Phương pháp điện di DNA
Nguyên tắc điện di
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân để phân tích các
đại phân tử tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta
thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA
nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR.
Axit nucleic nói chung là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch
chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác
dụng của điện trường. Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những
phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy
được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau. Sau khi
phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phương
pháp làm hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium
bromid. Chất này sẽ gắn xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dưới
tia tử ngoại. Như vậy dễ dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên
gel và có thể phân biệt được phân tử DNA trên cùng một bảng gel. Đối với
gel polyacrylamid, các phân tử thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ
và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Trong
điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn, thường là DNA λ. Khi điện di
cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh với DNA mẫu với
DNA chuẩn để biết trọng lưọng phân tử, hoặc trích li được DNA khác nhau.
Cách tiến hành
Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệ
thống soi chụp ảnh. Các bước được tiến hành như sau:
- Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml
đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE
(Tris-acetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng,
khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò
viba (làm nóng chảy gel và không tạo
bọt).
- Làm nguội gel xuống 50÷55°C, thêm
1µl ethidium bromid, đổ gel vào khuôn
gel và lắp lược.
- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng
điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào
khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel
khoảng 2÷5 mm.
- Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các
giếng, đậy nắp và cắm điện cực.
- Điện di trong khoảng 30 phút với điện
thế 100÷120V.
- Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để
xem kết quả.
Mô hình máy điện di
Lưu ý: Tùy thuộc vào kích thước của DNA mẫu mà người ta chọn loại gel
(agarose, polyacrlamid), nồng độ gel, loại đệm (TBE hoặc TAE). Đệm TAE
cho độ phân giải cao các phân đoạn lớn hơn 4 kb, trong khi đệm TBE có
phân giải cao từ 0,1 đến 3kb. Ngoài ra, độ phân giải các phân đoạn DNA còn
phụ thuộc vào phương pháp điện di, tối ưu điện thế, tối ưu lượng DNA nạp
và đệm nạp.
Thuốc nhuộm ethidium bromid (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang mà
có thể nhận biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép. Mặc dù vậy, ái lực liên
kết với DNA sợi đơn tương đối thấp hơn so với DNA sợi kép. DNA nhuộm
EtBr được nhận biết bằng tia cực tím. Tại bước sóng 254nm, ánh sáng UV
được hấp thụ bởi DNA và chuyển sang thuốc nhuộm. Tại bước sóng 302nm
và 366nm, ánh sáng UV được hấp thụ bởi chính thuốc nhuộm. Trong cả hai
trường hợp, năng lượng được phát xạ ứng với tia tại bước sóng 590nm trong
vùng vàng đỏ của quang phổ thấy được. EtBr là chất gây đột biến mạnh, cần
phải mang găng tay khi thao tác với dung dịch thuốc nhuộm này và các gel
nhuộm. Để tạo độ phân giải cao rõ nét, các vạch và nền nhạt nên nhuộm gel
với EtBr ngay sau khi điện di.
Ưu, nhược điểm và ứng dụng của phương pháp PCR
Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR
Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được
một trình tự đáng quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực
hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện
đồng thời). Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu
vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).
Nhược điểm: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để
có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại.
Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm
lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng E-Taq-polymerase khoảng
104 (sai sót cho một lần sao chép).
Phạm vi sử dụng
- Sản xuất mẫu dò đánh dấu phóng xạ (dầu dò) với khối lượng lớn, phù hợp
với phương pháp lai giữa DNA và DNA, RNA và DNA.
- Khuếch đại số lượng RNA, do lượng mRNA nhỏ dưới mức cho phép nên
người ta dùng phương pháp RT-PCR để tăng nồng độ mRNA đến một giới
hạn phát hiện bằng cách phiên mã ngược: mRNA → cDNA. Từ cDNA, ta
đánh giá được mRNA.