫu và cho vào máy xử lý tự động).

Bước 3: Đúc và cắt mẫu:

+ Đúc mẫu: Sử dụng máy để đổ parafin đã nóng chảy vào khuôn đã

có mẫu, sau đó đặt khuôn lên dàn lạnh, sau ít phút có thể tạo ra các khuôn

có chứa mẫu. Dùng dao gọt và cắt mẫu thành các khối hình thang cân hoặc

hình chữ nhật.

+ Cắt mẫu: Gắn cassette có mẫu đã được gọt vào máy cắt microtom, cắt lát có độ dày 5µm. Đưa lát cắt vào nước ẩm (40-50oC) (có thể bỏ thêm lòng

trắng trứng gà) khoảng 1-2 phút để lát cắt giãn, không bị nhăn. Dùng lam sạch để lấy lát cắt ra khỏi nước, đặt lên máy sấy ở nhiệt độ 45-60oC trong 1-4h

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 29

Bước 4: Nhuộm màu

Mẫu sau khi sấy sẽ được xếp vào trong các giỏ nhuộm và mang nhuộm

màu. Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm màu truyền thống bằng thuốc

nhuộm Hematocyline-Mayer và Eosin.

Bước 5: Đọc kết quả:

Dựa vào các dấu hiệu sau để xác định AHPND (Cục Thú y, 2012)

o Thoái hóa cấp gan tụy; o Thiếu hoạt động phân bào đẳng nhiễm của tế bào có nguồn gốc

từ mô phôi (tế bào E, Embryonalzellen);

o Rối loạn chức năng các tế bào trung tâm tổ chức gan tụy: tế bào

tiết B (Basenzellen), tế bào xơ F (Fibrillenzellen), tế bào dự trữ R

(Restzellen);

o Các tế bào gan tụy có nhân lớn bất thường và sự bong tróc tế bào. o Ở giai đoạn cuối các tế bào máu tập hợp giữa các ống gan tụy và

nhiễm khuẩn

2.3.2 Phân lập và định danh vi khuẩn (Frerichs và Millar (1983, 1993))

Tóm tắt các bước như sau:

Kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc Nuôi cấy trên môi trường cơ bản (Nu+) Kiểm tra hình thái khuẩn lạc (sau 24h)

Nuôi cấy vi khuẩn thuần chủng Cấy chuyển sang môi trường TCBS

Nhuộm vi khuẩn thuần chủng: Nhuộm Gram Soi kính 10-40-100

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 30

Thử phản ứng sinh hóa Bằng bộ Kit API 20E

Bước 1: Kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc: Sau khi lấy mẫu bệnh

phẩm tôm bệnh, nuôi cấy trên môi trường cơ bản (Nutrient Agar), ở nhiệt độ 28 – 300C, sau 24 giờ kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc (kích thước

khuẩn lạc, hình thái khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc).

Bước 2: Nuôi cấy vi khuẩn thuần chủng: Sau khi kiểm tra đặc điểm,

hình thái khuẩn lạc, đánh dấu các khuẩn lạc rời mà mọc trên đường cấy, dùng

que cấy đã vô trùng lấy khuẩn lạc đã đánh dấu, cấy chuyển sang đĩa môi trường chọn lọc TCBS và để mẫu ở nhiệt độ 28 – 300C.

Bước 3: Nhuộm vi khuẩn thuần chủng: Lấy khuẩn lạc thuần chủng,

dàn mỏng trên lam với 1 giọt nước muối sinh lý 2%, hơ cao trên ngọn lửa

đèn cồn nhằm cố định vi khuẩn và tiến hành nhuôm gram và soi vi khuẩn

bằng kính hiển vi từ vật kính 10 - 40 - 100 để quan sát hình dạng và màu sắc

của vi khuẩn.

Bước 4: Thử các phản ứng sinh hóa bằng bộ Kit API 20E (BioMerieux,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 31

Pháp):

Bảng 2.1: Cách thực hiện và đọc các phản ứng sinh hóa

Đọc kết quả

Cách nhỏ dung dịch huyền phù vào

Tests

các giếng

Âm tính

Dương tính

ONPG Nhỏ lên tới miệng

Màu vàng

Không màu

Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu

Màu đỏ hay cam Vàng

ADH

parafin đã vô trùng.

Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu

Màu đỏ hay cam Vàng

LDC

parafin đã vô trùng.

Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu

Màu đỏ hay cam Vàng

ODC

parafin đã vô trùng.

Xanh bule hay

Vàng hay hơi

CIT

Nhỏ đầy

xanh

green

Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu

Đen hay có vẩn

Trắng

hoặc

H2S

đen đục

parafin đã vô trùng.

xám

Nhỏ lên tới miệng rồi phủ kín bằng dầu

Màu đỏ hay cam Vàng

URE

parafin đã vô trùng.

Nhỏ lên tới miệng. Khi đọc nhỏ 1 giọt

Nâu đỏ

Vàng

TDA

TDA rồi đọc kết quả ngay .

Nhỏ lên tới miệng. Khi đọc nhỏ 1 giọt

IND

Trắng hay vàng Hồng

Jame rồi đọc kq ngay

Trắng hay hơi

Nhỏ đầy. Khi đọc nhỏ 1 giọt VP1 và 1

Hồng hay đỏ

giọt VP2 đọc kết quả sau 10 phút

hồng

Có sự khuếch

Không có sự

GEL

Nhỏ đầy

tán màu đen

khuếch tán

Vàng hay hơi

GLU

Nhỏ lên tới miệng.

Xanh

xám vàng

MAN

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

INO

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

SOR

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

RHA

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 32

SAC

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

MEL

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

AMY

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

ARA

Nhỏ lên tới miệng

Vàng

Xanh

Cấy vk vào 2 ống nghiệm chứa mt OF,

O/F

một trong 2 ống phủ kín bằng lớp dầu

Vàng

Xanh

parafin

Không

Bôi vk lên miếng giấy lọc đã tẩm thuốc

đổi

Màu xanh tím

Oxidase

thử . Đọc kq sau 10-30s.

màu

Có bọt khí sủi

Không có bọt

Catalase

Lấy vk lên lam rồi nhỏ 1-2 giọt H2O2 30% lên .

lên

khí

2.3.3 Xác định độc lực của vi khuẩn:

- Thí nghiệm đợt 1 (TN1):

108

12h

24h

12h

(3)

(2)

(3)

(1)

(3)

(1)

(2)

(1)

(2)

107

12h

24h

12h

(3)

(2)

(3)

(1)

(3)

(1)

(2)

(1)

(2)

106

12h

24h

12h

(3)

(2)

(3)

(1)

(3)

(1)

(2)

(1)

(2)

Đối

chứng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 33

Bố trí thí nghiệm 1:

- Tôm thí nghiệm: Tôm thẻ chân trắng khỏe Post 21

- Loài vi khuẩn gây nhiễm: V. paraheamolyticus (13.014)

- Dùng phương pháp ngâm vi khuẩn cho tôm khỏe ở 3 mức nồng độ vi khuẩn khác nhau: 106, 107, 108 (cfu/ml) và 1 nghiệm thức đối chứng ngâm

dung dịch nutrient broth; ở 3 mức thời gian khác nhau: 6h, 12h, 24h.

- Tôm được ngâm ở thùng nhựa 10 lít (8 lít nước) và được nuôi thí

nghiệm trong thùng nhựa thể tích 50 lít (40 lít nước)

- Độ mặn nước nuôi: 29‰;

- Độ oxy hòa tan: 7,4 ppm

- PH = 8,1

- Nhiệt độ: 26-30oC

Thí nghiệm đợt 2 (TN2):

106 6h (3)

105 6h (3)

104 6h (3)

106 1h (2) 105 1h (2) 104 1h (2)

106 1h (3) 105 1h (3) 104 1h (3)

106 3h (1) 105 3h (1) 104 3h (1)

106 1h (1) 105 1h (1) 104 1h (1)

106 3h (2) 105 3h (2) 104 3h (2)

106 3h (3) 105 3h (3) 104 3h (3)

106 6h (1) 105 6h (1) 104 6h (1)

106 6h (2) 105 6h (2) 104 6h (2)

Đối

chứng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 34

Bố trí thí nghiệm 2:

- Tôm thí nghiệm: Tôm thẻ chân trắng khỏe Post 24

- Loài vi khuẩn gây nhiễm: V. paraheamolyticus (13.014)

- Dùng phương pháp ngâm vi khuẩn cho tôm khỏe ở 3 mức nồng độ vi khuẩn khác nhau: 104, 105, 106 (cfu/ml) và 1 nghiệm thức đối chứng ngâm

dung dịch nutrient broth; ở 3 mức thời gian khác nhau: 1h, 3h, 6h.

- Tôm được ngâm ở thùng nhựa 10 lít (8 lít nước) và được nuôi thí

nghiệm trong thùng nhựa thể tích 50 lít (40 lít nước);

- Số lượng tôm thí nghiệm/công thức: 50 con

- Độ mặn nước nuôi: 29‰;

- Độ oxy hòa tan: 7,4 ppm

- PH = 8,1

- Nhiệt độ: 26-30oC

Thí nghiệm 3 (TN3):

- Tiến hành trên tôm thẻ chân trắng 40 ngày tuổi

- Số lượng tôm thí nghiệm/công thức: 5 con/8 lít nước

- Vi khuẩn gây nhiễm V. paraheamolyticus 12.020 nồng độ 5. 107, là vi

khuẩn được phân trong năm 2012 tại Hải phòng từ ao nuôi tôm được khẳng

định chắc chắn là phân lập từ tôm bị AHPND theo phương pháp mô bệnh học.

- Tiến hành ngâm trực tiếp vi khuẩn vào bể nuôi ở 3 hỗn hợp khác nhau

(1) Vi khuẩn+nước muối sinh lý; (2) vi khuẩn + dịch nuôi cấy; (3) Dịch nuôi

cấy vi khuẩn và 1 nghiệm thức đối chứng ngâm dung dịch nutrient broth ở các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 35

điều kiện nhiệt độ, độ oxy hòa tan, Ph, độ mặn tương tự thí nghiệm 1 và 2.

Hình 2.1: Bố trí thí nghiệm

2.3.4 Thử kháng sinh đồ (Kibry-Bauer)

Tiến hành thử kháng sinh đồ với 08 loại kháng sinh, đó là: Do

(Doxycyline, 30 µg); Rf (Rifampin, 5 µg); Te (Tetracylin, 30 µg); Ery

(Erythromycin, 15 µg); Sm (Streptomycin, 10 µg); Nv (Novobiocin, 5 µg);

Am (Ampicilin, 10 µg); Ox (Oxacillin, 1 µg).

Các bước cụ thể như sau:

Bước 1: Lấy vi khuẩn Vibrio thuần cho vào dung dịch nước muối 2%

để tạo dung dung dịch huyền phù 109CFU/ml

Bước 2: Lấy 100 ml dung dịch vi khuẩn này trên trang đều trên đĩa

thạch MH+(Mueller Hinton) trong vòng 1 phút

Bước 3: Đặt các tấm kháng sinh vào đĩa thạch nói trên cho vào tủ ấm,

sau 24h đo vòng kháng khuẩn và kiểm tra lại sau 48h.

2.4 Phương pháp xử lí số liệu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 36

Số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND

- Tôm thu tại Nghệ An (2 đợt), và Nam Định (1 đợt) được xác định có

dấu hiệu lâm sàng và biểu hiện AHPND theo như “Hướng dẫn về dấu hiệu

nhân biết hội chứng hoại tử gan tụy cấp” của Cục Thú y, 2012.

Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn

Thời gian

Địa

điểm

Số

lượng

Xác định vi khuẩn

thu mẫu

mẫu

thu mẫu

47,1% mẫu tôm nhiễm Vibrio, gồm:

V.parahaemolyticus

04/2013

Nam Định

17 mẫu

V. alginolyticus

V.cholerae

V. harveyi

42% mẫu tôm nhiễm Vibrio, cụ thể:

V.vulnificus

05/2013

Nghệ An

45 mẫu

V.cholerae

V. V.ordalii

Tỷ lệ phân lập các loài vi khuẩn Vibrio ở Nghệ An được thể hiện ở

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 37

hình 3.1 và Nam Định ở hình 3.2:

Hình 3.1: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nghệ An

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 38

Hình 3.2: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nam Định

Vi khuẩn V.vulnificus Vi khuẩn V.parahaemolyticus

Hình 3.3: Hình ảnh soi vi khuẩn trên kính hiển vi

Bảng 3.2 Kết quả phân tích mẫu theo phương pháp mô

Số lượng mẫu

Thời gian thu mẫu Địa điểm thu mẫu

AHPND (+)

04/2013

Nam Định

0/22 (0%)

05/2013

Nghệ An

28/47 (59,6%)

Dựa vào dấu hiệu bệnh lý và phương pháp phương pháp mô bệnh học

(Bảng 3.2) cho thấy mẫu tôm thu tại Nghệ An là chết do AHPND, ngược lại mẫu

tôm thu được ở Nam Định là âm tính. Tuy nhiên, kết quả phân lập tôm tại Nam

Định lại có phát hiện thấy vi khuẩn V. parahaemolyticus. Lightner và cộng sự

(2013) đã xác định một chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus là tác nhân gây

ra AHPND. Là một phần của đề tài: “Nghiên cứu nguyên nhân, tác nhân gây

hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng và biện pháp

khắc phục” do viện NTTS 1 chủ trì, chúng tôi quyết định sẽ tiến hành gây

Page 39

nhiễm vi khuẩn này để xác định rõ độc lực của vi khuẩn V. parahaemolyticus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

đã phân lập được. Mặt khác, chúng tôi thực hiện thí nghiệm trên V.

parahaemolyticus đã phân lập được cũng để so sánh với thí nghiệm 3, thí

nghiệm mà chúng tôi sẽ thực hiện sau đó đối với chủng vi khuẩn đã được phân

lập ở Hải phòng năm 2012 (chủng vi khuẩn đã được xác định là tác nhân gây

bệnh theo phương pháp mô bệnh học).

3.2 Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực

Trong thời gian thực hiện đề tài chúng tôi đã tiến hành tổng cộng 3 thí

nghiệm gây nhiễm vi khuẩn: 02 thí nghiệm đối với loài vi khuẩn V.

paraheamolyticus thu được tại Nam Định ký hiệu là V. paraheamolyticus 13-

041; và 01 thí nghiệm đối với chủng V. paraheamolyticus thu được từ Hải phòng

năm 2012 ký hiệu là V. paraheamolyticus 12-020.

* Kết quả thí nghiệm 1: - CTVK 108: Tỷ lệ chết 100% trong thời gian 14h - CTVK 107: Tỷ lệ chết 100% trong thời gian 24h - CTVK 106: bắt đầu chết sau 13h, và chết rải rác vào những ngày tiếp

theo cho đến khi thu mẫu định kỳ 21 ngày (tỷ lệ chết trung bình 83%).

- Tỷ lệ tái phân lập lại vi khuẩn 0% (0/17 mẫu).

- Tỷ lệ mẫu được xác định là hoại tử gan tụy cấp theo phương pháp mô

bệnh học là: 0% (0/45 mẫu).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 40

Số liệu chi tiết được thể hiện ở bảng 3.3:

Bảng 3.3: Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 1

Vi khuẩn

Công thức TN

Loại mẫu

Số mẫu (+)

Tái phân lập VK

Số lượng mẫu 17

Xác định ANHPD theo PP Mô học Số lượng mẫu 18

ĐC

CTVK106-06

Định kỳ 7 ngày

CTVK106-12

CTVK106-24

0

30

0

30 Tổng

ĐC

CTVK106-06

Định kỳ 14

CTVK106-12

ngày

CTVK106-24

0

27

0

29 Tổng

ĐC

Định kỳ 21

CTVK106-06

ngày

0

18

0

12 Tổng

0

75

0

71 Tổng cộng

Theo bảng 3.3 thì không có mẫu nào dương tính với AHPND trong số

75 mẫu xét nghiệm bằng phương pháp mô bệnh học. Tuy nhiên, chúng tôi

nghi ngờ có thể do tôm chết do bị sốc do nồng độ vi khuẩn quá cao. Vì vậy,

để khẳng định rõ tác nhân gây bệnh, chúng tôi tiếp tục tiến hành lặp lại thí nghiệm 1 bằng thí nghiệm 2 nhưng ở các nồng độ thấp hơn (104, 105, 106

(cfu/ml)) và thời gian ngâm vi khuẩn là ngắn hơn (1h, 3h, 6h).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 41

* Kết quả thí nhiệm 2:

- Tỷ lệ chết trung bình ở nồng độ 106 là 71% - Tỷ lệ chết trung bình ở nồng độ 105 là 21% - Tỷ lệ chết trung bình ở nồng độ 104 là 9%.

- Tỷ lệ tái phân lập lại vi khuẩn 0%.

- Tỷ lệ mẫu được xác định là hoại tử gan tụy cấp theo phương pháp mô

bệnh học là: 0%

Số liệu chi tiết được thể hiện ở bảng 3.4:

Bảng 3.4: Kết quả tái phân lập vi khuẩn và phân tích mô học thí nghiệm 2

Xác định ANHPD

Vi khuẩn

theo PP Mô học

Công thức TN

Số

Tái phân

Số

Số mẫu

Loại mẫu

lượng

lập VK lây

lượng

(+)

mẫu

nhiễm

mẫu

ĐC

CTVK106

Định kỳ 7 ngày

CTVK105 CTVK104

0

30

0

35 Tổng

ĐC

0

CTVK106

0

Định kỳ 14

CTVK105

0

ngày

CTVK104

0

62

0

36 Tổng

ĐC

0

CTVK106

0

Định kỳ 21

CTVK105

0

ngày

CTVK104

0

36

147 Tổng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 42

107

0

239

0 Tổng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 43

Kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn V. paraheamolyticus 13-041 trên tôm

thẻ ở thí nghiệm trên cho thấy mặc dầu tỉ lệ tôm chết vẫn giữ ở mức tương đối

cao so với thí nghiệm 1, nhưng theo kết quả mô bệnh học (0/239 dương tính),

vì vậy có thể khẳng định được vi khuẩn V. paraheamolyticus 13-041 không

liên quan tới AHPND.

Theo số liệu về báo cáo đề tài “Nghiên cứu xác định nguyên nhân gây

bệnh hoại tử gan tụy trên tôm tại các tỉnh phía Bắc năm 2012” do Viện

NTTS1 chủ trì, tỷ lệ tôm nhiễm V.parahaemolyticus là rất cao (chiếm 69,5%

trong tổng số vi khuẩn Vibrio phân lập được). Được sự đồng ý của đề tài,

chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3 gây nhiễm chủng V.parahaemolyticus ký

kiệu là V.parahaemolyticus (12.020) là vi khuẩn được phân lập trong năm

2012 tại Hải phòng từ ao nuôi tôm được khẳng định chắc chắn là phân lập từ

tôm bị AHNPD theo phương pháp mô bệnh học, để xác định có hay không vi

khuẩn này là tác nhân gây ra AHNPD. Chúng tôi tiến hành gây nhiễm vi

khuẩn này ở 3 nghiệm thức (1)Vi khuẩn + nước muối sinh lý; (2) Vi khuẩn +

dịch nuôi cấy; (3) Dịch nuôi cấy vi khuẩn) để bước đầu đánh giá về phase và

vấn đề sinh độc tố của vi khuẩn và 1 nghiệm thức đối chứng

* Kết quả thí nghiệm 3:

- Tỷ lệ chết ở tôm là 100% trong thời gian 32h

- Tiến hành thu mẫu phân lập vi khuẩn và xét nghiệm theo phương

pháp mô bệnh học chúng tôi thu được kết quả như sau:

Bảng 3.5: Kết quả tái phân lập vi khuẩn thí nghiệm 3

Kết quả tái phân lập vi

Công thức

Số lượng mẫu

Tỷ lệ

TN

khuẩn V.paraheamolyticus

100%

3 nghiệm thức (5.107)

Đối chứng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 44

Hình 3.4: Thử sinh hóa V. paraheamolyticus tái phân được

Bảng 3.6: Kết quả phân tích mô bệnh học thí nghiệm 3

Biến đổi mô học

Số lượng

Bong

Giảm

Công thức TN

AHPND

Hoại

mẫu

TB B,

Vi khuẩn

tróc tế

tử

(+)

bào

R, E

VK+ Nacl

3/8

8/8

2/8

8/8

VK+ dịch nuôi cấy

2/5

5/5

1/5

5/5

Dịch nuôi cấy

2/2

15 7/15

15/15

3/15

15/15

Tổng

Đối chứng

0/5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 45

Hình 3.5: Tổ chức mô của tôm bị AHPND (Mũi tên đen: Các tế bào máu tập hợp ở khoảng giữa ống gan tụy và nhiễm khuẩn)

Kết quả gây nhiễm vi khuẩn V.parahaemolyticus 12.020 trên tôm thẻ

chân trắng khỏe với các nghiệm thức khác nhau cho thấy rằng vi khuẩn này

có khả năng gây hoại tử gan tụy cấp. Đặc điểm mô bệnh học tôm mắc phải

AHPND theo định nghĩa của Lightner và cộng sự (2012) và hướng dẫn nhận

biết dấu AHPND (Cục Thú y, 2012) là cấu trúc mô gan tụy bị biến đổi, có

hiện tượng suy giảm tế bào B, F và R, các tế gan thoái hóa rơi vào lòng ống

và xuất hiện các cụm vi khuẩn trong vùng bị hoại tử (Hình 3.5). Trong nghiên

cứu của Nguyễn Trọng Nghĩa và cộng sự (2013) khi phân lập và xác định khả

năng gây hoại tử cuả vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên địa bàn tỉnh Bạc

Liêu cho thấy vi khuẩn này có khả năng gây hoại tử gan tụy cấp khi gây cảm nhiễm thực nghiệm trên tôm thẻ chân trắng ở nghiệm thực 105 cfu/g (sau 9 ngày và 106 cfu/g (sau 6 ngày) với dấu hiệu bệnh lý và mô bệnh học tương tự

thí nghiệm mà chúng tôi đã thực hiện.

3.3 Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được

Do chưa thể tiến hành thí nghiệm xác định độc lực với tất cả các loài

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 46

vibrio còn lại mà chúng tôi phân lập được trong thời gian tháng 4 và tháng 5

năm 2013. Vì vậy, ngoài việc thử kháng sinh đồ đối với vi khuẩn

V.paraheamolyticus (12.020) mà chúng tôi tái phân lập được, chúng tôi tiến

hành song song việc thử kháng sinh đồ đối với một số loài Vibrio mà chúng

tôi phân lập được từ thực địa trong thời gian này, đó là: V.vulnificus,

V.paraheamolyticus (13.014)

08 loại kháng sinh đã được thử nghiệm, đó là: Do (Doxycyline, 30 µg);

Rf (Rifampin, 5 µg); Te (Tetracylin, 30 µg); Ery (Erythromycin, 15 µg); Sm

(Streptomycin, 10 µg); Nv (Novobiocin, 5 µg); Am (Ampicilin, 10 µg); Ox

(Oxacillin, 1 µg).

Kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.7

Bảng 3.7: Tính nhạy, trung bình của một số loài vi khuẩn đối với một số loại kháng sinh

Vòng vô khuẩn (mm)

Kháng sinh

STT

V.para

Trung

(liều lương µg)

V.vunificus

(12.020)

(13.041)

bình

Doxycyline (30)

27,8±1,19

25,7±0,73

26,5±0,58

26,7

Rifampin (5)

26,7±0,86

24,1±0,54

25,3±0,7

25,4

Tetracylin (30)

21,6±0,56

17,6±0,45

21,5±0,68

20,2

Erythromycin (15)

15,7±0,74

20,9±0.34

14,6±0.92

17,1

Streptomycin (10)

16,2±0,49

10,8±0,32

17,4±0,89

14,8

Novobiocin (5)

15,2±0,45

14,5±0,62

14,9±0,47

14,9

Ampicilin (10)

Oxacillin (1)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 47

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 48

21,6 mm 27,8 mm

17,6 mm

26,5 mm

Hình 3.6: Kháng sinh đồ V.paraheamolyticus (12.020)

Hình 3.7: Kháng sinh đồ V. vulnificus và V.paraheamolyticus (13.014)

Qua bảng 3.7, chúng ta có thể thấy rằng Doxycylin và Rifampin là hai

loại kháng sinh có vòng vô khuẩn rộng cho cả ba loại vi khuẩn, với con số

trung bình tương ứng là (26,7 và 25,4 mm). Hơn nữa, 2 loại kháng sinh này

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 49

cũng cho vòng vô khuẩn cao nhất đối với loại V. paraheamolyticus (12.020)

được xác định là một trong những nguyên nhân gây AHPND. Tiếp theo, hai

loại kháng sinh khác có vòng kháng khuẩn trung bình 20,2 và 17,1 mm đối

với 3 loại vi khuẩn trên đó là Tetracylin và Erythromycin. Tuy nhiên,

Tetracylin cho vòng kháng khuẩn (21,6) đối với vi khuẩn V.

paraheamolyticus (12.020) rộng hơn đáng kể (5,9 mm) so với Erythromycin

(15,7). Đáng chú ý là các loại vi khuẩn trên có tính kháng hoàn toàn với 2

loại kháng sinh Ampicillin và Oxacilin. Tính diệt vi khuẩn của các loài

thuốc kháng sinh kém hiệu quả, nguyên nhân do trong quá trình nuôi người

dân thường sử dụng thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh, thậm chí việc sử

dụng có tính lạm dụng cao (Phan Thị Vân và công sự, 2004). Cũng theo tác

giả này, năm 2003 có 5 loại thuốc kháng sinh được sử dụng chủ yếu tuy

nhiên đến năm 2011 con số này đã tắng lên đến 28 loại (Phạm Thị Yến và

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 50

cộng sự, 2011).

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

1. Kết luận

- Các loài Vibrio đã phân lập được từ mẫu tôm thực địa nghi nhiễm

AHPND: V. vulnificus, V.parahaemolyticus, V.cholerae, V. alginolyticus, V.

harveyi và V.ordalii.

- Không phải tất cả chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus đều có khả

năng gây hoại tử gan tụy cấp.

- Chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus (12.020) phân lập từ năm 2012

là tác nhân gây hoại tử gan tụy cấp.

- Hai loại kháng sinh có tính diệt các loại vi khuẩn trên cao đó là:

Doxycylin và Rifampin.

2. Đề xuất

- Tiếp tục nghiên cứu khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp của các

loài vi khuẩn Vibrio khác như là V.vulnificus, V.alginolyticus.

- Cần tiến hành song song thu mẫu tôm, mẫu nước và mẫu bùn đáy ao

để phân tích sự tương quan về tỷ lệ nhiễm và mật độ của Vibrio spp giữa các

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 51

yếu tố đầu vào so với tôm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Cục Thú y (2011). Báo cáo tổng kết dịch bệnh Thủy sản năm 2011.

Cục Thú y (2012). Dấu hiệu nhận biết hội chứng hoại tử gan tụy cấp.

Cục Thú y (2012). Báo cáo tổng kết dịch bệnh Thủy sản năm 2012.

Đỗ Thị Hoà và cộng sự (1994). ‘Nghiên cứu một số bệnh chủ yếu trên tôm sú (Penaeus monodon) ở khu vực miền Trung Việt Nam và đề ra biện pháp phòng trị thích hợp’, Tạp chí khoa học công nghệ Thủy sản, tập 3, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang

Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học

thủy sản. Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.

Lý Thị Thanh Loan (2003), Nghiên cứu một số vi khuẩn và virus gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon) nuôi thương phẩm ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận án tiến sỹ sinh học.

Nguyễn Khắc Lâm (2004), ‘Kết quả nghiên cứu bước đầu về bệnh “Phân trắng, teo gan” trên tôm sú nuôi thương phẩm tại Ninh Thuận’, Thông tin Khoa học-Công nghệ-Kinh tế thủy sản.

Nguyễn Khắc Lâm, Đỗ Thị Hòa (2007). Ảnh hưởng của tảo độc trong ao nuôi và hàm lượng Aflatoxin B1 trong thức ăn tới hội chứng teo gan ở tôm sú nuôi ở Bình Thuận, Tạp Chí Khoa học Công nghệ Thủy sản số 2, trang 25-29.

Nguyễn Quang Linh, 2010, Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học Bokashi trầu ứng dụng cho vùng nuôi tôm của vùng đầm phá Tam Giang, Cầu Hai, tỉnh Thừa Thiên Huế, Báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm độc lập cấp nhà nước, 31/12/2010

thành

Lâm

phố

Chí

Hồ

Nguyễn Trọng Nghĩa và cộng sự (2013), ‘Phân lập và xác định khả năng gây hoại tử gan tụy của vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus’, Khoa Thủy sản, Trường đại học Nông Minh, .

Đặng Thị Hoàng Oanh, Phạm Trần Nguyên Thảo và Nguyễn Thanh Phương (2008). ‘Đặc điểm mô bệnh học tôm sú (Penaeus monodon) có dấu hiệu bệnh phân trắng nuôi ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long’, Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ 1: 1850191.

Trần Thị Kiều Trang (2004), ‘Ứng dụng Ozone xử lý nước và vi khuẩn Vibrio spp trong

bể ương ấu trùng tôm sú (P. monodon)’,

Tổng cục thủy sản (2012), Tình hình nuôi tôm nước lợ năm 2012 và giải pháp thực hiện kế hoạch năm 2013, Báo cáo hội nghị tổng kết dịch bệnh tôm tại Bến Tre 12/12/2012.

Phan Thị Vân và cộng sự (2012), Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan tụy trên tôm tại phía Bắc, Báo cáo tổng kết nhiệm vụ, Viên Nghiên cứu nuôi tròng thủy sản

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 52

Tài liệu tiếng Việt

Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hà, Phạm Văn Khang Trương Thị Mỹ Hạnh (2004), Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phổ biến đối với cá Mú Cá giò nuôi và đề xuất các giải pháp phòng trị, Báo cáo định kỳ hàng năm, Viên Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.

Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2 (2011), Kết quả nguyên cứu xác định nguyên nhân và đề xuất các biện pháp khắc phục trong chương trình khẩn cấp phòng chống dịch bệnh trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long, Báo cáo hội nghị giao ban phòng chống dịch bệnh tại Bạc Liêu, ngày 13/11/2011.

Phạm Thị Yến, Trịnh Ngọc Tuấn, Nguyễn Thị Là, Đào Xuân Trường, Phạm Thái Giang (2011). Điều tra thực trạng sản xuất, cung cấp thức ăn, chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản và các giải pháp quảnlý. Báo cáo tổng kết, Viên nghiên cứu nuôi tròng thủy sản 1.

Tài liệu tiếng Anh

Ackermann H.W. Kasatiya S.S. Kawata T. Koga T. Lee J.V. Mbiguino A.Newman F.S. Vieu J.-F. Zachary A, ‘Classification of Vibrio Bacteriophages’, Taxonomy, Vol. 22, No. 2, 1984

Adam A (1991), ‘Detection of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus in penaeid shrimp using an amplitied enzyme – Linked imnuennosor bent assay’, Aquaculture, pp. 101 – 108

Anderson, I.G., Shamsudin, M.N., Shariff, M. and Nash, G. (1988) Bacterial septicaemia in juvenile tiger shrimp, Penaeus monodon, cultured in Malaysian brackishwater ponds. Asian Fisher Sci 2, 93–108.

Brown, A.E. (2006). Mode of Action of Structural Pest Control Chemicals. Pesticide

Information Leaflet.

Buller, B.N. (2004), Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals, A Practical identification manual, CABI International Wallingford Oxfordshire OX10 8DE, UK.

Chanratchakool P (1995), ‘While patch disease of black tiger shirmp (P. monodon)’, The

AAHRI newsletter, July, pp. 3-5.

Chen S. N., P. S. Chang., G. H. Kou and D. V. Lightner (1989), Studies on virogenesis and cytopathology of P. monodon Baculovirus (MBV) in the giant tiger prawn (P. monodon) and the red tail prawn (P. penicilatus), Fish pathology, pp. 89-10017.

Cox, C. (1996) Insecticide facsheet: Cypermethrin. Journal of Pesticide Reform 16 (2):

15-20.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 53

Daud H. M. (1992), Current fish disease and fish health manegement status in Malaysia, In tropical fish health manegement in aquaculture, J. S. Langdon, G. L. Enriquez and S. Sukimin (eds), Biotrop Special Pub. No. 48, SEAMEO BIOTROP, Indonesia, pp. 29-37

David J. W. Moriarty (1999), Disease control in shrimp Aquaculture with probiotic bacteria, www.ag.arizona.edu.com diagnostic and control of penaeid shrimp in North American, C. J. Sinderman, p. 22- 26

Eleonor A. Tendencia (2007), ‘Polyculture of green mussels, brown mussels and oysters with shrimp control luminous bacterial disease in a simulated culture system’,

Flegel, T. W (2012), ‘Historic emergency, impact and current status of shrimp pathogens in Asia’.

Journal of Invertebrate Pathology 110: 166-173

Flegel, T.W., Fegan, D.F., Kongsom, S., Vuthikomudomkit, S., Sriurairatana, S., Boonyaratpalin, S., Chantanachookhin, C., Vickers, J.C., and Macdonald, O.D. (1992). Occurrence, Diagnosis and treatment of shrimp diseases in ThaiLand in Diseases of cultured Penaeid shrimp in Asia and the United States: 57-112.

Frelier, P.F., Sis, R. F., Bell, T. A., Lewis, D. H. (1992). Microscopic and ultrastructural studies of necrotizing hepatopancreatitis in Pacific white shrimp (Penaeus vannamei) cultured in Texas. Vet Pathol 29: 269-27.

Ha, N.T., Ha, D.T., Thuy, N.T., Lien, V.T.K (2011), ‘Occurrence of microsporodia Enterocytozoon hepatopenaei in white feces disease of cultured black tiger shrimp (Penaeus monodon) in Vietnam’. Aquatic Animal Disease.

Jiravanichpaisal P., et al (1995), ‘Comparative histopathology of Vibriosis in black tiger

shirm (P. monodon)’, Disease in Asian aquaculture, vol. II, pp. 123 – 130.

Kou G.H., Peng S.E., Chou Y.L and Lo L.F. 1998, ‘Tissue distribution of White sport syndrome virus (WSSV) in shrimp and crap’, Advanced in shrimp Biotechnology, 1998, pp. 267-276.

Ligghtner, D.V, Redman, R.M., Pantoja, C.R., Noble, B.I., Tran, L. (2012). ‘Early mortality syndrome affects shrimp in Asia’, Global Aquaculture Advocate, January/February 2012:40.

Lightner D. V (1998), ‘Vibrio disease diagnosis and control in North America marine

aquaculture 2nd’, Elsevier, Amsterdam, pp. 42-47

Lightner D.V (1996), 'Vibriosis cultured and identification, In: A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for disease of cultured penaeid shrimp’, The World Aquaculture Society, Section 4/Bacteria/Vibriosis, pp. 26 - 28

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 54

Lightner, D.V (1996). A Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases fo Penaeid Shrimp. Tucson, AZ: Department of Veterinary Science, University of Arizona.

NACA (2012). ‘Asia pacific emergency regional consultation on the emerging shrimp disease: Early mortality syndrome (EMS)/Acute hepatopancreatic necrosis syndrome (AHPND)’, Final report.

Pitogo L.C.R (1995), ‘Bacterial disease of penaeid shrimp’, Disease in Asian Aquculture,

Fish health Section Asian Fisheries Society, Manila, pp.107 – 121

Pitogo L.C.R (1998), ‘Isolation and identification of luminous bacteria causing

mortalities in P. monodon hatcheries in Panay’, Asian aquaculture, No 1, pp. 11-13

Ruangpan, L. and. T. Kitao (1991), ‘Vibrio Bacteria isolated from back tiger shirmp (P.

monodon)’, Journal Fish Disease, vol. 14, pp. 383-388

Ruby E.G. and K.H Nealson (1978), Seasonal changes in the species composition of luminous bacteria in near shore seawater, Limnology Ocean Org. 23, pp. 530 – 533

S.K. Otta et al (2000), Bacteriological study of shrimp, Penaeus monodon Fabricius,

hatcheries in India

Stewart T. E, (1980), ‘Disease in the biology and management of Lobsteus’, J. Stanley

cobb and B. F. Philippine, pp. 301-342

Su-Tuen Yeh and Jiann-Chu Chen (2008), ‘Immunomodulation by carrageenans in the white shrimp Litopenaeus vannamei and its resistance against Vibrio alginolyticus’, www.elsevier.com

Venkateswara Rao, Neospark Drugs and Chemicals Pvt. Ltd (n.d), ‘Vibriosis in Shrimp

Aquaculture’,< www. neospark.com>

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 55