Đồ án tốt nghiệp: Phân lập và định danh vùng gen ITS của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại TP. Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VÙNG GEN ITS CỦA NẤM MEN NHIỄM BỆNH TRÊN DA CHÓ NUÔI TẠI TP. HỒ CHÍ MINH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM- MÔI TRƯỜNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Ts. Hoàng Quốc Khánh

Ngô Đức Duy

Sinh viên thực hiện:

Huỳnh Long Thủ

MSSV: 1051110154 Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Huỳnh Long Thủ, là sinh viên đại học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học,

khóa 2010, tại trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan:

✓ Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện.

✓ Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở các

nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong Luận văn tốt

nghiệp của mình.

SINH VIÊN

Huỳnh Long Thủ

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC .......................................................................................................................... i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. iv

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH .................................................................... v

MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4

1.1. Tình hình nuôi chó .................................................................................................. 4

1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới ............................................................ 4

1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam ........................................................................ 5

1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da ................................................................................... 6

1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó .................................................................................... 6

1.2.2. Bệnh ngoài da của người ................................................................................. 7

1.3. Các tác nhân gây bệnh ............................................................................................ 7

1.3.1. Vi khuẩn ............................................................................................................ 7

1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp ............................. 7

1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra .................................................... 7

1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người ..................................................................... 8

1.3.2. Nấm men ........................................................................................................... 8

1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó ...................................... 8

1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra .......................................... 8

1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người ..................................................................... 9

1.3.3. Nấm sợi ............................................................................................................. 9

1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp. .......................................... 9

1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra ...................... 9

1.4. Tổng quan về nấm men ......................................................................................... 10

1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men ....................................................................... 10

1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men ..................................................... 10

i

Đồ án tốt nghiệp

1.4.3. Sinh sản của nấm men .................................................................................... 11

1.4.4. Nấm men gây bệnh ......................................................................................... 12

1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh ....................................... 12

1.6. Định danh nấm men .............................................................................................. 13

1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống .................................. 14

1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái ............................................................. 14

1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái ................................................... 14

1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử .................................................. 15

1.6.2.1 Đoạn gen rDNA ........................................................................................ 15

1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài ...................... 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................ 19

2.1. Vật liệu và thiết bị ................................................................................................. 19

2.1.1. Dụng cụ ........................................................................................................... 19

2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................ 19

2.1.3. Vật liệu ............................................................................................................ 19

2.1.3.1. Nguồn phân lập ........................................................................................ 19

2.1.3.2. Hóa chất ................................................................................................... 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 21

2.2.1. Phân lập nấm men gây bệnh .......................................................................... 21

2.2.2. Quan sát hình thái nấm men .......................................................................... 22

2.2.2.1. Quan sát tế bào nấm men ........................................................................ 22

2.2.2.2. Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả ........................................................ 23

2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men .............................................. 24

2.2.3.1. Tách chiết DNA ........................................................................................ 24

2.2.3.2. Điện di ...................................................................................................... 24

2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................ 25

2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men ............................................... 29

ii

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................... 33

3.1. Kết quả hình thái học nấm men ............................................................................ 33

3.1.1 Kết quả khuẩn lạc ............................................................................................ 33

3.1.2. Kết quả hình ảnh tế bào sinh dưỡng .............................................................. 34

3.1.3. Kết quả quan sát tế bào sinh sản ................................................................... 35

3.1.4. Kết quả quan sát khuẩn ty .............................................................................. 35

3.2. Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm men ......... 36

3.2.1. Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm men ........................................ 36

3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men ...................... 36

3.3. Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men trên ngân hàng gen NCBI và thiết lập cây phân loài ................................................................................... 37

3.3.1. Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của 4 mẫu nấm men ................... 37

3.3.2. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA trên ngân hàng gen NCBI và xây dựng cây phân loài............................................................................................................. 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 43

4.1. Kết luận ................................................................................................................. 43

4.2. Đề nghị .................................................................................................................. 43

Tài liệu tham khảo ........................................................................................................... 45

iii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Bp Base Pair

DNA Deoxyribonucleotide Acid

EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid

PCR Polymerase Chain Reatio

PDA Potato Dextrose Agar

TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae

TE Tris- Ethylenediamine- Tetraacet

iv

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

Bảng

Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993…………..………..13

Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene)…..17

Bảng 3.1 Hình ảnh kết quả hình thái khuẩn lạc ………………………………………33

Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng…………………………………………………34

Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản của nấm men……………………………………...35

Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty …………………………...……………..……..35

Hình ảnh

Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS……………………………………………..…………..17

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ly trích bộ gen của 4 mẫu nấm men………..……………..36

Hình 3.2 Kết quả sản phẩm PCR ……………………………………….…………….37

Hình 3.3 Kết quả sản phẩm PCR M23-2 ……………………………………..………37

Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA của các

chủng nấm men phân lập( M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) và các loài nấm men trong

ngân hàng

gen……………………………………………………………………………………..39

v

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Chó là người bạn thân thiết của con người, con người tiếp xúc với chó gần như

là mọi lúc, dù là trực tiếp hay gián tiếp. Chính vì thế mà việc lây nhiễm những căn

bệnh nguy hiểm của chó sang người là một vấn đề đáng quan tâm. Hiện nay, khi nhu

cầu sở hữu một con chó làm thú cưng của con người ngày càng cao, về đa dạng, chủng

loài và số lượng ngày càng nhiều, cùng với điều kiện nuôi đa dạng cho nên có nhiều

hơn căn bệnh xuất hiện trên chó và có khả năng lây lan sang người.

Trong các căn bệnh dễ lây lan sang người thì các căn bệnh ngoài da trên chó là

những bệnh dễ tấn công sang người nhất. Vì chỉ cần thông qua tiếp xúc trực tiếp hay

gián tiếp, và trong một điều kiện thích hợp thì con người cũng bị lây nhiễm.

Có nhiều tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó, trong đó nấm men cũng là một

tác nhân quan trọng có thể gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho chó và cả con

người. Vì thế để xác định được các loài nấm men đó thì trong khóa luận này sẽ tiến

hành phân lập và bước đầu định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử trên vùng gen ITS

rDNA nhằm xác định một số chủng nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành

phố Hồ Chí Minh.

2. Mục đích nghiên cứu

✓ Cung cấp những thông tin chính xác về một số chủng nấm men nhiễm bệnh da

trên chó cũng như khả năng lây lan của chúng sang con người, nhằm tăng khả

năng điều trị và phòng ngừa lây lan khi chó bị nhiễm những loại nấm men trên.

1

Đồ án tốt nghiệp

✓ Tạo nguồn giống nấm men thuần cho những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh học

của các loài nấm men đã định danh được.

3. Nhiệm vụ nghiên cứu

✓ Phân lập được một số nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành phố Hồ

Chí Minh.

✓ Định danh nấm men bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên việc giải trình

tự đoạn gen ITS rDNA của nấm men.

✓ Bước đầu xác định khả năng gây bệnh của các loài nấm men đã định danh dựa

trên các nghiên cứu trên thế giới.

4. Phương pháp nghiên cứu

✓ Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen bảo tồn ITS rDNA

của nấm men để định danh nấm men.

✓ Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo

khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet.

✓ Đề tài có sử dụng các phần mềm: BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4

4.32.0.0

✓ Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

5. Các kết quả đạt được

Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã phân lập và định danh được 4 loài nấm men, dựa

trên các nghiên cứu trên thế giới thì bước đầu nhận định cả 4 loài nấm men này đều có

khả năng gây bệnh nguy hiểm trên chó và cả con người.

6. Kết cấu đề tài

Đề tài gồm 4 chương

2

Đồ án tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Trình bày những thông tin liên quan đến chó, nấm men và các thông tin về phương

pháp sinh học phân tử đã được sử dụng trong định danh nấm men.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày toàn bộ những nguyên vật liệu, địa điểm, máy móc thiết bị phục vụ nghiên

cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp nghiên cứu.

Chương 3: Kết quả và biện luận

Trình bày những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện nhiên cứu.

Chương 4: Kết luận và đề nghị

Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên quan

nhằm hoàn thiện đề tài.

3

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nuôi chó

Ngay từ thời tiền sử, khi loài người còn phải sống bằng các phương thức săn bắt,

hái lượm, sống trong hang động. Khi tìm ra lửa, con người đã biết chế biến thức ăn đầu

tiên bằng phương pháp nướng thịt thú rừng và sản phẩm thừa là xương động vật, đó là

món khoái khẩu của chó rừng, một loài động vật có khứu giác rất phát triển. Đó chính

là nguyên nhân khiến loài người và loài chó "tiếp cận" với nhau và cùng chung sống.

Chó nhờ vào bản năng tự nhiên rất thính tai, thính mũi, có thể tìm ra được dấu vết cũng

như khả năng nhìn trong bóng đêm rõ hơn con người, rất tỉnh ngủ, có trí thông minh và

dễ huấn luyện.Vì thế con người đã sớm biết sử dụng chó để bảo vệ cho mình. Chó lại

là một giống vật có tình nghĩa nhất khi so sánh với các con vật khác đã sống gần gũi

với con người như trâu, bò, ngựa v.v…

1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới

Số lượng chó được con người nuôi trên thế giới là một con số thống kê rất khó

để đạt độ chính xác cao, vì ở một số quốc gia đặc biệt các quốc gia ở châu Á và châu

Phi thì chó được nuôi một cách tự do, có nghĩa là không có bất cứ một hệ thống quản

lý nào nhằm quản lý và kiểm soát số lượng chó của người dân.

Tuy nhiên trong một nỗ lực nghiên cứu thị trường, nhằm đánh giá tiềm năng của

ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm vật nuôi của Mỹ, đã đưa ra được một số thống

kê sơ bộ về số lượng chó trên thế giới.

Theo đó Mỹ là quốc gia đứng đầu về số lượng chó mà người dân họ sở hữu, với

42,5 triệu hộ gia đình ở Mỹ nuôi một hoặc nhiều con chó và tổng số chó trong cả nước

là 73 triệu con. Canada có 6 triệu con chó. [1]

Các nước Tây Âu cũng sở hữu 43 triệu con trong đó: đứng đầu là Pháp 8,8 triệu

con chó, cả Ý và Balan có 7,5 triệu, Anh có 6,8 triệu. Ở Đông Âu, Nga hiện có 12 triệu

4

Đồ án tốt nghiệp

con chó trong khi Ukraina cũng có 5,1 triệu con chó. Ở Nam Mỹ thì Brazil với 30 triệu

con, Argentina 6,5 triệu con, Columbia 5 triệu con. [1]

Ở châu Á và châu Úc thì việc thống kê số lượng chó gặp nhiều khó khăn khi

việc đăng ký sở hữu chó là một điều không cần thiết ở nhiều quốc gia trên châu lục

này. Nhưng theo ước tính Trung Quốc có khoảng 110 triệu con chó, Ấn Độ có khoảng

32 triệu con, Úc khoảng 4 triệu con. Các con số trên là chưa tính tới số lượng chó sống

tự do và đi hoang. Tuy nhiên, Nhật Bản lại là quốc gia thuộc châu Á quản lý chặt chẽ

nhất số lượng chó nuôi của người dân theo ước tính là khoảng 9,5 triệu con. [1]

Ở châu Phi, theo những thống kê của tổ chức Y tế thế giới về số lượng chó

nhằm kiểm soát bệnh dại trên người đang gia tăng, thì có khoảng 78 triệu con chó trên

toàn châu lục và trong số đó có tới 70 triệu con là chó hoang vô chủ. [1]

1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nuôi chó mèo và chim cảnh trong gia đình đã có từ lâu đời. Hầu

như trong mỗi gia đình nào của người dân nước ta cũng đều nuôi chó và mèo, với chức năng

chính là bảo vệ, diệt chuột… Ngày nay, khi nền kinh tế đã tương đối phát triển, nghề nuôi

chim, thú cảnh trong nhà càng phát triển, nhất là ở các thành phố lớn.

Gần đây, ở nước ta việc sử dụng chó nghiệp vụ vào công tác an ninh quốc

phòng đã và đang phát triển theo nhu cầu bảo vệ các xí nghiệp, cơ quan, cơ sở nông

nghiệp, kho tàng và mục tiêu quân sự. Số người yêu thích chó nghiệp vụ và chó làm

cảnh ngày một tăng. Vì vậy số lượng chó béc giê và các giống chó cảnh châu Âu trong

các gia đình, nhất là ở thành phố lớn ngày càng tăng.

Việc chăn nuôi chó nghiệp vụ tập trung ở các trường huấn luyện nghiệp vụ và

chó cảnh trong các gia đình, trong những năm qua gặp rất nhiều khó khăn, khó khăn

nhất là dịch bệnh làm chó chết. Vì vậy số lượng chó nghiệp vụ và chó cảnh tăng lên rất

chậm.

5

Đồ án tốt nghiệp

Nước ta có 2 trung tâm chăn nuôi giống chó nghiệp vụ thuần là giống chó của

Nga và Đức. Bên cạnh đó, có một số địa phương chú ý phát triển giống chó nghiệp vụ

lai có chất lượng tốt.

Ngày 19-01-2009, Bộ Nội vụ đã ban hành quyết định số 71 QĐ/BNV về việc

thành lập Hiệp hội nuôi chó giống Việt Nam (Vietnam kennel Association-VKA).

Về việc quản lý số lượng chó thì ở Việt Nam gần đây cũng đã đưa ra một quyết

định, trong đó quy định chủ sở hữu chó phải đến UBND để đăng ký và được cấp số

(Quyết định số 2891/QĐ-BNN-TY ngày 14/11/2012 của Bộ Nông nghiệp và phát triển

nông thôn về phê duyệt kế hoạch khống chế và loại trừ bệnh dại năm 2012) [32]. Tuy

nhiên cũng như một số nước ở châu Á thì người dân vẫn có tâm lý rất thoải mái trong

việc nuôi và sở hữu chó và thường không quan tấm tới các điều lệ về việc nuôi và sở

hữu chó.

1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da

1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó

Chó là vật nuôi rất gần gũi với con người và được cho là trung thành nhất với

con người. Tuy nhiên nếu việc chăm sóc người bạn này không tốt thì chúng rất dễ mắc

bệnh. Cũng giống con người, chó rất dễ mắc một số bệnh về đường tiêu hóa dẫn đến

các triệu chứng như tiêu chảy, chán ăn, tụt cân. Chó cũng dễ mắc các bệnh về hô hấp

với các triệu chứng tương tự con người như sổ mũi, nghẹt mũi khó thở. Và chó cũng

thường xuyên mắc các căn bệnh nghiêm trọng liên quan đế nội tạng như gan, phổi, tim

hay các bệnh về xương khớp v.v….

Trong các căn bệnh thường gặp ở chó có thể nói căn bệnh đáng lo ngại nhất đối

với con người là các căn bệnh ngoài da ở chó. Vì con người thường xuyên gần gũi và

tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với chó nên việc một con chó bị bệnh ngoài da là một

điều đáng lo ngại vì tính chất lây lan của các căn bệnh đó.

6

Đồ án tốt nghiệp

Các bệnh ngoài da tuy ít ảnh hưởng đến tính mạng của chó nhưng chúng lại gây

ra những tổn thương nghiêm trọng trên cơ thể chó và có nguy cơ ảnh hưởng đến con

người.

Các triệu chứng thường thấy cục bộ ở các vùng da như: rụng lông, đỏ tấy có

chảy nước dịch hoặc dịch mủ màu vàng, da dầy hóa bì, loét sùi. Con vật khó chịu, ngứa

ngáy hay gãi, kêu rên, thần kinh không ổn định, lở loét ở vùng cổ, chân, kẻ móng, mũi,

mặt, tai. Có mùi hôi tanh khó chịu.

1.2.2. Bệnh ngoài da của người

Là những bệnh thường gặp do nhiều tác nhân gây ra, bệnh thường chỉ gây

thương tổn trên da và rất ít gây nguy hiểm đến tính mạng. Một số bệnh thường gặp là:

ghẻ, nấm cạn, nhiễm trùng da thông thường, mụn trứng cá, chàm, vẩy nến, luput đỏ,

bệnh lao da.

1.3. Các tác nhân gây bệnh

1.3.1. Vi khuẩn

1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp

Các tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó thường thuộc các nhóm:

Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus , Escherichia, Pseudomonas, Proteus.

1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra

Các nhóm vi khuẩn trên thường gây nên các triệu chứng về viêm bề mặt da của

chó. Trong điều kiện bình thường da chó luôn có cơ chế để vô hiệu hóa các vi khuẩn

cũng như các yêu tố vi sinh vật gây bệnh khác. Nhưng trong trường hợp da bị tổn

thương do va chạm cơ học tạo chỗ hở trên bề mặt da làm thay đổi điều kiện sinh lý trên

7

Đồ án tốt nghiệp

bề mặt da, lúc đó các vi sinh vật gây bệnh sẽ dễ dàng xâm nhập, gây bệnh trên da chó

và có một số biểu hiện của viêm da do vi khuẩn như sau:

Viêm da mủ bề mặt: là những dấu hiệu trên bề mặt đặc trưng bởi vết loét và xói mòn,

bao gồm viêm da ẩm cấp tính (viêm da chấn thương) và viêm da nếp gấp (hăm da).

[33]

Viêm da mủ cạn: bao gồm những phần trên bề mặt của nang lông và biểu bì kể cả

bệnh chốc lở (viêm da mủ trên chó con) và viêm nang lông do vi khuẩn bề mặt (mụn

mủ với phần lông lồi ra). [33]

Viêm da mủ sâu: bao gồm những phần dưới của nang lông và chân bì kể cả viêm nang

lông sâu, mụn nhọt và viêm mô tế bào, như viêm mủ mũi, mụn trên chó, viêm bì móng.

[33]

1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người

Các loại vi khuẩn trên thường có khả năng lây lan từ chó sang người. Và một

điều đáng quan tâm là những tổn thương do chúng gây ra khi lây lan sang người còn

nguy hiểm hơn trên chó như staphylococcus aureus gây các bệnh mụn nhọt ngoài da,

viêm phổi, áp xe phổi, nhiễm khuẩn huyết. Bệnh rất nặng, rất dễ gây tử vong. Các vi

khuẩn như Proteus vulgaris có khả năng gây nên các bệnh trên đường tiểu như viêm

cầu thận, sỏi thận cấp, viêm bàng quang , v.v…

1.3.2. Nấm men

1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó

Các loài nấm men Melasezia vàCandida là 2 loài được xác định thường xuyên nhất

trong các trường hợp chó bị bệnh ngoài da. [2]

1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra

8

Đồ án tốt nghiệp

Bệnh biểu hiện đặc trưng bởi những vẩy trắng, hay màng giả trên niêm mạc

miệng hay lưỡi, đôi khi lan cả đến môi, bệnh tích thường nổi lên với sự sung huyết ở

xung quanh và bên ngoài còn ở dưới thì loét, những bệnh tích này có thể lan tràn đến

hầu hoặc thực quản.

1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người

Loài nấm men Candida có thể lây lan sang người thông qua tiếp xúc gián tiếp

hay trực tiếp. Khi lây sang người chúng có khả năng gây ra các tổn hại giống như ở

chó. Ngoài ra chúng còn có khả năng gây tổn thương cho cơ quan sinh dục của người.

Đặc biệt khi gây bệnh trên cơ thể người bị suy giảm miễn dịch (người bị nhiễm

HIV, đang điều trị ung thư, cấy gép tủy) thì chúng trở thành nguyên nhân gây tử vong

hàng đầu bởi những thương tổn lan toàn thân mà chúng gây ra.

1.3.3. Nấm sợi

1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp.

Các nhóm nấm mốc gây bệnh ngoài da thường được phân lập trên da và lông chó là:

Aspergillus, Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton.[3]

1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra

Chúng thường gây bệnh ở hốc mũi của chó. Chó bị nhiễm khi bị thương hoặc hít

phải dị vật. Khi bị nhiễm nấm này sẽ sinh trưởng và sinh ra độc tố phá hủy lớp niêm

mạc trong mũi, hình thành khối u sưng phòng, kèm theo các triệu chứng như viêm mũi,

viêm xoang. Nếu bệnh kéo dài sẽ dẫn đến tử vong do gây tổn thương lên não [4]. Các

nhóm nấm này gây rụng từng mảng lông, gãy sợi lông, nhất là vùng mặt, tai, ngứa ngáy

9

Đồ án tốt nghiệp

khó chịu, hay dùng móng gãi tai. Bệnh diễn biến chậm, lâu ngày gây viêm da bội

nhiễm, viêm thận, nhiễm trùng máu và tử vong.

1.4. Tổng quan về nấm men

Nấm men là vi sinh vật nhân thực, là một phần trong giới nấm với hơn 1500 loài

đã được phát hiện. Tuy nhiên, theo ước tính thì con số đó chỉ chiếm 1% trong giới nấm

đang tồn tại trên trái đất[5]. Đa số nấm men là đơn bào và một số loài còn có khả năng

hình thành các chuỗi liên kết đa bào được gọi là khuẩn ty thật và khuẩn ty giả [6]. Nấm

men có kích lớn hơn rất nhiều so sới các cộng đồng vi sinh khác.

Nấm men có thể có lợi hoặc gây bệnh cho con người, chúng có mặt ở khắp mọi

nơi và hiện diện nhiều nhất ở những nơi giàu nguồn đường như trái cây, một số loài

còn được tìm thấy trong đất, trên cơ thể động vật, côn trùng. [7]

1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tế bào nấm men thường

lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn. Kích thước khoảng từ 2.5µm-10µm, do đó có thể

quan sát rõ được dưới kính hiển vi quang học.

Tùy loài nấm men mà tế bào có hình cầu, hình tròn, hình ô van, hình elip, hình

thoi, hình chai, hình quả lê …

Tuy nhiên hình dạng nấm men hầu như không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của

nấm men và điều kiện nuôi cấy. Saccharomyces cerevisiace có hình bầu dục khi nuôi ở

môi trường giàu dinh dưỡng, còn nuôi trong điều kiện yếm khí thì nó có hình tròn, và

ngược lại khi nuôi trong môi trường có oxy thì tế bào có hình thon dài.

1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men

Nấm men là nhóm vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ. Chúng sử dụng các hợp chất

hữu cơ như là nguồn năng lượng duy nhất và không cần ánh sáng để phát triển. Những

loại đường mà nấm men dễ sử dụng nhất là các đường đơn như glucose, fructose, hoặc

10

Đồ án tốt nghiệp

các đường đôi như saccharose, maltose, một vài loài còn có khả năng sử dụng các

đường pentose, rượu và các hợp chất acid hữu cơ. [8]

Hô hấp nấm men là hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi. Không giống như vi

khuẩn nấm men không thể phát triển trong môi trường kỵ khí bắt buộc [8]. Nấm men

sinh trưởng tốt trong môi trường trung tính hoặc hơi chua. Một số chủng nấm men có

thể sinh trưởng ở độ cồn lên đến 10-11%.

Các loài nấm men khác nhau thì có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng khác nhau, có

những loài có thể sống ở -2oC cũng có những loài có thể đạt ngưỡng 45oC.

Chủng Leucosporidium frigidum phát triển ở -2 đến 20°C, Saccharomyces telluris ở 5-

35°C, và Candida slooffi tại 28-45°C [9]. Các tế bào có thể tồn tại trong điều kiện đông

lạnh nhất định, với khả năng giảm theo thời gian.

Trong phòng thí nghiệm nấm men được nuôi cấy và phát triển tốt trên các môi

trường giàu nguồn đường như: Potato Dextrose Agar (PDA), Yeast Peptone Dextrose

Agar(YPD), Sabouraud Agar…

1.4.3. Sinh sản của nấm men

Nấm men giống như tất cả các loại nấm, có thể sinh sản vô tính và hữu tính.

Nhưng hình thức phổ biến nhất là sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi [10]. Nhân của

tế bào mẹ chia tách thành một nhân con (nhân hoàn chỉnh) và di chuyển đến tế bào

con. Chồi tiếp tục phát triển cho đến khi nó tách ra từ tế bào mẹ, tạo thành một tế bào

mới [11]. Các tế bào còn được tạo ra qua hình thức sinh sản này thường nhỏ hơn tế bào

mẹ. Cũng có một số loài nấm men sinh sản bằng hình thức phân bào và tạo ra hai tế

bào con gần bằng nhau về kích thước. [10]

Trong điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng các tế bào đơn bội sẽ chết, tuy

nhiên trong cùng điều kiện đó, các tế bào lưỡng bội có thể sống sót nhờ tiếp hợp với

nhau (sinh sản hữu tính) tạo thành hợp tử và các hợp tử phân chia thành các bào tử nằm

11

Đồ án tốt nghiệp

trong nang sau đó sẽ được phát tán ra ngoài khi nang chín. Nếu 2 tế bào nấm men có

hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao.

Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao.

1.4.4. Nấm men gây bệnh

Một số loài nấm men là tác nhân gây bệnh cơ hội có thể gây nhiễm trùng ở

những người bị tổn thương hệ thống miễn dịch. Cryptococcus neoformans và

Cryptococcus gattii là tác nhân gây bệnh quan trọng của suy giảm miễn dịch người.

Chúng là nguyên nhân gây ra hơn 600.000 ca tử vong cho những người đang điều trị

HIV/AIDS [12]. Các tế bào được bao quanh bởi các nang khuẩn polysaccharide giúp

chúng tránh bị phát hiện và tấn công bởi các tế bào bạch cầu. [13]

Các nấm men thuộc chi Candida là một nhóm các tác nhân gây bệnh cơ hội

thường gây ra các tác động bệnh lý lên miệng hoặc cơ quan sinh dục. Candida được

tìm thấy như một vi sinh vật hội sinh sống trong các vùng nhầy và ẩm ướt trên cơ thể

người và động vật máu nóng. Khi xâm nhập vào niêm mạc các tế bào nấm men nảy

mầm gây kích ứng và biến đổi các mô gây nên các triệu chứng bệnh lý.

1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh

Trong thế kỷ thứ năm trước Công nguyên, Hippocrates đã mô tả bệnh tưa miệng

[14] và chính vì vậy ông được coi là người đầu tiên mô tả một triệu chứng nhiễm trùng

nấm men.

Đến năm 1839 nhờ sự xuất hiện của kính hiển vi và những nghiên cứu của

Langenbeck và sau đó là Berg Gruby đã chứng minh Candida albicans là một tác nhân

nấm men gây bệnh và ảnh hưởng đến tính mạng. Chúng là nấm men điểm hình được

phân lập từ bệnh phẩm của những người bị bệnh. [15]

Đến những năm 1960 với sự ra đời của các phương pháp điều trị ung thư, các

biện pháp điều trị kháng sinh, đã vô tình làm bùng phát và tăng nguy cơ nhiễm trùng

12

Đồ án tốt nghiệp

nấm men nghiêm trọng. (Candida được chứng minh là ra các triệu chứng nhiểm trùng ở

những người suy giảm miễn dịch). [16]

Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993.

Các chủng phát hiện Năm

1989 Malassezia vàTrichosporon là nấm bệnh cơ hội ngày càng được phát hiện

nhiều hơn. [17]

1989 C. tropicalis, Malassezia spp, Hansenulaspp,T. beigelii. [18]

1989 Phổ của nấm men kết hợp với ung thư có nhiều sự thay đổi bao gồm

T. beigelii, Saccharomyces spp, Torulopsis pintolopesii,

Pichiafarinosa, và Rhodotorula spp. [19]

1992 Các báo cáo về Saccharomyce,Hansenula,

Rhodotorula và Malassezia spp. Và C. glabrata. [20]

1993 Kết quả theo dõi từ năm 1980-1990 số ca nhiễm nấm C. albicans tăng từ

(52%-60%), các loài khác giảm (21%-16%). [21]

1993 So sánh kết quả phân lập 15 tháng (1991-1992) với cùng kỳ (1987-1988)

C. glabrata tăng gấp đôi, C. krusei tăng nhẹ; Tỷ lệ C. guilliermondii, C.

lipolytica, và C. kefyrtăng. [22]

1.6. Định danh nấm men

Có hai phương pháp để định danh nấm men là phương pháp truyền thống và

phương pháp sinh học phân tử. Hiện nay, phương pháp được dùng nhiều nhất là sử

dụng sinh học phân tử vì những ưu điểm như nhanh chóng, chính xác và hiệu quả cao.

13

Đồ án tốt nghiệp

1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống

1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái

Tuy nấm men có kích thước lớn hơn vi khuẩn rất nhiều nhưng vẫn rất nhỏ so

với khả năng quan sát của con người, việc quan sát nấm men phải được thực hiện bằng

kính hiển vi ở độ phóng đại từ vài trăm đến 1000 lần.

Các đặc điểm cần chú ý khi quan sát hình thái nấm men gồm: quan sát tế bào,

quan sát các dạng bào tử, quan sát khuẩn ty thật, khuẩn ty giả, quan sát nhân tế bào.

1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái

Để có thể định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống người ta phải

tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và sinh lý rất phức tạp và tốn thời gian:

- Lên men 13 loại đường.

- Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio

Mérieux SA, Marchy-l’Étoile…)

- Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ kit

ID 32C).

- Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine,

cadaverine dihydrochloride, creatine.

- Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin,

thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic

acid.

- Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC, 35oC, 37oC và 42oC.

14

Đồ án tốt nghiệp

- Tạo thành tinh bột.

- Sản sinh acid từ glucose.

- Thủy phân Urê.

- Phân giải Arbutin.

- Phân giải lipid.

- Năng lực sản sinh sắc tố.

- Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza.

- Hóa lỏng gelatin.

-Phản ứng với Diazonium Blue B.

- Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%.

1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử

Định danh nấm men bằng sinh học phân tử chủ yếu dựa trên sự phát triển của

những kỹ thuật gen hiện đại và có độ chính xác cao. Đó là những kỹ thuật hiện đại có

sự kết hợp của nhiều ngành khoa học như sinh học, hóa học, tin học và cơ khí tự động.

Để định danh một loài nào đó thì người ta phải tiến hành các phản ứng như PCR và kỹ

thuật giải trình tự, sau đó xử lý số liệu với ngân hàng gen.

1.6.2.1 Đoạn gen rDNA

Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng

trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là

15

Đồ án tốt nghiệp

một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của

gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa,

ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân

tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác

biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những

oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại

các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được

thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi

sinh vật. [23]

Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch

đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương

pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên

cứu liên quan đến rDNA . [24]

Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển

những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm

sợi.[25]

❖ Primer

Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5.8S và

28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc

dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S.

cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S.

cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự

giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25bp. [24]

16

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene) ITS1 White et al. 1990 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G

ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA

ITS2 1773-1791 (18S) 1735-1756 (18S) 53-34 Gardes & Bruns 1993 White et al. 1990

ITS3 34-53 White et al. 1990

ITS4 57-38 (25S) White et al. 1990

GTA A GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG 194-172 (25S) Gardes & Bruns

ITS5 1993 White et al. 1990

TCC AG GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G CGC TGC GTT CTT CAT CG

1749-1770 (18S) 54-38 37-54 Vilgalys lab Vilgalys lab

5.8S 5.8SR TCG ATG AAG AAC GCA GCG

Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS

Chỉ định dùng cho PCR: ITS1 hoặc ITS5, ITS1-F và ITS4 hoặc LR15, ITS4-B

1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài

❖ Nhân gen (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật lai DNA đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của

nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi tiến

hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện

17

Đồ án tốt nghiệp

được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian

dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này

được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn DNA đích một cách nhanh chóng bằng kỹ

thuật nhân gene PCR. [30]

Việc nhân DNA cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối

với đoạn DNA hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích

nguồn DNA khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di

để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính

đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu.

Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự DNA và RNA của

sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi DNA sẽ cho phép xác định và

định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự

DNA còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh

vật. [30]

❖ Kỹ thuật giải trình tự

Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi

sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm

sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự

tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo

sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối

tượng nghiên cứu. Các gen bảo tồn được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của

sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ

sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. [30]

18

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu và thiết bị

Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm trường đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh,

Viện Sinh Học Nhiệt Đới

2.1.1. Dụng cụ

Ống nghiệm Que cấy

Đĩa petri Cân phân tích

Becher Máy chụp hình

Pipet, Pipetman, Đầu tip Ống đong

Erlen Tăm bông dài

Lame, Lamelle Eppendorf

2.1.2. Thiết bị

Kính hiển vi Nikon eclipse 80i Bộ nguồn điện di EC105

Tủ lạnh, Tủ lạnh -20oc Bể điện di IBI QS- 710

Máy vortex Hộp đèn soi UV Uvintec, BioRad UV

CCD Camera Máy li tâm lạnh MIKRO 220R

Lò viba Nồi hấp khử trùng

Máy PCR sprint thermo Cycler

2.1.3. Vật liệu

2.1.3.1. Nguồn phân lập

19

Đồ án tốt nghiệp

Các chủng nấm men được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ các

phòng khám thú y trên địa bàn thành phố: Quận 9, Quận 2, Quận Bình Thạnh, Quận

Thủ Đức…

2.1.3.2. Hóa chất

Môi trường nuôi cấy : PDA (Potato Dextrose Agar)

Dịch chiết khoai tây 20%

Dextrose 2%

Agar 2%

pH 5.6

1000ml H2O

Dầu soi kính

❖ Các hóa chất định danh:

Lysis (100mM tris-pH 8.0, 30mM EDTA-pH 8.0, 0.5%SDS)

Potassium acetate pH 7.5

CHCl3_Isoamyl alchol (24:1)

Isopropanol

Etanol 70%, Etanol 99%

6X LB Double dye

TAE 1X

Agarose

20

Đồ án tốt nghiệp

Ethidium bromide

❖ Các hóa chất PCR

Nước khử ion

Master Mix : 2x My taq Mix

Mồi xuôi ITS1 :TCCGTAGGTGAACCTGCGG

Mồi ngược ITS4 :TCCTCCGCTTATTGATATGC

Thang DNA 1kb

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân lập nấm men gây bệnh

Vì yêu cầu phải phân lập nấm men gây bệnh ngoài da trên chó nên các mẫu nấm

men sẽ được thu thập và phân lập từ các mẫu bệnh phẩm trên da chó. Có nhiều phương

pháp phân lập nấm men trong đó người ta có thể dùng các chất chống mốc cũng như

kháng khuẩn để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm mốc và chỉ thu nhận nấm

men. Tuy nhiên, khi sử dụng các chất này cần lưu ý đến liều lượng vì nó có khả năng

ức chế cả nấm men phát triển. Khi thực hiện đề tài này vì đảm bảo tính liên tục và các

hướng khác của đề tài nên những mẫu vi khuẩn và nấm sợi cũng sẽ được lưu trữ để

phục vụ công tác nghiên cứu sau này nên không sử dụng các chất ức chế trên.

Môi trường được sử dụng để phân lập là PDA.

Các bước phân lập nấm men

❖ Chuẩn bị dụng cụ môi trường

✓ Chuẩn bị môi trường

✓ Chuẩn bị tăm bông trong ống nghiệm chứa nước muối sinh lý

21

Đồ án tốt nghiệp

✓ Chuẩn bị đĩa petri và ống nghiệm thạch nghiên

✓ Chuẩn bị kéo, kẹp vô trùng

 Các dụng cụ trên được hấp khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC, 1 atm trong 20

phút.

❖ Phân lập

Mẫu sau khi thu về sẽ được cấy trải đều bằng tăm bông lên bề mặt đĩa thạch đã

chuẩn bị trước, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 2 ngày.

❖ Làm thuần

✓ Sau 2 ngày ủ dùng que cấy, thao tác vô trùng chấm nhẹ vào khuẩn lạc

riêng lẻ có đặc trưng khác với các khuẩn lạc còn lại ria trên đĩa petri

khác, và đem ủ để tạo khuẩn lạc đơn dòng.

✓ Lặp lại việc tách dòng nhiều lần để có được giống thuần.

✓ Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong môi trường PDA thạch nghiên

trong ngăn mát tủ lạnh.

2.2.2. Quan sát hình thái nấm men

Vì trong khóa luận này sử dụng phương pháp sinh học phân tử để định danh

nấm men, nên việc quan sát hình thái nấm men đóng vai trò phân loại nấm men với vi

khuẩn và nấm sợi.

2.2.2.1. Quan sát tế bào nấm men

Tế bào nấm men có rất nhiều hình dạng giống như vi khuẩn song kích thước lại

lớn hơn rất nhiều so với vi khuẩn, nên ta dễ dàng phân loại được nấm men và vi khuẩn

qua kính hiển vi.

Cách tiến hành

22

Đồ án tốt nghiệp

✓ Nuôi tế bào nấm men trong môi trường khoai tây lỏng ở nhiệt độ phòng từ 1-2

ngày.

✓ Làm tiêu bản sống và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X.

✓ Ta cũng có thể làm tiêu bản nhuộm đơn bằng Fuchsin để quan sát tế bào nấm

men rõ hơn.

✓ Thu nhận những mẫu tế bào có kích thước lớn, to tròn, hoặc thon dài.

2.2.2.2. Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả

Ở một số loài nấm men, chồi trưởng thành không tách ra khỏi tế bào mẹ mà tạo

thành một chuỗi tế bào được gọi là khuẩn ty giả. Cấu tạo của khuẩn ty giả rất đơn giản,

bao gồm các tế bào có kích thước và hình dạng tương tự nhau hay chúng chỉ khác nhau

do sự kéo dài của tế bào. Tế bào cuối cùng luôn ngắn hơn tế bào kế nó.

Khuẩn ty thật thì có thể thấy rõ các vách ngăn giữa các tế bào, còn khuẩn ty giả

thì không.

Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện môi trường

nghèo dinh dưỡng. Vì vậy ta sử dụng phương pháp phòng ẩm để nuôi tế bào nấm men.

Cách tiến hành:

✓ Trước hết ta chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và hai thanh

đũa xếp hình chử “v” bên trên. Đem hấp khử trùng cùng với một ống môi

trường PDA và một bình nước cất.

✓ Dùng pipetman hút môi trường và nhỏ vào lame sao cho môi trường trang mỏng

khoảng 2/3 lame để môi trường đông tự nhiên.

✓ Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm men theo dấu “#” rồi đậy lamelle lại.

✓ Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm điều giấy thấm.

✓ Đậy nắm đĩa lại và gói đĩa cẩn thận và ủ ở nhiệt độ phòng trong một tuần.

23

Đồ án tốt nghiệp

✓ Quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100X.

2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men

2.2.3.1. Tách chiết DNA

Trước khi PCR ta phải tiến hành giải phóng và tinh sạch DNA nấm men khỏi tế bào để

có mẫu DNA trần và hàm lượng cao.

Các bước tiến hành

✓ Lấy một ít sinh khối nấm men từ khuẩn lạc nấm men nuôi cấy trên đĩa petri hòa

vào 200µl dung dịch lysis buffer chứa trong eppendorf 1.5ml, sau đó vortex nhẹ.

✓ Đun trên nước sôi 15 phút.

✓ Thêm vào 200µl dung dịch potassium acetate 2.5 M, pH7.5, sau đó cho vào

ngăn đá tủ lạnh trong 1 giờ.

✓ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút tại 4oC, sau đó thu dịch nổi.

✓ Thêm một thể tích CHCl3-isoamylalcohol (24:1) tương đương với thể tích phần

dịch nổi thu được sau đó đem ly tâm như trên và thu dịch nổi bên trên màng

phân cắt.

✓ Có thể lặp lại bước trên để tăng độ tinh sạch.

✓ Thêm vào một thể tích isopropanol lạnh tương đương thể tích dịch nổi thu được

ở bước trên và để vào tủ lạnh -20oC trong 20 phút, sau đó ly tâm 13000

vòng/phút trong 15 phút 4oC, và thu hồi tủa.

✓ Rửa tủa DNA với 100µl etanol 70%và 200µl etanol 99% lắc nhẹ rồi đem ly tâm

13000 vòng /phút trong 5 phút, 4oC.

✓ Bỏ phần dịch và để khô tủa tự nhiên.

✓ Hòa tan tủa trong 35-50µl nước cất tinh khiết hoặc TE buffer bảo quản -20oC.

2.2.3.2. Điện di

24

Đồ án tốt nghiệp

Điện di là một bước quan trọng nhằm kiểm tra kết quả ly trích DNA dựa trên sự

di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường trong nền agarose.

Cách tiến hành

✓ Chuẩn bị bảng gel agarose 1% (pha 1mg agarose và định mức 100ml TAE X1

buffer, đun tan).

✓ Chuẩn bị bể điện di chứa đây đệm TAE X1 sao cho bảng gel chìm hẳn trong

đệm.

✓ Hút 5µl dịch DNA trộn vào 3µl Double dye.

✓ Nạp mẫu vào các giếng và mở nguồn chạy với hiệu điện thế 110V trong 45

phút.

✓ Cho bảng gel vào dung dịch Ethidium Bromide nhuộm trong 20 phút.

Quan sát bằng buồn uv.

2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR do Karl Mullis và công sự phát minh vào năm 1985, là một

cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học

phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép

của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông

dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát

hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo

dòng gen. [31]

Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch

DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là

trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm men. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả

năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA

polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương

25

Đồ án tốt nghiệp

pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện

diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong

phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA

nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể

thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose.

❖ Các thành phần của phản ứng PCR.

✓ DNA mẫu: chứa vùng DNA cần được khuếch đại.

✓ Mồi: là những đoạn oligonucleotide, bổ sung cho vùng DNA tại đầu 5’

và 3’ của vùng DNA cần được khuếch đại.

✓ DNA polymerase: (Taq DNA polymerase hay một polymerase khác mà

có khả năng hoạt động tốt ở nhiệt độ khoảng 70OC) dùng để tổng hợp

đoạn DNA của vùng cần khuếch đại.

✓ Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs): là vật liệu để polymerase tổng

hợp DNA.

✓ Dung dịch Buffer: cung cấp môi trường thích hợp cho hoạt tính cao và

bến vững của polymerase.

✓ Cation hóa trị 2 (Mg2+ hay Mn2+): thông thường Mg2+ được sử dụng,

nhưng Mn2+ có thể được dùng cho phản ứng PCR tức thời. Tuy nhiên,

nồng độ Mn2+ cao gia tăng tỉ lệ bắt cặp sai trong quá trình tổng hợp DNA.

✓ Cation hóa trị 1: K+.[34]

Một trong những DNA polymerase bền nhiệt đầu tiên được thu nhận từ Thermus

acquaticus và thường được gọi là Taq polymerase [35]. Taq polymerase hiện nay được

sử dụng rộng rãi trong các phản ứng PCR. Một trong những nhược điểm của Taq

polymerase là thỉnh thoảng chúng tổng hợp sai khi tổng hợp đoạn DNA dẫn đến những

đột biến trong đoạn DNA, bởi vì chúng thiếu hoạt tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Một

số polymerase khác như: Pwo và Pfu được thu nhận từ Archaea có cơ chế đọc và sửa

26

Đồ án tốt nghiệp

sai (cơ chế kiểm tra lại sự sai) mà có thể giảm phần lớn những đột biến xảy ra trong

quá trình tổng hợp DNA. Tuy nhiên những enzyme này có hoạt tính tổng hợp DNA

thấp hơn Taq. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu polymerase cung cấp cả hoạt tính

tổng hợp DNA cao và sự chính xác trong sự tổng hợp DNA.

❖ Chu trình phản ứng

Thông thường, PCR kéo dài 20- 35 chu kì, hầu hết các phản ứng PCR bao gồm 3

bước:

✓ Bước 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến

nhiệt độ 94-96oC, nhiệt độ này được giữ 1-9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA

mục tiêu và mồi bị biến tính [36] , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên

kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA

mạch đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94-980C khoảng

20-30 giây.

✓ Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với

mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu

được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với

mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào

và bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng

chảy của mồi và thông thường khoảng 50-64oC trong thời gian 20-40 giây.

✓ Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối

với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động

tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu

70-74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối

hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ

cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và

không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử

27

Đồ án tốt nghiệp

dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối

cùng kéo dài khoảng 5-15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu),

chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có

thể được kéo dài hoàn toàn.

Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại, điện di

trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR. Kích thước

của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những đoạn DNA có

kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR. Các DNA được

nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV (bước sóng 312nm).

Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ ngoại

nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase… Vì vậy,

cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả.

❖ Trong khóa luận này PCR dùng để khuếch đại đoạn gen ITS rDNA của nấm

men.

Thành phần phản ứng

Mater mix 6.5µl

ITS1-F 0.1µl

ITS4-R 0.1µl

DNA 1µl

17.3µl H2O

Tổng 25 µl

❖ Chu trình phản ứng PCR

Bước 1: Biến tính DNA, 94oC trong 5 phút

Bước 2: 35 chu kỳ

94oC trong 1 phút

55oC trong 1 phút

28

Đồ án tốt nghiệp

72oC trong 2 phút

Bước 3: Kết thúc, 72oC trong 10 phút

Bước 4: Bảo quản 4oC

❖ Kiểm tra kết quả PCR

Ta sử dụng phương pháp điện di để kiểm tra mẫu PCR, các bước thực hiện giống

bước 2.2.3.2 trên nhưng bổ sung thêm một giếng nạp mẫu thang đối chứng có kích

thước từ 500bp- 10000bp.

2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men

Giải trình tự gen là sự xác định rõ trình tự của các base trong DNA. Tuy nhiên

không phải tất cả những chuỗi DNA đều là gen (vùng mã hóa), điều này phụ thuộc vào

sinh vật lấy mẫu và nguồn DNA mẫu như: trình tự khởi đầu, các trình tự lặp lại, các

intron. Hai phương pháp cơ bản để giải trình tự DNA. [30]

✓ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp thủy phân hóa học

dùng đoạn DNA mạch đôi): sử dụng các loại hóa chất để cắt DNA tại các vị trí

xác định tạo ra một bộ các đoạn chỉ khác nhau bởi một nucleotide.

✓ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp này dùng đoạn DNA

mạch đơn): dùng enzyme để tổng hợp các đoạn DNA có một đầu mang một

nucleotide biến đổi.

Việc phân tích các đoạn này được tiến hành giống nhau trong cả hai phương pháp,

gồm điện di trên gel và đọc kết quả trên bản phóng xạ tự ghi. Ngày nay, phương pháp

giải trình tự Sanger-Coulson là phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn. Một vài sự

thay đổi đã được phát triển và nó đã được tự động hóa cho sự giải trình tự nhiều đoạn

gen có kích thước lớn.

❖ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp hóa học)

29

Đồ án tốt nghiệp

Phương pháp tự phân hóa học dùng mẫu DNA mạch đôi vì thế không yêu cầu tạo

dòng DNA trong Phage M13 để tạo ra mạch DNA đơn như là trong phương pháp giải

trình tự Sanger-Coulson. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử

DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.

Trước hết các phân tử DNA được đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sau đó chúng được

chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả

năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và sau đó cắt phân tử DNA ngay tại

nucleotide. Năm nhóm nucleotide bị tác động là G, A, C, G+A, T+C. Kết quả của các

xử lí hóa học là hình thành năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một

tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt cùng một loạinucleotide. Cuối

cùng năm phân đoạn trên được đem phân tích trên gel polyacrylamide. Vị trí các

oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện bằng

đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bản phóng xạ ghi.

❖ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp enzyme) [30]

Phương pháp này được dựa trên sự làm gián đoạn tổng hợp enzyme polymerase do

các nucleotide tương đồng của đoạn DNA bổ sung với mạch khuôn. Một hỗn hợp các

đoạn DNA có chiều dài khác nhau được tạo ra phụ thuộc vào nơi mà chúng bị cắt. Đặc

trưng của phương pháp này là ngoài bốn loại nucleotide trong đó nhóm 3’OH được

thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành

các nối phosphodiester và do đó làm ngưng quá trình tổng hợp.

Trình tự DNA cần xác định phải được tạo dòng trong một vector mạch đơn (phage

M13). DNA polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của DNA polymerase I, Taq

polymerase. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên

biệt trên phage M13, với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được

đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (32P). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn

30

Đồ án tốt nghiệp

phân đoạn riêng. Người ta cho vào lần lượt bốn phân đoạn một trong bốn loại

dideoxynucleotide với hàm lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng mới có

một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp oligonucleotide đó ngừng

lại. Tính xác xuất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các đoạn oligonucleotide có

chiều dài khác nhau tương ứng với tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên trình

tự DNA. Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được phân tích trên gel Polyacrylamide và

kết quả được đọc trên bản phóng xạ điện di.

❖ Giải trình tự những đoạn DNA lớn [30]

Cả hai phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert và Sanger-Coulson chỉ có thể giải

trình tự cho đoạn trình tự khoảng 400 base một lần. Tuy nhiên, hầu hết những đoạn gen

đều có kích thước lớn hơn. Để giải trình tự những đoạn DNA lớn này, nó được cắt

(dùng hai hay nhiều enzyme cắt giới hạn) thành những đoạn khác nhau và mỗi đoạn

được giải trình tự một cách riêng rẽ bao gồm những trình tự gối đầu lên nhau (mà

thường được xác định bởi máy tính). Trình tự đầy đủ của đoạn gen sau đó sẽ được xác

định.

❖ Các phương pháp cải biên từ phương phápSanger-Coulson [30]

Trong thực nghiệm, việc sử dụng các phương pháp chính thống nêu trên đòi hỏi

thao tác phức tạp vì phải tạo dòng lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào vector mạch

đơn (phage M13). Do đó để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạo dòng các vector là

các plasmid thế hệ thứ ba. Ở hai bên đoạn DNA được tạo dòng các plasmid riêng biệt,

mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết

người ta tách rời hai mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự

chuyên biệt nằm trên mạch đó. Phản ứng tổng hợp xảy ra theo nguyên tắc đã nêu ở

phần trên.

31

Đồ án tốt nghiệp

Vì điều kiện trang thiết bị không cho phép nên các sản phẩm PCR sẽ được gửi đi giải

trình tự DNA tại công ty Nam Khoa.

Địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn - Phường Tân Hưng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt

Nam.

Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm

chuyên dụng để định danh loài và xây dựng cây phân loài.

BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

32

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả hình thái học nấm men

3.1.1 Kết quả khuẩn lạc

Bảng 3.1 Hình ảnh kết quả hình thái khuẩn lạc

Giống chó Vị trí nhiễm Khuẩn lạc Mẫu

M9-1

M9-5

M11-1

M23-2

33

Đồ án tốt nghiệp

✓ Mẫu nấm men M9-1 và M9-5 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 9 thu được

tại phòng khám thú y ở quận Thủ Đức. Giống chó bị nhiễm là giống Rock được

nuôi trong nhà. Vị trí bị nhiễm là vùng đầu với triệu chứng lâm sàng là rụng

lông, da sần. Kết quả quan sát khuẩn lạc cho thấy mẫu nấm men M9-1 có màu

đỏ đặc trưng, khuẩn lạc tròn, bề mặt trơn bóng. Còn mẫu nấm men M9-5 cùng

được phân lập từ mẫu bệnh phẩm trên nhưng có khuẩn lạc màu trắng, hình tròn,

bề mặt nhăn nheo, có rìa sợi tơ xung quanh.

✓ Mẫu nấm men M11-1 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 11 thu nhận được

tại phòng khám ở quận Thủ Đức. Giống chó bị nhiễm là giống chó xù Bắc Hà

được nuôi thả tự do. Vị trí bị nhiễm là hai chân với các triệu chứng lâm sàng

nghiêm trọng là rụng lông, loét, ửng đỏ. Kết quả quan sát khuẩn lạc của mẫu

nấm men M11-1 có màu trắng kem, hình tròn, bề mặt trơn bóng.

✓ Mẫu nấm men M23-2 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 23 thu nhận được

tại phòng khám ở quận Bình Thạnh. Giống chó bị nhiễm là giống Pug được nuôi

trong nhà. Vị trí bị nhiễm là chân với các triệu chứng lâm sàng là rụng lông,

chai sần. Kết quả quan sát khuẩn lạc của mẫu nấm men M23-2 có màu trắng,

tròn, bề mặt trơn.

3.1.2. Kết quả hình ảnh tế bào sinh dưỡng

Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng

M9-1 M9-5 M11-1 M23-2

34

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả quan sát tế bào sinh dưỡng của nấm men bằng phương pháp nhuộm

sống cho kết quả như sau.

Mẫu nấm men M9-1 có tế bào hình tròn, mẫu M9-5 cũng có tế bào hình tròn,

mẫu M11-1 có tế bào hình elip mẫu M23-2 có tế bào hình elip thon dài.

3.1.3. Kết quả quan sát tế bào sinh sản

Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản của nấm men.

M9-1 M9-5 M11-1 M23-2

Dựa trên hình ảnh quan sát thì các mẫu nấm men M9-1, M9-5, M11-1, M23-2

đều có khả năng sinh sản bằng hình thức nảy chồi.

3.1.4. Kết quả quan sát khuẩn ty

Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty

M9-1 M9-5 M11-1 M23-2

35

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả quan sát sự hình thành khuẩn ty cho thấy cả 4 mẫu nấm men phân lập

được từ các mẫu bệnh phẩm gồm M9-1, M9-5, M11-1, và M23-2 điều có thể quan sát

rõ sự hình thành khuẩn ty.

3.2. Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm men

M23-2 M11-1 M9-5

M9-1

3.2.1. Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm men

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ly trích bộ gen của 4 mẫu nấm men

Kết quả ly trích bộ gen của nấm men cho thấy cả 4 mẫu nấm men điều cho kết

quả tốt để dùng cho phản ứng PCR.

3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men

Trước khi giải trình tự đoạn gen ITS rDNA của các mẫu nấm men phân lập

được thì sản phẩm ly trích bộ gen của các mẫu nấm men trên được sẽ được chạy phản

ứng PCR với cặp mồi ITS1-F và ITS4-R nhằm nhân bản đoạn gen ITS rDNA. Đoạn

gen ITS rDNA có kích thước từ 500-600 bp. Sau khi PCR thì sản phẩm thu được được

thể hiện trên 2 bảng gel ở hình 3.2 và 3.3

36

Đồ án tốt nghiệp

M9-5 M23-2 M9-1 M11-1 Thang

Mẫu M23-2 ở các thể tích khác nhau

Hình 3.2 Kết quả sản phẩm PCR Hình 3.3 Kết quả sản phẩm PCR M23-2

Hình 3.2 cho thấy các giếng M9-5, M9-1, M11-1 đều có các vạch nằm tương

đương ở vị trí khoảng 500-600 bp. Riêng mẫu M23-2 không có vạch xuất hiện và được

chạy PCR lại với các thể tích tham gia phản ứng khác nhau và cũng cho kết quả tốt để

giải trình tự. Sản phẩm PCR sẽ được gửi đi công ty Nam Khoa để giải trình tự.

3.3. Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men trên ngân hàng

gen NCBI và thiết lập cây phân loài

3.3.1. Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của 4 mẫu nấm men

TCTTGGTCAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAAAACGGATTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGA

ATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACT

CTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATAA

AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG

CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGA

GTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTT

ACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCG

CTGAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTTA

AGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA

Mẫu M9-1:

37

Đồ án tốt nghiệp

CTTGGTCAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACATTCGTTTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT

TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACGCAAGTCGAGTATTTT

TACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCG

CATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA

ACGCAGCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTC

CTAATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTTTGACATTAATGT

CTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGAC

TCTGGCCTAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGTCGGAGGAAA

Mẫu M9-5:

AAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGTATTCTTTT

GCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGC

CTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAACTTTTGAATTA

ATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT

ATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGC

CTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTG

CTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTT

GAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCA

GGTAGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA

Mẫu M11-1:

TCTTCATCCACCTCGTGCTCATGGTCATCTAGAGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACAAGG

GGAAGGATCATTACAGAAGTTTTTAGCCAGCCATTAACTGCGCGGCGAAAAACCCCGACTTCACTGAGTCGTAA

TGACCATTCCTCTTGCTTTGGTACGGCCTAGAGATAGGTTGGCCCACAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATT

TTTACAGAAATAAAATGAACAACTTTCTTCAAGATATCAACAACTGGATCCAAGGGTTCTGCTCCGAGAAGAAA

GCAGGGAAAACGCAAATAAAATTTGCCCCGCAGATTTTACGAATCATGGAAGATTCATCGTAGCCGGCGCCCT

CTGGTATTCCGGCGGGCATTCCCCTTTGAGCGTCATTTCCCCATCAAACCCCCGGGTTTGGTAATGAGGGATAGT

CTTAGTCGGACTAGTCGTTTGCCGAAAAGTATCGGCGACGTTAGTTTTGGATAGGAAGGTCGATCTGTAAATGT

ATTAGGTTTATCCAATTCGGGTATGGCATGACGTGGAAGTGATGGTAACGATGAGTTCGTCGATTCATCATCAT

TCACATTAAGACCTCAACTTGAGCATCAGATTCCTTTTTCACTTAATCTTAACATTACACTGAGGAAATGAATGA

ATAGTGCTCTTTTTGCTTCCATGAACTTGCACTTGAGCTGAAGTT

Mẫu M23-2:

38

Đồ án tốt nghiệp

3.3.2. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA trên ngân hàng gen NCBI và xây dựng

cây phân loài

Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA của các

chủng nấm men phân lập (M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) và các loài nấm men trong

ngân hàng gen

Dựa trên kết quả so sánh trình tự DNA với ngân hàng gen (các kết quả so sánh

được thể hiện trong phụ lục) và các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào ta được

các kết quả sau:

39

Đồ án tốt nghiệp

Mẫu M9-1 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodotorula mucilaginosa

JX174412.1 với mức độ gen tương đồng là 100%.

✓ Các nghiên cứu về nấm men Rhodotorula mucilaginosa

Nấm men Rhodotorula mucilaginosa (tên cũ Rhodotorula rubra).

❖ Một số đặc điểm khuẩn lạc, tế bào

Là một nấm men mà khuẩn lạc có màu đỏ, hồng hoặc cam. Màu sắc đặc biệt này là

do các sắc tố của nấm men tạo ra nhằm ngăn cản một vài bước sóng nhất định có khả

năng gây tổn hại cho tế bào. Hình thái dưới kính hiển vi là hình cầu nảy chồi. Kích

thước tế bào 2,5 µ-6,5 µ x 6,5 µ-14,0 µ. [26]

❖ Khả năng gây bệnh

Nhiễm trùng huyết, viêm nội nhãn, nhiễm trùng ống thông, viêm phúc mạc, viêm

màng não chủ yếu ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Sản xuất một số chất gây dị

ứng và có khả năng liên quan đến bệnh dị ứng. [26]

Dựa trên kết quả so sánh trình tự gen và so sánh đặc điểm hình thái thì mẫu M9-1

chính là loài Rhodotorula mucilaginosa. Và dựa trên các nghiên cứu lâm sàng về khả

năng gây bệnh của chủng trên thì Rhodotorula mucilaginosa là loài nấm men nguy

hiểm có thể gây nên các bệnh nghiêm trọng khi bị nhiễm sang người.

Mẫu M9-5 có mối quan hệ gần nhất với loài Trichosporon asahii AB369919.1

với mức độ gen tương đồng là 99%, hay Malassezia globosa JQ088275.1 với mức độ

gen tương đồng là 99%.

✓ Các nghiên cứu về nấm men Trichosporon asahii

Nấm men Trichosporon asahii (tên củ là Trichosporon beigelii).

❖ Một số đặc điểm về khuẩn lạc, tế bào

40

Đồ án tốt nghiệp

Nấm men Trichosporon asahii có khuẩn lạc màu trắng hơi vàng, bề mặt nhăn, có

rìa sợi nấm bao quanh. Tế bào hình bầu dục nảy chồi kích thước 3,5µm-7µm x

3,5µm14µm. [28]

❖ Khả năng gây bệnh

Nấm men Trichosporon beigelii là một phần nhỏ của hệ vi sinh vật da bình thường,

và được phân phối rộng rãi trong tự nhiên. T.beigelii thường xuyên tham gia trong một

loạt các nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch.

Nhiễm trùng phổ biến thường xuyên nhất liên quan đến bệnh bạch cầu, cấy ghép

nội tạng, đa u tủy, thiếu máu bất sản, ung thư và AIDS. Sự nhiễm trùng thường được

lan ra và phổ biến rộng rãi, với các tổn thương xảy ra trong gan, lá lách, phổi và đường

tiêu hóa. [29]

Mẫu M11-1 có mối quan hệ gần nhất với loài Meyerozyma guilliermondii

KC119207.1 với mức độ gen tương đồng là 99%. Và mẫu M23-2 có mối quan hệ gần

nhất với Pichia guilliermondii DQ249193.1 với mức tương đồng 79%.

✓ Các nghiên cứu về Meyerozyma guilliermondii

Nấm men Meyerozyma guilliermondii còn có tên gọi khác Candida guilliermondii

hay Pichia guilliermondii.

❖ Một số đặc điểm về khuẩn lạc, tế bào

Khuẩn lạc Pichia guilliermondii có màu trắng đến vàng kem, mịn, hình tròn, bề mặt

trơn nhẵn. Tế bào hình cầu, nảy chồi và có khả năng hình thành khuẩn ty. Kích thước

tế bào 2,0µm -4,0 µm x 3,0 µm -6,5 µm.

❖ Khả năng gây bệnh

Candida guilliermondii đã được phân lập từ nhiều ca nhiễm bệnh, chủ yếu là

da. Nhưng rất hiếm khi được phát hiện trên các ca viêm da toàn thân. Tuy nhiên, các

41

Đồ án tốt nghiệp

nghiên cứu phát hiện rằng Candida guilliermondii có khả năng kháng lại các thuốc

kháng nấm. [30]

Dựa trên các kết quả phân lập, quan sát hình thái, định danh và những thông tin về

các loài nấm men có mối quan hệ gần nhất với các mẫu nấm men M9-1, M9-5, M11-1,

M23-2 có thể đưa ra nhận định là cả 4 mẫu nấm men phân lập được từ các mẫu bệnh

phẩm bệnh ngoài da trên chó đều có mối quan hệ tương đồng và gần gũi với những loài

nấm men có khả năng gây bệnh trên da động vật và con người.

42

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Sau khi tiến hành phân lập và định danh vùng gen ITS của 4 mẫu nấm men

nhiễm bệnh da trên chó nuôi ở thành phố Hồ Chí Minh đã cho một số kết luận sau.

Mẫu M9-1 được phân lập từ giống chó Rock nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài

Rhodotorula mucilaginosa với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 100%.

Mẫu M9-5 được phân lập từ giống chó Rock nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài

Trichosporon asahii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 99%.

Mẫu M11-1 được phân lập từ giống chó xù Bắc Hà nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng

là loài Meyerozyma guilliermondii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là

99%.

Mẫu M23-2 được phân lập từ giống chó Pug nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài

Pichia guilliermondii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 79%.

Dựa trên các thông tin từ các nghiên cứu trên thế giới thì cả 4 chủng nấm men

trên điều có khả năng gây bệnh cho người và chó với mức độ khác nhau, đặc biệt là với

những người bị suy giảm miễn dịch. Trong đó, loài Meyerozyma guilliermondii tuy rất

hiếm khi được phát hiện trong các ca viêm da toàn thân nhưng lại có khả năng kháng

thuốc kháng nấm. Các chủng còn lại điều được phát hiện là tác nhân gây nên những

thương tổn nặng nề không chỉ trên da mà còn ở các cơ quan nội tạng khác.

4.2. Đề nghị

Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu các thông tin từ các nghiên cứu trên thế giới về các loài nấm men đã định danh được thì các nấm men gây bệnh trên chó có thể lây lan sang người. Đặc biệt là với những người suy giảm miễn dịch. Vì vậy đối với những người đang điều trị ung thư, bị nhiễm HIV hoặc những căn bệnh có liên quan đến hệ

43

Đồ án tốt nghiệp

miễn dịch làm suy giảm miễn dịch thì không nên tiếp xúc với chó hay các vật nuôi khác.

Do thời gian và điều kiện thực hiện bài luận văn có hạn nên có nhiều phần không

thể thực hiện nên chúng tôi có một số đề nghị:

✓ Khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng nấm men phân lập được.

✓ Khảo sát sự nhạy cảm của các chủng đối với các thuốc kháng nấm.

44

Đồ án tốt nghiệp

Tài liệu tham khảo

❖ Tài liệu tiếng Việt

[3] Lý Thị Liên Khai và Huỳnh Trần Phúc Hậu. Khảo sát sự lưu hành của một số nấm

gây bệnh trên da, lông chó tại tỉnh Sóc Trăng và thử nghiệm thuốc điều trị. Trường Đại

học Cần Thơ. Tạp chí Khoa học 2012:22c 47-56.

[6] Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương. Nấm Men 11/07/2006.

❖ Tài liệu tiếng Anh

[1] The world wide population of dogs is astonishingly large.Published on September

19, 2012 by Stanley Coren, Ph.D., F.R.S.C. in Canine Corner.

[2] Ernest E. Ward, Jr., DVM. 2014. What causes “seborrhea” (dog dandruff and cat

dandruff)?.

[4] Walker K, Skelton H, Smith K. (2002). "Cutaneous lesions showing giant yeast

forms of Blastomyces dermatitidis". Journal of Cutaneous Pathology (10): 616–618.

[5] Kurtzman CP, Fell JW. (2006). "Yeast Systematics and Phylogeny—Implications

of Molecular Identification Methods for Studies in Ecology". Biodiversity and

Ecophysiology of Yeasts, The Yeast Handbook.

[7] Suh SO, McHugh JV, Pollock DD, Blackwell M. (2005)."The beetle gut: a

hyperdiverse source of novel yeasts". Mycological Research 109 (3): 261–265.

[8] Barnett JA. (1975). "The entry of D-ribose into some yeasts of the

genus Pichia". Journal of General Microbiology 90 (1): 1–12.

[9] Arthur H, Watson K. (1976). "Thermal adaptation in yeast: growth temperatures,

membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic, and

thermophilic yeasts". Journal of Bacteriology 128: 56–68.

45

Đồ án tốt nghiệp

[10] Balasubramanian MK, Bi E, Glotzer M. (2004). "Comparative analysis of

cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells". Current Biology 14:

R806–818.

[11] Yeong FM. (2005). "Severing all ties between mother and daughter: cell

separation in budding yeast". Molecular Microbiology 55 (5): 1325–1331.

[12] Cogliati M. (2013). "Global molecular epidemiology ofCryptococcus

neoformans and Cryptococcus gattii: An atlas of the molecular

types". Scientifica 2013: 675213.

[13] O' Meara TR, Alspaugh JA. (2012). "The Cryptococcus neoformans capsule: A

sword and a shield". Clinical Microbiology Reviews 25 (3): 387–408.

[14] Ainsworth, G. C. 1986. History of medical and veterinary mycology, p.43–47.

Cambridge University Press, Cambridge.

[15] G. C. Ainsworth, History of medical and veterinary mycology, p. 1986. 43–47.

Cambridge University Press, Cambridge.

[16] M.G. Rinaldi,BiologyandpathogenicityofCandidaspecies,p.1–20. In G. P. Bodey

(ed.), Candidiasis: pathogenesis, diagnosis and treatment. Raven Press, New

York.1993.

[17] Rinaldi,M.G.1993.Biology and pathogeni city of Candida species, p.1–20.In G. P.

Bodey (ed.), Candidiasis: pathogenesis, diagnosis and treatment. Raven Press, New

York.

[18] Anaissie, E., and G. P. Bodey. 1989. Nosocomial fungal infections: old problems

and new challenges. Infect. Dis. Clin. North Am. 3:867–882.

46

Đồ án tốt nghiệp

[19] Anaissie, E., G. P. Bodey, H. Kantarjian, J. Ro, S. E. Vartivarian, R. Hopfer,

J.Hoy, and K.Rolston. 1989. New spectrum of fungal infections in patients with cancer.

Rev. Infect. Dis. 11:369–378.

[20] Samonis,G.,andD.Bafaloukos.1992.Fungal infections in cancer patients: an

escalating problem. In Vivo 6:183–194.

[21] Beck-Sague´, C. M., W. R. Jarvis, and the National Nosocomial Infections

Surveillance System. 1993. Secular trends in the epidemiology of nosoco-mial fungal

infections in the United States, 1980–1990. J. Infect. Dis. 167: 1247–1251.

[22] Borg von-Zepelin, M., H. Eiffert, M. Kann, and R. Ru¨chel. 1993. Changes in the

spectrum of fungal isolates: results from clinical specimens gathered in 1987/1988

compared with those in 1991/1992 in the University Hospital, Go¨ttingen, Germany.

Mycoses 36:247–253.

[23] Y Van de Peer, J Jansen, P De Rijk, and R De Wachter. 1996. Database on the

structure of small ribosomal subunit RNA. Nucleic Acids Res. Jan 1, 1997; 25(1): 111–

116.

[24] White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J., 1989 Amplification and direct sequencing of

fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis M, Gelfand DH, Sninsky JJ,

White TJ, eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego,

California: Academic Press Inc. p 315–322.

[25] Bruns TD, Szaro TM., 1992 Rate and mode differences between nuclear and mitochondrial small-subunit rRNA genes in mushrooms. Mol Biol Evol 9: 836 -855.

[26] David Ellis ,The University of Adelaide,“Rhodotorula rubra”, Mycology Online,

2014.

47

Đồ án tốt nghiệp

[27] McPartland JM, Goff JP. (1991). "Neotypification of Trichosporon beigelii:

morphological, pathological and taxonomic considerations".Mycotaxon 41: 173–178.

[28] David Ellis. 2005. Trichosporon beigelii. The University of Adelaide Australia.

[29] Cuenca-Estrella, M., L. Rodero, G. Garcia-Effron, and J. L. Rodriguez

Tudela. 2002. Antifungal susceptibilities of Candida spp. isolated from blood in Spain

and Argentina, 1996-1999. J. Antimicrob. Chemother.

[34] Pavlov, A. R.; Pavlova, N. V.; Kozyavkin, S. A.; Slesarev, A. I. (2004). "Recent

developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient

applications☆". Trends in Biotechnology 22 (5): 253–260.

[35] Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from

the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol 127 (3): 1550–1557.

[36] Sharkey, D. J.; Scalice, E. R.; Christy, K. G.; Atwood, S. M.; Daiss, J. L. (1994).

"Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the

Polymerase Chain Reaction". Bio/Technology 12 (5): 506–509.

❖ Tài liệu mạng

[30]http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaivisinhbangsinhhocphan

tu.htm

[31] http://www.vsmmb.com/data/upload_file/File/PCR%20book%201/PCR_basic.pdf

[32]http://danluat.thuvienphapluat.vn/nuoi-cho-phai-dang-ky-va-duoc-cap-so-ban-co-

tin-khong-82093.aspx

[33] http://www.virbac.vnn.vn/thong-tin-ki-thuat/890/benh-viem-da-co-mu

48

Đồ án tốt nghiệp

49

Đồ án tốt nghiệp

Phụ lục

A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu ....................................................... 1

B. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA của 4 mẫu nấm men với ngân hàng gen NCBI ........................................................................................................................................ 2

Kết quả so sánh M9-1 với Rhodotorula mucilaginosa KDLYL10 trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA ..................................................................................................... 2

Kết quả so sánh M9-5 với Trichosporon asahii trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. .......................................................................................................................... 3

Kết quả so sánh M11-1 với Meyerozyma guilliermondii KAML05 trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. .......................................................................................... 4

Kết quả so sánh M23-2 với Pichia guilliermondii WM 02.91trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. .......................................................................................................... 6

i

Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu

Máy li tâm lạnh MIKRO 220R Hộp đèn soi UV Uvintec

Nguồn EC105 và Bể điện di IBI QS- 710 Máy PCR sprint thermo Cycler

Kính hiển vi Nikon eclipse 80i BioRad UV CCD Camera

1

Đồ án tốt nghiệp

B. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA của 4 mẫu nấm men với ngân hàng gen NCBI

Kết quả so sánh M9-1 với Rhodotorula mucilaginosa KDLYL10 trên trình tự

đoạn gen ITS 5.8S rDNA.

Score Expect Identities Gaps Strand

Query 1 CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGT 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5 CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGT 64

Query 61 CCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGC 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 65 CCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGC 124

Query 121 GAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATA 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 125 GAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATA 184

Query 181 AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 185 AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT 244

Query 241 AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCC 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 245 AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCC 304

Query 301 ATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCT 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 305 ATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCT 364

Query 361 TAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTC 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 365 TAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTC 424

1114 bits(603) 0.0 603/603(100%) 0/603(0%) Plus/Plus

2

Query 421 GTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCT 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 425 GTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCT 484

Query 481 GAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAAT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 485 GAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAAT 544

Query 541 GTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 545 GTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT 604

Query 601 CAA 603

|||

Sbjct 605 CAA 607

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả so sánh M9-5 với Trichosporon asahii trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA.

1005 bits(544)

0.0

560/567(99%)

4/567(0%)

Plus/Plus

Query 15 GGAAGTAAAAGTCGTAACATTCGTTTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT 74

||||||||||||||||||| |||| |||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1 GGAAGTAAAAGTCGTAACA-AGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT 59

Query 75 TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACG 134

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 60 TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACG 119

Query 135 CAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAA 194

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 120 CAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAA 179

Query 195 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAA 254

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 180 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAA 239

Score Expect Identities Gaps Strand

3

Query 255 GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCT 314

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 240 GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCT 299

Query 315 GGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTA 374

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 300 GGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTA 359

Query 375 ATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTT 434

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 360 ATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTT 419

Query 435 TGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTA 494

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 420 TGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTA 479

Query 495 ATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCT-AAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA 553

||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||

Sbjct 480 ATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCTGAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA 539

Query 554 ACTTAAGCATATCAA-AAGTCGGAGGA 579

||||||||||||||| ||| |||||||

Sbjct 540 ACTTAAGCATATCAATAAG-CGGAGGA 565

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả so sánh M11-1 với Meyerozyma guilliermondii KAML05 trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA.

Score Expect Identities Gaps Strand

Query 4 TTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAC 63

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 47 TTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAC 106

Query 64 AGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG 123

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

1149 bits(622) 0.0 633/638(99%) 2/638(0%) Plus/Plus

4

Sbjct 107 AGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG 166

Query 124 ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAAC 183

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 167 ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAAC 226

Query 184 ACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAACTTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAA 243

||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 227 ACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAA 286

Query 244 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAAT 303

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 287 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAAT 346

Query 304 TGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGA 363

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 347 TGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGA 406

Query 364 GGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATA 423

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 407 GGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATA 466

Query 424 CTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGC 483

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 467 CTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGC 526

Query 484 TGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTC 543

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 527 TGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTC 586

Query 544 TGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTA-GAA 602

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||

Sbjct 587 TGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAA 646

Query 603 TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA 640

||||||||||||||||||||||||| | || |||||||

Sbjct 647 TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC-GGAGGAA 683

Đồ án tốt nghiệp

5

Đồ án tốt nghiệp

Kết quả so sánh M23-2 với Pichia guilliermondii WM 02.91trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA.

342 bits(185)

3e-90

416/527(79%)

17/527(3%)

Plus/Plus

Query 24 GTCATCTAGAGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTT-CCGTAGGTGAACAAGGGGAAGGAT 82

||||| ||||| ||||||||||||||||||||||| |||||||||||| | ||||||||

Sbjct 15 GTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGAT 74

Query 83 CATTACAGAAGTTTTTAGCCAGCCATTAACTGCGCGGCGAAAAACCCCGACTTCACTGAG 142

|||||||| | | ||| |||||| ||||||||||||||||||||| || ||| | |

Sbjct 75 CATTACAGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACC-TTAC-ACACAGTG 132

Query 143 TCGTAATGA-CCATTCCTCTTGCTTTGGTACGGCCTAGAGATAGGTTGGCCCACAGGTTT 201

|| | ||| || ||||||||||||| |||||||||||||||||| ||| ||||||

Sbjct 133 TCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTT 192

Query 202 AACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGAAA-TAAAATGAACAACTT-TCTTCAAGA-T 258

||||||||||||||||||||||||||||| | | |||| || | ||||||| | |

Sbjct 193 AACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACT 252

Query 259 ATCAACAACTGGATCCAAGGGTTCT-GCTCCGA-GAAGAAAGCAGGGAAAACGCAAATAA 316

|||||||| ||||| |||||| || ||| |||||| |||| |||| || | |||

Sbjct 253 TTCAACAAC-GGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-GCGA-TAA 309

Query 317 --AATTTGCCCCGCAGATTTTAC-GAATCATGGAAGATTC-ATCGTAGCCGGCGCCCTCT 372

||| || ||||||||| ||||||| ||| || | || | |||||||||

Sbjct 310 GTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCT 369

Query 373 GGTATTCCGGCGGGCATTCCCCTTTGAGCGTCATTTCCCCATCAAACCCCCGGGTTTGGT 432

|||||||| | |||||| || ||||||||||||||| | |||||||||||||||||||

Sbjct 370 GGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGT 429

Query 433 AATGAGGGATAGTCTTAGTCGGACTAGTCGTTTGCC-GAAAAGTATCGGCGACGTTAGTT 491

| |||| |||| ||||||||||||||| ||||||| ||||||||| ||| | ||||

Score Expect Identities Gaps Strand

6

Sbjct 430 ATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTA 489

Query 492 TTGGATAGGAAGGTCGATCTGTAAATGTATTAGGTTTATCCAATTCG 538

| ||||| ||||| || | |||||||||||||||||||| |||

Sbjct 490 CTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCG 536

Đồ án tốt nghiệp

7