73
Rickettsia Real-time PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Phát hiện DNA c a Rickettsia Real-time trong mẫu bệnh phẩm máu c a
người.
2. Nguyên lý
Phương pháp phát hiện dựa trên nguyên lý Real-time qPCR khuếch đại gen đ c
hiệu c a các loài vi khuẩn Rickettsia: Orientia tsutsugamushi và Rickettsia
typhi.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ
ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại
học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- Máy real-time PCR: Máy Real-time PCR có ít nhất 04 kênh màu và hệ
thống máy vi tính (VD).
- Máy tách chiết acid nucleic.
- Bộ lưu điện.
- Máy nhiệt.
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút
- T lạnh 20C -80C
- T âm sâu (-200 C) ho c (-700C) (nếu có)
- Máy vortex
- T an toàn sinh học
- Micropipettes các thể tích từ 0,5 l - 1000 l.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
1
Khay đựng bệnh phẩm
Cái
2
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Cái
74
3
Tube đựng bệnh phẩm
Cái
4
Cryotube (lưu mẫu)
Cái
6
Master Mix Rickettsia
Test
7
Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách chiết
Test
8
Hóa chất chạy mẫu chứng và kiểm tra chất lượng
Test
9
Pipet nhựa
Cái
10
Đầu Pipét có lọc 1000 ul
Cái
11
Giấy thấm không bụi
Cuộn
12
Giấy xét nghiệm
Tờ
13
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Quyển
14
Bút viết kính
Cái
15
Bút bi
Cái
16
Mũ giấy
Cái
17
Khẩu trang
Cái
18
Găng không có bột tal
Đôi
19
Găng tay xử lý dụng cụ
Đôi
20
Quần áo
Bộ
21
Dung dịch xà phòng rửa tay
ml
22
Cồn sát trùng tay nhanh
ml
23
Dung dịch khử trùng
ml
24
Khăn lau tay
Cái
25
Ngoại kiểm (EQAS)* (nếu thực hiện)
* Ghi chú:
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình
ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với
số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Huyết tương tách từ máu có chất chống đông EDTA.
4. Phiếu xét nghiệm
Đi n đầy đ thông tin theo mẫu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên (VD
sử dụng bộ sinh phẩm Rickettsia rPCR Mix ho c sinh phẩm tương đương).
75
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
2. Tiến hành kỹ thuật
Phát hiện vi khuẩn Rickettsia bằng phản ứng Real-time PCR sử dụng Taqman
probe.
2.1. Thu nhận và xử lý mẫu
Phải tách huyết tương trước khi tách chiết DNA.
2.2. Tách chiết DNA
2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Điều kiện của phản ứng
- Kết quả chấp nhận được nếu cả 3 chứng đạt các đi u kiện sau:
+ Chứng âm: không phát hiện.
+ Chứng dương: nằm trong khoảng cho phép c a nhà sản xuất (đ c hiệu với
từng lô thuốc thử).
+ Chứng nội: với chứng âm và mẫu có nồng độ thấp (10-1000copies) phải
có tín hiệu lên ứng với Ct khoảng 27 đến 30.
- Ngược lại kết quả không được chấp nhận nếu không đáp ứng các đi u kiện
trên và phải thực hiện lại xét nghiệm:
2. Phân tích mẫu
1) Mẫu có tín hiệu FAM, ROX giá trị Ct ≤ 42 là mẫu dương tính
với Orientia tsutsugamushi.
2) Mẫu có tín hiệu HEX, Cy5, ROX giá trị Ct ≤ 42 là mẫu dương tính với
Rickettsia typhi.
3) Mẫu có tín hiệu Cy5, ROX tín hiệu dương tính với các loài Rickettsia
còn lại, không phải 2 loài Orientia tsutsugamushi và Rickettsia typhi.
4) Mẫu có tín hiệu FAM, HEX, Cy5 giá trị Ct > 42 là mẫu nghi ngờ
nên cần tiến hành kiểm tra lại bằng phương pháp chạy điện di sản phẩm
PCR, ho c tách chiết lại DNA khuôn từ mẫu bệnh phẩm và chạy lại Real-time
PCR để khẳng định kết quả.
5) Mẫu không có tín hiệu FAM, HEX, Cy5 và có tín hiệu ROX là mẫu âm
tính
6) Mẫu không có tín hiệu FAM, HEX, Cy5, ROX là mẫu bị ức chế, cần tách
chiết DNA (có bổ sung nội chuẩn vào mẫu khi tách chiết) và chạy lại Real-time
PCR.
76
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu
dương, mẫu âm thật sự.
2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm
từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.
Nếu vẫn g p sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.