Sự hiện diện và biểu hiện của gen Ds-Red ở Protocorm like body chuyển gen của phong lan Dendrobium cv. Burana White

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 212-218<br /> <br /> SỰ HIỆN DIỆN VÀ BIỂU HIỆN CỦA GEN Ds-Red Ở PROTOCORM-LIKE BODY<br /> CHUYỂN GEN CỦA PHONG LAN Dendrobium CV. BURANA WHITE<br /> Nguyễn Hữu Hổ1*, Huỳnh Nguyên Phát2, Lê Tấn Đức1,<br /> Trần Thị Ngọc Hà1, Nguyễn Hữu Tâm1,3<br /> (1)<br /> <br /> Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)nguyenhuuho@itb.ac.vn<br /> (2)<br /> Đại học Khoa học tự nhiên, tp Hồ Chí Minh<br /> (3)<br /> Đại học Nebraska-Lincohn, Nebraska, Hoa Kỳ<br /> <br /> TÓM TẮT: Bốn dòng protocorm-like body (PLB) phong lan Dendrobium cv. Burana White mang gen<br /> mục tiêu Ds-Red tạo biểu hiện phát sáng đỏ đã được chọn tạo qua biến nạp bằng phương pháp bắn gen.<br /> PLB (để tối khoảng 3 tháng, có màu trắng), qua cắt nhỏ thành các cụm có kích thước 3-5 mm, được sử<br /> dụng như mô đích để bắn. Vi hạt vàng (0,9 m), bao bởi hỗn hợp plasmid (tỷ số Mol 3:1, theo thứ tự) giữa<br /> plasmid pITB-DsRED mang gen Ds-Red tạo phát sáng đỏ với plasmid pITB-BAR mang gen bar tạo tính<br /> kháng chất diệt cỏ phosphinothricin (PPT), được bắn vào PLB bằng hệ thống BIO-RAD PDS-1000/He.<br /> Sau bắn gen 2 ngày, PLB được cấy chuyển qua nhiều chu kỳ chọn lọc trên môi trường Knudson C (với 1<br /> mg/l BA) có chứa 1-3 mg/l PPT. Sự biểu hiện tạm thời của gen DsRed ở PLB (2 ngày sau bắn gen) đã<br /> được kiểm tra với kết quả dương tính. Sự hiện diện của các gen DsRed, bar đã được kiểm tra bằng kỹ<br /> thuật PCR với kết quả có sự hiện diện của các băng DNA tương ứng 350 bp và 500 bp. Biểu hiện phát<br /> sáng đỏ bền vững đã được kiểm tra, ghi nhận bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên/ánh sáng trắng và<br /> ghi nhận dưới ánh sáng vàng-xanh lục (yellow-green) (bước sóng khoảng 560 nm) qua quan sát PLB dưới<br /> kính hiển vi soi nổi gắn kính lọc đỏ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy protein DsRed là một chỉ thị thích<br /> hợp trong nghiên cứu biến nạp di truyền ở lan Dendrobium và hệ thống này có thể được sử dụng trong<br /> nghiên cứu cơ bản đặc biệt trong nghiên cứu thay đổi màu sắc hoa do sản phẩm của gen chuyển. Đây là<br /> kết quả nghiên cứu đầu tiên về biến nạp gen DsRed được thực hiện thành công trên lan Dendrobium đến<br /> giai đoạn tạo được PLB chuyển gen có khả năng phát ánh sáng đỏ rất mạnh.<br /> Từ khóa: Bắn gen, chuyển gen, Dendrobium, gen DsRed, phosphinothricin (PPT).<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Đến nay, các gen gfp, yfp, rfp thuộc nhóm<br /> gen mã hóa protein phát sáng (fluorencent<br /> protein gene) xanh lục, vàng, đỏ, theo thứ tự, từ<br /> sinh vật biển [2, 11, 12] đã được các nhà khoa<br /> học nghiên cứu trên nhiều khía cạnh như phân<br /> lập (isolation) và dòng hóa (cloning) gen; hợp<br /> nhất (integration) vào bộ gen sinh vật chủ qua<br /> biến nạp/tải nạp; biểu hiện (expression) và di<br /> truyền của gen ở thể biến nạp sang các thế hệ<br /> sau. Ở thực vật, gen phát sáng được nghiên cứu<br /> sử dụng để biến nạp phổ biến nhất là gen gfp và<br /> tiếp theo là gen rfp [2, 7]. Ngoài ra, còn có gen<br /> luc (từ động vật đom đóm) cũng đã được nghiên<br /> cứu biến nạp.<br /> Thuộc nhóm gen rfp, gen DsRed [phân lập<br /> từ bọt biển (marine sponge) Discosoma sp.] [5,<br /> 7] được xem như một gen chỉ thị (reporter) sống<br /> (vital) có tiềm năng lớn, đã được sử dụng nhiều<br /> trong nghiên cứu biến nạp di truyền trên động<br /> vật [6, 19, 20], thực vật [5, 7, 13, 14, 17, 18] và<br /> <br /> 212<br /> <br /> vi sinh vật [16]. Đối với nghiên cứu biến nạp di<br /> truyền ở thực vật, ngoài ưu điểm tương tự gen<br /> gfp là có thể quan sát sự phát sáng mà không<br /> cần hủy mẫu (non-destructive/non-invasive),<br /> gen DsRed còn có ưu điểm là tia sáng vàngxanh lục dùng kích thích protein DsRED có khả<br /> năng xuyên thấu (penetration) mô sống tốt hơn<br /> tia UV và tia xanh lam dùng kích thích protein<br /> GFP; vì vậy, có thể dễ dàng ghi nhận ánh sáng<br /> đỏ hơn so với việc ghi nhận ánh sáng xanh lục<br /> phát ra từ mô chuyển gen gfp [12]. Ngoài ra, khi<br /> gen DsRed biểu hiện mạnh, có thể nhận thấy mô<br /> thực vật/động vật có màu hồng đỏ bằng mắt<br /> thường dưới ánh sáng tự nhiên [6, 13] và ưu<br /> điểm này, theo chúng tôi, có thể được khai thác<br /> trong nghiên cứu làm thay đổi màu sắc của mô<br /> thực vật có màu trắng, ví dụ mô cánh hoa,<br /> tương tự nghiên cứu tạo hoa cây trồng chứa<br /> protein GFP có khả năng phát sáng xanh lục<br /> (green fluorescent flower) [12].<br /> Trên cơ sở ưu điểm và tiềm năng của gen<br /> <br /> Nguyen Huu Ho et al.<br /> <br /> này như đã trình bày ở trên, trong công trình<br /> này, chúng tôi trình bày một số kết quả về<br /> nghiên cứu chuyển gen DsRed trước hết với tính<br /> chất là gen chỉ thị và hy vọng sản phẩm protein<br /> của gen này có thể sẽ tạo thay đổi ít nhiều màu<br /> sắc hoa của đối tượng phong lan thí nghiệm<br /> Dendrobium, từ trắng sang hồng.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Sử dụng giống phong lan thương mại<br /> Dendrobium cv. Burana White (có hoa màu<br /> trắng) được cung cấp bởi Vũ Ngọc Phượng,<br /> Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh<br /> học Nhiệt đới.<br /> Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô<br /> Môi trường nuôi, nhân protocorm-like body<br /> (PLB) dùng chuyển gen (môi trường số 1) gồm<br /> Knudson C [9] có 1 mg/l BA và 10% (v/v) nước<br /> dừa; điều kiện nuôi cấy tối, nhiệt độ 25-28oC.<br /> Môi trường tạo vươn chồi từ PLB (môi trường<br /> số 2, với thành phần khoáng như trên) không<br /> chất điều hòa sinh trưởng, 10% (v/v) nước dừa;<br /> điều kiện nuôi cấy: cường độ ánh sáng khoảng<br /> 3.000 lux, nhiệt độ như trên.<br /> Quy trình chuyển gen<br /> Plasmid dùng chuyển gen<br /> Sử dụng hai loại plasmid pITB-DsRED<br /> mang gen DsRed có promoter CVMV (Cassava<br /> vein mosaic virus) và plasmid pITB-BAR mang<br /> gen bar (kháng chất trừ cỏ) có promoter<br /> CaMV35S do chúng tôi thiết kế. Hai loại<br /> plasmid này được phối hợp, theo thứ tự, với tỷ<br /> lệ Mol 3:1 để bọc vi hạt bắn. Phương pháp tách<br /> chiết, tinh sạch DNA plasmid dùng bắn gen từ<br /> hai dòng vi khuẩn E. coli biến nạp mang hai loại<br /> plasmid nói trên được thực hiện theo tài liệu<br /> hướng dẫn ở bộ kit của công ty QIAGIEN<br /> (QIAquick Gel Extraction Kit, 2011).<br /> Thiết bị bắn gen, điều kiện bắn gen<br /> Sử dụng hệ thống BIO-RAD Particle<br /> Delivery System 1000/He (BIO-RAD, Hoa Kỳ).<br /> Quy trình khử trùng vi hạt vàng và bọc plasmid<br /> DNA được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn<br /> của công ty BIO-RAD. Điều kiện bắn gen: các<br /> cụm PLB, qua cắt nhỏ kích thước khoảng 3-5<br /> mm, được xếp khít nhau ở trung tâm đĩa petri<br /> <br /> (đường kính 6 cm) chứa môi trường số 1 và qua<br /> nuôi cấy 2 ngày trong tối; hạt vàng có kích<br /> thước 0,9 µm, khoảng cách bắn 6 cm, lực bắn<br /> 1.100 psi, lực hút chân không 27 in. Hg vac.<br /> Chọn lọc tế bào và tạo chồi chuyển gen<br /> Sau bắn gen 2 ngày, mô được cấy chuyển<br /> sang môi trường số 1 có bổ sung 1 mg/l<br /> phosphinothricin (PPT); thực hiện 1 chu kỳ<br /> chọn lọc (20 ngày). Sau đó, mô được cấy<br /> chuyển tiếp sang môi trường chọn lọc như trên<br /> nhưng có bổ sung 3 mg/l PPT liên tiếp 5 chu kỳ<br /> (20 ngày/chu kỳ). Điều kiện nuôi chọn lọc: tối<br /> (đối với 3 chu kỳ đầu), chiếu sáng với cường độ<br /> khoảng 3.000 lux (ở các chu kỳ tiếp theo), nhiệt<br /> độ 25-28oC. Tạo chồi chuyển gen từ PLB<br /> chuyển gen được thực hiện bằng môi trường số<br /> 2, có bổ sung 3 mg/l PPT; điều kiện nuôi: cường<br /> độ ánh sáng và nhiệt độ như trên.<br /> Phương pháp kiểm tra thể chuyển gen<br /> Sự có mặt của gen bar ở PLB chuyển gen<br /> được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR dùng cặp mồi<br /> đặc hiệu: BAR(F): 5’-GGTCTGCACCATCGT<br /> CAACC-3’, BAR(R): 5’-CCCTGCAGTTACT<br /> ATCAGATCTCG-3’; chương trình nhiệt: 94C:<br /> 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 62C: 1 phút,<br /> 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn<br /> DNA 350 bp. Sự có mặt của gen DsRed được<br /> kiểm tra bằng kỹ thuật PCR dùng cặp mồi đặc<br /> hiệu (theo Rehbein & Bogerd, 2007) [15]:<br /> DsRED(F): 5’-ACAACACCGTGAAGCTGAA<br /> GGTGACCAAG-3’, DsRED(R): 5’-GGTG<br /> TAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTC-3’;<br /> chương trình nhiệt như đối với gen bar; khuếch<br /> đại đoạn DNA 500 bp.<br /> Sự biểu hiện tạm thời (2 ngày sau bắn gen)<br /> và bền vững của gen DsRed ở PLB được ghi<br /> nhận trong tối bằng cách chiếu ánh sáng vàngxanh lục, độ dài sóng 560 nm [3], từ đèn cầm<br /> tay LED Spotlight (Hoa Kỳ) và quan sát mô<br /> dưới kính hiển vi soi nổi qua kính lọc đỏ. Chụp<br /> ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số CANON 12<br /> Mpixels. Sự biểu hiện bền vững của gen DsRed<br /> cũng được ghi nhận qua quan sát PLB bằng mắt<br /> thường dưới ánh sáng tự nhiên/ánh sáng đèn<br /> huỳnh quang trắng và quan sát PLB dưới kính<br /> hiển vi soi nổi.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> 213<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 212-218<br /> <br /> Theo tài liệu, tương tự nghiên cứu chuyển<br /> gen dùng gen gfp, sau khi được kích thích, ánh<br /> sáng phát ra bởi protein gen chuyển có thể bị<br /> che khuất bởi diệp lục tố hiện diện trong mô. Vì<br /> vậy, trước khi thực hiện nghiên cứu chuyển gen,<br /> mô PLB được nuôi trong điều kiện tối khoảng 3<br /> tháng để mô có màu trắng (etiolated) - diệp lục<br /> tố thoái hóa nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho<br /> việc ghi nhận biểu hiện phát sáng tạm thời; và<br /> tương tự, sau quá trình chọn lọc dài hạn mô<br /> PLB cũng được xử lý trong tối cũng trong<br /> khoảng thời lượng trên nhằm chuẩn bị cho khâu<br /> quan sát, ghi nhận biểu hiện phát sáng bền<br /> vững.<br /> Đến nay, trên thế giới chưa thấy tài liệu nào<br /> a<br /> <br /> công bố có đề cập dùng PPT để chọn lọc trong<br /> nghiên cứu chuyển gen vào đối tượng phong lan<br /> Dendrobium. Vì vậy, thử nghiệm tính chống<br /> chịu tự nhiên đối với PPT (nồng độ từ 1-5 mg/l)<br /> đã được thực hiện. Kết quả cho thấy, 3 mg/l<br /> PPT là nồng độ gây chết toàn bộ mô PLB, được<br /> dùng để chọn lọc ở thí nghiệm chuyển gen. Số<br /> liệu cụ thể về ảnh hưởng của PPT trên tỷ lệ chết<br /> hoại (necrosis) của mô PLB sẽ được trình bày ở<br /> một công bố khác. Theo một số tài liệu đã được<br /> công bố, đối với ba giống lan Brassia, Cattleya<br /> và Doritaenopsis, nồng độ PPT dùng chọn lọc<br /> là 3 mg/l [8]; còn đối với giống lan<br /> Phalaenopsis, nồng độ PPT dùng chọn lọc có<br /> cao hơn, 5 mg/l [1].<br /> c<br /> <br /> b<br /> <br /> 1 mm<br /> <br /> d<br /> <br /> f<br /> <br /> e<br /> <br /> 1 2 3 4 5 6 7<br /> <br /> 1 2 3 4 5 6 7 8<br /> <br /> Hình 1. Chọn lọc mô chuyển gen và kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển.<br /> a. Mô PLB dùng bắn gen; b. Mô PLB trên môi trường chọn lọc có 1 mg/l PPT; c. Cụm mô sống sót trên môi<br /> trường chọn lọc có 3 mg/l PPT; d. Sự biểu hiện tạm thời của gen DsRed (vị trí mũi tên); e. Kiểm tra PCR gen<br /> bar cho kết quả dương tính với đoạn DNA được khuếch đại 350 bp (vị trí mũi tên) (1: Thang DNA chuẩn 1<br /> kb; 2. Đối chứng dương - plasmid; 3. Đối chứng âm - PLB không chuyển gen; 4, 5, 6, 7. Các dòng PLB<br /> chuyển gen); f. Kiểm tra PCR gen DsRed cho kết quả dương tính với đoạn DNA được khuếch đại 500 bp (vị<br /> trí mũi tên) (1. Thang DNA chuẩn 1 kb; 2. Đối chứng dương - plasmid; 3. Đối chứng âm - PLB không chuyển<br /> gen; 4. Đối chứng âm - nước cất; 5, 6, 7, 8. Các dòng PLB chuyển gen).<br /> <br /> Quá trình bố trí và triển khai thí nghiệm, đã<br /> không thu được dòng mô nào kháng PPT nếu<br /> sau bắn gen mô được cấy chuyển ngay sang môi<br /> trường có áp lực chọn lọc cao - 3 mg/l PPT (số<br /> liệu chưa công bố). Vì vậy, ở các thí nghiệm<br /> sau, chế độ chọn lọc PPT được áp dụng với<br /> nồng độ lần lượt từ thấp (1 mg/l) đến cao (3<br /> 214<br /> <br /> mg/l). Theo chúng tôi, chế độ chọn lọc này tạo<br /> điều kiện cho tế bào chuyển gen có điều kiện<br /> thời gian tăng sinh giữa một số lượng lớn tế bào<br /> không được chuyển gen đang chết dần, có thể<br /> tạo ra các chất gây ảnh hưởng đến sinh trưởng<br /> của tế bào chuyển gen. Ở chu kỳ chọn lọc 20<br /> ngày trên môi trường có 1 mg/l nhận thấy, mô<br /> <br /> Nguyen Huu Ho et al.<br /> <br /> PLB vẫn còn khả năng tăng sinh (hình 1b)<br /> nhưng ở giai đoạn chọn lọc tiếp theo dùng nồng<br /> độ 3 mg/l, nhận thấy, mô PLB chết nhiều và<br /> nhanh hơn. Việc nuôi chọn lọc theo thời gian<br /> tạo điều kiện cho các mô chuyển gen tăng dần<br /> sinh khối từ một số ít PLB kháng PPT hình<br /> thành ban đầu (hình 1c); chúng vẫn có khả năng<br /> sinh trưởng trên môi trường có nồng độ PPT rất<br /> cao - 5 mg/l (số liệu cá nhân) và theo chúng tôi,<br /> chúng là các dòng PLB đã mang gen bar. Qua 6<br /> chu kỳ chọn lọc (thời lượng khoảng 4 tháng), đã<br /> nhận được 4 dòng (independent event/line) PLB<br /> kháng 3 mg/l PPT (ký hiệu tên các dòng RDL1,<br /> RDL2, RDL3 và RDL4) trên tổng số khoảng<br /> 1.100 PLB đơn (single PLB) được bắn gen và<br /> chọn lọc; tần số chuyển gen trung bình là<br /> 0,36%.<br /> Hai ngày sau bắn gen, đồng thời với việc<br /> <br /> a<br /> <br /> cấy chuyển chọn lọc, một số mô PLB được lấy<br /> ngẫu nhiên để kiểm tra sự biểu hiện tạm thời<br /> của gen DsRed qua chiếu ánh sáng vàng-xanh<br /> lục kết hợp quan sát dưới kính hiển vi soi nổi<br /> gắn kính lọc đỏ. Kết quả cho thấy, trên bề mặt<br /> PLB có nhiều điểm sáng màu đỏ (hình 1d).<br /> Kiểm tra sự có mặt của hai gen bar và DsRed<br /> bằng kỹ thuật PCR đã cho kết quả dương tính (ở<br /> cả 4 dòng) qua ghi nhận được hai băng DNA<br /> mong đợi tương ứng là 350 bp và 500 bp (hình<br /> 1e, 1f) và như vậy, có sự đồng hợp nhất (cointegration) cả hai gen nói trên vào bộ gen cây<br /> lan. Không ghi nhận có dòng PLB nào chỉ mang<br /> gen chọn lọc bar mà không mang gen DsRed dù<br /> phương pháp chuyển gen dùng ở nghiên cứu<br /> này là phương pháp đồng biến nạp (cotransformation) trên cơ sở dùng kỹ thuật đồng<br /> bắn gen (co-bombardment).<br /> <br /> c<br /> <br /> b<br /> <br /> 1 cm<br /> <br /> d<br /> <br /> e<br /> <br /> f<br /> <br /> 2 mm<br /> <br /> Hình 2. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng tự nhiên và ánh sáng đèn huỳnh quang trắng<br /> của PLB chuyển gen (chụp không dùng kính lọc đỏ).<br /> a. PLB đối chứng dưới ánh sáng tự nhiên; b, c. Hai dòng PLB có biểu hiện phát ánh sáng đỏ mạnh (dòng<br /> RDL1) và yếu hơn (dòng RDL3), theo thứ tự, dưới ánh sáng tự nhiên; d. Cận ảnh PLB đối chứng dưới ánh<br /> sáng đèn huỳnh quang trắng; e, f. Cận ảnh hai dòng PLB chuyển gen có biểu hiện phát ánh sáng đỏ mạnh<br /> (dòng RDL1) và yếu hơn (dòng RDL3), theo thứ tự, dưới ánh sáng đèn huỳnh quang trắng.<br /> <br /> Bốn dòng PLB chuyển gen được nhân lên,<br /> sinh khối của chúng được chia thành hai nhóm<br /> để ở ngoài sáng và trong tối. Sau nhiều tháng<br /> nuôi trong tối, điều thú vị là có thể ghi nhận<br /> được bằng mắt thường màu hồng/đỏ của quần<br /> thể PLB dưới ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng<br /> <br /> của đèn huỳnh quang trắng (hình 2); trong tổng<br /> số 4 dòng chuyển gen ghi nhận có 1 dòng<br /> (RDL3) có biểu hiện màu yếu hơn 3 dòng còn<br /> lại (RDL1, RDL2 và RDL4).<br /> Bốn dòng mô PLB chuyển gen hiện đang<br /> được nuôi trong điều kiện sáng trên môi trường<br /> 215<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 212-218<br /> <br /> số 2 (Knudson C không chất điều hòa sinh<br /> trưởng + 10% nước dừa) để tạo điều kiện cho sự<br /> vươn chồi, hình thành cây hoàn chỉnh chuẩn bị<br /> cho giai đoạn trồng ở vườn ươm.<br /> Kích thích protein DsRed bằng ánh sáng<br /> vàng-xanh lục có chiều dài sóng đặc trưng cũng<br /> đã được tiến hành nhằm ghi nhận sự phát sáng<br /> của protein này. Kết quả cho thấy, ánh sáng kích<br /> thích (excitation) đã tạo hiệu ứng phát ánh sáng<br /> (emission) đỏ với đỉnh sóng chính (major peak)<br /> 583 nm [4] rất rõ rệt ở các dòng PLB chuyển gen<br /> <br /> a<br /> <br /> nuôi trong điều kiện tối (hình 3a, 3b, 3c, 3d);<br /> bước đầu không thấy có sự khác biệt rõ về biểu<br /> hiện phát ánh sáng đỏ giữa một vài dòng PLB<br /> như đã ghi nhận dưới ánh sáng tự nhiên.<br /> Tuy nhiên, biểu hiện phát ánh sáng đỏ yếu<br /> hơn được ghi nhận đối với các dòng PLB<br /> chuyển gen được nuôi ngoài sáng do có chứa<br /> nhiều diệp lục tố (hình 3e, 3f); cũng nhận thấy<br /> biểu hiện phát sáng mạnh hơn ở phần gốc mỗi<br /> PLB đơn do phần gốc hàm chứa ít diệp lục<br /> tố hơn.<br /> <br /> b<br /> <br /> c<br /> <br /> e<br /> <br /> f<br /> <br /> 0,5 cm<br /> <br /> d<br /> <br /> Hình 3. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng kích thích (vàng-xanh lục)<br /> của PLB chuyển gen (bên trái mỗi ảnh nhỏ: PLB đối chứng; bên phải mỗi ảnh nhỏ: PLB chuyển<br /> gen; ảnh được chụp qua kính lọc đỏ).<br /> a, b, c, d. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng kích thích của 04 dòng PLB chuyển gen, theo thứ tự<br /> RDL1, RDL2, RDL4 và RDL3, nuôi trong điều kiện tối; e, f. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng kích<br /> thích của 02 dòng PLB chuyển gen, theo thứ tự RDL1 và RDL3, nuôi ở điều kiện chiếu sáng.<br /> <br /> Do ưu điểm vốn có nên thời gian gần đây,<br /> các nhà khoa học có khuynh hướng dùng gen chỉ<br /> thị DsRed trong nghiên cứu biến nạp gen trên<br /> nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, từ cây mô<br /> hình dùng nghiên cứu cơ bản đến cây trồng có<br /> giá trị kinh tế như cây đậu tương [13], cây<br /> Arabidopsis [14, 17, 18], Camelina sativa [10].<br /> Việc dùng gen chỉ thị DsRed này đặc biệt có lợi<br /> vì có thể không cần dùng gen kháng chất kháng<br /> sinh hay gen chọn lọc khác khi nghiên cứu biến<br /> nạp di truyền trên cây Arabidopsis bằng phương<br /> pháp nhúng chìm hoa (floral dip method) vào<br /> dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium<br /> tumefaciens; ở trường hợp này, có thể quan sát<br /> chọn ra hạt cây chuyển gen trong tổng số hạt thu<br /> hoạch chỉ bằng cách đơn giản là nhận diện sự<br /> 216<br /> <br /> phát ánh sáng đỏ của hạt [14, 18]. Theo xu thế<br /> này, việc nghiên cứu biến nạp gen phát sáng nói<br /> chung và gen DsRed nói riêng đã được triển khai<br /> tại Viện Sinh học Nhiệt đới và đã nhận được một<br /> số kết quả có ý nghĩa như đã trình bày.<br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Qua ứng dụng phương pháp đồng biến<br /> nạp/bắn gen để chuyển gen vào vật liệu PLB<br /> giống phong lan Dendrobium Burana White, đã<br /> nhận được 4 dòng PLB mang gen mục tiêu DsRed tạo protein phát ánh sáng đỏ cùng với gen<br /> chọn lọc bar tạo tính kháng chất trừ cỏ PPT.<br /> Các dòng này có khả năng sinh trưởng bình<br /> thường trên môi trường có 3 mg/l PPT và cho<br /> <br />