Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE

TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE

TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Thị Tuyên

PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội – Năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin trân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng

CNSH Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, lên

kế hoạch, tận tình theo sát hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ dạy kiến thưc

chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất để em có thể học tập và thực hiện luận văn tại

phòng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và công nghệ Việt Nam.

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy.

Người thầy, không những chỉ bảo tận tình cho em về mặt kiến thức, mà thầy còn

cho em những lời khuyên bổ ích và định hướng giúp đỡ cho em trong suốt quá trình

làm luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ sinh học enzyme –

Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn em trong

quá trình học tập, nghiên cứu.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân trong gia

đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em để

em vững bước và hoàn thành luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 3 tháng 12 năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Kim Thu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3

1.1. Sơ lược về enzyme xylanase……………………………………………………………………3

1.1.1. Định nghĩa .............................................................................................. 3

1.1.2. Phân loại ................................................................................................. 4

1.1.3. Cấu trúc .................................................................................................. 4

1.1.4. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác ........................................................... 6

1.2. Ứng dụng của enzyme xylanase ........................................................................ 10

1.2.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trường quốc tế .................................. 10

1.2.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ....................................... 11

1.2.3. Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 11

1.2.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy .................................................... 12

1.2.5. Các ứng dụng khác .............................................................................. 13

1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase.................................................... 13

1.3.1. Trên thế giới ........................................................................................ 13

1.3.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 18

CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 20

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ............................................................................. 20

2.1.1. Chủng giống ........................................................................................ 20

2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 20

2.1.3. Môi trường ........................................................................................... 22

2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 23

2.2. Phương pháp ................................................................................................... 24

2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase ............................................. 24

2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase ..................................................... 24

2.2.3. Xác định hàm lượng protein ................................................................ 26

2.2.4. Tinh sạch xylanase .............................................................................. 27

2.2.5. Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 30

2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase ............................................... 31

2.2.7. Xử lý số liệu ........................................................................................ 34

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 36

3.1. Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng

hợp xylanase .......................................................................................................... 36

3.2. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp ........................... 39

3.2.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ ...................................................... 39

3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH .................................. 40

3.2.3. Dung môi hữu cơ ................................................................................. 41

3.2.4. Chất tẩy rửa ......................................................................................... 42

3.2.5. Ion kim loại .......................................................................................... 43

3.3. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp ......... 43

3.3.1. Tinh sạch enzyme tự nhiên .................................................................. 44

3.3.2. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp 45

3.3.3. Khả năng phân giải cơ chất của xylanase tự nhiên và tái tổ hợp ........ 46

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52

CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................................. 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase .................................................. 14

Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật ........................................... 15

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng ............................................................................... 20

Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch ................................................... 21

Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng ................................................................................. 23

Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách ................................................................. 31

Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng

A. niger VTCC017/ pANXlG2 ................................................................. 39

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp .......... 42

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính của xylanase ......................... 43

Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng gốc A. oryzae VTCC-F-187 ... 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân

xylan ............................................................................................................. 3

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran .......... 5

Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 ....................................... 6

Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng .............................................................. 7

Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm .............................................................. 7

Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ ...................................... 8

Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase ............................................................. 10

Hình 2.1: Đường chuẩn xylose ................................................................................ 26

Hình 2.2: Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn ................................ 27

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger tái tổ hợp .... 28

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. oryzae tự nhiên .... 28

Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số của các mẫu protein và hoạt tính xylanase tái

tổ hợp trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất xylan 0,5% ................................ 36

Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A. oryzae

VTCC-F187; (B) chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp ......... 37

Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sau khi qua cột histag xylanase G2 ........ 38

Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của

xylanase tái tổ hợp ..................................................................................... 39

Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của

xylanase tái tổ hợp ..................................................................................... 40

Hình 3.6: Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol

(EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên

hoạt tính xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng) ................................... 41

Hình 3.7: (A) Sắc kí đồ trên cột Sephadex G200, (B) Điện di đồ SDS-PAGE của A.

oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sephadex G200, (C) Điện di đồ SDS-

PAGE của A. oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sắc kí trao đổi ion

DEAE ......................................................... Error! Bookmark not defined.

Hình 3.8: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân arabinoxylan lần lượt thương

mại và hãng của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp với hệ

dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) ........................................ 46

Hình 3.9: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân cơ chất của enzyme xylanase tự

nhiên và enzyme tái tổ hợp sạch với hệ dung môi n-butanol : acid acetic :

H2O = (3:1:48)…………………………………………………………………..……49

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ

Ammonium persulfate

APS

Acid ribonucleic

ARN

BLAST

Basic local alignment search tool

Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

BSA

Base pairs

Complement DNA

cDNA

Acid Deoxyribonucleic

DNA

2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate

dNTP

Đối chứng

ĐC

Ethylene diamine tetraacetic acid

EDTA

Kilo dalton

kDa

Marker (thang chuẩn)

Microgam

μg

Microliter

μl

Optical density

Sodium dodecyl sulfate

SDS

SDS- PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine

TTH

Tái tổ hợp

VTCC

Vietnam Type Culture Collection (Trung tâm bảo tàng giống VTCC)

v/v

Volume/ volume

w/v

Weight/ volume

MỞ ĐẦU

Xylan một loại polysacharid chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose của

thành tế bào thực vật. Để phân giải hoàn toàn xylan thành xylose cần có sự phối hợp

của nhiều loại xylanase khác nhau với các chức năng khác nhau (endo-β-1,4-D-

xylanase, EC 3.2.1.8; β-D-xylosidase, EC3.2.1.37; α-L-arabinofuranosidase, EC

3.2.1.55; α-D-glucuronidase, EC 3.2.1.1; acetyl xylan esterase; EC 3.1.1.6).

Endoxylanase có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase

dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc

(chlorine) thường dùng để tẩy lignin trong giấy [14], làm trong nước hoa quả, rượu

vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo [67]. Xylanase thủy phân

hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) và chuỗi oligosaccharid arabinoxylan ngắn hơn

(arabinoxylanoligosaccharid-AXOS). Arabinoxylan (AX) là một thành phần chất xơ

chính được tìm thấy trong một loạt các loại ngũ cốc, được dùng cho chế độ ăn kiêng có

tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngườ. Nên arabinoxylan được định hướng dùng làm

phẩm chức năng [71, 61, 57].

Rất nhiều chủng vi sinh vật tự nhiên từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi được công

bố có khả năng sản xuất xylanase, trong đó nấm mốc là sinh vật tiềm năng có khả năng

tổng hợp xylanase hoạt tính cao [38]. Vì những lý do ứng dụng khác nhau, rất nhiều

loại xylanase được sản xuất từ chủng Bacillus [14] và chủng nấm Aspergillus như

Aspergillus awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus giganteus, Aspergillus nidulans,

Aspergillus niger và Aspergillus sydowii đã được tinh sạch và đánh giá một số tính chất

lý hóa của xylanase [33, 34, 49, 57, 62, 85]. Các nghiên cứu trong nước cũng như trên

thế giới đã tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp xylanase như

E. coli [88], Bacillus [85], Pichia pastoris [16]. Chủng Aspergillus niger

VTCC017/pANXlnG2 đã được tạo ra từ việc nhân đoạn gen xylanase từ chủng

Aspergillus oryzae VTCC F187, gen mã hóa xylanase được chèn vào vector biểu hiện

pAN7.1GluA với cặp mồi đặc hiệu, plasmid tái tổ hợp được đưa vào A. niger VTCC

017 với chất cảm ứng hygromycin sau 72 giờ nuôi cấy chủng có khả năng sinh tổng

hợp enzyme xylanase cao. Với mong muốn ứng dụng chủng vào thực tế sản xuất

enzyme xylanase tái tổ hợp định hướng nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan

và các chế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch

và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp” với mục

tiêu sau:

1. Tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp

2. Đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp

3. Thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme

xylanase tự nhiên.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lƣợc về enzyme xylanase

1.1.1. Định nghĩa

Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of

Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có [67]:

Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase

Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase;

xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D-

xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β- xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase;

endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase

Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase

Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan

tạo thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose (Hình 1.1) [67].

Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy

phân xylan [67]

1.1.2. Phân loại

Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. Chúng được

phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối lượng

phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng:

Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm

mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là họ F).

Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi

khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G) [52,

73].

Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ 10

có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu

không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [41]. Trong khi

endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì

endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế.

Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng

đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ hơn.

Sapag và cộng sự (2002) chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III

chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc. Các enzyme nhóm I và II thường là các

enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và

Basidiomyceta. Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị

pI ở phía axit. Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí.

Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C. Nhóm

A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn

toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương. Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ

yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [73].

1.1.3. Cấu trúc

Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các

enzyme [81], từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans

có nét đặc trưng của họ 11 [41]. Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo thành

(A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như

một phần bàn tay phải được đóng lại [73]. Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của

các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba

của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β.

Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ

được tạo thành từ 8 mảnh.

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran [39]

Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β cái mà

làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác. Vũng lõm này được so sánh

với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải.

Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân tử isoleusin [41].

Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [Jeffries1996]

Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc

tác. Meagher và cộng sự (1998) nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei có thể

liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3

vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác [59]. Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên

kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [21, 80].

1.1.4. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác

1.1.4.1. Đặc điểm cơ chất

Xylanase chủ yếu thủy phân xylan và một phần nhỏ cellulose. Xylan là thành

phần chính cấu tạo hemicellulose tập trung chủ yếu ở cấu trúc thứ cấp của thành tế bào

thực vật, và là một trong số polysaccharid quan trọng trong tự nhiên [48].

Ở cây gỗ cứng, xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan (Hình

1.4), còn ở cây gỗ mềm là arabino-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.5). Ở các loài

ngũ cốc, thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete

4-Omethylvà arabinose.

Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng [48]

Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm [48]

1.1.4.2. Phức hệ enzyme phân cắt xylan

Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan. Sử

dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện

nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế. Nhưng vấn đề ô nhiễm môi trường đang

ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu ra phương pháp

thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng enzyme sinh học. Phân

huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme [68], trong đó endo-

β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện nhiệm vụ phân

cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các

oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β- 1,4-D-xylan xylohydrolase EC

3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các nhóm bên có mặt

trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase,

galactosidase và acetyl xylan esterase.

Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [68]

Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo-

oligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử. Sự thủy phân liên kết α-

1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự như

liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với

xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng

hợp α-glucuronidase [39].

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết của

các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose với axit

acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic

(feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p- coumaroyl

esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho

sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên

kết este giữa lignin và hemicellulose. Nếu sử dụng cùng với xylanase và các enzym

phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase có thể phá vỡ và làm lỏng

lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [19].

Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là

enzyme xylanase [67]. Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt các

liên kết của xylan.

1.1.4.3. Cơ chế xúc tác

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase [23, 41, 50,

53]. Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua

Hình 1.7:

(a) Xylanase nhận diện xylan và liên kết nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần

cánh trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí

đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 (a); [41]

(b) Hai gốc glutamat (Glu) được định vị cho phù với vị trí hoạt động (khoảng 5,5

Å). Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện tử [41];

liên kết glycosidic bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị

enzyme – cơ chất (b) [53];

(d) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thành

ion 𝐻+ gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi 𝑂𝐻− gắn vào đầu khử

của mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm

được giải phóng (c), (d) [50];

(e) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và phân

tán các đường (xylose) [41].

Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase

1.2. Ứng dụng của enzyme xylanase

1.2.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trƣờng quốc tế

Enzym xylanase được sử dụng thương mại trong một số ngành công nghiệp như

tẩy trắng bột giấy, thực phẩm, thức ăn và sản xuất bia. Ứng dụng chính của xylanase

là tẩy trắng bột giấy và được sản xuất bởi các công ty khác nhau trên thế giới với

nhiều tên thương mại khác nhau như Bleachzyme (Biocon, Ấn Độ), Cartzyme

(Sandoz, US), Cartzyme MP (Clarient, UK), Ecozyme (Thomas Swan, UK), Ecopulp

(Alko Rajamaki, Phần Lan…. Xylanase được sản xuất thương mại bởi một số ngành

công nghiệp quốc tế để ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn

chăn nuôi. Sankyo từ Nhật Bản, Ciba Giegy từ Thụy Sĩ sản xuất xylanase với tên

thương mại lần lượt là Sanzyme và Albazyme-10A, và đã được sử dụng thương mại

trong ngành công nghiệp thực phẩm và làm bánh. Một công ty Đan Mạch Novo

Nordisk, 2017) [82]. Một công ty Mỹ Alltech, Inc., sản xuất thương mại xylanase với

tên thương mại Allzym PT và Fibrozyme và đã được sử dụng để nâng cấp thức ăn

chăn nuôi. Hầu hết các xylanase thương mại được sản xuất bởi nguồn nấm do tiềm

năng sản xuất cao.

1.2.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Xylanase đóng vai trò quan trọng trong thức ăn chăn nuôi bằng cách phá vỡ

thành phần thức ăn arabinoxylan và làm giảm độ nhớt của nguyên liệu thô. Chủng A.

japonicus C03 với khả năng sản xuất endoxylanase và cellulase tốt với độ ổn định

cao trong môi trường dạ cỏ dê, cho thấy các ứng dụng đối với động vật nhai lại

[32]. Một số nghiên cứu đã cho thấy sự sẵn có xylanase trong các sản phẩm chưng

cất hạt khô có thể hòa tan (DDGS) được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi và sử dụng

xylanase ngoại sinh trong chế độ ăn của gia cầm để xử lý hàm lượng chất xơ cao hơn

[66, 83]. Bổ sung xylanase cho thấy sự cải thiện cân nặng và tăng tỷ lệ chuyển đổi

thức ăn vì sự cải thiện khả năng tiêu hóa arabinoxylan trong chế độ ăn của động vật

[78]. ECONASE XT một quảng cáo nổi tiếng endo -1,4-xylanase đã được sử dụng

làm phụ gia thức ăn cho gà vỗ béo, heo con cai sữa và vỗ béo cho lợn [72].

1.2.3. Trong công nghiệp thực phẩm

Xylanase tìm thấy ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm như công

nghiệp bánh mì. Bánh mì được tạo thành từ lúa mì bao gồm hemicelluloses như

arabinoxylan. Xylanase có thể hòa tan arabinoxylan không thể tách rời thành

arabinoxylan chiết xuất được trong nước [24]. Điều này giúp phân phối nước đồng đều

và cải thiện sự hình thành mạng gluten bột trong suốt. Butt et al. (2008) đã chứng minh

vai trò của GH11 endoxylanase từ B. subtilis trong việc hòa tan arabinoxylan

[22]. Điều này làm tăng độ nhớt và khối lượng bột và giảm sự kết tụ gluten và độ cứng

của bột làm cho các mảnh vụn đồng đều và mịn. GH11 xylanase (0,12 U/g bột)

từ Penicillium constitanis Pol6 cải thiện quá trình sản xuất bánh mì như giảm sự hấp

thụ nước (8%) và tăng bột nhào (36,8%), khối lượng (17,8%), cụ thể khối lượng

(34,9%) và độ kết dính. Bánh mì đã được cải thiện tính chất lưu biến và cảm quan (kết

cấu, hương vị, hương vị, độ mềm). Xylanase được tinh chế một phần để sản xuất bánh

mì có đặc tính cảm quan tốt hơn (màu sáng hơn) [36]. Việc bổ sung xylanase cũng dẫn

đến tăng khối lượng riêng và thời hạn sử dụng, với độ cứng thấp hơn và thuận tiện

trong quá trình bảo quản. Tương tự, xylanase tái tổ hợp (r-XynBS27) thu được

từ Pichia pastoris (gen xynBS27 từ Streptomycessp. S27) được sử dụng làm phụ gia

trong quá trình làm bánh mì.

Quá trình sử dụng enzyme trong chiết xuất và làm trong nước ép trái cây được sử

dụng rộng rãi. Nước ép trái cây thô chứa polysacaride như cellulose, hemicellulose,

pectin tinh bột và lignin liên kết bề mặt và làm giảm chất lượng của nước ép, ví dụ,

màu đục và độ nhớt cao. Việc sử dụng enzyme làm giảm độ nhớt và tránh sự hình

thành các cụm, bằng cách loại bỏ chất rắn lơ lửng và không hòa tan bằng phương pháp

ly tâm và lọc. Điều này làm tăng độ trong, mùi thơm và màu của nước ép

[26]. Xylanase được tinh chế một phần từ Streptomyces sp AOA40 đã được sử dụng

trong ngành công nghiệp nước ép trái cây để tăng độ trong của nước ép từ táo (17,8%),

cam (18,4%) và nho (17,9%) [10]. Xylanase cố định hoạt hóa glutaraldehyde được sử

dụng để làm trong nước ép cà chua. Xylanase từ P. acidilactici GC25 đã được sử dụng

cho kiwi, táo, đào, cam, mơ, nho và lựu trong đó tăng lượng đường và giảm độ đục của

nước ép [11].

1.2.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy

Quá trình loại bỏ lignin từ bột gỗ để tạo ra giấy thành phẩm trắng sáng được gọi

là tẩy trắng [17]. Theo truyền thống, các chất tẩy trắng hóa học (như clo) được sử

dụng để tẩy trắng [75]. Việc sử dụng các enzyme ligno-hemiaellulolytic để tẩy trắng

đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Xylanase có khả năng thủy phân xylan được

liên kết với cellulose và lignin của sợi bột giấy. Do đó, sự gián đoạn xylan cuối cùng

sẽ dẫn đến sự phân tách giữa các thành phần này, cải thiện việc chiết xuất lignin từ

bột giấy [77]. Do đó, xylanase kết hợp với enzyme phân giải lignin giúp tăng độ sáng

của bột giấy [65]. Sự tiếp xúc của sợi cellulose với quá trình nghiền enzyme giúp

tăng cường lực liên kết của giấy và cải thiện độ bền của giấy thông qua sự thoái biến

của xylan và loại bỏ lignin trong quá trình xử lý enzyme [55]. Hệ thống enzyme đã

được lựa chọn rất cao, không độc hại, thân thiện với môi trường để tẩy trắng sinh học

[15].

Tiền xử lý Paenibacillus campinasensis BL11 xylanase cho thấy độ sáng và độ

nhớt của bột giấy gỗ cứng tăng lên [47]. S. thermophilum xylanase hoạt động ở nhiệt

độ cao (50-70°C) đã được sử dụng để tẩy trắng bã mía [43]. T. lanuginosus VAPS24

xylanase ổn định ở phạm vi pH rộng có thể hữu ích trong cả hai chế phẩm sinh học

kiềm và axit [51]. Các đơn vị sản xuất giấy của các quốc gia khác nhau, tức là Nhật

Bản, Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Châu Âu đang dần thay thế tẩy trắng bột hóa học bằng tẩy

trắng bột qua trung gian xylanase. Canada được biết đến là nhà sản xuất bột giấy hàng

đầu và họ đang tẩy trắng hơn 10% bột giấy thông qua xylanase [28].

1.2.5. Các ứng dụng khác

Xynalase được ứng dụng rộng rãi trong việc làm mềm rau quả, gạn lọc chất xơ

trong công nghiệp nước hoa quả và rượu vang, hóa lỏng chất nhày trong quá trình tạo

café lỏng, tách chiết hương liệu và chất màu, dầu thực vật và tinh bột…Ngoài ra

xynalase còn được dùng trong các nghiên cứu khoa học. Như trong việc mô tả một vài

xylanase có được sử dụng nhằm cải thiện khả năng làm mềm thành tế bào đối với quá

trình tạo tế bào trần.

1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase

1.3.1. Trên thế giới

1.3.1.1. Xylanase tự nhiên

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật, nhiều loại vi khuẩn và nấm

được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [17, 70, 84].

Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [75]

Vi sinh vật Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml)

Nấm mốc

12,00 Aspergillus awamori VTT-D-75028

138 Aspergillus niger KKS

250 Aspergillus niger

3,70 Fusarium oxysporum VTT-D-80134

15-20 Phanerochate chrysosporium

7,96 Piromyces sp. strain E2

650-780 Thermomyces lanuginosus

960 Trichoderma reesei

Vi khuẩn

506 Bacillus SSP-34

400 Bacillus circulans

2,33 Bacillus stearothermophilus StrainT6

120 Bacillus sp.

93 Bacillus sp. strain NCL 87-6-10

19,28 Bacillus circulans AB 16

96 Streptomyces sp. QG-11-3

42 Thermoactinomyces thalophilus sub

group C

Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [76]

Điều kiện tối ƣu

Độ bền

KLPT

Vmax (µmol

pI

Km (mg/ml)

Nhiệt độ

Vi sinh vật

(KDa)

/ phút /

pH Nhiệt độ pH (giờ)

(giờ)

Nấm mốc

Acrophialophora

60 (1)

7,0

16 -

5,5-6

5,7-6,7

10000

1,0

Aspergillus awamori

5,0

3,7

3333

0,33

45-50

4,0

3,3-3,5

455

0,09

Aspergillus nidulans

4,0-6,7

3,4

1091

0,97

Aureobasidium

4,5

7,6

2650

4,8

9,4

pullulans

7,5-

6,3

118,4

5,26

Cephalosporium sp.

7,5-

4,4

145,2

4,16

Erwinia chrysanthemi 42

5,5

4-7

8,8

7,0

6,0-7,5

40 (3)

8,6

Penicillium

purpurogenum

3,5

4,5-5,5

40 (3)

5,9

Trichoderma viride

9,3

4,5

160

Trichoderma

5,0

0,58

0,106

harzianun

Vi khuẩn

Aeromonas caviae

3,0-4,0

6.5-8

7,1

9,4

4330

ME1

Bacillus sp. Strain

6,0

70 (4)

0,7

145

SPS-0

21,5

4,5-10

8,5

4,5

Bacillus sp.W1

(JCM2888)

49,5

7,9

4,5-7,0

3,7

0,95

7,8

Streptomyces T-7 20,64

4,5-5,5

5,0 (144) 37 (264)

7600

5,5-6,5

60-65

5,5-6,5

7,1

9,1

Streptomyces sp. No

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

10,06

3137

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

10,26

11,2

0,36

1,18

266b

Thermotoga thermarum

35C

90-

0,24

19,5

1.3.1.2. Xylanase tái tổ hợp

Để có năng suất enzyme cao với các đặc tính cụ thể như độ ổn định cao trong

phạm vi nhiệt độ và pH rộng, độ đặc hiệu cơ chất cao và khả năng kháng mạnh đối với

các cation kim loại và hóa chất cho ứng dụng công nghiệp [35, 69]. Enzyme nội sinh

thường được sản xuất với số lượng thấp và cũng thiếu tất cả các đặc tính để đáp ứng

nhu cầu công nghiệp [13]. Do đó, các phương pháp công nghệ sinh học khác nhau

được sử dụng để cải thiện năng suất và truyền các đặc tính đặc trưng cho enzyme

mong muốn. Những phương pháp này liên quan đến thao tác di truyền liên quan đến

đột biến và công nghệ DNA tái tổ hợp.

Nhân bản gen và biểu hiện gen xylanase bằng DNA tái tổ hợp. Các xylanase tái

tổ hợp được thiết kế để có các đặc tính tương đương hoặc tốt hơn các enzyme tự nhiên

có năng suất cao trong hệ thống biểu hiện, để có thể được sử dụng trong ngành công

nghiệp lên men.

Một số nghiên cứu cho thấy gen xylanase mong muốn đã được nhân bản vào

vectơ phù hợp, sau đó là biểu hiện của nó trong các hệ vi sinh vật phù hợp như vi

khuẩn, nấm men và nấm [18, 37, 42, 44, 63, 79].

Biểu hiện ở vi khuẩn

Goswami và cộng sự (2014) đã nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xylanase từ

Bacillus brevis trong E. coli BL21. Chủng tái tổ hợp chủ yếu tiết ra xylanase trong môi

trường nuôi cấy với hoạt tính xylanase đạt 30 IU/ml. Dịch lọc nuôi cấy không có hoạt

tính cellulase và được tìm thấy hoạt động trong khoảng rộng pH và nhiệt độ [37]. Một

gen mã hóa xylanase ổn định nhiệt kiềm (Mxyl) đã được lấy từ thư viện và nhân bản

vector pET28a biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3). Xylanase tái tổ hợp có thời gian

bán hủy lần lượt là 2 giờ và 15 phút ở 80°C và 90°C. Xylanase tái tổ hợp có pH tối ưu

và nhiệt độ tương ứng là 9,0 và 90°C [79].

Escherichia coli được sử dụng rộng rãi nhất do điều kiện tăng trưởng không tốn

kém, thao tác dễ dàng, yêu cầu kỹ thuật đơn giản, mức độ tích lũy sản phẩm cao trong

tế bào chất của tế bào [42]. Tuy nhiên, với E. coli khả năng biểu hiện hiệu quả và chức

năng của nhiều gen xylanase là không có, điều này có thể là do sự xuất hiện lặp đi lặp

lại của các codon hiếm và yêu cầu điều chỉnh dịch mã (hình thành liên kết disulfide và

glycosyl hóa [18, 42, 44]. Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa xylanase của A.

usamii E001. Gen mã hóa một protein gồm 184 amino acid, có khối lượng 19,8 kDa.

Vùng mã hóa của gen có một intron nên việc nhân dòng gen được tiến hành thông qua

bước tổng hợp cDNA từ RNA. Cùng với việc sử dụng pET-28a (+) làm vector biểu

hiện, gene được biểu hiện trong E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL. Xylanase từ

chủng tái tổ hợp có hoạt tính cao nhất đạt 49,6 U/mg. Nhiệt độ và pH tối ưu là 50°C,

pH 4,6. Hơn 50% hoạt lực enzyme duy trì trong dải pH từ 4,2 - 5,3. Đây là công bố

đầu tiên về việc tách dòng gen xylanase từ A. usamii [88].

Biểu hiện và đặc tính của gen xylanase (xynB) từ Dictyoglomus thermophilum

Rt46B.1 trong hệ thống Bacillus subtilis. Độ pH tối ưu và nhiệt độ của enzyme tái tổ

hợp đã được tinh chế lần lượt là 6,5 và 85°C. Xylanase bền ở 95°C và hoạt tính vẫn

còn được duy trì khi được ủ với các chất hoạt động bề mặt như EDTA, DTT, và Triton

X-100 [86, 87].

Biểu hiện trong nấm men

Sự biểu hiện protein dị loại trong hệ thống nấm men rất hấp dẫn nhờ khả năng

thực hiện các sửa đổi sau dịch mã của sinh vật nhân chuẩn và có thể phát triển đến mật

độ tế bào rất cao với khả năng tiết enzyme vào môi trường lên men. Hầu hết các loại

nấm men không tạo ra độc tố [44]. Saccharomyces cerevisiae đã được thiết lập như

một vi sinh vật công nghiệp, do đó, có thể được sử dụng thuận tiện cho sản xuất

xylanase [13].

Việc áp dụng Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện đã trở nên khó khăn vì nó

có thể tự thúc đẩy sự biểu hiện của protein bằng cách sử dụng rượu oxyase làm chất

xúc tiến sử dụng con đường sử dụng metanol [13, 44]. Pichia pastoris là hệ thống biểu

hiện được ưa thích vì nó có thể phát triển với mật độ tế bào rất cao, thừa hưởng các

chất xúc tiến mạnh và được điều hòa chặt chẽ, và tạo ra protein tái tổ hợp (g/L) cao cả

về nội bào và ngoại bào [12]. Nhân bản của hai gen GH11 xylanase, MYCTH_56237

và MYCTH_49824, từ nấm ưa nhiệt Myceliophthora thermophila và biểu hiện của nó

trong Pichia pastoris. Hoạt độ của xylanase tái tổ hợp lần lượt là 1533,7 U/mg và

1412,5 U/mg đối với MYCTH56237 và MYCTH_49824. Xylanase tái tổ hợp ổn định

trong điều kiện khắc nghiệt (pH và nhiệt độ cao) và hiệu quả cao đối với quá trình

đường hóa sinh khối [16]. Tuy nhiên, việc áp dụng Pichia pastoris ở quy mô lớn bị

hạn chế do các nguy cơ về sức khỏe và cháy nổ của methanol [13].

Biểu hiện ở nấm sợi

Nấm sợi có thể được sử dụng một cách hiệu quả cho biểu hiện gen dị loại và

tương đồng dẫn đến sản lượng gen tái tổ hợp cao [74, 63, 64].

Việc áp dụng nấm như một hệ thống biểu hiện cũng có những lợi thế liên quan

đến chi phí của tổng thể quy trình do cơ chất chi phí thấp. Hơn nữa, nấm đã trải qua

nhiều quy trình cải tiến chủng để tăng cường sản xuất xylanase. Do đó, máy móc biểu

hiện xylanase tự nhiên có thể được sử dụng một cách hiệu quả để biểu hiện chức năng

của một gen xylanase ngoại lai từ các nguồn khác. Gen xylanase xyn2 được biểu hiện

ở T. reesei bằng biểu hiện tương đồng dẫn đến 1,61 g/L của xylanase 2 trên môi

trường chứa glucose [54]. Sự biểu hiện của gen xylanase 2 (XYN2) và xylanase từ

nấm ưa nhiệt Humicola grisea var. thermoidea và P. griseofulvum đã được thể hiện

trong Trichoderma reesei và Aspergillus oryzae [27]. Một đánh giá toàn diện về ứng

dụng của nấm sợi làm hệ thống biểu hiện và cho rằng nghiên cứu hiện đang tập trung

vào việc tìm hiểu các cơ chế tế bào để kiểm soát chất lượng protein tốt hơn và quá

trình bài tiết. Việc sử dụng các công cụ omics có thể giúp cải thiện quy định sản xuất

xylanase bằng cách sử dụng nấm sợi làm hệ thống biểu hiện [63].

1.3.2. Tại Việt Nam

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ các chủng vi sinh

vật. Nguyễn Thị Uyên Thảo và cộng sự (2004) đã nghiên cứu về việc sử dụng vi nấm

Trichoderma để thu nhận các enzyme cellulose, xylanase và pectinase từ nguồn

nguyên liệu bã khoai mì. Tổ hợp enzyme này được nghiên cứu, ứng dụng vào sản xuất

thức ăn chăn nuôi [4].

Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2009) ghiên cứu và đánh giá một số tính chất hóa lý

của chủng Aspergillus niger DSM1957 trên dịch tinh sạch sơ bộ. Hoạt tính của enzym xylanase đạt cao nhất ở nhiệt độ 55oC, pH là 5,0. Hoạt tính xylanase bị giảm khi ủ với một số ion kim loại (Fe2+, Fe3+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, K+, EDTA) ở nồng độ 2

mM [7].

Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp. Năm 2009,

Nguyễn Thị Thu Thùy và cộng sự đã biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của

xylanase tái tổ hợp từ A. oryzae VTCC F187 trong Pichia pastoris GS115 [5]. Khi

nghiên cứu biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của xynalase tái tổ hợp từ chủng

Asprgillus niger DSM1957 trong Pichia pastoris GS115. Hoạt tính xynalase tái tổ hợp cao nhất là 125 U/mg protein. Nhiệt độ và pH tối ưu là 40oC và pH 4,0. Hoạt tính xynalase vẫn còn duy trì được hơn 70% sau khi ủ 1h ở pH 4,0 – 5,0 và 40oC [8].

Lê Văn Trường, Thomas Schweder (2010) đã biểu hiện gen mã hóa xylanase

trong B. subtilis sử dụng promoter α-amylase từ B. amyloliquefaciens. Sau khi biểu

hiện, hàm lượng XynA tái tổ hợp được tiết ra môi trường ngoại bào với mức độ cao,

đạt khoảng 0,5 mg/ml trên môi trường BMM. Nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu tương ứng là 50oC và pH 6,0 [6].

CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1. Chủng giống

Chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp được cung cấp bởi phòng Công

nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học. Chủng được tạo ra bằng sử dụng

đoạn gene mã hóa sinh tổng hợp xylanase G2 từ A. oryzae VTCCF187 có kích thước

699 bp mã hóa cho 232 acid amin được nhân dòng, phân tích trình tự và đăng ký trên

gene bank với mã số E4848307. Gen được chèn vào vector biểu hiện pAN7.1GluA, với

cặp mồi đặc hiệu có điểm cắt enzyme giới hạn BamHI, plasmid tái tổ hợp được đưa vào

A. niger VTCC017

Chủng A. oryzae VTCC F187, A. niger VTCC 017 được cung cấp từ Trung tâm bảo tồn

chủng giống VTCC, Đại học quốc gia Hà Nội. Chủng A. oryzae VTCC F187 được lên men

trong môi trường tối ưu bảo gồm 7% bột lõi ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 [30].

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích, được liệt kê ở Bảng 2.1.

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng

Tên hóa chất Hãng sản xuất (nƣớc)

3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Honeywell Fluka (Mỹ)

Acrylamide Bio Basic Canada Inc (Canada)

Albumin Mti-Diagnostics GmbH (Đức)

Amoni persulfate Sigma (Mỹ)

Sodium metabisulfite Bio Basic Canada Inc (Canada)

Bis-acrylamid ICN Biomedicals (Mỹ)

Brommophenol blue Sigma (Mỹ)

Cao nấm men Bio Basic Canada Inc (Canada)

Coomassie brilliant blue Sigma (Trung Quốc)

DEAE Heldelberg (Đức)

Mercapthoethanol Sigma (Mỹ)

SDS Sigma (Mỹ)

TEMED Merck (Đức)

Tris Bio Basic Canada Inc (Canada)

Xylan from birchwood Biochemika

D-Xylose Sigma (Nhật Bản)

L- arabinose, Arabinoxylan Megazyme

Arabinoxylan Trường ĐHKH tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Việt

Nam

Và một số hóa chất thông dụng khác.

Bột đậu tương, bột lõi ngô đều đạt tiêu chuẩn của nhà sản xuất tại Việt Nam.

Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm

chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong Bảng 2.2.

Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Bradford stock solution 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200

ml 88% phosphoric acid

Bradford working buffer 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88%

phosphoric acid; 30 ml Bradford stock solution

Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8

Dung dịch APS 20% amoni persulfat

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamid; 0,8% bis-acrylamid

Dung dịch D 10% SDS (tinh thể); 25 mM EDTA

Dung dịch DNS 153 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15g Na2S2O5; 5,3 g

(1000ml) DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol (làm tan ở

50oC)

Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)

methanol; 10% (v/v) acetic acid

Dung dịch tẩy PAGE 60% (v/v) H2O; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v)

acid acetic

Đệm potasium phosphat 20 mM K2HPO4; pH 6,5

Đệm điện di protein (biến tính) 20 mM Tris-HCl; 192 mM glycerin; 0,1% (w/v)

SDS; pH 8,4

Đệm tra mẫu protein 5X 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol 100%;

(biến tính) 10% SDS; 10% β-mercaptho-ethanol pha trong

đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8

Dung dịch cơ chất 0,5% xylan, pha trong đệm 20 mM potasium

phosphat pH 6,5

Dung dịch đặc cơ chất 0,5% xylan; 1,2% agar

Dung dịch Native purification 250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl pH 8,0

buffer (NPB) 5X

Dung dịch Native purification 80% H2O; 20% 5x native purification buffer

buffer (NPB) 1X (NPB)

Dung dịch Native binding 250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 10 mM

buffer (NBB) imidazole pH 8,0

Dung dịch Native wash buffer 250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 20 mM

(NWB) imidazole pH 8,0

Dung dịch Native elution 250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 250 mM

buffer (NEB) imidazole pH 8,0

Các hóa chất thông thường khác: NaOH, HCl, ethanol, nước khử RO. Các hóa

chất này đều đạt tiêu chuẩn phân tích.

2.1.3. Môi trƣờng

 Môi trường YP gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone.

 Môi trường YPG bao gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone; 2% (w/v)

D-glucose.

 Môi trường YPGS bao gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone; 2%

(w/v) D-glucose, 1 M sorbitol.

 Môi trường nuôi cấy: 7% bột lõi ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 được khử trùng.

2.1.4. Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phòng Công nghệ sinh học

Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học được liệt kê ở Bảng 2.3.

Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng

Tên thiết bị Xuất xứ

Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG Công nghệ (Việt Nam)

Máy đo pH-827 Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc rung ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)

Máy lắc rung Inka (Đức)

Máy li tâm lạnh Hitachi (Nhật)

Máy khuấy từ Metrohm (Thụy Sỹ)

Hệ thống điện di đứng Biorad (Mỹ)

Máy quang phổ UV 2500 Labomed (Mỹ)

Tomy (Nhật)

Nồi khử trùng ES-315 Tủ lạnh 4oC, - 20oC Toshiba (Nhật)

Dụng cụ thí nghiệm

 Các ống ly tâm eppendorf 2,0 ml; 1,5 ml; 0,5 ml.

 Các ống falcon 15 ml; 50 ml.

 Micropipet và đầu côn phù hợp với các thể tích 0,5 - 10 µL; 10 - 100 µL; 20-

200 µL; 100 - 1000 µL.

 Dụng cụ thủy tinh: đĩa Petri, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, nhiệt kế, ống đong, chai

đựng hóa chất.

 Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống.

Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích.

2.2. Phƣơng pháp

2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase

Đối với chủng tự nhiên: Chủng nấm A. oryzae VTCCF187 sinh tổng hợp

xylanase được hoạt hóa, nhân giống trong môi trường Czapek nhiệt độ 30C, lắc 180

vòng/phút sau 72 giờ. Sau đó được nuôi trong môi trường nuôi cấy chứa 7% bột lõi

ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 ở 28C, lắc 180 vòng/phút sau 168 giờ [29].

Đối với chủng tái tổ hợp: Chủng nấm A. niger VTCC017/pANXlnG2 sinh tổng hợp xylanase được hoạt hóa, nhân giống trong môi trường YPG nhiệt độ 30oC, lắc 180

vòng/phút sau 72 giờ. Sau đó được nuôi trong môi trường YP cảm ứng hygromycin,

lắc 200 vòng/phút, thời gian lên men 72 giờ [29].

2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase

2.2.2.1. Định tính xylanase

Xylanase được định tính theo phương pháp khuếch tán enzym trên đĩa thạch [2].

Nguyên tắc:

Dựa vào khả năng thủy phân xylan của xylanase. Hoạt tính enzym được đánh giá

theo bán kính vòng sáng do xylanase thủy phân xylan 0,5% tạo ra.

Tiến hành:

Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất xylan trong nước cất dày khoảng 0,5 cm, được đục lỗ đường kính 0,5 cm. 100 μl dịch enzym được cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4oC cho enzym khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch được ủ 6 giờ ở 37oC lấy ra và nhuộm bằng lugol

1%. Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ

đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tương đối

của enzym.

2.2.2.2. Định lượng xylanase

Hoạt tính xylanase được định lượng theo phương pháp quang phổ theo Miller

(1959) [60].

Nguyên tắc:

Dịch enzym phản ứng với cơ chất xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở

trong điều kiện pH, nhiệt độ và khoảng thời gian phản ứng là 5 phút. Hàm lượng

đường khử giải phóng ra được định lượng bằng phản ứng với DNS và đo quang phổ

bước sóng 540 nm. Độ hấp thụ được đối chiếu với đường chuẩn nồng độ đường xylose

để tính hàm lượng đường giải phóng tương đương. Từ đó tính ra hoạt độ enzym.

Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ xylanase là lượng enzym phân giải cơ chất

xylan thành đường khử tương đương 1 µmol xylose trong một phút ở điều kiện nhất

định [60].

Tiến hành:

Xây dựng đường chuẩn: xylose được pha trong 100 mM đệm natri acetat pH 5,0

với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10-70 µg/ml. Tiến hành phản ứng với DNS và đo

độ hấp thụ ở 540 nm. Độ hấp phụ và nồng độ xylose được vẽ theo chương trình Excel.

Kết quả cho thấy, đuờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 10-70 µg/ml.

Đường chuẩn có phương trình y = 0,0178x + 0,0312. Trong đó, y là độ hấp phụ (OD)

ở bước sóng 540 nm, x là nồng độ xylose (µg/ml) (Hình 2.1).

Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzym 0,4 ml được cho vào ống

nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat pH 6,5. Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml DNS.

Lắc đều hỗn hợp và đun cách thủy 5 phút. Sau đó, dịch được làm nguội và đo OD ở

bước sóng 540 nm. Lặp lại 3 lần.

Ống kiểm tra: Hút 0,1 ml dịch enzyme, thêm 1,25 ml DNS, ủ 5 phút. Sau đó bổ

sung 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat pH 6,5.

Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC. Sau đó đun cách thủy 5 phút. Dịch được làm

nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm.

Hình 2.1: Đƣờng chuẩn xylose

2.2.3. Xác định hàm lƣợng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [20].

Nguyên lý:

Các protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ hình thành phức hợp màu

có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, độ hấp thụ tỉ lệ thuận

với nồng độ protein. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn

protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò.

Tiến hành:

Dựng đường chuẩn: albumin huyết thanh bò (BSA) được pha trong nước muối

sinh lý NaCl 0,9% với dải nồng độ 2,5-30 µg/ml. Cho 900 µl dung dịch Bradford

working phản ứng với 100 µl dung dịch BSA chuẩn. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt

độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Kết quả đường chuẩn

protein có phương trình y = 0,0031x + 0,1298 với y là độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm,

x là nồng độ BSA (µg/ml) (Hình 2.2).

Hình 2.2: Đƣờng chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn

Ống thí nghiệm: Cho 900 µl dung dịch Bradford working phản ứng với 100 µl

dung dịch protein. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút sau đó đo

độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Lặp lại 3 lần.

Ống trắng: Cho 900 µl dung dịch bradford working phản ứng với 100 µl dung

dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%. Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 2

phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.

2.2.4. Tinh sạch xylanase

Đối với chủng tái tổ hợp:

Quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger tái tổ hợp được mô tả

tóm tắt trong hình 2.3

Dịch enzym thô

Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút

Qua cột PronondTM

Enzym xylanase tinh sạch

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger

tái tổ hợp

Đối với chủng tự nhiên:

Dịch enzym thô

Ly tâm 10000 vòng/phút,10 phút

Qua cột sắc ký lọc gel

(Sephadex G200)

Qua cột sắc ký trao đổi ion

(DEAE-sephadex)

Enzym xylanase tinh sạch

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae

tự nhiên

2.2.4.1. Tinh sạch xylanase tái tổ hợp bằng cột ProbondTM

Protein tái tổ hợp được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch ProbondTM (Invitrogen).

Cột tinh sạch 10ml theo kit được cho 2 ml resin vào, resin lắng xuống nhờ trọng lực và

hút nhẹ dịch nổi ra. Cột Ni2+ được rửa 2x với nước khử ion và đệm gắn cột (NBB) pH

8,0. Sau đó hút 9 ml protein (dịch nổi) cần tinh sạch đưa lên cột, đặt lên máy lắc rung

nhẹ để các hạt resin luôn giữ ở trạng thái lơ lửng trong dịch protein 30-60 phút để

xynalase gắn vào hạt resin. Tiếp theo, các hạt resin được để lắng và loại bỏ dịch trong

cột. Cột được rửa 3x với đệm rửa (NWB) pH 8,0. Protein gắn cột được thôi ra bằng

dung dịch (NEB) pH 8,0 với 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein và

số đơn vị hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.

2.2.4.2. Tinh sạch xylanase tự nhiên

Tinh sạch xylanase bằng cột sắc ký Sephadex G-200

Đầu tiên, xylanase được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.

Nguyên lý:

Sắc ký lọc gel sẽ tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước và khối

lượng các phân tử. Gel (các hạt hình cầu) nhồi vào cột tạo thành mạng lưới lỗ xốp. Khi

hỗn hợp mẫu được nạp vào cột, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào các lỗ.

Còn các phân tử kích thước lớn sẽ khó vào lỗ hơn, tiếp tục đi dọc theo cột; do đó, sẽ

được rửa giải ra khỏi cột sớm hơn những phân tử nhỏ [31].

Tiến hành:

Dịch enzym thô (dịch lên men) sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10

phút, thu dịch nổi và đưa dịch nổi lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-200. Kích thước

cột là 0,6 x 26 cm, được cân bằng với đệm kali phosphat 50 mM, pH 7,5. Tốc độ dòng

chảy khoảng 25 ml/h. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt

tính enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.

Tinh sạch xylanase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex

Sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel, bước tiếp theo, xylanase được tinh sạch

bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex [25, 30].

Nguyên lý:

Ở pH khác pI của protein, protein mang điện tích. Cho hỗn hợp protein chảy qua

cột sắc ký chứa pha tĩnh (Diethylaminoethyl) là các hạt tích điện dương được gắn

trong mạng lưới gel Sephadex. Các protein mang điện âm sẽ liên kết với pha tĩnh bằng

lực ion mạnh hơn các protein mang điện dương. Hỗn hợp mẫu chất đang gắn vào pha

tĩnh trong dung dịch đệm có nồng độ ion thấp. Pha động chạy qua cột có nồng độ ion

lớn (nồng độ NaCl cao) sẽ cạnh tranh gắn pha tĩnh với protein, đẩy protein ra khỏi pha

tĩnh, theo dòng chảy ra khỏi cột. Tùy thuộc vào điện tích mỗi protein mà lực ion mạnh

yếu khác nhau, từ đó các protein sẽ được rửa giải ra khỏi cột ở những điểm khác nhau

theo gradient nồng độ NaCl. Protein mang điện dương sẽ được rửa giải ra trước [25].

Tiến hành:

Các phân đoạn qua cột Sephadex G200 có hoạt tính xylanase cao nhất được đưa

lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE-Sephadex. Cột có kích thước 0,6 x 26 cm được cân

bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa 50 mM NaCl.Tốc độ dòng chảy khoảng

24 ml/h. Thu mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 chứa NaCl với nồng độ NaCl

tăng dần 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M và 1 M; sử dụng 10 ml đệm để thôi mẫu ứng với

mỗi nồng độ. Thu thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính

enzym được xác định trong mỗi phân đoạn.

2.2.5. Điện di SDS-PAGE

Gel polyacrylamid được sử dụng để điện di protein với nồng độ 12,5% theo phương

pháp điện di biến tính của Laemmli (2011) [40].

Nguyên lý:

Các phân tử protein trong môi trường có SDS sẽ bị duỗi thẳng và tích điện âm, vì

vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng

phân tử của chúng.

Tiến hành: gồm 3 bước.

Đổ bản gel: Bản gel gồm 2 lớp gel tách và gel cô. Đổ lớp gel tách cách mép trên

1,5 cm; để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô ở phía trên, cài lược tạo

các giếng riêng biệt, để 30 phút cho gel đông hoàn toàn. Thành phần gel được trình

bày trong Bảng 2.4.

Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách

Thành phần Gel tách (µl) Gel cô (µl)

1940 1180 H2O

Dung dịch A 1500 0

Dung dịch B 0 500

Dung dịch C 2500 300

Dung dịch D 60 20

APS 10% 24 10

TEMED 7 5

Tổng 6031 2015

Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với tỷ lệ

mẫu/dye là 5/1, biến tính ở 95oC trong 10 phút, sau đó để ở tủ -20 oC trong 1 phút

Điện di: Bản điện di được lắp vào hệ thống điện di, cường độ dòng điện 20 mA

cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách đến khi hàng mẫu chạy xuống đáy bản gel.

Sau đó bản gel được tách khỏi phiến kính, nhuộm bằng dung dịch nhuộm PAGE trong

1,5-2 giờ. Bản gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy PAGE trong khoảng 2 giờ.

2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase

2.2.6.1. Nhiệt độ phản ứng tối thích

Phản ứng của dịch enzyme tinh sạch và cơ chất 0,5% xylan trong đệm potassium

phosphat 20 mM, pH 6,5 được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 37 - 80oC. Hoạt

tính xylanase được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với thời

gian ủ là thời gian phản ứng tối ưu.

2.2.6.2. pH phản ứng tối thích

Dịch enzym tinh sạch được ủ với các đệm potasium phosphat 20 mM có pH khác

nhau từ 3,5-8,0, sau đó tiến hành xác định hoạt tính theo phương pháp quang phổ theo

Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, pH 6,5 ở

nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.

2.2.6.3. Xác định độ bền nhiệt độ

Dịch enzym tinh sạch được ủ từ 1, 5 và 24 giờ ở các nhiệt độ khác nhau từ 25,

37, 40, 50oC. Dịch enzym sau khi ủ được xác định hoạt tính theo phương pháp quang

phổ theo Miller (1959), với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM,

ở pH, nhiệt độ tối ưu.

2.2.6.4. Xác định độ bền pH

Dịch enzym tinh sạch được ủ với đệm potasium phosphat có nồng độ 20 mM với

các pH khác nhau từ 4,0-8,0 sau các khoảng thời gian từ 1, 2, 8 và 24 giờ ở nhiệt độ

phòng. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller

(1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ

tối ưu.

2.2.6.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa

Dịch enzym tinh sạch được ủ với các chất Tween 80, Tween 20, Trixton x100,

SDS ở nồng độ 2% trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp

quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20

mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.

2.3.5.6. Ảnh hưởng của các dung môi

Dịch enzym tinh sạch được ủ với các dung môi: Methanol, ethanol, acetone,

isopropanol, n-butanol trong 1 giờ. Hoạt tính còn lại được xác định theo phương pháp

quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất 0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20

mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu.

2.2.6.7. Ảnh hưởng của các ion kim loại

Dịch enzym tinh sạch được ủ với các ion kim loại: Mg2+, Fe2+, Cu2+, Ca2+, Ag+,

Ni+, K+, EDTA, Zn+, Hg+ với nồng độ 10 mM trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính

còn lại được xác định theo phương pháp quang phổ theo Miller (1959) với cơ chất

0,5% xylan trong đệm potasium phosphat 20 mM, ở pH, nhiệt độ và thời gian phản

ứng tối ưu.

2.2.6.8. Thủy phân arabinoxylan bằng enzyme xylanase

Sử dụng cùng số đơn vị hoạt độ (khoảng 1 U cho 1 mg mẫu araninoxylan) của mỗi một loại enzyme xylanase để thủy phân arabinoxylan trong 24 giờ ở 55οC, trong

đệm CH3COONa 50 mM, pH 5. Dịch mẫu sau khi thủy phân được bất hoạt enzyme ở 100oC trong 10 phút.

2.2.6.9. Thủy phân cơ chất bằng enzyme xylanase

Cơ chất: Bột đậu tương, bột cám gạo, bột lõi ngô, bột bã mía, bột gỗ mục, Xylan.

Pha 5 g bột cơ chất với 40ml đệm phosphate 20 mM, pH 6,5. Trộn 1000 μl cơ chất với 200μl enzyme, ủ ở 55οC, tại mỗi thời điểm 15-30-60-90 phút 250 μl dung dịch đun

cách thủy 10 phút để dừng phải ứng. Sau đó li tâm 10000v/ phút trong 10 phút. Rồi thu

dịch chấm sắc kí (10 μl).

2.2.6.10. Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC

Nguyên tắc:

Sắc ký bản mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm, là pha

cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân

tách các chất chấm trên bản gel. Do các chất di chuyển với tốc độ nhanh chậm khác

nhau nên chúng dần dần được tách ra khỏi nhau dưới dạng các vết trên bản mỏng. Để

đánh giá khả năng phân tách của từng chất trên bản sắc ký người ta quan tâm đến giá

trị Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất trong hệ thống sắc ký, được tính

bằng tỉ số giữa khoảng cách mà chất đó di chuyển được khỏi vệt xuất phát trên khoảng

cách mà dung môi di chuyển được.

Rf =

Trong đó:

a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử

b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến vạch mức cuối cùng mà dung môi chạy đến

Kết quả phân tách các chất trên bản sắc ký có thể được hiển thị bằng các

phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn. Khi việc phân tách các

chất trong hỗn hợp không rõ ràng, người ta có thể thay đổi thành phần và/ hoặc tỷ lệ

của các dung môi trong hỗn hợp dung môi sắc ký. Việc bổ sung các chất không phân

cực cũng như tăng tỷ lệ của chúng sẽ tạo điều kiện cho các chất ít phân cực chạy

nhanh hơn khỏi vạch xuất phát và ngược lại [3].

Tiến hành:

Dùng pipet loại nhỏ hoặc dùng ống chấm sắc ký có chia vạch thể tích (5-10 μl)

để hút mẫu và chấm lên các vị trí đã được đánh dấu trên bản gel. Bản gel sau khi chấm

mẫu được đặt vào hệ thống bình sắc ký có nắp đậy, trong đó có chứa dung môi hữu cơ.

Mức dung môi luôn được giữ thấp hơn vạch xuất phát của mẫu. Dung môi sẽ theo lớp

gel để chạy ngược lên và mang theo các chất cần phân tích. Khi vạch dung môi chạy

đến gần mép trên của bản gel sắc ký thì phải làm ngừng quá trình sắc ký. Bản gel được

lấy ra, làm khô dung môi và sau đó có thể cho chạy lại một vài lần tương tự, tùy thuộc

vào sự tách bạch giữa các mẫu quan tâm [3]. Kết quả phân tách các chất trên bản sắc

ký được hiển thị bằng phản ứng màu đặc trưng kèm theo việc so sánh với chất chuẩn

là D-xylose và L-arabinose được mua từ hãng Megazyme.

2.2.7 Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm MS excel 2016 và GraphPad Prism 8.1.0.

Các giá trị được biểu diễn dưới dạng ± SD ( là giá trị trung bình).

Công thức tính các thông số:

Hoạt tính riêng (IU/mgprotein) = Hoạt tính (IU/ml): Hàm lượng protein (mg/ml)

Hoạt tính tổng (IU) = Hoạt tính (IU/ml) x Thể tích (ml)

Độ sạch (lần) = Hoạt tính riêng (mẫu): Hoạt tính riêng (dịch nổi lên men)

Hiệu suất tinh sạch (%) = Hoạt tính tổng (mẫu) x 100%: Hoạt tính tổng

(dịch nổi lên men).

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng

hợp xylanase

Chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 được tiến hành nuôi biểu hiện trong môi

trường YPG, cảm ứng hygromycin. Sau 72 giờ nuôi biểu hiện, dịch nổi được điện di

trên gel polyacrylamide 12,5%. Kết quả trên hình 3.1A cho thấy dịch nổi chủng A.

niger VTCC017/pANXlnG2 xuất hiện một băng protein có khối lượng phân tử <25

kDa (làn 2 - hình 3.1A), trong khi đó chủng tự nhiên A. niger VTCCF017 không xuất

ĐC

hiện (làn 1- hình 3.1A và làn 1 – hình 3.1B)

B C

Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số của các mẫu protein và hoạt tính xylanase tái tổ hợp

trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất xylan 0,5%

Ghi chú:

(A) mẫu biểu hiện chủng A. niger VTCC 017/pANXlnG2 tái tổ hợp (1) chủng A. niger VTCC

017 tự nhiên; (2) chủng A. niger VTCC 017/pANXlnG2 tái tổ hợp; (M) marker protein; (B) (1) mẫu

protein tự nhiên từ chủng A. niger VTCC 017; 2: Phân đoạn qua cột sephadex G200 của chủng A.

oryzae VTCC F187 (3) chủng A. oryzae VTCC F187; (M) marker protein; (C) hoạt tính của enzyme

xynalase từ chủng A. niger tái tổ hợp trên đĩa thạch: ĐC: H2O; 1-5: mẫu enzyme xylanase tái tổ hợp

Hoạt tính xylanase của chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp thể hiện

hoạt tính thủy phân 0,5% cơ chất xylan trên đĩa thạch (hình 3.1C) và đạt 105 IU/ml so

với chủng tự nhiên A. oryzae VTCC-F187 đạt 114 IU/ml. Theo một số nghiên cứu trên

thế giới khi biểu hiện enzyme ở các chủng khác nhau thì hoạt tính xylanase thu được là

khác nhau. Biểu hiện xylanase từ A. usamii trong E. coli BL21 (DE3) hoạt tính enzyme

đạt 49,6 IU/ml [88]. Biểu hiện enzyme xylanase G2 trong pichia pastoris hoạt tính đạt

41 IU/ml [5]. Như vậy, khi biểu hiện trong A. niger hoạt tính enzyme xylanase đã được

ĐC

cải thiện tăng đạt 105 IU/ml so với các hệ biểu hiện khác.

Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A. oryzae

VTCC-F187; (B) chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp

(ĐC: Đối chứng, M: Mẫu thí nghiệm)

3.2. Tinh sạch enzyme xylanase tái tổ hợp

Dòng tế bào A. niger VTCC017/pANXlnG2 được nuôi với lượng lớn 200 ml và

thu hoạch sau 72 giờ cảm ứng bằng hygromycin. Dịch nuôi được ly tâm 8000

vòng/phút trong 5 phút để loại tủa tế bào. Dịch trong chứa protein được đưa lên cột để

tinh sạch theo phương pháp đã mô tả (Hình 2.3). Xylanase tái tổ hợp được gắn đuôi

6xhistidin để tinh sạch dễ dàng và hiệu quả cao. Xylanase tái tổ hợp tinh sạch qua cột ProBondTM resin (Invitrogen) và được kiểm tra trên gel SDS-PAGE.

Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sau khi qua cột histag xylanase G2

Ghi chú: (1) Dịch nổi chủng tái tổ hợp; (2-5) các phân đoạn xylanase TTH tinh sạch;

(M) thang protein chuẩn

Các phân đoạn tinh sạch chỉ có một băng protein xuất hiện ở dạng đồng nhất trên

điện di đồ (Hình 3.3) và có kích thước khoảng 23 kDa tương ứng với kích thước của

xylanase tái tổ hợp, với hoạt tính đạt 1102 IU/ml protein, thấp hơn so với hoạt tính

riêng của xylanase tự nhiên từ chủng A. oryzae VTCC F187 (6768 U/mgprotein). Biểu

hiện thành công Xyl B trong pichia pastoris GS115 có kích thước 27 kDa [8]. Bên

cạnh đó, biểu hiện Xyl G2 trong pichia pastoris với kích thước 27 KDa [5]. Dịch nổi

A. niger VTCC017/pANXlnG2 cũng có băng protein với kích thước tương đương và

nhiều protein khác nữa của tế bào A. oryzae VTCC F187 với các trọng lượng phân tử

khác nhau (Hình 3.1, làn 2).Để xác định độ tinh sạch của enzyme tái tổ hợp, hàm lượng

protein trong các dịch mẫu ở các bước tinh sạch được xác định theo phương pháp

Bradford, và xác định hoạt tính theo Miller và cộng sự (1954). Từ 8 ml dịch thô ban

đầu của chủng tái tổ hợp A. niger VTCC017/pANXlnG2 thu được 501,1 IU/mg

protein. Xylanase G2 được tinh sạch với 4 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1,0 ml. Protein

tinh sạch đạt 1102,5 IU/mg protein tương ứng với hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp là

52,6, độ sạch 2,2 lần.

Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng

A. niger VTCC017/ pANXlG2

Protein tổng

Hoạt tính

Hiệu suất

Mẫu

Độ sạch

tổng (IU)

riêng (IU/mg)

thu hồi (%)

(mg)

501,1

100

1,84

Dịch nổi

922,1

Dịch tinh

485,1

0,44

1102,5

2,2

52,6

sạch

3.3. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp

3.3.1. Nhiệt độ tối ƣu và độ bền nhiệt độ

Khi tăng nhiệt độ phản ứng từ 37oC lên 55oC thì hoạt tính xylanase cũng tăng dần từ 56% lên 100%, hoạt tính enzyme đạt cao nhất ở 55oC (1058,9 IU/mg). Khi nhiệt độ phản ứng tiếp tục tăng trên nhiệt độ tối ưu 55oC thì hoạt tính còn lại theo chiều hướng giảm dần. Nhiệt độ phản ứng tối ưu cho xyalanse tái tổ hợp là 55oC (Hình 3.4A).

A B

Hình 3.4: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase

tái tổ hợp

Mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian ủ enzyme. Hoạt tính của

enzyme ủ ở các nhiệt độ 25C, 37C, 40C và 50C theo thời gian khá gần nhau (Hình

3.4B), đều giảm theo thời gian, nhưng nhiệt độ ủ càng cao, hoạt tính càng giảm nhiều.

Sau 5 giờ ủ ở 25C-50C, hoạt tính enzyme giảm còn 53% đến 92%, sau 24 giờ ủ, ở

50C hoạt tính giảm còn 53% so với hoạt tính ban đầu (Hình 3.4B).

3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH

A B

Hình 3.5: Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase

tái tổ hợp

Ở pH 3,5 hoạt tính tương đối của xylanase là 35,4% (Hình 3.5). Khi pH phản ứng

tăng tới 6,5 (852,3 IU/mg) thì đạt cực đại. độ pH tiếp tục tăng lên thì hoạt tính còn lại

giảm đều xuống còn 69,3% ở pH 8. Vậy xylanase tái tổ hợp tối ưu trong môi trường trung

tính (Hình 3.5A).

pH môi trường ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme nên việc lựa chọn môi

trường có đệm pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Đệm potassium

phosphate được chọn tiếp tục để khảo sát độ bền xylanase với các pH khác nhau 4,0-

8,0 ở nhiệt độ phòng (Hình 3.5B). Xylanase từ chủng tái tổ hợp tương đối bền ở pH

4,0, sau 24 giờ ủ, hoạt tính vẫn còn 78% ở pH 4,0 và 79% ở pH 8,0 (Hình 3.5B).

Như vậy, từ kết quả nghiên cứu đánh giá: Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ, ảnh

hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH cho thấy: Xylanase G2 hoạt động tối ưu ở

nhiệt độ 55oC, pH 6,5. Enzyme tái tổ hợp bền ở dải nhiệt độ và pH; 25 - 40oC, pH 4 - 8.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới

như: Nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch enzyme Xyl G2 và Xyl F3 là hai họ

xylanase từ A. oryzae. Kết quả cho thấy hoạt tính Xyl G2 tinh sạch đạt tối ưu ở pH 6,0, nhiệt độ 58oC. Gen mã hóa Xyl F3 có kích thước 1468 bp mã hóa cho 323 amino acid, nhiệt độ tối ưu của enzyme xylanase tái tổ hợp là 58oC, pH 5,0 [45, 46]. Bên cạnh đó,

gen được nhân dòng Xyl B có kích thước 678 bp mã hóa sinh tổng hợp 225 aa, Xyl B có khối lượng 21 KDa, nhiệt độ và pH tối ưu là 55oC, pH 5,0 [49].

3.3.3. Dung môi hữu cơ

Các dung môi hữu cơ đều làm ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase. Ethanol,

acetone, Isopropanol với nồng độ 30% (v/v) sau 2 giờ ủ ở nhiệt độ phòng đều làm giảm

mạnh hoạt tính của xylanase còn 41% đến 72% hoạt tính, riêng methanol 30% (v/v)

làm giảm nhẹ hoạt tính của xylanase còn 85% (Hình 3.6).

Hình 3.6: Ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol

(EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên hoạt tính

xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng)

Như vậy, trong tất cả các dung môi khảo sát ảnh hưởng tới hoạt tính của

xylanase tái tổ hợp thì tất cả các dung môi ở nồng độ 30% đều làm giảm hoạt tính 41

enzyme, riêng dung môi methanol ở nồng độ 30% làm giảm nhẹ hoạt tính enzyme hơn

so với các dung môi: ethanol, isopropanol, acetone, n-butanol. N-butanol làm giảm

hoạt tính enzyme mạnh nhất. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thu Thùy và cộng sự

(2009), hoạt tính xylanase G2 ít ảnh hưởng bởi các dung môi methanol, ethanol,

isopropanol, n-butanol và acetone ở nồng độ thấp 2%, với nồng độ cao hơn như: 10%

và 20% thì đều làm giảm hoạt tính của enzyme hơn so với mẫu đối chứng [5]. Khảo sát

ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên xylanase từ chủng tự nhiên A. oryzae DMS1863

cho thấy n-butanol làm tăng hoạt tính lên tới còn acetone làm giảm hoạt tính xuống còn

31% [9].

3.3.4. Chất tẩy rửa

Các chất tẩy rửa như Tween 20, SDS có ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase. ở

nồng độ Tween 20 2% (v/v), SDS 2% (v/v) hoạt tính tương đối giảm tương ứng từ

100% xuống còn 73% và 49% sau 2 giờ ủ. Riêng với Triton X-100 và Tween 80 làm

tăng mạnh hoạt tính xylanase đạt từ 103% đến 117% (Bảng 3.2). Chủng A. oryzae

DMS1863 cho thấy ở nồng độ thấp (0,2 – 1%), Tween 20 và Triton X-100 hầu như

không ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính xylanase. Hoạt tính xylanase lại giảm một cách

rõ rệt ở nồng độ cao 2%. Trong khi đó, SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh nhất ở

tất cả các nồng độ [9].

Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp

Chất tẩy rửa

Hoạt tính xylanase còn lại (%)

Đối chứng

100±0,00

Trixton X-100

103±5,6

Tween 80

117±0,7

Tween 20

73±2,8

SDS

49±6,9

3.3.5. Ion kim loại

Các ion kim loại có vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc không gian

của phân tử enzyme hoặc trong một vài trường hợp nó là nhân tố cần thiết trong trung

tâm hoạt động enzyme. Do đó, các ion kim loại và các nhân tố bám có ảnh hưởng đến

khả năng hoạt động của enzyme.

Để khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại, xylanase được ủ cùng ion kim loại với

làm ức chế hoạt

nồng độ 10 mM ở nhiệt độ phòng, sau 2 giờ ủ hoạt tính còn lại được xác định kết quả cho thấy các ion kim loại Fe2+ Cu2+ Ag+ Hg+ Zn2+ làm giảm hoạt tính xylanase còn 0%

và thậm chí cả EDTA

đến 53% (Hình 3.3). Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt động Xyl P từ chủng tự nhiên A. niger DDB106 cho thấy: các ion Zn2+, Mn2+, Fe2+ động của Xyl P. Sự có mặt của Na+, K+, Ca2+, Cu2+, Co2+, Mg2+

có tác dụng tăng cường hoạt lực của XylP [1].

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính của xylanase

Hoạt tính còn lại (%)

Các ion kim loại

10mM

± SD

1,1

5,8

7,7

99,6

13,5

9,1

3,1

10mM Mg2+ Fe2+ Cu2+ Ca2+ Ag+ Ni+ K+

101

0,1

106

10,4

5,3

EDTA Zn2+ Hg+

0,0

Đối chứng

100

0,0

3.4. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp

3.4.1. Tinh sạch enzyme tự nhiên

Với mục đích so sánh khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và

tái tổ hợp với các chất chuẩn là D- xylose và L- arabinose, chúng tôi tiến hành tinh

sạch xylanase tự nhiên từ chủng A. oryzae VTCC F187 là chủng gốc tự nhiên dùng để

nhân dòng gene mã hóa enzyme xylanase và biểu hiện trong A. niger VTCC F017.

Bằng phương pháp sắc ký lọc gel kết hợp với sắc ký trao đổi ion. Những phân đoạn

qua cột Sephadex G200 có hoạt tính cao được đưa lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE-

Sephadex.

Protein được phân tách thành 1 đỉnh rõ rệt trên sắc ký đồ Sephadex G200 (hình

3.7). Hoạt tính xylanase đặc hiệu của phân đoạn rất cao đạt 4659 IU/mg protein. Mức

độ tinh sạch và khối lượng phân tử tương đối được xác định bằng điện di trên gel

12,5% polyacrylamide. Enzyme thu được khá sạch ở phân đoạn có băng protein 23

kDa và 39 kDa (hình 3.7B).

A B C

Hình 3.7: (A) Sắc ký đồ trên cột Sephadex G200; (B) Điện di đồ SDS-PAGE của A. oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sephadex G200 (giếng 1: dịch nổi; giếng 2-6: các phân đoạn 2,3,4,5 qua cột G200; M: Marker); (C): Điện di đồ SDS-PAGE của A. oryzae VTCC F1 sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE (giếng 1: dịch nổi; giếng 2-5: các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE; M: Marker)

Đặc biệt sau khi tập trung các phân đoạn trên cột Sephadex G200 có hoạt tính cao

đưa lên cột sắc ký trao đổi ion DEAE. Sản phẩm trên điện di đồ SDS-PAGE cho thấy,

xylanase tinh sạch có khối lượng khoảng 23kDa (Hình 3.7C). Từ những số liệu thu 44

được cho thấy sau hai lần tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion,

enzyme xylanase thu được có hoạt tính đặc hiệu đạt 6768 IU/mg protein với độ sạch 11

lần so với dịch enzym thô ban đầu, hiệu suất thu hồi 28 % (Bảng 3.4).

Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng gốc A. oryzae VTCC-F-187

Hoạt tính

Hàm lƣợng

Hoạt tính

Độ sạch

Hiệu

Các bƣớc tinh sạch

tổng

protein

riêng (IU/mg)

(lần)

suất (%)

(IU/ml)

(mg/ml)

Dịch enzyme thô

114,3

0,1858

100

615

Sắc ký Sephadex

78,7

0,0212

6,13

3768

G-200

Sắc ký trao đổi ion

84,3

0,0126

6768

DEAE-Sephadex

3.4.2. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp

Chúng tôi sử dụng các mẫu enzyme xylanase thô, tinh sạch sơ bộ qua cột

sephadex G200 và mẫu xylanase tinh sạch từ chủng gốc A. oryzae VTCC F187 và dịch

enzyme xylanase tái tổ hợp để nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan. Theo

Wong và cộng sự (1998) cho rằng xylanase chia thành 2 nhóm: nhóm 1 có khối lượng

phân tử dưới 30 kDa có pI cao (thuộc họ 11 hay họ G), nhóm 2 có khối lượng phân tử

lớn (Mw trên 30 kDa) có pI thấp (thuộc họ 10 hay họ F). Họ F ngoài hoạt tính

xylanase, đôi khi chúng cũng thể hiện hoạt tính endocellulase. Các enzyme họ G có thể

coi như là các xylanase thực sự chúng không có hoạt tính cellulase, có vùng xúc tác

chủ yếu là các nếp gấp của dải β tạo nên khe hẹp hai lớp bao quanh điểm xúc tác [96].

Trong thí nghiệm này, chúng tôi bước đầu tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng

thủy phân arabinoxylan của enzyme xylanase tái tổ hợp thuộc enzyme họ G đều có

khối lượng phân tử nhỏ hơn 25 kDa.

Thí nghiệm được sử dụng hai loại enzyme xylanase tự nhiên và tái tổ hợp ủ với

cơ chất arabinoxylan thương mại được cung cấp từ trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH quốc gia Hà Nội và arabinoxylan (Megazym) trong 24 giờ, 55οC trong đệm potassium

phosphate. Kết quả hình 3.8 và 3.9 cho thấy các enzyme đã thủy phân arabinoxylan 45

thành các băng vết rõ nét có vị trí ngang với chuẩn L- arabinose và D- xylose và một số

đường khác, chứng tỏ arabinoxylan đã bị thủy phân. Tuy nhiên, khả năng thủy phân

arabinoxylan của enzyme tự nhiên có vẻ rõ ràng hơn. Điều này chứng tỏ ở cùng một nồng độ enzyme, nhiệt độ xúc tác là 55oC (nhiệt độ tối ưu), trên 2 sản phẩm

arabinoxylan đã được bán trên thị trường và arabinoxylan (Megazym), enzyme

xylanase tự nhiên thủy phân sản phẩm tạo băng vết đậm hơn, rõ ràng hơn so với các

enzyme tái tổ hợp.

B

Hình 3.7: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân arabinoxylan lần lƣợt thƣơng mại và

hãng của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp với hệ dung môi

n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1)

Ghi chú:

CX: xylose chuẩn (Sigma); CA: L-arabinose chuẩn (Megazym); 1: Mẫu enzyme xylanase tự

nhiên; 2: enzyme thô tự nhiên; 3: Dịch enzyme tinh sạch qua cột Sephadex; 4: Dịch enzyme

tinh sạch bằng cột DEAE; 5: Dịch enzyme xylanase tái tổ hợp thô; 6: Dịch enzyme xylanase

TTH tinh sạch

3.4.3. Khả năng phân giải cơ chất của xynalase tự nhiên và tái tổ hợp

Để đánh giá khả năng phân giải cơ chất của enzyme xylanase tái tổ hơp của

chủng A. niger VTCC017/pANXylG2 và enzyme chủng tự nhiên A. oryzae VTCC-

F187, chúng tôi bước đầu thử nghiệm trên 6 loại cơ chất 0,8 % trong đệm potassium

phosphate 20 mM pH 6,5 như: bột đậu tương, bột cám gạo, bột lõi ngô, bột bã mía, bột

gỗ, và xylan pha trong đệm postadium phosphate 20 mM; pH 6,5. Trộn 1000 μl cơ chất với 200 μl enzyme, ủ ở 55οC, tại mỗi thời điểm 15- 30- 60- 90 phút. Dừng phản ứng

bằng đun cách thủy 10 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch. Mẫu

được chạy sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1).

Sản phẩm thủy phân của cơ chất xylan bởi enzyme tự nhiên và tái tổ hợp được

kiểm tra trên sắc kí lớp mỏng TLC. Sản phẩm chính trong quá trình thủy phân cơ chất

xylan được công bố là: xylotriose (X3), xylotetraose (X4) và xylopentose (X5). Kết

quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của xylanase tái tổ hợp như Anxyl 10A từ A.

usamii E001(Zhou et al. 2008) và AnxA từ A. niger (Liu et al. 2006). Điều đó chứng

tỏ rằng các sản phẩm thủy phân chính của xylan bởi các enzyme xylanase là xylotriose

(X3), xylotetraose (X4) và xylopenose (X5) trên 98% (Wang et al. 1998)

Cơ chất đậu tƣơng Cơ chất cám gạo

Cơ chất lõi ngô Cơ chất bã mía

Cơ chất gỗ mục

Cơ chất xylan nồng độ 0,5%

Hình 3.9: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân cơ chất của enzyme xylanase

tự nhiên và enzyme tái tổ hợp sạch với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1)

Ghi chú:

TN: Xylanase tự nhiên thủy phân cơ chất; TTH: Xylanase tái tổ hợp; CX: chất chuẩn D-

xylose; 15: dịch phản ứng lấy ra tại thời điểm thủy phân sau 15 phút; 30: dịch phản ứng lấy ra

tại thời điểm thủy phân sau 30 phút; 60: Dịch phản ứng lấy ra tại thời điểm thủy phân sau 60

phút; 90: Dịch phản ứng lấy ra tại thời điểm thủy phân sau 90 phút

Kết quả hình 3.9 cho thấy xynalase tự nhiên và xylanase tái tổ hợp đều có khả

năng phân giải các cơ chất khác nhau tạo thành các D-xylose và còn nhiều cơ chất

được thủy phân ở mức độ không hoàn toàn. Tuy nhiên trong 6 cơ chất khảo sát thì khả

năng thủy phân cơ chất cám gạo của hai enzyme tự nhiên và tái tổ hợp là tốt nhất, gợi ý

cho việc sử dụng nguồn bột cám gạo là nguồn cơ chất để tạo sản phẩm arabinoxylan

bằng enzyme.

KẾT LUẬN

Từ những số liệu thu được chúng tôi thu được một số kết luận sau:

1. Đã tinh sạch thành công xylanase G2 tái tổ hợp trong Aspergillus niger

VTCC017/pANXlnG2. Xylanase tái tổ hợp được thể hiện trên điện di SDS-PAGE với

trọng lượng phân tử khoảng 23 kDa, với hoạt tính xylanase G2 đạt 1102,5 U/mg, hiệu

suất đạt 52% cùng với độ sạch là 2,2 lần.

2. Xylanase tái tổ hợp hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 55oC, pH 6,5. Enzyme tái tổ hợp bền ở dải nhiệt độ và pH; 25 - 40oC, pH 4-8. Hoạt tính xylanase bị ức chế đối với các kim loại nặng như Ag2+, Hg2+. Chất tẩy rửa Triton X-100 và Tween 80 làm tăng

hoạt tính xylanase, SDS làm giảm hoạt tính. Các dung môi hữu cơ làm giảm hoạt tính

enzyme xylanase.

3. Đã tinh sạch được xylanse tự nhiên từ chủng tự nhiên Aspergillus oryzae

VTCC F187 với trọng lượng phân tử là dưới 25 kDa khi qua hai bước tinh sạch là sắc

ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion. So sánh mức độ thủy phân arabinoxylan của enzyme

tự nhiên và enzyme tái tổ hợp, số liệu cũng cho thấy ở cùng nồng độ enzyme mức độ

thủy phân arabinoxylan của các enzyme là khác nhau. Đồng thời bước đầu đánh giá

khả năng thủy phân các cơ chất khác nhau của enzyme xylanase tự nhiên và tái tổ hợp.

KIẾN NGHỊ

Tối ưu biểu hiện và nâng cao hoạt tính enzyme xylanase G2 tái tổ hợp làm

nguyên liệu thủy phân cám gạo tạo sản phẩm arabinoxylan làm thực phẩm chức năng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phương Phú Công (2008), “Tuyển chọn và nghiên cứu ứng dụng một số chủng vi

Tiếng việt

sinh vật có khả năng lên men xylan trên chế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase

2. Đàm Thị Hồng, Đỗ Thị Tuyên. (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng nấm Aspergilus

phục vụ cho chăn nuôi”, luận án tiến sĩ sinh học.

awamori sinh tổng hợp xylanase và đánh giá tính chất lý hóa của xylanase tinh sạch,

3. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất bản giáo

Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Mở Hà Nội.

4. Nguyễn Thị Uyên Thảo, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng. (2004), “Nghiên

dục VIệt Nam, Hà Nội, tr. 63-90.

cứu tận dụng bã khoai mì nhằm thu nhận enzyme cellulose, xylanase, pectinase bổ

sung thức ăn gia súc từ vi nấm Trichoderma”, Báo cáo Khoa học Hội nghị khoa học

5. Nguyễn Thị Thu Thùy, Nguyễn Văn Thuật, Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Đình Thi

lần thứ IV – ĐHKHTN-ĐHQGTPHCM.

(2009), “Biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của xylanase tái tổ hợp từ Aspergillus

oryzae VTCC – F187 trong Pichia pastoris GS115”, Báo cáo khoa học Hội nghị công

6. Lê Văn Trường, T. Schweder, (2010), “Biểu hiện cao gen mã hóa xylanase trong

nghệ sinh học toàn quốc 2009, tr. 710-714.

Bacillus subtilis sử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens”, Tạp

7. Đỗ Thị Tuyên, Đàm Thị Hồng, Quyền Đình Thi. (2009), “Đánh giá một số tính chất

chí Công nghệ Sinh học, 8, 3A, tr. 827- 832.

hóa lý của xylanse ở chủng nấm Aspergillus niger DSM1957 trên dịch tinh sạch sơ

8. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ lê Thanh, Quyền Đình Thi. (2009), “Biểu hiện và đánh

bộ”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, (6), tr. 16-21.

giá tính chất hóa lý của xynalase tái tổ hợp từ chủng Asprgillus niger DSM1957 trong 52

Pichia pastoris GS115”, Báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc

9. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Văn Thuật, et al. (2008b), “Đánh giá một số tính chất hóa lý

2009, tr. 151-157.

của xylanase từ chủng nấm A. oryzae DSM1863”, Tạp chí CNSH, 6(1), tr. 721-728.

10. Adigüzel A.O., Tunçer M. (2016), “Production, characterization and application of a

Tiếng anh

xylanase from Streptomyces sp. AOA40 in fruit juice and bakery industries”, Food

11. Adiguzel G., Faiz O., et al. (2019), “A novel endo-β-1,4-xylanase from

Biotechnol, 30, pp. 189–218.

Pediococcus acidilactici GC25; purification, characterization and application in

12. Ahmad M., Hirz M., et al. (2014), “Protein expression in Pichia pastoris: recent

clarification of fruit juices”, Int J Biol Macromol, 129, pp. 571–578.

achievements and perspectives for heterologous protein production” Appl Microbiol

13. Ahmed S., Riaz S., et al. (2009), “Molecular cloning of fungal xylanases: an

Biotechnol, 98, pp. 5301–5317.

14. Ayyachamy M., Vatsala T.M. (2007), “Production and partial characterization off

overview”, Appl Microbiol Biotechnol, 84, pp. 19–35.

cellulase free xylanase by Bacillus subtilis C01 using agriresidues and its application in

15. Bajpai P. (2012), “Biobleaching. In Bajpai P (eds) Biotechnology for pulp and

biobleaching of nonwoody plant pulps”, Lett. Appl. Microbiol, 45, pp. 467-472.

16. Basit A., Liu J., et al. (2018), “Characterization of two endo-β-1,4-xylanases

paper processing”, Springer, Berlin, pp. 93–138.

from Myceliophthora thermophila and their saccharification efficiencies, synergistic

17. Beg K.Q., Kapoor M., et al. (2001), “Microbial xylanase their industrial application: a

with commercial cellulase”, Front Microbiol, 9, pp. 1–11.

review”, App Microbiol Biotechnology, 56, pp. 326-338.

18. Belancic A., Scarpa J., et al. (1995), “Penicillium purpurogenum produces several

19. Bissoon S., Christov L. (2002), “Bleach boosting effects of purified xylanase from

xylanases: purification and properties of two of the enzymes”, J Biotechnol, 41, pp. 71–79.

20. Bradford M. M. (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of

Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp”, Process Biochem, 37, pp. 567-572.

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal

21. Bray M. R., Clarke A.J. (1995), “Identification of an essential tyrosyl residue in the

Biochem, 72, pp. 248-54.

22. Butt M.S., Tahir-Nadeem M., et al. (2008), “Xylanases and their applications in

binding site of Schizophyllum commune xylanase-A”, Biochemistry, 34, pp. 2006-2014.

23. Collins T., Gerday C., et al. (2005), "Xylanases, xylanase families and

baking industry”. Food Technol Biotechnol, 46, pp. 22–31.

24. Courtin C.M., Delcour J.A. (2002), “Arabinoxylans and endoxylanases in wheat

extremophilic xylanases", FEMS Microbiol Rev, 29(1), pp. 3-23.

25. Cummins P. M., Rochfort K. D., et al. (2017), "Ion-Exchange Chromatography:

flour bread-making”, J Cereal Sci, 35, pp. 225- 243.

26. Danalache F., Mata P., et al. (2018), “Enzyme-assisted extraction of fruit juices”.

Basic Principles and Application", Methods Mol Biol, 1485, pp. 209-223.

27. De Faria F.P., Te’o V.S.J., et al. (2002), “Expression and processing of a major

Elsevier Inc., New York.

xylanase (XYN2) from the thermophilic fungus Humicola grisea var. thermoidea in

28. Dhiman S.S., Sharma J., et al. (2008a), “Industrial applications and future

Trichoderma reesei”, Lett Appl Microbiol, 34, pp. 119–123.

29. Do T.T., Quyen D.T., et al. (2009), "Optimiation of some culture conditions for

prospects of microbial xylanases: a Review”, BioResources, 3(4), pp. 1377–1402.

Aspergillus niger VTCC-F-017 and Aspergillus oryzae VTCC-F-187 producing

xylanase", The analytica Vietnam conference 2009, pp. 294-301.

30. Do TT., Quyen DT., et al. (2010), "Purification and properties of a thermoactive

xylanase from Aspergillus oryzae DSM1863", Middle–East Journal of Scientific

31. Duong-Ly K. C., Gabelli S. B. (2014), "Gel filtration chromatography (size

Research, 6(4), pp. 392-397.

32. Facchini F.D.A., Vici A.C., et al. (2011), “Production of fibrolytic enzymes by

exclusion chromatography) of proteins", Methods Enzymol, 541, pp. 105-14.

Aspergillus japonicus C03 using agro-industrial residues with potential application as

33. Fernandez-Espinar, M. et al. (1994), “Purification, characterization and regulation

additives in animal feed”, Bioprocess Biosyst Eng, 34, pp. 347–355.

of the synthesis of an Aspergillus nidulans acidic xylanase” Appl. Microbiol.

34. Fialho, M. B. and. E. C. C. (2004), “Purification and characterization of xylanases

Biotechnol, 42, pp. 555-562.

35. Garg N., Kumar A., et al. (2010), “Xylanase: applications and biotechnological

from Aspergillus giganteus”, Folia Microbiol, 49(1), pp. 13-18.

aspects: biotechnological aspects of xylanase”, LAP LAMBERT Academic Publ,

36. Ghoshal G., Shivhare U.S., et al. (2013), “Effect of xylanase on quality attributes

Lambert.

37. Goswami G.K., Krishnamohan M., et al. (2014), “Cloning and heterologous

of whole-wheat bread”. J Food Qual, 36, pp. 172-180.

expression of cellulose free thermostable xylanase from Bacillus brevis”, Springerplus,

38. Haltrich, D., Nidetzky B., et al. (1996), “Production of fungal xylanases”,

3, pp. 1–6.

39. Hazlewood G.P., Gilbert H.J. (1993), “Molecular biology of hemicellulases, in

Bioresour. Technol, 58, pp. 137-161.

Hemicelluloses and Hemicellulases”, Coughlan, M. P. and Hazlewood, G. P. Eds.,

40. He Fanglian (2011), "Laemmli-SDS-PAGE", Bio-protocol, 1(11), pp. e80.

Portland Press, London, pp.103-126.

41. Jeffries T.W. (1996), “Biochemistry and genetics of microbial xylanases”, Curr.

42. Jhamb K., Sahoo D.K. (2012), “Production of soluble recombinant proteins

Opin. Biotechnol., 7, pp. 337-342.

in Escherichia coli: effects of process conditions and chaperone co-expression on cell

43. Joshi C., Khare S.K. (2011), “Utilization of deoiled Jatropha curcas seed cake for

growth and production of xylanase”, Bioresour Technol,123, pp. 135–143.

production of xylanase from thermophilic Scytalidium thermophilum”, Bioresour

44. Juturu V., Wu J.C. (2012), “Microbial xylanases: engineering, production and

Technol, 102, pp. 1722–1726.

45. Kimura T., Suzuki H., et al. (2000), "Molecular cloning, overexpression, and

industrial applications”, Biotechnol Adv, 30, pp. 1219–1227.

purification of a major xylanse from Aspergillus oryzae”, Biosci Biotechnol Biochem,

46. Kimura T., Suzuki H., et al. (2002), “Molecular cloning, charaterization, and

64(12), pp. 2734-2738.

expression analysis of the xynF3 gene from Aspergillus oryzae”, Biosci Biotechnol

47. Ko C-H., Lin Z-P., et al. (2010). “Xylanase production by Paenibacillus

Biochem, 66(2), pp. 285-292.

campinasensis BL11 and its pretreatment of hardwood kraft pulp bleaching" Int

48. Krengel U., Dijkstra B.W. (1996), "Three-dimensional structure of Endo-1,4-beta

Biodeterior Biodegrad, 64, pp. 13–19.

xylanase I from Aspergillus niger: molecular basis for its low pH optimum", J Mol

49. Krisana, A. et al. (2005), “Endo-1,4-β-xylanase B from Aspergillus cf. niger

Biol, 263(1), pp. 70-8.

BCC14405 isolated in Thailand: Purification, characterization and gene isolation” J.

50. Kulkarni N., Shendye A., et al. (1999), "Molecular and biotechnological aspects of

Biochem. Mol. Biol, 38(1), pp. 17-23.

xylanases", FEMS Microbiol Rev, 23(4), pp. 411-56.

51. Kumar V., Shukla P. (2018), “Extracellular xylanase production from T.

lanuginosus VAPS24 at pilot scale and thermostability enhancement by

52. Kuno, A., Kaneko, S., et al. (2000), “Novel sugar- binding specificity of the type

immobilization”, Process Biochem, 71, pp. 53–60.

XIII xylan-binding domain of a family F/10 xylanase from Streptomyces

53. Leggio L. L., Jenkins J., et al. (2000), "X-ray crystallographic study of

olivaceoviridis E-86”, FEBS Letts, 482, pp. 231-236.

xylopentaose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A", Proteins, 41(3), pp.

54. Li J., Wang J., et al. (2012), “Achieving efficient protein expression

362-73.

in Trichoderma reesei by using strong constitutive promoters”, Microb Cell Fact, 11,

55. Lin X., Wu Z., et al. (2018), “Enzymatic pulping of lignocellulosic biomass”, Ind

pp. 84.

56. Liu M.Q., Weng X.Y., et al. (2006), “Expression of recombinant Aspergillus niger

crop prod, 120, pp. 16–24.

xylanase A in Pichia pastoris and its action on xylan”, Protein Expr. Purif, 48, pp.

57. Lu F., et al. (2008), “Purification and characterization of xylanase from Aspergillus

292-299

58. Lu Z.X., et al. (2004), “Arabinoxylan fibre improves metabolic control in people

ficuum AF-98”, Bioresour. Technol, 99, pp. 5938-5941.

59. Meagher M.M., Tao, B.Y., et al. (1988), “Kinetics and subsite mapping of β-D-

with Type II diabetes”, European Journal of Clinical Nutrition, 58, pp. 621-628.

xylobiose and D-xylose producing Aspergillus endoxylanase”, Carbohydr. Res., 173,

60. Miller G. L. (1959), "Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of

pp. 273-283.

Reducing Sugar", Analytical Chemistry, 31(3), pp. 426-428.

61. Möhlig M, K. C., Weickert M.O., et al. (2005), “Arabinoxylan-enriched meal

increases serum ghrelin levels in healthy humans” Horm Metab Res, 37(5), pp. 303-

62. Nair, S., Sindhu R., et al. (2008), “Purification and biochemical characterization of

308.

two xylanases from Aspergillus sydowii SBS 45”, Appl. Biochem. Biotechnol, 149, pp.

63. Nevalainen H., Peterson R. (2014), “Making recombinant proteins in filamentous

229-243.

64. Nevalainen H., Peterson R., et al. (2018), “Overview of gene expression using

fungi-are we expecting too much”, Front Microbiol, 5, pp. 1-10.

65. Pérez J., Munoz-Dorado J., et al. (2002), “Biodegradation and biological

filamentous fungi”, Curr Protoc Protein Sci, 92, pp. e55.

treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview”, Int Microbiol, 5, pp.

66. Pirgozliev V., Whiting I., et al. (2016), “Variability between wheat dry distillers

53–63.

grains with solubles samples influence the effectiveness of exogenous enzymes when

67. Polizeli M.L., Rizzatti A.C., et al. (2005), “Xylanase from fungi: properties and

fed to broiler chickens”, Vet Med Anim Stud, 6, pp. 61–69.

68. Poutanen K. (1998), “Characterisation of xylanolytic enzyms for potential

industrial application”. Appl Microbiol Biotechnol, 67, pp. 577-591.

applications. Ph.D. Thesis”, Technical Research Centre of Finland, Publications, 47,

69. Qiu Z., Shi P., et al. (2010), “A xylanase with broad pH and temperature

Espoo.

adaptability from Streptomyces megasporus DSM 41476, and its potential application

70. Ramón Gerardo Guevara-González and lrineo Torres-Pacheco. (2006), “Xylanase.

in brewing industry”, Enzyme Microb Technol, 46, pp. 506–512.

71. Rao R.S., Muralikrishna G. (2006), “Water soluble feruloyl arabinoxylans from

Advances in Agricultural and Food Biotechnology”, 305-322 ISBN: 81-7736-269.

rice and ragi: changes upon malting and their consequence on antioxidant activity. Ph”.

72. Rychen G., Aquilina G., et al. (2018), “Safety and efficacy of ECONASE®XT

(endo-1,4-β-xylanase) as a feed additive for pigs for fattening”, EFSA J, 16, pp.

73. Sapag A., Wouters J., et al. (2002), “The endoxylanases from family 11: computer

e05217.

analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic

74. Su X., Schmitz G., et al. (2012), “Heterologous gene expression in filamentous

relationships”, J. Biotechnol, pp. 109-131.

fungi. In: Gadd GM, Sariaslani S (eds) Advances in applied microbiology”, Academic

75. Subramaniyan S., Prema P. (2002), "Biotechnology of microbial xylanases:

Press, Cambridge, pp. 1–61.

enzymology, molecular biology, and application", Crit Rev Biotechnol, 22(1), pp. 33-

76. Subramaniyan S., Prema P. (2003), “Biotechnology of Microbial Xylanases:

64.

Enzymology, Molecular Biology and Application”, Critical Reviews in Biotechnology,

77. Thomas L., Sindhu R., et al. (2015), “Production of an alkaline xylanase from

Kerala, India, pp. 1030-1045.

recombinant Kluyveromyces lactis (KY1) by submerged fermentation and its

78. Van Dorn R., Shanahan D., et al. (2018), “Safety evaluation of xylanase 50316

application in bio-bleaching”, Biochem Eng J, 102, pp. 24–30.

enzyme preparation (also known as VR007), expressed in Pseudomonas fluorescens,

79. Verma D., Kawarabayasi Y., et al. (2013), “Cloning, expression and characteristics

intended for use in animal feed”, Regul Toxicol Pharmacol, 97, pp. 48–56.

of a novel alkalistable and thermostable xylanase encoding gene (Mxyl) retrieved from

80. Wakarchuk W.W., Campbell R.L., et al. (1994), “Mutational and crystallographic

compost-soil metagenome”, PLoS ONE, 8, pp. e52459.

analyses of the active site residues of the Bacillus circulans xylanase”, Prot.Sci., 3, pp.

467-475.

81. Wakiyama M., Tanaka H., et al. (2008), “Purification and properties of family-10

endo-1,4-β-xylanase from Penicillium citrinum and structural organization of encoding

82. Walia A., Guleria S., et al. (2017), “Microbial xylanases and their industrial

gene”, J Biosci Bioeng, 105, pp. 367–374.

83. Whiting I.M., Rose S.P., et al. (2019), “Effect of wheat distillers dried grains with

application in pulp and paper biobleaching: a review”, 3 Biotech, 7, pp. 1–12.

solubles and exogenous xylanase on laying hen performance and egg quality”, Poult

84. Wong K.K.Y., Tan, L.U.L., et al. (1988), “Multiplicity of β-1,4-xylanase in

Sci, 98, pp. 3756–3762.

85. Yang, Y., Zhang. W, et al. (2010), “Purification and characterization of an

microorganisms: Functions and applications”, Microbiol. Rev, 52, pp. 305-317.

extracellular xylanase from Aspergillus niger C3486”, Afr J Microbiol Res, 4, pp.

86. Zhang M., Jiang Z., et al. (2010a), “Cloning and expression of a Paecilomyces

2249–2256.

thermophila xylanase gene in E. coli and characterization of the recombinant

87. Zhang W., Lou K., et al. (2010b), “Expression and characterization of

xylanase”, Bioresour Technol, 101, pp. 688–695.

the Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1 xylanase gene (xynB) in Bacillus subtilis”,

88. Zhou C., et al. (2008), “Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its

Appl Biochem Biotechnol, 160, pp. 1484–1495.

expression in Escherichia coli”, Bioresour. Technol, 99, pp. 831-838.

CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

1. Hoàng Thu Huyền, Nguyễn Thị Kim Thu, Lê Thanh Hoàng, Đào Thị Mai Anh, Đỗ

Thị Tuyên (2019), “Nghiên cứu các điều kiện tinh sạch enzyme xylanase tự nhiên từ

chủng Aspergillus oryzae”. Báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc

2019: 36-37.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp

Mục tiêu của đề tài là tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp; đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp; thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme xylanase tự nhiên.

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE

TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE

TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Viết tắt

Viết đầy đủ

Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy

phân xylan [67]

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran [39]

Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [Jeffries1996]

Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng [48]

Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm [48]

Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [68]

Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase

Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [75]

Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [76]

Điều kiện tối ƣu

Độ bền

KLPT

Vmax (µmol

pI

Km (mg/ml)

Nhiệt độ

Vi sinh vật

(KDa)

/ phút /

pH Nhiệt độ pH (giờ)

(giờ)

Nấm mốc

Vi khuẩn

Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch

Hình 2.1: Đƣờng chuẩn xylose

Hình 2.2: Đƣờng chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger

tái tổ hợp

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase từ chủng A. oryzae

tự nhiên

Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số của các mẫu protein và hoạt tính xylanase tái tổ hợp

trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất xylan 0,5%

Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A. oryzae

VTCC-F187; (B) chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp

(ĐC: Đối chứng, M: Mẫu thí nghiệm)

Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sau khi qua cột histag xylanase G2

Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng

A. niger VTCC017/ pANXlG2

Protein tổng

Hoạt tính

Hoạt tính

Hiệu suất

Mẫu

Độ sạch

tổng (IU)

riêng (IU/mg)

thu hồi (%)

(mg)

Hình 3.4: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase

tái tổ hợp

Hình 3.5: Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase

tái tổ hợp

Hình 3.6: Ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol

(EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên hoạt tính

xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng)

Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp

Chất tẩy rửa

Hoạt tính xylanase còn lại (%)

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính của xylanase

Hoạt tính còn lại (%)

Các ion kim loại

10mM

± SD

10mM Mg2+ Fe2+ Cu2+ Ca2+ Ag+ Ni+ K+

Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng gốc A. oryzae VTCC-F-187

Hoạt tính

Hàm lƣợng