NG NG
ƯƠ ƯƠ
TR TR
B CÔNG TH Ộ B CÔNG TH Ộ Ạ Ọ Ạ Ọ Ệ Ệ
NG Đ I H C CÔNG NGHI P TP.HCM NG Đ I H C CÔNG NGHI P TP.HCM Ọ Ọ
Ệ Ệ Ự Ự
Ẩ Ẩ
ƯỜ ƯỜ VI N CÔNG NGH SINH H C & TH C PH M Ệ VI N CÔNG NGH SINH H C & TH C PH M Ệ
Ề
ỀĐ TÀI BÁO CÁO Đ TÀI BÁO CÁO ::
L P: DHSH07LT
Ớ
SVTH: Nhóm 15
GVHD: Th.s Tr n H ng B o Quyên
ồ
ả
ầ
1. Nguy n Thanh Di u ệ ễ
2. Tr n Th Tha La ầ ị
3. Nguy n Th C m N ị ẩ ễ ngươ
ng 4. Nguy n Th Ph ễ ị ươ
5. D ngươ Chí Sơn
6. Đinh Th Y n Thi ị ế
ăn Thi 7. Tr n Vầ tế
8. Tr n Trung Th nh ầ ị
N I DUNG
Ộ
1. Khái ni m gi i trình t gen và ý nghĩa c a GTTG ệ ả ự ủ
2. Ph ng pháp gi i trình t gen: ươ ả ự
2.1 Ph ng pháp Maxam – Gilbert ươ
2.2 Ph ng pháp Sanger ươ
2.3 Ph ng pháp gi i trình t gen t đ ng ươ ả ự ự ộ
3. So sánh ph ng pháp Maxam–Gilbert và Sanger ươ
4. ng d ng Ứ ụ
1.1.Khái Ni mệ :
ự
gen (DNA sequencing) là ng pháp xác đ nh v trí s p x p ị
ị
Gi i trình t ả ph ươ các nucleotid trong phân t
ế ắ DNA.
ử
1.2 Ý nghĩa
Giúp xác đ nh v tr
ị
ủ
í c a gen trên ị NST, cho phép k t lu n v b n ch t ấ ế ề ả ậ ó ý nghĩa trong vi c tệ ìm c a gen. C ủ úc c a ủ hi u nh ng ch c năng c u tr ứ ể
ữ
ấ
gen cũng nh cư ác dòng gen.
2.1 Ph 2.1 Ph ng pháp Maxam - Gibert ng pháp Maxam - Gibert ươ ươ
i đ c tr ng phân t DNA c n ử ầ
ư ng pháp hóa h c. ươ ọ
c th c hi n
5’OH
3’
Nguyên lý: Th y gi ủ ả ặ xác đ nh trình t b ng ph ự ằ ệ ự
5’OH
3’
ị Các b ướ B c 1: ướ
P32, ATP, enzyme
P32
ạ ở
DNA đánh d u ấ P32
90oC
- Đánh d u phóng x P32 đ u 5’ c a m ch khuôn. ạ ấ ủ ầ
ệ
- Bi n tính b ng nhi ế ằ t đ . ệ ộ
Đi n di phân tách các m ch đ n ạ
ơ
ộ ạ ệ
P32
ạ
ạ
Tách l y m ch ấ đ nơ
ạ
- Đi n di tách l y m t m ch ấ DNA làm m ch khuôn, dùng m ch khuôn này cho các x ử lý ti p theo. ế
2.1 Ph 2.1 Ph ng pháp Maxam - Gibert ng pháp Maxam - Gibert ươ ươ
B c 2 ướ : Th c hi n các ph n ng hóa h c đ c hi u ả ứ ự ệ ệ ặ ọ
ể ử ụ ệ ả ố
ể ự ạ ệ ặ ạ
Hóa ch t x lý
ng 1Ố
ấ ử
V trí c t ắ
ị
1
Dimethyl sunrfat pH 8
G
2
Piperidine formate pH2
A và G
3
Hydrazine
C và T
4
Hydrazine + Nacl 1,5M
C
Có th s d ng 4 ng nghi m đ th c hi n các ph n ệ ng hóa h c đ c hi u khác nhau, t o các đo n DNA ứ c t dài ng n khác nhau. ắ ọ ắ
2.1 Ph 2.1 Ph ng pháp Maxam - Gibert ng pháp Maxam - Gibert ươ ươ
2.1 Ph 2.1 Ph ng pháp Maxam - Gibert ng pháp Maxam - Gibert ươ ươ
ẩ
ấ
ả ệ
ử ạ
ệ
ị
ướ : L y s n ph m x lý trong B c 3 m i ng nghi m đem ch y đi n di, ỗ ố hi n hình phóng x và xác đ nh ạ ệ k t qu . ế
ả
ử
ng ở ố i G.
Ví d :ụ X lý Dimethylsunfat ph n ng 1, ph n ng c t t ắ ạ
ả ứ
ả ứ
32P ATCG
2.1 Ph 2.1 Ph ng pháp Maxam - Gibert ng pháp Maxam - Gibert ươ ươ
32P ATCGCCAG
gen ban ự
32P ATCGCCAGTTG
32P ATCGCCAGTTGTACCAG
32P ATC
32P ATCGCCA
Trình t đ uầ
ằ
32P ATCGCCAGTT
32P ATCGCCAGTTGTACCA
Sau khi x lý b ng ử DMSO4
t ượ ở ấ ả
ả
ạ
đó xác đ nh
ừ
ị
ng pháp Maxam - Gibert 2.1 Ph ươ ng pháp Maxam - Gibert 2.1 Ph ươ : T p h p k t qu thu đ B c 4 t c các c ợ ướ ế ậ ng nghi m, thu đ c các đo n polynucleotid dài ượ ệ ố ng n h n kém nhau 1 nucleotid, t đ
c a DNA m ch khuôn.
ơ c trình t
ắ ượ
ự ủ
ạ
2.2 Ph 2.2 Ph ng pháp Sanger ng pháp Sanger ươ ươ
ự ổ
ạ
ợ c n xác đ nh nh ho t đ ng
ự ầ
ị
ờ ớ ệ
Nguyên lý: D a vào s t ng h p m ch b ổ ự sung cho trình t ạ ộ c a enzyme DNA Polymerase. V i vi c s ử ủ d ng thêm các dideoxynucleotid (ddNTP) và ụ các deoxynucleotid thông th
ng.
ườ
ươ ươ
ệ ổ
ẽ ị ừ
i ạ
ạ
ợ
ng pháp Sanger 2.2 Ph ng pháp Sanger 2.2 Ph Vi c t ng h p m ch b sung s b d ng l ổ do ddNTP không có kh năng hình thành liên ả k t phosphodieste . ế
2.2 Ph 2.2 Ph ng pháp Sanger ng pháp Sanger ươ ươ
ậ ệ ệ ố
V t li u: ậ ệ - Primer( 20 nucleotides) - DNA polymerase - DNA template - dNTP và ddNTP - V t li u đánh d u ấ - H th ng đi n di Các b
c ti n hành
ệ ướ
ế
: Bi n tính DNA khuôn
B c 1 ướ
ế
ể
ạ
ể ế
Đi n di trên gel polyacrylamid đ thu các m ch đ n DNA, dùng DNA này đ ti n hành các b
c x lý ti p theo. ế
ệ ơ ướ
ử
2.1 Ph 2.1 Ph ng pháp Sanger ng pháp Sanger ươ ươ
: Chu n b cho ph n ng t ng h p
ả ứ
ẩ
ổ
ợ
ị
B c 2 ướ DNA
t vào m i ng : m ch khuôn, m i có ạ
ầ ồ
ệ
ứ
L y 4 ng Eppendorf, cho các thành ph n ố ấ c n thi ế ầ ỗ ố đánh d u phóng x P32, enzyme DNA ạ ấ polymerase, dNTP, dung d ch đ m thích ị ng ng m t h p và thêm vào m i ng t ộ ươ ỗ ố lo i ddNTP nh t đ nh.
ấ ị
ợ ạ
2.2 Ph 2.2 Ph ng pháp Sanger ng pháp Sanger ươ ươ
2.2 Ph 2.2 Ph ng pháp Sanger ng pháp Sanger ươ ươ
: Th c hi n các ph n ng t ng h p
ả ứ
ự
ệ
ợ
ổ
B c 3 ướ DNA
ả
ượ ổ
ợ
c a m ch khuôn.
: Đi n di k t qu , so sánh k t qu B c 4 ế ả ế ướ ệ các chu i m ch đ n DNA đ c t ng h p ơ ạ ỗ đ xác đ nh trình t ạ ự ủ ị
ể
2.2 Ph 2.2 Ph ng pháp Sanger ng pháp Sanger ươ ươ
ddTTP
2.3 Ph 2.3 Ph ng pháp gi ng pháp gi i trình t i trình t gen t gen t đ ng đ ng ươ ươ ả ả ự ự ự ộ ự ộ
c thi ắ
Nguyên lý: Hoàn toàn đ ượ s d ng ddNTP do Sanger và c ng s phát minh. ử ụ t k trên nguyên t c ế ế ộ ự
M i và dNTP đ c đánh d u huỳnh quang. ồ ượ ấ
c đánh d u huỳnh quang khác ỗ ạ ượ ấ
M i lo i dNTP đ nhau, bi u th các màu s c khác nhau. ể ắ ị
ự ợ ơ
ạ ử ụ ề ả ầ
Máy th c hi n t ng h p các m ch đ n DNA m i ệ ổ ớ trên c 2 m ch khuôn DNA, s d ng ph n m m trên ạ máy tính đ x lý k t qu . ả ể ử ế
2.3 Ph 2.3 Ph ng pháp gi ng pháp gi i trình t i trình t gen t gen t đ ng đ ng ươ ươ ả ả ự ự ự ộ ự ộ
: Chu n b (DNA khuôn, các dNTP và
ẩ
ị
ắ
B c 1 ướ ddNTP có g n màu quỳnh quang, enzyme, m i…) ồ
: Nhân DNA b ng PCR
B c 2 ướ
ằ
ẩ
ả
ạ
i trình t
B c 3 ướ trình t ự
: N p s n ph m PCR vào máy gi i ả gen và ch y máy gi gen. ạ
ự
ả
: Phân tích k t qu t
ế
ả ừ
các d ữ
B c 4 ướ li u do máy tính cung c p ệ
ấ
ng pháp gi ng pháp gi ả ả ự ự ự ộ ự ộ
2.3 Ph 2.3 Ph ầ ươ ươ ọ đ ng đ ng ấ
gen t gen t ạ ụ ế ấ
c ượ
i trình t i trình t Đ u đ c laser trong máy kích ho t các ch t phát quỳnh quang khi n chúng h p th và phát ra các màu, m i màu ng v i m t nucleotide và đ ộ ớ hi n th b ng m t đ nh. ứ ộ ỉ ỗ ị ằ ể
2.3 Ph 2.3 Ph ng pháp gi ng pháp gi i trình t i trình t gen t gen t đ ng đ ng ươ ươ ả ả ự ự ự ộ ự ộ
Đ c k t qu ế ọ ả
2.3 Ph 2.3 Ph ng pháp gi ng pháp gi i trình t i trình t gen t gen t đ ng đ ng ươ ươ ả ả ự ự ự ộ ự ộ
ABI Automated Sequencers (contd.) ABI Automated Sequencers (contd.)
ABI 310
ABI 3700
Máy s c ký kh i ph
ắ
ố
ổ
Capillary
3. So sánh ph 3. So sánh ph ng pháp Maxam – Gibert và Sanger ng pháp Maxam – Gibert và Sanger ươ ươ
ợ
c phân tách b ng
ề ượ
ự
ằ
Gi ng nhau
ố
này đ ệ
ng pháp đi n di trên gel polyacrylamid ạ ự
c đ c trên b n phóng x t ả
ươ ế
ả ượ
ọ
Đ c đi m ể ặ
ắ
ọ
ể
Khác nhau
+ Dùng các ch t ấ hóa h c đ làm c t ể các base
ổ
+ Dùng enzyme và các ddNTP đ làm d ng quá trình t ng h p ADN
ừ ợ
Sanger Maxam – Gibert Sanger Maxam – Gibert + Hình thành m t t p h p nhi u ề ộ ậ oligonucleotide có chi u dài khác nhau + Các trình t ph + K t qu đ ghi
3. So sánh ph 3. So sánh ph ng pháp Maxam – Gibert và Sanger ng pháp Maxam – Gibert và Sanger ươ ươ
ng pháp d ti n hành
c ti n hành đ n gi n
ễ ế
ả
ế
ơ
u đi m: Ư ể + Ph ươ + Chi phí th pấ
i ả
đ ng
u đi m: Ư ể + Các b ướ + Có đ chính xác cao ộ + Là c s c a các máy gi ơ ở ủ gen t trình t ự
ự ộ
ượ
ượ
c m t đo n trình ạ
ộ
c đi m: ể ẩ ự
c đi m: Nh ể + Ch đ c đ ỉ ọ ng n t ắ ự
Nh ượ + Đ chu n xác không cao ộ + Ph i th c hi n nhi u l n và ả ệ ề ầ lo i b các sai sót đ ch n các ạ ỏ ọ ể k t qu g n đúng nh t ấ ế
ả ầ
Maxam – Gibert Maxam – Gibert Sanger Sanger
4. ng d ng 4. ng d ng Ứ Ứ ụ ụ
ộ
ạ
ấ
ớ
ể ủ
ượ
ạ
So sánh m t đo n ADN b t kỳ v i các d ữ li u trong ngân hàng gen có th chúng ta ệ xác đ nh đ c đo n ADN đó c a sinh v t ậ ị nào.
ế
ự ắ
c trình t ạ
ể ng ng trên m ch
ứ
ạ
t đ s p x p các nucleotit Bi ế ượ c a m t đo n ADN có th suy ra trình t ự ộ ủ các axit amin t ươ polypeptide n u đo n ADN đó mã hóa ạ ế
4. ng d ng 4. ng d ng Ứ Ứ ụ ụ
