Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm giàu axit amin và B-Glucan từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng và năng lượng cho người

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM GIÀU AXIT AMIN VÀ

-GLUCAN TỪ TẾ BÀO NẤM MEN SACCHAROMYCES

CEREVISIAE ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC

PHẨM GIÀU DINH DƯỠNG VÀ NĂNG LƯỢNG CHO NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM GIÀU AXIT AMIN VÀ

-GLUCAN TỪ TẾ BÀO NẤM MEN SACCHAROMYCES

CEREVISIAE ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC

PHẨM GIÀU DINH DƯỠNG VÀ NĂNG LƯỢNG CHO NGƯỜI

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Mai Hương

ThS. Vũ Duy Nhàn

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Lan Anh

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60420114

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi

đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Mai Hương - Viện Hóa

học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và

ThS Vũ Duy Nhàn - Viện Hóa học Vật liệu - Viện Khoa học và Công nghệ Quân

sự đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh vật đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực

hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đã tạo điều kiện, quan tâm,

động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành

luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Lan Anh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm giàu axit amin

và -Glucan từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae để làm nguyên liệu sản

xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng và năng lượng cho người” là công trình nghiên

cứu của cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Lê Mai Hương và

ThS Vũ Duy Nhàn. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận

văn là trung thực và rõ ràng.

Đây là đề tài nghiên cứu mới, không giống với các đề tài luận văn nào trước

đây, do đó không có sự sao chép của bất kì luận văn nào. Nội dung của luận văn

được thể hiện theo đúng quy định, các nguồn tài liệu, tư liệu nghiên cứu và sử dụng

trong luận văn đều được trích dẫn nguồn.

Nếu xảy ra vấn đề gì với nội dung luận văn này, tôi xin chịu hoàn toàn trách

nhiệm theo quy định.

Học viên

Nguyễn Thị Lan Anh

MỤC LỤC

PHẦN I. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1

1.1.Đặt vấn đề……………………………………………………………………….1

1.2. Mục đích và yêu cầu……………………………………………………………2

1.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu……………………………………………….2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3

2.1.1. Giới thiệu về nấm men Saccharomycescerevisiae ............................................................................... 3

2.1.2. Thành phần hóa học của nấm men Saccharomyces cerevisiae ............................................................ 3 2.1.2.1. Nước................................................................................................................................................................ 3 2.1.2.2. Protein và các loại axit amin ............................................................................................................................. 4 2.1.2.3. Carbonhydrat ................................................................................................................................................... 4 2.1.2.4. Lipit ................................................................................................................................................................. 4 2.1.2.5.  - Glucan ........................................................................................................................................................ 4 2.1.2.6. Các nguyên tố khoáng và nguyên tố vi lượng .................................................................................................... 5 2.1.2.7. Vitamin ............................................................................................................................................................ 5 2.1.2.8. Enzyme ............................................................................................................................................................ 5

2.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae và thành phần hóa học của nấm men 3

2.2. Cấu tạo thành tế bào nấm men………………………………………………….5

2.3.1.Phương pháp hóa học ......................................................................................................................... 6

2.3.2. Phương pháp sinh học ....................................................................................................................... 7

2.3.3. Phương pháp tự phân ........................................................................................................................ 8

2.3. Các phương pháp thủy phân tế bào nấm men…………………………………..6

2.4. Hiện trạng công nghệ sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ tế bào nấm men

2.4.1. Các nguồn thu sinh khối nấm men giàu protein[15] ........................................................................... 9

2.4.2. Thành phần axit amin trong cao nấm men và các axit amin thiết yếu .................................................10 2.4.2.1. Thành phần axit amin trong cao nấm men ....................................................................................................... 10 2.4.2.2. Các axit amin thiết yếu ................................................................................................................................... 11

2.4.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ nấm men bia trên thế giới ...................12

2.4.5. Ứng dụng của chế phẩm giàu axit amin từ nấm men bia ...................................................................15 2.4.5.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và chăn nuôi ................................................................... 15 2.4.5.2. Ứng dụng trong công nghiệp lên men .............................................................................................................. 16

2.4.6. Triển vọng thị trường sử dụng chế phẩm giàu axit amin ....................................................................16

2.4.7. Công nghệ thủy phân nấm men thu hồi axít amin tự do và protein [39] ..............................................17

Sacharomyces cerevisiae[39]………………………………………………………9

2.5. Hiện trạng công nghệ sản xuất chế phẩm giàu -Glucan từ tế bào nấm men

2.5.1. Giới thiệu chung về β – glucan ..........................................................................................................18

2.5.2. Ứng dụng của -glucan ....................................................................................................................19 2.5.2.1. Ứng dụng trong y dược ................................................................................................................................... 19 2.5.2.2. Ứng dụng trong thực phẩm ............................................................................................................................. 20

2.5.3. Các phương pháp thu hồi, tách chiết, tinh sạch  - glucan từ nấm men ..............................................21

2.5.3.1. Các phương pháp thu hồi, tách chiết  - glucan từ nấm men ............................................................................. 21

2.5.3.2. Các phương pháp tinh sạch  - glucan từ nấm men .......................................................................................... 21

2.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới giá thành của chế phẩm -glucan ..............................................................22

Saccharomyces cerevisiae………………18

PHẦN III. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

............................................................................................................................. 23

3.1.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................................................23

3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ............................................................................................................23 3.1.2.1. Hóa chất: ....................................................................................................................................................... 23 3.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị: ........................................................................................................................................ 23

3.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu…………………………23

3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford ..................................................................23

3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số (theo phương pháp Kjeldahl) ....................................24

3.2.3. Phân tích độ hòa tan .........................................................................................................................25

3.2.4. Đánh giá chất lượng nguyên liệu ......................................................................................................25

3.2.5. Xác định hàm lượng chất đắng (bằng phương pháp so màu)..............................................................25

3.2.6. Xác định pH của bã nấm men bằng máy đo pH .................................................................................26

3.2.7. Phân tích độ ẩm nấm men .................................................................................................................26

3.2.8. Phương pháp xác định nồng độ protein tổng .....................................................................................26

3.2.9. Phương pháp xác định axit amin tổng bằng phản ứng Ninhydrin .......................................................26

3.2.10. Phương pháp thu thành tế bào ........................................................................................................27

3.2.11. Tinh sạch axit amin bằng phương pháp trao đổi ion ........................................................................27

3.2.12. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo theo Lecoq (1965) ........................................................28

3.2.13. Phương pháp tách chiết -glucan tổng số........................................................................................28

3.2.14. Phương pháp xác định hàm lượng -glucan (theo phương pháp McCleary và Glennie-Holmes (1985)

..................................................................................................................................................................28

3.2.15. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo .....................................................................................29

3.2.16. Phương pháp xây dựng công thức và đánh giá lý thuyết năng lượng của sản phẩm ..........................30

3.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………23

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 32

4.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện thủy phân nấm men bia để sản xuất axit

4.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tự phân nấm men ...............................................................................32 4.1.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ nồng độ % nấm men ............................................................................................. 32 4.1.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ tự phân .......................................................................................................... 33 4.1.1.3. pH ban đầu của mẫu nấm men tự phân ............................................................................................................ 33 4.1.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tự phân ................................................................................................... 34

4.1.2. Ảnh hưởng của phương pháp hóa lý đến quá trình thủy phân ............................................................35 4.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tác nhân hóa lý đến quá trình thủy phân. ................................................................ 35 4.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân lên hiệu quả của quá trình thủy phân .......................... 36

4.1.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bằng phương pháp sử dụng enzyme ...................................37 4.1.3.1.Lựa chọn enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân nấm men. ......................................................................... 37 4.1.3.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp của enzyme thủy phân nấm men ............................................................... 38

amin và –glucan…………………………………………………………………..32

4.2.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu nhận dịch chứa protein sau quá trình thủy phân tế bào

Saccharomyces cerevisie ............................................................................................................................42 4.2.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô của dịch trước khi lọc .................................................................................. 42 4.2.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất trợ lọc ..................................................................................................................... 43 4.2.1.3 Ảnh hưởng của tốc độ bơm .............................................................................................................................. 43

4.2.2. Nghiên cứu công nghệ tinh sạch axit amin tổng số ............................................................................44 4.2.2.1. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch ..................................................................................................................... 44 4.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ protein đến hiệu quả tinh sạch bằng trao đổi ion ......................................................... 45 4.2.2.3. Lựa chọn chế độ cô thích hợp ......................................................................................................................... 46

4.2.3. Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ thích hợp trong quá trình tinh sạch. .............................47 4.2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ protein trước khi bơm vào cột .................................................................................... 47 4.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch .................................................................................................... 48 4.2.3.3. Nghiên cứu tinh sạch ở quy mô pilot ............................................................................................................... 48

4.2.4. Nghiên cứu tạo dạng sản phẩm .........................................................................................................49 4.2.4.1. Lựa chọn phương pháp sấy thích hợp cho việc tạo sản phẩm bột giàu axit amin từ nấm men. ........................... 49 4.2.4.2. Nghiên cứu điều kiện sấy phun sản phẩm bột giàu axit amin từ nấm men ......................................................... 51

4.2.5.Xây dựng quy trình cho các bước công nghệ của các quá trình sản xuất chế phẩm giàu axit amin làm

thức ăn bổ sung cho người .........................................................................................................................52

4.2. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm giàu axit amin……………………………….42

4.3.1.Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tinh sạch -glucan .......................................................................55

4.3.2.Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ bổ sung enzyme lipase thích hợp tinh sạch -glucan ...................................56

4.3.3.Nghiên cứu lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp tinh sạch -glucan ..............................................57

4.3.4.Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình tinh sạch -glucan ..........................58

4.3.5.Nghiên cứu lựa chọn pH thích hợp cho quá trình tinh sạch -glucan tổng số ......................................58

4.3.6.Nghiên cứu tạo dạng sản phẩm -glucan làm thức ăn cho người ........................................................59 4.3.6.1.Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo sản phẩm .............................................................................................. 59 4.3.6.2.Nghiên cứu tạo sản phẩm -glucan dạng bột bằng phương pháp sấy phun ......................................................... 59

4.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất thực phẩm giàu -Glucan………………………55

4.3.7.Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm β-glucan ................................................................................63

4.4. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm dinh dưỡng và năng lượng giàu axit amin và

4.4.1. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm dinh dưỡng và năng lượng giàu axit amin ........................................65 4.4.1.1. Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu .................................................................................................................... 65 4.4.1.2. Xây dựng công thức ....................................................................................................................................... 66 4.4.1.3. Xây dựng quy trình sản xuất lương khô ........................................................................................................... 71

thực phẩm chức năng chứa  - glucan 65

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa của từ viết tắt

OD Optic density: Độ hấp thu của mẫu thử

S. cerevisiaes Saccharomyces cerevisiae

E.coli Escherichia coli

C.saitoana Candida saitoana

IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1:Yếu tố tăng trưởng giống Insulin-1

Bovine Serum Albumin: dung dịch máu huyết thanh bò BSA

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

YGT Nấm men bánh mỳ

Đ/C Đối chứng

proPO prophonoloxidaza

Pmt Áp suất riêng của hơi nước trong môi trường

cs Cộng sự

v/p Vòng/phút

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần axit amin trong cao nấm men ............................................. 11

Bảng 2.2 Nhu cầu tối thiểu của các axit amin cần thiết của con người .................. 12

Bảng 3.1. Bảng tính toán các loại thực phẩm khác ................................................. 30

Bảng 3.2. Đánh giá lý thuyết khẩu phần ................................................................ 31

Bảng 3.3. Đánh giá mức đáp ứng nhu cầu .............................................................. 31

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến hiệu suất thủy phân ..................... 32

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân ................................... 33

Bảng 4.3: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thủy phân ................................................. 34

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của hàm lượng HCl đậm đặc lên hiệu quả của quá trình thủy

phân ...................................................................................................................... 36

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân bằng tác nhân HCl ...... 36

Bảng 4.6: Nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân nấm men ................................. 38

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thủy phânnấm men ......... 39

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất thủy phân nấm men ............................. 39

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới hiệu suất thủy phân nấm men ... 40

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thủy phân nấm men ................... 41

Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô của dịch trong lọc tinh ..................... 42

Bảng 4.12. Ảnh hưởng của chất trợ lọc ................................................................... 43

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch vào máy lọc khung bản ..................... 44

Bảng 4.14. Thành phần hóa học của bã nấm men trước và sau khi lọc ................... 44

Bảng 4.15. Ảnh hưởng của tốc độ chảy ................................................................. 45

Bảng 4.16. Ảnh hưởng của nồng độ dịch protein đến hiệu quả tinh sạch................ 46

Bảng 4.17. Lựa chọn chế độ cô thích hợp .............................................................. 46

Bảng 4.18. Kết quả tổng kết quá trình thu nhận và tinh sạch axit amin từ nấm men

.............................................................................................................................. 47

Bảng 4.19.Ảnh hưởng của nồng độ dịch protein đến hiệu quả tinh sạch................. 47

Bảng 4.20.Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến quá trình tinh sạch ....................... 48

Bảng 4.21. Tổng kết quá trình thu nhận và tinh sạch protein quy mô pilot ........... 49

Bảng 4.23. Kết quả lựa chọn điều kiện sấy phun.................................................... 51

Bảng 4.24: Ảnh hưởng của phương pháp tinh sạch tới hiệu suất thu hồi ................ 56

Bảng 4.25: Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung enzyme lipase tới quá trình tinh

sạch -glucan......................................................................................................... 57

Bảng 4.26: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme lipasse tới quá trình tinh

sạch -glucan......................................................................................................... 57

Bảng 4.27: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình tinh sạch-glucan ...... 58

Bảng 4.28: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới thu nhận -glucan tổng số .............. 58

Bảng 4.29: Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo sản phẩm cho chế phẩm -glucan

làm thức ăn cho người ........................................................................................... 59

Bảng 4.30: Ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang .......................................................... 60

Bảng 4.31: Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào -glucan đã tinh sạch của dịch

trước sấy phun ....................................................................................................... 61

Bảng 4.32: Ảnh hưởng của chế độ sấy phun .......................................................... 62

Bảng 4.33. Thành phần dinh dưỡng trong mỗi loại thực phẩm khảo sát ................. 66

Bảng 4.34. Khối lượng các thành phần sinh nhiệt .................................................. 68

Bảng 4.35. Tỉ lệ và thành phần lipid và glucid để tạo bột bán thành phẩm ............. 68

Bảng 4.36. Công thức để sản xuất thử nghiệm bột bán thành phẩm ....................... 69

Bảng 4.37. Khẩu phần ăn được bố sung ................................................................. 69

Bảng 4.38. Công thức của sản phẩm lương khô ..................................................... 70

Bảng 4.39. Công thức để sản xuất lương khô ......................................................... 70

Bảng 4.40. Tiêu chí gói thực phẩm chức năng ......... Error! Bookmark not defined.

Bảng 4.41. Công thức gói thực phẩm chức năng ..... Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1. Ảnh hưởng của thời gian tự phân từ bã nấm men bia ............................. 35

Hình 4.2. Sơ đồ quy trình sản xuất giàu axit amin ................................................. 53

Hình 4.3.Quy trình sản xuất chế phẩm β-glucan ................................................... 63

Hình 4.4. Quá trình tạo dạng sản phẩm giàu axit amin .......................................... 67

Hình 4.5. Quy trình sản xuất lương khô ................................................................ 71

Hình 4.6. Quy trình sản xuất gói thực phẩm chức năng ......... Error! Bookmark not

defined.

PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1.Đặt vấn đề

Nấm men là một nguồn thức ăn bổ sung có giá trị cao và không cholesterol.

Hàm lượng protein trong nấm men đạt từ 40 – 60%, với axit amin không thay thế

gần giống protein của động vật [5,13,14]. Hệ số hấp phụ của protein này cũng rất

cao. Hàm lượng vitamin trong nấm men với hoạt tính cao hơn gấp 2 -3 lần so với

vitamin tổng hợp[14]. Nấm men còn cung cấp vitamin B tự nhiên phong phú, chứa

nhiều enzym kích tố có ảnh hưởng tốt tới quá trình trao đổi chất, nhưng không gây

độc hại cho cơ thể[13].

Trên thế giới đã có nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tận dụng nấm

men bia Saccharomyces cerevisiaevào các mục đích khác nhau, sử dụng dịch chiết

nấm men bia đã khử đắng được tận dụng làm thuốc bổ, sử dụng sinh khối nấm men

bia được tận dụng làm thức ăn gia súc. Với sự phát triển của khoa học hiện đại ngày

nay đã phát hiện ra sự phong phú về thành phần dinh dưỡng của nấm men như các

vitamin, axitamin, -Glucan… Từ đó có rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là ở

Nhật, Đức, Pháp rất quan tâm và đã tận dụng nguồn sinh khối nấm men sản xuất ra

các chế phẩm giàu axitamin, cao nấm men… Để ứng dụng trong các lĩnh vực y học,

dược học, công nghiệp thực phẩm và công nghệ lên men. Trong công nghệ lên men,

chế phẩm này là nguồn bổ sung nitơ và các chất kích thích lý tưởng cho quá trình

sinh trưởng phát triển của vi sinh vật.

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây ngành sản xuất bia đã có những bước

phát triển mạnh mẽ, tiêu thụ bia tại Việt Nam tăng trung bình 12% giai đoạn 2006-

2010, tăng 13% giai đoạn 2011-2015[12]. Hiện cả nước có hơn 400 nhà máy bia.

Như vậy với sản lượng bia sản xuất khoảng 5 tỷ lít bia sẽ thải ra một lượng nấm

men vô cùng lớn, theo ước tính cứ sản xuất 1000 lít bia có thể thu được từ 12-15 kg

nấm men dạng sệt. Trong thực tế thì một lượng nấm men dư tương đối lớn được bán

cho các hộ gia đình chăn nuôi làm thức ăn thô cho gia súc, gia cầm, tôm, cá. Việc

sử dụng như vậy không những không tận dụng được triệt để nguồn dinh dưỡng quý

giá của nấm men, mà còn có thể gây ra sự ô nhiễm môi trường.

Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu tận dụng nấm men bia để tạo bột

nấm men ứng dụng trong chế biến thực phẩm và bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.

1

Các dạng chế phẩm này chủ yếu dùng phương pháp tự phân hoặc có bổ sung

enzyme Neutrase trong quá trình thủy phân và để nguyên cả xác tế bào nấm men,

nên chất lượng sản phẩm chưa cao chưa đáp ứng được nhu cầu ngày đòi hỏi càng

cao của thị trường, như ngành công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm đặc biệt là

ngành công nghệ lên men vẫn phải nhập khẩu cao nấm men với giá rất đắt 2-2,7

triệu/kg. Sản xuất bột giàu axit amin và giàu -Glucantừ nấm men bia nhằm đáp

ứng nhu cầu trong nước là nhu cầu hết sức cấp thiết. [11]

Việc chiết xuất các chất có lợi từ nấm men bia để bổ sung cho thực phẩm

chức năng là một đóng góp có giá trị cho đời sống xã hội. Ý nghĩa hơn nữa là việc

này tận dụng được nguồn nguyên liệu khá dồi dào trong nước (hầu như địa phương

nào cũng có nhà máy bia), nên sẽ giảm rất nhiều giá thành cho ngành sản xuất thực

phẩm chức năng trong nước. Sản xuất bột nấm men giàu axit amin và -Glucanvào

làm thức ăn cho người, quy trình sản xuất an toàn, các công đoạn trong quy trình tối

ưu hóa để có thể thu hồi axit amin và -Glucanvới hiệu suất cao nhất, giá thành hợp

lý, đáp ứng được nhu cầu khi ứng dụng vào sản xuất công nghiệp các sản phẩm

thực phẩm khác.

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm giàu

axit amin và -Glucan từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae để làm nguyên

liệu sản xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng và năng lượng cho người” với mục đích

đóng góp một loại sản phẩm dành cho người sử dụng hiệu quả trong các hoạt động

và điều kiện đặc biệt hiện nay.

1.2. Mục đích và yêu cầu

- Sản xuất được hỗn hợp axit amin và-Glucan từ tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae.

- Sản xuất được thực phẩm giàu dinh dưỡng, năng lượng cho người từ nguồn

nguyên liệu axit amin vàthực phẩm chức năng chứa -Glucan.

1.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Viện Hóa học Vật liệu - Viện Khoa học và Công nghệ

Quân sự Việt Nam

2

- Thời gian nghiên cứu: 06/2014-12/2015

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae và thành phần hóa học của nấm men

2.1.1. Giới thiệu về nấm men Saccharomycescerevisiae

Không một nhóm vi sinh vật nào lại gắn liền với sự tiến bộ và phồn vinh của

loài người hơn là nấm men. Đây là nhóm vi sinh vật đã được con người sử dụng rất

nhiều trong sản xuất và nghiên cứu khoa học. Các sản phẩm từ nấm men chiếm gần

70% tổng số các sản phẩm sinh học trên toàn thế giới. Có thể nói nấm men là đối

tượng quan trọng bậc nhất của ngành công nghệ sinh học hiện đại, nó được ứng

dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như: sản xuất nấm

men bánh mì, lên men bia rượu, sản xuất các chế phẩm enzyme, các chế phẩm giàu

axitamin, cao nấm men…[5].

Nấm men là vi sinh vật điển hình của nhóm nhân thật là một loại nấm đơn

bào, sinh sản bằng phương pháp nẩy trồi hoặc tự phân đôi tế bào. Loại nấm men mà

các nhà máy bia, rượu thường sử dụng là Saccharomyses cerevisiace, kích thước

của tế bào nấm men rất nhỏ từ 5-10µm, nó thường có dạng hình trứng hoặc hình

bầu dục. Hình thái cũng như thành phần hóa học của nấm men phụ thuộc nhiều vào

điều kiện nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng và trạng thái sinh lý của tế bào. Người ta

thường chia các hợp chất trong tế bào nấm men ra thành nước và các chất khô gồm:

protein, vitamin, carbonhydrat, lipit các nguyên tố vi lượng tro và một số chất có

hoạt tính sinh học [5].

2.1.2. Thành phần hóa học của nấm men Saccharomyces cerevisiae

2.1.2.1. Nước

Trong tế bào nấm men nước chiếm tỷ lệ khá cao khoảng 75-85% trọng lượng

tế bào. Nước trong tế bào gồm 2 dạng: nước tự do và nước liên kết.

Nước tự do trong tế bào có tác dụng hòa tan các chất vô cơ, hữu cơ. Hàm

lượng nước tự do có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện bên ngoài, trạng thái tế

bào, lứa tuổi. Sự mất nước tự do có thể làm rối loạn sự trao đổi chất của tế bào nấm

men

Nước ở dạng liên kết nằm trong tế bào chất, đóng vai trò quan trọng trong

đời sống tế bào. Nước này liên kết với các hợp chất thể keo của tế bào bằng hấp thụ

hoặc nối hóa học, còn gọi là nước cấu tạo. Nước cấu tạo khó tách khỏi tế bào và khi

3

mất đi sẽ phá vỡ cấu tạo tế bào, tế bào nấm men sẽ bị chết.

2.1.2.2. Protein và các loại axit amin

Protein là thành phần quan trọng nhất trong tế bào nấm men, chiếm chủ yếu

trong phần chất khô của tế bào, thường là 50-70% trọng lượng chất khô, gồm

protein đơn giản và phức tạp (lipoprotein và nucleoprotein ). Protein có ở hầu hết

các bộ phận tế bào nấm men trong đó tập trung ở các tế bào và ở màng nguyên sinh

chất của tế bào ( chiếm 10% trọng lượng khô của vách tế bào và 50% trọng lượng

khô của màng nguyên sinh chất).Vềtính chất protein của nấm men gần giống

protein nguồn gốc động vật, có chứa khoảng 20 loại axitamin, trong đó có đủ các

loại axitamin không thay thế với thành cân đối[50].

2.1.2.3. Carbonhydrat

Carbonhydrat chiếm 10-30% chất khô tế bào nấm men, trong đó 2-3% là

ribose, còn lại phấn lớn là các polisaccarit thường gặp như glucozen, trehaloza,

manan, glucan, xenluloza, hemixenluloza và D-mannoza…, manan, glucan là 2

thành phần hóa học chủ yếu của các tế bào[50].

2.1.2.4. Lipit

Lipit phụ thuộc vào thành phần môi trường thức ăn và các loài nấm men

khác nhau. Có khoảng 1-3% lipit ở dạng trung tính như: các este phức tạp của

glyxerin, lipit, photpholipit, steroid và các axit béo bậc cao. Lipit trong tế bào ở

dạng tự do hay kết hợp, chúng đóng vai trò quan trọng vì trong nguyên sinh chất

chúng liên kết với nhau tạo thành hệ sợi mixel hay kết hợp với protein tạo thành

lipoprotein, cơ sở chính để xây dựng nên tế bào[5].

2.1.2.5.  - Glucan

 - Glucanlà một trong những polysacharit nhiều nhất trong thành tế bào nấm

men, -glucan tồn tại như một homopolymer của glucoza, liên kết với nhau qua cầu

nối -(1,3) hoặc -(1,6)-D-glycosidic, chịu trách nhiệm cho hình dạng và độ bền cơ

học của thành tế bào. Thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae gồm có -

(1,3)-D-glucan, -(1,6)-D-glucan, chitin và mannoprotein. Cả 4 thành phần cấu trúc

của thành tế bào liên kết hoá trị với nhau. Mannoprotein (khối lượng protein khoảng

100 Kda) liên kết với -(1,6)-D-glucan qua glycosyl-phosphatidyl-inositol có chứa

5 gốc mannosyl liên kết . Đầu khử của -(1,6)-D-glucan liên kết với đầu glucoza

4

không khử của -(1,3)-glucan. Chitin gắn thẳng vào nhánh -(1,6)-glucan. Những

năm gần đây, -glucan phân lập từ thành tế bào nấm men ngày càng được chú ý.

Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như tăng cường miễn dịch,

kháng khối u và là tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống miễn dịch [18].

2.1.2.6. Các nguyên tố khoáng và nguyên tố vi lượng

Ngoài các nguyên tố hữu cơ C,H,N,O trong tế bào nấm men còn có các

nguyên tố tro P,S,K,Ca, Mg,Fe, Na, Cl,Ba và các nguyên tố vi lượng B, Mo,Zn ,Cu,

I. Các nguyên tố này tuy chỉ chiếm 2-14% tổng lượng chất khô trong tế bào nấm

men nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng [10].

2.1.2.7. Vitamin

Nấm men rất giàu vitamin chủ yếu là vitamin nhóm B và vitamin nhóm D

trong 1g chất khô của nấm men chứa 300µg vitamin B1, 40µg vitamin B2, 50µg

vitamin B6, 600µg vitamin PP, 80µg axit pantoteic, 25µg axit foleic, 1µg biotin và

500µg inozit.Ngoài ra trong nấm men còn có vitamin E và nhiều hợp chất khác. Tất

cả các chất hoạt tính sinh học này được chứa trong nấm men với 1 tỷ lệ hết sức phù

hợp, chính vì thế mà tác dụng của chúng đến trạng thái sinh lý của các cơ thể sống

là rất rõ nét [10].

2.1.2.8. Enzyme

Tế bào nấm men chứa một tập hợp enzyme rất phong phú, đa dạng như

Enzyme dehydrogenaza, photphoglyxerat kinaza, alcohol dehydrogenaza… Enzyme

trong tế bào gồm 2 loại chính: enzyme nội và ngoại bào. Enzyme nội bào làm tăng

các phản ứng hóa học của các quá trình hô hấp, lên men và các phản ứng dẫn đến

tạo thành nguyên sinh chất của tế bào. Enzyme ngoại bào chuẩn bị thức ăn cho môi

trường xung quanh, chuyển các hợp chất không hòa tan thành các hợp chất hòa tan

và dễ đồng hóa [5].

2.2. Cấu tạo thành tế bào nấm men

Thành tế bào nấm men tạo thành một biên giới xác định kích thước tế bào

nấm men và bảo vệ các cơ quan của tế bào khỏi những ảnh hưởng tiêu cực của môi

trường. Các thành phần cấu tạo nên thành tế bào nối với nhau bằng liên kết hóa trị

hình thành một siêu phân tử polymer sinh học duy nhất. Để tìm hiểu bản chất của

những liên kết này, cũng như các cấu trúc của từng polysaccharid, tất cả các yếu tố

cấu tạo phải được phân cắt, hòa tan, tinh sạch và phân tích. Trong quá trình này gần

5

như không thể không làm tổn hại đến các yếu tố cấu trúc và tiếp theo sau đó là làm

sao để phân biệt giữa các thành phần ban đầu của thành tế bào và các polysaccharid

hòa tan có thể có mặt trong tế bào chất hoặc có thể là bị mắc kẹt (chất hấp thu)

trong thành tế bào. Hơn 50 năm nghiên cứu đã thiets lập được cấu trúc của các

homopolysaccharide chính, trọng lượng phân tử cao ở nấm men [53].

Các Mannoprotein chủ yếu tập trung trên bề mặt bên ngoài của thành tế bào

(Osumi, 1998). Có chức năng thụ quan cho các chất dinh dưỡng, hóa học và độc tố

vi khuẩn/virus, tích cực tham gia vào việc vận chuyển chất dinh dưỡng và các chất

chuyển hóa qua thành tế bào, và cũng tham gia giao phối [54]. Một số enzyme

thành tế bào như glucanase, mannanase, invertase, alkaline phosphatase và lipase là

các mannoprotein thủy phân chất dinh dưỡng và tham gia vào các việc tái tạo các

polysaccharid của tế bào trong quá trình tăng trưởng tế bào và phân chia tế bào mới.

Quá trình tách glucan thành tế bào nấm men (phần không tan) khỏi các mannan

nấm men đã được sử dụng trên quy mô công nghiệp (Sedmak,2006). Phần hòa tan,

phân đoạn giàu mannan, có thẻ được thêm trở lại thành tế bào (chỉ chứa 10-17%

mannan tính theo trọng lượng), để tăng hàm lượng của các mannan đến 30%[55].

Thành tế bào của Saccharomyces cerevisiae chiếm khoảng 25-30% tổng

trọng lượng khô tế bào, trong đó chứa khoảng 30-60% lượng glucan [41].

2.3. Các phương pháp thủy phân tế bào nấm men

2.3.1.Phương pháp hóa học

- Tác nhân thủy phân

Người ta thường sử dụng axit HCl để thủy phân. Axit có tác dụng thủy phân

phức hệ glucan, protein và lipid gây hư hỏng mạng lưới cấu trúc của thành và màng

tế bào, do đó các chất nội bào được chiết ra môi trường ngoài một cách dễ dàng.

Tuy nhiên khi sử dụng axit quá nhiều có thể dẫn đến những thay đổi về bản chất

hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm có trong tế bào. Theo các tài liệu

nghiên cứu cho thấy dùng HCl có nhiều ưu điểm hơn so với các axit khác hay các

bazơ khác vì khi thủy phân bằng HCl sẽ cho sản phẩm có mầu sắc tươi đẹp, đạm hư

ít và ít tổn thất axít amin.Nếu dùng NaOH cũng nhanh nhưng cũng khử đi một số

các axit amin.

6

- Nồng độ axit thủy phân:

Lượng axit ít, tác nhân xúc tác trong quá trình thủy phân sẽ yếu, thời gian

thủy phân dài, thủy phân không triệt để, tốn nước và nhiệt.Lượng axit nhiều sẽ gây

lãng phí hóa chất (HCl, NaOH trung hòa) lượng muối sinh ra trong dịch thủy phân

nhiều, đồng thời dưới tác dụng của nhiệt độ và nồng độ axit cao, axit amin sẽ bị

phân hủy mạnh [10].

- Thời gian thủy phân:

Khi thời gian thủy phân ngắn, các mạch protit chưa phân giải hết làm cho

hiệu suất thu hồi thấp. Nếu thời gian quá dài: đạm amin sẽ bị phân hủy, nhiều hợp

chất màu nâu sẫm được hình thành, ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau

này [10].

- Nhiệt độ thủy phân:

Nếu nhiệt độ quá cao sẽ làm protit trong nguyên liệu phân giải mạnh dẫn

đến các axit amin bị giảm mạnh tạo thành nhiều sản phẩm phụ.Nếu nhiệt độ quá

thấp thì thời gian thủy phân kéo dài [10].

2.3.2. Phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sử dụng

enzyme. Người ta dùng enzyme tương ứng với cơ chất có trong thành tế bào, thủy

phân cơ chất và như vậy thành tế bào sẽ bị phá vỡ kết quả thu được tế bào nấm

men.

Enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình thủy phân protein nấm men là

proteaza. Đây là nhóm enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptit (-CO-NH-)

trong phân tử protein. Proteaza được chia thành proteinaza (endoproteaza) và

peptitdaza (exoproteaza)[38].

Proteinaza: chủ yếu phân hủy các liên kết peptit nằm trong phân tử protein.

Chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng. Dưới tác dụng của chúng, protein bị phân

cắt thành những đoạn peptit có trọng lượng phân tử nhỏ (pepton, polipeptit).

Peptidaza: phân hủy chủ yếu là các liên kết peptit ở cuối mạch polypeptit,

tách các gốc axit amin thành các axit amin tự do. Các peptidaza có tính đặc hiệu hẹp

hơn. Chúng chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở vị trí nhất định. Ví dụ như

aminopeptidaza chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở đầu mạch polypeptit có nhóm

amin tự do, còn cacboxypeptidaza chỉ tác dụng lên liên kết peptit ở cuối mạch có

7

nhóm cacboxyl tự do [5,10] .

Như vậy, quá trình thủy phân protein xảy ra dưới tác dụng của proteaza theo

một trật tự nhất định. Lúc đầu, endoproteaza phân hủy protein thành các thành phần

có phân tử lượng nhỏ hơn là polypeptit, pepton, albumin. Tiếp đó, các sản phẩm này

lại trực tiếp chịu tác dụng của exoproteaza để tạo thành các axit amin tự do. Sản

phẩm do endoproteaza lại là cơ chất cho exoproteaza [10].

2.3.3. Phương pháp tự phân

Tự phân là quá trình tự xảy ra khi tế bào nấm men chết và vách tế bào không

có khả năng tự vệ sẽ bị phá hủy bởi các enzyme trong tế bào. Lúc này chất trong

tế bào như: protein, nucleotic, cacbohydrate…cũng bị hệ thống enzyme này tấn

công và phân hủy. Quá trình tự phân bắt đầu khi tế bào nấm men chết lúc đó màng

tế bào và các bào quan khác không hoạt động lúc này enzyme nội sinh bắt đầu hoạt

động, các enzyme có nhiệm vụ phân giải protein thành các đơn vị nhỏ hơn như

peptide và các axit amin. Tương tự như vậy, enzyme nuclease phân hủy RNA và

DNA tạo thành hợp chất như nucleoside, mononucleotides, và polynucleotides. Các

enzyme glucanase và proteinase phân hủy các thành phần vách tế bào như glucan và

mannoprotein, khiến các tế bào trở nên xốp. Các thành phần chính hình thành trong

quá trình tự phân bao gồm các hợp chất đạm, polysaccharide, các thành phần

nucleic axit, axit béo, các loại vitamin khác nhau.

Quá trình tự phân của nấm men chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau

như: nồng độ nấm men trong dung dịch, các yếu tố thúc đẩy quá trình tự phân như

ethyl acetate, chitosan.., nhưng yếu tố quan trọng nhất vẫn là nhiệt độ, pH, thời

gian, đối với từng loại nấm men khác nhau thì yếu tố chi phối cũng khác nhau[32].

Nồng độ nấm men trong dung dịch: ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tự phân.

Nồng độ nấm men càng thấp thì hiệu quả tự phân càng cao, tuy nhiên nếu dung dịch

tự phân quá loãng vì vậy dung dịch tự phân sẽ được pha loãng ở nồng độ từ 10-

15% sinh khối nấm men[50].

Nhiệt độ: Nấm men bia tự phân ở nhiệt độ 450C[50], trong khi đó nấm men

8

bánh mì đạt hiệu quả cao nhất ở nhiệt độ 510C.

2.4. Hiện trạng công nghệ sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ tế bào nấm men

Sacharomyces cerevisiae[39]

2.4.1. Các nguồn thu sinh khối nấm men giàu protein[15]

Nấm men là một nhóm vi sinh đơn bào được loài người sử dụng từ hàng

nghìn năm nay để sản xuất nước uống có cồn và làm bánh. Ngày nay những hiểu

biết khoa học và công nghệ đã cho phép phân lập và sản xuất công nghiệp những

chủng nấm men có những tính chất đặc biệt, thoả mãn ngày càng cao nhu cầu thực

phẩm của con người.

Nấm men thực phẩm bao gồm nấm men bánh mì, nấm men bia, nấm men bia

dinh dưỡng, nấm men rượu vang, nấm men rượu, nấm men probiotic, chiết chất

nấm men, nấm men Torula, nấm men whey... Một số loại nấm men trên đây không

những được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm mà còn được dùng làm nguồn bổ

sung protein rất quý cho người, gia súc, gia cầm và thủy sản.

Nấm men bánh mì (baker’s yeast):

Nấm men bánh mì tươi có khoảng 30-33% chất khô; 40-58% protein; 35-

45% carbohydrate; 4-6% lipid và 5-7,5% chất khoáng và một số loại vitamin như

vitamin nhóm B, tiền vitamin D[15].

Nấm men bánh mì thương phẩm bao gồm các sản phẩm dạng lỏng, dạng

cream, dạng ép và dạng men khô hoạt động và không hoạt động. Nấm men bánh mì

là các loại nấm men thuộc chủng Saccharomyces cerevisiaes. Men khô dạng hoạt

động gồm các hạt tế bào men sống có năng lực lên men, còn men khô không hoạt

động là dạng men chết, không có năng lực lên men thường dùng làm bột nhào trong

quá trình làm bánh hay tạo hương vị cho bánh. Ngành chăn nuôi cũng sử dụng men

khô dạng không hoạt động để bổ sung protein, lysine và vitamin nhóm B cho người

và động vật nuôi.

Nấm men bia (brewer’s yeast):

Môi trường nuôi cấy nấm men bia tinh chất thường được sản xuất công

nghiệp để cung cấp cho ngành bia. Hai chủng Saccharomyces được dùng là S.

uvarum (trước đây gọi là S. carlsbergenis) và S. cerevisiaes, tuỳ từng kiểu lên men

khác nhau (lên men chìm hay lên men nổi) mà người ta sử dụng các chủng khác

9

nhau và cho ra các loại bia khác nhau.

Nấm men bia cũng đã được nuôi cấy trên những môi trường đặc biệt để thu

sinh khối giàu protein và vitamin B làm chất bổ sung dinh dưỡng cho người và

động vật nuôi. Đặc biệt khác với nấm men bánh mì, nấm men bia dinh dưỡng hay

Torula, nấm men bia khá giàu crôm (vi khoáng cần để duy mức đường màu bình

thường) và selen (vi khoáng có vai trò nâng cao năng lực miễn dịch). Vách tế bào

nấm men bia còn có năng lực hấp phụ độc tố nấm mốc rất mạnh; ngày nay sản

phẩm này đã được chế biến thành phụ gia bất hoạt độc tố nấm mốc trong thức ăn

chăn nuôi có hiệu quả và đã được thương mại hoá trên khắp thế giới.

Nấm men bia dinh dưỡng (nutritional brewer’s yeast):

Nấm men bia dinh dưỡng là những nấm men chết còn lại sau quá trình làm

bia. Sinh khối nấm men thu được từ ngành bia là rất lớn, cứ sản xuất 1.000 lít bia

thì thu được 12 – 20 kg nấm men sệt tương ứng với 1,5 - 2 kg nấm men khô trong

đó chứa khoảng 700g protein. Hàng năm, sản lượng bia của nước ta đạt khoảng 2,5-

3,0 tỷ lít, với sản lượng này thì sinh khối nấm men khô thu được sẽ vào khoảng

3.500 – 4.000 tấn.

Sinh khối nấm men thu được từ quá trình làm bia thường có vị đắng (do

nhựa hoa Houblon bám trên tế bào nấm men) và có thành tế bào ở dạng bền vững

(do liên kết peptido-glucan của vách tế bào nấm men). Do vậy để sử dụng sinh khối

nấm men làm thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi thì cần loại bỏ vị đắng và phá vỡ

liên kết peptido-glucan thành tế bào.

Các nhà khoa học Viện Chăn nuôi nước ta đã dùng dung dịch NaOH 0,1% để

khử đắng và dùng phương pháp tự phân (xử lý nhiệt 50oC trong 18 giờ) để phá vỡ

vách tế bào nấm men đã thu được bột sinh khối nấm men có 48% protein và lượng

axit amin tổng số là 36%, dùng làm nguồn bổ sung protein cho gia súc, gia cầm và

cá. Ngoài ra, sinh khối nấm men loại này cũng giàu vitamin nhóm B và chất khoáng

như Ca, P, K, Mg, Cu, Fe, Zn, Mn và Cr [15]

2.4.2. Thành phần axit amin trong cao nấm men và các axit amin thiết yếu

2.4.2.1. Thành phần axit amin trong cao nấm men

Sinh khối tế bào nấm men là nguồn nguyên liệu để sản xuất bột nấm men

giàu axit amin. Theo tác giả Satake Kenji [30] thành phần axit amin trong cao nấm

10

men gồm:

Bảng 2.1: Thành phần axit amin trong cao nấm men

Thành phần Hàm lượng % Thành phần Hàm lượng %

Lysine 3,8 Proline 0,5

Histidine 1,2 Glycine 2.2

Trytophan 0,5 Alanine 4.9

Aspartic acid 3.6 Cystine 0.5

Arginine 1.2 Valine 3.2

Threonine 2.6 Methionine 0.6

Serine 4.7 Isoleusin 1.5

Glutamic acid 4.2 Leusin 1.6

Tyrosine 0.5 Pheninalanine 2.1

2.4.2.2. Các axit amin thiết yếu

Có 4 axit amin thiết yếu hay bị thiếu hụt trong khẩu phần ăn ở nước ta: đó là

lysine, threonine, tryptophan và methionine. Trong đó, lysine được quan tâm hơn cả

vì có nhu cầu khá cao nhưng lại thường bị thiếu hụt nhất trong các khẩu phần ăn

chủ yếu dựa vào ngũ cốc (chiếm 70-80% năng lượng) như nước ta hiện nay. Mặt

khác, lysine dễ bị phá hủy trong quá trình chế biến nấu nướng thức ăn, và cơ thể

tuyệt đối không thể tổng hợp được lysine (các axit amin thiết yếu kia có thể được

tổng hợp từ các axit amin khác qua quá trình chuyển đổi amin). Do đó, thiếu lysine

rất phổ biến, đặc biệt ở trẻ nhỏ. Thiếu lysine dẫn đến giảm tổng hợp protein cơ thể,

làm cho trẻ chậm lớn, còi cọc, biếng ăn, hay bệnh, thiếu men tiêu hoá, thiếu nội tiết

tố Làm thế nào để tránh thiếu lysine? Biện pháp tối ưu vẫn là bữa ăn đa dạng hợp

lý, có đủ các chất dinh dưỡng trong đó có lysine. Thức ăn giàu lysine là trứng, sữa,

thịt, cá, các loại đậu, nhất là đậu nành. Cũng có thể bổ sung lysine vào thực phẩm.

Một cách dễ thực hiện khác là có thể bổ sung thêm bằng thuốc bổ có lysine. Lysine

giúp trẻ ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hóa, hấp thu tối đa dinh dưỡng và phát

triển chiều cao. Do sự bất hợp lý về khẩu phần nên người Việt dễ bị thiếu lysine.

Lysine là một trong 12 axit amin thiết yếu cần có trong bữa ăn hằng ngày. Nó giúp

tăng cường hấp thụ và duy trì canxi, ngăn cản sự bài tiết khoáng chất này ra ngoài

11

cơ thể.

Nhu cầu của các axit amin cần thiết đối với cơ thể con ngưởi: theo tổ chức

FAO cho thấy khi lượng đạm đầy đủ, chất đạm được quyết định bởi tính cân đối của

các axit amin trong đó hơn là số lượng tuyệt đối của các axit amin cần thiết khác

nhau. Những tác dụng qua lại giữa các axit amin rất nhiều và phức tạp. Một hỗn

hợp không cân đối có thể ảnh hưởng xấu về mặt dinh dưỡng ngay cả khi lượng axit

amin cần thiết đầy đủ cho một cơ thể bình thường. Nhu cầu tối thiểu của các axit

amin cần thiết được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.2Nhu cầu tối thiểu của các axit amin cần thiết của con người [4]

Axit amin Trẻ em (mg/kg) Nữ trưởng thành

(g/ngày) Nam trưởng thành (g/ngày)

Isoleusin 126 0,45 0,7

Leusin 150 0,62 1,1

Lysine 103 0,5 0,8

Methionine 45 0,35 - 0,2 (a)

Tổng số aa chứa S - 0,55 1,1 – 1,01

Pheninalanine 90 0,22 1,1 – 0,3 (b)

Tổng số aa thơm - 1,12 1,1 – 1,4

Threonine 87 0,3 0,5

Trytophan 22 0,15 0,25

Valine 105 0,65 0,8

(a: Khi lượng cystine đầy đủ; b: Khi lượng tyrosine đầy đủ)

2.4.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ nấm men

bia trên thế giới

Việc tận dụng nguồn sinh khối nấm men bia đã và đang được nhiều nước

trên thế giới quan tâm chú ý đến. Trong đó, Nhật Bản là nước sử dụng nhiều nhất

nấm men bia và các sản phẩm có chứa bột nấm men bia. Tại đây, bột nấm men bia

được xếp vào nhóm các loại sản phẩm gia vị tự nhiên. Nhật Bản đã có nhiều cố

gắng tận thu nguồn nguyên liệu protein quý giá này từ các nhà máy bia trong nước,

hàng năm sản xuất được 7.574 tấn sản phẩm các dạng khác nhau.

Trong công nghiệp thực phẩm tại Nhật Bản cũng như nhiều nước khác, sinh

12

khối nấm men được sản xuất thành xì dầu, được bổ sung vào các sản phẩm mỳ ống,

bánh mì, bánh nướng làm tăng hàm lượng protein trong sản phẩm. Đặc biệt ở Nhật,

các sản phẩm tăng lực như viên đạm được sản xuất và tiêu thụ nhiều. Sử dụng viên

đạm để nấu các bữa ăn nhanh hay sử dụng như các chất gia vị được chế biến sẵn có

nhiều tiện ích như tiết kiệm thời gian, tái tạo năng lượng nhanh, không sợ béo phì.

Đồng thời sinh khối nấm men hoặc nấm men thải từ các nhà máy bia cũng

được rất nhiều nước trên thế giới (Đức, Pháp,Mỹ, Nhật…) đã nghiên cứu tạo ra sản

phẩm gọi là cao nấm men, nó được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp

thực phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men… Chất lượng cao nấm men phụ thuộc

vào nguồn nguyên liệu nấm men, phương pháp sản xuất,…nhưng cao nấm men

dạng bột thường có hàm ẩm 5-6% và một số thành phần chính gồm: nitrogen tổng

số từ 8-12%; protein tổng số 50-75%; cacbonhydrat 4-13%; lipit không có hoặc rất

ít [40].

Những cải tiến nhằm nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng của sản phẩm

cao nấm men đã được ghi nhận bởi các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả, đó

là của Bavisotta , John Conway đã chỉ ra rằng enzyme ngoại bào rất có hiệu quả

trong việc thủy phân nấm men, cụ thể là sử dụng enzyme proteaza trong quá trình

thủy phân sẽ rút ngắn thời gian thủy phân, nâng cao hiệu quả thủy phân, cải thiện

hương thơm và giá trị dinh dưỡng của nấm men. Nghiên cứu về phương pháp thủy

phân nấm men bằng enzyme, D.Knorr và ctv cũng đã chỉ ra rằng khi xử lý dịch

nấm men với enzyme thủy phân, cụ thể là với cặp enzyme lisozim và zymolaza ở

pH 9 thì có thể thu được hơn 70% nitơ tổng số có trong tế bào nấm men sau 90

phút [20].

Một số sáng chế nữa của Hobson [20]nhằm cải thiện hương vi của sản phẩm

men tự nhiên. Tuy nhiên ông mới chỉ nghiên cứu nồng độ chất khô của dịch mang

thủy phân, nhiêt độ, thời gian thủy phân mà không quan tâm đến chủng loại cũng

như nồng độ enzym dùng để thủy phân. Theo đó ông đã đưa ra nồng độ chất khô

thích hợp của dịch thủy phân là 12-14%.

Một nghiên cứu khác của Nolf nhằm cải thiện hương thơm và giá trị dinh

dưỡng của nấm men. Quy trình của ông đưa ra gồm phần lớn các bước chủ yếu của

quy trình sản xuất cao nấm men hiện đại. Cụ thể là: đun nóng dịch nấm men đến 45-60oC lắc đều và để tự phân trong 3 ngày sau đó chiết tách phần dịch hòa tan và

13

điều chỉnh dịch nhằm giảm độ đắng của dịch chiết xuất [20].

Một sáng chế khác là của Willstatter và Sobotka, trong quy trình này ông sử

dụng đường là yếu tố làm co nguyên sinh chất của tế bào nấm men bia. Dịch nấm

men thu được là một chất lỏng giàu vitamin, enzyme và có hương thơm giống mật

ong. Tương tự như vậy, năm 1941, Gregor và cs của ông đã sử dụng đường

saccaroza làm co nguyên sinh chất của hỗn hợp tế bào nấm men bia và nấm men

rượu, đồng thời có bổ sung thêm enzyme papain. Kết quả là ông thu được dịch chiết

nấm men có hàm lượng vitamin B cao.

Trong các nghiên cứu trên, việc kiến nghị sử dụng enzym để thủy phân nấm

men được sử dụng nhiều hơn cả.

2.4.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ nấm men

bia ở Việt Nam.

Ở Việt Nam, với tốc độ phát triển nhanh của ngành công nghiệp sản xuất bia

trong hơn 10 năm trở lại đây, đã có một lượng lớn sinh khối nấm men bia dư thừa

được tạo ra. Phần lớn lượng nấm men này được bán cùng với các chế phẩm bã bia

khác cho các hộ gia đình chăn nuôi làm thức ăn thô cho tôm, cá và các loại gia súc,

gia cầm. Tuy nhiên, việc sử dụng như vậy không những không tận dụng triệt để

nguồn dinh dưỡng quý giá có trong nấm men mà còn có thể gây ô nhiễm môi

trường, đặc biệt các hộ nuôi tôm cá. Qua tính toán thì chỉ có 17% thức ăn được

đồng hóa thành sinh khối của vật nuôi. Như vậy lượng thức ăn còn lại không được

sử dụng hết sẽ tích thành lớp bùn dưới ao hồ. Hơn nữa khi thả nấm men sống xuống

nước, tế bào nấm men vẫn tiếp tục hoạt động tạo ra các sản phẩm trao đỗi chất

không có lợi cho môi trường sinh sống của tôm cá. Về lâu dài, điều này sẽ ức chế sự

phát triển của tôm cá đồng thời gây ra sự ô nhiễm môi trường.

Nhằm khai thác có hiệu quả hơn nguồn protein trong sinh khối nấm men bia.

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng sinh khối nấm men cho

công nghiệp chế biến thực phẩm và bổ sung vào thức ăn chăn nuôi như: “Nghiên

cứu sử dụng nấm men bia trong công nghiệp chế biến thực phẩm”, đề tài đã dùng

phương pháp tự phân nấm men cho hàm lượng protein tổng 55-56% và axit amin

đạt 49%; “Nghiên cứu tận dụng phế thải bia sau quá trình lên men làm thức ăn chăn

nuôi”[11],“Chế biến nấm men từ phế phụ phẩm sản xuất bia làm nguyên liệu thức

ăn chăn nuôi” [8] “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sấy phun để thiết kế chế tạo

14

thiết bị sản xuất bột đậu nành uống liền và bột nấm men giàu protein và khoáng

chất”[7]. Các dạng chế phẩm trên có thể ở dạng bột hoặc dạng dịch, chủ yếu đều

dùng phương pháp tự phân hoặc có bổ sung enzyme Neutrase trong quá trình thủy

phân và sử dụng cả xác tế bào nấm men do vậy chất lượng sản phẩm chưa cao: hàm

lượng chất khô hòa tan thấp vì thủy phân không triệt để, sản phẩm trước sấy phun

chưa được lọc bỏ xác tế bào,… Và hiện nay các sản phẩm này không đáp ứng được

nhu cầu đòi hỏi ngày càng cao của thị trường như ngành công nghiệp dược, công

nghiệp thực phẩm và đặc biệt là công nghệ lên men, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá

trình lên men. Do vậy ngành công nghiệp lên men và một số ngành công nghiệp

khác đều phải nhập khẩu cao nấm men của nước ngoài với giá thành rất đắt …

Chính vì vậy việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ nấm men bia có

chất lượng cao để đáp ứng nhu cầu thị trường và làm hạ giá thành sản phẩm là rất

cần thiết.

2.4.5. Ứng dụng của chế phẩm giàu axit amin từ nấm men bia

2.4.5.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và chăn nuôi

Bằng phương pháp tự phân hay các phương pháp khác, tế bào nấm men có

thể bị phân hủy thành các thành phần phân tử lượng thấp hòa tan vào môi trường

nước. Dịch chiết nấm men thu được, được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau

như: làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi (lợn, gà, cá, tôm); làm thức ăn, gia vị phụ

cho người (viên súp, viên đạm); hoặc sử dụng làm thành phần dinh dưỡng nuôi vi

sinh vật.

Hội đồng quốc tế kiểm định các sản phẩm protein thủy phân đã định nghĩa

về dịch chiết nấm men như sau: “ sản phẩm này là mọt phụ gia dùng làm chất tạo

hương tự nhiên cho thực phẩm trên thế giới. Thành phần chính của nó là các axit

amin, các peptit và các polipeptit thu nhận được từ quá trình phân cắt các liên kết

pepit bởi các enzyme. Có thể bổ sung thêm muối ăn vào trong quá rình thủy phân

này. Dịch chiết này có thể để ở dạng lỏng, dạng dịch đặc, dạng bột hoặc dạng hạt”.

Chế phẩm giàu axit amin hay dịch chiết nấm men từ lâu đã được sử dụng

làm gia vị trong công nghiệp thực phẩm. Trên thị trường, sản phẩm nấm men thủy

phân được xếp vào nhóm protein thủy phân thực vật (HVP) – đó là một phụ gia

được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp gia vị sau mì chính. Sản phẩm này

được dùng làm chất tạo hương trong một số sản phẩm thực phẩm như súp, nước

15

thịt, thức ăn nhanh và các sản phẩm chế biến từ thịt. Ngoài ra còn được ứng dụng

trong ngành y dược, nó có thể làm tăng cường sức lực cho con người, tăng khả

năng chịu đựng và chống đỡ các bệnh truyền nhiễm, giảm sự mệt nhọc khi làm việc

quá sức, để điều trị một số bệnh thiếu chất dinh dưỡng hoặc phá hoại cân bằng trao

đỗi chất trong cơ thể, dùng ngăn chặn bệnh còi xương ở trẻ em,… Đây là chế phẩm

có vai trò quan trọng, không những phục vụ cho mục đích nâng cao sức khỏe của

con người mà còn là nguyên liệu thiết yếu trong ngành công nghệ sinh học[10].

2.4.5.2. Ứng dụng trong công nghiệp lên men

Chế phẩm giàu axit amin từ nấm men bia là một chế phẩm rất giàu chất bổ

dưỡng, gồm các axit amin, các peptit, các vitamin ( chủ yếu là các vitamin nhóm

B). Đây là một nguồn bổ sung nitơ và các chất kích thích lý tưởng cho môi trường

nuôi cấy vi sinh vật.

Môi trường dinh dưỡng cần thiết cho việc nuôi cấy, tích lũy, phân lập, bảo

quản giống cũng như nuôi cấy với mục đích thu nhận sản phẩm trao đổi chất có giá

trị vi sinh vật. Để sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật cần một lượng lớn các

nguyên tố C, N, H, O, P, S, Ca, Fe và một lượng nhỏ hơn các nguyên tố Mn, B, Mo,

Zn, Cu, Co, Ni,V, Cl – đây là những nguyên tố vi lượng. Do vậy, môi trường dinh

dưỡng cần phải chứa tất cả các thành phần cần thiết đối với quá trình hình thành cấu

trúc và năng lượng của tế bào, đó là nguồn cacbon, nitơ, các nguyên tố khoáng và

nguyên tố vi lượng. Tuy nhiên khả năng tổng hợp và phương thức thu nhận năng

lượng ở các dạng vi sinh vật là rất khác nhau dẫn đến nhu cầu về các chất dinh

dưỡng của chúng cũng rất khác biệt [10].

2.4.6. Triển vọng thị trường sử dụng chế phẩm giàu axit amin

Kể từ thế kỷ 19 các nhà khoa học đã phân lập được các axit amin thì các tính

chất vật lý và hóa học của axit amin đã trở thành một chủ đề được nghiên cứu rất

quan trọng, không chỉ vì giá trị của chúng như là các yếu tố cơ bản trong tất cả các

hình thức của cuộc sống, mà chúng còn quan trọng trong quá trình công nghiệp, đặc

biệt đối với thực phẩm, hóa chất, y tế, dược phẩm và mỹ phẩm các ngành công

nghiệp.

Ngoài giá trị dinh dưỡng axit amin còn có giá trị là tiền chất hương vị, mỗi

axit amin có hương vị đặc trưng trong thực phẩm cho người như vị ngọt, chua, mặn

và cay đắng. Trong dinh dưỡng động vật, axit amin được sử dụng trong các sản

16

phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc cho vật nuôi. Thị trường thế giới năm 1999

cho axit amin ước đạt hơn 1,6 triệu tấn, với khoảng 95% khối lượng của natri L-

glutamate (sử dụng như là một chất tăng cường hương vị), DL-methionine, và L-

lysine · HCl (cả hai đều được sử dụng để nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn

chăn nuôi). Năm 2003, tổng lượng tiêu thụ trên toàn thế giới hàng năm của các axit

amin được ước tính là hơn 2 triệu tấn. Khoảng 1,5 triệu tấn axit L-glutamic được

sản xuất, và thị trường axit glutamic đang tăng lên khoảng 6% mỗi năm. Các ứng

dụng của các axit amin trong thực phẩm và dược phẩm, hoặc về dinh dưỡng thức

ăn gia súc, được dự kiến sẽ tăng hơn nữa trong những năm tiếp theo [16].

Trong những thập kỷ cuối cùng những nỗ lực rất lớn đã được thực hiện để

nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất.Công nghệ sinh học sản xuất các axit

amin hôm nay phục vụ một thị trường có triển vọng mạnh mẽ để phát triển. Sự phát

triển trong 20 năm qua là do những thành công lớn trong sản xuất hiệu quả chi phí

và tinh sạch của các axit amin sản phẩm. Bốn phương pháp sản xuất cho các axít

amin (khai thác, tổng hợp, lên men và enzyme xúc tác [36]. Hơn nữa, việc thu hồi

và phân tách riêng rẽ từng axit amin cho thấy những tiến bộ kỹ thuật đáng kể.

2.4.7. Công nghệ thủy phân nấm men thu hồi axít amin tự do và protein [39]

Chế phẩm giàu axit amin là sản phẩm thu được từ quá trình thủy phân nấm

men, sau đó tế bào cô đặc tạo thành sản phẩm dạng bánh, hoặc sấy phun tạo thành

sản phẩm dạng bột. Sản phẩm dạng bột phổ biến hơn vì nó tiện dụng,sản phẩm này

hòa tan trong nước, chứa hàm lượng axit amin cao, chứa nhiều vitamin,

cacbonhydrat, nucleotit và các chất vi lượng,...Đây là sản phẩm chất lượng cao có

thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi. Quy trình nghiên

cứu và sản xuất gần giống với quy trình sản xuất cao nấm men của các nước tiên

tiến trên thế giới, do hiện nay việc phân tích axit nucleic và hàm lượng 5'(GMP) và

5'(IMP) còn nhiều hạn chế do vậy các nghiên cứu ở Việt Nam hiện nay thường là

dừng ở mức chế phẩm giàu axit amin, và chủ yếu phục vụ cho chăn nuôi. Các sản

phẩm thương mại chính từ dịch chiết nấm men: cao nấm men (yeast extract), cao

nấm men tự phân (autolysis yeast extract) và thể thủy phân nấm men (yeast

17

hydrolysate).

Nấm men bia

Làm sạch, tách nước

Sữa nấm men

Tự phân (bổ sung NaCl, forrmaldehyt...)

Thủy phân (bằng enzyme hoặc HCl)

Bã sau li tâm

Ly tâm

Thức ăn gia súc

Tinh sạch

Cô đặc

Tạo dạng sản phẩm

Hình 2.1. Sơ đồ công nghệ thủy phân nấm men thu hồi axit amin

2.5. Hiện trạng công nghệ sản xuất chế phẩm giàu -Glucan từ tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae

2.5.1. Giới thiệu chung về β – glucan

β – glucan thành tế bào nấm men là β-(1,3/1,6)-D-glucan, có cấu trúc mạch

chính là (1,3)- β-D-glucan và mạch nhánh (1,6)- β-D-glucan. Các nhánh được gắn

vào vòng glucopyranose tại C-6 của mạch chính tạo thành một cấu trúc duy nhất

(Lessage & Bussey, 2006). Các phân tử (1,3)- β-D-glucan hình thành cấu trúc

chuỗi xoắn ba (tridimension) với đặc điểm đàn hồi, đảm bảo sức mạnh của thành tế

bào nấm men và khả năng hấp thụ các chất độc. (1,6)- β-D-glucan là một cầu nối

18

(linker) giữa (1,3)- β-D-glucan, chitin và các mannoprotein đảm bảo ổn định toàn

bộ cấu trúc tế bào và là còn chứa một hỗn hợp (1,4)-α-(1,3)- β-D-glucan, đây là một

loại glycogen giống tinh bột, hòa tan trong kiềm, là một polysaccharid dự trữ năng

lượng trong tế bào chất của tế bào, khó hòa tan trong axit, chúng đôi khi mắc kẹt ở

tế bào.

Hình 2.2. Cấu trúc của β-glucan trong thành tế bào nấm men [30]

2.5.2. Ứng dụng của -glucan

2.5.2.1. Ứng dụng trong y dược

-glucan có khả năng chống ung thư: Các nhà khoa học đã khẳng định vai

trò chống ung thư, khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch của -glucan. Nhiều

nghiên cứu đã chỉ ra khả năng điều chỉnh các đáp ứng miễn dịch của -glucan thông

qua trung gian tế bào.Hiệu quả của -glucan lên chiếu xạ và hóa trị liệu: -1,3-

glucan được sử dụng cho bệnh nhân ung thư phải điều trị bằng hóa chất hoặc chiếu

xạ vì -1,3-glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hồi máu khi bị chiếu xạ ở liều

gây chết và dưới mức gây chết. -1,3-glucan cũng có thể kích thích sự phục hồi của

tủy xương sau hóa trị liệu và ngăn cản biến chứng nhiễm bệnh trong quá trình điều

19

trị [43].

Hiệu quả của -glucan lên da: -1,3-glucan còn có khả năng cảm ứng hoạt

tính của tế bào Langerhans khi bôi lên da. Tế bào Langerhans là một loại đại thực

bòa chuyên hóa nằm trên da hoạt động tương tự như đại thực bào. -1,3-glucan làm

se lỗ chân lông, giảm số lượng, độ sâu, độ dài của nếp nhăn, giảm sự khô da và

thương tổn da, ngăn ngừa lão hóa, phòng chống nhiễm khuẩn, phòng chống mụn. -

1,3-glucan có thể thêm vào kem cho mỹ phẩm, thuốc mỡ,… [18]

Hiệu quả của -glucan lên trị liệu kháng sinh: khi bổ sung -glucan vào chế

độ kháng sinh đối với động vật bị nhiễm các nguồn bệnh vi khuẩn và nấm khác

nhau (Staphylococsus aureus, E.coli, C.albicans và các loại khác) hoăc các nguồn

bệnh virus như mụn giộp (herpes) và virus viêm gan, cần một lượng kháng sinh và

kháng virut ít hơn để đối phó với sự nhiễm này [30].

Hiệu quả của -glucan lên sự thiếu hụt miễn dịch: trong các trường hợp nhất

định bị thiếu hụt (suy giảm miễn dịch) do virut (HIV) -glucan cải thiện quá trình

nhiễm bệnh trong các bệnh nhân bằng cách làm cho cơ thể tấn công trực tiếp chống

lại sự nhiễm virus hoặc ngăn cản sự phát triển của các nguồn bệnh.

Hiệu quả của -glucan lên chữa lành vết thương: hiệu quả này được đánh giá

trên một vai mô hình thí nghiệm. Phân tích mô học chỉ ra rằng vết thương nhanh

lành bởi đại thực bào đến vùng bị thương sớm hơn ở động vật không được dùng -

glucan [45]

Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng của -glucan còn phụ thuộc

vào nguồn gốc, cách tách chiết, nồng độ, mức độ phân nhánh và cách thức đưa vào

cơ thể ( màng bụng, tĩnh mạch, dưới da, theo đường miệng) sẽ cho kết quả khác

nhau ngay cả trên cùng một đối tượng.

2.5.2.2. Ứng dụng trong thực phẩm

-glucan được bổ sung vào thức ăn như một nguồn dinh dưỡng dưới dạng

sợi. Chất xơ (sợi) tự nhiên rất có lợi cho chức năng tiêu hóa, giúp chúng ngăn chặn

ung thư ruột kết, chúng đóng vai trò là chất đóng khuôn phân. Thường thì nguồn

dinh dưỡng dạng sợi có nguồn gốc từ ngũ cốc và nấm men (Saccharomyces

cerevisiae) có thành phần là các polysaccharide [43].

Để khẳng định hiệu quả của -glucan như một chất phụ gia có lợi trong thực

phẩm các nhà khoa học đã thực hiện một thí nghiệm trên chuột vì lipoprotein máu

20

của chuột giống người. Chuột được nuôi bằng thức ăn có hàm lượng cholesterol cao

sau một thời gian nhất định thì lại cho ăn cám yến mạch, cám lúa mì hoặc glucan từ

thành tế bào nấm men. Kết quả nhận thấy hàm lượng cholesterol giảm hẳn. Có một

vài cơ chế đã được đưa ra để giải thích cho khả năng làm giảm cholesterol của -

glucan. Cơ chế này liên quan đến việc giảm hấp thụ ở cả cholesterol và axit mật

bằng việc liên kết với -glucan[33].

2.5.3. Các phương pháp thu hồi, tách chiết, tinh sạch  - glucan từ nấm men

2.5.3.1. Các phương pháp thu hồi, tách chiết  - glucan từ nấm men

β-glucan chiết tách từ nấm men Saccharomyces cerevisiae bao gồm từ 2

bước như sau:

- Bước 1: Thủy phân tế bào nấm men thủy phân, thu phần tế bào không tan

từ cytoplasm

- Bước 2: Phần tế bào không tan đem chiết tách thu β-glucan

Thông thường thủy phân tế bào nấm men sử dụng phương pháp: hóa học, vật

lý và enzyme:

- Phương pháp hóa học: Sử dụng NaOH, HCl, axit acetic, axit citric các hóa

chất này được sử dụng phần lớn trong các nghiên cứu cũng như các ứng dụng trong

quy mô sản xuất công nghiệp. Thông thường sử dụng hóa chất kết hợp với nhiệt độ cao khoảng 90-1000C [42].Phương pháp sử dụng hóa chất gây ô nhiễm môi trường,

độ tinh sạch của sản phẩm β-glucan không cao.

- Phương pháp vật lý: Phá vỡ thành tế bào bằng siêu âm hoặc nghiền bi, đồng

hóa ở áp suất cao [18]. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp này thấp.

- Phương pháp sử dụng enzyme: Tự phân bằng các enzyme có sẵn trong nấm

men hoặc bổ sung enzyme protease thương phẩm. Phương pháp này thân thiện với

môi trường, an toàn, hiệu suất thu hồi cao[17].

2.5.3.2. Các phương pháp tinh sạch  - glucan từ nấm men

Tinh sạch β-glucan là một trong những khâu rất quan trọng có thể thu được

sản phẩm có độ tinh khiết cao. Các tác giả đã chứng minh được sản phẩm β-glucan

có độ tinh khiết cao dễ dàng hấp thụ và tiêu hóa.

Với công nghệ hiện nay có thể sản xuất β-glucan có độ tinh khiết cao lên tới

98.5%, mannan <0.1%, 0.4% α-glucan, 0.3% protein, 0.2% chitin [35].Tinh sạch β-

21

glucan có thể sử dụng phương pháp hóa học hoặc phương pháp enzyme:

* Phương pháp enzyme[35]:

- Thành tế bào thu được giữ trong môi trường kiềm pH=9-10 bổ sung

enzyme protease để loại bỏ mannan.

- Tách các pha bằng phương pháp vật lý, sử dụng ly tâm và rửa.

- Bước tiếp theo sử dụng enzyme glucoseamylase hoặc lipase để thủy phân

lipid từ màng tế bào.

- Bước cuối cùng tạo dạng sản phẩm bột β-glucan thu được có mầu trắng đến

mầu nâu sẫm, không có hương vị.

* Phương pháp hóa học[51]: -Thành tế bào thu được thủy phân bằng NaOH 1M ở nhiệt độ 900C trong 2

giờ. Ly tâm thu cặn, rửa bằng nước cất 3 lần.

- Cặn thu được bổ dung axit H3PO4, nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Ly tâm thu

cặn, rửa bằng nước cất 3 lần.

- Cặn thu được xử lý loại bỏ mannaprotein bằng bổ sung dung dịch đệm citrate pH=7, hấp 1210C, thời gian 90 phút. Ly tâm thu cặn, rửa bằng nước cất 3 lần.

- Tạo dạng sản phẩm bằng sấy đông khô, sấy phun hoặc sấy đối lưu.

2.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới giá thành của chế phẩm -glucan

- Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu: Các nhà máy sản xuất bia xa nơi sản

xuất chế phẩm -glucan, ảnh hưởng tới giá thành không nhỏ. Thông thường giá

nấm men tại nhà máy là 1000 đ/kg, do công vận chuyển giá thành giao động từ

3.000-5.000đ/kg.

- Ảnh hưởng của quy trình sản xuất: Quy trình sản xuất -glucan sử dụng phương

pháp hóa học (kiềm hóa) giá thành thấp nhất, do giá hóa chất thấp. Nếu quy trình

sản xuất -glucan sử dụng phương pháp enzyme, giá thành cao hơn nhiều lần do giá

enzyme cao, hiệu suất thu hồi cao hơn, giảm ô nhiễm môi trường.

- Ảnh hưởng của quá trình tạo sản phẩm: Tạo sản phẩm theo phương pháp sấy

đối lưu, giá thành thấp hơn, chất lượng sản phẩm không cao, thời gian bảo quản

ngắn. Tạo sản phẩm theo phương pháp sấy phun hiệu suất thu hồi cao, chất lượng

sản phẩm tốt, thời gian bảo quan dài hơn, chi phí cho sấy cao hơn.

22

.

PHẦN III. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀPHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

3.1.1. Nguyên vật liệu

- Nấm men bia Saccharomyces cereviasia được thu nhận từ xưởng bia của

Trung tâm sản xuất thực nghiệm&chuyển giao công nghệ – Viện công nghệ thực

phẩm.

- Bã nấm men bia thu hồi tại Xưởng bia Viện Công nghiệp thực phẩm.

3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

3.1.2.1. Hóa chất:

- K2SO4, NaOH 30%, H2SO4 đậm đặc, CuSO4, HCl, H2SO4 0,1N

- Các loại enzyme sử dụng: Neutrase; Alcalase; Flavourzyme

3.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị:

- Bể cách thủy Memmert- Đức

- Nồi hấp áp lực TOMMY – Nhật Bản

- Máy so màu – Mỹ

- Cân phân tích Pessia – Thụy Sĩ

- Cân kỹ thuật – Trung Quốc

- Tủ ấm – Trung Quốc

- Chiết quang kế – Đức

- Máy đo pH – Nhật Bản

- Cân phân tích hàm ẩm – Thụy Sĩ

- Các dụng cụ thí nghiệm đơn giản của phòng thí nghiệm

3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford

Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp

có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1µg.

 Nguyên tắc:

- Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc

nhuộm Coomassie Brillant Blue tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang

tính axit khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu tím nhạt có bước

23

sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển

sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm.

Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung

dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc

nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch

bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta được OD độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với

lượng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (OD). Lấy giá trị ∆OD

= OD

- Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào

đường chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương

ứng trên trục hoành.

 Hóa chất:

Dung dịch albumine 0.1%, nước cất.

Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như

sau:Coomassie Brilliant Blue: 0.001g ; Ethanol tuyệt đối: 4.7 g; Phosphoric axit:

85%

3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số (theo phương pháp

Kjeldahl)

Nguyên lý

Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm

mạnh (NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do.

Định lượng NH3 bằng H2SO4 0,1N.

Tiến hành

- Đốt đạm: Cho 1g mẫu, 5g chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) và 10ml H2SO4

đậm đặc vào bình Kjeldahl và đun trên bếp từ từ cho đến khi thu được dung dịch

trong suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4 để nguội.

Chú ý: Quá trình vô cơ hóa mẫu trong bình Kjelhdahl giải phóng khí SO2

nên phải tiến hành trong tử hút.

Trong quá trình đốt nên đặt bình nằm hơi nghiêng trên bếp.

- Cất đạm: Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho một ít nước cất vào bình

24

Kjeldahl để tráng rồi cho vào bình định mức 500ml, tráng rửa bình Kjeldahl và

phễu vài lần rồi cho vào bình định mức và cho khoảng 10÷15ml NaOH 40% và vài

giọt phenolphtalein vào bình định mức, sau đó thêm nước cất vừa đủ 300ml.

Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3: dùng pipet cho vào bình hứng khoảng

10ml axit Boric, sau đó lắp vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung

dịch axit Boric. Bắt đầu quá trình cất đạm cho đến khi dung dịch trong bình hứng

đạt khoảng 150ml.

- Chuẩn độ: Lấy bình hứng ra và đem đi chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N.

, × (’ × ×,)

*Tính kết quả

Hàm lượng protein thô =

3.2.3. Phân tích độ hòa tan

Sử dụng thiết bị đo Bx đo độ hòa tan của dung dịch chất tan

3.2.4. Đánh giá chất lượng nguyên liệu

Xử lý bã nấm men bia

Nguyên liệu nấm men sau khi đưa về được xác định hàm lượng ẩm rồi đem

đi lọc, rây để loại bớt nước trước khi tách đắng. Sau khi rửa bằng nước lạnh (5ᴼC),

được ly tâm tách nước, rồi tiến hành phân tích các thành phẩm cơ bản của nấm men

( hàm ẩm, protein, hydratcacbon, hàm lượng đắng,…)

3.2.5. Xác định hàm lượng chất đắng (bằng phương pháp so màu)

Xử lý chất đắng của nấm men sau khi thủy phân

Nguyên liệu nấm men đưa về được rửa với nước rửa có giá trị pH khác nhau

ở nhiệt độ lạnh (5ᴼC). Quá trình rửa nấm men được lặp lại nhiều lần. Sau đó đem ly

tâm tách nước. Nấm men thu được sau mỗi lần rửa được tiến hành phân tích hàm

lượng đắng.

a/ Nguyên tắc:

 Chất đắng có trong bia hoặc trong nấm men bia do -axit đắng tạo thành từ

hoa houblon.

 Chiết chất đắng ra khỏi bia hoặc nấm men bia bằng dung môi hữu cơ

(Iso-octan), đo độ hấp phụ ở bước sóng 275nm

b/Cách tiến hành:

Cân 3-5 gam mẫu (tùy theo từng loại mẫu) cho vào ống ly tâm dung tích

25

50ml, sau đó them 20ml dung môi Iso-octan. Lắc đều 10 phút. Tiến hành ly tâm 10

phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, rồi lọc qua giấy lọc. Lấy phần dung dịch đã lọc đem

đo ở bước sóng 275nm. Làm mẫu trắng tương tự, chỉ thay mẫu bằng nước cất.

c/ Cách tính: Độ đắng= ((A₁ - A₂) x 50)/m

Trong đó : A1: giá trị đo của mẫu thí nghiệm ở bước sóng 275nm

A2 : Giá trị đo của mẫu trắng ở bước sóng 275nm

m: Trọng lượng mẫu phân tích (g)

50: Hệ số chuyển đổi Iso- octan sang chất đắng

3.2.6. Xác định pH của bã nấm men bằng máy đo pH

Sử dụng máy đo pH để xác định pH của bã nấm men bia.

3.2.7. Phân tích độ ẩm nấm men

Nấm men sau khi rửa và ly tâm được xác định độ ẩm bằng máy cân hàm ẩm

của Thủy Sĩ theo nguyên lý xác định trọng lượng không đổi sau quá trình sấy

105oC.

3.2.8. Phương pháp xác định nồng độ protein tổng

* Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo mầu giữa protein với dung dịch

mầu huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin - BSA). Cường độ mầu tỷ lệ thuận với

nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung

dịch protein nghiên cứu với dung dịch mầu BSA từ đó dựa theo đường chuẩn của

protein tinh khiết với thuốc thử này, tính được hàm lượng protein nghiên cứu.

* Tiến hành:

Hàm lượng protein đã được xác định bằng phương pháp của Bradford

(1976). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 100l của enzym và 900l dung dịch

Bradford, lắc đều, để sau 5 phút thì đem đo ở bước sóng 595nm bằng máy so mầu

điện quang.

Nồng độ protein có trong mẫu được tính toán dựa trên phương trình đường

chuẩn BSA - Bradford.

Đường chuẩn BSA - Bradford được xác định bằng cách sử dụng và pha

loãng dung dịch BSA theo các nồng độ khác nhau, sau đó tiến hành làm phản ứng

giống như làm với các mẫu.

3.2.9. Phương pháp xác định axit amin tổng bằng phản ứng Ninhydrin

26

Chuẩn bị hóa chất:

-Dung dịch Ninhydrin: 500 mg Ninhydrin được hòa tan trong 10 ml cồn

tuyệt đối.

-Dung dịch phenol 80%: 80 gam thuốc thử phenol hòa tan trong 20 ml cồn

tuyệt đối, lắc nhẹ, để lắng sau 20 phút chiết lớp trên thu dung dịch phenol

-Thuốc thử KCN-pyridin: 2 ml 0,01M KCN được pha loãng đến 100 ml bằng

pyridin ammonia

-Ethanol 60%

Phản ứng:

Phản ứng gồm 0,5 ml dung dịch axit amin, 1ml thuốc thử KCN-pyridine và 1ml dung dịch phenol 80% trong bể ổn nhiệt 1000C. Sau khi đạt được nhiệt độ sôi

bổ sung tiếpdung dịch Ninhydrin, đậy kín ống. Phản ứng xảy ra trong 5 phút, sau đó

làm lạnh nhanh và bổ sung10ml Ethanol 60%. Đo độ hấp phụ mầu với dung dịch

Ninhydrin ở bước sóng 570nm.Dựng đường cong chuẩn xác định hàm lượng axit

amin tổng.

3.2.10. Phương pháp thu thành tế bào

Phương pháp: cho dịch lên men ly tâm 6000v/phút, trong 20 phút, rửa 2 lần

bằng đệm citrat photphat, pH = 5,5. Hoà cặn tế bào trong 1 lít 4% NaOH, đun nóng đến 1000C, khuấy mạnh trong 1 giờ. Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 1 lít nước

lạnh để dừng phản ứng. Ly tâm 4000 v/phút trong 15 phút.Thu cặn (thành tế bào) và bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng.

3.2.11. Tinh sạch axit amin bằng phương pháp trao đổi ion

- Dùng hai loại hạt trao đổi ion là cation và anion. Mỗi loại hạt ion được nhồi

vào một cột trao đổi ion là cột inox tự chế có kích thước 10x120cm. Hai cột được

nối liên tiếp với nhau bằng ống nhựa. dịch sử lý sẽ qua cột cation trước, sau đó qua

cột anion.

- Lượng hạt ion Dowex-50W nhồi vào mỗi cột là 5,6 kg, chiếm 3/4 thể tích

của cột.

- Xử lý hạt trao đổi ion trước khi sử dụng

+ Đối với hạt cation: trước khi sử dụng, hạt cation được ngâm trương nở

trong dung dịch NaOH 5 % trong thời gian 3- 4 giờ. Gạn dung dịch kiềm ra và rửa

27

lại bằng nước cất đến sạch kiềm rồi dùng dung dịch HCl nồng độ từ 5 đến 15 % rửa

tiếp theo thứ tự 5 thể tích HCl 5 %; 5 thể tích 10 % và 5 thể tích 15 %. Sau đó dùng

nước cất rửa đến trung hoà.

+ Đối với hạt anion: Anionit sau khi trương nở trong NaCl bão hoà được rửa

tiếp bằng dung dịch HCl 2 % rồi rửa với NaOH 4 % và nước cất đến trung hoà.

3.2.12. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo theo Lecoq (1965)

2 gam mầu bổ sung 50 ml HCl 4N gia nhiệt hồi lưu ở 1000C trong 1 giờ.

Làm lạnh, lọc bỏ dịch, cặn được hòa tan bằng petrolium ether, lọc thu dung môi.

Thu dầu sau khi cho bay hơi hết dung môi, cân thu chất béo.

3.2.13. Phương pháp tách chiết -glucan tổng số

Phương pháp 1: -glucan được thu hồi theo phương pháp dùng kiềm của

Williams.

Phương pháp 2: -glucan được thu hồi theo phương pháp kiềm-axit của

Williams và Hunter.

Phương pháp 3: -glucan được thu hồi theo phương pháp enzyme của

Freimund, Porchalearn và Liu.

3.2.14. Phương pháp xác định hàm lượng -glucan (theo phương pháp McCleary

và Glennie-Holmes (1985)

Sử dụng kit phân tích -glucan bằng enzyme của công ty Megazyme

International Ireland Ltd, Wicklow, Ireland.

Bộ Kit phân tích bao gồm 5 loại dung dịch, phân tích được khoảng 100 mẫu.

- Chai dung dịch 1: Lichenase [specific, endo-(1-3)(1-4)-β-D-glucan 4-

glucanohydrolase], dung tích 1 mL. Pha loãng V=20 ml trong buffer sodium phosphat 20mM, pH=6.5, giữ ở -200C.

- Chai dung dịch 2: β-Glucosidase dung tích 1 mL. Pha loãng V=20 ml trong

buffer sodium acetate 50mM, pH= 4.0, giữ ở -200C.

- Chai dung dịch 3: GOPOD Buffer cho phản ứng. Buffer (48 mL, pH=7.4),

p-hydroxybenzoic axit và sodium azide (0.4 % w/v). Pha loãng bằng nước cất thành

1lít dung dịch, dung dịch sử dụng ngay.

-Chai4: GOPOD Enzymes. Glucose oxidase plus peroxidase, 4-

aminoantipyrine. Dạng bột

- Chai dung dịch 5: Dung dịch D-Glucose chuẩn (5 mL, 1.0 mg/mL) trong

28

0.2 % benzoic axit (w/v)

Mẫu chứa -glucan hòa tan trong HCL đậm đặc, sau đó thủy phân có gia nhiệt hồi lưu mẫu trong dung dịch HCl 1.3 N ở 1000C trong 1 giờ. Sau đó bổ sung

10ml KOH 2N, chuyển toàn bộ mẫu vào bình định mức 100 ml, bổ sung buffer

sodium acetate pH=5 chỉnh đến vạch định mức. Dịch đem lọc qua màng lọc

Whaterman GF/A trước khi dịch bị chuyển mầu. Thủy phân D-glucose bằng endo-

1,3--glucanase (20 U/ml) và -glucosidase (4 U/ml) ở 400C trong 60 phút. Kết

thúc, bổ sung 3ml gluco oxidase/peoxidase vào dịch huyền phù phía trên, giữ 400C

trong 20 phút. Dịch đo tại bước sóng 510 nm, trên máy UV-vis. Dung dịch blank

0.2ml buffer sodium acetate pH=5 có bổ sung 3ml gluco oxidase/peoxidase. -

glucan tổng được xác định ở cả phẩn cặn và phần dịch thủy phân tế bào.

3.2.15. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo

Phân tích theo TCVN4331:2009

Lipid là este phức tạp của rượu bậc 3 glyerin và axit béo caocaps (axit

panmitic, stearic, oleic, linoleic…)

Xác định lipid dựa vào tính chất đa số chất lipid đều hoà tan trong các dung

môi hữu cơ như ete etylic, cacbon disunfua, ete petrol…Dung môi nào có nhiệt độ

sôi thấp và tỷ trọng càng nhỏ thì hoà tan và chiết lipid ra khỏi thực phẩm càng

nhanh và càng dễ làm bốc hơi đi. Trong phòng thí nghiệm hay dùng ete petrol. Các

ete này hoà tan nhanh các lipid như axit béo, phosphtit, sáp, các rượu béo, andehyt,

xeton, các chất màu…

Hỗn hợp các chất béo được chiết bằng ete etylic gọi là béo thô, thành phần

béo thô chiết được phụ thuộc vào dung môi dùng vì độ tan của các chất béo khác

nhau trong mỗi loại dung môi là không giống nhau.

Chất béo thô được xác định theo phương pháp trực tiếp là chiết bởi dung

môi. Một trong những ohương pháp trực tiếp xác định chất béo chính xác nhất là

chiết bằng máy Soxhlet.

Nguyên tắc: Dựa vào tính chất các dung môi hữu cơ có khả năng hoà tan và

rút được chất béo ra khỏi mẫu phân tích. Sau khi tách được chất béo, đun đuổi dung

môi ra khỏi chất béo và sấy khô chất béo đến trọng lượng không đổi.

Tiến hành: Cân 5 g mẫu cho vào bầu chiết của máy chiết Soxhlet chiết ở 700C, trong 6-8giờ. Chuyển dung môi đã chiết béo sang bình cầu sau đó cất đuổi

29

dung môi, cân cốc, tìm ra lượng chất béo.

Cách tính

× 100 Chất béo % =

G1: Trọng lượng cốc chứa mẫu, g

G2: Trọng lượng cốc chứa chất béo, g

G: Trọng lượng mẫu, g

3.2.16. Phương pháp xây dựng công thức và đánh giá lý thuyết năng lượng của

sản phẩm

Sử dụng các bảng để tính toán lượng lương thực, thực phẩm có trong công

thức; dựa vào bảng để tính ra các chất dinh dưỡng của công thức dự kiến. Tiến hành

theo các bước đánh giá khẩu phần như sau:

Bước 1. Tính thành phần các chất dinh dưỡng trong khẩu phần: Dựa vào "Bảng

thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam" để tính: Thành phần các chất dinh

dưỡng trong mỗi loại thực phẩm được tính theo công thức:

- Tính toán các loại thực phẩm khác rồi đưa kết quả tính được vào bảng sau

Bảng 3.1. Bảng tính toán các loại thực phẩm khác

Các chất sinh năng lượng Năng lượng (Kcal) TT Tênthực phẩm Protid Lipid Glucid

ĐV TV ĐV TV

* Tính tỉ lệ cân đối giữa các chất dinh dưỡng

- Cân đối giữa các chất sinh năng lượng

Số gam protid x 4 x 100 Calo chung

30

+ Tỷ lệ % năng lượng do protid cung cấp =

ố

+ Tỷ lệ % năng lượng do lipid cung cấp =

ố

+ Tỷ lệ % năng lượng do glucid cung cấp =

- Cân đối trong bản thân các chất sinh năng lượng

ố độ ậ

ố ự ậ

+ Tỷ lệ % protid động vật/protid chung =

+ Tỷ lệ % lipid thực vật/lipid chung =

Bước 2: Đánh giá lý thuyết khẩu phần

Bảng 3.2. Đánh giá lý thuyết khẩu phần

Kết quả Đánh giá STT 1

2 Các chỉ số dinh dưỡng Tỷ lệ % năng lượng do Protid Lipid Glucid Tỷ lệ P động vật/ P chung

3 Tỷ lệ L thực vật/ L chung

Bước 3: Đánh giá mức đáp ứng nhu cầu

ế ả ầ đề ị

+ Mức đáp ứng nhu cầu đề nghị (%) =

Bảng 3.3. Đánh giá mức đáp ứng nhu cầu

Chấtdinh dưỡng Năng lượng Protid Vitamin Chất khoáng

Kết quả tính toán

Nhu cầu đề nghị

31

Mức đáp ứng nhu cầu

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện thủy phân nấm men bia để sản xuất axit

amin và –glucan

4.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tự phân nấm men

Các yếu tố ảnh hưởng đến tự phân nấm men bao gồm tỷ lệ nấm men/ dung

môi, nhiệt độ, pH và thời gian tự phân do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh

hưởng của các yếu tố trên tới sự thủy phân nấm men.

4.1.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ nồng độ % nấm men

Thực hiện quá trình tự phân với tỉ lệ nấm men/dung môi (w/w) thay đổi từ

10%, 12%, 14%, 16%, 18% và nồng độ chất khô được xác định ở mẫu ban đầu có

nồng độ chất khô là 20%. Để ổn định giá trị pH trong quá trình tự phân, dung môi

được chọn là nước muối 0,9%. Trong các mẫu thí nghiệm này, nhiệt độ, pH ban đầu và thời gian tự phân lần lượt là 32 0 C; 5,0 và 72 giờ. Kết quả được trình bày trong

bảng 4.1.

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến hiệu suất thủy phân

Protein tổng (g/l) Hiệu suất thủy phân (%) Mẫu

Đ/C 13,9 20,1

18% 14.3 22,4

16% 14,9 23,1

14% 16,3 23.8

12% 15,8 24,0

10% 16,0 24,0

Nhìn vào bảng kết quả trên ta thấy ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tự

phân của tế bào nấm men có sự thay đổi, tuy hiệu suất của quá trình tự phân là

không cao so với các tác nhân thủy phân khác như sử dụng enzyme, axit, bazơ để

thủy phân. Do vậy với nồng độ nấm men tự phân 14% thì hiệu suất thủy phân thu

được là cao nhất cùng với hàm lượng protein tổng thu. Như vậy chúng tôi chọn

32

nồng độ pha loãng dịch nấm men tự phân là 14% cho các nghiên cứu tiếp theo.

4.1.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ tự phân

Tiếp theo, chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tự phân đến hàm

lượng protein, hàm lượng nitơ tổng thu được. Bốn giá trị nhiệt độ được khảo sát là 30, 40, 50 và 60oC. Sinh khối nấm men được đưa về tỷ lệ 16% chất tan, thời gian tự

phân được chọn là 50 giờ. Quá trình tự phân liên quan đến giải phóng các enzyme

trong nấm men để phá vỡ các protein nấm men. Các protein trong nấm men bia

được thủy phân càng nhiều thì khả năng thu được hàm lượng axit amin

cao. Tangluer và Erten (2008) phát hiện ra rằng 50°C trong 94 giờ là lý tưởng cho

quá trình tự phân. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.2:

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân

Protein tổng (g/l) Hiệu suất thủy phân (%)

18.9 24,0

19,1 24,4

21,1 24,9

Mẫu 300 C 400 C 500 C 600 C 20,3 25,5

Kết quả thực nghiệm trong bảng 4.2 cho thấy khi ta tăng nhiệt độ tự phân từ 30 đến 60 0C hàm lượng protein tổng thu được trong dịch tự phân cũng tăng dần và đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 50 oC do ở nhiệt độ này enzyme nội sinh trong tế bào nấm men hoạt động mạnh. Khi nhiệt độ tự phân nấm men tăng đến 60oC, hàm

lượng protein giảm. Có lẽ khi nhiệt độ của quá trình tự phân quá cao sẽ làm vô hoạt

các enzyme tự phân. Như vậy, nhiệt độ thích hợp để tự phân bã nấm men bia là 50oC.

4.1.1.3. pH ban đầu của mẫu nấm men tự phân

Tương tự như nhiệt độ, pH cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình

tự phân ảnh hưởng trực tiếp đến các enzyme nội sinh trong tế bào nấm men, do đó

ảnh hưởng đến mức độ phá vỡ màng tế bào nấm men và khả năng giải phóng các

enzyme tự phân từ lớp không gian chu chất ra bên ngoài tế bào. Chúng tôi thay đổi

giá trị pH ban đầu của mẫu nấm men tự phân từ 2,0 đến 7,0 bằng cách sử dụng dung

dịch đệm acetate. Mẫu đối chứng sử dụng nước cất là dung môi (Sau khi phối trộn

sinh khối nấm men với nước cất theo tỉ lệ qui định, pH ban đầu của mẫu đối chứng

33

là 6,3). Các thông số khác của quá trình tự phân được giữ cố định: tỉ lệ % nấm men

14%, nhiệt độ tự phân: 500C, thời gian tự phân: 50 giờ kết quả thí nghiệm được

trình bày ở bảng 4.3.

Bảng 4.3: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thủy phân

Protein tổng (g/l) Hiệu suất thủy phân (%) pH

2,0 6,41 9,8

3,0 11,7 16,1

4,0 13,8 17,3

4,5 15,4 20,4

5,0 20,3 25,5

5,5 25,5 26,9

6,0 33,7 33,1

6,5 25,2 27,0

7,0 25,4 27,3

Theo kết quả ở bảng 4.3, ở pH 2,0 và 3,0 chúng tôi thấy hiệu suất thủy phân

protein rất thấp. Có lẽ, giá trị pH quá thấp đã ức chế hoạt tính các enzyme tự phân.

Trong khoảng pH tự phân từ 3,0 đến 6,0 hiệu suất thủy phân tăng dần và kèm theo

hàm lượng protein cũng tăng theo, tỷ lệ thuận với hiệu suất thủy phân trong mẫu.

Hiệu suất thủy phân đạt giá trị cực đại là 33,1% hàm lượng protein đạt giá trị 33,7g/

100g mẫu ở pH tự phân là 6,0. Có lẽ giá trị 6,0 là pH tối thích cho hoạt động của

các enzyme tự phân trong nấm men để giải phóng các enzyme nội sinh ra bên ngoài

tế bào. Ở khoảng pH 6,5 – 7,0, hiệu suất tự phân nấm men tăng không đáng kể do

vậy chúng tôi xác định với pH=6,0 là pH tối ưu cho quá trình tự phân

4.1.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tự phân

Trong thực tế sản xuất, thời gian tự phân là một yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến chi phí năng lượng của quá trình và năng suất hoạt động của thiết bị tự

phân. Chúng tôi tiến hành tự phân nấm men với thời gian tự phân thay đổi từ 24 đến

144 giờ. Các thông số kỹ thuật khác được chọn từ các kết quả trên: tỉ lệ nấm men 14% , nhiệt độ và pH tự phân lần lượt là 50 0C và 6,0. Kết quả được thể hiện ở hình

34

4.1

38

4.6

37

)

%

36

4.1

35

3.6

34

3.1

33

2.6

32

i

( n â h p y ủ h t t ấ u s u ệ H

2.1

Hiệu suất thủy phân Hàm lượng Protein

31

30

1.6

20

40

60

80

100

120

140

160

Thời gian thủy phân (giờ)

Hình 4.1. Ảnh hưởng của thời gian tự phân từ bã nấm men bia

Từ kết quả trên hình trên, ta nhận thấy trong khoảng thời gian đầu của quá

trình tự phân, thu hàm lượng protein 35,5 g/100g và lượng nitơ tổng tăng nhanh

7,20g/lít sau 90 giờ tự phân đầu tiên. Nếu ta kéo dài thêm thời gian tự phân, hiệu

quả thủy phân vẫn tiếp tục tăng nhưng lượng đạm nitơ amin của quá trình tự phân

tạo ra nhiều. Do vậy chúng tôi xác định thời gian tự phân cho nấm men đạt hiệu quả

cao là 90 giờ.

4.1.2. Ảnh hưởng của phương pháp hóa lý đến quá trình thủy phân

4.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tác nhân hóa lý đến quá trình thủy phân.

Theo các tài liệu nghiên cứu cho thấy dùng HCl có nhiều ưu điểm hơn so với

các axit khác hay bazơ khác vì khi thủy phân bằng HCl sẽ cho ra sản phẩm có màu

sắc tươi đẹp, đạm thối ít và ít tổn thất axit amin. Do vậy chúng tôi tiến hành lựa

chọn HCL làm tác nhân thủy phân và khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng axít HCl

đậm đặc lên hiệu quả của quá trình thủy phân. Thí nghiệm này sử dụng nguyên liệu

là dung dịch nấm men sau khi tự phân Trong đó: Yếu tố cố định

- Nhiệt độ thủy phân, 80oC.

- Thời gian thủy phân 8h.

-Yếu tố thay đổi - Hàm lượng HCl đậm đặc dùng để thủy phân nấm men: 4

%, 6 %, 8%.

Hàm lượng HCl đậm đặc có vai trò hết sức quan trọng ảnh hưởng lên hiệu

quả thủy phân, thời gian thủy phân, chất lượng và giá thành sản phẩm. Đây chính là

ý nghĩa của việc cần phải khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng HCl đậm đặc lên hiệu

35

quả thủy phân nấm men. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 4.4.

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của hàm lượng HCl đậm đặc lên hiệu quả của quá trình thủy phân

Hàm lượng HCl đậm đặc (%) Protein tổng (g/l) Hiệu suất thủy phân (%)

4% 27,5 33,5

6% 29,7 36,8

8% 29,2 35,1

Dựa vào bảng 4.4, chúng tôi thấy ở hàm lượng axit 4 % lượng phân tử HCl

quá ít để cắt đứt các liên kết peptide nên đạm tổng thu được là thấp. Khi nâng hàm

lượng axit đến mức vừa đủ để axit cắt đứt hết các liên kết peptide, protein sẽ tiến

hành thủy phân thành axit amin. Nhưng nếu tiếp tục tăng hàm lượng HCl đậm đặc

lên thì HCl dư, và lượng dư này dezamine hóa lượng amine vừa mới tạo ra, tạo

thành các sản phẩm khác dẫn đến thất thoát đạm. Vì vậy nếu ta tiếp tục tăng hàm

lượng axit thì hàm lượng đạm sẽ giảm giảm xuống còn 29,2 g/l do vậy chúng tôi lựa

chọn nồng độ HCl 6% làm các nghiên cứu tiếp theo.

4.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân lên hiệu quả

của quá trình thủy phân

Các yếu tố nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân nhiệt độ

và thời gian thủy phân không thích hợp thì cho hiệu quả thủy phân rất kém. Do vậy

trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thử ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân. Kết

quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.5:

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân bằng tác nhân HCl

Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) Protein tổng (g/l) Hiệu suất thủy phân (%)

6h 25,5 25,5 40

8h 29,6 25,7

10h 31,2 36,8

12h 35,4 39,1

6h 37,4 42,5 50

8h 40,6 45,1

10h 38,9 43,7

36

12h 38,2 43,4

60 6h 37,0 42,2

8h 37,6 42,8

10h 36,9 39,9

12h 33,7 37,0

Qua kết quả ở bảng 4.5 chúng tôi nhận thấy hàm lượng đạm tổng số thay đổi

theo nhiệt độ và thời gian thủy phân. Nhiệt độ thủy phân thấp và thời gian thủy

phân ngắn sẽ không đủ thời gian cho các phân tử HCl cắt đứt hết các liên kết

peptide nên sẽ tạo thành đạm tổng số còn rất thấp. Hay ngược lại, nhiệt độ thủy

phân cao và thời gian thủy phân càng kéo dài thì lượng đạm tổng số cũng sẽ thấp là do có hiện tượng dezamine hóa gây thất thoát đạm. Ở nhiệt độ 40 0C – nhiệt độ thủy

phân thấp, protein tổng số tăng liên tục từ 6 h đến 12 h (25,5g/l đến 35,4g/l) và sẽ có thể tiếp tục tăng ở thời gian sau đó. Ở nhiệt độ 60 0C – nhiệt độ thủy phân cao,

đạm tổng số giảm liên tục từ 6 h đến 12 h (37,0 g/l đến 33,7 g/l). Chỉ có ở nhiệt độ 50 oC là thấy được quá trình thủy phân xảy ra triệt để nhất. Hàm lượng đạm tổng số

đạt cao nhất vào lúc 8 h (45,6 g/l) và giảm dần ở thời gian sau đó.

4.1.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bằng phương pháp sử dụng

enzyme

4.1.3.1.Lựa chọn enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân nấm men.

Sau khi nấm men đã được rửa sạch, loại bỏ chất lắng, tiến hành khảo sát ảnh

hưởng của từng loại enzyme và kết hợp các loại enzyme với nhau trong quá trình

thủy phân tới hiệu suất thủy phân của nấm men bia.

Điều kiện thí nghiệm:

- Mỗi mẫu thí nghiệm là 100ml dịch nấm men

- Nồng độ cơ chất (nấm men khô): 14%

- pH của dịch nấm men 5,5

- Nhiệt độ thủy phân là 55ᴼC

- Thời gian thủy phân 24h

37

Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.6

Bảng 4.6: Nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân nấm men

Mẫu Nồng độ Dịch sau Chất hòa Protein tổng Hiệu suất

enzyme (%) ly tâm tan (ᴼBx) (g/l)(g/l)) thủy phân

(ml) (%)

Đ/C 0 72 8,9 40,6 40,1

N 0,2 73 9,1 42,6 42,0

A 0,2 74 9,5 43,9 44,3

F 0,2 74 9,6 44,2 44,8

N+A 0,1+0,1 74 9,8 45,4 45,5

N+F 0,1+0,1 74 9,9 46,8 45,8

A+F 0,1+0,1 75 10,2 47,4 47,9

75 10,3 47,0 48,2 N+A+F 0,1+0,1+0,1

(Chú thích : N= Neutrase; A=Alcalase; F=Flavourzyme)

Qua bảng trên cho thấy:Khi thủy phân với từng loại enzyme thì enzyme: (A)

và (F) cho hiệu suất thủy phân gần tương đương nhau và cao nhất. Nhưng khi kết

hợp các loại enzyme với nhau để thủy phân nấm men thì thấy khi kết hợp 2 loại

enzyme: (A) + (F) cho hiệu suất thủy phân cao gần tương tương với khi kết hợp 3

loại enzyme và cao hơn hẳn khi dung 1 loại enzyme. Vì vậy ta chọn kết hợp 2 loại

enzyme: (A) + (F) để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

4.1.3.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp của enzyme thủy phân nấm men

a. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thủy phân nấm men bia

Như chúng ta đã biết nồng độ enzyme phụ thuộc vào từng loại cơ chất, trong thí

nghiệm này đầu tiên ta cố định nồng độ enzyme (F) là 0,1% và nồng độ enzyme của

(A) biến đổi từ 0,1 – 0,5%. Sau khi tìm được nồng độ thích hợp của enzyme (A) thì

cố định nồng độ enzyme này và lại cho nồng độ của enzyme (F) biến đổi từ 0,2-

38

0,5%. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thủy phân nấm men

Dịch Chất Hiệu suất Nồng độ enzyme (%) Protein STT sau ly hòa tan thủy phân tổng (g/l) A F tâm (ml) (ᴼBx) (%)

0,1 1 0,1 75 10,3 47,4 47,9

0,2 2 0,1 75 10,7 52,5 51,4

0,3 3 0,1 76 10,8 49,2 48,6

0,4 4 0,1 76 10,9 49,6 49,8

0,5 5 0,1 76 11,0 50,21 50,6

0,2 6 0,2 75 10,8 50.32 50,9

0,2 7 0,3 76 10,9 49.90 49,8

0,2 8 0,4 76 11,0 51,12 50,6

0,2 9 0,5 75 10,8 51,40 50,9

Qua bảng 4.7 ta thấy nồng độ enzyme càng tăng thì hiệu suất thủy phân tăng

không đáng kể, do vậy ta chọn nồng độ enzyme: (A) = 0,2% và (F) = 0,1% (so với

thể tích dịch nấm men) là thích hợp nhất và phù hợp về mắt kinh tế.

b. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới hiệu suất thủy phân nấm men

pH của môi trường thủy phân cũng là một yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng đến khả

năng xúc tác của enzyme trong quá trình thủy phân. Trong thí nghiệm này, chúng

tôi tiến hành thử pH của dịch thủy phân từ 4,5-8. Điều kiện thí nghiệm tương tự thí

nghiệm trên, ta sử dụng hai loại enzyme: (A) với nồng 0,2% và (F) với nồng độ

0,1% (so với lượng dịch nấm men đem thủy phân). Kết quả thí nghiệm được ghi tại

bảng 4.8.

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất thủy phân nấm men

pH Dịch sau ly Hàm lượng chất Protein Hiệu suất thủy phân

tâm (ml) hòa tan (ᴼBx) tổng (g/l) (%)

73 9,4 45,6 46,8 4,5

73 10,4 47,4 47,9 5,0

74 10,8 52,5 51,4 5,5

39

75 11,0 49,2 48,6 6,0

6,5 75 11,3 53.17 55,2

7,0 75 11,2 53,07 54,9

7,5 74 11,0 52,17 51,0

8,0 72 11,0 51,75 50,2

Qua bảng 4.8 cho thấy: ở pH 6,5 và 7,0 cho hiệu suất thủy phân tương đương

nhau và cao nhất do vậy ta chọn pH trong quá trình thủy phân là 6,5 để tiến hành

các thí nghiệm sau.

c. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất thủy phân nấm men

Theo một số tài liệu, trong điều kiện tự phân thì thời gian thủy phân của nấm

men là rất dài (khoảng 5 ngày). Nhưng trong thí nghiệm này có bổ sung enzyme

nhằm rút ngắn thời gian thủy phân, nên chúng tôi tiến hành thử thời gian thủy phân

từ 8 – 40 giờ. Điều kiện tiến hành thí nghiệm: Nồng độ cơ chất 14%, nhiệt độ thủy

phân 55ᴼC, nồng độ enzyme: (A) 0,2%, (F) 0,1% và pH thủy phân 6,5… Kết quả thí

nghiệm được thể hiện ở bảng 4.9

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới hiệu suất thủy phân nấm men

Thời gian Dịch sau ly Hàm lượng chất Protein Hiệu suất thủy

thủy phân (h) tâm (ml) hòa tan (ᴼBx) tổng (g/l) phân (%)

8 73 8,6 53.17 55,2

12 75 54,31 63,7 9,2

16 75 56,19 68,24 10,1

20 76 57,23 71,71 10,7

24 76 59,19 75,17 11,2

28 76 59,23 75,29 11,2

32 76 59,29 75,32 11,3

36 76 59,34 75,38 11,3

40 75 59,39 75,41 11,4

Qua bảng 4.9 ta thấy: Thời gian thủy phân nấm men thích hợp nhất là 24 giờ,

còn nếu tăng thời gian hiệu suất thủy phân có tăng nhưng không đáng kể. Và như

vậy phương pháp thủy phân có bổ sung enzyme đã rút ngắn thời gian thủy phân rất

nhiều so với phương pháp tự phân mà một số tác giả đã nêu. Do vậy ta chọn thời

gian thủy phân là 24 giờ để tiến hành các thí nghiệm sau.

40

d.Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thủy phân

Nhiệt độ cũng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình thủy phân của enzyme, nhiệt

độ mà không thích hợp thì cho hiệu quả thủy phân rất kém. Do vậy trong thí nghiệm

này chúng tôi tiến hành thử ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân từ 40 - 65ᴼC, điều

kiện thí nghiệm tương tự thí nghiệm trên và nồng độ muối bổ sung là 1%. Kết quả

được thể hiện ở bảng 4.10.

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thủy phân nấm men

Nhiệt độ thủy Dịch sau ly Hàm lượng chất Protein Hiệu suất thủy

phân (ᴼC) tâm (ml) hòa tan (ᴼBx) tổng (g/l)) phân (%)

40 79 9,6 59,21 65,17

45 77 10,7 59,27 73,11

50 77 11,5 59,32 74,32

55 75 11,6 59,39 75,38

60 75 11,3 59,19 73,17

65 74 10,0 59,23 73,19

Qua thí nghiệm trên ta nhận thấy: nhiệt độ thủy phân 50 – 55ᴼC cho hiệu

suất thủy phân tương đương nhau và cao nhất. Do vậy ta chọn độ thủy phân cho các

thí nghiệm tiếp theo là 50 - 55ᴼC.

Từ những nghiên cứu, chúng tôi tổng kết lại các kết quả đạt được như sau:

1. Phương pháp thủy phân nấm men bia theo phương pháp tự phân kết quả thu được

hàm lượng: Protein tổng 35,5g/100g, hiệu suất thủy phân đạt 37%

- Nồng độ cơ chất : 14% - Nhiệt độ tự phân : 50 oC

- Thời gian tự phân: 90-94 giờ

- pH tự phân : 5,5

2. Phương pháp thủy phân nấm men bia theo phương pháp hóa học kết quả thu

được hàm lượng : Protein tổng 40,6g/100g, hiệu suất thủy phân đạt: 45,1%

- Nồng độ HCl sử dụng : 6% - Nhiệt độ thủy phân : 80 oC

- Thời gian thủy phân : 8 giờ

41

- pH thủy phân : 5,5

3. Phương pháp thủy phân nấm men bia theo phương pháp sử dụng enzyme làm tác

nhân thủy phân kết quả thu được hàm lượng : Protein tổng 59,39g/100g, hiệu suất

thủy phân đạt: 75,38%

- Enzyme : Alcalase+ Flavourzyme

- Nồng độ enzyme sử dụng : Alcalase = 0,2% và Flavourzyme = 0,1% - Nhiệt độ thủy phân : 55 oC

- Thời gian thủy phân : 24 giờ

- pH thủy phân : 6,5

Chúng tôi lựa chọn phương pháp 3 là phương pháp thích hợp để thủy phân

nấm men bia, để tiến hành nghiên cứu các bước nghiên cứu tiếp theo cho quá trình

tạo sản phẩm là axit amin.

Chúng tôi lựa chọn phương pháp 1 là phương pháp tự phân nấm men để thủy phân

nấm men bia cho các bước nghiên cứu tiếp theo cho quá trình tạo sản phẩm là beta-

glucan.

4.2. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm giàu axit amin

4.2.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu nhận dịch chứa protein sau quá

trình thủy phân tế bào Saccharomyces cerevisie

Quá trình lọc ly tâm dùng để tách sơ bộ các bã lớn, còn lọc khung bản là để

tách triệt để hơn các bã tinh và một phần các tạp chất hòa tan trong đó.

Lọc khung bản trong thu nhận sinh khối nấm men sau khi thủy phân. Quá

trình này được thực hiện trên máy lọc khung bản, có sự tham gia của chất trợ lọc.

4.2.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô của dịch trước khi lọc

Cũng như quá trình lọc thô, lọc tinh cũng bị ảnh hưởng của nồng độ chất khô

trong dịch lọc. Việc xác định nồng độ chất khô trong dịch lọc thích hợp là cần thiết.

Kết quả thử nghiệm lọc với dịch có nồng độ chất khô khác nhau được thể hiện trên

bảng 4.11.

Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô của dịch trong lọc tinh

TT Nồng độ chất Tổng dịch thu được quy về Trực quan đánh giá

khô (0Bx) nồng độ 25 g/l (lít)

1 5 Lọc dễ dàng, dịch chảy 100

nhanh, thời gian lọc kéo dài.

42

2 10 Lọc dễ dàng, dịch chảy 100

nhanh,.

3 15 Lọc dễ, dịch chảy nhanh, 97

hiệu suất thu hồi tốt.

4 20 Lọc hơi bí , dịch chảy chậm, 93

hiệu suất thu hồi thấp.

5 25 Lọc bí, dịch chảy chậm, hiệu 91

suất thu hồi thấp.

Kết quả cho thấy, nồng độ chất khô thích hợp cho quá trình lọc tinh phù hợp với nồng độ chất khô thích hợp trong lọc thô, tức là 150Bx.

4.2.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất trợ lọc

Chất trợ lọc có vai trò như một màng lọc, lớp màng này giữ lại các chất cặn

cần loại bỏ, để rồi tách chúng ra khỏi dung dịch cần thu, giúp cho dịch trong sạch

hơn. Nhờ đặc tính cấu tạo mà lớp lọc này rất thoáng, tạo cho dịch trong chảy qua dễ

dàng, nhanh chóng, không bị tắc nghẽn.

Bảng 4.12. Ảnh hưởng của chất trợ lọc

STT Tỷ lệ chất trợ lọc (g/lít) OD 500

1 0.094 2

2 0.078 3

3 0.069 4

4 0.066 5

5 0.066 6

6 0.115 0 (Đối chứng)

Qua bảng 4.12 thấy rằng hiệu quả thu nhận dịch tốt nhất khi chọn nồng độ chất

trợ lọc là 5g/lít.

4.2.1.3 Ảnh hưởng của tốc độ bơm

Tốc độ bơm dịch trong quá trình lọc khung bản có vai trò rất quan trọng, nếu

tốc độ bơm không phù hợp, lớp lọc được tạo dựng nhờ lớp chất trợ lọc sẽ bị phá vỡ

và dịch lọc ra không bao giờ trong, sản phẩm thu được không đạt chất lượng như

mong muốn. Vì thế việc xác định tốc độ bơm dịch vào thiết bị lọc là cần thiết.

Nghiên cứu được xác định bằng cách lọc các mẫu dịch ở các tốc độ bơm khác nhau

để tìm ra tốc độ tối ưu nhất, chỉ tiêu đánh giá là độ trong được tính bằng độ hấp phụ

43

quang trên máy so màu ở bước sóng 450 nm. Kết quả được trình bày trên bảng 4.13.

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch vào máy lọc khung bản

TT Tốc độ bơm (lít/giờ) Tình trạng khi lọc OD 450

Khó lọc, dịch khó qua vải lọc 1 20 0.094

2 30 Hơi khó lọc 0.078

3 40 Lọc được 0.069

4 50 Lọc tốt 0.066

5 60 Lọc tốt 0.076

Kết quả cho thấy ở tốc độ lọc 50 lít/giờ hiệu quả lọc đạt giá trị tốt nhất.

Với dịch chứa sinh khối nấm men sau quá trình lọc đó, chúng tôi tiến hành

xác định thành phần chất khô, pH của nguyên liệu, đồng thời phân tích hàm lượng

đạm tổng số. Kết quả được trình bày ở bảng 4.14.

Bảng 4.14. Thành phần hóa học của bã nấm men trước và sau khi lọc

Hàm lượng ẩm Hàm lượng xơ thô pH Protein tổng số

(%) (%) (12%)

Trước lọc Sau lọc Trước lọc Sau lọc Trước lọc Sau lọc Trước lọc Sau lọc

83,43 75,85 26,57 24,15 5,72 6,54 10,4 12,53

Kết quả bảng trên cho thấy: nấm men nguyên liệu ban đầu có hàm lượng ẩm

trung bình là 83,43%. Sau khi lọc hàm lượng ẩm giảm xuống còn 75,85%, hàm

lượng chất xơ thô trung bình là 24,15%, hàm lượng protein tổng số chiếm khoảng

12,53% , pH của nấm men sau khi lọc cũng khá trung tính (6,54). Như vậy, nguyên

liệu nấm men sau khi xử lý, được thu nhậnbằng thiết bị lọc khung bản có chất lượng

tốt. Nguyên liệu này được dùng để tinh sạch sản phẩm.

4.2.2. Nghiên cứu công nghệ tinh sạch axit amin tổng số

Dịch sau khi lọc sẽ được đưa qua hệ thống trao đổi ion bằng nhựa Dowex-

50W. Sau đó cột được rửa nhiều lần cho hết mầu và tiến hành quá trình tinh sạch,

rửa giải hấp phụ bằng 3% dung dịch ammoniac.

4.2.2.1. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch

Cũng như mọi quá trình khác, quá trình trao đổi ion cần có thời gian. Trong

kỹ nghệ sắc ký, thời gian cần thiết để quá trình thực hiện gọi là thời gian lưu. Đối

với mỗi một sản phẩm sẽ có một thời gian lưu thích hợp, nếu ta xử lý nhanh hoặc

44

chậm hơn thời gian lưu thích hợp đều không cho hiệu quả cao. Thời gian lưu có thể

điều khiển được bằng tốc độ bơm dịch qua cột. Tốc độ bơm lớn thời gian lưu ngắn,

tốc độ bơm chậm thời gian lưu dài.

Để xác định tốc độ bơm dịch thích hợp trong quá trình tinh sạch chúng tôi

tiến hành thí nghiệm cho dịch protein nấm men có nồng độ 200 g/l chạy qua hai cột

trao đổi cation và anion được lắp đặt liên tiếp theo thứ tự cation trước anion sau.

Quá trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Tốc độ bơm dịch vào cột sắc ký lần lượt

là 2ml/phút, 3ml/phút, 4ml/phút 5ml/phút, 6ml/phút, 7ml/phút, 8ml/phút. Sau khi

xử lý trao đổi ion tất cả các mẫu được đem đun nóng dung dịch để loại ammoniac.

Sau đó dùng HCl hạ pH của dung dịch xuống 4,9 – 5. Tiến hành cô đặc chân không

thu nhận dịch chứa protein đã tinh sạch.

Chỉ tiêu đánh giá là giá trị OD của sản phẩm khi so mầu ở bước sóng 280nm

và nhận xét cảm quan. Kết quả được trình bày trên bảng 4.15.

Bảng 4.15. Ảnh hưởng của tốc độ chảy

Đánh giá cảm quan TT Tốc độ chảy (ml/phút) OD280

2 Màu sáng, dịch trong, thơm đặc trưng. 0.064 1

3 Màu sáng, dịch trong, thơm đặc trưng. 0.065 2

4 0.065 Màu sáng dịch trong, thơm đặc trưng. 3

5 Màu hơi vàng, dịch trong 0.077 4

6 Màu vàng, dịch trong, không thơm. 0.085 5

7 Màu vàng, dịch trong, không thơm. 0.094 7

Kết quả cho thấy tốc độ bơm dịch vào cột tỷ lệ nghịch với chất lượng sản

phẩm, tốc độ bơm càng lớn, sản phẩm thu được có độ tinh sạch càng kém. Mặc dù

vậy tốc độ bơm lại có ảnh hưởng đến hiệu suất tinh sạch, bơm chậm cho sản phẩm

sạch nhưng thời gian tinh sạch lâu, hiệu quả kinh tế kém. Dựa trên sự cân nhắc về

mức đáp ứng độ tinh sạch và hiệu quả kinh tế, chúng tôi chọn tốc độ 4ml/phút là tốc

độ bơm dịch thích hợp nhất.

4.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ protein đến hiệu quả tinh sạch bằng trao đổi

ion

Yếu tố cuối cùng ảnh hưởng đến hiệu quả tinh sạch dịch protein là nồng độ

dịch protein đem tinh sạch. Từ các điều kiện như trên ta tiến hành nghiên cứu ảnh

45

hưởng của nồng độ dịch protein đến hiệu quả tinh sạch bằng trao đổi ion với các

nồng độ đem nghiên cứu lần luợt là 0.5; 1; 1.5; 2, 2.5. Dịch thu được ta cũng đem

đo OD để xác định độ đục, màu và mùi. Kết quả được trình bày qua bảng 4.16.

Bảng 4.16. Ảnh hưởng của nồng độ dịch protein đến hiệu quả tinh sạch

Nồng độ dịch protein (Bx) OD (280nm) Màu

0.5 0.008 Dịch trong suốt, màu trắng sáng.

1 0.011 Dịch trong suốt, màu trăng.

1.5 0.018 Dịch trong, màu vàng sáng.

2 0.020 Dịch trong, màu vàng sáng.

2.5 0.021 Dịch hơi đục, màu vàng sáng.

3,0 0.021 Dịch hơi đục, màu vàng sáng.

Cũng giống như tốc độ bơm, ở đây nồng độ dịch protein đem tinh sạch cũng

tỷ lệ nghịch với hiệu quả tinh sạch, nồng độ dịch protein đem tinh sạch càng lớn thì

dịch thu được càng có độ đục cao. Do đó điều kiện nồng độ dịch protein tốt nhất

đem tinh sạch là Bx = 2,0.

4.2.2.3. Lựa chọn chế độ cô thích hợp

Quá trình cô dịch sau quá trình ly tâm nhằm mục đích loại bỏ các chất dễ bay

hơi nhiễm tạp trong dịch thủy phân tế bào nấm men, các axit sử dung trong quá

trình tinh sạch. Dựa theo các nghiên cứu đi trước, đề tài tiến hành kiểm chứng lại

một số chế độ cô đẻ lựa chọn phương án tối ưu. Các thông số kiểm chứng và kết

quả kiểm chứng được ghi trên bảng 4.17

Bảng 4.17. Lựa chọn chế độ cô thích hợp

Nhiệt độ cô (0C) Hàm lượng protein tổng (%) Đánh giá cảm quan

50 Màu đẹp, sáng trong 36

60 Màu đẹp, sáng trong 59

70 Màu hơi sẫm 20

Kết quả trên bảng cho thấy, nhiệt độ cô thấp, màu sắc của sản phẩm đẹp, giá

46

trị cảm quan tốt, nhưng nếu nhiệt độ quá thấp, không đảm bảo độ tinh sạch. Từ kết quả trên ta chọn nhiệt độ cô là 600C là thích hợp nhất.

Bảng 4.18. Kết quả tổng kết quá trình thu nhận và tinh sạch axit amin từ nấm men

Quá trình Protein tổng (%) Axit amin tổng (%) Hiệu suất thu hồi (%)

Lọc 30,4 15,6 68,4

Tinh sạch 60,13 20,65 40,8

4.2.3. Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ thích hợp trong quá trình

tinh sạch.

Do cột trao đổi ion là cột inox tự chế nên việc nghiên cứu nồng độ dịch trước

khi bơm vào cột và tốc độ bơm dịch rửa giải thích hợp là rất cần thiết, do mỗi loại

cột thì thích hợp với mỗi điều kiện làm việc là khác nhau.

4.2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ protein trước khi bơm vào cột

Việc đầu tiên trong nghiên cứu tinh sạch protein bằng sắc ký trao đổi ion ở

quy mô xưởng sản xuất là tiến hành khảo sát nồng độ dịch protein phân tích vào

cột trao đổi ion, các bước chuẩn bị như sau hai cột trao đổi ion nối tiếp với nhau

được nhồi hai loại hạt cation và anion, lượng ionit chiếm 3/4 thể tích cột, dịch

protein được đưa về pH trung tính (5 – 7), nồng độ protein nghiên cứu lần luợt là

1,5; 2; 2,5; 3; 3,5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ protein trước khi bơm vào cột

trao đổi ion với các chỉ tiêu đánh giá là giá trị OD của mẫu ở bước sóng 280 nm.

Kết quả thí nghiệm được trình bày trên bảng 4.19.

Bảng 4.19.Ảnh hưởng của nồng độ dịch protein đến hiệu quả tinh sạch

Nồng độ dịch protein (Bx) OD (280nm) Màu

1,5 0,038 Dịch trong suốt, màu trắng sáng.

2 0,041 Dịch trong suốt, màu trăng.

2,5 0,048 Dịch trong, màu vàng sáng.

3 0,050 Dịch hơi đục, màu vàng sáng.

3,5 0,051 Dịch hơi đục, màu vàng sáng.

Cũng giống như tốc độ bơm, ở đây nồng độ dịch protein đem tinh sạch cũng

tỷ lệ nghịch với hiệu quả tinh sạch, nồng độ dịch protein đem tinh sạch càng lớn thì

dịch thu được càng có độ đục cao. Do đó điều kiện nồng độ dịch protein tốt nhất

47

đem tinh sạch là Bx = 3,0.

4.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch

Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ bơm dịch vào cột đến hiệu quả tinh sạch bằng

trao đổi ion với các các tốc độ thay đổi là 2; 2,5; 3; 3,5; 4 và nồng độ dịch protein ta

lấy cố định để khảo sát là Bx = 3,0 Dịch thu được đem đo OD ở bước sóng 280nm

để xác định độ đục cao nhất . Kết quả được trình bày qua bảng 4.20.

Bảng 4.20.Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến quá trình tinh sạch

Tốc độ bơm dịch (l/giờ) OD (280nm) Màu

2,0 0,033 Dịch trong suốt màu trắng sáng

2,5 0,045 Dịch trong suốt, màu trăng sáng.

3,0 0,062 Dịch trong suốt, màu trăng sáng.

3,5 0,055 Dịch trong hơi vàng

4,0 0,052 Dịch có màu vàng nhạt.

Từ kết quả bảng cho thấy, mẫu có tốc độ bơm dịch là 3,0 lít/giờ cho kết quả

tinh sạch tốt nhất. Vì thế ta chọn tốc độ này làm tốc độ tối ưu cho quá trình trao đổi

ion.

4.2.3.3. Nghiên cứu tinh sạch ở quy mô pilot

Được bơm vào cột chứa gel. Sử dụng dung dịch rửa giải hấp phụ bằng 3%

dung dịch ammoniac. Dung dịch rửa giải được bơm tự động với tốc độ 3,0 lít/giờ,

lấy mẫu sau mỗi phân đoạn 20ml và đo mật độ 280nm. Xác định các phân đoạn

chứa protein, các mẫu được đem đun nóng dung dịch để loại ammoniac. Sau đó

dùng HCl hạ pH của dung dịch xuống 4,9 – 5. Tiến hành cô đặc chân không thu

nhận dịch chứa protein đã tinh sạch.

Từ các kết quả nghiên cứu trên ta có thể rút ra phương pháp tinh sạch bằng

cột trao đổi ion ở quy mô xưởng sản xuất tốt nhất là các chế độ nhưsau: dịch protein

phải được đưa về dạng pH trung tính. Hạt ionit nhồi vào cột chiếm 3/4 thể tích cột,

quá trình tinh sạch tiến hành ở nhiệt độ phòng, tốc độ bơm dịch vào cột là 3,0 lít/giờ

48

và dịch trước khi tinh sạch có nồng độ Bx = 2,0.

Bảng 4.21. Tổng kết quá trình thu nhận và tinh sạch protein quy mô pilot

Giai đoạn Lượng mẫu Hiệu suất Hàm lượng Hàm lượng

thu được (ml) (%) protein tổng axít amin

(%) tổng (%)

Dịch chiết protein 14 000 100 59,39 21,6

thô từ nấm men

Dịch cô đặc sau quá 5,65 56,5 67,8 33,5

trình tinh sạch

Sau mỗi quá trình thu nhận và tinh sạch dịch protein giàu axit amin, hàm

lượng protein tổng đạt 67,8%, hàm lượng axit amin tổng đạt 33,5%, hiệu suất thu

nhận đạt 56,5%.

4.2.4. Nghiên cứu tạo dạng sản phẩm

4.2.4.1. Lựa chọn phương pháp sấy thích hợp cho việc tạo sản phẩm bột giàu

axit amin từ nấm men.

Để tiến hành sấy sản phẩm giàu axit amin từ nấm men thu sản phẩm dạng

bột chúng tôi sử dụng 3 phương pháp sấy khác nhau: đông khô, sấy chân không và

sấy phun. Sửa dụng dịch axit amin sau quá trình tinh sạch đã được cô đặc có độ

Bx=3.

Đối với phương pháp sấy chân không: 1 lít dịch chứa axit amin nấm men, khuấy đều và dàn mỏng ra khay (chiều cao khay 2cm). Sấy ở nhiệt độ 70-750C, độ chân không 0,8-0,9 kgF/cm3, sấy khô đến độ ẩm khoảng 3%.

Đối với phương pháp sấy đông khô: 1 lít dịch chứa axit amin nấm men, khuấy đều và dàn mỏng ra khay (chiều cao khay 2cm) để ở -200C trong 24 giờ. Sau đó đem đông khô sản phẩm ở điều kiện -500C, áp suất 0,1-0,13mBa, sấy khô đến độ

ẩm khoảng 3%

Phương pháp sấy phun được thực hiện với 1 lít dịch chứa axit amin nấm men, khuấy đều, , sấy ở điều kiện nhiệt độ khí vào/ra là 1650C/800C, tốc độ bơm

tiếp liệu 2,0 lít/giờ, tốc độ vòng quay tạo phun sương 35.000 vòng/phút. Kết quả

49

được trình bày ở bảng 4.22

Bảng 4.22.Khảo sát các phương pháp sấy khác nhau tới hiệu suất thu hồi giàu axit

amin từ nấm men

Lượng Hiệu suất

Phương pháp Trạng thái hạt sau sấy Thời gian sấy bột thu thu hồi

sấy (giờ) được (g) (%)

Các phần tử trong khối

hạt còn vón cục, khối hạt

Sấy chân không cứng đóng bánh, phải

nghiền để tạo sản phẩm

dạng bột 48 74,8 97,2

Các phần tử trong khối

Sấy đông khô hạt còn vón cục nhỏ,

nghiền nhẹ tạo dạng bột

tơi xốp, bột mịn 48 75,9 98,6

Các phần tử trong khối

0,5 Sấy phun hạt tơi, xốp, bột mịn 69,4 90,13

Kết quả cho thấy, cả ba phương pháp đều thu được sản phẩm giàu axit amin

từ nấm men dạng bột với các thông số kỹ thuật của sản phẩm đạt yêu cầu của đề tài

đề ra. Hiệu suất thu hồi đạt trên 90%.

Đông khô là phương pháp tốt nhất cho tạo chế phẩm giàu axit amin từ nấm

men dạng bột, sau đó đến phương pháp sấy chân không và sấy phun. Tuy nhiên, do

đông khô có thể cho sản phẩm có chất lượng cao hơn sấy phun nhưng giá thành,

chi phí cho sản phẩm cao do thời gian sấy dài, tốn năng lượng, khấu hao thiết bị

lớn, phù hợp với nghiên cứu ở phòng thí nghiệm. Cũng tương tự, phương pháp sấy

chân không cũng khó để thực hiện ở ở điều kiện sản xuất lớn. Phương pháp sấy

phun cũng là một biện pháp để bảo quản sản phẩm trong thời gian lâu, so với đông

khô thì sấy phun nhanh hơn, chi phí thấp hơn và có thể tiến hành sấy với số lượng

sản phẩm lớn hơn. Do vậy, chúng tôi đã quyết định sử dụng phương pháp sấy phun

50

để thu nhận và tạo dạng sản phẩm bột giàu axit amin từ nấm men.

4.2.4.2. Nghiên cứu điều kiện sấy phun sản phẩm bột giàu axit amin từ nấm

men

Tiến hành khảo sát các điều kiện như nhiệt độ dòng khí vào (vì nhiệt độ dòng khí ra phụ thuộc nhiều yếu tố). Sấy phun ở các nhiệt độ khí vào ở 1550C, 1650C, 1750C. Cố định nhiệt độ khí ra là 800C;áp suất khí nén là 6 bar tương đương với tốc

độ quay của đầu phun là 35.000 vòng/phút;tốc độ tiếp bơm nguyên liệu là 2,0

lít/giờ, 2,5 lít/giờ, 3,0 lít/giờ, dịch axit amin tinh sạch có độ Bx=6. Kết quả được

trình bày ở bảng 4.23.

Bảng 4.23. Kết quả lựa chọn điều kiện sấy phun

TT Hiệu Hàm Cảm quan đánh

Chế độ sấy suất lượng giá

thu Protein

hồi tổng

(%) (%)

1 Nhiệt độ đầu vào 1550C Bột bết, cháy,

85 59,75 dính nhiều trên Tốc độ tiếp liệu 2lít/giờ

thiết bị, thao tác Tốc độ đầu bơm ly tâm 35000

khó.

2 Nhiệt độ đầu vào 1650C Bột không cháy,

tơi, khô vừa tới, Tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ

không dính bết, 96 60,25 Tốc độ đầu bơm ly tâm 35000

thao tác dễ.

3 Nhiệt độ đầu vào v/phút 1750C Bột tơi, khô vừa

tới, không dính Tốc độ tiếp liệu 3lít/giờ

98 57,7 bết, thao tác dễ. Tốc độ đầu bơm ly tâm 35000

v/phút

Từ kết quả trên ta chọn tổ hợp các thông số sấy là:Nhiệt độ đầu vào: 1650C;

Tốc độ tiếp liệu: 2,5lít/giờ; áp suất khí nén 6 bar tương đương tốc độ đầu bơm ly

tâm tạo sương: 35000 v/p.

Qua kết quả trên chúng tôi thấy rằng, lượng protein thất thoát qua các giai

đoạn cũng khá nhiều. Sau mỗi quá trình tách chiết làm sạch để thu nhận protein

51

lượng mẫu thu được khoảng 500 gam, theo phân tích lượng mẫu thu được có hàm

lượng protein tổng đạt 64,8% và hàm lượng axit amin tổng đạt 32,4%, số liệu này

có giảm so với dịch protein sau cô đặc là do trong quá trình sấy có tác dụng của

nhiệt nhiệt độ làm giảm hàm lượng protein.

4.2.5.Xây dựng quy trình cho các bước công nghệ của các quá trình sản xuất

chế phẩm giàu axit amin làm thức ăn bổ sung cho người

Trong nghiên cứu ở các chuyên đề trước đã xác định được các phương pháp,

quy trình cho các bước công nghệ của các quá trình sản xuất sản xuất chế phẩm

giàu axit amin làm thức ăn bổ sung cho người. Trong nghiên cứu này chúng ta sẽ sử

dụng các kết quả đã thu được hợp lại trong toàn bộ quy trình sản xuất tổng thể để

nghiên cứu sản xuất thử nghiệm sản xuất chế phẩm giàu axit amin làm thức ăn bổ

52

sung cho người. Với phương án trên ta xác lập quy trình sản xuất như hình 4.2 sau:

Nấm men bia

Nước

Xử lý nấm men, rửa làm sạch

Ly tâm

Nước

Tách đắng

NaOH

Thủy phân

Enzyme Alcalae, Flavourzyme

Bã

Lọc khung bản

Tinh sạch

Ammoniac 3%

Cô đặc

Sấy phun

Đóng gói

Sản phẩm giàu axit amin

Hình 4.2. Sơ đồ quy trình sản xuất giàu axit amin

Thuyết minh quy trình:

53

1. Nguyên liệu:

Bã nấm men bia Saccharomyces cerevisiae là phần nấm men dư thừa lấy

sau quá trình lên men chính được thu nhận tại được thu nhận từ xưởng bia của

Trung tâm SXTN&CGCN – Viện CNTP và một số xưởng bia lân cận Hà Nội.

2. Xử lý bã nấm men bia, rửa làm sạch:

Nguyên liệu nấm men đưa về được xác định hàm lượng ẩm rồi đem đi lọc

bằng sàng rây (kích thước 0,053 µm)để loại bớt nước trước khi tách đắng.

Rửa: Bã nấm men bia sau khi thu nhận từ các nhà máy được rửa, tỷ lệ nước hòa loãng / sinh khối là 2/1, số lần rửa: 3 lần, nhiệt độ nước rửa và lắng là 2-50C,

thời gian để lắng 4h.

3. Ly tâm:Sử dụng ly tâm vắt lọc qua sàng lọc có kích thước 0,053 µm, tốc độ

ly tâm 2000 v/phút, 150 lít dịch/giờ.

4. Tách đắng:

Sau quá trình lọc bã nấm men bia được tách đắng bằng dung dịch NaOH 1%

trong điều kiện pH 8,0, tốc độ khuấy để tách đắng là 250 vòng/phút, nhiệt độ tách đắng là 2-50C, thời gian tách đắng: 15 phút.thu được kết quả hàm lượng chất khô

20,52%, Protein tổng 14,8%, pH=6,83, độ đắng 2,08( Bu/g)

5. Thủy phân:

Tự phân: có thể tiến hành tự phân nấm men trong khoảng nhiệt độ từ 550C.

pH 5,2 với thời gian là 3 ngày.Sau qáu trình tự phân protein tổng 35,5g/100g, hàm

lượng đạm tổng 7,2g/l và hiệu suất thủy phân đạt 37%

Thủy phân bằng enzyme: sử dụng hỗn hợp enzyme Alcalase và

Flavourzyme, nồng độ Alcalase và Flavourzyme tương ứng là 0,2%: 0,1%: nhiệt độ thủy phân : 55oC; trong thời gian thủy phân 24 giờ; pH 6,5. kết quả thu được hàm

lượng : Protein tổng 59,39/100g , hàm lượng đạm tổng 17,51g/l và hiệu suất thủy

phân đạt: 75,38%

6. Lọc thu dịch chứa protein:

Sử dụng thiết bị lọc khung bản: nồng độ chất khô của dịch trước khi lọc

150Bx, Tỷ lệ đất trợ lọc 5 g/lít, Tốc độ bơm dịch trong quá trình lọc 50 lít/giờ.

Chất lượng men sữa sau quá trình xử lý độ ẩm trung bình là 75,85 %, độ xơ

thô trung bình là 24,15%, hàm lượng Protein trung bình là 12,53%, pH của nấm

54

men sau khi lọc có giá trị trung tính (6,54). Như vậy, nguyên liệu nấm men sau khi

xử lý, dịch được thu nhận bằng thiết bị lọc khung bản có chất lượng tốt. Nguyên

liệu này được dùng để tinh sạch sản phẩm

7. Tinh sạch:

Dịch sau khi lọc sẽ được đưa qua hệ thống trao đổi ion cation bằng nhựa

Dowex 50W. cột kích có kích thước 10x120cm, nhựa trao đổi ion Dowex-50W chiếm 3/4 thể tích của cột, nồng độ protein trước khi bơm vào cột là 3,00Bx, tốc độ

bơm dịch là 3 lít/giờ, rửa giải bằng dung dịch ammoniac 3%. Cô loại dung môi ở nhiệt độ cô 600C. Dịch sau quá trình tinh sạch cóhàm lượng protein tổng đạt 67,8%,

hàm lượng axit amin tổng đạt 33,5%.

8. Tạo dạng sản phẩm axit amin

Tạo dạng sản phẩm giàu axit amin thích hợp là phương pháp sấy phun. Điều kiện sấy nhiệt độ đầu vào: 1650C; tốc độ tiếp liệu: 2,5lít/giờ; áp suất khí nén 6 bar

tương đương tốc độ đầu bơm ly tâm tạo sương: 35000 v/p. Hiệu suất thu hồi đạt

96%, hàm lượng protein tổng đạt 64,8% và hàm lượng axit amin tổng đạt 32,4%

9. Đóng gói, bảo quản

Đóng gói: Bột sau sấy phun sau khi phối trộn tiêu chuẩn hóa sẽ là sản phẩm

bột giàu axit amin được đóng gói ngay vào túi nhôm chuyên dụng hợp vệ sinh an

toàn thực phẩm, mỗi túi 12g rồi được đóng vào hộp giấy, mỗi hộp 15 túi. Bảo quản

nơi khô ráo thoáng mát, tránh ánh sáng mặt trời.

4.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất thực phẩm giàu -Glucan

4.3.1.Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tinh sạch -glucan

Cặn chứa -glucan tổng số thu được đã tinh sạch một phần loại bỏ được

manoprotein, peptid (hàm lượng -glucanđạt 65,6%, hàm lượng protein 2.5%).

Tổng lượng cặn thu được sau mỗi mẻ xử lý 500 kg nấm men bia là 16kg (w=65%),

tiến hành tinh sạch theo 2 phương pháp sau:

* Tinh sạch theo phương pháp enzyme:

Bước tiếp theo sử dụng enzyme lipase thương phẩm của Novo là Lipozyme

CalBL để thủy phân lipid từ màng tế bào. Thành tế bào nấm men bổ sung nước theo

tỷ lệ 1:1 (w/v) chỉnh pH=10 bằng NaOH, tiếp theo bổ sung 0.1% Lipozyme CalBL, giữ ở nhiệt độ 450C, trong 5 giờ. Kết thúc thủy phân, bất hoạt enzyme 850C trong

15 phút [Jaehrig và cs, 2008].

55

* Tinh sạch theo phương pháp hóa học:

- Thành tế bào thu được thủy phân bằng NaOH 1M ở nhiệt độ 900C trong 2

giờ. Ly tâm thu cặn, rửa lại bằng nước cất 3 lần.

- Cặn thu được bổ dung axit H3PO4 theo tỷ lệ 1:1 (w/v), giữ ở nhiệt độ phòng

trong 2 giờ. Ly tâm thu cặn, rửa bằng nước cất 3 lần.

- Cặn thu được xử lý loại bỏ mannaprotein bằng bổ sung dung dịch đệm citrate pH=7 theo tỷ lệ 1:2 (w/v), hấp 1210C, thời gian 90 phút. Ly tâm thu cặn chứa

-glucan, rửa bằng nước cất 3 lần, ly tâm thu cặn -glucan đã tinh sạch[Vesna

Zechner-Krpan và cs, 2010].

-glucantách chiết từ thành tế bào nấm men, được tinh sạch theo 2 phương

pháp hóa học và phương pháp enzyme kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.24.

Bảng 4.24: Ảnh hưởng của phương pháp tinh sạch tới hiệu suất thu hồi

Phương pháp tinh Hàm lượng Hàm lượng Hiệu suất thu

sạch chất béo (%) -glucan(%) hồi-glucantừ

cặn thô(%)

8.5 65.6 Cặn -glucan thô

Phương pháp dùng 3.1 71.3 80.1

enzyme

Phương pháp hóa học 4.3 66.8 45.5

(Hàm lượng chất béo và -glucan tính theo % trọng lượng cặn khô thu được)

Qua kết quả ở bảng trên cho thấy tinh sạch cặn thô theo phương pháp dùng

enzyme hàm lượng -glucan, hiệu suất thu hồi cao hơn và hàm lượng lipid trong

mẫu thấp hơn khi tinh sạch theo phương pháp hóa học.

Do enzyme Lipase thủy phân chất béo tốt hơn so với thủy phân chất béo

bằng NaOH, mặt khác phương pháp hóa học phải qua nhiều công đoạn, quá trình

rửa giải nhiều, dẫn tới hiệu suất thu hồi thấp.

4.3.2.Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ bổ sung enzyme lipase thích hợp tinh sạch -

glucan

Tiến hành bổ sung enzyme lipase theo tỷ lệ 0.1-0.25% (w/v).

56

Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.25:

Bảng 4.25: Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung enzyme lipase tới quá trình tinh sạch-

glucan

Tỷ lệ bổ sung enzyme Hàm lượng chất béo (%) Hàm lượng -glucan (%)

lipase (%) (w/w)

0.05 6.9 68.4

0.10 3.10 71.3

0.15 2.50 74.5

0.20 2.55 75.0

(% -glucan, chất béo tính theo cặn khô sau thủy phân)

Kết quả ở bảng trên cho thấy khi tăng nồng độ enzyme từ 0.05-0.15%, hàm

lượng -glucan tăng. Khi tăng nồng độ ezyme lên tới 0.20% hàm lượng -glucan

tăng không đáng kể. Do vậy chọn nồng độ enzyme 0.15% là thích hợp nhất.

4.3.3.Nghiên cứu lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp tinh sạch -glucan

Thủy phân loại bỏ chất béo, thu hồi -glucan trong khoảng thời gian: 4.0, 5.0, 6.0 và 7.0 giờ. Kết thúc thủy phân, nâng nhiệt lên 800C trong 15 phút để bất

hoạt enzyme.

Sau khi thủy phân tiến hành ly tâm bằng thiết bi ly tâm vắt, loại bỏ dịch chứa

chất béo, thu cặn. Cặn thu được tiến hành rửa bằng nước lạnh 2 lần, ly tâm thu-

glucan đã tinh sạch.Kết quả thu được ở bảng 4.26:

Bảng 4.26: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme lipasse tới quá trình tinh sạch

-glucan

Thời gian thủy phân (giờ) Hàm lượng -glucan (%) Hàm lượng chất béo (%)

4.0 3.81 65.3

5.0 1.50 74.5

6.0 2.45 75.0

7.0 2.4 75.1

Khi tăng thời gian thủy phân, độ tinh khiết -glucan tăng, hàm lượng chất

béo giảm xuống, thời gian thích hợp cho thủy phân là 5 giờ, hàm lượng -glucan

57

đạt 74.5%, hàm lượng chất béo là 2.5%.

4.3.4.Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình tinh

sạch -glucan

Tiến hành thu hồi -glucan trên dải nhiệt độ từ 45-550C. Kết quả thu được ở

bảng 4.27.

Bảng 4.27: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình tinh sạch-glucan

Nhiệt độ (0C) Hàm lượng chất béo (%) Hàm lượng -glucan (%)

3.1 40 57.8

1.50 45 74.5

0.90 50 75.6

1.40 55 75.0

Khi tăng nhiệt độ từ 40-500C hàm lượng -glucan thu được tăng dần từ

57.8%-75.6%, hàm lượng chất béo giảm từ nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên tới 550C hàm lượng -glucan giảm. Hàm lượng protein không ảnh hưởng nhiều bởi yếu

tố nhiệt độ. Do đó lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho thu hồi -glucan tổng số là 500C.

4.3.5.Nghiên cứu lựa chọn pH thích hợp cho quá trình tinh sạch -glucan tổng

số

Bổ sung nước theo tỷ lệ 1:1 (w:v), tiếp theo chỉnh các mẫu theo pH= 8-11,

bằng dung dịch NaOH đậm đặc 40%. Kết quả thu được ở bảng 4.28.

Bảng 4.28: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới thu nhận -glucan tổng số

pH Hàm lượng chất béo (%) Hàm lượng -glucan (%)

0.70 8.0 75.0

0.30 9.0 76.2

0.90 10.0 75.6

0.8 11.0 74.5

Khi tăng pH dịch thủy phân từ pH=8-11, hàm lượng -glucan thu thay đổi

không đáng kể. Hàm lượng chất béo đạt giá trị thấp nhất tại pH=9 là 0.3%. Chọn

pH thích hợp cho tinh sạch-glucanlà 9.0.

Từ 16kg cặn chứa -glucan (w=65%) qua quá trình tinh sạch thu được 10 kg

-glucan tinh sạch có w=80%, hàm lượng -glucan đạt 76.2%. Hiệu suất thu hồi đạt

58

42%

4.3.6.Nghiên cứu tạo dạng sản phẩm -glucan làm thức ăn cho người

4.3.6.1.Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo sản phẩm

Tiến hành sấy sản phẩm theo các phương pháp: sấy phun, sấy chân không,

sấy đông khô. Kết quả như sau:

Bảng 4.29: Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo sản phẩm cho chế phẩm -glucan

làm thức ăn cho người

Phương Thông số chế độ sấy Đặc điểm Hiệu suất Nhận xét

sản phẩm thu hồi (%) pháp tạo sản

phẩm

Bổ sung nước theo tỷ Bột tơi mịn, 90 Có thể sản Sấy phun

lệ 1:1 (w/v), malto màu vàng xuất quy mô

nhạt công nghiệp

10 g/lít, sấy nhiệt độ đầu vào 1500C, tốc

độ đầu quay 40.000

v/phút, tốc độ sấy

91 Phù hợp với 2.5 lít dịch/giờ Nhiệt độ 600C, P=0.5 Đóng thành Sấy chân

quy mô atm mảng dầy không

phòng thí mầu nâu

nghiệm sẫm

Đóng thành 93 Phù hợp với Sấy đông

quy mô mảng mỏng -Nhiệt độ phòng để máy đông khô: 20 0C khô

phòng thí mầu nâu

nghiệm vàng

- Áp xuất buồng sấy: 5,6 .10-2 - Nhiệtđộ buồng đông khô: - 80 0C

4.3.6.2.Nghiên cứu tạo sản phẩm -glucan dạng bột bằng phương pháp sấy

phun

Nghiên cứu lựa chọn được công thức phối trộn giữa chất mang

(maltodextrin) với -glucan tinh sạch hàm lượng -glucan đạt 76.2% (w=80%) và

chế độ sấy thích hợp là hết sức quan trọng. Vì thế trong nghiên cứu tạo chế phẩm -

59

glucan dạng bột được thực hiện bằng cách: -glucantinh sạch bổ sung thêm nước

theo tỷ lệ 1:1 (w/v),bổ sung thêm chất mang và điều chỉnh nồng độ chất rắn của

dịch trước sấy phun về các thông số tối thích.

a.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất mang trong quá trình sấy phun -

glucan dạng bột

Maltodextrin là một loại chất mang được dùng nhiều trong sấy phun, đặc biệt

là trong sấy các sản phẩm có đường, protein và các chất keo khác. Maltodextrin giá

thành hợp lý, dễ dàng ứng dụng đối với quy mô sản xuất công nghiệp, do vậy chọn

maltodextrin làm chất mang cho sản phẩm -glucankhi sấy phun tạo bột. Tỷ lệ chất

mang và chất rắn trong dịch chiết là những thông số cần xác định. Đề tài đã tiến

hành thử nghiệm sấy phun các mẫu -glucan có tỷ lệ chất mang khác nhau trong điều kiện sấy giống nhau là: Nhiệt độ đầu vào 1500C; Tốc độ bơm dịch vào là 2.5

lít/giờ;-glucan đã tinh sạch (w=80%) bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1:1; Tốc độ đầu

quay là 40000 vòng/phút. Kết quả thu được ở bảng 4.30.

Bảng 4.30: Ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang

STT Tỷ lệ bổ sung Hiệu suất thu Cảm quan đánh giá

malto (g/l) hồi (%)

1 5 80 Bột tơi, không bết dính nhưng vẫn vón

cục nhanh khi gặp không khí.

2 7 86 Bột tơi, không bết dính, hiệu suất cao.

3 10 90 Bột tơi hơn, không bết dính.Hiệu suất

cao.

4 12 90 Bột tơi hơn, không bết dính, thao tác dễ

dàng. Hiệu suất cao.

Bổ sung với lượng malto 7 g/lít hiệu suất thu hồi đạt 86%, hàm lượng

-glucan sẽ cao hơn khi bổ sung malto từ 10-12 g/lít, do bổ sung với nồng độ này

hiệu suất thu hồi cao hơn, lượng chất mang nhiều do vậy hàm lượng hoạt chất yêu

cầu trong sản phẩm giảm xuống. Chọn nồng độ bổ sung malto 7g/lít là thích hợp

nhất

b.Xác định nồng độ chất khô dịch trước sấy phun

Do -glucan tinh sạch có w=80% , tiến hành bổ sung thêm nước với tỷ lệ

60

(w/v) hợp lý tiết kiệm được tổn năng lượng, hiệu suất thu hồi và hiệu quả kinh tế

cao. Nếu bổ sung lượng nước quá ít độ nhớt cao, tắc đầu phun, bột ẩm, không sấy

được. Các mẫu bổ sung với lượng nước khác nhau, đều bổ sung thêm 7% malto.

Kết quả thu được ở bảng 4.31.

Bảng 4.31: Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào -glucan đã tinh sạch của dịch

trước sấy phun

STT Tỷ lệ bổ sung Hiệu suất Sản lượng Nhận xét

thu hồi (%) (g/giờ) nước

1:0.5 75 230 Dịch trước sấy đặc, khó sấy, 1

tốc độ sấy chậm, bột ẩm, dễ

vón cục

1:1 86 376 Dịch loãng vừa phải, bột 2

tơi không bết dính, độ ẩm

vừa phải, không cháy, thao

tác dễ.

3 1:1.5 87 380 Dịch loãng, bột tơi không

bết dính, khô, không cháy,

thao tác dễ. Thời gian sấy

kéo dài do lượng dịch nhiều

c.Xác định chế độ sấy phun chế phẩm giàu -glucan

Các thông số điều khiển của chế độ sấy phun bao gồm: nhiệt độ đầu vào,

nhiệt độ đầu ra, tốc độ tiếp liệu, tần xuất tạo sương (tốc độ quay của đầu li tâm tạo

sương). Các thông số này lại có ảnh hưởng qua lại lẫn nhau, ví dụ tốc độ tiếp liệu

ảnh hưởng trực tiếp nhiệt độ đầu ra; Tần suất tạo sương cũng phải tương xứng với

tốc độ tiếp liệu... Vì thế xác định chế độ sấy phun thích hợp là xác tập hợp các

thông số tối ưu nhất.

Dựa trên kinh nghiệm nghiên cứu và sản xuất các loại đồ uống tan nhanh

khác chúng tôi tiến hành thử nghiệm sấy ở các chế độ sấy khác nhau để tìm ra điều

kiện sấy thích hợp nhất cho sản phẩm. Kết quả được ghi nhận trên bảng 9. Ta thấy ở chế độ sấy phun thứ ba, khi nhiệt độ đầu vào là 1500C; Tốc độ tiếp liệu là 2,5 lít/giờ

61

và tốc độ đầu bơm ly tâm là 40000 vòng/ phút cho sản phẩm có chất lượng tốt nhất.

Vì thế chúng tôi chọn chế độ này cho sản xuất chế phẩm giàu -glucan bằng

phương pháp sấy phun.

Bảng 4.32: Ảnh hưởng của chế độ sấy phun

STT Chế độ sấy Hiệu Sản Hàm lượng Đánh giá

suất thu lượng cảm quan -glucan

hồi (%) (g/giờ) trong chế

phẩm (%)

Nhiệt độ đầu 170 0C 1 Bột bết,

vào cháy, dính

nhiều trên Tốc độ tiếp 3 lít/ giờ 75 276 60.5 thiết bị, liệu

thao tác Tốc độ quay 40000

khó. của bơm li tâm

2 Nhiệt độ đầu vòng/phút 160 0C Bột không

vào cháy

nhưng bết Tốc độ tiếp 2,8 lít/giờ 80 305 65.4 dính nhiều liệu

trên thiết Tốc độ quay 40000

bị. của bơm li tâm

3 Nhiệt độ đầu vòng/phút 150 0C Bột tơi

vào không vón

cục, không Tốc độ tiếp 2,5

dính bết, liệu lít/ giờ 86 74,5 376

thao tác 40000 Tốc độ quay

dễ. vòng/phút của bơm li

62

tâm

4.3.7.Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm β-glucan

Bã nấm men bia (500kg)

Xử lý bã nấm men bia

Rửa nấm men

Lọc khung bản Thủy phân (bằng enzyme Flavourzyme+Alcalase)

Thành tế bào nấm men Dịch chứa peptid

Tinh sạch lần 1 bằng enzyme Alcalase

Dịch chứa glycerol, axit béo Tinh sạch lần 2 bằng enzym Lipozyme

-glucan tinh sạch Bổ sung nước cất theo tỷ lệ 1:1 (w/v), malto 7g/lít

Sấy phun (nhiệt độ đầu vào 1700C, đầu ra 800C, v= 2lit/giờ)

Chế phẩm giàu -glucan

Hình 4.3.Quy trình sản xuất chế phẩm β-glucan

63

THUYẾT MINH QUY TRÌNH

1. Nấm men bia

Nấm men bia thu hồi sau quá trình sản xuất bia tai Xưởng bia- Viện Công

nghiệp Thực phẩm để sản xuất chế phẩm giàu axit amin và β-glucan với hàm lượng

chất khô ban đầu là: hàm lượng chất khô 15(%). Hàm lượng hydratcacbon 6,2%,

protein tổng 14,7%, pH=5,4, độ đắng ban đầu 4,5 Bu/g

Khối lượng nấm men ướt: 500kg

2. Xử lý thu hồi bã nấm men bia

Bã nấm men bia sau khi thu nhận từ các nhà máy được rửa, lọc, lắng, khử

đắng

- Lọc qua sàng lọc có kích thước 0,053 µm

- Rửa: tỷ lệ nước rửa: sinh khối nấm men là 2:1 (v:w), số lần rửa: 3 lần,

nhiệt độ nước rửa và lắng là 2-50C, thời gian để lắng 4 giờ.

3. Ly tâm

Sử dụng ly tâm vắt lọc tốc độ ly tâm 2000 v/phút, 150 lít dịch/giờ.

4. Tách đắng

Sau quá trình lọc bã nấm men bia được tách đắng bằng dung dịch NaOH

1%trong điều kiện pH 8,0, tốc độ khuấy để tách đắng là 250 vòng/phút, nhiệt độ tách đắng là 2-50C, thời gian tách đắng: 15 phút.thu được kết quả hàm lượng chất

khô 20,52%, protein tổng 14,8%, pH=6,83, độ đắng 2,08( Bu/g).

5. Thủy phân bã nấm men bia

- Nồng độ enzyme sử dụng : Alcalase = 0,2% và Flavourzyme = 0,1% - Nhiệt độ thủy phân : 55 oC

- Thời gian thủy phân : 24giờ

- pH thủy phân : 6,5

6. Ly tâm thu cặn chứa thành tế bào

Sử dụng thiết bị lọc khung bản: nồng độ chất khô của dịch trước khi lọc

150Bx, tỷ lệ chất trợ lọc 5 g/lít, tốc độ bơm dịch trong quá trình lọc 50 lít/giờ.

Phần dịch chuyển sang sản xuất axit amin. Phần bã chứa thành tế bào nấm

men thu hồi phục vụ sản xuất -glucan.

7. Tinh sạch lần 1 bằng enzyme Alcalase

64

Thành tế bào nấm men đã qua xử lý bằng enzyme Alcalase trên thiết bị nồi 2

vỏ có cánh khuấy như sau:

+ Thành tế bào nấm men bổ sung nước theo tỷ lệ 1:1 (w/v). Bổ sung 0.25%

(v/v) enzyme Alcalase, nhiệt độ thủy phân 550C, thời gian 6 giờ.

+ Cặn chứa -glucan tổng số thu được đã tinh sạch một phần loại bỏ được

manoprotein, peptid (hàm lượng -glucan đạt 65,6%, hàm lượng protein 2.5%), sử

dụng cặn này cho các bước tinh sạch tiếp theo.

8. Tinh sạch lần 2 bằng enzyme Lipozyme CalBL

+ Cặn chứa -glucan đã tinh sạch lần 1(w=65,6%) bổ sung nước theo tỷ lệ

1:1 (w/v), nồng độ enzyme bổ sung theo khối lượng cặn 0.15% (w/w), pH dịch=9

+ Nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân: 5 giờ, + Kết thúc thủy phân bằng gia nhiệt 800C trong 15 phút. Làm lạnh nhanh, ly

tâm thu -glucan tinh sạch (w=80%) sử dụng cho các bước tạo dạng sản phẩm.

9. Tạo dạng sản phẩm bằng phương pháp sấy phun

Tạo dạng trên thiết bị sấy phun Trung Quốc

+ -glucan đã tinh sạch bổ sung nước theo tỷ lệ 1:1 (v/v), bổ sung malto 7

g/lít

+ Chế độ sấy: 1500C, tốc độ sấy 2.5 lít/giờ, tốc độ đầu quay 40.000v/phút.

Hiệu suất thu hồi đạt 86%, chế phẩm có hàm lượng -glucan 74.5%, lượng chế

phẩm1.3 kg.

4.4. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm dinh dưỡng và năng lượng giàu axit amin

và thực phẩm chức năng chứa  - glucan

4.4.1. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm dinh dưỡng và năng lượng giàu axit

amin

4.4.1.1. Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu

Nguyên liệu được chia làm 4 nhóm như sau:

(i) Nguồn cung cấp lipid: dầu thực vật, lòng đỏ trứng gà, shortenning.

(ii) Nguồn cung cấp protid: đạm sữa (whey, sữa gầy), đậu xanh, Cao nấm men.

65

(iii) Nguồn cung cấp glucid: đậu xanh, maltodextrin, trehalose

(iiii) Nhóm Vitamin (A,E,C,D3), khoáng (Ca-gluconate, Selen) và hương liệu và

phụ gia khác

- Dựa vào "Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam" để ước tính

các thành phần các chất dinh dưỡng trong mỗi loại thực phẩm. Kết quả như sau:

Bảng 4.33. Thành phần dinh dưỡng trong mỗi loại thực phẩm khảo sát

Năng lượng Tên Các chất sinh năng lượng (%) (Kcal) TT thực phẩm

Protid Lipid CHO

ĐV TV ĐV TV

Shortenning 99 891 1

Lòng đỏ trứng 35,0 2,5 55,0 675,0 2

Dầu thực vật 100,0 900,0 3

Bơ 90 810 5

Whey protein 80 320,0 6

Cao nấm men 64 256 7

Đậu xanh 23,8 0,8 62,3 346,2 8

Sữa gầy 62 35 9

Bột mỳ 86 10 1,4 396,6 10

Đường mía 99 396,0 11

Trehalose 99 396,0 12

Maltodextrin 99 396,0 13

4.4.1.2. Xây dựng công thức

Căn cứ vào những nguyên liệu trên, qua khảo sát và tham khảo các quy trình

sản xuất các dạng lương khô tại Công ty Cổ phần X22 chúng tôi đã tiến hành xây

66

dựng sơ đồ xây dựng công thức lương khô như sau:

Định lượng

Phối trộn

ủ

Định hình

Nghiền

Nướng

Bột bán thành phẩm

Nguyên liệu glucid Nguyên liệu lipid

Cao nấm men

Trộn

Lựa chọn lượng cao nấm men bổ sung vào lương khô

wheyprotein,

sữa gầy, vitamin, khoáng chất

Bổ sung thêm nguyên liệu protid, vi tamin, khoáng

Ép thanh

Hình 4.4. Quá trình tạo dạng sản phẩm giàu axit amin

67

Với định lượng khẩu phần ăn đảm bảo năng lượng 950-1000 Kcalo/200g, với

3 thành phần sinh nhiệt cơ bản gồm protid, glucid, lipid với tỉ lệ khối lượng như

sau:

Bảng 4.34. Khối lượng các thành phần sinh nhiệt

Thành phần Hàm lượng (%)

Lipid 15-19

glucid 63-65

protid 15-16

Qua quá trình khảo sát, tham khảo ý kiển chuyên gia sản xuất lương khô tại

Công ty cổ phần 22, Bộ Quốc phòng đề tài đã lựa tỉ lệ và thành phần lipid và glucid

để tạo bột bán thành phẩm như sau:

Bảng 4.35. Tỉ lệ và thành phần lipid và glucid để tạo bột bán thành phẩm

STT Đặc điểm Thành phần Công thức 1 Công thức 2

1. Lipid - Khối lượng 30g Shortenning 9 14

Dầu thực vật 6 4

Lòng đỏ trứng 9 6

Bơ 6 6

2. Glucid Bột mỳ 30 30

Đường mía 20 24

Trehalose 20 18 - Khối lượng 130g

Maltodextrin 20 18

Bột đậu xanh 10 10

Sữa gầy 30 30

Đánh giá khả năng định hình bánh, độ nhớt, kết cấu Đạt Đạt

bánh

Chúng tôi lựa chọn 2 công thức để sản xuất thử nghiệm bột bán thành phẩm.

- Shortenning ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc của bánh ép và quá trình nhũ hóa, ủ

bột lên có thành phần thay đổi trong công thức 1 và 2 lần lượt là 9 g và 14 g.

- Đường mía ảnh hưởng nhiều đến độ ngọt của sản phẩm nhất trong các nguồn

68

glucid, do đó được điều chỉnh lần lượt là 20 g và 24 g

- Bột mỳ ảnh hưởng đến cấu trúc bánh, qua tham khảo thành phần bột mỳ trong các

sản phẩm lương khô truyền thống của công ty cổ phần 22, đề tài đã lựa chọn khối

lượng bột mỳ là 30 g cho cả 2 công thức.

Với mục đích sử dụng tối đa nguồn cung cấp protid là cao nấm men, một chế

phẩm giàu axit amin, tuy nhiên do cao nấm men có vị ngọt dậm ảnh hưởng nhiều

đến vị của sản phẩm lương khô nên sau khi sản xuất được bột bán thành phẩm cao

nấm men được bổ sung vào bột bán thành phẩm với hàm lượng như sau:

Bảng 4.36. Công thức để sản xuất thử nghiệm bột bán thành phẩm

Hàm lượng cao nấm men (g) Nhận xét mùi vị

Rất ngọt, khó ăn Công thức 1 35

Rất ngọt , khó ăn 25

Ngọt, khó ăn 20

Ngọt, khó ăn 15

Vừa, dễ ăn 13

Rất ngọt, khó ăn Công thức 2 35

Rất ngọt , khó ăn 25

Ngọt, khó ăn 20

Ngọt, khó ăn 15

Vừa, dễ ăn 13

Như vậy, với cả hai công thức hàm lượng cao nấm nem phù hợp là 13g. Phần

protid còn lại trong khẩu phần ăn được bố sung bằng sữa gầy, wheyprotein với hàm

lượng được thể hiện trong bảng dưới đây:

Bảng 4.37. Khẩu phần ăn được bố sung

Thành phần Khối lượng tổng (g)

Wheyprotein 10

Cao nấm men 13

Protid từ sữa gầy 11

69

Protid từ bột đậu xanh 6

Qua quá trình khảo sát, đề tài đã xây dựng được công thức của sản phẩm

lương khô như sau:

Bảng 4.38. Công thức của sản phẩm lương khô

Đặc điểm Thành phần Công thức 1 Công thức 2 STT

1. Lipid Shortenning 9 14

Dầu thực vật 6 4

- Khối lượng 30g Lòng đỏ trứng 9 6

Bơ 6 6

2. Glucid Bột mỳ 30 30

Đường mía 20 24

Trehalose 20 18 - Khối lượng 130 g

Maltodextrin 20 18

Bột đậu xanh 10 10

Sữa gầy 30 30

Cao nấm men 13 3. Protid 13

wheyprotein 10 10 -Khối lượng 40g Bột đậu xanh 11 11

Sữa gầy 6 6

Hai công thức trên được sử dụng để sản xuất lương khô và đánh giá chi tiết

được thể hiện trong bảng dưới đây:

Bảng 4.39. Công thức để sản xuất lương khô

Kết cấu thanh lương khô Năng lượng lý thuyết (kcal) Độ ngọt

Công thức 1 Độ cứng vừa phải, dễ ăn 950-1000 Vừa

Công thức 2 Độ cứng vừa phải, dễ ăn 950-1000 Ngọt

Qua quá trình khảo sát, đề tài đã lựa chọn công thức 1 để sản xuất lương khô

70

vì có độ ngọt vừa phải, dễ ăn.

4.4.1.3. Xây dựng quy trình sản xuất lương khô

Hình 4.5. Quy trình sản xuất lương khô

Mô tả các giai đoạn:

- Chuẩn bị nguyên liệu: Thu mua nguyên liệu rõ nguồn gốc đảm bảo an

toàn vệ sinh thực phẩm.

- Chế biến nguyên liệu:

+ Bột mì: được làm ẩm trước với nước đạt độ ẩm 20%

+ Bột đậu xanh: Đậu xanh -> làm sạch (bụi bẩn và cát sạn) -> rang chín -> ủ ->

tách vỏ -> nghiền bột.

Yêu cầu:

Bột phải mịn, chín màu vàng, mùi thơm đặc trưng của bột đậu xanh, không

vón cục để ở nhiệt độ bình thường, đóng trong bao tải dứa, trong có lót túi PE buộc

71

chặt chống ẩm, mất mùi thơm.

Bột đậu xanh xay đến đâu đem sản xuất đến đó nếu để lâu bột dễ bị mất mùi

thơm, dễ vón cục.

+ Cân định lượng các thành phần nguyên liệu theo khối lượng trong bảng công thức

và tiến hành thứ tự theo sơ đồ

+ Các chất phụ gia: Các chất làm nở bánh, muối phải được hòa tan hoàn toàn trước

khi trộn.

- Nhào trộn: Bột nhào trước khi định hình phải qua nhiều lần cán nên yêu

cầu bột nhào phải có độ dai thích hợp, thời gian và nhiệt độ nhào trộn.

+ Thời gian nhào trộn: mùa hè: 20 – 25 phút + Nhiệt độ bột nhào: 45 – 470C

+ Độ ẩm bột nhào: 20 – 25 %

Trong thực tế sản xuất các thông số trên có thể thay đổi do phụ thuộc vào

chất lượng nguyên liệu, môi trường không khí (độ ẩm, tốc độ gió và nhiệt độ không

khí). Vì vậy phải điều chỉnh lượng nước, thời gian nhào trộn để bột nhào đạt yêu

cầu chất lượng.

- Cán bánh: bánh được cán để định hình tạo bánh có độ dày khoảng 10mm

trên dây truyền sản xuất bánh quy của Italia

- Nướng bánh: Bánh được nướng trên dây truyền sản xuất bánh quy của

Italia theo gradien nhiệt độ : Khoang đầu: 3000C – 3700C Khoang giữa: 3200C – 3800C Khoang cuối: 3200C – 3800C

Thời gian nướng: 3,20 – 4,20 phút

Trong thực tế sản xuất nhiệt độ nướng bánh và thời gian nướng bánh có thể

thay đổi phụ thuộc vào chất lượng bột nhào, độ ẩm không khí.

- Nghiền đập: Bán thành phẩm lương khô khi đã đạt độ ẩm thích hợp được

đem nghiền tạo bột bán thành phẩm

- Trộn cao nấm men, wheyprotein, vitamin và khoáng chất: Bột bán

thành phẩm được trộn với các nguyên liệu còn lại tạo bột thành phẩm

- Ép bánh: Bột thành phẩm được đưa vào máy ép với khối lượng 50g/thanh

72

Yêu cầu:

Bột bánh lương khô sau khi nghiền phải có kích thước phù hợp, không lẫn

bột bánh cháy.

Thời gian trộn nguyên liệu phụ: 2,5 - 3 phút (bột bánh và các nguyên liệu

phụ sau khi trộn phải đều không bị vón cục).

Thanh lương khô sau khi ép phải chắc, có hình khối chữ nhật rõ nét, đủ trọng

lượng theo yêu cầu.

- Bao gói túi và hộp carton: Bánh được bao gói đủ trọng lượng theo từng

loại sản phẩm, bao gói kín, mép dán đẹp. Hộp carton trước khi sử dụng phải được

điền đầy đủ thông tin (ngày sản xuất, ca sản xuất,...), mỗi hộp phải có đủ số gói quy

73

định.

KẾT LUẬN

1.Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp thích hợp

để thủy phân nấm men bia thu hồi dịch chứa axit amin và thành tế bào chứa

betaglucan như sau:

* Phương pháp sử dụng enzyme làm tác nhân thủy phân thu hồi dịch chứa

axit amin kết quả thu được hàm lượng: Protein tổng 59,39/100g, hiệu suất thủy

phân đạt: 75,38%.

- Enzyme : Alcalase + Flavourzyme

- Nồng độ enzyme sử dụng : Alcalase = 0,2% và Flavourzyme = 0,1% - Nhiệt độ thủy phân : 55 oC

- Thời gian thủy phân : 24 giờ

- pH thủy phân : 6,5

* Phương pháp thủy phân nấm men thu hồi thành tế bào chứa beta glucan

theo phương pháp tự phân kết quả thu được hàm lượng: Protein tổng 35,5g/100g,

hiệu suất thủy phân đạt 37%.

- Nồng độ cơ chất : 14% - Nhiệt độ tự phân : 50 oC

- Thời gian tự phân: 90-94 giờ

- pH tự phân : 5,5

2. Đã nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình tinh sạch protein từ dịch

nấm men ở quy mô pilot như: cột kích có kích thước 10x120cm, nhựa trao đổi ion

Dowex-50W chiếm 3/4 thể tích của cột, nồng độ protein trước khi bơm vào cột là 3,00Bx, tốc độ bơm dịch là 3 lít/giờ, rửa giải bằng dung dịch ammoniac 3%. Hiệu

suất thu nhận axit amin, protein sau khi tinh sạch đạt 56,5%, hàm lượng protein

tổng đạt67,8%, hàm lượng axit amin tổng đạt 33,5%.

Đã nghiên cứu phương pháp tạo dạng sản phẩm giàu axit amin thích hợp là phương pháp sấy phun. Điều kiện sấy nhiệt độ đầu vào: 165 0C; tốc độ tiếp liệu:

2,5lít/giờ; áp suất khí nén 6 bar tương đương tốc độ đầu bơm ly tâm tạo

sương:35000 v/p. Hiệu suất thu hồi sản phẩm bột sau sấy đạt 96%, hàm lượng

74

protein tổng đạt 64,8% và hàm lượng axit amin tổng đạt 32,4%,

Đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ

bã nấm men bia Saccharomyces cerevisiaelà phần nấm men dư thừa lấy sau quá

trình lên men chính.

3.Đã lựa chọn được phương pháp tinh sạch-glucan thô bằng sử dụng

enzyme lipase thương phẩm của Novo là Lipozyme CalBL.

Đã lựa chọn được các điều kiện tinh sạch như sau:

+ Cặn chứa -glucan bổ sung nước theo tỷ lệ 1:1 (w/v), nồng độ ezyme bổ sung

0.15%(w/v), pH =9

+ Nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân: 5 giờ,

+ Kết thúc thủy phân bằng gia nhiệt 800C trong 15 phút. Làm lạnh nhanh, ly tâm

thu -glucantinh sạch sử dụng cho các bước tạo dạng sản phẩm.

Đã lựa chọn được phương pháp tạo sản phẩm cho chế phẩm giàu -glucan

làm thức ăn cho người:

+ -glucanđã tinh sạch bổ sung nước theo tỷ lệ 1:1 (v/v), bổ sung malto

7 g/lít

+ Chế độ sấy: 1500C, tốc độ sấy 2.5 lít/giờ, tốc độ đầu quay 40.000v/ph. Hiệu suất

thu hồi đạt 86%, hàm lượng -glucan74.5%, tổng lượng bột thu được 1.3 kg.

Đã xây dựng được quy trình sản xuất -glucanlàm thức ăn bổ sung cho

người trên quy mô 500 kg nấm men/mẻ.

4. Đề tài đã xây dựng được công thức và lựa chọn được kỹ thuật chế biến để

sản xuất khẩu phần ăn lương khô dựa trên công nghệ và dây truyền sản xuất lương

khô của Công ty cổ phần 22, Bộ Quốc phòng. Sản phẩm lương khô của đề tài đạt

năng lượng bình quân 950-1000 Kcal/200g.

5. Từ nguồn nguyên liệu -glucan sản xuất được đã tiến hành nghiên cứu và

75

sản xuất được thực phẩm chức năng với thành phần: -glucan≥100mg; L.acidofilus, B.subtilis:≥1-5*108 cfu/g.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng VIệt

1. Dương Thanh Liêm, Lê Thanh Hải, Vũ Thủy Tiên (2010),Thực phẩm chức

năng – sức khỏe bền vững, NXB Khoa học và kỹ thuật

2. Giáo trình Dinh dưỡng học

3. Giáo Trình Dinh dưỡng người

4. Hoàng Tích Mịnh và Hà Huy Khôi (1977). Nhu cầu tối thiểu của các axit

amin cần thiết của người

5. Lương Đức Phẩm (2009). Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa Học

và Kĩ Thuật, Hà Nội.

6. Nguyễn Huy Nam (2014), Nghiên cứu hoạt chất sinh học trong sao biển

Astropecten polyacanthus tạo thực phẩm chức năng cho vận động viên điền kinh,

Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

7. Nguyễn Phương (2009). “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sấy phun để thiết

kế chế tạo thiết bị sản xuất bột đậu nành uống liền và bột nấm men giàu protein và

khoáng chất”. Đề tài nghiên cứu cấp bộ, trung tâm Công nghệ Sinh học và Công

nghệ Thực phẩm Hà Nội (Sở KH&CN Hà Nội)

8. Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Vinh Hiển, Bùi Thị Thu Huyền (2008). “Chế

biến nấm men từ phế phụ phẩm sản xuất bia làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi”.

Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 10 tháng 10/2008, trang 64 – 67

9. Nguyễn Thị Kim Ngân (2010), Nghiên cứu thực trạng thể lực và hiệu quả sử

dụng thực phẩm chức năng từ các cơm và cá chìa vôi giúp tăng cường thể lực vận

động viên Pencak silat, Đại học y HN.

10. PGS.TS. Phạm Việt Cường (2009). Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm

chứa axit amin và betaglucan từ nấm men. Viện Khoa học và Côn nghệ Việt Nam

11. Phạm Quỳnh Trang (2012), Nghiên cứu tận dụng phế thải bia sau quá trình

lên men làm thức ăn chăn nuôi, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

12. Quy hoạch tổng thể phát triển ngành rượu bia nước giải khát đến năm 2020.

13. Trần Thị Thanh (2009). Công nghệ Vi sinh. Nhà xuất bản Giáo dục Việt

76

Nam.

14. Trịnh Vinh Hiển (2010). Nghiên cứu sử dụng bột protein nấm men sản xuất

từ phụ phẩm men bia làm thức ăn cho lợn nuôi thương phẩm. Viện Chăn nuôi.

15. Vũ Duy Giảng (2011). Nấm men- nguồn protein quý của động vật nuôi.

Nông nghiệp Việt Nam.vn

Tiếng Anh

16. Alberici, J.C., Farrell, P.A., and Kris-Etherton, P.M., Effects of pre-exercise

candy bar ingestion on substrate utilization and performance in trained cyclists,

Med. Sci. Sports Exerc., 21, S47, 1989.

17. BIOLOGIJA. 2012. β-glucan extraction from Saccharomyces cerevisiae

yeast using Actinomyces rutgersensis 88 yeast lyzing enzymatic complex. 51–59

18. Bohn JA, Bemiller JN, 1995. (1-3) – Beta-D- glucan as biologycal response

modifiers: a review of structure-funtional activity relationship. Carbonhydr Polym

28: 3-14

19. Borts, S., Schoonen, J.C., Kanter, M. Kosharek, S., and Benardot, D.,

Physiology of Anaerobic and Aerobic Exerice, in Sports Nutrition: A Guide for the

Professional Working with Active People, 2 ed., Benardot, D., Eds., The American

Dietetic Association, Chicago, 1993, Chap. 1

20. Chae, H. J., Joo, H., and In, M. (2001). Utilization of brewer’s yeast cells for

the production of food-grade yeast extract. Part I: Effects of different enzymatic

treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics, Bioresour.

Technol., 76, 253–258

21. Chen, J. D., Wang, J. F., Li, K. J., Zhao, Y. W., Wang, S. W., Jioa, Y., and

Hou, X. Y., Nutritional problems and measures in elite and amateur athletes. Am. J.

Clin. Nutr. 49:1084, 1989.

22. Clark, N., Sports Nutrition Guidebook, 2nd ed., Human Kinetics, Champaign,

IL., 1997.

23. Coggan, A.R. and Coyle, E.F., Effect of carbohydrate feedings during high-

intensity exercise, J. Appl. Physiol., 65, 1703, 1988.

24. Coggan, A.R. and Swanson, S.C., Nutritional manipulation before and

during endurance exercise: effects on performance, Med. Sci. Sports Exerc., 24,

77

S331, 1992

25. Coleman, E. and Steen, S.N., The Ultimate Sports Nutrition Handbook, Bull

Pub. Co., Palo Alto, Ca., 1996.

26. Coleman, E.J., Carbohydrate — the master fuel, in Nutrition for Sport and

Exercise, 2nd ed., Berning, J.R. and Steen, S.N., Eds., Aspen Pub., Inc.,

Gaithersburg, MD., 1998, chap. 2.

27. Eden, B.D. and Abernathy, P.J., Nutritional intake during ultra-endurance

running race, Int. J. Sport Nutr., 4, 166, 1994.

28. Fallon, K.E., Broad, E., Thompson, M.W., and Reull, P.A., Nutritional and

fluid intake in a 100–km ultramarathon, Int. J. Sport Nutr., 8, 24, 1998.

29. Gabel, K.A., Aldous, A., and Edgington, C., Dietary intake of two elite male

cyclists during 10-day, 2,050-mile ride, Int. J. Sport Nutr., 5, 56, 1995.

30. Godfrey Chi-Fung Chan, Wing Keung Chan and Daniel Man-Yuen

Sze(2009), “The effects of -glucan on human immune and cancer cells” Journal of

Hematology & Oncology 2:25 doi:1756-8722

31. Grandjean, A. C., Reimers, K. J., and Ruud, J. S., Dietary habits of Olympic

athletes, in Nutrition in Exercise and Sport, Wolinsky, I., Ed., CRC Press, Boca

Raton, FL, 421, 1998.

32. Hasa Tagular, 2008. Utilisation of spent brewer's yeast for yeast extract

production by autolysis: The effect of temperature, Food and Bioproducts

Processing

33. Jung K., Ha Y., Kim W., Moon K.W.(2004) “Antiviral effect of S.cerevisiae

-glucan to swine influenza virus by incereased production of interferon and Nitric

oxide”, J.V.Met, B51,pp 72-76

34. Kanter, M., Refueling for stop-and-go sports, Gatorade Sports Sci. Inst.,

Coaches Corner, (www.gssiweb.com/), 1996, accessed, Sept. 1999.

35. Keller T. (2000). Compounding with s-1,3-D-Glucan. International Journal

of Pharmaceutical Compounding 4: 342-345

36. Leuchtenberger et al., 2005. Biotechnological production of amino acids

and derivatives: current status and prospects

37. Mason, V.C., Meyer, A.V., and Klicka, M.V., Summary of Operational

Rations, Natick, MA: U.S. Army Natick Research & Development Laboratory

78

Technical Report TR-82/013 (June 1982): The MRE was officially type-classified

for adoption in 2000 b.c but due to budget cuts was not officially placed into

production until 1981; stocks of the MCI continued to be issued until exhausted.

38. Max.Bergmann, New Yord. NY. A Classification of proteolytic Enzyme..

39. Method for separating and purifying amino acid. US 4554376 A

40. Nathalie Dallies, Jean Francois and Veronique Paquet (1998), A new method

for Quantitative Determination of Polysaccharides in the Yeast Cell wall.

Application to the cell wall Defective Mutants of S. cerevisiae. Yeast 14. 1297-

1306

41. P.Magnelli, J.F.Cipollo and C.Abeijon, Anal.Biochem., 2002, 301, 136-150

42. Pelizon AC, et al. (2005) Immunomodulatory activities associated with beta-

glucan derived from Saccharomyces cerevisiae. Physiol Res54(5):557-64

43. Peter N., Lipke and Rafael Ovalle (1998), “ Cell wall Architecture in Yeast,

New structure and New Challenges”. Journal of Bacteriology, 40 : pp 3735-3740

44. Rankinen, T., Lyytikainen, S., Vanninen, E., Penttila, I., Rauramaa, R., and

Uusitupa, M., Nutritional status of the Finnish elite ski jumpers. Med. Sci. Sports

Exerc. 30:1592, 1998.

45. Reseach History (2011), betaglucan.org/history.htm

46. Rico-Sanc, J., Frontera, W. R., Mole, P. A., Rivera, M. A., Rivera-Brown, A.,

and Meredith, C. N., Dietary and performance assessment of elite soccer players

during a period of intense training. Int. J. Sport Nutr . 8:230, 1998.

47. Saris, W. H. M., van Erp-Baart, M. A., Brouns, F., Westerterp, K. R., and ten

Hoor, F., Study on food intake and energy expenditure during extreme sustained

exercise: The Tour de France. Int. J. Sports Med., 10, S26, 1989.

48. Sugiura, K., Izumi, S., and Kobayashi, K., Nutritional intake of elite

Japanese track-and-field athletes. Intl. J. Sport Nutr. 9:202, 1999.

49. Trappe, T. A., Gastaldelli, A., Jozsi, A. C., Troup, J. P., and Wolfe, R. R.,

Energy expenditure of swimmers during high volume training. Med. Sci. Sports

Exerc., 29,950, 1997.

50. Valdemiro C. Sgarbieri et al, 2005, Yeast (Saccharomyces cerevisiae)

protein concentrate:  preparation, chemical composition, and nutritional and

79

functional propertie, J. Agric. Food Chem

51. Vesna Zechner-Krpan và cs, 2010, Potential Application of Yeast β-Glucans

in Food Industry

52. Yaspelkis, B.B., Patterson, J.G., Anderla, P.A., Ding, Z., and Ivy, J.L.,

Carbohydrate supplementation spares muscle glycogen during variable-intensity

exercise, J. Appl. Physiol., 75, 1477, 1993.

53. Bacon & Farmer,1969; Aimaniada et al, 2009

54. Klis et al, 2002; Stewart & Russell, 1998

55. Stewart & Russell, 1998

80

56. Kazumi Araki, Toshitsugu Ozeki (2003). Amino acids.